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CURSO 08-09 Tema 12. Replicacin y reparacin del genoma. Principios generales de la replicacin del DNA. Enzimologa de la replicacin. DNA polimerasas procariotas: caractersticas y funcin. DNA polimerasas eucariticas. Orgenes de replicacin. Iniciacin de la replicacin. Elongacin de las cadenas de DNA. Replicacin de los telmeros: telomerasa. Mutaciones, mutgenos y reparacin del DNA.
BIOQUMICA-1 de Medicina Dpto. Biologa Molecular Dolores Delgado
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGA MOLECULARF. Crick 1958
REPLICACIN TRANSCRIPCIN
TRADUCCIN
Tema 12
2
Clulas en divisin: el ciclo celular
2C 2C 2C MITOSISM G2 G1
2C
4C
SSINTESIS DE DNA (replicacin)
interfase 4CTema 123
Caractersticas de la replicacinReplicacin: proceso mediante el cual se hacen copias fieles del DNA que garanticen la transmisin y conservacin de la informacin gentica
Se necesita un grado exquisito de precisin. Existen sistemas complejos que aseguran que la informacin se transmite intacta. Las enzimas que sintetizan del DNA han de copiar molculas de millones de bases con gran fidelidad y velocidad. Han de actuar sobre un sustrato de DNA muy compactado y unido con otras protenas En la replicacin intervienen multitud de protenas y enzimas Los mecanismos utilizados y las propiedades fundamentales del proceso de replicacin son idnticos en todos los organismos.
Tema 12
4
Principios generales de la replicacin
1. La replicacin del DNA es semiconservadoraCada cadena acta de molde para la sntesis de una nueva cadena. El resultado es dos molculas de DNA, cada una con una cadena vieja y una nueva.
Tema 12
Luque y Herraez. Texto Ilustrado de Biologa Molecular e Ingeniera Gentica. Harcourt 2001.
5
2. La replicacin empieza en un punto de origen y es bidireccional
En organismos procariotas la replicacin tiene lugar de forma bidireccional desde un nico origen.
Los organismos eucariotas replican su material gentico de forma bidireccional desde muchos orgenes.
Tema 12
6 "Bioqumica. Libro de texto con aplicaciones clnicas". Devlin, T.M. Ed. Revert. Bioqumica. Stryer, L. Ed. W.H. Revert. .
3. La sntesis de DNA transcurre en direccin 5 3 y es semidiscontnua
Las polimerasas sintetizan DNA siempre en sentido 5 3 Una cadena se sintetiza de manera continua: cadena conductora o adelantada La otra cadena ha de sintetizarse por fragmentos: cadena retrasada o rezagada Fragmentos de Okazaki: fragmentos cortos (200 a 2000 nt) que posteriormente sern unidos por una DNA ligasa5 3 3 5
Cadenas parentales
3 Cadena conductora: su sntesis 5 va en el mismo sentido que la horquilla de replicacin 5 3Movimiento de la horquilla de replicacinTema 12
3 5 3 5 3 5 Cadena retrasada: su sntesis va en sentido opuesto a la de la horquilla de replicacin7
4. El DNA es sintetizado por DNA polimerasas
Catalizan la reaccin: (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPiDNA DNA alargado
Para la reaccin de polimerizacin se requiere: a) Una hebra desapareada que acte como molde b) Una cadena cebadora o prmero que aporte un extremo 3-OH libre, al cual se aade un nuevo nucletido c) Un nucletido trifosfato: se incorpora el nucletido con el fosfato en alfa y se libera pirofosfato
a) Hebra molde
c)Tema 12
b) prmero o cebador"Biochemistry" . Garrett, R.H. and 8 Grisham, Saunders College Publ
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959"for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid"
Severo Ochoa1/2 of the prize USA New York University, College of Medicine New York, NY, USA b. 1905 (in Luarca, Spain) d. 1993
Arthur Kornberg1/2 of the prize USA Stanford University Stanford, CA, USA b. 1918 d. 2007
Descubridor de la DNA polimerasa I de E Coli
Tema 12
http://nobelprize.org/
9
Reaccin de polimerizacin
Desoxinuclesido 5-trifosfato entrante
Pirofosfato (PPi)
Formado el enlace fosfodister
