Upload
others
View
2
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
TESIS DOCTORAL
2017
NUEVOS MECANISMOS Y BIOMARCADORES DE LA
INTERACCIÓN DE LA VITAMINA A CON EL
METABOLISMO LIPÍDICO Y ENERGÉTICO Y SU PAPEL
EN LA PROGRAMACIÓN METABÓLICA
Andrea Arreguín Coronado
TESIS DOCTORAL
2017
Programa de Doctorado en Nutrigenómica
y Nutrición Personalizada
NUEVOS MECANISMOS Y BIOMARCADORES DE LA
INTERACCIÓN DE LA VITAMINA A CON EL
METABOLISMO LIPÍDICO Y ENERGÉTICO Y SU PAPEL
EN LA PROGRAMACIÓN METABÓLICA
Andrea Arreguín Coronado
Directores:
Dr. Joan Ribot Riutort y Prof. María Luisa Bonet Piña
Doctor por la Universitat de les Illes Balears
Los directores de Tesis Doctoral
Dr. Joan Ribot Riutort
Profesor Titular de Universidad
Bioquímica y Biología Molecular
Prof. María Luisa Bonet Piña
Catedrática de Universidad
Bioquímica y Biología Molecular
La interesada
Andrea Arreguín Coronado
Agradecimientos
“Ningún hombre, por más estudioso que sea,
le sobrevendrá nada más perfecto en la doctrina
que saberse doctísimo en la ignorancia”
Nicolás de Cusa
En primer lugar quiero agradecer de una manera muy especial a mis tutores, el Dr. Joan
Ribot Riutort y la Prof. María Luisa Bonet Piña. Al Dr. Joan por brindarme su confianza
y la oportunidad de aprender y crecer en el ámbito de la investigación. A la Prof. Luisa por
su ejemplo y constancia que son motivo de inspiración y entrega profesional. A ambos les
estoy enormemente agradecida por sus consejos, orientación, tiempo, dedicación y apoyo
para guiarme durante este trayecto. Han logrado que me sienta con más seguridad
profesional y con más gusto por la investigación.
Al Prof. Andreu Palou Oliver, por brindarme la oportunidad de integrarme en el Laboratorio
de Biología Molecular, Nutrición y Biotecnología de la UIB-CIBERobn, y a todos los profesores
de su equipo de trabajo por los consejos que me han dado durante estos años.
A la Lic. Enf. Claudia Elena González Acevedo, directora de la Facultad de Enfermería
y Nutrición de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí por el apoyo brindado para la
realización de mis estudios de doctorado.
Al Programa del Mejoramiento del Profesorado (PROMEP/103.5/13/5629) de la Secretaría de
Educación Superior del Gobierno de México por el financiamiento de mis estudios de postgrado, y
Gobierno de España, la fundación Ramón Areces y al Programa Marco 7 de Unión Europea
(proyectos DIABAT y BIOCLAIMS) por la financiación del proyecto de investigación de la tesis.
A todos mis compañeros de laboratorio por hacerme el trabajo más ameno y agradable y
por la ayuda prestada en todo momento. Especialmente a los que me brindaron sus consejos
y ayuda con el trabajo experimental.
A todos mis profesores que a lo largo de mi vida académica me han aportado todas las
habilidades y conocimientos que ahora dispongo. En especial a la Dra. Mariana Cifuentes
Köster que desde mi estancia en Chile me brindó su apoyo y motivación para adentrarme
al mundo de la investigación.
A mis incondicionales Mónica y Oso que siempre han estado conmigo. A Ailem, Pauli,
Dona, Shirley y todos mis amigos chilenos por creer en mí. A las personas que hicieron de
mi estancia más agradable y llevadera a Gemma, Carlos, Juanma, Laia, Natalia, Elisabeth,
vivimos momentos inolvidables. Y especialmente, a José Luis por ser lo mejor que me ha
dado Mallorca. A mis mejores compañeras de trabajo Nara y Andrea que siempre
estuvieron para escucharme, motivarme y aconsejarme, y brindarme su amistad que
siempre recordaré y sé que perdurará, logramos una hermandad chicas.
A mi familia por apoyarme, entenderme y confiar en mí siempre. Son el mejor regalo que
me ha dado la vida y por ustedes soy todo lo que soy. Los quiero.
Gracias
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
ix
Índice
Resum/Abstract/Resumen xi
Abreviaturas xv
1. Introducción 17
1.1. La vitamina A y el metabolismo de los retinoides 19
1.1.1. Mecanismos de acción de los retinoides 22
1.2. Actividad de la vitamina A en el control del metabolismo lipídico y
energético, la adiposidad corporal y la obesidad 23
1.2.1. Efectos de los retinoides en el tejido adiposo 25
1.2.2. Efectos de los retinoides en otros tejidos 27
1.3. Retinoides y biomarcadores metabólicos 27
1.3.1. Acilcarnitinas como biomarcadores: origen y significado
biológico 29
1.4. Retinoides y epigénetica 32
1.4.1. Mecanismos epigenéticos y programación metabólica 32
1.4.2. Los retinoides como agentes epigenéticos 34
2. Objetivo y Planteamiento Experimental 37
3. Materiales y Métodos 45
3.1. Estudios en animales 47
3.2. Estudio morfológico e inmunohistoquímico del tejido adiposo blanco
inguinal (TABi) de ratones 48
3.3. Obtención de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de
ratón 48
3.4. Análisis metabolómico en plasma y células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) 49
3.5. Aislamiento de la fracción celular estromal vascular (SVF) del tejido
adiposo y cultivo primario 49
3.6. Extracción de ácidos nucleicos 50
3.6.1. Extracción de ARN total 50
3.6.2. Extracción del ADN 51
3.6.3. Cuantificación y comprobación del estado del ARN y ADN 51
3.7. Análisis de ARNm por RT-qPCR a tiempo real 52
3.7.1. Retrotranscripción (RT) 52
3.7.2. qPCR a tiempo real 52
3.8. Contenido de ADN mitocondrial 55
3.9. Análisis de metilación de ADN por secuenciación con bisulfito 55
3.10. Análisis estadístico 56
4. Resultados y Discusión 60
4.1. Capítulo 1: Mecanismos y biomarcadores tisulares de la marronización
del tejido adiposo blanco inducida por ácido retinoico 60
4.1.1. Antecedentes 61
4.1.2. Resultados 62
4.1.3. Discusión 81
4.1.4. Conclusiones 82
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
x
4.2. Capítulo 2: Biomarcadores metabólicos circulantes de la acción del
ácido retinoico: estudio in vivo 85
4.2.1. Antecedentes 87
4.2.2. Resultados 88
4.2.3. Discusión 97
4.2.4. Conclusiones 107
4.3. Capítulo 3: Efectos nutriepigenéticos en el tejido adiposo de la
suplementación con vitamina A preformada o -caroteno durante la
lactancia 111
4.3.1. Antecedentes 113
4.3.2. Resultados 115
4.3.3. Discusión 127
4.3.4. Conclusiones 133
5. Recapitulación 151
6. Conclusiones 161
7. Referencias 165
Tesi Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
Universitat de les Illes Balears, 2017 xi
Resum
Nous mecanismes i biomarcadors de la interacció de la vitamina A amb el
metabolisme lipídic i energètic i el seu paper en la programació metabólica
Els factors nutricionals a l’edat adulta i en etapes primerenques de la vida poden
condicionar el desenvolupament de la obesitat i malalties metabòliques. El nostre grup ha
estat pioner en l'estudi de l'activitat biològica de les formes actives de la vitamina A
(retinoids) i carotenoids provitamina A en relació al control de l'adipositat corporal i la salut
metabòlica, que apunta una acció antiobesogènica. L'objectiu principal de la present tesi ha
estat aprofundir en la interacció de la vitamina A amb el metabolisme energètic i el
desenvolupament del teixit adipós i els seus mecanismes, incloent mecanismes epigenètics
possiblement relacionats amb la programació metabòlica, i identificar nous biomarcadors
d'aquesta interacció. Per a això hem utilitzat diferents dissenys experimentals: a) ratolins
adults tractats amb àcid retinoic tot-trans (ATRA) o vehicle per via subcutània; b) cultius
primaris d'adipòcits exposats a ATRA i altres estímuls; i c) cries de rata suplementades amb
un excés moderat de vitamina A en forma de retinil palmitat o -carotè durant l'etapa de
lactància.
Els resultats mostren que el tractament amb ATRA va incrementar la capacitat funcional
oxidativa de les mitocòndries en el teixit adipós blanc (TAB) de ratolí i va afavorir
l'adquisició de certs marcadors de marronització o d'adipòcits beix/BRITE, incloent
l'expressió gènica de UCP1 i Cd137, encara que altres marcadors van mostrar una utilitat
limitada i va haver-hi variacions intrínseques entre els diferents dipòsits de greix (visceral
i subcutani). Aquests efectes de l'ATRA podrien ser deguts en part a mecanismes d'acció
indirectes, a través de la inducció de la IRISINA d'origen hepàtic i del propi teixit adipós.
Basant-nos en els resultats dels estudis en cultiu primari i en animals adults, identifiquem
la ràtio entre l'expressió de Rarb i Rxrg com un nou marcador transcripcional en teixit de
marronització i activació metabòlica del TAB. D'altra banda, el tractament amb ATRA va
afectar els nivells de diferents metabòlits circulants: alguns canvis podrien reflectir
l'activació de la mobilització i oxidació tissular de lípids (e.g., acilcarnitinas), mentre que
altres podrien jugar un paper més actiu o causal. L'anàlisi metabolòmic realitzat ens va
permetre identificar diversos marcadors plasmàtics d'activació del teixit adipós marró i
d'activació metabòlica del TAB, particularment el visceral. La suplementació amb vitamina
A durant la lactància va induir canvis en l'estat de metilació de l'ADN en el teixit adipós
inguinal en regions reguladores de gens relacionats amb la proliferació cel·lular, la
diferenciació i determinació adipogénica i la termogènesi, i de manera diferencial quan es
va administrar com a retinil palmitat o -carotè. Els efectes observats podrien ser deguts a
diferències en fenòmens de programació de les característiques i respostes del TAB en
etapes posteriors de la vida.
El coneixement de compostos actius en la programació metabòlica i en l'optimització de la
funció mitocondrial del teixit adipós, així com la disponibilitat de nous marcadors de la
mateixa, és d'interès ja que pot contribuir a noves estratègies de control de la obesitat i les
seves comorbiditats.
Doctoral Thesis
Andrea Arreguín Coronado
xii Universitat de les Illes Balears, 2017
Abstract
New mechanisms and biomarkers of the interaction of vitamin A with lipid and energy
metabolism and their role in metabolic programming
Nutritional factors in adulthood and in early stages of life can condition the development
of obesity and metabolic diseases. Our group has been a pioneer in the study of the
biological activity of the active forms of vitamin A (retinoids) and provitamin A
carotenoids in relation to body adiposity control and metabolic health, which points to an
antiadiposity action. The main objective of this thesis has been to further understand the
interaction of vitamin A with energy metabolism and the development of adipose tissue
and its mechanisms, including epigenetic mechanisms possibly related to metabolic
programming, and to identify new biomarkers of this interaction. To achieve this we have
used different experimental designs: a) adult mice treated subcutaneously with all-trans
retinoic acid (ATRA) or vehicle; b) primary cultures of adipocytes exposed to ATRA and
other stimuli; and c) rat pups supplemented with moderate excess of vitamin A in the form
of retinyl palmitate or -carotene during the lactation stage.
Our results show that ATRA treatment increased the functional capacity of the
mitochondria in mouse white adipose tissue (WAT) and favored the acquisition of markers
of beige/BRITE adipocytes, including the gene expression of Ucp1 and Cd137. Other
markers showed limited utility and there were intrinsic variations between the different fat
depots (visceral and subcutaneous). These effects of ATRA may result in indirect
mechanisms of action, through the induction of IRISINE of hepatic origin and of the
adipose tissue itself. In accordance to the results of studies in primary culture and adult
animals, we identified the ratio between Rarb and Rxrg expression as a new transcriptional
marker in the browning process and metabolic activation WAT. Moreover, treatment with
ATRA affected the levels of a whole series of circulating metabolites: some changes may
reflect the activation of tissue mobilization and oxidation of lipids (eg acylcarnitines), while
others may play a more active or causal role. The metabolomic analysis allowed us to
identify several plasma markers of brown adipose tissue activation and metabolic activation
of WAT, particularly visceral WAT. Vitamin A supplementation during lactation induced
changes in the state of DNA methylation in inguinal adipose tissue in regulatory regions of
genes related to cell proliferation, differentiation and adipogenic determination and
thermogenesis, and differently when administered as retinyl palmitate or -carotene. The
observed effects underlie the differences in the programming phenomena of the
characteristics and responses of WAT in the later stages of life.
Knowledge of active compounds in metabolic programming and in the optimization of the
mitochondrial function of adipose tissue, as well as the availability of new biomarkers, is
of great interest and may contribute to new strategies for obesity control and its
comorbidities.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
Universitat de les Illes Balears, 2017 xiii
Resumen
Nuevos mecanismos y biomarcadores de la interacción de la vitamina A con el
metabolismo lipídico y energético y su papel en la programación metabólica
Factores nutricionales en edad adulta y en etapas tempranas de la vida pueden condicionar
el desarrollo de obesidad y enfermedades metabólicas. Nuestro grupo ha sido pionero en el
estudio de la actividad biológica de formas activas de la vitamina A (retinoides) y
carotenoides provitamina A en relación con el control de la adiposidad corporal y la salud
metabólica, que apunta a una acción antiobesogénica. El objetivo general de la presente
tesis ha sido profundizar en la interacción de la vitamina A con el metabolismo energético
y el desarrollo del tejido adiposo y sus mecanismos, incluyendo mecanismos epigenéticos
posiblemente relacionados con la programación metabólica, e identificar nuevos
biomarcadores de esta interacción. Para ello hemos utilizado diferentes diseños
experimentales: a) ratones adultos tratados con ácido retinoico todo-trans (ATRA) o
vehículo por vía subcutánea; b) cultivos primarios de adipocitos expuestos a ATRA y otros
estímulos; y c) crías de rata suplementadas con un exceso moderado de vitamina A en forma
de retinil palmitato o -caroteno durante la etapa de lactancia.
Los resultados muestran que el tratamiento con ATRA incrementó la capacidad funcional
oxidativa de las mitocondrias en el tejido adiposo blanco (TAB) de ratón y favoreció la
adquisición de ciertos marcadores de marronización o de adipocitos beige/BRITE,
incluyendo la expresión génica de Ucp1 y Cd137, si bien otros marcadores mostraron una
utilidad limitada y hubo variaciones intrínsecas entre los diferentes depósitos de grasa
(visceral y subcutánea). Estos efectos del ATRA podrían resultar en parte de mecanismos de
acción indirectos, a través de la inducción de la IRISINA de origen hepático y del propio
tejido adiposo. Basándonos en los resultados de los estudios en cultivo primario y en animales
adultos, identificamos la ratio entre la expresión de Rarb y Rxrg como un nuevo marcador
transcripcional en tejido de marronización y activación metabólica del TAB. Además, el
tratamiento con ATRA afectó los niveles de toda una serie de metabolitos circulantes:
algunos cambios reflejarían la activación de la movilización y oxidación tisular de lípidos
(e.g., acilcarnitinas), mientras que otros podrían jugar un papel más activo o causal. El
análisis metabolómico realizado nos permitió identificar varios marcadores plasmáticos de
activación del tejido adiposo marrón y activación metabólica del TAB, especialmente el
visceral. La suplementación con vitamina A durante la lactancia indujo cambios en el estado
de metilación del ADN en el tejido adiposo inguinal en regiones reguladoras de genes
relacionados con la proliferación celular, la diferenciación y determinación adipogénica y la
termogénesis, y de manera diferencial cuando se administró como retinil palmitato o -
caroteno. Los efectos observados podrían subyacer a diferencias en fenómenos de
programación de las características y respuestas del TAB en etapas posteriores de la vida.
El conocimiento de compuestos activos en la programación metabólica y en la optimización
de la función mitocondrial del tejido adiposo, así como la disponibilidad de nuevos
marcadores de la misma, es de interés ya que puede contribuir a nuevas estrategias de
control de la obesidad y sus comorbilidades.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
xiv
Contribución personal a cada capítulo
Capítulo 1: Mecanismos y biomarcadores tisulares de la marronización del tejido
adiposo blanco inducida por ácido retinoico. Llevé a cabo el manejo de animales
(seguimiento de la ingesta y el peso y colaboración en el sacrificio). Realicé la extracción
de ARN de los distintos depósitos de tejido adiposo diseccionados (marrón y blanco
inguinal, epididimal y retroperitoneal). Diseñé cebadores y analicé la expresión de genes
relacionados con la marronización y función mitocondrial en estos tejidos. Además, realicé
la extracción de ADN total de estos tejidos para la cuantificación de la ratio entre el ADN
mitocondrial y el nuclear. Participé en el análisis y representación gráfica de los resultados,
incluyendo el análisis estadístico.
Capítulo 2: Biomarcadores metabólicos circulantes de la acción del ácido retinoico:
estudio in vivo. En colaboración con otros autores, analicé la expresión en PBMCs de genes
relacionados con el metabolismo lipídico y energético cuya expresión se sabe alterada en
el hígado y el tejido adiposo en animales tratados con ácido retinoico. Participé en el
análisis, interpretación y representación gráfica de los resultados de expresión génica y
metabolómicos, incluyendo el análisis estadístico.
Capítulo 3: Efectos nutriepigenéticos en el tejido adiposo de la suplementación con
vitamina A preformada o β-caroteno durante la lactancia. En colaboración con otros
autores, realicé la extracción de ADN del tejido adiposo inguinal. Diseñé cebadores y
analicé el estado de metilación de promotores génicos seleccionados utilizando la
secuenciación por bisulfito. Participé en el análisis, interpretación y representación gráfica
de los resultados, incluyendo el análisis estadístico.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
xv
Abreviaturas
AAA: aromatic amino acids, aminoácidos aromáticos
Actb: beta-actin, beta actina
AP1: activator protein 1, proteína activadora 1
ACOX: acyl-coenzyme A oxidase, acil-coenzima A oxidasa
ATRA: all-trans retinoic acid, ácido retinoico todo-trans
ATP5F1: ATP Synthase, H+ Transporting, Mitochondrial Fo Complex Subunit B1, ATP
sintasa subunidad b, mitocondrial
ARAT: acyl-CoA-retinol-acyltransferase, acilCoA-retinol aciltransferasa
AR: retinoic acid, ácido retinoico
BCAA: branched chain amino acids, aminoácidos de cadena ramificada
BC: -carotene, -caroteno
BCO1: -carotene 15,15’-oxygenase 1, -caroteno 15,15’-oxigenasa
CD36: cluster of differentiation 36, transportador de ácidos grasos CD36
CD137: Tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member 9, miembro de
superfamilia del receptor de TNF9
C/EBPs: CCAAT-enhancer-binding proteins, proteínas de unión al potenciador CCAAT
COX: cytochrome c oxidase, citocromo c oxidasa
CPT: carnitine palmitoyltransferase, carnitina palmitoil transferasa
CRABPs: cellular retinoic acid binding proteins, proteínas celulares de unión a ácido
retinoico
CRBPs: cellular retinol binding proteins, proteinas celulares de unión a retinol
CYP26: cytochrome P450, citocromo P450
DNMTs: DNA methyltransferasea, ADN metiltransferasas
DHA: docosahexaenoic acid, ácido docosahexaenoico
EPA: eicosapentaenoic acid, ácido eicosapentaenoico
FABP5: fatty acid binding protein 5, proteína 5 de unión a ácido graso
FASN: fatty acid synthase, sintasa de ácidos grasos
FNDC5: fibronectin type III domain containing 5
FXR: farnesoid X receptor, receptor de farnesoide X
GNMT: glycine N-methyltransferase, N-glicina metiltransferasa
HOXC9: homeobox C9, proteína homeobox C9
LDLr: low density lipoprotein receptor, receptor de lipoproteínas de baja densidad
LPL: lipoprotein lipase, lipoproteina lipasa
LRAT: lecithin retinol acyltransferase, lecitina retinol aciltransferasa
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
xvi
LXRs: liver X receptor, receptores X hepáticos
NA: noradrenaline, noradrenalina
PCNA: proliferating cell nuclear antigen, antígeno nuclear de células proliferativas
PBMCs: peripheral blood mononuclear cells, células mononucleares de sangre periférica
PPARs: peroxisome proliferator-activated receptors, receptores activados por
proliferadores de peroxisomas
p38 MAPK: p38 mitogen-activated protein kinase, proteína quinasa activada por
mitógenos p38
RARs: retinoic cid receptors, receptores de acido retinoico
RARE: retinoic acid response element, elemento de respuesta a ácido retinoico
RALDH: retinaldehyde dehydrogenase, retinaldehído deshidrogenasa
RBP (RBP4): retinol binding protein, proteina de union a retinol
RDH: retinol dehydrogenase, retinol deshidrogenasa
RE: retinyl ester, éster de retinilo
REH: retinyl ester hydrolase, retinil ester hidrolasa
RXRs: retinoic X receptors, receptores X de retinoides
SAM: S-adenosyl methionine, S-adenosil metionina
SLC27A1: solute carrier family 27 (fatty acid transporter), member 1, miembro 1 de la
familia 27 de transportadores de solutos
STRA6: stimulated by retinoic acid 6, estimulada por ácido retinoico 6 (receptor de RBP)
SVF: fracción estromal vascular
TAB: tejido adiposo blanco
TAM: tejido adiposo marrón
TBX1: T-box transcription factor 1, proteína T-box 1
TR: thyroid hormone receptor, receptor de hormonas tiroideas
TMEM26: transmembrane protein 26, proteína trasnmembrana 26
TFB2M: transcription factor B2, mitochondrial, factor de transcripción mitocondrial B2
UCP1: uncoupling protein 1, proteína desacoplante 1
UCP2: uncoupling protein 2, proteína desacoplate 1
VDR: vitamin D receptor, receptores de vitamina D
YY1: YY1 transcription factor, factor de transcripción YY1
ZFP423: zinc finger protein 423, proteína zinc-finger 423
1. Introducción
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
18
Introducción
19
1.1. La vitamina A y el metabolismo de los retinoides
La vitamina A es un micronutriente liposoluble esencial para los seres humanos y otros
vertebrados que comprende un grupo de compuestos naturales relacionados estructural y
bioquímicamente con el retinol. Las diferentes formas activas de la vitamina A, más sus
metabolitos y análogos sintéticos, se denominan colectivamente retinoides. Estos se
definen como compuestos formados por cuatro unidades isoprenoides unidas cabeza con
cola. La estructura básica de un retinoide se compone de tres partes: un anillo ciclohexano
trimetilado hidrofóbico, una cadena lateral tetraeno conjugada y un grupo terminal polar
con un estado de oxidación que puede variar, siendo un grupo hidroxilo en el retinol,
aldehído en el retinal y carboxilo en los ácidos retinoicos, como se muestra en la Figura 1.1
(Das et al., 2014; de Oliveira et al., 2015).
Figura 1.1. Estructura de los retinoides. Adaptado de (Das et al., 2014).
Los retinoides son importantes para una gran variedad de funciones fisiológicas, entre ellas
la reproducción, la embriogénesis, la visión, el crecimiento, la diferenciación y
proliferación celular, el mantenimiento de la integridad de los epitelios y la función inmune
(Blomhoff and Blomhoff, 2006; von Lintig, 2010). Como se introducirá más adelante, más
recientemente se ha relacionado a la vitamina A con el control del metabolismo lipídico y
energético y la adiposidad corporal en mamíferos. Las formas biológicamente activas de la
vitamina A incluyen el cis y el trans retinol, el retinal todo-trans y 11-cis y el ácido retinoico
(AR) todo-trans y 9-cis, entre otros (Rhee and Plutzky, 2012). Clásicamente, el retinol,
además de ser el precursor de los demás retinoides, ha sido relacionado con la fertilidad, el
retinal (también llamado retinaldehído) con la visión y el AR con la regulación de la
expresión génica (véase el apartado 1.1.2). En la Figura 1.2 se representan las principales
formas activas de la vitamina A y sus interconversiones.
El metabolismo de los retinoides es muy complejo y altamente especializado e incluye la
acción de diferentes enzimas y proteínas intra y extracelulares de unión a retinoides
(D'Ambrosio et al., 2011; Gottesman et al., 2001; Harrison, 2012; Theodosiou et al., 2010).
Estas proteínas de unión ayudan a la solubilización de los retinoides en medio acuoso y
permiten dirigir los diferentes retinoides hacia las enzimas que los metabolizan u otras
dianas celulares particulares. En la Figura 1.3 se presenta un esquema del metabolismo de
la vitamina A.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
20
Figura 1.2. Estructura química de los principales retinoides naturales biológicamente activos.
Adaptado de (Bonet et al., 2003).
La vitamina A se obtiene de la dieta, en la que se encuentra principalmente en forma de
retinol o ésteres de retinilo y de carotenoides provitamina A, sobre todo el β-caroteno, que
se derivan de fuentes animales y vegetales, respectivamente. Después del consumo, el
retinol dietético, los ésteres de retinilo y los carotenoides son liberados de la matriz del
alimento. La absorción de estos micronutrientes liposolubles se produce en el tracto
gastrointestinal superior de forma similar a la de otros lípidos dietéticos, después de la
dispersión micelar de la grasa de la dieta en el estómago y el duodeno (de Oliveira et al.,
2015). En los enterocitos, los ésteres de retinilo son hidrolizados por acción de la enzima
retinil ester hidrolasa (REH) para dar retinol, y parte del β-caroteno dietético es escindido
centralmente por la enzima β-caroteno 15,15’-oxigenasa (BCO1) en dos moléculas de
retinal, que a su vez es reducido a retinol por acción de enzimas deshidrogenasas. La
absorción intestinal del β-caroteno y su conversión en retinoides en los enterocitos es
dependiente del estatus en vitamina A, merced a un mecanismo de retroalimentación
negativa que implica la inducción por AR en los enterocitos de ISX; este es un factor de
transcripción específico del intestino delgado que inhibe la expresión de la enzima BCO1
y del receptor implicado en la absorción intestinal del β-caroteno (Lobo et al., 2010). El
retinol en los enterocitos se une a una proteína celular de unión (CRBP) y en esta forma es
sustrato para enzimas que catalizan su esterificación a un ácido graso, como la lecitina
retinol aciltransferasa (LRAT) y otras aciltransferasas. Los ésteres de retinilo resultantes,
junto con carotenoides intactos, son incorporados en los quilomicrones, que se secretan en
la linfa para pasar después a la circulación general.
Gran parte de la vitamina A de la dieta llega al hígado mediante endocitosis de los
quilomicrones remanentes que resultan de la hidrólisis de los quilomicrones circulantes por
la enzima lipoproteína lipasa (LPL). El hígado es el principal reservorio de vitamina A, en
forma de ésteres de retinilo. El retinol hepático puede ser movilizado y pasa a la circulación
unido a la proteína de unión a retinol RBP (también conocida como RBP4), a la que se le
une otra proteína, la transtiretina (TTR). La unión de la TTR impide la eliminación de los
complejos retinol-RBP por el riñón (RBP es una proteína muy pequeña). Los tejidos
Introducción
21
extrahepáticos toman el retinol de los complejos retinol-RBP-TTR: en este proceso
interviene, al menos en algunos tejidos, la proteína de la membrana plasmática STRA6
(estimulada por ácido retinoico 6), que es un receptor de alta afinidad para la RBP (Das et
al., 2014). Algunos tejidos periféricos, incluyendo el tejido adiposo, también pueden captar
el retinol de los ésteres de retinilo contenidos en las lipoproteínas circulantes, tras su
hidrólisis catalizada por la LPL (Theodosiou et al., 2010). El tejido adiposo es un reservorio
importante de vitamina A y puede, como el hígado, exportar retinol a la circulación unido
a RBP.
