TECNICAS ENZIMATICAS

Dr. Ronald Navarro OviedoDepartamento Académico de Biología

Cátedra de EnzimologíaU.N.S.A.

TECNICAS ENZIMATICAS

La propiedad mas característica de una enzima es su poder para catalizar una reacción química definida

La presencia de una enzima se detecta por las reacciones que ellas catalizan

La cantidad de una enzima se estima a partir de la velocidad de reacción

MEDICION DE LA VELOCIDAD

Las curvas de progreso de las reacciones enzimáticas, muestran que la velocidad decae con el tiempo (velocidad vs. tiempo)

Las causas de esta caída son: A) Los productos de la reacción pueden inhibir a la

enzima. B) El grado de saturación de la enzima por el S puede

disminuir a causa de la caida de la [S] conforme procede la reacción

C) La reacción inversa puede hacerse mas importante a medida que aumenta la [ ] de los productos.

D) La enzima puede inactivarse por la temperatura o el pH de la reacción

UNA TÌPICA CURVA DE PROGRESO

CURVA DE PROGRESO NO TIPICA

Hay que determinar la causa, para luego modificar el procedimiento para eliminar esto de modo que se pueda usar la velocidad en la forma normal

No es fácil decidir si la velocidad inicial, la Vmax o la inclinación de la curva en otro punto dan una medida exacta de la actividad de la enzima.

Ejemplo A) La D-aminoácido

oxidasa requiere una coenzima flavínica que se combina lentamente con la enzima; por lo tanto, la cantidad de enzima activa aumenta tiempo, después de mezclar los reactivos, produciendo una aceleración.

Esto se puede eliminar incubando primero la enzima con la coenzima y el S se añade al final para iniciar la reacción.

B) Una enzima en una solución stock concentrada puede estar en la forma de un agregado parcialmente activo, que se disocia a la forma totalmente activa durante la dilución de la mezcla de reacción.

Esto se trata añadiendo primero la E y luego el S para iniciar la reacción

C) La enzima en la solución stock se halla formando un complejo revresible con un ión metálico inhibidor (impureza) que se disocia por dilución.

Este caso se trata igual que a y b

Por lo tanto, no es fácil decidir si la velocidad inicial, la Vmax o la pendiente de la curva en otro punto dan una medida exacta de la actividad de la enzima

MEDICIÓN DE LA VELOCIDAD

Por esta razón solo se trabaja en velocidad inicial (vi) de reacción enzimática. Es decir: a) en el punto inicial, b) cuando las causas anteriores no tienen tiempo para operar, c) donde las condiciones son correctamente conocidas.

Para obtener la velocidad inicial, solo es necesario determinar la primera parte de la curva de progreso y luego se traza una tangente al origen. Las curvas casi son líneas rectas cuando el cambio no excede de 20% del total (P. ej. 20% de consumo de sustrato). Mejor no mas del 5% del S.

Importancia de tomar las velocidades iniciales. (a) Curvas de progreso con tres cantidades diferentes de enzima, (b) velocidad aparente, derivada a partir de los puntos de (a) a tres tiempos diferentes, ploteada frente a la cantidad de enzima

CLASES DE METODOS

Para seguir las reacciones enzimáticas existen dos tipos de métodos:

Métodos por muestreo: Las observaciones no se realizan en la misma mezcla de reacción sino sobre muestras retiradas a varios tiempos (puntos separados, curvas discontinuas)

Métodos continuos: Las observaciones se hacen en la misma mezcla de reacción. Muchas lecturas o por registro automático, curvas continuas.

ASPECTOS PRACTICOS: Para obtener linearidad

Se deben mantener constantes las condiciones de la mezcla de reacción

La reacción debe ser realizada en un termostato Todos los reactivos deben ser llevados a la

temperatura correcta antes de iniciar la reacción Usar un buffer adecuado para evitar cambios en el

pH Escoger condiciones de pH y temperatura

adecuados apara la enzima

ASPECTOS PRÁCTICOS: Debido a la alta actividad catalítica de las enzimas

Evitar las trazas de enzimas en las puntas de pipetas o los polvos enzimáticos (trazas de saliva: usar tapones de algodón en los topes de las pipetas cuando se trabaje con amilasas)

ASPECTOS PRACTICOS: Para hacer lecturas correctas

Ajustar la velocidad de reacción por dilución adecuada de la enzima

Mezcla rápida y completa

ASPECTOS PRACTICOS: Cómo guardar las enzimas

Las enzimas deben ser guardadas en soluciones stock altamente concentradas:

A. Precipitación con sulfato de amonioB. Concentración con cromatografíaC. Concentración con membranas diaflo

(AMICON)

Para iniciar la reacción: realizar mezcla rápida y completa por agitación (manual o con vortex)

MANEJO GENERAL DE ENZIMAS

Evitar inactivación Eliminar condiciones en las que la enzima es

inestable: altas temperaturas, soluciones ácidas o alcalinas (evitar pH <5 o >9), alcohol

Durante la purificación usar cuarto frio, o baño refrigerado que contiene alcohol diluido (usar vasos de acero)

La mayoría de enzimas se inactivan a pH pH <5 o >9. Agregar ácido por las paredes del vaso y con agitación

MANEJO GENERAL DE ENZIMAS Evitar formación de espuma, pues las

enzimas se desnaturalizan en las superficies: El vaciado de un vaso a otro se debe realizar por las paredes (inclinando); hojas de agitador sumergidas profundamente y el vástago debe girar a plomo

Las sales: agregar poco a poco para evitar burbujas. Usar soluciones saturadas de sal.

