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Teoria dei Grafi, QSARs ed Esperimenti “REACH Oriented”
5° “LEARNING BY ACCIDENTS” 15 maggio 2015 - ISIS Giulio Natta
POETA PACCATI GIUSEPPE ISIS Giulio Natta - Bergamo
REACH COMPLIANCE
Quante sono le sostanze conosciute? CAS REGISTRYSM:
›96 million chemical substances
› 66 million sequences
≈ 15,000 new subst./day
O
O
O
O
OO
O
O
O
OO
NO
O
N
OO
O N
NO
O
N
OO
O N
O
OO
O
OO O
O
O
OO
O
O
OO
O
O
O
OO
OO
N
O
N
N
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OO
P
NO
O
Br
H
HH
H
O
OO
O
OO
O
O
OO
O
O
SVHC Substances of Very High Concern_ (sostanze estremamente preoccupanti)
Art. 57 REACH "Registration, Evaluation, Authorisation and
Restriction of Chemicals“:
• (CMR) Cancerogene o Mutagene o Tossiche per la riproduzione (categorie 1A o 1B, a norma del regolamento CLP – art. 57 lettere a), b), c) del regolamento REACH);
• (PBT) Persistenti, Bioaccumulabili e Tossiche, • (vPvB) Molto Persistenti e molto Bioaccumulabili; • (criteri stabiliti nell’allegato XIII del regolamento REACH – art. 57 lettere d), e));
• Sostanze, per le quali esiste l’evidenza scientifica di probabili effetti gravi per la salute umana o per l’ambiente, (art. 57 lettera f)). Es.: gli (EI) Interferenti Endocrini.
Per la maggioranza delle
sostanze xenobiotiche i dati
tossicologici ed ecotossicologici
sono scarsi o inesistenti.
Esigenza di strumenti previsione
delle proprietà Tox. Ecotox. ecc.
Esigenza di sostituire, per quanto
possibile, la sperimentazione su
vertebrati con metodi scientifici
alternativi.
Approcci teorico-sperimentali “Reach Oriented”
Approcci teorico-sperimentali “Reach Oriented”
Rouvray DH, Bonchev D (1991). Chemical graph theory: introduction and fundamentals. Tunbridge Wells, Kent, England: Abacus Press.
Kow, Coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua
QSARs (Quantitative Structure Activity Relationships)
Descrittore molecolare: è un
numero associato a una molecola in
grado di trasformare l'informazione
chimica codificata nella struttura della
molecola, in un valore utile.
Metodi topologici Teoria dei grafi in chimica
Test di Ames, test di genotossicità (mutagenesi) mediante reversione
ceppo auxotrofo His- di Salmonella typhimurium
La struttura …. è tutto! proprietà chimico-fisiche , tossicologiche, ecotossicologiche
NanoPutians, James Tour et al. (Rice University) 2003
Chanteau, S. H.; Tour, J. M. (2003). "Synthesis of Anthropomorphic Molecules: The NanoPutians". The Journal of Organic
Chemistry 68 (23): 8750–8766.
N
AsH
Deucein putian
OO OO
Molecole Chirali e attività farmacologica
D-DOPA Nessun effetto biologico
L-DOPA Antiparkinson
HNH
2
COOH HOOC
HNH2
HNH
2
COOHOH
OH
HOOC
HNH2
OH
OH
D-Fenilalanina
*R
L-Fenilalanina
S
*
D-DOPAnessun effetto biologico
*R
L-DOPAantiparkinson
S
*
(XII)
(XIII)
(S)
TERATOGENO
(R)
N
N
O
O
H
O
O
N
N
O
O
H
O
O
2-((S)-2,6-Dioxo-piperidin-3-yl)-isoindole-1,3-dione
2-((R)-2,6-Dioxo-piperidin-3-yl)-isoindole-1,3-dione
* *
TALIDOMIDE
LIMONENE
S-(-)
Essenza
trementina
* *
R-(+)
Aroma
limone
arancia
CL-20 2,4,6,8,10,12-
esanitro-
2,4,6,8,10,12-
esaazaisowurtzitano
Thiokol Corporation
O2N
NO2
NO2
O2NO
2N
NO2
O2N
NO2
Ottanitrocubano 2000_Philip Eaton e Mao-Xi Zhang.