Figura 1.3. Metabolismo de la vitamina A en los adipocitos. Adaptado de (Bonet et al., 2003).
Abreviaturas: 9cRA, ácido 9-cis retinoico; tRA, ácido retinoico todo-trans; CRABP, proteína
celular de unión a ácido retinoico; CRBP, proteína celular de unión a retinol; LPL, lipoproteína
lipasa; NR, receptor nuclear hormonal; RAR, receptor de ácido retinoico; RXR, receptor rexinoide;
RBP, proteína de unión a retinol.
Después de entrar en las células, el retinol se une a la CRBP y unido a esta proteína es
transformado en ésteres de retinilo (por acción de la LRAT) u oxidado a retinaldehído (por
acción de la retinol deshidrogenasa, RDH, o de alcohol deshidrogenasas).
Subsiguientemente, el retinaldehído puede ser oxidado irreversiblemente a la forma
carboxílica, el AR, por acción de la retinaldehído deshidrogenasa (RALDH, también
llamada aldehído deshidrogenasa, ALDH). El AR se une a las proteínas celulares de unión
a ácido retinoico (CRABPs) o a la proteína 5 de unión de ácidos grasos (FABP5), que están
involucradas en el transporte del AR al núcleo y la transferencia del AR a receptores
nucleares específicos que mediarán efectos genómicos (véase el apartado 1.1.1). Dentro de
las células, el AR puede ser convertido en catabolitos oxidados inactivos, tales como ácido
4-hidroxi-retinoico y ácido 4-oxo retinoico, por enzimas de la superfamilia citocromo P450
(como CYP26A1) (Das et al., 2014).
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
22
La eficiencia de la escisión intestinal del β-caroteno en retinoides depende de la especie.
Las ratas adultas y ratones son muy eficientes, mientras que los seres humanos y otros
mamíferos como los caballos y los hurones lo son mucho menos. En las especies menos
eficientes, una cantidad sustancial del β-caroteno absorbido (aproximadamente del 17% al
45%) escapa a la escisión intestinal, es incorporado en los quilomicrones y viaja asociado
a lipoproteínas circulantes. Los carotenoides (dietéticos o contenidos en las lipoproteínas
circulantes) son captados por las células a través de receptores específicos de lipoproteínas
‒ tales como SR-BI (que es el receptor de las HDL), el receptor de lipoproteínas de baja
densidad (LDLr) o la misma LPL ‒ o el receptor de ácidos grasos CD36 (Shete and Quadro,
2013). El hígado, el tejido adiposo, el riñón, la piel y los pulmones son los principales sitios
de acumulación de β-caroteno y carotenoides en general (Shete and Quadro, 2013). Las
enzimas del metabolismo de carotenoides ‒ la ya citada BCO1 y la β-caroteno 9',10'-
oxigenasa (BCO2) ‒ se expresan en muchos tejidos, además de los enterocitos. BCO1
cataliza la rotura central del β-caroteno y algunos otros carotenoides provitamina A (-
caroteno, β-criptoxantina), para dar retinal. BCO2 cataliza la rotura excéntrica del β-
caroteno y de otros muchos carotenoides incluyendo licopeno y xantofilas para dar
apocarotenoides distintos de los retinoides, cuya actividad biológica es todavía mal
conocida (von Lintig, 2010).
1.1.1. Mecanismos de acción de los retinoides
Los retinoides son ligandos para factores de transcripción específicos que pertenecen a la
superfamilia de los receptores nucleares. Se han identificado dos clases distintas de
receptores de retinoides, los RARs (retinoic acid receptors) y los RXRs (retinoid X
receptors). Cada clase se compone de tres subtipos diferentes (α, β y ), cada subtipo
codificado por un gen distinto. El ácido retinoico todo-trans (ATRA) es el ligando natural
(endógeno) de los RAR. Su isómero cis, el ácido 9-cis-retinoico, puede activar tanto a los
RAR como a los RXR, al menos in vitro, y se ha venido considerando el ligando endógeno
natural de los RXR. No obstante esto último se ha puesto en duda, lo mismo que la propia
presencia de ácido 9-cis-retinoico en muchos tejidos, en los que no se detecta; la excepción
es el páncreas, en donde sí está presente (Zhang et al., 2015).
Más de 500 genes responden a ATRA o ácido retinoico 9-cis (Balmer and Blomhoff, 2002).
La expresión de la mayoría de genes diana de retinoides está controlada por heterodímeros
RAR:RXR; unos pocos genes están controlados por homodímeros RXR:RXR. Los dímeros
RAR:RXR y RXR:RXR reconocen secuencias específicas de ADN, que se denominan
elementos de respuesta a ácido retinoico (RAREs) y elementos de respuesta a retinoide X
(RXRE), respectivamente, ubicadas en regiones reguladoras de los genes diana
(promotores, enhancers). La unión de sus ligandos específicos permite que estos factores
de transcripción puedan disociarse de correpresores y pasar a reclutar coactivadores
transcripcionales, que ayudan al ensamblaje de la maquinaria general de transcripción sobre
el promotor mínimo del gen diana.
Además de lo anterior, los retinoides afectan la expresión génica por mecanismos
adicionales (Al Tanoury et al., 2013; Bonet et al., 2012; Zhang et al., 2015):
Introducción
23
- Además de activar a los RARs canónicos, se ha descrito que ATRA es un ligando
agonista de otro factor de transcripción de la superfamilia de receptores nucleares, el
PPAR/, que es un miembro de la subclase de receptores activados por proliferadores
de peroxisomas (PPARs). PPAR/ activa la transcripción de genes relacionados con la
oxidación de ácidos grasos y el metabolismo de la glucosa (Zhang et al., 2015). Se ha
aportado evidencia de que, dentro de las células, el ATRA unido a CRABPs es
transferido a RARs, y el unido a FABP5, al PPAR/ (Schug et al., 2007).
- Los receptores de retinoides activados por ligando pueden interferir con la actividad
de otros factores de transcripción tales como el factor nuclear B, la proteína activadora
1 (AP1) o las proteínas de unión al potenciador CCAAT (C/EBPs), lo que explicaría
buena parte de los efectos anti-inflamatorios, anti-proliferativos y anti-adipogénicos
descritos para los retinoides.
- Los RXRs son socios de dimerización obligatorios de muchos otros receptores
nucleares además de los RAR, tales como los PPARs (PPAR, PPAR y PPAR/), los
receptores X hepáticos (LXRs), el receptor de vitamina D (VDR), el receptor de
farnesoides X (FXR) y el receptor de hormonas tiroideas (TR). Algunos de estos
heterodímeros incluyendo PPAR:RXR se activan en respuesta a los respectivos
ligandos de ambos monómeros constituyentes, lo que proporciona un mecanismo para
efectos generalizados de los retinoides sobre la expresión génica (Aranda and Pascual,
2001).
Por otro lado, los retinoides tienen efectos genómicos y extra-genómicos que se derivan de
su capacidad (mediada o no por RARs) de activar importantes proteína quinasas
reguladoras, como la proteína quinasa activada por mitógenos p38 (p38 MAPK) y otras, y
de la reitoinilación de proteínas celulares por unión covalente a las mismas de AR, entre
otros mecanismos (Al Tanoury et al., 2013; Bonet et al., 2012; Zhang et al., 2015).
Otros retinoides distintos del ATRA, como el retinaldehído, así como derivados de
carotenoides diferentes de los retinoides (por ejemplo, apocarotenoides resultado de la
rotura excéntrica por BCO2) pueden interaccionar asimismo con receptores nucleares, para
promover o antagonizar, según el caso, la acción de estos factores de transcripción sobre
sus genes diana. Incluso moléculas intactas de carotenoides parecen ser capaces de
interactuar físicamente con receptores nucleares afectando su actividad transcripcional: en
particular, la astaxantina podría comportarse como un ligando antagonista del PPAR y la
-criptoxantina, como un ligando agonista de RAR (revisado en (Bonet et al., 2015)).
1.2. Actividad de la vitamina A en el control del metabolismo lipídico y energético, la
adiposidad corporal y la obesidad
La obesidad se define como un exceso de masa grasa resultado de un balance energético
positivo sostenido (más energía consumida que gastada), que conduce a una expansión
anormalmente grande de los depósitos grasos, ya sea por un almacenamiento excesivo de
energía en gotas de lípidos en los adipocitos, con aumento del tamaño de estos (obesidad
hipertrófica), y/o por el aumento de la adipogénesis, que conduce a un incremento del
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
24
número de adipocitos (obesidad hiperplásica) (Rutkowski et al., 2015). La cantidad y
distribución de la grasa corporal son factores determinantes de la susceptibilidad a muchos
trastornos metabólicos, siendo la grasa visceral especialmente deletérea, más que la
subcutánea, que podría incluso tener un efecto protector (Bays, 2011).
En los últimos años se ha consolidado el concepto de que, además de sus funciones clásicas,
la vitamina A, principalmente en forma de AR, participa en el control del metabolismo y
el balance energético en mamíferos, con implicaciones para la adiposidad corporal, la
obesidad y sus secuelas (Brun et al., 2013; Jeyakumar and Vajreswari, 2015; Zhang et al.,
2015). Esta es una línea de investigación en la que nuestro grupo de Nutrigenómica y
Obesidad de la UIB ha sido pionero y a la que ha hecho numerosas aportaciones, incluyendo
varias revisiones (Bonet et al., 2003; Bonet et al., 2012; Bonet et al., 2015). En general,
diversos resultados experimentales y epidemiológicos que se relacionan a continuación
apuntan a una acción anti-adiposidad de la vitamina A y el -caroteno, que vendría mediada
por retinoides como el ATRA:
- El tratamiento con ATRA exógeno contrarresta el desarrollo de obesidad inducida por la
dieta en ratones y reduce el peso y la adiposidad corporal en ratones obesos y no obesos, a
la vez que mejora el perfil lipídico y la sensibilidad a la insulina.
- La suplementación crónica de la dieta con -caroteno reduce la adiposidad corporal en
ratones de genotipo salvaje pero no en ratones genoanulados carentes de BCO1. Esto estaría
de acuerdo con un efecto anti-adiposidad de los retinoides derivados de la acción de la
BCO1 sobre el -caroteno.
- En estudios en animales, una dieta deficiente en vitamina A se ha asociado a una mayor
adiposidad corporal, mientras que, en el otro extremo, la suplementación de la dieta con
vitamina A en forma de retinil éster se ha asociado a una adiposidad reducida en algunos
estudios, aunque no en otros.
- Modelos dietéticos y genéticos de obesidad en ratones presentan una deficiencia en
vitamina A (retinol) en tejidos (pero no plasma) y una menor señalización transcripcional
por vitamina A en tejidos (Trasino et al., 2015).
- En humanos, numerosos estudios epidemiológicos han encontrado niveles reducidos de
carotenoides circulantes en la obesidad/sobrepeso y el síndrome metabólico. Es más, se ha
reportado que los niveles de -caroteno están reducidos no sólo en plasma sino también en
los adipocitos de humanos obesos (Osth et al., 2014).
- También hay estudios en humanos que asocian ingestas dietéticas altas de vitamina A y
carotenoides con una menor adiposidad corporal.
- Aunque no esté claro que los niveles endógenos (circulantes y en los tejidos) de ATRA
guarden una relación directa con el estatus en vitamina A, es de destacar que se ha
identificado el ATRA circulante como un factor protector frente al desarrollo del síndrome
metabólico en humanos (Liu et al., 2016).
- Para carotenoides específicos, entre ellos el β-caroteno y la β-criptoxantina, ambos con
actividad de provitamina A, se ha postulado una acción anti-obesidad a partir de los
Introducción
25
resultados de estudios experimentales y estudios piloto de intervención en humanos obesos.
En conjunto, se sugiere que una ingesta pobre en vitamina A/carotenoides super-impuesta
a una dieta obesogénica sería un factor que favorecería la ganancia de un exceso de
adiposidad. La acción anti-obesidad de los retinoides se ha atribuido a sus efectos en
diferentes tejidos y muy especialmente el tejido adiposo.
1.2.1. Efectos de los retinoides en los tejidos adiposos
Los depósitos adiposos configuran un órgano cuyo metabolismo, plasticidad y actividad
secretora es clave en la regulación de la homeostasis energética a nivel sistémico.
Clásicamente se consideran dos grandes tipos de tejido adiposo, el tejido adiposo blanco
(TAB) y el tejido adiposo marrón (TAM). La principal función del TAB es almacenar el
exceso de energía en forma de triglicéridos para movilizarla en condiciones de escasez,
además de secretar hormonas y citoquinas importantes para regular el metabolismo
energético y la sensibilidad a la insulina. El TAM, por su parte, está especializado en la
disipación regulada de energía en forma de calor (termogénesis adaptativa), a través de la
proteína desacoplante 1 (UCP1), un desacoplador natural del sistema de fosforilación
oxidativa mitocondrial, que se expresa de manera exclusiva en los adipocitos marrones. El
proceso llamado de marronización (browning) consiste en la aparición, en los depósitos de
TAB, de células con capacidades metabólicas oxidativas y termogénicas semejantes a las
de los adipocitos marrones. Las células resultantes se han denominado brite (del inglés
brown-in-white, marrón-en-blanco) o beige; estas células podrían expresar proteínas
marcadoras específicas diferenciales, además de proteínas en común con los adipocitos
marrones y otras en común con los adipocitos blancos (Walden et al., 2012; Wu et al.,
2012). La marronización del TAB se da en respuesta a estímulos y agentes específicos,
muchos de los cuales también activan la función termogénica del TAM, incluyendo en
roedores la exposición al frío, los agonistas beta-adrenérgicos y diferentes estímulos
hormonales y nutricionales, entre ellos los retinoides (Bonet et al., 2013; Giralt and
Villarroya, 2013; Lo and Sun, 2013).
El órgano adiposo es un importante reservorio de vitamina A (retinol) y de -caroteno y
otros carotenoides. Se ha estimado que, en roedores, un 15-20% de todo el retinol corporal
se encuentra en el tejido adiposo, en particular en los adipocitos, mayoritariamente como
retinol no esterificado (Tsutsumi et al., 1992). El contenido en retinol en diferentes
depósitos de TAB (i.e., visceral y subcutáneo) y en TAM es similar. Además de retinol, en
el tejido adiposo se han podido detectar otros retinoides, como ATRA y retinaldehído
(Kane et al., 2008a; Kane et al., 2008b; Perumal et al., 2016) y es destacable que el ATRA
endógeno es mucho más abundante en los depósitos de TAB que en otros tejidos (Kane et
al., 2008a; Kane et al., 2008b; Perumal et al., 2016). Los adipocitos expresan las proteínas
necesarias para almacenar el retinol, movilizarlo y oxidarlo a AR, incluyendo las enzimas
BCO1 y BCO2 (Hessel et al., 2007; Landrier et al., 2012; Tourniaire et al., 2009) y la
producción de RBP (Tsutsumi et al., 1992). Esta última hace posible la exportación del
retinol de origen adipocitario a la circulación. Los adipocitos también expresan los
receptores de retinoides (RAR y RXR), de manera que pueden responder a los retinoides.
Se han descrito diferencias entre TAB y TAM en los patrones de expresión de las diferentes
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
26
isoformas de receptores de retinoides, lo que sugiere que la regulación de la expresión
génica por retinoides podría ser diferente en TAB y TAM: RAR, RARγ y RXR son
altamente expresados en el TAB, mientras que RARβ y RXRγ se expresan más en el TAM
(Landrier et al., 2012).
El retinol y los carotenoides provitamínicos almacenados en los adipocitos pueden servir
para regular la homeostasis de la vitamina A en el organismo, al nivel sistémico. Al mismo
tiempo, cabe esperar que las acciones de los retinoides sean importantes para la biología de
los tejidos adiposos. De hecho, numerosos estudios indican que retinoides como el
retinaldehído y principalmente el ATRA modulan aspectos clave de la biología del tejido
adiposo, incluyendo la diferenciación, la expansión hipertrófica, la capacidad para la
oxidación de grasas y la termogénesis, y la función secretora de los adipocitos (Bonet et
al., 2003; Bonet et al., 2012; Brun et al., 2013; Jeyakumar and Vajreswari, 2015).
El tratamiento con retinoides, especialmente ATRA, tiene los siguientes efectos destacados
sobre el metabolismo de los tejidos adiposos, de acuerdo a lo reportado en la literatura:
a) Inducción de la expresión de UCP1 y la termogénesis en el TAM. En el enhancer
distal del gen Ucp1 hay elementos de respuesta a RAR y el tratamiento con ATRA induce
la expresión de UCP1 y promueve el metabolismo oxidativo en el TAM, tanto in vivo como
en modelos celulares. Estos efectos dependen de la activación de RAR, RXR y la p38
MAPK. Estas acciones genómicas y no genómicas coordinadas podrían dar lugar a un gran
aumento de la actividad transcripcional en el promotor de UCP1 (Landrier et al., 2012). Es
más, estudios nutricionales en roedores muestran que la capacidad termogénica (contenido
en UCP1) del TAM disminuye cuando la alimentación es crónicamente deficiente en
vitamina A y aumenta con la suplementación dietética en vitamina A en forma de éster de
retinilo (Bonet et al., 2000; Bonet et al., 2003; Kumar et al., 1999). Por tanto, el estatus en
vitamina A parece ser un regulador fisiológico del sistema termogénico del TAM.
b) Inhibición de la adipogénesis y la lipogénesis en el TAB. El ATRA es un conocido
inhibidor de la adipogénesis, el proceso de diferenciación de adipocitos a partir de células
precursoras. Lo hace por diversos mecanismos no excluyentes. El RAR con ligando
(ATRA) unido interfiere con la actividad de un factor de transcripción temprano en la
cascada adipogénica, el C/EBP (Schwarz et al., 1997), a través de la inducción
dependiente de RAR de una proteína inhibidora del C/EBP, la Smad3 (Marchildon et al.,
2010). Además, por la vía CRABP-RAR, el ATRA induce la expresión en los preadipocitos
de proteínas específicas que inhiben la adipogénesis, en particular Pref-1, Sox9 y KLF2
(Berry et al., 2012). La inhibición de la adipogénesis es uno de los mecanismos mediante
los cuales el tratamiento crónico con ATRA contrarresta el desarrollo de obesidad inducida
por alimentación crónica con dieta rica en grasa en ratones (Berry et al., 2012; Noy, 2013).
Además de inhibir la formación de nuevas células adiposas, el ATRA favorece la
delipidación de los adipocitos maduros al inhibir la expresión y actividad en estas células
del PPAR. Este receptor nuclear es necesario para el mantenimiento del fenotipo del
adipocito maduro (Tamori et al., 2002) y para la hipertrofia de los adipocitos inducida por
una dieta rica en grasa (Kubota et al., 1999), aparte de ser esencial para la diferenciación
Introducción
27
adiposa. Proteínas producto de genes diana del PPAR facilitan la captación y activación
de los ácidos grasos para la síntesis de triacilgliceroles y la formación y el mantenimiento
de las gotas lipídicas, y la supresión de la actividad del PPAR en los adipocitos favorece
la movilización de la grasa almacenada en ellos (Tamori et al., 2002). La reducción de la
adiposidad corporal en ratones tras el tratamiento agudo con ATRA se correlaciona con la
regulación a la baja del PPARγ en los depósitos de TAB y TAM (Ribot et al., 2001).
También la reducción de la adiposidad corporal en ratones con BCO1 funcional
suplementados con BC está ligada a la represión del PPAR y sus genes diana en el TAB,
como lo indican distintos tipos de análisis incluido el análisis transcriptómico (Amengual
et al., 2011). Finalmente, en adipocitos 3T3-L1 maduros en cultivo se ha demostrado que
la exposición a BC reduce la expresión de PPAR y genes diana de PPAR y el contenido
en lípidos, al tiempo que da lugar a la producción de ATRA (Lobo et al., 2010).
c) Incremento del metabolismo oxidativo e inducción del proceso de marronización
del TAB. Se ha descrito que el tratamiento con ATRA in vivo promueve la remodelación
del TAB a un tejido más oxidativo, en particular más activo en la oxidación de grasas, con
inducción de la expresión de UCP1 en el TAB subcutáneo (inguinal) (Mercader et al.,
2006). Hay también evidencia de un efecto marronizador del ATRA en modelos celulares
de adipocitos (Mercader et al., 2007; Mercader et al., 2010; Tourniaire et al., 2015). El
precursor directo del ATRA, el retinaldehído, también ha sido descrito como un agente
promotor de la marronización del TAB (Kiefer et al., 2012).
1.2.2. Efectos de los retinoides en otros tejidos
El tratamiento con ATRA en modelos animales in vivo no sólo activa el metabolismo
oxidativo en los tejidos adiposos; también en hígado (Amengual et al., 2010) y músculo
esquelético (Amengual et al., 2008), donde se induce la expresión de genes relacionados
con la oxidación de ácidos grasos y la disipación de energía. En conjunto, los efectos del
ATRA en los diferentes tejidos contribuyen a la reducción de la adiposidad corporal y
conllevan, en dichos modelos animales, una mejora del perfil lipídico del plasma y de la
sensibilidad a la insulina (Bonet et al., 2003; Bonet et al., 2012; Das et al., 2014). La
activación del metabolismo oxidativo por ATRA ha sido relacionada con la activación de
los RAR y del PPARß/δ (Bonet et al., 2012; Noy, 2013).
1.3. Retinoides y biomarcadores metabólicos
Contar con biomarcadores del estatus del metabolismo oxidativo y termogénico en los
tejidos, incluyendo la marronización del TAB, es de interés en el contexto del tratamiento
de la obesidad y sus co-morbilidades. Los modelos animales de tratamiento con retinoides
pueden ser instrumentales en la identificación de este tipo de biomarcadores, dados sus
efectos sobre el metabolismo oxidativo en TAB y otros tejidos.
Un biomarcador es una característica que puede ser objetivamente medida y evaluada como
un indicador de procesos biológicos normales, procesos patológicos o respuestas a una
intervención terapéutica (Feigin, 2004). Los biomarcadores se utilizan como herramientas
en el diagnóstico y la detección temprana de la enfermedad, el pronóstico o la predicción
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
28
del resultado del tratamiento. Pueden proporcionar la base para el diseño, mejorar la
seguridad y la eficiencia y explicar los resultados empíricos de los ensayos clínicos
(Choong and Tsafnat, 2012). Idealmente, un biomarcador debe ser no invasivo y fácil de
obtener, además de fácil de medir, específico, sensible, cuantitativo y relacionado con el
mecanismo bioquímico. Para poder realizar tratamientos e intervenciones terapéuticas
tempranas, más que biomarcadores de enfermedad es necesario contar con biomarcadores
de salud, que permitan evaluar el estatus metabólico y detectar desviaciones de la
homeostasis en fases iniciales.
La investigación en animales puede ayudar a desvelar biomarcadores tisulares del estado
metabólico y de salud o de los efectos de fármacos o dietas en tejidos tales como tejido
adiposo, músculo o hígado. Este tipo de biomarcadores puede ser de gran utilidad de cara
a la investigación en animales en nuevas estrategias de intervención, por ejemplo
farmacológica o nutricional. Sin embargo, en voluntarios humanos es difícil disponer de
este tipo de tejidos. Interesan, por tanto, especialmente biomarcadores que residan en
fluidos biológicos fácilmente accesibles, entre ellos muy especialmente la sangre. Tanto las
células sanguíneas como los metabolitos presentes en la sangre pueden ser una fuente de
biomarcadores.
De las células sanguíneas, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) ‒ que
comprenden principalmente monocitos y linfocitos, células del sistema inmunitario ‒
presentan características que las hacen especialmente interesantes para ser utilizadas como
fuente de biomarcadores de salud sistémica (de Mello et al., 2012). Las PBMC circulantes
entran en contacto con los diferentes tejidos y están expuestas a factores ambientales y
metabólicos. Las PBMC expresan aproximadamente el 80% de los genes codificados por
el genoma humano y su perfil de expresión génica puede reflejar la presencia y la extensión
de diferentes condiciones fisiopatológicas como la hipertensión, el cáncer, la aterosclerosis,
o el lupus eritematoso sistémico, entre otras (Liew et al., 2006). También se han demostrado
diferencias en el transcriptoma de las PBMC entre humanos normopeso y con diferentes
grados de obesidad, que reflejan la progresión de la inflamación del tejido adiposo y de
trastornos metabólicos asociados a la obesidad y que afectan a genes relacionados con el
metabolismo energético (Jung et al., 2016). La expresión génica en PBMC también se ve
afectada por fármacos y por factores dietéticos. En estudios nutricionales en animales, por
ejemplo, las PBMC son una fuente potencial de biomarcadores transcriptómicos para
probar la eficacia de estrategias dietéticas para la pérdida de peso (Reynes et al., 2015) y
para estudiar las alteraciones metabólicas causadas por la ingesta de dietas con una
composición desequilibrada en macronutrientes (Reynés et al., 2016). Resultados recientes
de nuestro grupo han mostrado que, en ratones tratados con ATRA, la expresión génica en
sangre total refleja algunos de los cambios de expresión de genes metabólicos que se
producen en el hígado y los tejidos adiposos relacionados con la capacidad de oxidación de
ácidos grasos, la termogénesis y la remodelación del TAB (Petrov et al., 2016a).
La metabolómica permite analizar una gran cantidad de metabolitos en matrices complejas
como biofluidos y tejidos de manera automatizada y relativamente rápida y es de gran
interés de cara al descubrimiento de biomarcadores tempranos de desviaciones de la
Introducción
29
homeostasia metabólica. La metabolómica de plasma u orina se ha utilizado en numerosos
estudios para identificar biomarcadores asociados al desarrollo de obesidad y las
alteraciones metabólicas que frecuentemente acompañan a la obesidad (Rauschert et al.,
2014). Aunque menos explotado, el metaboloma de las PBMC también puede ser
informativo, especialmente si se puede cotejar con el metaboloma del plasma. Entre los
posibles biomarcadores de obesidad identificados mediante estudios metabolómicos
destacan las acilcarnitinas, los aminoácidos de cadena ramificada y aromáticos, los ácidos
grasos no esterificados, ácidos orgánicos y fosfolípido (Rauschert et al., 2014). Cambios
de estos marcadores han sido relacionados con alteraciones del metabolismo energético que
serían frecuentes en la obesidad.
En esta tesis hemos querido ahondar en la interacción de la vitamina A con el metabolismo
oxidativo en los tejidos y en la identificación de biomarcadores asociados a esta interacción.
Para la identificación de biomarcadores circulantes, hemos analizado la expresión génica
en PBMC de genes puntuales candidatos y aplicado metabolómica dirigida en PBMC y
plasma, comparando ratones tratados con ATRA y sus controles. El análisis metabolómico
ha incluido fundamentalmente acilcarnitinas, que se introducen a continuación con más
detalle, y aminoácidos.