Usar solventes fríos para el fraccionamiento (acetona, alcohol)

Los detergentes pueden afectar a la enzima y son difíciles de eliminarlos

MANEJO GENERAL DE ENZIMAS

Los precipitados deben ser separados por centrifugación; solo en algunos casos por filtración (papel, celita, hyflo, supergel, etc.)

Realizar la purificación sin pérdida de tiempo para evitar pérdida de actividad (en 2 – 3 días) a menos que la enzima sea bastante estable.

Guardar las enzimas en frío (congelación) El secado de las enzimas debe hacerse al vacio y

a baja temperatura (liofilización) La contaminación bacteriana, solo es un

problema si las soluciones se dejan en reposo por largos tiempos

EL ESTUDIO DE UNA ENZIMA

Propiedades proteicas Homogeneidad

Número de isoenzimas Peso molecular Forma de la molécula Curva de titulación Punto isoeléctrico Movilidad electroforética Grado de hidratación Estabilidad frente al pH, calor, oxidación y

radiaciones Disociación en pequeñas subunidades Espectro de absorción, etc.

Estructura Composición de aminoácidos

Número de cadenas peptídicas Secuencia de aminoácidos Plegamiento de las cadenas Presencia de grupos prostéticos Número de grupos –SH Efecto de reactivos químicos Dispersión rotatoria óptica Dicroismo circular Resonancia magnética nuclear Resonancia del spin electrónico

Propiedades de la enzima

Naturaleza de la reacción Implicación de coenzima Especificidad por el sustrato Reversibilidad de la reacción Especificidad hacia inhibidores

Centro activo

Número por molécula Estructura química Efecto de la combinación con el

sustrato Mecanismo de reacción Modo de acción del grupo prostético

Cinética

Actividad específica Actividad molecular Actividades absolutas por centro activo Medida de las constantes de velocidad Efecto de activadores Efecto de iones a diferente pH Efectos alostéricos Secuencia de las etapas de reacción Ecuación de velocidad

Termodinámica

Reversibilidad y Keq de la reacción Coeficiente de temperatura Energías libres y entropías Afinidad de la enzima por el sustrato

(Km) Efecto del pH sobre Km Afinidad por un inhibidor (Ki)

Propiedades biológicas

Significado de las enzimas en el metabolismo

Acoplamiento con otras enzimas Ocurrencia y distribución en especies y

tejidos Localización intracelular Formación a partir de precursores Formación adaptativa Genética de la enzima Efecto de las mutaciones génicas

Propiedades biológicas

Existencia de isoenzimas Efectos de la deficiencia de

enzimas Efectos del envenenamiento

específico Comportamiento inmunológico Antienzimas

LAS ACTIVIDADES ESPECIFICA Y MOLECULAR

Se debe definir un parámetro que exprese la velocidad de reacción que puede ser alcanzada por una determinada cantidad de enzima

En otros campos se usa: cantidad / unidad de peso con el adjetivo

“Específico” Cantidad / molécula con el adjetivo

“molecular”

Actividad específica

Ha sido expresada de diferentes maneras: A) Unidades / mg de enzima; la unidad es

arbitraria (p.ej. P.Z. para peroxidasas) B) Constante de velocidad / mg de enzima;

Kat. F. para catalasa; coeficiente proteolítico, para peptidasas

C) Moles de S que reaccionan / min / mg de enzima

D) Moles de S que reaccionan / min / 100,000 g de enzima

Actividad molecular

Moléculas de S que reaccionan / min / molécula de enzima ( = “actividad molecular”)

Moléculas de S que reaccionan / min / centro activo ( = “actividad de centro catalítico”)

Nota: “Número de recambio”: se usó para las dos, pero ha creado confusión. Por acuerdo internacional, para la segunda se usa “actividad de centro catalítico”

Según la I.U.B. (E.C.) Una unidad U: “ cantidad de enzima que

transforma 1 Mol de S / min” Actividad específica: “Unidades de

enzima / mg de proteína” Actividad molecular: “Unidades / Mol de

enzima ( = Nº de moléculas de S transformadas / min / molécula de enzima

Actividad absoluta por centro activo, o actividad de centro catalítico: Nº de moléculas de S transformadas / min / centro catalítico

Katal (kat)

Cantidad de enzima que transforma 1 mol de S / seg

Microkatales (kat); nanokatales (nkat) o picokatales (pkat)

1 kat = 6 x 107 UI 1 UI = 0.01667 kat = 16.67 nkat

AFINIDADES ENZIMATICAS

Constantes de disociación E – S Km: E + S ==== ES Ki: E + I ==== EI Ka E + A ==== EA

METODOS PARA SEGUIR CUANTITATIVAMENTE LAS REACCIONES

ENZIMATICAS Métodos espectrofotométicos Métodos de fluorescencia Métodos manométricos Métodos de electrodo Métodos polarimétricos Métodos por muestreo

La absorbancia molar es la absorbancia de una solución 1 M de la sustancia en una cubeta de 1 cm; así, la molaridad real de una solución se obtiene dividiendo la absorbancia observada por la absorbancia molar. Para referencias ver (12). Las longitudes de onda dadas corresponden a las bandas de máxima absorción, excepto para el azul de metileno, fenazina metosulfato reducida, ferri- y ferrocianuro a 314 nm y citocromo oxidado. Se debe notar que algunas de estas sustancias, especialmente las formas reducidas de las flavinas y colorantes, reaccionan rápidamente con el oxígeno, el cual debe ser rigurosamente excluido. Los artificios para la espectrofotometría anaeróbica han sido discutidos por DIXON (11).

Espectrofotómetro Beckman

Beckman DU-650 UV-Vis spectrophotometer with sipper and sampler

ESPECTROFOTÓMETRO DE FLUORESCENCIA

pH-STAT Titrator, Biburette motor positions without Burette stand (Radiometer Analytical)

Polarímetro de Disco