Hebra creciente
Hebra molde
Lehninger Principios de Bioqumica", 4 ed. Nelson, D.L. y Cox, M.M. Omega. 2006
Tema 12
10
Reaccin de polimerizacinHebra creciente Hebra molde
Tema 12
Alberts et al Molecular Biology of the Cell. Garland Science 2008 11
5. La replicacin es muy precisaEn E Coli se comete un error cada 109 1010 nucletidos adicionadosHebra molde
Hebra creciente
La actividad correctora de pruebas (35 exonucleasa) de las DNA polimerasas elimina el nucletido mal apareado
Nucleasas o DNasas: enzimas que degradan el DNA Exonucleasas: degradan desde un extremo del cido nucleico. Actividad exonucleasa 5----3 3---5 Endonucleasas: degradan en sitios internos
Tema 12
12
Propiedades de las DNA polimerasas procariotas
DNA pol I Funciones de limpieza y reparacin. Eliminar el cebador y sustituir el RNA por DNATema 12
DNA pol III Enzima principal polimerizante13 Lehninger Principios de Bioqumica", 4 ed. Nelson, D.L. y Cox, M.M. Omega. 2006
Otras protenas necesarias para la replicacinEn total, al menos 20 protenas distintas. Al complejo completo se le llama REPLISOMA o sistema DNA replicasa 1) Helicasas: se trasladan a lo largo del DNA y separan las dos cadenas, utilizando la energa del ATP. 2) la separacin crea una tensin topolgica que se elimina por accin de las DNA topoisomerasas 3) las cadenas separadas se estabilizan mediante protenas fijadoras del DNA (SSB) 4) los prmeros son fragmentos cortos de RNA sintetizados por las primasas 5) al final, los cebadores de RNA han de ser eliminados y reemplazados por DNA (Se lleva a cabo en E Coli por la DNA pol-I) 6) quedan unos cortes o mellas que han de ser sellados por las DNA ligasas2)
1) 4)Tema 12
3)Lehninger Omega. 2006 14
Inicio de la replicacin del DNA en E Coli
Ori C: 245 bpCajas DnaA
Cajas DnaA
Sitio de fusin de la doble hlice
Unin de DnaA a sus sitios de fijacin. Fusin de la doble hlice Asociacin secuencial de protenas que desenrollan el DNA y forman la horquilla de replicacin: La helicasa DnaB, ayudada por DnaC se sita en la burbuja de replicacin La primasa DnaG se une al complejo, formando el primosoma La unin posterior de la DNA pol III lleva a cabo la replicacin del DNA
Tema 12
Lehninger Principios de Bioqumica", 4 ed. Nelson, D.L. y Cox, M.M. Omega. 2006
15
Elongacin de las hebras adelantada y rezagada del DNAhttp://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/replic/replic3.htm
La sntesis de las cadenas adelantada y retardada estn coordinadas Ambas hebras son producidas por un dmero de la DNA pol IIITema 12
La hebra retardada forma un bucle que aproxima los dos puntos de polimerizacin. "Bioqumica" . Mathews, C.K.
16 Van Holde, K.E
Sntesis de la cadena retrasasa
1. La primasa sintetiza un cebador de RNA en el extremo 5 de la nueva cadena
2. La DNA polimerasa III alarga los cebadores sintetizando nueva cadena de DNA
3. La DNA polimerasa I elimina el RNA del fragmento vecino y llena el hueco
4. La DNA ligasa une los fragmentos de DNA adyacentes17 Bioqumica bsica de Marks. Un enfoque clnico. McGraw-Hill Interamericana, 2006.
Tema 12
Replicacin en eucariotas
Tema 12
18
En el genoma humano hay cientos de focos de replicacin, cada uno con muchos orgenes
Tema 12
19
Activacin de los orgenes de replicacinorigen
ORCG1
Complejo de reconocimiento del origen
Cdc6 cdt1
MCM2-7Complejo prereplicativo
(Mini Chromosome Maintenance proteins, Complejo helicasa)
Licencia del origen de replicacinP-
S
DNA pols , Complejo de pre-iniciacin Tema 12
Inicio de la replicacin
20
DNA polimerasas eucariotasTabla 24.3. Propiedades de las DNA polimerasas de los eucariotas
*
*
DNApol : aade los primeros y 10-15 d-ribonucletidos
DNApol : completa el fragmento de Okazaki y sintetiza la hebra conductora
DNApol : rellena los huecos que dejan los prmeros al ser eliminados21
Tema 12
"Bioqumica" 3 ed. Mathews, C.K. Van Holde, K.E y Ahern, K.G. Ed. Addison Wesley. 2002.