1.3.1. Acilcarnitinas como biomarcadores: origen y significado biológico
Las acilcarnitinas son metabolitos intermediarios oxidativos que comprenden un grupo
acilo esterificado a una molécula de carnitina. Son generadas por enzimas mitocondriales
y peroxisomales, como la carnitina palmitoil transferasa 1 (α) y la carnitina palmitoil
transferasa 2 (CPT2), y funcionan en el transporte transmembrana de grupos acilo (McCoin
et al., 2015; Reuter and Evans, 2012; Schooneman et al., 2013).
La mayor parte de las acilcarnitinas se derivan de la beta-oxidación mitocondrial de ácidos
grasos. Para poder entrar en las mitocondrias, los ácidos grasos de cadena larga (de 14 o
más C) tienen que ser convertidos de acil-CoA (su forma activa) a la correspondiente
acilcarnitina por acción de la CPT1, que se localiza en la membrana mitocondrial externa.
La acilcarnitina resultante entra en la matriz mitocondrial vía un transportador específico
(la carnitina-acilcarnitina translocasa) y aquí es reconvertida en acil-CoA por acción de la
CPT2, que está asociada a la membrana mitocondrial interna. El acil-CoA es sustrato de la
beta-oxidación mitocondrial, que rinde en cada ciclo sucesivo una unidad de acetil-CoA y
coenzimas reducidos que alimentan el ciclo de Krebs y la cadena de transporte de electrones
para la obtención de energía, junto con el acil-CoA acortado en 2 C.
Si la llegada de combustible excede la capacidad de producción de energía, es decir, si se
produce más acetil-CoA del que el ciclo de Krebs puede absorber, se acumulan en la
mitocondria acetil-CoA y acil-CoA intermediarios. A partir del exceso de acetil-CoA se
sintetizan cuerpos cetónicos, acetato y acetilcarnitina (AC2:0). Esta última es la
acilcarnitina más corta, y se forma en reacción catalizada por la carnitina acetil transferasa,
una enzima de la matriz mitocondrial que tiene preferencia por los ésteres de acilo de
cadena corta. Además, bajo estas condiciones la CPT2 puede funcionar en sentido opuesto
y reconvertir los acil-CoAs de cadena larga que no están siendo metabolizados en las
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
30
correspondientes acilcarnitinas. La acetilcarnitina y demás acilcarnitinas pueden salir de la
mitocondria al citosol celular y en último término fuera de la célula. Este es un mecanismo
importante para evitar el secuestro del CoA-SH mitocondrial en forma de acil-CoAs y los
efectos nocivos del exceso de acetil-CoA y acil-CoA de cadena larga sobre la función de
las mitocondrias, incluyendo la inhibición de la oxidación de glucosa (por inhibición de la
piruvato deshidrogenasa por el exceso de acetil-CoA) (Aguer et al., 2015; Noland et al.,
2009; Schooneman et al., 2013) (Figura 1.4).
Figura 1.4. Generación y transporte de acilcarnitinas de cadena larga. Adaptado de (Noland et al.,
2009). Abreviaturas: CPT1, carnitina palmitoil transferasa 1; CPT2, carnitina palmitoil transferasa
2; CACT, carnitna-acilcarnitina translocasa; LCAC, acilcarnitinas de cadena larga; PDH, piruvato
deshidrogenasa; TCA, ciclo de los ácidos tricarboxílicos; CrAT, carnitina aciltransferasa; PM,
membrana plasmática; OMM, membrana mitocondrial externa; IMM, membrana mitocondrial
interna.
Las acilcarnitinas también pueden proceder de la beta-oxidación peroxisomal de ácidos
grasos de cadena muy larga (>22 C) y ácidos grasos de cadena ramificada (como el
pristánico o el fitánico). Aunque la carnitina no está implicada en la entrada de estos ácidos
grasos en los peroxisomas, la oxidación peroxisomal no es completa, sino que rinde acetil-
CoA y acil-CoAs de cadena corta y media (como el octanoil-CoA, C8) que salen del
peroxisoma en forma de las correspondientes acilcarnitinas para terminar de oxidarse en
las mitocondrias (Poirier et al., 2006; Wanders et al., 2001). La síntesis de acilcarnitinas de
cadena media está favorecida por la presencia en los peroxisomas de la enzima carnitina
octanoil transferasa. Además, algunas acilcarnitinas pueden derivarse de cuerpos cetónicos
(C4-3OH-carnitina), del catabolismo de ciertos aminoácidos como lisina, triptófano, valina
Introducción
31
e isoleucina (C3- y C5-carnitina, L-isoC4-OH-carnitina), y del catabolismo de la glucosa
(acetilcarnitina) (McCoin et al., 2015; Schooneman et al., 2013).
Las acilcarnitinas circulantes se cree que provienen principalmente de tejidos como el
músculo y el hígado, pero también de los depósitos adiposos, de modo que en parte
reflejarían la movilización de los triglicéridos almacenados en el TAB (Schooneman et al.,
2014; Schooneman et al., 2016). Un estudio reciente en cerdos reveló un papel central del
hígado, más que el músculo, en los flujos de acilcarnitinas en el estado postprandial
(Schooneman et al., 2015). Los niveles de acilcarnitinas en plasma se ven influidos por la
dieta y el estado metabólico, en particular por el estatus de oxidación de ácidos grasos
(Schooneman et al., 2014). Niveles altos pueden ser indicativos de trastornos de la β-
oxidación mitocondrial (de hecho, el análisis de acilcarnitinas en sangre se emplea en el
diagnóstico de los errores hereditarios de la oxidación de ácidos grasos causados por
anomalías genéticas en la CPT2 u otras enzimas/proteínas implicadas), pero también se
asocian a condiciones fisiológicas en que la tasa de oxidación de lípidos está elevada, como
el ayuno a corto plazo o el ejercicio agudo (Longo et al., 2006; McCoin et al., 2015;
Schooneman et al., 2013). Las dietas obesogénicas ricas en grasa se asocian a incrementos
generalizados de los niveles de acilcarnitinas en músculo y de algunas especies en plasma
(Newgard et al., 2009; Noland et al., 2009; Wessels et al., 2015).
Se ha propuesto que, más allá de marcar el estatus metabólico, las acilcarnitinas podrían
jugar un papel regulador activo de la fisiología celular, tanto en condiciones normales como
fisiopatológicas (McCoin et al., 2015; Schooneman et al., 2013). En este sentido, hay
estudios que indican que las acilcarnitinas de cadena larga pueden afectar sistemas
asociados a membranas celulares, incluyendo canales iónicos y proteínas implicadas en
vías de señalización intracelular, como las caspasas o la proteína quinasa C. Además, se
ha sugerido que las acilcarnitinas podrían influenciar la propia función mitocondrial,
aunque faltan estudios específicos al respecto (McCoin et al., 2015; Schooneman et al.,
2013).
Estudios metabolómicos en humanos y en modelos animales han identificado niveles
aumentados de acilcarnitinas en plasma y/o tejidos en la obesidad, la pre-diabetes y la
diabetes tipo 2 (Adams et al., 2009; Koves et al., 2008; Mihalik et al., 2010; Sampey et al.,
2012; Zhang et al., 2014b). Se ha sugerido que la sobrecarga de las células con lípidos crea
condiciones para una oxidación incompleta que favorece la acumulación de acilcarnitinas
y otros metabolitos (e.g., diacilglicerol, ceramidas, acil-CoAs) que pueden interferir con la
señalización de la insulina, especialmente en las células musculares, contribuyendo al
desarrollo de resistencia a la hormona (Muoio and Koves, 2007). En esta línea, hay estudios
en modelos celulares que muestran que la exposición a determinadas acilcarnitinas causa
resistencia a la insulina y estrés oxidativo en células musculares (caso de AC4:0, AC14:0
y AC16:0 (Aguer et al., 2015)) y la activación de vías proinflamatorias en macrófagos (caso
de AC12:0, AC13:0 y AC14:0 (Adams et al., 2009; Rutkowsky et al., 2014; Sampey et al.,
2012)). Por tanto, niveles elevados de acilcarnitinas podrían ser marcadores y a la vez
mediadores de la resistencia a la insulina, defectos en el metabolismo de grasas e
inflamación ligada a la obesidad.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
32
No obstante lo anterior, la relación de las acilcarnitinas con la obesidad y la resistencia a la
insulina es compleja y no está clara (McCoin et al., 2015; Schooneman et al., 2013). Hay
autores que consideran que los niveles de acilcarnitinas sólo reflejan la tasa de oxidación
de ácidos grasos, sin más. Se ha argumentado que, en condiciones de reposo, el flujo a
través del ciclo de Krebs es normalmente mucho menor que la máxima capacidad oxidativa
del músculo y que, de hecho, el flujo a través de la beta-oxidación de ácidos grasos tiene
que exceder el flujo a través del ciclo de Krebs y la cadena respiratoria para que las células
puedan hacer frente a eventuales fluctuaciones de la demanda energética (McCoin et al.,
2015; Schooneman et al., 2013). Por tanto, se producen acilcarnitinas siempre, en
condiciones fisiológicas, y los niveles incrementados en la obesidad podrían ser una
respuesta natural a un mayor suministro de lípidos a los tejidos (Ramos-Roman MA et al.
2012). Un segundo argumento proviene de estudios que muestran que manipulaciones que
mejoran la sensibilidad a la insulina se asocian a incrementos (y no descensos) de los
niveles de acilcarnitinas. Por ejemplo, en un estudio en humanos, la pérdida de peso se
asoció a un aumento de las acilcarnitinas circulantes (consecuencia de un incremento de la
lipólisis y la oxidación de ácidos grasos) y, al mismo tiempo, a una mejora de la sensibilidad
a la insulina (Redman et al., 2011; Schooneman et al., 2016). En un estudio en ratas, los
niveles de carnitina libre y de acilcarnitinas de cadena larga (AC18:1, AC18:0 y AC16:0)
en músculo e hígado incrementaron con la restricción calórica y el ejercicio continuado y
se encontró una asociación directa entre los niveles de acilcarnitinas de cadena larga en
hígado y la sensibilidad a la insulina de los animales (Gopalan et al., 2016). En otro estudio,
la suplementación con carnitina por vía oral a ratones diabéticos mejoró la sensibilidad a la
insulina y se asoció a un marcado incremento de los niveles plasmáticos de acilcarnitinas
(Power et al., 2007). Recientemente, un estudio en ratones concluyó que los niveles
plasmáticos de acilcarnitinas y aminoácidos muestran valor predictivo en relación con la
propensión a la obesidad, pero no en relación con la sensibilidad futura a la insulina
(Horakova et al., 2016).
1.4. Retinoides y epigenética
1.4.1. Mecanismos epigenéticos y programación metabólica
La epigenética estudia los cambios heredables en la expresión génica que no van
acompañados de alteraciones en la secuencia de bases del ADN. Los principales
mecanismos epigenéticos son la metilación del ADN, las modificaciones postraduccionales
de las histonas y la remodelación de la cromatina inducida por ARNs pequeños o por la
actividad de complejos remodeladores dependientes de ATP. Los cambios epigenéticos
afectan muchos procesos reguladores en la célula, incluyendo: expresión de genes y micro
ARNs, interacciones ADN-proteína, supresión de la movilidad de elementos transponibles,
diferenciación celular, embriogénesis, inactivación del cromosoma X y fenómenos de
impronta genómica (Choi and Friso, 2010). El estado epigenético del ADN de los tejidos
de un individuo es tanto heredado como modificable, de manera que los patrones de
expresión del ADN pueden ser pasados de generación celular en generación celular y de
padres a hijos o pueden ser modificados en respuesta al ambiente. Cambios epigenéticos
Introducción
33
han sido asociados con estados de enfermedad, como los observados en el síndrome
metabólico y el cáncer (Smith and Ryckman, 2015).
La metilación del ADN es el paradigma de mecanismo epigenético y el mejor conocido.
La mayoría de las marcas de metilación en el ADN se producen por la adición enzimática
de un grupo metilo al carbono 5 de la citosina para formar 5-metilcitosina (m5C), reacción
catalizada por una familia de ADN metiltransferasas (DNMTs) (Moore et al., 2013). En los
mamíferos, las citosinas metiladas se encuentran por lo general en dinucleótidos CpG.
Estos dinucleótidos no están distribuidos uniformemente en el genoma: en la mayor parte
del genoma (98%) hay en promedio un CpG cada 100 pb, pero existen regiones (de 200 pb
a 1000 pb) que tienen una frecuencia mucho mayor, por ejemplo 1 CpG cada 10 pb,
denominadas "islas CpG". Las islas CpG a menudo coinciden con promotores génicos
(Rodriguez-Dorantes et al., 2004). Aproximadamente 70 a 90% de todos los sitios CpG
dispersos en el genoma humano (en genes o secuencias intergénicas) presentan las citosinas
metiladas, mientras que los sitios CpG contenidos en las islas CpG de promotores génicos
están mayoritariamente sin metilar (Fan and Zhang, 2009; Rodriguez-Dorantes et al., 2004;
Wilson et al., 2007). La metilación de los dinucleótidos CpG en estas islas se asocia
habitualmente a la silenciación génica, aunque no siempre (Rodriguez-Dorantes et al.,
2004).
Nutrientes y otros componentes bioactivos de los alimentos pueden propiciar la
modificación de marcas epigenéticas y alterar con ello la expresión de genes al nivel
transcripcional. En particular, el patrón de metilación del ADN (y de las histonas) es
sensible a factores dietéticos. Nutrientes y bioactivos afectan la metilación de los sustratos
biológicos, ya sea cambiando la disponibilidad de donantes de metilo o por modular la
actividad de las DNMTs (Romani et al., 2015). El mecanismo más ampliamente
investigado es la influencia de ciertos nutrientes sobre la vía del “metabolismo de un
carbono”, que rinde S-adenosil metionina (SAM), requerida para la metilación de todas las
moléculas biológicas incluyendo el ADN. Los nutrientes implicados en este mecanismo
son los donantes dietéticos de metilo y los micronutrientes que funcionan como sustratos o
cofactores de las enzimas implicadas en dicha vía, incluyendo folato, metionina, colina,
betaína y vitaminas B12, B6 y riboflavina. Una ingesta dietética insuficiente o un exceso
de estos nutrientes puede alterar la disponibilidad de SAM, que es el donante directo de
metilo en las reacciones biológicas de metilación, y de S-adenosil homocisteína, que es un
inhibidor de las DNMTs (Choi and Friso, 2010).
La nutricion durante el desarrollo intrauterino y postnatal temprano se cree que es crítica
en la programacion de los circuitos que regulan la homeostasia energética y puede dar lugar
a un reajuste permanente de los programas de expresion genica, mediado por la alteracion
de factores epigeneticos. Numerosos estudios epidemiológicos y en modelos animales han
confirmado que las condiciones nutricionales durante etapas críticas del desarrollo afectan
la susceptibilidad a desarrollar enfermedades crónicas en la edad adulta, incluyendo las
enfermedades cardiovasculares, la obesidad, la diabetes tipo II y la osteoporosis (Inadera,
2013; Lillycrop and Burdge, 2012; Pico et al., 2012; Tarry-Adkins and Ozanne, 2016). La
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
34
dieta materna en estas etapas puede alterar dinámicamente la regulación epigenética,
incluyendo el estado de metilación del ADN en tejidos del feto/neonato.
1.4.2. Los retinoides como agentes epigenéticos
Los retinoides afectan marcas epigenéticas, entre ellas marcas de metilación del ADN, con
consecuencias funcionales (Vieira, 2011). Los estudios que relacionan a los retinoides con
cambios en la metilación del ADN, ya sea a nivel genómico global o de genes específicos,
se han centrado fundamentalmente en la actividad epigenética del AR en los contextos
de la embriogénesis y el cáncer (Bar-El Dadon and Reifen, 2017).
En células madre embrionarias humanas el tratamiento con AR altera el estado de
metilación de 166 sitios CpG en todo el genoma y los niveles de expresión de 2013 genes:
para 19 genes se encontró una correlación entre los cambios de metilación y de expresión,
con 9 genes hipermetilados y reprimidos, 7 genes hipometilados e inducidos y 3 genes
hipermetilados e inducidos tras el tratamiento (Cheong et al., 2010). En ratones, los efectos
teratogénicos derivados de la exposición materna a AR exógeno han sido relacionados con
la hipometilación de islas CpG y del ADN global en los fetos (Kuriyama et al., 2008). En
otro estudio, este en ratas, una dieta deficiente en vitamina A durante las etapas
preconcepcional y gestacional condujo a defectos en el corazón de las crías que se
relacionaron con una hipermetilación, y en paralelo una menor expresión al nivel
transcripcional, del gen para GATA-4, que es un factor de transcripción involucrado en la
cardiogénesis y regulado por vitamina A (Feng et al., 2013).
En relación con el cáncer, en diferentes líneas celulares de cáncer y células transformadas
se ha reportado que la exposición a AR favorece la diferenciación y revierte el fenotipo
canceroso a la vez que causa hipometilación del ADN a nivel global (Miftakhova et al.,
2012; Stallings et al., 2011) o la hipometilación de genes supresores tumorales, con
aumento de sus niveles de expresión (Lim et al., 2011; Woo and Jang, 2012). Otros estudios
han revelado cambios ligados al cáncer del estado de metilación de genes relacionados con
el metabolismo y la actividad de los retinoides. Por ejemplo, en una proporción significativa
de tumores de mama y líneas de cáncer de mama hay hipermetilación y falta de expresión
del gen RAR2 (Sirchia et al., 2000) y en diferentes tipos de cáncer hay hipermetilación y
expresión reducida del gen CRBP1 (Esteller et al., 2002). Interesantemente, en pacientes
con cáncer colorrectal, una ingesta dietética alta de vitamina A (retinol) ha sido asociada
con una menor metilación de estos dos genes, RAR2 y CRBP1, en las biopsias de tejido
tumoral (Esteller et al., 2002).
Los estudios sobre la actividad epigenética del -caroteno son más escasos. Uno de los
pocos al respecto ha investigado la posible implicación de cambios epigenéticos en los
efectos pro-quimiotáctico y pro-angiogénico del -caroteno en modelos celulares (células
endoteliales de cordón umbilical humano y células endoteliales progenitoras). La
exposición a -caroteno se asoció a una hipometilación del ADN, global y específicamente
en genes relacionados con el homing y con la angiogénesis, como el receptor 2 del factor
de crecimiento del endotelio vascular, cuya expresión se vió aumentada (Kiec-Wilk et al.,
Introducción
35
2007; Kiec-Wilk et al., 2009). Se ha sugerido que estos cambios podrían estar conectados
con una posible acción pro-tumoral del -caroteno.
La actividad epigenética de la vitamina A en relación con la salud metabólica y la
homeostasis energética ha sido muy poco estudiada. En humanos adultos con
sobrepeso/obesidad se han descrito asociaciones del estado de metilación del ADN de
algunos genes candidatos inflamatorios (TNF, elementos HERV-w) en sangre total con
la ingesta dietética de carotenoides, -caroteno y retinol (Bollati et al., 2014). Dos estudios
recientes han investigado efectos epigenéticos de la vitamina A en la programación de
circuitos neurales implicados en el control de la ingesta. En el primero de ellos, la
alimentación con una dieta rica en vitamina A tras el destete (x10 veces el contenido
estándar en el pienso) redujo la ingesta y el peso corporal y contrarrestó en parte el fenotipo
obesogénico característico de la progenie macho de ratas suplementadas con
multivitaminas durante la gestación, y esto se acompañó de una hipometilación del
promotor del gen para la pro-opiomelanocortina (POMC) en el hipotálamo y de cambios
en la expresión de genes relacionados con el control de la ingesta (aunque no de POMC) y
el sistema de recompensa en el cerebro de los animales a los 8 meses de edad (Sanchez-
Hernandez et al., 2014). El otro estudio, del mismo grupo, muestra que una ingesta alta de
vitamina A durante la gestación modifica en ratas la expresión y estatus de metilación en
el hipocampo de genes del sistema de recompensa y reduce la preferencia por el azúcar en
edad adulta, aunque no afecta al peso corporal (Sanchez-Hernandez et al., 2016).
Los mecanismos de la actividad epigenética del AR en la metilación del ADN han sido
investigados principalmente en relación con el cáncer y en general están mediados por la
interacción del AR con sus receptores (Stefanska et al., 2012; Vieira, 2011). Estos
mecanismos son múltiples:
- Diferentes estudios muestran inhibición de la expresión y actividad de las DNMTs (1,
3a y 3b) tras el tratamiento de líneas celulares y tumores primarios con AR, que se
relaciona con desmetilación e incremento de la expresión de genes supresores
tumorales (Fazi et al., 2005; Lim et al., 2011). La inhibición de la DNMT1 se explicaría
por las capacidades del ATRA de, vía sus receptores, inducir la transcripción del gen
para p21 (la cual compite con DNMT1 por la unión a PCNA en la horquilla de
replicación) e inhibir la actividad transcripcional de AP1 (el cual transactiva
normalmente el gen para DNMT1). Además, el ATRA induce miRNAs dirigidos a los
ARNm de DNMTs (Stefanska et al., 2012).
- La vitamina A (retinil palmitato) y el ATRA regulan positivamente la abundancia y
actividad hepática de la N-glicina metiltransferasa, a la vez que favorecen la
hipometilación del ADN hepático (McMullen et al., 2002; Rowling et al., 2002). La
actividad de la N-glicina metiltransferasa consume el donador de metilo SAM (ya que
cataliza la reacción entre SAM y glicina para dar S-adenosil-homocisteína y sarcosina).
- En células tumorales, el tratamiento con ATRA inhibe la actividad de las metionina
adenosiltransferasas (Lai et al., 1997), que son enzimas implicadas en la biosíntesis
de SAM.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
36
- El AR y el retinol revierten marcas de metilación del ADN en células embrionarias al
inducir la expresión de enzimas clave para la desmetilación activa del ADN (enzimas
ten-eleven translocation, en concreto TET2 y TET3); este borrado de marcas de
metilación favorece la reprogramación de estas células hacia la pluripotencia (Hore et
al., 2016).
Aunque en la mayoría de los estudios considerados en este apartado se ha puesto el énfasis
en la capacidad de los retinoides de favorecer la hipometilación del ADN, los retinoides
también pueden favorecer la hipermetilación del ADN (Cheong et al., 2010): depende de
los genes concretos y contexto biológico considerados. Finalmente, cabe señalar que,
además de afectar la metilación del ADN, los retinoides afectan otros mecanismos
epigenéticos, como la acetilación y metilación de histonas (Vieira, 2011).
Resultados previos de nuestro laboratorio (Granados et al., 2013; Musinovic et al., 2014)
sugieren una posible participación de la vitamina A en la regulación de la expresión génica
y la programación del metabolismo del TAB a través de factores epigenéticos, como la
metilación del ADN, que ha sido abordada como parte de esta tesis.
2. Objetivos y Planteamiento Experimental
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
38
Objetivos y Planteamiento Experimental
39
El objetivo general de esta tesis doctoral es ahondar en la interacción de la vitamina A con
el metabolismo energético especialmente en el tejido adiposo y sus mecanismos,
incluyendo mecanismos epigenéticos posiblemente relacionados con la programación
metabólica, e identificar nuevos biomarcadores de esta interacción.
El trabajo experimental se ha realizado mayoritariamente en el Laboratorio de Biología
Molecular, Nutrición y Biotecnología (LBNB) de la Universidad de las Islas Baleares,
dentro del grupo de investigación Nutrigenómica y Obesidad (NUO), dirigido por el
Profesor Andreu Palou y adscrito al CIBER de Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición
(CIBEROBN) del Instituto de Salud Carlos III del Gobierno de España. La realización de
la tesis ha sido posible gracias a una beca a la doctoranda del Programa de mejoramiento
del Profesorado (PROMEP) de la Subsecretaría de Educación Superior de México.
Los objetivos de esta tesis se enmarcan en una de las principales líneas de investigación del
grupo NUO: la interacción de la nutrición con procesos y mecanismos moleculares y
celulares relacionados con el control de la adiposidad corporal, de interés en el control de
la obesidad y sus complicaciones metabólicas. La tesis parte de las investigaciones previas
del grupo sobre la actividad biológica en este sentido de la vitamina A y carotenoides
provitamina A. Como micronutriente esencial, la vitamina A juega un papel clave en la
salud general del individuo y es bien conocida por ser esencial para varias funciones vitales
como la visión, la inmunidad, la reproducción y el desarrollo embrionario. Más
recientemente se han atribuido a esta vitamina funciones en el control del metabolismo de
los lípidos, la respuesta a la insulina y la homeostasis energética. El grupo de la UIB ha
sido pionero en la identificación y caracterización de múltiples efectos del ATRA, derivado
carboxílico activo de la vitamina A, de potencial interés de cara al control del síndrome
metabólico, incluyendo una acción anti-obesidad. Aquí nos planteamos nuevos desarrollos
en esta línea, buscando incorporar conceptos y aspectos (e.g., biomarcadores,
nutriepigenética) que son parte de la evolución de la nutrición molecular en los últimos
tiempos, y aprovechar al mismo tiempo la experiencia acumulada y las oportunidades
surgidas de la participación de nuestro grupo de la UIB en proyectos de investigación
nacionales y europeos.
En particular, en relación con el objetivo general, se han planteado y desarrollado los
siguientes objetivos específicos:
Objetivo 1. Ahondar en los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a la
activación por ATRA del metabolismo oxidativo en los tejidos adiposos.
Estudios previos mostraron que, en roedores, el tratamiento con ATRA promueve la
activación del TAM y un incremento de la capacidad para la oxidación de ácidos grasos y
la termogénesis en el TAB y, ligado a esto, una pérdida de grasa corporal y mejoras en la
tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina de los animales. También se ha
demostrado una remodelación metabólica hacia una mayor capacidad oxidativa y
termogénica en modelos celulares de adipocitos blancos en cultivo (e.g., adipocitos 3T3-
L1) expuestos a ATRA, que el grupo de la UIB acababa de relacionar al inicio de esta tesis
con un incremento de la función y abundancia de mitocondrias. Quedaban por estudiar los
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
40
efectos del ATRA sobre las mitocondrias del TAB in vivo. Además, si bien los resultados
en los modelos de adipocitos en cultivo indicaban que, en buena medida, la remodelación
metabólica inducida por ATRA en los adipocitos se deriva de efectos directos (autónomos)
del retinoide sobre las células adiposas, in vivo también pueden estar implicados efectos
sistémicos del ATRA.
Así las cosas, en esta tesis hemos estudiado el efecto del ATRA sobre la marronización y
la función mitocondrial adipocitaria centrándonos en aspectos no abordados anteriormente,
en particular: (i) la posible implicación in vivo de cambios en el contenido en mitocondrias
y en la expresión de genes marcadores candidatos de adipocitos beige/BRITE; (ii) la
modulación por ATRA de la expresión in vivo de irisina, una señal proteica estimuladora
de la marronización del TAB; y (iii) la modulación por ATRA de la expresión de receptores
nucleares y proteínas transportadoras intracelulares de retinoides, que puede permitir
identificar nuevos biomarcadores de marronización del TAB relacionados, así como
informar sobre las vías de señalización implicadas en la acción del ATRA en los adipocitos.