N
N
N
N
NO2
NO2
NO2
O2N
N
N
NNO
2
NO2
O2N
RDX ciclotrimetilentrinitroammina1,3,
5-Trinitroperidro-1,3,5-triazina
HMX (Ottagene) Ciclotetrametilentetranitroammina
NO2
NO2
O2N
O2N
O2N
O2N
O2N
NO2
NO2
NO2
O2N
NO2
DNH
Dodecanitrohexaprismane
OOO
2N
NO2
ONO
2
SOMAN (GD)
3,3-Dimethylbutan-2-yl
methylphosphonofluoridate
LCt50 humans =70 mg min/m3.
LCt50 rat = 954.3 mg min/m3.
*
SARIN (GB)
LD50 = 5 mg (70 kg human)
* *
Gas nervini
AGENTI NOVICHOK
P
O
NF N
NEtEt
Et
Et
*
A-242
(Novichok-5)
P
O
NF
ON
NEtEt
Et
Et
*
A-262
(Novichok-7)
TABUN (GA)
(RS)-Ethyl N,N-Dimethylphosphoramidocyanidate
* *
2,2',3,3',6,6'-Esaclorobifenile; PCB 136
ClCl
Cl
Cl
Cl
La tossicità differenziale dei PCB enantiomeri
-200
-150
-100
-50
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8
T eb (
°C)
NC
Teb n-alcani e isomeri = f(NC)
Mr(n) = 12.01115n + 1.00797(2n + 2)
Mr (uma)
-200,0
-150,0
-100,0
-50,0
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 T eb (
°C)
NC
Teb n-alcani = f(NC)
0 0,5
1 1,5
2 2,5
3
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
logT
eb (
K)
NC
log Teb = f(NC)
Ceb NkT log
Grafi chimici & indici topologici
Top
olo
gia
TOPOLOGIA = tópos, "luogo" e lógos, "studio"
È lo studio delle proprietà delle figure e delle forme che non
cambiano quando viene effettuata una deformazione senza
"strappi", "sovrapposizioni" o "incollature".
Topologia e previsione delle proprietà chimiche e fisiologiche
=
Topologia chimica Grafo chimico e grafo ridotto
Hp: le proprietà chimiche dipendono "dal modo in cui gli atomi sono connessi".
GRAFO CHIMICO RIDOTTO
Non hanno importanza:
- forma 3D della molecola,
- natura e lunghezza legami,
- angoli di legame,
- tipi di atomi nella molecola.
Lati (archi)
(a, b, c)
Vertici (nodi)
(1,2,3,4)
1 3 2
4
c
a b
Isobutano
Si dice grafo una coppia
ordinata G = (V, E) di insiemi,
con V insieme dei nodi
(vertici) ed E insieme degli
archi (lati), tali che gli
elementi di E siano coppie di
elementi di V.
2VEVVE che segueDa
Connected acyclic graphs (albero)
Grafi chimici_ esempi
Molecola Grafo chimico
Metano
Etano
Propano
Butano
…………… ……………………………………………………
2-Metilbutano (Isobutano)
1 2
3
5
4
A. Cayley, Philos. Mag., 1874, 47, 444-446, as quoted in N. L. Biggs, E. K. Lloyd and
R. J. Wilson, "Graph Theory 1736-1936", Clarendon Press, Oxford, 1976; Oxford
University Press, 1986,
In 1874 Cayley published a paper entitled “On the Mathematical Theory of
Isomers”, which represents the first serious chemical application of graph theory. He
introduced the terms plerogram and kenogram, which are the molecular graph and
the hydrogen-suppressed molecular graph respectively. If, further one continues to
delete atoms connected by a single link, one arrives to a mere kenogram, possibly
empty.
Derived from the Greek words πλήρης, pleres "full" and κενός, kenos "empty“
sprovvisto, vacante, spoglio, respectively.
Arthur Cayley (1821-1895) –In 1874 Cayley published a paper entitled “On the
Mathematical Theory of Isomers”, which represents the first serious chemical
application of graph theory. In this paper he introduced the concept of molecular
graph. Cayley’s intention was to solve the problem of alkane isomers, that is to find
a method by which the number NI(n) of distinct isomers of formula CnH2n+2 could
be determined. He,however, did not succeed.