Replicacin del DNA en eucariotas
En eucariotas hay varias DNA polimerasas: la que sintetiza los prmeros, la que sintetiza la conductora y acaba los fragmentos de Okazaki, y otrasTema 12Bioqumica bsica de Marks. Un enfoque clnico. McGraw-Hill Interamericana, 2006. 22
Replicacin de los telmeros
Tema 12
23
El problema de la replicacin de los extremos de los cromosomasPorqu se acortan los telmeros? Los telmeros tienden a acortarse, en cada ronda de replicacin en la hebra rezagada, porque la DNApolimerasa no puede actuar sin prmero y la primasa no puede colocar un prmero ms externo si no tiene un molde de DNA La hebra conductora se replica por completo sin interrupcin
3 5polimerizacin
5 Telmero 3
3 5
5 hebra molde 3 hebra conductora
+3 5Eliminacin del prmero y ligacin de los fragmentos de okazaki
5 fragmentos de Okazaki 3 hebra molde
3 5Tema 12
5 3
Problema:se pierde el DNA equivalente24al prmero en cada ronda de replicacin
Acortamiento de los telmeros y telomerasa
Qu consecuencias tiene el acortamiento de los telmeros? En cada ronda de replicacin se van perdiendo secuencias telomricas (cromosomas ms cortos) y los cromosomas se hacen inestables: se unen a otros cromosomas o sufren reorganizaciones que alteran el material gentico
Telomerasa un componente proteico (subunidad cataltica hTERT) y una molcula de RNA aade secuencias telomricas en el extremo 3 del DNA (~transcriptasa inversa) la molcula de RNA de la Telomerasa sirve de molde para aadir repeticiones de 6 nucletidos al extremo 3 de los telmeros. este alargamiento permite aadir un prmero ms externo sobre el que la DNApol puede aadir dNTPs En ausencia de telomerasa, a medida que las clulas se van dividiendo (y envejeciendo) se van acortando los telmeros La telomerasa es inactiva en la mayor parte de las clulas somticas La telomerasa se activa en muchas clulas tumorales Papel en el envejecimiento(reloj biolgico), la proliferacin y el cncerTema 1225
La telomerasa sintetiza nuevas unidades telomricas en el extremo 3Telomerasa hTERT 3 RNA 5
Telmero humano
C C Sntesis de C telmero AU AATCCCAATCCCAATCCC 5 AAUCCCA TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3dGRepeticiones telomricas ELONGACIN TRASLOCACIN ELONGACINdA TPTP
dC T
P
dG TP
El componente proteico de la telomerasa alarga el saliente 3 usando como molde la hebra de RNA de la propia telomerasa
3 5
AATCCCAATCCCAATCCC 5 AAUCCC TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3Sntesis de un prmero + elongacin por DNApol Sellado de la mella por la ligasa
AATCCCAATCCCAATCCC 5 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3Tema 1226
REPARACIN DEL DNA
Tema 12
27
Reparacin del DNAREPARACIN DEL DNA El mantenimieno de la informacin contenida en el DNA es fundamental, las molculas de DNA son irreemplazables (a diferencia del RNA o las protenas) El DNA puede resultar daado por diversos procesos (espontneos, agentes ambientales) Adems la replicacin puede dejar bases mal apareadas La qumica de las lesiones del DNA es diversa y compleja por lo que en la respuesta celular hay muchos sistemas enzimticos de reparacin IMPORTANCIA DE LA REPARACIN Qu efecto tiene una lesin del DNA no reparada? Se produce un cambio en la secuencia de bases del DNA que, si se replica y se transmite a las clulas hijas, se hace permanente Estos cambios de secuencia se llaman MUTACIONES. Sustitucin de un par de bases por otro Adicin o eliminacin de un par de bases, etc. La mayora de las mutaciones son deletreas para la clula Las mutaciones estan ligadas al cncerTema 1228
Fumar: principal causa de cncer
Tema 12
Bioqumica bsica de Marks. Un enfoque clnico. McGraw-Hill Interamericana, 2006.
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Dao al DNA y principales sistemas de reparacinAGENTESFsicos: radiacin UV, radiaciones ionizantes (rayos X) Qumicos: alquilantes, intercalantes, etc. TABACO Rayos X Radicales de oxgeno Agentes alquilantes Reacciones espontneas Radiacin UV Hidrocarburos aromticos policclicos
Errores en la replicacin
LESIONES
Bases desaminadas, oxidadas, sitios absicos
Dmeros de timina, derivados voluminosos, (distorsiones de la hlice)
SISTEMAS DE REPARACIN
Reparacin por escisin de base (BER)
Reparacin por escisin de nucletido (NER)
Reparacin de apareamientos incorrectos (mismatch repair)
Tema 12
OTROS SISTEMAS DE REPARACIN: Reparacin directa. Recombinacin homloga
30
Reparacin por escisin de bases (BER)La accin de los agentes qumicos da lugar a la aparicin de bases daadas que son eliminadas por DNA glucosilasas especficas La hidrlisis espontnea tambin conduce a la prdida de bases (sitio absico: apurnico o apririmidnico, AP)
A diferencia de las escinucleasas las endonucleasas AP solo cortan la hebra daada por un punto situado en 5 de la lesin
La DNA polimerasa I va eliminando nucletidos y rellenando el hueco
Finalmente la DNA ligasa sella los dos extremos de la cadena de DNA31
Tema 12
Lehninger Principios de Bioqumica", 4 ed. Nelson, D.L. y Cox, M.M. Omega. 2006
Reparacin por escisin de nucletidos (NER)
Dmeros de timina
La excinucleasa se diferen cia de las dems nucleasas en que corta la hebra daada por dos puntos, en 5 y en 3 de la lesin
Tanto E.coli como el hombre poseen sistemas homlogos para reparar este tipo de lesin Tema 12Lehninger Principios de Bioqumica", 4 ed. Nelson, D.L. y Cox, M.M. Omega. 2006
32
Reparacin de errores cometidos durante la replicacin
La reparacin es posible porque la hebra molde est marcada previamente por metilacin de la A de todas las secuencias GATC presentes en ella (en E Coli)33
Tema 12
Lehninger Principios de Bioqumica", 4 ed. Nelson, D.L. y Cox, M.M. Omega. 2006