Algunos de estos estudios (del apartado (i)) se han realizado como parte de una
colaboración con el grupo del Dr. Jean François Landrier, del INRA-INSERM- Aix-
Marseille Université (Francia). Este grupo participa, al igual que nuestro grupo de la UIB,
en la acción COST CA15136 EUROCAROTEN, enfocada en la investigación en
carotenoides y moléculas relacionadas y sus aplicaciones agroalimentarias y en el campo
de la salud. Además, parte de la investigación de esta tesis se ha hecho dentro del marco de
la participación de nuestro grupo en un proyecto europeo sobre la conexión entre la
actividad termogénica de los adipocitos marrones y beige y la diabetes de tipo II
(DIABAT).
Para la consecución del objetivo 1, diseñamos y realizamos en el LBNB los siguientes
experimentos:
a) Experimento in vivo. Este experimento se hizo con ratones adultos NMRI. Los ratones
se mantuvieron a temperatura controlada (22ºC) y con ciclos de 12 horas de luz/oscuridad,
con acceso libre a agua y pienso estándar. La mitad de los animales recibieron una
inyección subcutánea diaria de ATRA, a una dosis de 50 mg/kg de peso corporal, durante
los 4 días anteriores al sacrificio, como está descrito en (Amengual et al., 2008); a la otra
mitad le fue inyectado el vehículo. Se determinaron diferentes parámetros bioquímicos y
biométricos (Figura 2.1). Para caracterizar el impacto del ATRA sobre la marronización
del TAB y sus mecanismos evaluamos en diferentes depósitos de TAB (inguinal,
retroperitoneal y epididimal), así como en TAM, la expresión de genes relacionados con la
función mitocondrial; genes marcadores de los adipocitos beige/BRITE; y genes para
transportadores y receptores de retinoides y otros receptores nucleares relacionados.
También analizamos en los distintos depósitos grasos el contenido en ADN mitocondrial y
la inmunohistoquímica de COXIV y UCP1. Este experimento se utilizó también para
analizar la expresión del gen de la irisina en hígado y los diferentes depósitos adiposos.
Objetivos y Planteamiento Experimental
41
Figura 2.1. Esquema del experimento con ratones adultos NMRI tratados con ácido retinoico todo-
trans (ATRA) o vehículo. TAM, tejido adiposo marrón; TABi, TABrp, TABe, tejido adiposo
blanco inguinal, retroperitoneal y epididimal; PBMC, células mononucleares de sangre periférica.
(Veáse el apartado 3.1 de Materiales y Métodos).
b) Estudios en cultivos primarios de adipocitos. Se establecieron cultivos primarios de
adipocitos a partir de la fracción estromal-vascular aislada de TAM y de TAB inguinal y
epididimal de ratones NMRI. Las células fueron diferenciadas en las condiciones
habitualmente utilizadas para la diferenciación de los cultivos primarios de adipocitos
marrones, y fueron expuestas a ATRA o noradrenalina una vez diferenciadas,
procediéndose a la cosecha tras una incubación de 24 h (Figura 2.2). Se estudiaron los
efectos sobre la expresión de genes relacionados con la actividad termogénica y la
marronización y de genes relacionados con la señalización por retinoides.
Los resultados de estos estudios se presentan y discuten en el capítulo 1. Parte de estos
resultados se encuentran incluidos en un trabajo ya publicado del que la doctoranda es
coautora (Tourniaire et al., 2015).
Figura 2.2. Esquema del experimento con cultivos primarios de la fracción estromal vascular (SVF)
del tejido adiposo marrón (TAM) y del tejido adiposo blanco inguinal (TABi) y epididimal (TABe).
CM, cambio de medio de cultivo; NA, noradrenalina; ATRA, ácido retinoico todo-trans. (Véase el
apartado 3.5 de Materiales y Métodos).
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
42
Objetivo 2. Identificar/validar biomarcadores sanguíneos del incremento de la
capacidad oxidativa/termogénica en tejidos adiposos y otros tejidos, explotando el
modelo de tratamiento con ATRA.
Conseguir incrementar mediante tratamientos específicos la capacidad oxidativa/
termogénica tisular, en particular en los tejidos adiposos, es una posible estrategia de
control y tratamiento de la obesidad y sus co-morbilidades. Contar con biomarcadores
fácilmente accesibles que reflejen los cambios al efecto inducidos en tejidos internos por
agentes terapéuticos candidatos con efectos sistémicos beneficiosos es de gran interés de
cara a la identificación, evaluación y optimización de nuevas terapias. Puesto que, en
ratones, el tratamiento con ATRA induce la capacidad oxidativa y termogénica en
diferentes tejidos, incluyendo la marronización del TAB, hipotetizamos que este modelo
puede ser utilizado para identificar y/o validar biomarcadores circulantes de dichos efectos.
A partir de esta hipótesis, hemos realizado un análisis metabolómico en PBMC y plasma
de ratones tratados con ATRA empleando el modelo animal previamente descrito en el
objetivo 1 (Figura 2.1). Además, evaluamos en estas PBMC la expresión de genes
relacionados con el metabolismo oxidativo, mediante qPCR. El análisis metabolómico se
realizó como parte de una colaboración en el laboratorio del Dr. Jan Kopecký, del Instituto
de Fisiología de la Academia Checa de Ciencias (Praga, República Checa). Dicho grupo ha
sido partner en un proyecto europeo coordinado por nuestro grupo de la UIB sobre
“biomarcadores nutrigenómicos de robustez de la homeostasia metabólica de aplicabilidad
en la sustentación de alegaciones de salud en alimentos”, el proyecto BIOCLAIMS
(finalizado en 2015). El análisis metabolómico dirigido llevado a cabo se ha centrado en el
posible papel de biomarcadores circulantes candidatos identificados en el proyecto
BIOCLAIMS, fundamentalmente acilcarnitinas y aminoácidos.
Los resultados obtenidos en estos estudios, y su integración con los obtenidos en el
desarrollo del objetivo 1, se presentan y discuten en el capítulo 2.
Objetivo 3. Caracterizar efectos nutriepigenéticos de la suplementación durante la
lactancia con vitamina A, preformada y como -caroteno, de posible relevancia en la
programación metabólica del TAB
Estudios previos de nuestro laboratorio mostraron que la suplementación de crías de rata
durante el periodo de lactancia con un exceso (moderado) de vitamina A en forma de retinil
palmitato produce cambios en el desarrollo del TAB y favorece la hiperplasia y aumento
de la adiposidad con la exposición a un dieta alta en grasa tras el destete (Granados et al.,
2013). En concreto, la administración de vitamina A preformada (retinil palmitato) afecta
la expresión en TAB de genes claves relacionados con la diferenciación adipocitaria y la
proliferación celular. A diferencia del tratamiento con retinil palmitato, el tratamiento
durante la lactancia con una dosis equivalente de vitamina A en forma de -caroteno no
afecta la expresión de dichos genes (Musinovic et al., 2014).
La lactancia es un periodo crítico en el desarrollo del tejido adiposo en el que pueden quedar
condicionados cambios epigenéticos que impactan las características del tejido a largo
plazo, como parte de fenómenos de programación metabólica. La influencia de factores
Objetivos y Planteamiento Experimental
43
nutricionales en etapas tempranas de la vida sobre la susceptibilidad a la obesidad vía
mecanismos epigenéticos es una línea de trabajo activa en el LBNB, desarrollada a través
de proyectos como el financiado por la fundación Ramón Areces “Nutriepigenética del
control de la adiposidad corporal: estudios en modelos animales de susceptibilidad
diferencial a la obesidad basados en intervenciones nutricionales en etapas vitales
tempranas” (2012-2015). Los retinoides vitamina A es sabido que influencian la metilación
del ADN, con implicaciones en el cáncer y el desarrollo embrionario.
Figura 2.3. Esquema del experimento con ratas Wistar lactantes tratadas con vitamina A
preformada (retinil palmitato), β-caroteno o vehículo durante la etapa de lactancia. TABi, tejido
adiposo blanco inguinal. *, 3-5 veces la dosis diaria de vitamina A ingerida con la leche materna;
**, cantidad equivalente en unidades internacionales de vitamina A a la suplementada como retinil
palmitato. (Véase el apartado 3.1 de Materiales y Métodos).
Por todo ello, en esta tesis nos planteamos estudiar la influencia del tratamiento durante la
lactancia con -caroteno o vitamina A preformada, ambos precursores dietéticos del
ATRA, sobre el estatus de metilación en tejido adiposo de promotores génicos diana
seleccionados, usando el modelo animal (Figura 2.3) descrito en (Musinovic et al., 2014).
Los genes seleccionados son genes relacionados con la diferenciación (Pparg) y
determinación adipogénica (Zfp423), la proliferación celular (Pcna), el transporte de retinol
(Rbp4) y la termogénesis (Ucp1). Hemos analizado la expresión de estos genes y el estado
de metilación de tramos reguladores de los mismos (en promotores o enhancers) en el TAB
inguinal de crías de rata suplementadas durante la etapa postnatal temprana (los primeros
21 días de vida, coincidentes con la etapa de lactancia) con -caroteno, retinil palmitato o
vehículo. La expresión génica se determinó por qPCR a tiempo real y el estado de
metilación del ADN, mediante secuenciación por bisulfito (realizada en el LBNB y los
servicios generales de la UIB). Nuestra hipótesis de partida es que la suplementación
perinatal con vitamina A puede afectar marcas de metilación del ADN de estos genes y de
manera diferencial según sea aportada como retinil palmitato o como -caroteno.
Los resultados obtenidos en estos estudios se presentan y discuten en el capítulo 3.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
44
3. Materiales y Métodos
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
46
Materiales y Métodos
47
3.1. Estudios en animales
Los diseños experimentales y protocolos usados en la presente tesis doctoral fueron
revisados y aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal (CEEA) de la
Universidad de las Islas Baleares y siguen las recomendaciones generales para el uso y
cuidado de animales de laboratorio.
Para los estudios del Capítulo 1 y el Capítulo 2 se usaron 22 ratones machos NMRI adultos
(de unas 13 semanas de edad) obtenidos de Charles River Laboratories International, Inc.
(Barcelona, España). Los ratones se mantuvieron en jaulas con 2-3 animales por jaula, a
temperatura controlada (22ºC), con ciclos de 12 h de luz/oscuridad, y con acceso libre a
agua y pienso (dieta de mantenimiento A04; Panlab SL, Barcelona, España). La mitad de
los animales fueron tratados con una dosis de 50 mg de ácido retinoico todo trans (ATRA;
Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, EE.UU.) por kg de peso corporal y día mediante
inyección subcutánea (100 μL) durante los 4 días anteriores al sacrificio, como está descrito
en (Amengual et al., 2008; Mercader et al., 2006). La otra mitad de los animales recibieron
solamente el vehículo (aceite de oliva; grupo control). Durante el periodo de tratamiento se
monitorizó el peso corporal y la ingesta de los animales. Justo antes del sacrificio se
recogieron muestras de sangre de la vena facial (200-400μL) en un tubo con 100μL de
citrato sódico al 3.8%, para la obtención de las células mononucleares de sangre periférica
(PBMC), y (~50 μL) en un tubo capilar heparinizado, para obtener el plasma. Los animales
fueron sacrificados por decapitación y a continuación los depósitos de tejido adiposo
marrón interescapular (TAM) y de tejido adiposo blanco inguinal (TABi), epididimal
(TABe) y retroperitoneal (TABr), así como el hígado se diseccionaron, se pesaron, se
congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su posterior procesamiento
y análisis. Un fragmento longitudinal de los distintos depósitos de tejido adiposo blanco
diseccionados se fijaron por inmersión en paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1
M (pH=7,3), para los estudios morfológicos e inmunohistoquímicos. El plasma se obtuvo
por centrifugación a 1000 x g durante 10 min a 4ºC y se guardó en nuevos recipientes
estériles que se almacenaron a -80ºC hasta su posterior análisis.
Para los estudios del Capítulo 3 fue utilizado el TABi de la cohorte de animales estudiados
y descritos en una publicación previa de nuestro laboratorio (Musinovic et al., 2014).
Brevemente, después de un periodo de aclimatación, ratas hembras Wistar de 3 meses de
edad (obtenidas de Charles River Laboratories International, Inc.) fueron enjauladas con
ratas machos Wistar. Después del apareamiento, las ratas fueron individualmente
enjauladas y se mantuvieron bajo temperatura controlada (22ºC), con ciclos de 12 h de
luz/oscuridad, y con acceso libre a agua y pienso (Panlab, SL; 4,5 mg de vitamina A por
kg de dieta). El día del nacimiento se definió como día 0 de la lactancia. Al día 1, el exceso
de crías fue retirado para mantener diez crías por camada y las crías fueron aleatoriamente
asignadas a tres grupos que, desde el día 1 hasta el día 20 del periodo de lactancia,
recibieron diariamente de forma oral, con la ayuda de una pipeta, 10-15 μL de vehículo
(aceite de oliva; grupo control) o una emulsión de vitamina A en forma de retinil palmitato
(Sigma-Aldrich Inc.; grupo RE) o como -caroteno (Sigma-Aldrich Inc.; grupo BC) en
aceite de oliva. La cantidad suplementada fue entre tres y cinco veces la ingesta diaria de
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
48
vitamina A ingerida a través de la leche materna, que fue estimada en base al contenido de
retinol de la leche materna de rata (Granados et al., 2013), la cantidad de leche materna
ingerida por las crías (que se incrementa a medida que avanza la lactancia) (Kojima et al.,
1998) y la equivalencia en vitamina A del BC en aceite (Otten et al., 2006; van Lieshout et
al., 2001; Van Loo-Bouwman et al., 2014). Se usaron al menos 16 ratas jóvenes de al menos
cuatro diferentes madres por grupo experimental, y un número similar de machos y
hembras. De estos animales se ha dispuesto del peso corporal, la composición corporal
determinada por resonancia magnética (EchoMRI-900 analyzer; EchoMRI, Houston, TX,
EE.UU.), el peso del TABi, los niveles circulantes de glucosa, retinol y BC, los niveles de
retinol, retinil ésteres y BC en hígado, y los niveles de retinol total en TABi. Los niveles
de retinoides y carotenoides se determinaron por HPLC acoplado a un detector multidiodo
previa extracción (Granados et al., 2013; Musinovic et al., 2014).
3.2. Estudio morfológico e inmunohistoquímico del tejido adiposo blanco inguinal
(TABi) de ratones
Las muestras de TABi fueron fijadas en paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M
(pH=7,3) durante toda la noche, y a continuación lavadas en tampón fosfato, deshidratadas
en una serie graduada de etanol y embebidas en bloques de parafina para los estudios
inmunohistoquímicos del Capítulo 1. Estos se realizaron mediante la técnica de avidina-
biotina (Hsu and Raine, 1981). Para ello, secciones de 5 μm se incubaron con un anticuerpo
primario policlonal de conejo anti-CoxIV (Cell Signalling Technology, Danvers, MA,
EE.UU.) diluido 1:100 en PBS o con un anticuerpo anticuerpo primario policlonal de
conejo anti-UCP1 (GeneTex Inc., Irvine, CA, EE.UU.) diluido 1:300 en PBS, luego con el
correspondiente anticuerpo secundario biotinilado anti-IgG de conejo diluido 1:200
(Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.), y finalmente con complejo ABC
(Vectastain ABC kit, Vector Laboratories). La actividad de la peroxidasa se reveló usando
clorhidrato de 3,3'-diaminobenzidina al 0,075% como cromógeno (Sigma, St Louis, MO,
EE.UU.) en tampón Tris 0,05 M, pH 7,6. Las secciones se contrastaron con hematoxilina
y se montaron en Eukitt (Kindler; Freiburg, Alemania). Las secciones se observaron con el
microscopio Zeiss Axioskop 2 equipado con cámara digital AxioCam Icc3 (Carl Zeiss,
S.A., Barcelona, España). Se utilizaron controles positivos apropiados para comprobar la
especificidad del anticuerpo.
3.3. Obtención de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ratón
Las PBMC utilizadas en los Capítulos 1 y 2 se aislaron por un método de flotación,
siguiendo básicamente el protocolo Application Sheet C07 proporcionado por la casa
comercial Alere Technologies AS (Oslo, Noruega). Brevemente, la sangre recogida con el
citrato sódico de la vena facial de los ratones se transfirió a un tubo de 15 mL y se le
añadieron 5 mL de la solución de trabajo OptiPrep™ recién preparada (1,5 mL de
OptiPrep™ –Sigma-Aldrich Inc– en 5 mL de tampón tricina salino –TBS; 10 mM Tricina-
NaOH, 0.85% NaCl, pH=7,4– bien mezclado), mezclando suavemente por inversión. La
mezcla se cubrió cuidadosamente con 0,5 mL de TBS y se centrifugó a 1000 g durante 30
min a 20ºC. Tras la centrifugación se recogieron las PBMC desde el menisco hacia abajo,
Materiales y Métodos
49
hasta medio centímetro del pellet de eritrocitos. La suspensión celular se diluyó en dos
volúmenes de TBS y se centrifugó a 350 x g durante 10 min a 20ºC. Finalmente, el pellet
de células fue resuspendido en 120 μL de tampón fosfato salino (PBS; 50mM de fosfato de
potasio, 150mM NaCl, pH=7,2) y se guardó en dos alícuotas a -80ºC hasta su posterior
análisis. El número de células viables se estimó por contaje directo en una cámara de
Neubauer usando el colorante de exclusión Trypan blue (Sigma-Aldrich Inc.), obteniendo
5.81 x 105 ± 1.15 x 105 células viables a partir de 200-400 μL de sangre.
3.4. Análisis metabolómico en plasma y células mononucleares de sangre periférica
(PBMC)
En el Capítulo 2, a raíz de una colaboración internacional dentro del proyecto Europeo
BIOCLAIMS (FW7-Grant agreement no. 244995), determinamos los niveles de diferentes
especies de acilcarnitinas, aminoácidos y otros metabolitos, que representan un panel
ampliado para la detección de trastornos metabólicos innatos, a partir de 3 μL de plasma o
de suspensión de PBMCs de ratones control y tratados con ATRA. Las determinaciones se
efectuaron en el laboratorio del Dr. Jan Kopecky, del Institute of Physiology de Praga
(República Checa), por análisis de inyección de flujo acoplado a espectrometría de masas
en tándem con ionización por electroespray (FIA-ESI-MS/MS), utilizando el kit
MassChrom® Amino Acids and Acylcarnitines (Chromsystems, Gräfelfing Alemania) y
siguiendo el protocolo descrito en (Horakova et al., 2016; Horakova et al., 2012). Los
niveles de los metabolitos en el plasma o la suspensión de PBMCs se normalizaron por
volumen de muestra y por número de células respectivamente.
3.5. Aislamiento de la fracción celular estromal vascular (SVF) del tejido adiposo y
cultivo primario
Para establecer los cultivos primarios de (pre)adipocitos para los estudios incluidos en el
Capítulo 1 se usaron ratones NMRI machos de 2-3 meses de edad, obtenidos de Charles
River Laboratories International, Inc. Brevemente, los animales fueron sacrificados con
CO2, y los tejidos –de una parte el TAM interscapular, cervical y axilar, que se combinaron,
de otra el TABi, y finalmente el TABe– se diseccionaron, se trocearon en trozos pequeños,
se digirieron con 0.2% (w/v) colagenasa tipo II (Sigma-Aldrich Inc.) y se obtuvieron las
células de la fracción estromal vascular siguiendo el protocolo descrito en (Bonet et al.,
1997; Petrov et al., 2016b; Petrovic et al., 2008; Petrovic et al., 2010; Siersbæk et al., 2012)
Las células fueron finalmente resuspendidas en medio de cultivo (0,5 mL/animal) y
sembradas (día 0) en placas de 6 pocillos en condiciones estériles (0,25 mL de suspensión
celular más 1,75 mL de medio de cultivo por pocillo). Las células se hicieron crecer a 37°C
y 8% de CO2 en una incubadora humidificada. El medio de cultivo fue Dulbecco’s modified
Eagle’s (DMEM) suplementado con 10% (v/v) de new born calf serum (Linus; Cultek,
Madrid, España), 4 nM insulina, 25 μg/mL ascorbato de sodio, 10 mM HEPES, 4 mM
glutamina, 86 μM piruvato de sodio, 50 IU/ mL de penicilina y 50 μg/mL de estreptomicina.
A día 1, las células se lavaron en DMEM precalentado a 37°C y se añadió medio de cultivo
recién preparado precalentado. A partir de aquí se cambió el medio de cultivo cada dos
días. Las células fueron tratadas con 1μM de ácido retinoico todo trans (ATRA; Sigma-
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
50
Aldrich Inc.) o 1μM de (±) Arterenol (noradrenalina, NA; Sigma-Aldrich Inc.) el día 7 de
cultivo, cuando ya habían alcanzado la confluencia y estaban en proceso de diferenciación,
hasta el día 8 (24 h). La monocapa de células se recogió directamente con el tampón de
lisado del kit E.Z.N.A.® total RNA kit I (Omega Bio-Tek, Norcross, GA) y se procedió a
la extracción del ARN total (ver más adelante). Se realizaron dos experimentos
independientes por duplicado.
3.6. Extracción de ácidos nucleicos
3.6.1. Extracción de ARN total
El ARN total se extrajo de las muestras de tejido (TAM, TAB inguinal, epididimal y
retroperitoneal e hígado) y de las células en cultivo primario usando el kit E.Z.N.A.® total
RNA kit I (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, EE.UU.) y de las PBMC usando el kit Direct-
zolTM RNA MiniPrep (Zymo Research, Irvine, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones
del fabricante.
Entre 10 a 15 mg de tejido adiposo o hígado se homogenizaron en 700 μL de TRK lysis
buffer, con ayuda de un homogeneizador (modelo VDI 12, VWR). El homogenado se
centrifugó a 13000 x g durante 5 min a temperatura ambiente con la finalidad de eliminar
la grasa y residuos celulares. Las células en monocapa se recogieron directamente del
pocillo en 350 μL de TRK lysis buffer. El sobrenadante o lisado celular resultante fue
transferido a otro tubo y se le añadió un mismo volumen (700 o 350 μL, respectivamente)
de etanol al 70%, mezclando vigorosamente. La mezcla se introdujo en columnas HiBind
RNA spin acopladas a un tubo colector, que se centrifugaron a 10000 x g durante 1 min a
temperatura ambiente descartando el eluido. A continuación se realizó un lavado de las
columnas con 350 μL de RNA Wash Buffer I, centrifugando a 10000 x g durante 1 min a
temperatura ambiente y descartando el eluido. Para eliminar la contaminación por ADN,
en cada columna se introdujeron 35 μL de reactivo con ADNasas y se incubó durante 15
min a temperatura ambiente. A continuación se realizó un segundo lavado de las columnas
con RNA Wash Buffer I seguido de 2 lavados con RNA Wash Buffer II, siempre en cada
lavado centrifugando a 10000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descartando el
eluido. Finalmente las columnas se centrifugaron a máxima velocidad (unos 20000 x g)
durante 2 minutos descartando el eluido, a fin de secarlas. Una vez secas, se les acopló un
nuevo tubo colector de 1,5 mL y el ARN total fue eluido con 40 μL de H2O libre de
ADNasas y ARNAasas (Sigma-Aldrich Inc.; añadida directamente sobre el centro de la
membrana de la columna), centrifugando a 10000 x g durante 2 min y recogiendo el eluido,
que se guardó a -80ºC hasta su posterior análisis.
Las PBMC en suspensión (unas 500 mil células en 100 µL) se lisaron añadiendo 0,3 mL
de TripureTM (Sigma-Aldrich Inc.), mezclando vigorosamente e incubando la mezcla
durante 5 minutos a temperatura ambiente. El lisado se centrifugó a 12000 x g durante 1
min a temperatura ambiente con la finalidad de eliminar residuos celulares. El sobrenadante
resultante fue transferido a otro tubo y se le añadieron 400 μL de etanol al 95-100%, se
mezcló vigorosamente y se introdujo en las columnas Zymo-SpinTM IIC RNA spin,
acopladas a un tubo colector, las cuales se centrifugaron a 13000 x g durante 1 min a
Materiales y Métodos
51
temperatura ambiente descartando el eluido. A continuación se realizaron dos lavados de
las columnas con 400 μL de Direct-zol RNA PreWash seguidos de un último lavado con
RNA Wash Buffer, siempre en cada lavado centrifugando a 13000 x g durante 1 min a
temperatura ambiente y descartando el eluido. Finalmente las columnas se centrifugaron a
13000 x g durante 2 min descartando el eluido, a fin de secarlas. Una vez secas, se les
acopló un nuevo tubo colector de 1,5 mL y el ARN total fue eluido con 10 μL de H2O libre
de ADNasas y ARNasas (Sigma-Aldrich Inc.; añadida directamente sobre el centro de la
membrana de la columna) y se centrifugaron a máxima velocidad (unos 20000 x g) durante
2 min. El eluido de ARN se guardó a -80ºC hasta su posterior análisis.
3.6.2. Extracción del ADN
El ADN se extrajo de las muestras de tejido adipso (TAB inguinal, epididimal y
retroperitoneal) usando el kit DNeasy® Tissue & Blood Kit (QIAGEN GmbH, Hilden
Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para ello, se pesaron aproximadamente 50 mg de tejido adiposo. Las muestras se
homogeneizaron en 180 μL de Buffer ATL con 20 μL de proteinasa K y se incubaron a 56ºC
durante 4 h, con agitación vigorosa ocasional para dispersar la muestra. Posteriormente, se
añadieron 200 μL de Buffer AL y 200 μL de etanol (96-100%) a cada muestra y se mezcló
vigorosamente. El sobrenadante resultante se introdujo en las columnas DNeasy Mini spin
acopladas a un tubo colector y se centrifugó a 7500 x g durante 1 min a temperatura
ambiente descartando el eluido. A continuación se realizaron dos lavados de las columnas
con 500 μL de Buffer AW1 y AW2, respectivamente, el primer lavado se centrifugó a 7500
x g durante 1 min y el segundo a 20000 x g durante 3 min a temperatura ambiente, se
descartaron los eluidos. Finalmente las columnas se centrifugaron a máxima velocidad
(20000 x g) durante 2 min descartando el eluido; una vez secas las columnas se acoplaron
a un tubo de 1,5 mL nuevo, se añadieron 100 μL de Buffer AE y se incubaron a temperatura
ambiente durante 5 min, después se centrifugaron a 750 x g durante 1 min para recoger el
eluido de ADN.
3.6.3. Cuantificación y comprobación del estado del ARN y ADN
Las concentraciones de ARN y ADN se determinaron por absorbancia a 260 nm a partir de
2 μL de muestra utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop
Technologies Inc., Wilmington, DE, EE.UU.). Asimismo se determinó la absorbancia a
280 nm y 230 nm para la estimación de la pureza de las muestras mediante los ratios
260/280 y 260/230.
La integridad del ARN se estimó por visualización en electroforesis en gel de agarosa de
las bandas del ARN ribosómico 28S y 18S y la del ADN se estimó por la visualización de
una sola banda de ADN de alto peso molecular. Un total de 250 ng de ácido nucleico por
muestra se mezclaron con un tampón de carga (50% de glicerol y 2,5 mg/mL de azul de
bromofenol), se cargaron en un pocillo y se separaron en un gel de agarosa al 1% (para
ARN) y al 2% (para ADN) en TBE (44,5 mM de Tris base, 44,5 mM de ácido bórico y 1
mM de EDTA) 0.5X, teñido con SYBER® Safe DNA Gel Stain (10 μL por cada 100 mL de
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
52
TBE). Las condiciones de electroforesis fueron 80V durante 30 min para ambos geles y las
bandas se visualizaron en un transiluminador de UV (ChemiGeninus Bio, Syngene).