Riproduzione dei kenogrammi
usati da Cayley (1874) nella
sua enumerazione dei radicali
alchilici.
The proof of the general validity of the formula CnH2n+2 was
first communicated in 1875 by the British mathematician
William Clifford
The general solution of the enumeration problem was obtained in
1935 by the Hungarian mathematician George Pòlya.
C80H162, NI(80) = 10 564 .476 906 946 .675 106 953 .415 600 016
A. Crum Brown (1864) "On
the Theory of Isomeric
Compounds," Transactions
of the Royal Society of
Edinburgh, 23 : 707–719.
Indice di Wiener (W) _ caratterizzazione delle ramificazioni
Proposto nel 1947 da Harry Wiener (Brooklin College), è basato sulla nozione
di distanza in un grafo: la distanza tra 2 vertici i e j di
un grafo è uguale al numero di lati che si devono
attraversare per andare da i a j percorrendo il cammino
più breve possibile attraverso il grafo.
Wiener, H. (1947), "Structural determination of paraffin boiling points", Journal of the American Chemical
Society 1 (69): 17–20.
Indici topologici = numeri che si calcolano in base alla sola
conoscenza del grafo di una molecola.
Indice di Wiener (W)_
2-Methylbutane
T = grafo del 2-Metilbutano (isopentano)
A
B
C
A 1 +
B 2 +
C 3 +
D
D 3 +
E
E 1 +
F
F 2 +
G
G 2 +
H 1 +
I 1 +
J 2 =
J
W = 18
d
c b a
Sommare i prodotti ottenuti
moltiplicando il n° di vertici (atomi di C)
presenti da ciascuna parte di ciascun
lato (leg. C-C, in questo caso: a,b,c,d).
W = a (1x4) + b (3x2) +
c (4x1) + d (1x4) =
W =18
Indice di Wiener (W)_2-Methylbutane
1
2
3
5
4
T = grafo del 2-Metilbutano
5
1
5
12
1
i jijTDW
MATRICE DELLE DISTANZE: Dato un grafo G con n vertici, la matrice
delle distanze D, è una matrice quadrata,
simmetrica n x n di eq:
ji
jidd
jiji
0
,,
MATRICE DELLE ADIACENZE A(G):
Dato un grafo G con n vertici, la
matrice delle adiacenze A, è una
matrice quadrata, simmetrica n x
n di eq:
GEeji
GEejia
ji
jiji
,
,,
0
1
1
2
3
5
4
T = grafo del 2-Metilbutano
J=1 J=2 J=3 J=4 J=5
i=1 0 1 0 0 0
i=2 1 0 1 0 1
i=3 0 1 0 1 0
i=4 0 0 1 0 0
i=5 0 1 0 0 0
A(T)=
Teb (n-alcani + isomeri) = f(W, NC) Un confronto!
0
100
200
300
400
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
T eb
n-a
lcan
i + is
om
eri
(K)
W -200
-150
-100
-50
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8
T eb
n-a
lcan
i + is
om
eri (
°C)
NC
Teb (n-alcani + isomeri) = f(W)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
T eb
n-a
lcan
i + is
om
eri
(K)
W
CH4
Etano
Propano
n-Butano
n-Pentano
n-Esano
n-Eptano
n-Ottano
W aumenta all’aumentare del NC
W assume il valore maggiore per l’alcano lineare rispetto ai suoi isomeri W, all’interno della stessa serie di isomeri, è sempre più piccolo più la molecola è compatta
logTeb = 0,1752logW + 2,2591
R² = 0,9934
2,2
2,25
2,3
2,35
2,4
2,45
2,5
2,55
2,6
0 0,5 1 1,5 2
log
Teb
log W
Teb (n-alcani + isomeri) = f(W)_ grafico doppio logaritmico
Etano
Propano
Butani
Pentani
Esani
Eptani
Indice di Randić (χ)
Milan Randić
Drake University,
Des Moines, Iowa.
National Institute
of Chemistry,
Ljubljana,
Slovenia.
Randić, M. (1975), "Characterization of molecular branching", Journal of the American Chemical Society 97 (23): 6609–6615
χ = somma dei
valori di tutti i lati del
grafo. 12
1
24
1
41
1
41
1
41
1
χ
56072,χ
2,2-Dimethylbutane
Grado di un vertice
del grafo = n° dei
vertici ai quali quel
vertice è collegato.
Valore del lato =
reciproco della radice
quadrata del prodotto
dei gradi dei due
vertici del lato. 41
1
41
1
24
1
12
1
41
1
c =
lati lati jiji
aac
1,
Tebn-alcani + isomeri = f(c) logTebn-alcani + isomeri = f(logc)
0 50
100 150 200 250 300 350 400 450
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00
T eb
n-a
lcan
i (K
)
χ
2,20 2,25 2,30 2,35 2,40 2,45 2,50 2,55 2,60 2,65
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 lo
gT e
b n
-alc
ani +
iso
me
ri
logc
99090R
2801254780T
2
eb
,
,χlog,log
Composti PBT (Persist., Bioacc., Tossici):
Coefficiente di ripartizione Kow
Come prevedere il potenziale di bioaccumulo?
Bio
accu
mu
lo
Dose di xenobiotico
assunta dall’acqua
Dose assunta
con gli alimenti
Dose eliminata
Accumulo totale da tutte le
possibili vie di assunzione
BCF = Cf/Cw
Cf ,Cw = mg/kg
Cf
Cw eq. sta
zio
nario
Bio
co
nce
ntr
azio
ne
25.000.000
2.800.000
835.000
45.000
500
250
Lago Ontario Lago Ontario
250
500
45.000
835.000
2.800.000
25.000.000
Bio
magn
ificazion
e PCBs-lago Ontario
INTERNATIONAL PROGRAMME ON CHEMICAL SAFETY
ENVIRONMENTAL HEALTH CRITERIA 152
POLYBROMINATED BIPHENYLS
(Br)3
(Br)3
Fries GF, Marrow GS, & Cook RM (1978a) Distribution and kinetics of PBB residues in cattle. Environ Health Perspect,
23: 43-50.
Fries GF, Cook RM, & Prewitt LR (1978b) Distribution of polybrominated biphenyl residues in the tissues of
environmentally contaminated dairy cows. J Dairy Sci, 61: 420-425.
PBB nel grasso corporeo
(ppm) P
BB
ne
l gra
sso
de
l lat
te
(p
pm
)
Xenobiotic_ Long Range Transport
POP = PCB, TCDD,
PAH, Cl-Pesticidi,
DDT, Lindano …
Altamente persistenti;
Semivolatili;
Liposolubili (elevato
Kow);
Latitudini basse evaporazione > deposizione
Latitudini alte Basse temperature;
Bassa irradiazione solare
deposizione > evaporazione
Degrad. e ritenz.
perman. Trasp.
oceanico
Distillazione
globale
AVERAGE LEVELS OF Hg IN THE BLOOD OF MOTHERS ACROSS THE CIRCUMPOLAR ARCTIC CANADIAN ARCTIC CONTAMINANTS ASSESSMENT REPORT II, HIGHLIGHTS – NORTHEN CONTAMINANTS PROGRAM
Minister of Indian Affairs and Northen Development, Ottawa, 2003
MERCURIO NEL SANGUE MATERNO INUIT
MERCURIO TROTA NORD CANADA
LEVELS OF Hg IN LAKE TROUT MUSCLE ACROSS THE CANADIAN NORTH CANADIAN ARCTIC CONTAMINANTS ASSESSMENT REPORT II, HIGHLIGHTS – NORTHEN CONTAMINANTS PROGRAM
Minister of Indian Affairs and Northen Development, Ottawa, 2003
CH3-Hg+ cordone ombelicale =f(T-Hg capelli)
* Anomalie congenite
* PARALISI
CEREBRALE
INFANTILE, un
disturbo persistente (non
progressivo) della postura
e del movimento dovuto ad
alterazioni della funzione
cerebrale infantile prima
che il SNC abbia
completato il suo sviluppo
* Altri disordini infantili
La placenta rimuove il
metilmercurio dal flusso
sanguigno della madre e
lo concentra nel feto!