3.7. Análisis de ARNm por RT-qPCR a tiempo real
Los niveles de ARNm de los genes seleccionados (que se especifican en cada capítulo) en
muestras de tejido (TAM, TAB inguinal, epididimal y retroperitoneal e hígado), células en
cultivo primario y PBMC se determinaron por RT-qPCR a tiempo real.
3.7.1. Retrotranscripción (RT)
Para la retrotranscripción, 0,25 μg de ARN total (en 5 μL de agua libre de ARNasas) fueron
primero desnaturalizados a 65ºC durante 10 min en un termociclador (Thermal Cycler
2720, Applied Biosystems, Foster City, California, EE. UU.). A continuación, el ARN
desnaturalizado fue retrotranscrito a ADN complementario (cADN) tras añadir, a cada
muestra, 7,5 μL de RT-mix que contenía: 1,25 μL de Buffer 10x, 1,25 μL de MgCl2 25 mM,
2 μL de dNTPs 2,5 mM, 0,5 μL de random hexamers (Applied Biosystems), 0,5 μL de
inhibidor de ARNasas (Applied Biosystems), 0,5 μL de transcriptasa reversa (MuLV;
Applied Biosystems) y 1,5 μL de agua libre de ARNasas, siguiendo las recomendaciones
del fabricante. Las condiciones de la reacción de retrotranscripción fueron: 15 min a 20ºC,
30 min a 42ºC y un paso final de 5 min a 95ºC; luego se refrigeró y mantuvo a 4ºC.
Para las PBMCs, 0,05 μg de ARN total fueron primero desnaturalizados para, a
continuación, ser retrotranscritos usando el iScript™ cDNA synthesis kit (Bio Rad
Laboratories, Madrid, Spain), que emplea a la vez ramdom hexamers y oligoT como
cebadores, siguiendo las instrucciones del fabricante.
3.7.2. qPCR a tiempo real
El cDNA obtenido en la RT fue usado para la cuantificación de los niveles de ARNm de
los genes seleccionados. Se utilizaron 2 μL del producto de RT (dilución 1/20 o 1/5) y se
le añadieron 9 μL de la PCR-mix que contenía: 3,1 μL de H20 libre de ARNasas, 0,45 μL
de cada cebador (a una concentración de 2,5-10 μM) y 5 μL de Power Syber Green PCR
Master Mix (Applied Biosystems), siguiendo las recomendaciones del fabricante. En la
Tabla 3.1 se detallan las parejas de cebadores (primers) usadas. Todos los cebadores se
obtuvieron de Sigma Genosys (Sigma Aldrich Química SA, Madrid, España).
La reacción de amplificación y cuantificación se realizó en un termociclador
StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, EE.UU.), con las siguientes condiciones: una activación/ desnaturalización
de 10 min a 95ºC, seguida de 40 ciclos de dos temperaturas: 15 s a 95ºC (desnaturalización)
y 1 min a 60ºC (alineamiento y elongación) y por último una curva de fusión para verificar
la pureza de los productos obtenidos siguiendo las recomendaciones del fabricante. El ciclo
umbral (Ct, del inglés threshold cycle) se calculó con el software del equipo (StepOne
Software v2.0) y la expresión relativa del gen de interés en cada muestra se calculó respecto
a la expresión del gen de referencia β-actina, que se ha usado ampliamente como un gen de
referencia para el tejido adiposo, hígado y las PBMC de ratones y ratas y para cultivos
Materiales y Métodos
53
primarios de (pre)adipocitos (Amengual et al., 2010; Granados et al., 2013; Mercader et
al., 2006; Musinovic et al., 2014; Petrov et al., 2016a; Petrov et al., 2016b) usando el
método 2-ΔCt. Se probaron diferentes genes de referencia con resultados similares.
Tabla 3.1. Secuencias de los cebadores usados para las PCR a tiempo real
Primer 5 a 3´
Forward (F) y Reverse (R)
Actb F: TACAGCTTCACCACCACAGC Mus/Rat 120
R: TCTCCAGGGAGGAAGAGGAT
Acox1 F: CCGCCACCTTCAATCCAG Mus 456
R: ACTCTTGGGTCTTGGGGTCA
Adlh9a1 F: AGACCATCAACAACGGGAAG Mus 199
R: TGGAAGGGATAGTTCCATGC
Atp5f1 F: GGGAACGGCTACATAAAGCA Mus 166
R: TTGGCAATGGTCTCCTTTTC
Cd137 F: AAGCAACCATTTAAGAAGGCGG Mus/rat 115
R: GGATGGCACATTACAGCTCG
Cpt1a F: CGAGAAGGGAGGACAGAGAC Mus/Rat 201
R: GGACACCACATAGAGGCAGAA
Cox8b F: TGCGAAGTTCACAGTGGTTC Mus 170
R: TGCTGCGGAGCTCTTTTTAT
Crabp2 F: AGGACTCAGCGTCCAGTGTT Mus 162
R: CACAGCGATCTTCCTCATCA
Cyp26a1 F: TGGGAGAGGGGAGAGAGGCTGGA Mus 290
R: CGAAACCCTCCTGGAACCGGA
Fabp5 F: ACTGAGACGGTCTGCACCTT Mus 165
R: CCCTCATTGCACCTTCTCAT
Fasn F: CGGCGAGTCTATGCCACTAT Mus 222
R: ACACAGGGACCGAGTAATGC
Fndc5 F: ATGAAGGAGATGGGGAGGAA Mus 102
R: GCGGCAGAAGAGAGCTATAACA
Hoxc9 F: CGGCAGCAAGCACAAAGA Mus/rat 138
R: AGAAACTCCTTCTCCAGTTCCA
Pcna F: TATTGGAGATGCTGTGGTGA Rat 204
R: AGTGGAGTGGCTTTTGTGAA
Ppara F: CGTTTGTGGCTGTGCAAGTT Mus 163
R: AGAGAGGACAGATGGGGCTC
Pparb/d F: GGAACAGCCACAGGAGGA Mus/Rat 155
R: AGGGAGGAAGGGGAGGAA
(Continúa)
Tamaño del
producto (pb)Gen Especie
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
54
(Continúa)
Pparg F:AGAGCCTTCAAACTCCCTCA Mus/rat 230
R:GAGACATCCCCACAGCAAG
Ppargc1b F: TGAGGTGTTCGGTGAGATTG Mus 165
R: CCATAGCTCAGGTGGAAGGA
Rara F: TCTCCCTGGACATTGACCTC Mus 196
R: GTGTCTTGCTCAGGCGTGTA
Rarb F: GCCTCTGGGACAAATTCAGTGAAC Mus 272
R: GGCAAAGGTGAACACAAGGTCAG
Rarg F: AGGTCACCAGAAATCGATGC Mus 212
R: CTGGCAGAGTGAGGGAAAAG
Rxra F: TACCCACCACACCCACATT Mus 420
R: GGTTCCGCTGTCTCTTGTC
Rxrb F: AACCCTGGAGAGGTGGAGAT Mus 156
R: CAGGTGCTCCAGACACTTGA
Rxrg F: GCAAGAAGAAAGGCAGAGGA Mus/Rat 223
R: CCACTCAACGAGGGTGAAAA
Slc27a1 F: CAGGAGTGGAGGGGAAAG Mus/rat 131
R: CAGAAGACGCAGGAAGATGG
Srebp1c F: CAGCGGTTTTGAACGACA Mus 165
R: GCCAGAGAAGCAGAAGAGAAG
Tbx1 F: ACCCTCGAAAAGACAGCGAG Mus/rat 109
R: TGCGTGATCCGGTGATTCTG
Tfb2m F: CCAGAGTGGTTGCCTTTGA Mus 64
R: TTCCTCTGTAAGGGCTCCA
Tmem26 F: GCTGTTCCTGTTGCATTCCC Mus/rat 159
R: GGAGAAAGCCATTTGTAGCCTC
Ucp1 F: ACACCTGCCTCTCTCGGAAA Mus 76
R: TAGGCTGCCCAATGAACACT
Ucp1 F: GGGCTGATTCCTTTTGGTCT Rat 229
R: GGTGGTGATGGTCCCTAAGA
Ucp2 F: CCTACAAGACCATTGCACGA Mus/Rat 149
R: TGTCATGAGGTTGGCTTTCA
Yy1 F: TGAGAAAGCATCTGCACACC Mus 175
R: CGCAAATTGAAGTCCAGTGA
Zfp423 F: GTCACCAGTGCCCAGGAAGAAGAC Mus/Rat 144
R: AACATCTGGTTGCACAGTTTTACACTCAT
Materiales y Métodos
55
3.8. Contenido de ADN mitocondrial
El contenido relativo de ADN mitocondrial se determinó mediante la amplificación y
cuantificación de un fragmento de ADN mitocondrial específico de Rattus novergicus y de
un gen nuclear de una sola copia (beta-2-microglobulina, β2M) por qPCR en tiempo real.
El gen β2M ha sido descrito previamente como un buen marcador para identificar el ADN
nuclear (Venegas et al., 2011). Las PCRs se llevaron a cabo usando 0,02 ng de ADN y los
cebadores en una concentración final de 0.25 µM cada uno (para el fragmento de ADN
mitocondrial, Forward: 5´-GAGCATCTTATCCACGCTTCC-3’ y Reverse: 5’GGTG
GTACTCCCGCTGTAAA3’; para el gen β2M, Forward: 5´TGTCAGATATGTC
CTTCAGCAAGG-3’ y Reverse: 5’TGCTTAACTCTGCAGGCGTATG-3’) siguiendo
básicamente el protocolo descrito en el apartado anterior. El Ct se calculó con el software
del equipo (StepOne Software v2.0) y el contenido relativo del ADN mitocondrial en cada
muestra se calculó respecto al ADN nuclear como se describe en (Venegas et al., 2011).
3.9. Análisis de metilación de ADN por secuenciación con bisulfito
El ADN genómico del TABi, purificado con el kit Genomic DNA Clean & Concentrator
(Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.), se utilizó para determinar el patrón de metilación
de los sitios CpG en tramos reguladores (promotor o enhancer) de los genes Pparg2,
Zfp423, Pcna, Rbp4 y Ucp1, por secuenciación directa tras conversión con bisulfito.
Brevemente, 200 ng de ADN genómico se sometieron a reacción con bisulfito usando el
Kit EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research), de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Paralelamente, un estándar comercial universal de ADN metilado de ratón
(Zymo Research) fue convertido con bisulfito para monitorizar dicha reacción.
Se consideró que la reacción de conversión con bisulfito fue óptima cuando la conversión
del estándar comercial de ADN metilado fue > 99%. A continuación, el ADN tratado con
bisulfito (BS-DNA) se eluyó en 20 μL de H20 libre de ADNasas y ARNasas y su
concentración fue determinada con el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. Para la
amplificación de cada región a estudiar se utilizaron 5 ng (en 2µL) del BS-DNA y la DNA
polimerasa JumpStart™ REDTaq® ReadyMix™P (Sigma, Madrid, España), junto con los
cebadores específicos bisulfito correspondientes (forward y reverse, véase la Tabla 3.2).
Tras comprobar su integridad en un gel de agarosa, el producto de la PCR se purificó
usando el kit QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania) y se cuantificó con el
espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. Aproximadamente 20±5 ng (en un 1µL) de ADN
se secuenciaron con el Kit BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Madrid,
España) utilizando el cebador reverse y siguiendo las instrucciones del fabricante, en un
termociclador (Applied Biosystems Termociclador 2720, Madrid, España). Los fragmentos
obtenidos se purificaron por precipitación en etanol y acetato de sodio y resolvieron
mediante electroforesis capilar en un Analizador Genético 3130 (Applied Biosystems,
Madrid, España).
Las secuencias obtenidas fueron alineadas con la secuencia original (no convertida)
utilizando el programa BiQ Analyzer (Bock et al., 2005) para un control de calidad. Todas
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
56
las muestras experimentales cumplieron con los estándares de calidad del programa (>80%
de alineación y >90% de conversión).
Con el tratamiento con bisulfito, las citosinas metiladas en el ADN permanecen intactas
mientras que las citosinas no metiladas son convertidas en uracilo y detectadas como
timinas tras la PCR. Para la cuantificación del grado de metilación de cada CpG de interés
en las muestras de tejido, la altura del pico de la citosina (phc) para esa posición se dividió
por la suma de los picos de citosina y timina (phc+t) y se multiplicó por 100 (phc/phc+t *
100) (Jiang et al., 2010), utilizando el software Chromas Lite versión 2.01 (Technelysium
Pty Ltd 2007).
Tabla 3.2. Secuencias de los cebadores específicos bisulfito utilizados
Programas utilizados para el diseño de los cebadores específicos bisulfito: a MethPrimer (Li and Dahiya,
2002), b BiSearch (Aranyi et al., 2006; Tusnady et al., 2005) y c PerlPrimer (Marshall, 2004).
3.10. Análisis estadístico
Todos los datos se presentan como media±error estándar de la media (SEM). Para
determinar la significancia estadística de las diferencias entre grupos se utilizó el test de la
t de Student de dos colas o el test no paramétrico U de Mann-Whitney (cuando el número
de individuos fue bajo) y el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc
DMS cuando se compararon entre sí más de dos grupos. Los coeficientes de correlación de
Pearson (r) o de Spearman (ρ) se utilizaron para identificar las asociaciones entre las
variables estudiadas, considerando todos los grupos conjuntamente. El umbral de
significación se estableció en P<0,05. En el Capítulo 2, se realizó un análisis de
componentes principales (PCA) para evaluar las relaciones entre los niveles relativos de
metabolitos en plasma, expresión de genes de interés en los tejidos y parámetros
Primer 5 a 3´
Forward (F) y Reverse (R)
Pcna a
F: TGGGTTAGTGTTGTGATGTTATAATTT 17 231
R: CCTAAATCAAACATACCTCAAACATAATA
Pparg2 a
F: AAATATTGAATGTGTGGGTTATTGG 4 433
R: CAACAACATCAAAAATAAACTTTACCTTAT
Rbp4 a,b
F: TTAGGGTAATAGGATTTGGAGGATATT 9 224
R: AAACTTACATAACCCTCCCTAACTCA
F: GTTTAGGYGGTGAGTTAGGGAGGG 25 215
R: ACCRCTCACCAACAAAAACC
Ucp1 c
F: GGTTATGTTGGGAGGGTTTAGAT 13 276
R: TATCCCCAAAAAACCTAATTCATACT
Zfp423 a
F: GTTTTTTTTATTTTTTTAGGGAGTT 2 265
R: AAAAATATCCCTCAACTCAACCTACT
F: GTTTTTGGTTTATGGAGGTAGTTAG 1 322
R: ATATCCCTCAACTCAACCTACTTAA
Núm. de
sitios CpG
Tamaño del
producto (pb)Gen
Materiales y Métodos
57
biométricos en los animales tratados con ATRA (50 mg/kg peso corporal) o con vehículo.
Las variables originales (117 variables) se tipificaron restándole a cada dato su media y
dividiéndolo por la desviación estándar. El análisis se basó en la matriz de correlación y los
componentes principales se consideraron significativos si aportaron más del 6% para la
varianza total (Priego et al., 2013). Los gráficos de puntuación biplot de PC1, PC2 y PC3
se utilizaron para examinar la posible contribución de estos componentes para discriminar
entre los animales tratados con ATRA o con vehículo (animales control). El análisis
estadístico se realizó utilizando el programa SPSS para Windows versión 23.0 (IBM SPSS
statistics, Chicago, IL, EE.UU.).
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
58
4. Resultados y Discusión
4.1. Mecanismos y biomarcadores tisulares de la marronización del tejido adiposo
blanco inducida por ácido retinoico (Capítulo 1)
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
60
Resultados y Discusión
Capítulo 1
61
Capítulo 1: Mecanismos y biomarcadores tisulares de la marronización del tejido
adiposo blanco inducida por ácido retinoico
4.1.1. Antecedentes
Los adipocitos blancos típicos son pobres en mitocondrias y tienen una baja capacidad
oxidativa. Debido a esto, la contribución del tejido adiposo blanco (TAB) al gasto
energético se considera relativamente pequeña. Sin embargo, hay estudios en humanos y
roedores que documentan una asociación inversa entre la capacidad oxidativa mitocondrial
en el TAB y la obesidad, así como ejemplos de intervenciones nutricionales y
farmacológicas en animales que confieren resistencia al desarrollo de obesidad en paralelo
a un aumento del metabolismo oxidativo en el TAB (Boudina and Graham, 2014; Flachs
et al., 2013). La estimulación de la capacidad oxidativa mitocondrial de los adipocitos
blancos ligada a un aumento del gasto energético en estas células a través de un mayor
desacoplamiento y/o desperdicio de energía vía ciclos fútiles, emerge, por tanto, como un
posible objetivo en el control de la obesidad y sus complicaciones médicas asociadas
(Bonet et al., 2013; Flachs et al., 2013).
La activación metabólica del TAB puede implicar la aparición de adipocitos más parecidos
al clásico adipocito del tejido adiposo marrón (TAM), rico en mitocondrias y especializado
en la respiración desacoplada y la termogénesis vía la proteína desacoplante 1 (UCP1). Este
proceso se denomina marronización (browning) y los adipocitos tipo marrón que aparecen
en el TAB se denominan adipocitos marrones inducibles, beige o BRITE (de brown-in-
white) (Giralt and Villarroya, 2013). La función termogénica final de los adipocitos
beige/BRITE no diferiría de la de los adipocitos marrones clásicos, aunque su contribución
al gasto energético global es menor (Shabalina et al., 2013). Los adipocitos beige/BRITE
y los marrones comparten la expresión de toda una serie de genes ligados a la termogénesis
y mecanismos comunes de inducción (por ejemplo, inducción mediada por agentes
noradrenérgicos como el frío) (Shabalina et al., 2013). Hay controversia en cuanto al origen
de los adipocitos beige/BRITE. Por una parte se cree que derivan de células precursoras
diferentes de las clásicas del TAM, de hecho se cree que están más cerca del linaje de los
adipocitos blancos (Park et al., 2014). Por otra parte, se cree que su aparición en el TAB
puede implicar procesos de transdiferenciación o remodelación metabólica de adipocitos
blancos a marrones. Las células beige/BRITE tienen un patrón de expresión génica distinto
del de los adipocitos blancos o marrones clásicos, lo que permite identificarlas y
monitorizar el proceso de marronización del TAB (Petrovic et al., 2010; Siersbæk et al.,
2012; Wu et al., 2012). No obstante, la mayor parte de los marcadores de adipocito
beige/BRITE identificados en los últimos años no tienen funciones termogénicas o
adipogénicas aparentes, y se ha argumentado que el hecho deque se expresen o no tiene
poco que ver con la estructura y función de los adipocitos, sino que más bien reflejan
etapas/nichos durante el desarrollo (de Jong et al., 2015; Long et al., 2014).
El tratamiento in vivo con ácido retinoico todo trans (ATRA), la principal forma activa de
la vitamina A (retinol), induce en ratones la expresión de genes relacionados con la
oxidación de ácidos grasos y la termogénesis en depósitos de TAB (Berry and Noy, 2009;
Mercader et al., 2006). El TAB es, de hecho, un importante sitio de almacenamiento y
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
62
metabolismo de la vitamina A, así como un objetivo principal de la acción del ATRA
(Bonet et al., 2015; Bonet et al., 2003; Bonet et al., 2012; Landrier et al., 2012; Tourniaire
et al., 2009), que es una molécula altamente bioactiva que impacta muchos procesos
celulares por mecanismos genómicos y no genómicos (Theodosiou et al., 2010). El
tratamiento con ATRA también incrementa la capacidad oxidativa de lípidos en otros
tejidos como el TAM (Bonet et al., 2000; Puigserver et al., 1996), el músculo esquelético
(Amengual et al., 2008; Berry and Noy, 2009) y el hígado (Amengual et al., 2010). Como
resultado de todo ello, el tratamiento con ATRA reduce el peso corporal y la adiposidad
independientemente de cambios en la ingesta de alimento y mejora la tolerancia a la glucosa
y la sensibilidad a la insulina en ratones delgados y obesos (Berry and Noy, 2009; Bonet et
al., 2000; Felipe et al., 2004; Felipe et al., 2005; Mercader et al., 2006; Puigserver et al.,
1996; Ribot et al., 2001).
Más recientemente, en nuestro grupo hemos estudiado de una manera más específica el
impacto del ATRA sobre las mitocondrias de los adipocitos, en colaboración con el grupo
del Dr. Landrier (Universidad de Marsella). Hemos descrito en adipocitos 3T3-L1 maduros
en cultivo que la exposición a ATRA (1 M-10 M), además de reducir los lípidos
intracelulares y aumentar la tasa de oxidación de ácidos grasos (Mercader et al., 2007),
aumenta el consumo de oxígeno y el contenido en mitocondrias (Tourniaire et al., 2015).
Sin embargo, al inicio de esta tesis se sabía poco sobre los efectos del ATRA en las
mitocondrias del TAB en el animal intacto. Además, aunque los resultados en modelos
celulares apuntan a efectos directos del ATRA sobre el metabolismo oxidativo mitocondrial
en adipocitos, no se pueden descartar efectos indirectos del ATRA en este mismo sentido
in vivo, por ejemplo derivados de cambios en la producción de moléculas señal de secreción
que pueden favorecer la marronización del TAB, derivadas del propio TAB u otros tejidos.
Por todo lo anterior, el objetivo del presente capítulo ha sido caracterizar efectos directos
(i) e indirectos (ii) del tratamiento con ATRA sobre la capacidad funcional de las
mitocondrias y la expresión de marcadores de marronización y de adipocitos beige/BRITE
en depósitos de TAB de ratón in vivo. Además (iii), hemos querido explotar el modelo de
inducción de marronización por ATRA para identificar y validar nuevos marcadores
tisulares de marronización basados en transcritos de ARNm.
4.1.2. Resultados
4.1.2.1. Efecto del tratamiento con ATRA sobre la expresión de genes relacionados
con la función mitocondrial y marcadores de marronización y de adipocitos
beige/BRITE en el tejido adiposo blanco de ratón
El tratamiento con ATRA (50 mg de ATRA por kg de peso corporal y día, durante los 4
días precedentes al sacrificio) produjo en ratones NMRI una reducción significativa del
peso (Figura 4.1.1A) y de la adiposidad corporal (Figura 4.1.1E), sin cambios significativos
en la ingesta (Figura 4.1.1B), de acuerdo con trabajos previos del grupo (Amengual et al.,
2010; Mercader et al., 2006; Ribot et al., 2001). Los animales tratados con ATRA
exhibieron una reducción del 13,6% del peso corporal en comparación con los animales
control, siendo significativa dicha reducción del peso corporal a partir del segundo día de
Resultados y Discusión
Capítulo 1
63
tratamiento. La ingesta acumulada durante el tratamiento fue menor, aunque no
significativamente, en los animales tratados con ATRA, lo que podría contribuir en parte a
la pérdida de peso (Figura 4.1.1B). Por otro lado, la eficiencia energética (peso corporal
ganado en g por comida consumida en kg) durante el tratamiento fue 5 veces menor en los
ratones tratados con ATRA, lo que apunta a la implicación importante de mecanismos
metabólicos (Figura 4.1C). Al sacrificio, los animales tratados con ATRA exhibieron una
reducción del 15,1% de la adiposidad corporal (medida como la suma de los pesos de todos
los depósitos adiposos diseccionados y expresado relativo al peso del animal) en
comparación con los animales control, pero no en el peso relativo del hígado (Figura
4.1.1E). La reducción en la adiposidad afectó por igual todos los depósitos adiposos
estudiados, independientemente de su localización anatómica o tipología metabólica
(Figura 4.1.1D).
Figura 4.1.1. Ratones NMRI de 13 semanas de edad fueron tratados con 50 mg de ATRA por kg
de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria (; 100 µL)
durante los cuatro días previos al sacrificio. Los paneles muestran la evolución del peso corporal
(A), ingesta acumulada (B) y eficiencia energética (C) durante el tratamiento; el peso de los tejidos
adiposo marrón (TAM), adiposo blanco inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal
(TABe) e hígado (D) y el peso relativo (por 100 g de peso corporal, PC) de todos los tejidos adiposos
sumados (TA) y del hígado (E). Los datos de peso corporal y de pesos de tejido son la media±SEM
de 10-11 animales por grupo. La ingesta acumulada y la eficiencia energética se calcularon por
jaula y son la media±SEM de 4 jaulas por grupo (2-3 animales por jaula). * Diferente del grupo
control tratado con vehículo (P<0,05; prueba t de Student de dos colas).
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
64
Figura 4.1.2. Niveles de expresión de genes relacionados con la mitocondria y de marcadores de
adipocitos beige/BRITE en los tejidos adiposos blancos inguinal (TABi, A), retroperitoneal
(TABrp, B) y epididimal (TABe, C) de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso
corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días
previos al sacrificio. Los datos normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan
en porcentaje respecto al grupo control y son la media±SEM de 8-11 animales por grupo. *
Diferente del grupo control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando
0,05<P<0,1; prueba t de Student de dos colas).
Resultados y Discusión
Capítulo 1
65
Figura 4.1.3. Niveles de expresión de genes relacionados con la termogénesis y la mitocondria en
el tejido adiposo marrón (TAM) de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso
corporal o vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos
al sacrificio (A). Comparación de los niveles de expresión de genes relacionados con la
termogénesis y la mitocondria en TAM y tejido adiposo blanco inguinal (TABi) en el grupo control
(B). Los datos normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje
respecto al grupo control (en A) y en porcentaje respecto al TABi (en B), y son la media±SEM de
8-11 animales por grupo. * Diferente del grupo control tratado con vehículo y # diferente del TABi
(P<0,05; prueba t de Student de dos colas).
Figura 4.1.4. Comparación de los niveles de expresión de genes relacionados con la mitocondria y
de marcadores de adipocitos beige/BRITE entre los tejidos adiposos blancos inguinal (TABi),
retroperitoneal (TABrp) y epididimal (TABe) en ratones NMRI (grupo control). Los datos
normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto al
depósito inguinal y son la media±SEM de 8-11 animales por grupo. Letras diferentes indican
diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con el análisis ANOVA de una vía
seguido de la prueba post-hoc DMS.