Teratogenicità del metilmercurio: supera la
barriera placentare e provoca danni congeniti al feto
PCB e CLORDANO SANGUE MATERNO INUIT
AVERAGE LEVELS OF CHLORDANE AND PCBs IN MATERNAL BLOOD ACROSS THE CIRCUMPOLAR ARCTIC
CANADIAN ARCTIC CONTAMINANTS ASSESSMENT REPORT II, HIGHLIGHTS – NORTHEN CONTAMINANTS PROGRAM –
Minister of Indian Affairs and Northen Development, Ottawa, 2003
Octachloro-4,7-methanohydroindane
La capacità di accumulo di uno xenobiotico
(la sua lipofilicità) si determina con il
descrittore molecolare
Kow (coefficiente di ripartizione n-ottanolo/H2O).
Come prevedere il potenziale di Bioaccumulo
w
oow
C
CK
adimensionale
Struttura della membrana cellulare doppio foglietto fosfolipidico
Sostanze SVHC e Kow Cl
Cl
ClCl
Cl
PCB: log Kow = 6,41 2,2',4,4',5-Pentaclorobifenile
w
oow
C
CK
DDT: log Kow = 4.9 - 6.9
t1/2 = 2-15 anni
Cl Cl
ClClCl
DDE: log Kow = 6.51 (1,1-dicloro-2,2-bis(p-
diclorodifenil)etilene)
DDD: log Kow = 6.02 (1,1-dicloro-2,2-bis(p-
clorofenil)etano)
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH
log
D
Co
eff.
di d
istr
ib. D
= f
(pH
) OH
NH2
pKa1 = 4.4
OH
NH3+
O
NH2
pKa2 = 9.8
zwitterione
OH
NH3+
OH
NH2
OH
NH2
pKa2 = 9.8 pKa1 = 4.4
log K
ow
co
rre
cte
d =
log K
ow
pH +
log(1
+10
pH
-pK
a).
pH = pKa1
[1] =[2]
pH = pKa2
[2] =[3]
1 2 3
pI = (pKa1+pKa2)/2
Kow rosso metile
NN
COOHN
1
NN
COOHN
2
NN
COOHN
3
1
Met-
2
Et-
3
Prop-
H
2O
n
-esano
Valium
Heroin
Morphin
Kow (olive oil/water partition coefficient)
Bra
in u
pta
ke r
ate
(m
L/g
/min
)
Anestetici_ Correlazione di H. Meyer e C. E. Overton
MA
C (f
ract
ion
of
1 a
tm)
POTENZA
+
POTENZA
-
MAC = concentrazione minima alveolare di gas anestetico nel sangue ad una pressione di
1013 hPa alla quale il 50% dei pazienti non reagisce con il movimento ad una incisione della cute.
Hans Horst Meyer
(1853 – 1939) German pharmacologist.
Charles Ernest Overton
(1865–1933) British physiologist,
pioneer of cell membrane’s theory.
Veith G. D. , Call D. J., Brooke L.T., Structure-toxicity relationship for the fathead minnow, Pimephales promelas: narcotic
industrial chemicals, Ca. J. Fish Aquat. Sci., 1983, 40, 743-748. et al. (1979). Linear model based on fathead minnows
(Pimephales promelas) valid for log Kow < 6.
BCF = f(Kow)
log BCF = a + b log kow
y = y0 + k x
Fathead minnows
(Pimephales promelas)
(n = 55, r² = 0.90) for: log KOW < 6.
a
log
BC
F
log kow
b
a = - 0,7
b = 0,85
0
L = frazione lipidica
OWWF KLBCF /
L
BC
F
KOW
EC = f(Kow) Linear Free Energy Relationships (LFERs)
EC = (mol/L) Effective Conc. for inhibit microalgal photosynthesis by a factor 2
Ch
lam
yd
om
on
as
an
gu
losa
(Hu
tch
inson
et. a
l.
19
78
)
Ch
lore
lla
vu
lgaris
(H
utc
hin
son
et. a
l.