Sabíamos al iniciar esta tesis, por investigaciones previas en las que ha participado nuestro
grupo del LBNB, que el tratamiento con ATRA aumenta el consumo de oxígeno y el
contenido mitocondrial en adipocitos 3T3-L1 maduros en cultivo, desencadenando
cambios en la expresión génica que incluyen un aumento de la expresión de un conjunto de
genes vinculados a la replicación y transcripción del ADN mitocondrial, la biogénesis
mitocondrial y la fosforilación oxidativa (OXPHOS), como se desprende de un análisis
transcriptómico (Tourniaire et al., 2015). Entre los genes relacionados con la mitocondria
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
66
inducidos por ATRA en los adipocitos cultivados se encontraron los genes Ucp1, Ppara,
Ppargc1b, Tfb2m, Yy1, Atp5f1 y Cox8b. Para investigar el impacto del ATRA sobre las
mitocondrias del TAB in vivo, cuantificamos la expresión de los ARNm de estos genes en
los depósitos inguinal, retroperitoneal y epididimal de TAB en los ratones tratados con 50
mg de ATRA por kg de peso corporal en comparación con los animales control tratados
con vehículo. Como se puede observar en la Figura 4.1.2, los ARNm estudiados
aumentaron significativamente sus niveles, especialmente en los depósitos viscerales, en
los ratones tratados con ATRA. También analizamos la expresión de algunos de estos genes
en el TAM, en donde el tratamiento in vivo con ATRA incrementó los niveles de expresión
de Ucp1, Ppara y Cox8b, pero no de Atp5f1 (Figura 4.1.3A). A modo de control del
tratamiento, se constató que la expresión de Cyp26a1 resultó fuertemente inducida en los
tejidos adiposos de los ratones tratados con ATRA, lo que se muestra para el TAM en la
misma Figura 4.1.3A (Cyp26a1 es un gen diana del ATRA que codifica para una proteína
implicada en su catabolismo intracelular).
Asimismo, cuantificamos el impacto del tratamiento con ATRA sobre los niveles de
expresión en los depósitos de TAB de una serie de genes que han sido propuestos como
marcadores del fenotipo beige/BRITE, en concreto Slc27a1, Cd137, Tmem26, Hoxc9 y
Tbx1 (descritos en (de Jong et al., 2015; García-Ruiz et al., 2015; Wu et al., 2012)). El
tratamiento con ATRA aumentó la expresión de Cd137 en todos los depósitos estudiados
pero la expresión de Slc27a1, Hoxc9 y Tbx1 sólo en algunos de ellos, principalmente los
depósitos viscerales (Figura 4.1.2). Además, se encontró una disminución de la expresión
de Tmem26 en todos los depósitos de TAB en los ratones tratados con ATRA (Figura 4.1.2).
En la Figura 4.1.4 se presenta la expresión relativa de estos diferentes genes en los tres
depósitos de TAB en los animales control. Comparativamente, el depósito de TAB inguinal
(subcutáneo) mostró mayores niveles de expresión del gen Ucp1 y de genes que codifican
para factores de transcripción y cofactores que rigen la expresión génica de la β-oxidación
de ácidos grasos y la biogénesis mitocondrial (esto es Ppara y Ppargc1b) respecto de los
depósitos viscerales, mientras que los depósitos viscerales (retroperitoneal y epididimal)
mostraron una mayor expresión con respecto al subcutáneo de genes que codifican para la
maquinaria OXPHOS (especialmente Atp5f1 y Cox8b). Aunque siempre muy por debajo
de los niveles de expresión observados para dichos genes en el TAM (véase la Figura
4.1.3B). En cuanto a los genes relacionados con el fenotipo beige/BRITE, la mayoría se
encontraron expresados a mayor nivel en TAB inguinal (subcutáneo) que en los depósitos
viscerales: esto fue así para Slc27a1, Tmem26 y Tbx1 y también para Cd137, más expresado
en TABi que en TABe (P=0,014, t de Student de dos colas) (Figura 4.1.4). La excepción
fue Hoxc9, que encontramos más expresado en los depósitos viscerales (retroperitoneal y
epididimal) (Figura 4.1.4). En conjunto, estos resultados están de acuerdo con resultados
previos que indican que el TAB subcutáneo es más propenso a la marronización que el
TAB visceral (Seale and Lazar, 2009) y que los adipocitos viscerales de roedores y
humanos contienen más mitocondrias y tienen una mayor capacidad oxidativa que los
adipocitos subcutáneos (Deveaud et al., 2004; Kraunsoe et al., 2010).
Resultados y Discusión
Capítulo 1
67
Figura 4.1.5. Microfotografías representativas de secciones de tejido adiposo blanco inguinal
(TABi, A), retroperitoneal (TABrp, B) y epididimal (TABe, C) de ratones NMRI tratados con 50
mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva; control) por inyección
subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio. Los recuadros en la parte superior
derecha de las microfotografías muestran la inmunopositividad de COXIV, y los recuadros en la
parte inferior izquierda, la inmunopositividad de UCP1.
Para profundizar más en el impacto del ATRA sobre las mitocondrias del TAB, se realizó
tinción inmunohistoquímica con anticuerpos anti-COXIV y anti-UCP1 y se determinaron
los niveles de ADN mitocondrial respecto al ADN nuclear en los depósitos de TAB
inguinal, retroperitoneal y epididimal de los ratones tratados con 50 mg de ATRA por kg
de peso corporal en comparación con los animales control tratados con vehículo. En la
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
68
Figura 4.1.5 se muestran microfotografías representativas de estos diferentes depósitos de
TAB. El estudio histológico reveló adipocitos más pequeños en todos los depósitos de TAB
estudiados y la presencia de células multiloculares específicamente en el depósito
subcutáneo (TAB inguinal) en los ratones tratados con ATRA, en concordancia con
estudios previos (Mercader et al., 2006). El estudio inmunohistológico, por su parte, reveló
una mayor positividad de COXIV en todos los depósitos de TAB estudiados en los animales
tratados con ATRA. En depósitos viscerales (retroperitoneal y epididimal), el tratamiento
con ATRA conllevó una mayor positividad de COXIV en el citoplasma de adipocitos
uniloculares, sin positividad para la UCP1 (Figura 4.1.5B y C). Mientras que en el depósito
subcutáneo (inguinal) el tratamiento con ATRA conllevó la aparición de adipocitos
multiloculares que fueron altamente positivos para ambas proteínas, COXIV y UCP1
(Figura 4.1.5A).
Figura 4.1.6. Niveles de ADN mitocondrial respecto al ADN nuclear en los tejidos adiposos
blancos inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal (TABe) (A) y en el tejido adiposo
marrón (TAM) (B) de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con
vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al
sacrificio. Comparación de los niveles de ADN mitocondrial respecto al ADN nuclear entre los
distintos tejidos adiposos blancos estudiados (C) y entre el TAM y el TABi (D) en el grupo control.
Los datos normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto
al grupo control (en A y B) o en porcentaje respecto al TABi (en C y D) y son la media±SEM de 8-
11 animales por grupo. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05)
de acuerdo con el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS. # Diferente del
TABi (P<0,05; prueba t de Student de dos colas).
Resultados y Discusión
Capítulo 1
69
A diferencia de lo que sucede en los adipocitos 3T3-L1 (Tourniaire et al., 2015), los niveles
de ADN mitocondrial respecto al nuclear no se encontraron aumentados en ninguno de los
depósitos de TAB estudiados tras el tratamiento con ATRA in vivo (Figura 4.1.6A), y
tampoco en el TAM (Figura 4.1.6B). Los resultados obtenidos del tejido entero representan
la suma de las contribuciones de todos los tipos de células en el tejido y pueden generar
resultados diferentes a los observados en las condiciones/dosis del cultivo celular de
adipocitos maduros. Además, en otros sistemas celulares se ha demostrado que el ATRA
puede incrementar la bioenergética mitocondrial y el consumo de oxígeno, incluso sin
ningún aumento en el número de mitocondrias (Xun et al., 2012). Comparando la ratio
ADN mitocondrial/ADN nuclear entre los distintos depósitos de TAB en los animales
control (Figura 4.1.6C) vemos que los depósitos viscerales (retroperitoneal y epididimal)
presentaron un mayor contenido de ADN mitocondrial que el depósito subcutáneo
(inguinal), en concordancia con nuestros resultados de expresión de genes que codifican
para la maquinaria OXPHOS (también más expresados en los depósitos adiposos
viscerales) y resultados previos (Deveaud et al., 2004; Kraunsoe et al., 2010), y siempre
por debajo de los niveles de ADN mitocondrial observados en el TAM (Figura 4.1.6D).
En conjunto, los resultados presentados en esta sección demuestran un aumento de la
función mitocondrial en el TAB de los animales tratados con ATRA. Los resultados
también indican que, de los diferentes marcadores candidatos de adipocito beige/BRITE
ensayados, sólo Cd137 y tal vez Slc27a1 marcan la marronización del TAB inducida por
el tratamiento in vivo con ATRA en ratones. Mientras que otros marcadores candidatos,
como Hoxc9 y Tbx1, no cumplen el criterio de aumentar tras un estímulo de marronización
in vivo.
4.1.2.2. Efecto del tratamiento con ATRA sobre la expresión del gen de la IRISINA
en tejido adiposo e hígado de ratón
El músculo esquelético secreta toda una serie de moléculas señal reguladoras,
colectivamente denominadas mioquinas, como parte de cambios adaptativos,
especialmente cambios metabólicos asociados a la actividad física. Estas mioquinas no sólo
pueden actuar localmente en el músculo de manera autocrina/paracrina, sino que también
son liberadas al torrente sanguíneo como factores endocrinos para regular procesos
fisiológicos en tejidos distantes. Se ha propuesto que algunas mioquinas pueden ser señales
mediadoras de las acciones biológicas beneficiosas de la actividad física.
La IRISINA, derivada de la escisión de la proteína de membrana FNDC5, es una mioquina
que induce la marronización del TAM y un aumento concomitante del gasto energético
(Rodríguez et al., 2017). El tratamiento con ATRA en ratones provoca, junto con la
marronización del TAB (apartado anterior y (Mercader et al., 2006)), cambios metabólicos
en el músculo esquelético que recuerdan a los asociados a la actividad física, esto es,
aumenta la capacidad de oxidación de ácidos grasos, la respiración mitocondrial y la
termogénesis y reduce el contenido de lípidos intramiocelulares (Amengual et al., 2008;
Berry and Noy, 2009; Felipe et al., 2003). Interesantemente, el tratamiento con ATRA (en
las mismas condiciones usadas en esta tesis) incrementa los niveles circulantes de IRISINA
en ratones pero no la expresión de Fndc5 en músculo esquelético (Ribot J, Bonet ML y
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
70
Palou A, datos no publicados). Por otro lado, se ha descrito que el tejido adiposo no sólo
constituye un objetivo para la IRISINA, sino que también expresa el gen Fndc5 y secreta
IRISINA, aunque en menor medida que el músculo esquelético (Moreno-Navarrete et al.,
2013; Roca-Rivada et al., 2013). Más recientemente se ha descrito que el hígado también
expresa el gen Fndc5 y secreta IRISINA (Mo et al., 2016). El tratamiento con ATRA afecta
el metabolismo del hígado (Amengual et al., 2010), el TAM (Bonet et al., 2000; Puigserver
et al., 1996) y el TAB (Bonet et al., 2007; Mercader et al., 2006; Ribot et al., 2001), por lo
que podría afectar la producción en estos tejidos de señales de secreción reguladoras, como
la IRISINA.
Figura 4.1.7. Niveles de expresión de Fndc5 en hígado, tejido adiposo marrón (TAM) y tejido
adiposo blanco inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal (TABe) de ratones NMRI
tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección
subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio (A). Comparación de los niveles de
expresión de Fndc5 entre los distintos tejidos adiposos estudiados (B) y entre el hígado y el TABi
(C) en el grupo control. Los datos normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se
expresan en porcentaje respecto al grupo control (en A) o en porcentaje respecto al TABi (en B y
C) y son la media±SEM de 8-11 animales por grupo. * Diferente del grupo control tratado con
vehículo y # diferente del TABi (P<0,05; prueba t de Student de dos colas). Letras diferentes indican
diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con el análisis ANOVA de una vía
seguido de la prueba post-hoc DMS.
Resultados y Discusión
Capítulo 1
71
Por todo ello, en esta tesis hemos analizado la expresión del gen Fndc5 en el hígado, el
TAM y en el TAB inguinal, retroperitoneal y epididimal de ratones NMRI (de 13 semanas
de edad) tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de
oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio.
Como se puede ver en la Figura 4.1.7A, el tratamiento con ATRA incrementó los niveles
de expresión del gen Fndc5 en hígado, TAM y TAB epididimal, y tendió a incrementarlos
en los otros dos depósitos de TAB estudiados. Comparativamente, entre los tejidos
adiposos la menor expresión de Fndc5 se encontró en el TAB epididimal (Figura 4.1.7B),
lo que estaría de acuerdo con resultados previos en ratas que indican menores niveles de
IRISINA en TAB visceral que en subcutáneo (Roca-Rivada et al., 2013), y es destacable
que los niveles de expresión de Fndc5 fueron mucho más altos en hígado que en cualquiera
de los tejidos adiposos (Figura 4.1.7C).
En conjunto, nuestros datos sugieren un origen hepático del incremento de la IRISINA
circulante en los animales tratados con ATRA y que los efectos del ATRA sobre la
marronización del TAB en parte podrían ser debidos a una acción indirecta a través de la
IRISINA de origen hepático. Se ha descrito que la inducción de Fndc5 selectivamente en
hígado induce la marronización del TAB en ratones (Mo et al., 2016). Nuestros resultados
también sugieren un efecto potenciador de la activación de la termogénesis y marronización
de los tejidos adiposos por un mecanismo autocrino/paracrino de la IRISINA de origen
adiposo, asimismo estimulado por el tratamiento con ATRA. En esta línea, se ha descrito
que la secreción de IRISINA por células 3T3-L1 resulta potenciada después de inducir en
ellas características de marronización mediante el knockdown de la proteína del
retinoblastoma (Moreno-Navarrete et al., 2013).
4.1.2.3. Identificación de la ratio Rarb/Rxrg como nuevo marcador transcriptómico de
marronización del TAB in vivo
En los últimos años se han dirigido numerosos esfuerzos a la identificación de marcadores
transcriptómicos que permitan distinguir los preadipocitos y adipocitos beige/BRITE
(Petrovic et al., 2010; Wu et al., 2012) y diferenciar los depósitos grasos en función de su
riqueza en diferentes tipos de adipocitos (beige/BRITE, marrón y blanco) (de Jong et al.,
2015). No obstante, los marcadores de adipocito beige/BRITE identificados en general no
tienen funciones termogénicas o adipogénicas aparentes, y su expresión parece estar más
ligada a la localización anatómica de los depósitos grasos que a las características
estructurales y funcionales de estos (Long et al., 2014).
Por ello, aquí nos planteamos investigar en marcadores de marronización del TAB con una
función bioquímica/metabólica. Concretamente, marcadores basados en la expresión en
TAB de factores de transcripción y proteínas de unión a lípidos que median las acciones
celulares del ATRA, un potente remodelador metabólico del TAB en roedores (Mercader
et al., 2006). En adipocitos y músculo esquelético, la actividad del ATRA está mediada en
gran parte por la activación de los heterodímeros de los receptores X de retinoides (RXRs)
con los receptores de ácido retinoico (RARs) o con el receptor activado por proliferadores
peroxisomales (PPAR) β/δ y sus respectivas proteínas intracelulares de unión a ácido
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
72
retinoico asociadas, CRABP-II (que transfiere el ATRA al RAR) y FABP5 (que transfiere
el ATRA al PPARβ/δ), lo que lleva a una mayor oxidación de lípidos, funcionalidad y
biogénesis mitocondrial y disipación de energía (Amengual et al., 2008; Berry and Noy,
2009; Mercader et al., 2006; Tourniaire et al., 2015).
Figura 4.1.8. Comparación de los niveles de expresión de genes relacionados con la mitocondria y
marcadores de adipocitos beige/BRITE (A) y de genes para factores de transcripción y proteínas de
unión a lípidos asociadas que median la acción del ATRA (B) en adipocitos no estimulados (células
control) derivados de la fracción estromal vascular (SVF) del tejido adiposo marrón (TAM), tejido
adiposo blanco inguinal (TABi) y TAB epididimal (TABe) de ratones NMRI. Los datos
normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto a las
células derivadas del TABi y son la media±SEM de dos experimentos independientes por
duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con
el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS.
En una primera fase, que podríamos llamar de prospección, se establecieron cultivos
primarios a partir de la fracción estromal vascular (SVF) de TAM, TAB inguinal y TAB
epididimal de ratones NMRI, una cepa de ratón relativamente propensa genéticamente a la
marronización en comparación con otras (Petrovic et al., 2010). Las células se dejaron
diferenciar (de manera espontánea) in vitro en adipocitos maduros, utilizando un protocolo
de diferenciación idéntico para las tres SVF, el empleado rutinariamente para cultivos
Resultados y Discusión
Capítulo 1
73
primarios de (pre)adipocitos marrones (Bonet et al., 1997; Petrov et al., 2016b; Petrovic et
al., 2010; Siersbæk et al., 2012). A día 7, cuando más del 50% de las células se habían
diferenciado en adipocitos llenos de lípidos, se trataron con dos de los principales
reguladores de la expresión de la UCP1 (Palou et al., 1998; Silva and Rabelo, 1997), esto
es noradrenalina (NA) o ATRA, durante 24h, para evidenciar el fenotipo celular. En los
cultivos estimulados y en cultivos control no estimulados determinamos la expresión de
Ucp1 y otros genes relacionados con la termogénesis, genes marcadores de adipocitos
beige/BRITE y genes para factores de transcripción y proteínas de unión a lípidos asociadas
que median la acción del ATRA.
Como era de esperar (Petrovic et al., 2010; Siersbæk et al., 2012), los adipocitos derivados
de TAM, TAB inguinal y TAB epididimal mostraron en condiciones basales (sin
estimulación por NA o ATRA) perfiles de expresión génica que reflejan las características
termogénicas y metabólicas de sus respectivos depósitos (Figura 4.1.8). Los adipocitos
derivados de TAM mostraron una expresión incrementada de Ucp1, Prdm16, Ppargc1a,
Cpt1b y Cox8b, todos ellos genes clásicamente relacionados con la termogénesis y el TAM,
y de Pparg, gen fundamental para la diferenciación/función de todo tipo de adipocitos
(Koppen and Kalkhoven, 2010), con respecto a los adipocitos derivados de TAB; los
adipocitos derivados del depósito de TAB epididimal fueron los que mostraron los niveles
más bajos de expresión de estos genes. Por otro lado, los adipocitos derivados de TAB,
especialmente del depósito inguinal, mostraron una expresión incrementada de los
marcadores de adipocito beige/BRITE Slc27a1, Hoxc9 y Tbx1 respecto de los adipocitos
derivados de TAM. También encontramos diferencias entre los adipocitos cultivados
derivados de los distintos depósitos grasos en la expresión de los receptores de ATRA y
sus proteínas asociadas (Figura 4.1.8B), que igualmente reflejan características de los
tejidos y depósitos de origen (Alvarez et al., 1995; Landrier et al., 2012; Villarroya et al.,
1999). Así, encontramos una mayor expresión de Rarb y menor de Rara en los adipocitos
derivados de TAM frente a los derivados de TAB, y una menor expresión de Rxrb, Rxrg,
Pparb/d y Fabp5 y mayor de Rarg y Crabp2 en los adipocitos derivados del depósito
blanco por excelencia, el TAB epididimal, con respecto a los derivados de TAM y TAB
inguinal.
Al estimular las células se hizo evidente que los adipocitos cultivados derivados de TAM,
TAB inguinal y TAB epididimal presentaron, en los tres casos, características de adipocito
tipo marrón ya que, en todos ellos, la estimulación aguda (1µM durante 24h) con NA indujo
la expresión de Ucp1 y Ppargc1a y la estimulación aguda con ATRA, la de Ucp1 (Figuras
4.1.9A, 4.1.10A y 4.1.11A). Aunque no se puede descartar que algunas de las diferencias
de expresión génica observadas aquí (del Pparg y otros genes) obedezcan en parte a
diferencias en el grado de diferenciación de los cultivos (Alvarez et al., 1995; Berry et al.,
2010; Koppen and Kalkhoven, 2010; Villarroya et al., 1999), los resultados sustentan la
existencia de al menos dos tipos de adipocitos diferentes en lo que respecta a su expresión
basal de genes termogénicos, pero ambos susceptibles de inducir la expresión de Ucp1, y
que se corresponderían, por tanto, con adipocitos marrones y adipocitos beige/BRITE. No
obstante, los marcadores de adipocito beige/BRITE Slc27a1, Cd137, Tmem26, Hoxc9 y
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
74
Tbx1 no cumplieron los criterios esperables de resultar inducidos tras un estímulo de
activación de la capacidad termogénica como es el tratamiento agudo con NA o ATRA
(Figuras 4.1.9A, 4.1.10A y 4.1.11A), lo que nos animó en nuestra idea de identificar nuevos
marcadores de adipocitos beige/BRITE funcionales.
Figura 4.1.9. Niveles de expresión de genes relacionados con la mitocondria y marcadores de
adipocitos beige/BRITE (A) y de genes para los factores de transcripción y proteínas de unión a
lípidos asociadas que median la acción del ATRA (B) en adipocitos derivados de la fracción
estromal vascular del tejido adiposo marrón (TAM) estimulados a día 7 de cultivo con 1µM
noradrenalina (NA) o 1µM ácido retinoico todo-trans (ATRA) durante 24h. Los datos normalizados
a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto a las células control
no estimuladas y son la media±SEM de dos experimentos independientes por duplicado. Letras
diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con el análisis
ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS.
Nos centramos en la búsqueda de marcadores de adipocitos beige/BRITE funcionales
relacionados con la señalización por ATRA. Al analizar la expresión génica de los factores
de transcripción (Rara, Rarb, Rarg, Rxra, Rxrb, Rxrg y Pparb/d) y las proteínas de unión
a lípidos asociadas a ellos (Crabp2 y Fabp5) que median las acciones celulares del ATRA
observamos que el tratamiento agudo con ATRA indujo o tendió a aumentar la expresión
de Rarb, Rarg y Crabp2 e inhibió o tendió a disminuir la de Rara en los adipocitos marrones
derivados de TAM (Figura 4.1.9B) y los adipocitos beige/BRITE derivados de TAB
inguinal y TAB epididimal (Figuras 4.1.10B y 4.1.11B). Esto está de acuerdo con
Resultados y Discusión
Capítulo 1
75
resultados previos que indican que los efectos del ATRA sobre la capacidad termogénica
de los adipocitos estarían canalizados por la vía CRABP2-RAR (Alvarez et al., 1995;
Berry and Noy, 2009; Murholm et al., 2013; Tourniaire et al., 2015). Es interesante destacar
que el tratamiento agudo con NA también moduló la expresión de algunos genes
relacionados con la señalización del ATRA en los cultivos primarios de adipocitos.
Concretamente el tratamiento con NA indujo la expresión de Crabp2 en los adipocitos
marrones derivados de TAM (Figura 4.1.9B) y disminuyó o tendió a disminuir la expresión
de Rxrg en los adipocitos marrones derivados de TAM (Figura 4.1.9B) y en los adipocitos
beige/BRITE derivados de TAB inguinal (Figura 4.1.10B).
Figura 4.1.10. Niveles de expresión de genes relacionados con la mitocondria y marcadores de
adipocitos beige/BRITE (A) y de genes de los factores de transcripción y proteínas de unión a
lípidos asociadas que median la acción del ATRA (B) en adipocitos derivados de la fracción
estromal vascular del tejido adiposo blanco inguinal (TABi) estimulados a día 7 de cultivo con
1µM noradrenalina (NA) o 1µM ácido retinoico todo-trans (ATRA) durante 24h. Los datos
normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto a las
células control no estimuladas y son la media±SEM de dos experimentos independientes por
duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con
el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
76
Figura 4.1.11. Niveles de expresión de genes relacionados con la mitocondria y marcadores de
adipocitos beige/BRITE (A) y de genes para los factores de transcripción y proteínas de unión a
lípidos asociadas que median la acción del ATRA (B) en adipocitos derivados de la fracción
estromal vascular del tejido adiposo blanco epididimal (TABe) estimulados a día 7 de cultivo
con 1µM noradrenalina (NA) o 1µM ácido retinoico todo-trans (ATRA) durante 24h. Los datos
normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto a las
células control no estimuladas y son la media±SEM de dos experimentos independientes por
duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con
el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS.
Considerando (i) los efectos de los dos tratamientos “pro-termogénicos” aplicados sobre la
expresión de genes clave de la señalización por ATRA, que muestran inducción de Rarb
por ATRA (en adipocitos marrones y beige/BRITE) y represión de Rxrg por NA
(especialmente en adipocitos beige/BRITE) y (ii) los niveles de expresión basales de estos
genes en los adipocitos derivados de TAM y de TAB, que muestran una expresión de Rarb
mucho mayor en los adipocitos derivados de TAM, proponemos la ratio entre el nivel de
expresión de Rarb y de Rxrg como un nuevo marcador de marronización en adipocitos
derivados de TAB. Como se observa en la Figura 4.1.12 la ratio Rarb/Rxrg se encuentra
incrementada significativamente en los adipocitos derivados de TAB tratados con NA y con
ATRA con respecto a sus respectivos controles, mientras que en los adipocitos derivados de
TAM solamente se ve incrementada con el tratamiento con ATRA.
Resultados y Discusión
Capítulo 1
77
Figura 4.1.12. Ratio entre los niveles de expresión de Rarb y Rxrg en adipocitos derivados de la
fracción estromal vascular del tejido adiposo marrón (TAM), tejido adiposo blanco inguinal (TABi)
y TAB epididimal (TABe) estimulados a día 7 de cultivo con 1µM noradrenalina (NA) o 1µM ácido
retinoico todo-trans (ATRA) durante 24h. Los datos se expresan en porcentaje respecto a las células
control no estimuladas de cada tejido y son la media±SEM de dos experimentos independientes por
duplicado. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con
el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS.
A continuación quisimos validar nuestro nuevo marcador de marronización en el modelo
animal caracterizado en los apartados anteriores. Para ello, analizamos la expresión de los
factores de transcripción (Rara, Rarb, Rarg, Rxra, Rxrb, Rxrg y Pparb/d) y proteínas de
unión a lípidos asociadas (Crabp2 y Fabp5) que median la acción del ATRA, junto con la
de Pparg, en diferentes depósitos de TAB y en el TAM de ratones NMRI tratados con 50
mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección
subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio.
Figura 4.1.13. Comparación de los niveles de expresión de genes de los factores de transcripción
y proteínas de unión a lípidos asociadas que median la acción del ATRA en el tejido adiposo marrón
(TAM) y en los tejidos adiposos blancos inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal
(TABe) en ratones NMRI (grupo control). Los datos normalizados a la expresión del gen de
referencia Actb se expresan en porcentaje respecto al depósito inguinal y son la media±SEM de 8-
11 animales por grupo. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05)
de acuerdo con el análisis ANOVA de una vía seguido de la prueba post-hoc DMS.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
78
Como se observa en la Figura 4.1.13, encontramos diferencias en la expresión de los receptores
del ATRA y sus proteínas asociadas entre los distintos tipos de tejido adiposo (blanco y marrón)
y entre los distintos depósitos TAB (inguinal, retroperitoneal y epididimal) de los ratones
NMRI. En general, estas diferencias están en concordancia con los datos publicados (Alvarez
et al., 1995; Landrier et al., 2012; Villarroya et al., 1999). Así, encontramos una expresión
mucho mayor de Rarb, Rxra, Rxrg y Crabp2 en el TAM con respecto al TAB. Y una mayor
expresión de Rarb y Rxrb y menor de Rara, Rxrg y Pparb/d en el depósito de TAB con mayor
capacidad de remodelación (el inguinal) con respecto al TAB por excelencia (el epididimal).
La expresión del Pparg fue máxima en el TAM, seguido de los depósitos viscerales de TAB.
En la Figura 4.1.14 (A-D) se presentan los efectos del tratamiento con ATRA in vivo en ratones
sobre la expresión de estos genes. El tratamiento con ATRA aumentó o tendió a aumentar la
expresión de Rarb, Rarg y Crabp2 y redujo la de Fabp5 en todos los tejidos adiposos
estudiados, lo que está en consonancia con nuestros resultados en los cultivos primarios de
(pre)adipocitos y con la bibliografía que indica que los efectos del ATRA sobre la capacidad
termogénica de los adipocitos están mediados por la vía CRABP2-RAR (Alvarez et al., 1995;
Berry and Noy, 2009; Murholm et al., 2013; Tourniaire et al., 2015). Además, el tratamiento
in vivo con ATRA aumentó la expresión de Rxrb y Rxrg en el TAM y redujo la de Rara en los
depósitos de TAB inguinal y TAB retroperitoneal. La expresión de Pparg, por su parte, se vio
disminuida en los depósitos viscerales de TAB (epididimal y retroperitoneal), en concordancia
con resultados previos que muestran al TAB epididimal como el más sensible a los efectos
antiadipogénicos del ATRA (Ribot et al., 2001).
Resultados y Discusión
Capítulo 1
79
Figura 4.1.14. Niveles de expresión de genes para los factores de transcripción y proteínas de unión
a lípidos asociadas que median la acción del ATRA en el tejido adiposo marrón (TAM, A) y en los
tejidos adiposos blancos inguinal (TABi, B), retroperitoneal (TABrp, C) y epididimal (TABe, D)
en ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de
oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos
normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto al grupo
control y son la media±SEM de 8-11 animales por grupo. * Diferente del grupo control tratado con
vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba t de Student de dos colas).
Al calcular la ratio entre el nivel de expresión de Rarb y de Rxrg como nuevo marcador de
marronización del TAB en nuestro modelo animal, observamos que dicha ratio Rarb/Rxrg
se ve significativamente incrementada tras el tratamiento con ATRA en todos los
depósitos de TAB, pero no en el TAM (Figura 4.1.15A). El nuevo marcador propuesto
aquí muestra en nuestro modelo un comportamiento parecido al de algunos marcadores de
adipocito beige/BRITE previamente descritos y aquí ensayados, como el Cd137 y tal vez
Slc27a1 (Figura 4.1.2). Interesantemente, la ratio Rarb/Rxrg como marcador muestra el
proceso de marronización de TAB diferenciado del proceso de activación del TAM. Así,
encontramos una correlación directa significativa entre la ratio Rarb/Rxrg y la expresión
de Ucp1 en el TAB pero no en el TAM (Figuras 4.1.15B y C, respectivamente).
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
80
Figura 4.1.15. Ratio entre los niveles de expresión de Rarb y Rxrg (A) en el tejido adiposo marrón
(TAM) y en los tejidos adiposos blancos inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal
(TABe) de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo
(aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio.
Correlación del ratio entre los niveles de expresión de Rarb y Rxrg con los niveles de expresión de
Ucp1 en el TAB (B) y en el TAM (C). Los datos se expresan en porcentaje respecto al grupo control
y son la media±SEM de 8-11 animales por grupo. * Diferente del grupo control tratado con vehículo
(P<0,05; prueba t de Student de dos colas). r, Coeficiente de Pearson.
Los biomarcadores son particularmente interesantes si están ligados a muestras no
invasivas, fácilmente accesibles. Por ello, evaluamos la traslación de estos hallazgos en
TAB a la expresión génica de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Sin
embargo, la ratio Rarb/Rxrg no se encontró incrementada en las PBMC de los animales
tratados con ATRA (tratados con vehículo versus ATRA: 100±2 versus 67±17, n=3-5, no
significativo, U de Mann-Whitney), como tampoco la expresión génica en estas células
reflejó los efectos del ATRA de inhibir la adipogénesis y la expresión de ciertas
adipoquinas en TAB y adipocitos blancos (Petrov et al., 2016a). Así, nuestros resultados
apoyarían la idea de que la expresión génica en sangre total/PBMC refleja preferentemente
los efectos o imita el escenario metabólico encontrado en tejidos muy densamente
vascularizados como hígado o TAM (Petrov et al., 2016a) o procesos en TAB
estrechamente asociados con una activación de la angiogénesis (Voigt et al., 2015).
Resultados y Discusión
Capítulo 1
81
4.1.3. Discusión
Los adipocitos blancos de los depósitos de TAB son pobres en mitocondrias y tienen una
baja capacidad oxidativa y termogénica en concordancia a su función de almacén de
energía, mientras que lo contrario es cierto para los adipocitos marrones de los depósitos
de TAM, dada su especialización en la disipación regulada de energía o termogénesis
adaptativa a través de la actividad de la UCP1. La estimulación del gasto energético en el
TAB es una estrategia antiobesidad potencial, que puede lograrse activando en los
adipocitos blancos la termogénesis mediada por UCP1 y/o un ciclo de sustrato fútil de
hidrólisis de triacilgliceroles intracelulares y subsiguiente reesterificación de ácidos grasos
(ciclo TAG/FA) (Flachs et al., 2013). En estudios previos se demostró que el ATRA puede
inducir la UCP1 (Mercader et al., 2010; Tourniaire et al., 2015) y estimular un ciclo
TAG/FA en adipocitos blancos maduros cultivados, en asociación con un aumento de la β-
oxidación (Mercader et al., 2007). Además, se ha descrito un efecto positivo del ATRA
sobre la capacidad oxidativa y termogénica del TAB, vinculado a su efecto antiobesogénico
(Berry and Noy, 2009; Mercader et al., 2007; Mercader et al., 2006). Es importante destacar
que la activación de cualquiera de los dos mecanismos (UCP1 o ciclo fútil) debe
acompañarse de la inducción de la β-oxidación de los ácidos grasos y de la capacidad
OXPHOS mitocondrial para alcanzar un efecto significativo sobre el contenido intracelular
de lípidos o el gasto energético. Aquí, presentamos pruebas de un aumento de la función
mitocondrial en el TAB de los animales tratados con ATRA, necesaria para ambos
mecanismos de disipación de energía, los dependientes de UCP1 y los independientes de
UCP1.
Interesantemente, el tratamiento in vivo con ATRA indujo en el TAB subcutáneo (inguinal)
la aparición de células multiloculares similares a los adipocitos marrones y positivas para
UCP1 ‒ es decir, adipocitos beige/BRITE ‒ mientras que en los depósitos viscerales el
tratamiento con ATRA aumentó la capacidad OXPHOS sin inducir la aparición de tales
células. Además, nuestros resultados refuerzan la idea que el TAB subcutáneo es más
propenso a la marronización que el visceral, mientras que los depósitos de TAB viscerales
contienen más mitocondrias y tienen mayor capacidad oxidativa que los subcutáneos.
Parece, por lo tanto, que el tratamiento con ATRA es capaz de potenciar capacidades
intrínsecas diferenciales de cada tipo de depósito adiposo.
El efecto marronizante del TAB inducido por el ATRA in vivo sería consecuencia de
efectos directos sobre los adipocitos, pero podría estar potenciado por mecanismos de
acción indirectos. De hecho, nuestros resultados apuntan a una posible participación de la
IRISINA de origen hepático y de la IRISINA producida por el propio tejido adiposo, ya
que muestran que la expresión de esta señal marronizadora se induce en estos tejidos en
los animales tratados con ATRA.
En tanto que se considera la marronización del tejido adiposo como una potencial diana
antiobesidad (Bonet et al., 2013), la identificación y validación de marcadores de
marronización de TAB es de interés, ya que estos marcadores pueden servir para simplificar
y acortar ensayos en animales de nuevos ingredientes u otras intervenciones dietéticas
antiobesidad, y encontrar aplicabilidad en la sustanciación de declaraciones de propiedades
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
82
saludables en alimentos en relación con la obesidad, la adiposidad y problemas de salud
relacionados con la obesidad. Los adipocitos beige/BRITE muestran un patrón de expresión
génica distintivo (Wu et al., 2012), lo que ha llevado a la identificación de marcadores
transcriptómicos específicos para distinguirlos (de Jong et al., 2015; Petrovic et al., 2010;
Wu et al., 2012). Todavía no está claro si el empleo de estos marcadores de fenotipo
beige/BRITE para medir el grado de marronización en el TAB representa una mejora con
respecto a la evaluación de las transcripciones de los genes termorreguladores. De hecho,
mientras que la mayoría de dichos marcadores se expresan claramente en adipocitos
beige/BRITE en cultivo, hay discrepancias en cuanto a la especificidad de algunos de estos
marcadores para identificar marronización in vivo por su pequeño rango dinámico, potencia
del estímulo de marronización y edad de los ratones, cosa que pueden limitar su utilidad
(Garcia et al., 2016).
Nuestros resultados indican que Cd137 y tal vez Slc27a1 pueden tener utilidad como
marcadores de marronización en el TAB y discriminar adipocitos beige/BRITE, así como
adipocitos uniloculares con la función mitocondrial incrementada, de adipocitos blancos
puros in vivo. No obstante, otros marcadores de adipocitos beige/BRITE ensayados de los
propuestos en la literatura no cumplieron el criterio de aumentar tras un estímulo de
marronización como es el tratamiento con ATRA. Esto nos reafirmó en nuestro objetivo de
identificar nuevos marcadores de marronización funcionales, para lo que explotamos
paradigmas de marronización de adipocitos en cultivo primario (tratamiento con NA y
ATRA) y de marronización in vivo (tratamiento con ATRA por vía subcutanea).
Los resultados en adipocitos en cultivo primario sustentaron la existencia de al menos dos
tipos de adipocitos en lo que respecta a su expresión basal de genes termogénicos y de
genes relacionados con la señalización por ATRA, los adipocitos derivados de TAM (que
se corresponderían con adipocitos marrones) y los derivados de TAB (que se
corresponderían con adipocitos beige/BRITE). La consideración integrada de las
diferencias entre ambos tipos de adipocitos en el estado basal (no estimulado) y de los
efectos de los dos tratamientos “pro-termogénicos” aplicados nos ha llevado a proponer la
ratio entre el nivel de expresión de Rarb y de Rxrg como un posible nuevo marcador
de marronización. Este nuevo marcador incrementa en los adipocitos derivados de TAB
estimulados con NA y ATRA e, interesantemente, puede discriminar entre la activación del
TAM y la marronización del TAB in vivo, al menos en los animales tratados con ATRA.
4.1.4 Conclusión
En resumen, este trabajo demuestra que el ATRA, en su efecto antiobesogénico, impacta
en las mitocondrias de los adipocitos blancos, lo que lleva a una mayor funcionalidad
mitocondrial, necesaria tanto para los mecanismos de disipación de energía dependientes
de UCP1 como los independientes de UCP1 (e.g. ciclo fútil de hidrólisis de triacilgliceroles
intracelulares y reesterificación de ácidos grasos) (Bonet et al., 2013; Flachs et al., 2013).
Más aún, el tratamiento con ATRA es capaz de potenciar capacidades intrínsecas
diferenciales de cada depósito de TAB. Así, mientras que adipocitos tipo marrón
(multiloculares y que expresan UCP1) son fácilmente inducidos in vivo en el TAB
subcutáneo (inguinal) de ratones tratados con ATRA, en los depósitos viscerales
Resultados y Discusión
Capítulo 1
83
(retroperitoneal y epididimal) el tratamiento con ATRA aumenta la capacidad funcional de
las mitocondrias sin inducir la aparición de tales células. Algunos marcadores de adipocito
beige/BRITE (notablemente Cd137) son inducidos en el TAB subcutáneo y visceral de los
ratones tratados con ATRA, mostrando utilidad como marcadores de marronización o
activación metabólica del TAB, al marcar in vivo tanto los adipocitos tipo marrón inducidos
como los adipocitos uniloculares con la función mitocondrial incrementada. Además,
nuestros datos nos permiten identificar la ratio Rarb/Rxrg como un nuevo marcador de
marronización o activación metabólica del TAB. Nuestros datos también apoyan la idea de
que los efectos del ATRA sobre la capacidad oxidativa de los adipocitos estarían
canalizados vía Rarb/Crabp2 y sugieren que el efecto marronizante del TAB inducido por
el ATRA podría estar potenciado por mecanismos de acción indirectos a través de la
IRISINA de origen hepático y del propio tejido adiposo.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
84
4.2. Biomarcadores circulantes de la acción metabólica del ácido retinoico: estudio
in vivo (Capítulo 2)
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
86
Resultados y Discusión
Capítulo 2
87
Capítulo 2: Biomarcadores circulantes de la acción metabólica del ácido retinoico:
estudio in vivo
4.2.1. Antecedentes
Resultados previos de nuestro grupo y otros grupos, expandidos en esta tesis (véase el
capítulo 1), indican que en ratones el tratamiento con ATRA incrementa la capacidad para
el metabolismo oxidativo en diferentes tejidos, incluyendo el TAB, en donde se evidencian
signos de marronización tras el tratamiento, el TAM, el hígado y el músculo esquelético
(revisado en (Bonet et al., 2012)). Junto con cambios en la expresión de genes metabólicos,
el tratamiento in vivo con ATRA conlleva la reducción del contenido en grasa corporal y
efectos beneficiosos sobre la tolerancia a la glucosa, la sensibilidad a la insulina y los
niveles de lípidos circulantes. En general, un incremento de la oxidación de combustibles
en los tejidos puede oponerse a la acumulación de grasa y contribuir a reducir los niveles
circulantes de glucosa y lípidos, por lo que puede ser interesante para el control y
tratamiento de la obesidad y complicaciones metabólicas como la diabetes o la
hiperlipidemia, frecuentemente asociadas a la obesidad. Los agentes capaces de inducir tal
incremento son por tanto de posible interés terapéutico.
Para avanzar en la identificación y evaluación de agentes/condiciones capaces de activar el
metabolismo oxidativo a nivel tisular, y así en nuevas estrategias para la prevención y el
tratamiento de la obesidad y sus complicaciones, es importante contar con biomarcadores
fácilmente accesibles, cuyos niveles en sangre u otros fluidos corporales reflejen los
cambios metabólicos propiciados por estos agentes en los tejidos internos. La identificación
de este tipo de biomarcadores puede contribuir asimismo a una mejor definición de los
propios mecanismos de acción de dichos agentes/condiciones, y con ello a una mejor
comprensión del control del metabolismo oxidativo tisular.
La sangre se viene utilizando tradicionalmente como una fuente de marcadores del estado de
salud, la progresión de la enfermedad y la respuesta a intervenciones nutricionales y
farmacológicas frente a ella. Muchos de los biomarcadores establecidos son metabolitos
discretos, cuyos niveles en plasma (o, en casos particulares, en células sanguíneas) son
informativos del estado de salud o de patologías puntuales. Más recientemente se está utilizando
la expresión génica en células sanguíneas como una fuente de posibles marcadores basados en
los niveles de determinados ARN mensajeros o conjuntos de ARN mensajeros. En este sentido,
resultados previos de nuestro grupo ya mostraron que, en ratones tratados con ATRA, la
expresión génica en sangre total refleja algunos de los cambios de expresión de genes metabólicos
que se producen en el hígado y los tejidos adiposos relacionados con la capacidad de oxidación
de ácidos grasos, la termogénesis y la remodelación del TAB (Petrov et al., 2016a).
Las tecnologías ómicas permiten un análisis exhaustivo, no sesgado, de los metabolitos,
proteínas y ARNs presentes en muestras biológicas. Por ello, el análisis metabolómico,
proteómico y transcriptómico de la sangre se está revelando como una fuente de nuevos
marcadores potencialmente útiles en diferentes contextos, incluyendo la obesidad y sus co-
morbilidades. La metabolómica, en particular, se considera una herramienta muy potente a
este fin. Estudios metabolómicos en animales experimentales y en humanos
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
88
obesos/diabéticos han llevado a proponer una serie de posibles marcadores plasmáticos que
estarían alterados en etapas tempranas del desarrollo de la obesidad y sus complicaciones,
o que incluso podrían servir para predecir la susceptibilidad futura a la obesidad. Entre los
biomarcadores asociados a la obesidad propuestos están los niveles de aminoácidos de
cadena ramificada (BCAA, del inglés branched chain amino acids), aminoácidos
aromáticos (AAA, aromatic amino acids), ácidos grasos no esterificados, ácidos orgánicos,
acilcarnitinas y fosfolípidos (Rauschert et al., 2014).
En esta tesis, nos planteamos como objetivo específico identificar y validar/contrastar
marcadores sanguíneos del incremento de la capacidad oxidativa/termogénica en tejidos
adiposos y otros tejidos explotando el modelo de tratamiento con ATRA detallado en el
apartado 3 de Materiales y Métodos (50 mg ATRA/kg peso ratón/día, por vía subcutánea, los
4 días anteriores al sacrificio). Para ello realizamos metabolómica dirigida de plasma y PBMC
de ratones control (a los que se había administrado el vehículo) y ratones tratados con ATRA.
En particular, se cuantificaron simultáneamente los niveles de acilcarnitinas y aminoácidos, así
como una serie de ácidos grasos y metabolitos clave del metabolismo intermediario, mediante
FIA-ESI-MS/MS. El método analítico utilizado es en esencia una extensión de una prueba
diagnóstica empleada rutinariamente en pediatría para detectar enfermedades metabólicas.
También analizamos la expresión en PBMC de genes seleccionados.
4.2.2. Resultados
4.2.2.1. Análisis metabolómico del plasma
En las Figuras 4.2.1 a 4.2.4 se presentan los niveles relativos de las diferentes metabolitos
analizados en plasma de ratones control (n=11) y ratones tratados con ATRA (n=11).
En general, los niveles plasmáticos de acilcarnitinas fueron mayores en los animales tratados
con ATRA. Estos presentaron niveles significativamente incrementados de acilcarnitinas de
cadena corta (C2-C7), en concreto AC2:0 (↑74%) y AC4OH (↑80%); de cadena media (C8–
C14), en concreto AC8:0 (↑72%) y AC12:1 (↑137%); y de cadena larga (C16–C20), en
concreto AC16DC (↑47%), AC18:1 (↑86%) y AC18:2 (↑91%). Los niveles plasmáticos de
carnitina libre también fueron significativamente mayores (↑53%) en los ratones tratados con
ATRA en comparación con los controles (Figura 4.2.1). El pico de AC4OH puede representar
distintos esteroisómeros que no se pueden resolver por el método de análisis empleado, en
concreto puede tratarse de: D-C4-OH-carnitina, derivada del cuerpo cetónico beta-
hidroxibutirato; L-C4-OH carnitina, derivada del intermediario de la oxidación de ácidos
grasos L-3-hidroxibutiril-CoA; y L-isoC4-OH-carnitina, derivada del intermediario del
catabolismo de la valina L-3-hidroxibutiril-CoA (Schooneman et al., 2013).
En lo que respecta a los niveles plasmáticos de aminoácidos, los ratones tratados con ATRA
presentaron niveles significativamente incrementados de cistina (↑51%) y creatina (↑31%) y
reducidos de citrulina (31%) (Figura 4.2.2). Los niveles de ornitina tendieron a ser menores
en el grupo ATRA (22%, P=0,128; prueba t de Student de dos colas), mientras que los de
arginina fueron muy similares en ambos grupos. La biodisponibilidad global de arginina, que
se define como la ratio entre los niveles de arginina y los de citrulina+ornitina (Tang et al.,
Resultados y Discusión
Capítulo 2
89
2009), resultó ser significativamente mayor en un 35% en el grupo ATRA (P=0,000; prueba t
de Student de dos colas). Además, aunque con importantes diferencias interindividuales, los
niveles plasmáticos de glicina y, especialmente, taurina tendieron claramente a ser mayores en
los ratones tratados con ATRA, por un factor de ~2 para la glicina (P=0,133; prueba t de
Student de dos colas) y de ~7 para la taurina (P=0,074). Los niveles de otros aminoácidos en
plasma, incluyendo aminoácidos de cadena ramificada (leucina, isoleucina, valina) y
aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano, tirosina), no mostraron cambios destacables
entre los dos grupos experimentales, con la excepción de una tendencia a la baja de los niveles
plasmáticos de serotonina en los ratones tratados con ATRA (Figura 4.2.2).
Figura 4.2.1. Niveles plasmáticos de acilcarnitinas en ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA
por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los
cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por volumen se expresan en porcentaje
respecto al grupo control y son la media±SEM de 11 animales por grupo. * Diferente del grupo
control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba t de
Student de dos colas).
Figura 4.2.2. Niveles plasmáticos de aminoácidos en ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA
por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los
cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por volumen se expresan en porcentaje
respecto al grupo control y son la media±SEM de 11 animales por grupo. * Diferente del grupo
control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba t de
Student de dos colas).
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
90
Figura 4.2.3. Niveles plasmáticos de colesterol y de los ácidos grasos palmítico, oleico,
araquidónico, eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA) en ratones NMRI tratados con
50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea
diaria durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por volumen se expresan
en porcentaje respecto al grupo control y son la media±SEM de 11 animales por grupo. * Diferente
del grupo control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba
t de Student de dos colas).
Figura 4.2.4. Niveles plasmáticos de metabolitos/cofactores importantes en el metabolismo
intermediario en ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con
vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al
sacrificio. Los datos normalizados por volumen se expresan en porcentaje respecto al grupo control
y son la media±SEM de 11 animales por grupo. * Diferente del grupo control tratado con vehículo
(P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba t de Student de dos colas).
En la Figura 4.2.3 se presentan los niveles plasmáticos relativos de colesterol y de los ácidos
grasos palmítico (16:0), oleico (18:1), araquidónico (ARA, 20:4n-6), eicosapentaenoico (EPA;
20:5n-3) y docosahexaenoico (DHA; 22:6n-3). Los ratones tratados con ATRA presentaron
niveles incrementados de ácido araquidónico (↑35%), EPA (↑29%) y, especialmente, DHA
(↑63%) en plasma. La ratio n-6/n-3 (ARA/EPA+DHA) fue un 15% menor en el grupo ATRA
(P=0,015; prueba t de Student de dos colas). Los niveles plasmáticos de ácido palmítico, ácido
oleico y colesterol no revelaron diferencias entre los grupos control y ATRA.
Resultados y Discusión
Capítulo 2
91
Finalmente, la Figura 4.2.4 muestra los niveles plasmáticos relativos de una serie de
metabolitos/cofactores importantes en el metabolismo intermediario (hexosas, hexosas-
fosfato, lactato, citrato-isocitrato, malato, AMP, nicotinamida, colina y urea) en los grupos
control y tratado con ATRA. No se encontraron diferencias significativas, aunque los
niveles plasmáticos de lactato (P=0,150; prueba t de Student de dos colas) y, especialmente,
malato (P=0,087) tendieron a ser considerablemente más elevados y los de hexosas-fosfato
más reducidos (P=0,087) en el grupo ATRA.
4.2.2.2. Análisis metabolómico de las PBMC
En las Figuras 4.2.5 a 4.2.8 se presentan los niveles relativos de las diferentes metabolitos
analizados en PBMC de ratones control (n=3) y ratones tratados con ATRA (n=5).
Dificultades durante el aislamiento de las PBMC nos impidieron obtener esta fracción de
todos los animales, por lo que los resultados deben ser tomados con cautela, máxime teniendo
en cuenta que en el grupo control la dispersión de los resultados fue bastante grande.
Figura 4.2.5. Niveles de acilcarnitinas en PBMC de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA
por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los
cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por célula se expresan en porcentaje
respecto al grupo control y son la media±SEM de 3-5 animales por grupo. * Diferente del grupo
control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba U de
Mann-Whitney).
Aún así, los resultados apuntan a una reducción generalizada de los niveles relativos de
prácticamente todos los metabolitos analizados, excepto el EPA, en las PBMC de los
ratones tratados con ATRA en comparación con sus controles. Entre las acilcarnitinas, la
reducción llegó a ser significativa para la AC5:0 (66%) y clara para la AC4:0 (76%)
(Figura 4.2.5). En cuanto a los niveles de aminoácidos, la tendencia a la baja en las PBMC
del grupo ATRA fue manifiesta para todos ellos, alcanzándose la significancia estadística
para aspartato, glutamina, histidina, ornitina, serina y taurina, y con P<0,100 para alanina,
arginina, creatinina, cistina, glutamato, serotonina y tirosina (Figura 4.2.6); los niveles de
estos aminoácidos fueron entre un 65% y un 84% más bajos en las PBMC del grupo ATRA.
Los niveles de oleico fueron menores (81%) en las PBMC de los ratones tratados con
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
92
ATRA, que también tendieron a presentar niveles reducidos de colesterol (87%,
P=0,071), ácido palmítico (55%, P=0,143; prueba U de Mann-Whitney), ácido
araquidónico (40%, P=0,143; prueba U de Mann-Whitney) y DHA (67%, P=0,393;
prueba U de), aunque no de EPA (Figura 4.2.7). También los niveles plasmáticos relativos
de hexosas, hexosas-fosfato, citrato-isocitrato, AMP, colina, nicotinamida y urea tendieron
a ser menores en las PBMC del grupo ATRA, con P<0.100 para colina y urea, mientras
que lactato y malato fueron indetectables en las PBMC (Figura 4.2.8).
Figura 4.2.6. Niveles plasmáticos de aminoácidos en PBMC de ratones NMRI tratados con 50 mg
de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria
durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por célula se expresan en
porcentaje respecto al grupo control y son la media±SEM de 3-5 animales por grupo. * Diferente
del grupo control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba
U de Mann-Whitney).
Figura 4.2.7. Niveles de colesterol y de los ácidos grasos palmítico, oleico, araquidónico,
eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA) en PBMC de ratones NMRI tratados con 50 mg
de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria
durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por célula se expresan en porcentaje
respecto al grupo control y son la media±SEM de 3-5 animales por grupo. * Diferente del grupo control
tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba U de Mann-
Whitney).
Resultados y Discusión
Capítulo 2
93
Figura 4.2.8. Niveles de algunos metabolitos/cofactores importantes en el metabolismo
intermediario en PBMC de ratones NMRI tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o
con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al
sacrificio. Los datos normalizados por célula se expresan en porcentaje respecto al grupo control y
son la media±SEM de 3-5 animales por grupo. Valores de P indicados cuando P<0,1 al analizar las
diferencias entre grupos mediante la prueba U de Mann-Whitney). n.d., no detectado.
4.2.2.3. Expresión génica en PBMC
En estudios previos, nuestro grupo había estudiado en ratones si la expresión génica en
sangre total podía reproducir cambios en la expresión génica inducidos por el ATRA en
tejidos internos (Petrov et al., 2016a). Aquí quisimos ir un paso más allá y usar
específicamente ARN extraído de PBMC aisladas, en lugar de ARN extraído de sangre
total, para así poder relacionar más directamente cambios en el metaboloma del plasma y
las PBMC con cambios en la expresión génica en estas células sanguíneas. Es conocido
que las PBMC expresan receptores de retinoides, RARs y RXRs (Szabova et al., 2003).