1978)
LC50 = f(Kow) Linear Free Energy Relationships (LFERs)
LC50 = (mol/L) Lethal Conc. for kill 50% of given populat. at t = 24h, 48h ….
Klipos/W = L-α-Dimyristoylphosphatidylcholine liposome/water
N+
OP
O
OO
OO
O O
Po
ecilia
retic
ula
ta (G
uppy,
rain
bow
fish), E
nvir. O
rg.
Chem
. 2° e
d. R
. P.
Schw
arz
enbach e
t. al., p
. 376
R2 = 0,99, N = 27
Veith G. D. , Call D. J., Brooke L.T., Structure-toxicity relationship for the fathead minnow, Pimephales promelas: narcotic industrial chemicals,
Ca. J. Fish Aquat. Sci., 1983, 40, 743-748. et al. (1979). Linear model based on fathead minnows (Pimephales promelas) valid for log Kow < 6.
LC50 = f(Kow)_ Predittività di composti congeneri ed eterogenei
Correlazione per 59 sostanze
di differenti classi chimiche:
alcooli, chetoni, eteri, cloruri
alchilici, benzeni.
Correlazione per 10 alcooli
alifatici (R2 = 0,999).
Trattato di farmacologia e terapia, Ecotossicologia, M. Vighi, E. Bacci, UTET, 1998, p. 90,
Relazione tra tossicità di composto organostannici su
Daphnia misurata e calcolata secondo l’equazione:
Trattato di farmacologia e terapia, Ecotossicologia, M. Vighi, E. Bacci, UTET, 1998, p. 90,
Come riconoscere l’attività mutagena?
TEST DI AMES:
Mutazione per
“Reversione”:
His- → His+
Si basa sulla valutazione della
capacità di un sospetto mutageno
di provocare la reversione di un
carattere auxotrofo his- in un
ceppo di batteri mutato (S.
typhimurium), rendendolo
nuovamente capace di
sopravvivere in un terreno privo di
istidina.
Test su batteri
Salmonella typhimurium: ceppi auxotrofi per alcuni aa, es: His-
Escherichia coli: ceppi lacZ- con
inattivato gene Z operone lattosio (lacZ461)
24-h nutrient broth cultures
S. typhimurium, Strain TA
1538 (ATCC e 29631).
La maggior parte dei ceppi di
Salmonella utilizzati nel test presentano
anche altre mutazioni che alterano la
permeabilità della parete (rfa-, elimina la
catena polisaccaridica dei
lipopolisaccaridi di membrana),
consentendo l'ingresso nel batterio di
mutageni anche di grosse dimensioni, o
eliminano l'azione dei meccanismi di
riparo del DNA (ΔuvrB, delezione del
gene uvrB), permettendo in tal modo il
mantenimento delle mutazioni ottenute.
NO2
Spot Test di Ames_ 2-nitrofluorene e tinte per capelli
Test di Ames ATTIVAZIONE METAB. PROMUTAGENI
FRAZIONE S9 OMOGENATO DI FEGATO
Enzimi microsomiali es.: citosolici, quali idrolasi ed enzimi responsabili della coniugazione epatica, ovvero
glutatione transferasi, glucuronato reduttasi, acetilasi, metil transferasi e zolfo transferasi.
Plate and spot Ames test
Furylfuramide
(-)-Aflatoxin B1
Colonie revertenti
spontanee
2-aminofluorene
NH2
O
O
O
OO
OH
H
O
O
O
O
OO
OH
H
O
Test di Ames
B. Ames, E. Gurney, et. al., “Carcinogens as Frameshift Mutagens: Metabolites and Derivatives of 2-Acetylaminofluorene and Other Aromatic Amine
Carcinogens”, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, Vol. 69, N° 11, pp.3128-3132, Nov. 1972
0
100
200
300
400
500
0 200 400 600 800 1000
N°
Co
lon
ie r
eve
rte
nti
/pia
stra
µg mutageno/piastra
N-Hydroxy-2-acetyl aminofluorene
2-Aminofluorene
NH2
Numero di colonie revertenti del ceppo TA1534 di S. typhimurium
per piastra di Petri in funzione della dose del mutageno. (ridisegnato)
2-nitrosofluorene
NO
Grazie per
l’attenzione!