Seleccionamos para este análisis un conjunto de genes discretos, sensibles al ATRA en
tejidos de acuerdo con estudios previos y/o que pudieran estar relacionados con los cambios
más destacados revelados por el análisis metabolómico realizado (descritos en los apartados
anteriores). En concreto, determinamos por RT-qPCR a tiempo real en PBMC de ratones
control (n=3/4) y tratados con ATRA (n=5) los niveles de expresión de genes para:
proteínas desacoplantes (Ucp1 y Ucp2); enzimas limitantes de la beta-oxidación
mitocondrial y peroxisomal de ácidos grasos (Cpt1a y Acox1, respectivamente); proteínas
relacionadas con la lipogénesis y su control (Fasn y Srebp1c); posibles marcadores de
adipocitos beige/BRITE (Tmem26); una aldehído deshidrogenasa que interviene en la ruta
de biosíntesis de carnitina y es inducida por ATRA en tejido adiposo (Aldh9a1) (Berry and
Noy, 2009); y Cyp26a1 a modo de control positivo, ya que este gen codifica para una
proteína del catabolismo del ATRA y se induce en condiciones de abundancia de ATRA.
Los resultados mostraron una inducción de Cyp26a1 (~x130) y una tendencia a una mayor
expresión de Cpt1a (~x7) y menor de Aldh9a1 (42%) en las PBMC del grupo ATRA.
También apreciamos la tendencia a una menor expresión de los genes lipogénicos Fasn
(60%, P=0,190; prueba U de Mann-Whitney) y Srebp1c (76%, P=0,556; prueba U de
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
94
Mann-Whitney) en las PBMC del grupo ATRA, que no alcanzó la significancia estadística
debido al bajo número de animales en el grupo control y las importantes diferencias
interindividuales entre ellos. No se detectaron cambios destacables con el tratamiento con
ATRA en los niveles de expresión de Ucp1, Ucp2, Tmem26 y Acox1 en las PBMC (Figura
4.2.9).
Figura 4.2.9. Niveles de ARNm de los genes indicados en PBMC de ratones NMRI tratados con
50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea
diaria durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos normalizados por célula se expresan
en porcentaje respecto al grupo control y son la media±SEM de 3-5 animales por grupo. * Diferente
del grupo control tratado con vehículo (P<0,05 o valores de P indicados cuando 0,05<P<0,1; prueba
U de Mann-Whitney).
4.2.2.4. Análisis de componentes principales y de correlaciones
Se realizó un análisis estadístico de componentes principales (PCA, principal components
analysis) y un análisis de correlaciones con el fin de estudiar posibles relaciones entre el
perfil metabolómico del plasma y la eficiencia energética, la adiposidad (peso de los tejidos
adiposos) y los marcadores relacionados con la capacidad oxidativa/termogénica en los
tejidos adiposos estudiados en el capítulo 1.
En el análisis PCA, los tres primeros componentes (PC1, PC2 y PC3) explicaron
aproximadamente la mitad de la varianza total y se representan dos a dos en la Figura
4.2.10. El análisis por PCA, y particularmente el PC2, discriminó claramente entre los
grupos ATRA y control. El PC1 quedó definido por los niveles plasmáticos de las AC de
cadena larga y media insaturadas y los de algunos aminoácidos; el PC3, por los niveles
plasmáticos de metabolitos/cofactores importantes en el metabolismo intermediario; y el
PC2, por variables “clásicas” que ya sabíamos afectadas por el ATRA por estudios
anteriores, como la eficiencia energética, la adiposidad corporal y la expresión de Ucp1 en
TAM y de Ppara y Pparg en TAB retroperitoneal, junto con parámetros metabolómicos
revelados en esta tesis, en concreto los niveles plasmáticos de carnitina, algunas AC
(AC2:0, AC3DH/AC4OH, AC8:0 y AC16DC) y DHA (ver Anexo 2A).
A continuación analizamos posibles correlaciones entre los niveles plasmáticos de los
metabolitos más significativos incluidos en el componente PC2 (carnitina, AC2:0,
AC3DH/AC4OH, AC8:0, AC16DC y DHA) y las variables relativas a las capacidades
metabólicas del TAM y del TAB subcutáneo (inguinal) y visceral (retroperitoneal +
Resultados y Discusión
Capítulo 2
95
epididimal) analizadas. Como se muestra en la Tabla 4.2, los niveles plasmáticos de AC2:0,
AC8:0, AC3DH/AC4OH, AC16DC y DHA, pero no los de carnitina, correlacionaron
inversamente con la eficiencia energética y el peso del TAM y el TAB subcutáneo, y
directamente con los niveles de ARNm de Ucp1 y Ppara en el TAM. Los niveles
plasmáticos de acilcarnitinas (especialmente AC2:0) y de DHA también correlacionaron
directamente con los niveles de ARNm de Ucp1 y Ppara en el TAB (especialmente en los
depósitos viscerales) e, interesantemente, con la ratio entre la expresión génica de Rarb y
Rxrg (Rarb/Rxrg) en el TAB, identificada en el capítulo 1 de esta tesis como un marcador
de marronización/activación metabólica del TAB. También encontramos correlaciones
inversas entre los niveles plasmáticos de acilcarnitinas (especialmente la AC2:0) y DHA y
los niveles de ARNm de Pparg en los depósitos de TAB visceral. Por su parte, los niveles
plasmáticos de carnitina correlacionaron directamente con los de ARNm de Ucp1 y la ratio
Rarb/Rxrg en el TAB visceral.
Figura 4.2.10. Gráfico de puntuación biplot del componente principal (PC) 1, PC2 y PC3. Se realizó
un análisis de componentes principales (PCA) con 117 variables ‒ incluyendo metabolitos en
plasma, expresión de genes de interés en tejidos y parámetros biométricos ‒ de ratones NMRI
tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección
subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio (11 animales por grupo). Entre
paréntesis se indica el % de varianza explicada por cada PC.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
96
Tabla 4.2. Correlaciones entre parámetros seleccionados más significativos
Se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman. En la tabla se muestra el coeficiente de
correlación (ρ), la significancia estadística y el número de animales. La correlación positiva
significativa se muestra resaltada en amarillo y la negativa en azul; las correlaciones significativas
más fuertes (ρ≥0,500) se resaltan con un color amarillo o azul más oscuro y las más débiles
(ρ<0,500), con un color amarillo o azul más claro. ** indica que la correlación es significativa en
el nivel 0,01 (bilateral) y * indica que la correlación es significativa en el nivel 0,05 (bilateral). UA,
unidades arbitrarias.
Carnitine AC2:0 AC3DC/AC4OH AC8:0 AC16DC DHA
(UA/vol., %) (UA/vol., %) (UA/vol., %) (UA/vol., %) (UA/vol., %) (UA/vol., %)
ρ -,270 -,759** -,521* -,490* -,727** -,665**
Sig. ,224 ,000 ,013 ,021 ,000 ,001
N 22 22 22 22 22 22
ρ -,365 -,744** -,470* -,462* -,591** -,642**
Sig. ,113 ,000 ,036 ,040 ,006 ,002
N 20 20 20 20 20 20
ρ ,335 ,783** ,474* ,618** ,513* ,658**
Sig. ,128 ,000 ,026 ,002 ,015 ,001
N 22 22 22 22 22 22
ρ ,346 ,484* ,469* ,467 ,761** ,781**
Sig. ,160 ,042 ,050 ,050 ,000 ,000
N 18 18 18 18 18 18
ρ ,038 ,129 ,202 ,348 -,085 ,051
Sig. ,867 ,566 ,368 ,112 ,706 ,820
N 22 22 22 22 22 22
ρ ,445* ,273 ,095 -,087 -,126 -,090
Sig. ,043 ,232 ,683 ,708 ,586 ,699
N 21 21 21 21 21 21
ρ -,390 -,698** -,597** -,405 -,551* -,542*
Sig. ,089 ,001 ,005 ,076 ,012 ,014
N 20 20 20 20 20 20
ρ ,203 ,215 -,145 ,192 ,129 ,183
Sig. ,391 ,363 ,541 ,416 ,587 ,439
N 20 20 20 20 20 20
ρ ,258 ,435 ,357 ,451 ,247 ,461*
Sig. ,286 ,063 ,133 ,053 ,307 ,047
N 19 19 19 19 19 19
ρ ,116 ,082 ,036 -,039 ,005 ,042
Sig. ,608 ,717 ,875 ,863 ,982 ,852
N 22 22 22 22 22 22
ρ ,043 ,517* ,439* ,344 ,423* ,319
Sig. ,848 ,014 ,041 ,117 ,050 ,148
N 22 22 22 22 22 22
ρ -,109 -,196 -,171 -,080 -,247 -,176
Sig. ,502 ,225 ,290 ,625 ,125 ,278
N 40 40 40 40 40 40
ρ ,487** ,552** ,443** ,102 ,434** ,352*
Sig. ,001 ,000 ,004 ,530 ,005 ,026
N 40 40 40 40 40 40
ρ ,273 ,164 ,140 ,138 ,222 ,171
Sig. ,088 ,312 ,390 ,395 ,169 ,292
N 40 40 40 40 40 40
ρ -,274 -,502** -,263 -,206 -,353* -,385*
Sig. ,092 ,001 ,106 ,208 ,027 ,016
N 39 39 39 39 39 39
ρ ,397* ,619** ,311 ,441** ,357* ,521**
Sig. ,014 ,000 ,057 ,006 ,028 ,001
N 38 38 38 38 38 38
mRNA Ucp1 (%)
mRNA Ppara (%)
mRNA Pparg (%)
Ratio Rarb/Rxrg (%)
mRNA Ucp1 (%)
mRNA Ppara (%)
mRNA Pparg (%)
Ratio Rarb/Rxrg (%)
Peso tejido (mg)
Tejido adiposo blanco subcutáneo (inguinal)
Tejido adiposo blanco visceral (retroperitoneal + epididimal)
Peso tejido (mg)
Ratio Rarb/Rxrg (%)
Tejido adiposo marrón (TAM)
Eficiencia
energética (g/kg)
Peso tejido (mg)
mRNA Ucp1 (%)
mRNA Ppara (%)
mRNA Pparg (%)
Resultados y Discusión
Capítulo 2
97
4.2.3. Discusión
El análisis realizado muestra que el modelo de tratamiento con ATRA en ratones tiene un
profundo impacto sobre el metaboloma del plasma y nos ha permitido identificar
marcadores sanguíneos potenciales del incremento de la actividad oxidativa/termogénica
tisular. A continuación se discuten los resultados más destacados.
El tratamiento con ATRA conllevó un aumento generalizado de los niveles de
acilcarnitinas en plasma. Estos niveles se cree que constituyen una “foto fija” que refleja
la exportación de acilcarnitinas desde los diferentes tejidos, así como la captación de
acilcarnitinas circulantes por estos. De acuerdo con esta idea, un estudio en ratones
sometidos a ayuno concluyó que los cambios cualitativos y cuantitativos en las
acilcarnitinas circulantes no se corresponden completamente con los cambios detectados a
nivel tisular en músculo, hígado, TAB o TAM, aunque sí que, en general, niveles
incrementados en plasma se corresponden con niveles incrementados en estos diferentes
tejidos (Schooneman et al., 2014).
Niveles altos de acilcarnitinas en plasma pueden ser indicativos de trastornos de la β-
oxidación mitocondrial pero también se asocian a condiciones fisiológicas en que la tasa
de oxidación de ácidos grasos está elevada, como el ayuno a corto plazo o el ejercicio
(Longo et al., 2006; McCoin et al., 2015; Schooneman et al., 2013). El aumento
generalizado observado estaría, por tanto en consonancia con resultados previos que
indican que el tratamiento con ATRA activa la lipólisis y la oxidación de ácidos grasos en
diversos tejidos. Así, el tratamiento con ATRA resulta en una reducción de la masa de los
depósitos de TAB y de los niveles circulantes de leptina (Felipe et al., 2004; Mercader et
al., 2006; Ribot et al., 2001); un aumento de los niveles circulantes de cuerpos cetónicos,
pero no de ácidos grasos libres (que serían oxidados, activamente) (Amengual et al., 2010);
y una reducción de los triacilgliceroles tisulares en hígado (Amengual et al., 2010) y
músculo esquelético (Amengual et al., 2008). Estos cambios son paralelos a la inducción
de la expresión de genes para proteínas implicadas en el metabolismo oxidativo en TAB
(Mercader et al., 2006; Tourniaire et al., 2015), hígado (Amengual et al., 2010) y músculo
(Amengual et al., 2008), y en la termogénesis en el TAM (Bonet et al., 2003).
En particular, el tratamiento con ATRA induce la expresión de la enzima limitante de la
beta-oxidación mitocondrial de ácidos grasos, la CPT1, en hígado, músculo y TAB, y de la
enzima limitante de la beta-oxidación peroxisomal, la ACOX1, en músculo esquelético
(pero no en hígado). Es importante destacar que el tratamiento con ATRA también induce
la expresión de genes para proteínas que están corriente abajo de la beta-oxidación en el
metabolismo oxidativo mitocondrial, como son: la aconitasa del ciclo de Krebs en depósitos
de TAB (Tourniaire et al., 2015); componentes de la cadena respiratoria mitocondrial, en
concreto subunidades de la citocromo oxidasa, en músculo esquelético y TAB (Amengual
et al., 2008; Mercader et al., 2006); y proteínas desacoplantes, a saber UCP1 en TAM,
UCP2 en hígado y UCP3 en músculo esquelético (Bonet et al., 2012). La activación del
metabolismo oxidativo tras el tratamiento in vivo con ATRA en buena parte se derivaría de
efectos directos sobre las células, ya que la exposición a ATRA incrementa la expresión de
genes del metabolismo oxidativo y la oxidación de palmitato exógeno en adipocitos
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
98
(Mercader et al., 2007), células hepáticas HepG2 (Amengual et al., 2012) y miotubos
C2C12 (Amengual et al, resultados no publicados). Los efectos del ATRA sobre el
metabolismo oxidativo han sido relacionados con la activación de diversos receptores
nucleares y vías de señalización (Bonet et al., 2012).
Los resultados muestran los siguientes efectos destacados del tratamiento con ATRA sobre
el perfil plasmático de acilcarnitinas:
− Un aumento de la serie AC18:1, AC16:1, AC14:1 y AC12:1 (significativo para
AC18:1 y AC12:1), que sugiere que el tratamiento con ATRA estimula la
movilización y oxidación de ácido oleico (18:1), que es uno de los ácidos grasos más
abundantes en el TAB, tanto en humanos como en ratones (Ahn et al., 2010).
− Un incremento significativo de los niveles de AC8:0, que podría reflejar un
incremento de la oxidación peroxisomal de ácidos grasos, ya que esta rinde
específicamente en abundancia AC8:0 (Poirier et al., 2006), que se avendría con el
incremento de la expresión de ACOX1, enzima limitante de la beta-oxidación
peroxisomal, descrito en músculo esquelético de ratones tratados con ATRA
(Amengual et al., 2008).
− Un incremento significativo de los niveles del AC16DC, que podría reflejar un
incremento de la omega-oxidación de ácidos grasos de cadena larga. La omega-
oxidación ocurre en el retículo endoplásmico, fundamentalmente en el hígado, sobre
ácidos grasos de cadena media y larga, y consiste en la oxidación del grupo metilo
terminal de la cadena de acilo, rindiendo un ácido dicarboxílico que es degradado vía
beta-oxidación (Wanders et al., 2001).
− Un incremento significativo de los niveles de acetilcarnitina (AC2:0, derivada de
acetil-CoA) y de AC4OH (posiblemente derivada de beta-hidroxibutirato), que
reflejaría una oxidación aumentada de ácidos grasos hasta acetil-CoA en diversos
tejidos y una cetogénesis hepática incrementada.
− Un incremento significativo de los niveles de carnitina libre en plasma, que permitiría
encarar el incremento de la oxidación de los ácidos grasos movilizados del TAB
(véase más abajo).
Aunque el pico de AC4OH en nuestros análisis puede representar distintos esteroisómeros
(D-C4-OH-carnitina, L-C4-OH carnitina o L-isoC4-OH-carnitina), nuestra interpretación
es que se trataría mayoritariamente de D-C4-OH-carnitina derivada de beta-hidroxibutirato,
porque el tratamiento con ATRA se acompaña de un incremento de los niveles circulantes
de este cuerpo cetónico (Amengual et al., 2010) y en cambio no altera los niveles
circulantes de valina (cuyo catabolismo rinde L-isoC4-OH-carnitina). Pensamos que la
AC4OH incrementada en plasma provendría principalmente del hígado, porque el hígado
es el principal sitio de síntesis de cuerpos cetónicos y porque resultados previos muestran
que en células hepáticas (HepG2) la exposición a ATRA incrementa la conversión de
palmitato exógeno en CO2 y en productos ácidos solubles que incluyen cuerpos cetónicos
(además de acetil-CoA, acilcarnitinas de cadena corta e intermediarios del ciclo de Krebs)
(Amengual et al., 2012). [El tratamiento con ATRA también estimula el metabolismo
Resultados y Discusión
Capítulo 2
99
oxidativo en músculo esquelético, que también es un sitio de síntesis de cuerpos cetónicos
(Soeters et al., 2012), pero resultados de nuestro grupo indican que en células musculares
(miotubos C2C12) la exposición a ATRA incrementa la oxidación completa de ácidos
grasos hasta CO2, pero no los niveles de productos ácidos solubles (Amengual et al.,
resultados no publicados)].
Niveles incrementados de acilcarnitinas de cadena larga en plasma y tejidos han sido
descritos en asociación a la obesidad y la resistencia a la insulina (Adams et al., 2009;
Koves et al., 2008; Mihalik et al., 2010; Sampey et al., 2012; Zhang et al., 2014b), pero
también tras la pérdida de peso y con el ejercicio, junto con incrementos de la sensibilidad
a la insulina a nivel sistémico (Gopalan et al., 2016; Redman et al., 2011; Schooneman et
al., 2016). Es interesante destacar que, mientras que el incremento de acilcarnitinas de
cadena larga que se produce en condiciones de obesidad, dieta rica en grasa o estrés lipídico
se asocia a la depleción del fondo de carnitina intracelular y a niveles plasmáticos de
carnitina libre disminuidos (Seiler et al., 2014; Wessels et al., 2015), la acumulación de
acilcarnitinas que se produce en condiciones de pérdida de peso o ejercicio es paralela a un
aumento de los niveles de carnitina libre en tejidos y/o plasma (Gopalan et al., 2016;
Schooneman et al., 2016). En este sentido, es destacable nuestro resultado de que, junto
con el incremento de los niveles circulantes de acilcarnitinas, el tratamiento con ATRA
conllevó un incremento de los niveles de carnitina libre en plasma. Resultados previos
han mostrado que el tratamiento con ATRA en ratones aumenta la tolerancia a la glucosa
y la sensibilidad a la insulina (con reducción del índice HOMA) y mejora el perfil de
adipoquinas relacionadas con la resistencia a la insulina, como la resistina y la RBP4
(Felipe et al., 2004; Mercader et al., 2008). Por tanto, en conjunto los resultados de esta
tesis refuerzan la idea de que niveles incrementados de acilcarnitinas reflejan
primariamente aumentos en el flujo a través de la beta-oxidación, más que defectos en la
sensibilidad a la insulina, particularmente cuando se acompañan de un incremento de los
niveles de carnitina libre.
En relación con la base molecular del incremento de los niveles plasmáticos de carnitina
libre en el grupo ATRA, cabe señalar que en preadipocitos y adipocitos en cultivo
expuestos a ATRA y en TAB de ratones tratados in vivo con ATRA se ha descrito la
inducción de la expresión génica de una enzima clave en la síntesis de novo de carnitina, la
ALDH9A1 (es la 4-N-trimetil-aminobutiraldehído deshidrogenasa que cataliza el tercer
paso de esta ruta) (Berry and Noy, 2009). Así pues, el incremento observado podría reflejar,
al menos en parte, un incremento de la síntesis endógena de carnitina, aunque no pueden
descartarse otras explicaciones. La carnitina se obtiene mayoritariamente de alimentos de
origen animal en la dieta, pero en parte es sintetizada a partir de lisina y metionina (con la
participación de ácido ascórbico, nicotinamida, vitamina B6 y hierro como cofactores),
fundamentalmente en hígado, riñón y cerebro, y es captada por el músculo y otros órganos
a través de un transportador de membrana (OCTN2) (Reuter and Evans, 2012). En roedores
y otros mamíferos, el ayuno incrementa la síntesis endógena y la captación de carnitina por
los tejidos, un efecto que viene mediado por la activación del PPAR, que transactiva genes
de la biosíntesis de carnitina así como el gen para OCTN2 (Ringseis et al., 2009; van Vlies
et al., 2007). Desde un punto de vista etiológico, parece lógico que agentes/condiciones
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
100
que promueven la lipólisis y la oxidación de ácidos grasos, como el ayuno o, en nuestro
caso, el tratamiento con ATRA, favorezcan también un incremento de la disponibilidad de
carnitina, necesaria para este metabolismo.
Incrementos de los niveles de carnitina como los propiciados por el tratamiento con ATRA
pueden ser de interés de cara al mantenimiento de la salud metabólica, especialmente en un
ambiente obesogénico. Estudios en modelos animales han mostrado que la insuficiencia en
carnitina a nivel sistémico es común en estados de resistencia a la insulina ligados a la edad
avanzada, la diabetes genética y la obesidad inducida por la dieta, y se asocia a alteraciones
del metabolismo energético mitocondrial (Noland et al., 2009). En ratas de edad avanzada
alimentadas crónicamente con dieta rica en grasa, la suplementación por vía oral con
carnitina incrementa los niveles en plasma y tejidos y mejora la condición metabólica a
nivel sistémico y la función de las mitocondrias musculares, asociado a un incremento de
la exportación (efflux) y la excreción urinaria de acilcarnitinas (Noland et al., 2009). Esto
viene a subrayar la importancia de la carnitina a la hora de exportar de la mitocondria el
exceso de carbonos combustibles, que podrían interferir con la función mitocondrial de no
ser eficientemente exportados (Noland et al., 2009). Otros estudios han mostrado efectos
positivos de la suplementación con carnitina en pacientes con síndrome metabólico (Zhang
et al., 2014a) y en modelos animales de obesidad y diabetes (Cha, 2008; Power et al., 2007;
Wu et al., 2015), si bien hay resultados discrepantes (Wessels et al., 2015).
Niveles incrementados de acetilcarnitina (AC2:0) como los observados a nivel plasmático
en los ratones tratados con ATRA pueden asimismo ser de interés de cara a la salud
metabólica. Resultados en ratas indican que la suplementación (por vía oral o
intraperitoneal) con acetilcarnitina revierte los efectos del envejecimiento sobre las
mitocondrias de músculo esquelético y corazón, potenciando la biogénesis y función
mitocondrial (Lesnefsky et al., 2006; Pesce et al., 2010). También en adipocitos murinos
3T3-L1 se han descrito efectos complementarios de acetilcarnitina y ácido lipoico
favoreciendo la biogénesis mitocondrial (Shen et al., 2008). Los beneficios de la
suplementación con acetilcarnitina sobre la función mitocondrial, y con ello la salud
metabólica, se han atribuido especulativamente a diferentes mecanismos, incluyendo la
potenciación de la acetilación de diferentes proteínas incluyendo histonas, factores de
transcripción y enzimas mitocondriales (Rosca et al., 2009).
El otro gran componente del análisis metabolómico llevado a cabo han sido los
aminoácidos, incluyendo proteicos y no proteicos. No hubo diferencias significativas entre
los ratones tratados con ATRA y sus controles en los niveles plasmáticos de BCAA
(leucina, isoleucina, valina) ni de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano,
tirosina), que son dos grupos de aminoácidos que estudios pioneros y estudios
metabolómicos más recientes han encontrado que están aumentados en la
obesidad/resistencia a la insulina (Felig et al., 1969; Newgard et al., 2009; Wang et al.,
2011) y normalizados tras intervenciones que mejoran dichas condiciones (Lien et al.,
2009), y que por tanto cabría hipotetizar, a priori, que estuvieran disminuidos en los ratones
tratados con ATRA. No obstante sí que hubo diferencias en otros aminoácidos que han sido
relacionados directa o más indirectamente con la salud metabólica.
Resultados y Discusión
Capítulo 2
101
Uno de estos aminoácidos es la citrulina, cuyos niveles relativos en plasma fueron
significativamente menores en el grupo ATRA que en el grupo control. Interesantemente,
un estudio metabolómico de 2013 concluyó que niveles plasmáticos incrementados de
citrulina marcan la obesidad inducida por dieta hipergrasa y predicen el desarrollo de
síndrome metabólico en ratones (Sailer et al., 2013). En dicho estudio, los niveles
plasmáticos incrementados de citrulina conllevaron una menor “biodisponibilidad global
de arginina” en los ratones alimentados con dieta hipergrasa. Este índice se define como
la ratio entre los niveles circulantes de arginina y los de sus productos catabólicos
ornitina+citrulina, refleja mejor la biodisponibilidad a nivel sistémico de arginina para la
biosíntesis de óxido nítrico que los niveles circulantes de arginina y está disminuido en
modelos animales de síndrome metabólico y humanos con riesgo incrementado de
enfermedad cardiovascular o diabetes tipo 2 (Erdely et al., 2010; Sailer et al., 2013; Tang
et al., 2009; Tripolt et al., 2012). En nuestro experimento, la biodisponibilidad global de
arginina fue significativamente mayor en el grupo tratado con ATRA, por tener los
animales de este grupo niveles reducidos de citrulina y (en menor medida) ornitina en
plasma en comparación con los controles, con iguales niveles de arginina.
La mayor biodisponibilidad global de arginina en el grupo ATRA sugiere que el tratamiento
con ATRA puede favorecer la biosíntesis de óxido nítrico, que es un importante modulador
de la función endotelial, crítico para la homeostasia y salud vascular, y también un
activador de la mitocondriogénesis y la actividad del TAM (Nisoli et al., 1997). Además,
el óxido nítrico señaliza vía guanilato ciclasa y GMPc, y el incremento del GMPc en TAB
favorece la marronización y una expansión saludable del tejido graso (Mitschke et al.,
2013). Por tanto, incrementos en la producción de óxido nítrico podrían contribuir a la
activación del TAM y la marronización del TAB inducidas por ATRA exógeno. De la
misma manera, efectos sobre la producción de óxido nítrico podrían explicar en parte la
asociación inversa entre niveles de ATRA circulantes y riesgo de síndrome metabólico
reportada recientemente en humanos (Liu et al., 2016). De hecho, hay estudios que indican
que el ATRA incrementa la producción de óxido nítrico en células endoteliales, lo que se
asociaría a efectos positivos sobre el endotelio vascular (Uruno et al., 2005), y que el ATRA
(vía RAR:RXR) transactiva la expresión del gen de la óxido nítrico sintasa inducible
humana (Zou et al., 2007). Aunque hay resultados controvertidos, que indicarían inhibición
en vez de activación de la producción de óxido nítrico por ATRA en células endoteliales y
otros tipos celulares (e.g. (Cho et al., 2005)), es de destacar que, en uno de los pocos
estudios al respecto in vivo, la suplementación con ATRA (10 mg/kg, por vía
intraperitoneal) incrementó en ratones la producción de óxido nítrico inducida por
lipopolisacárido bacteriano (Devaux et al., 2000). Nuestros resultados sugieren que el
ATRA podría favorecer la síntesis de óxido nítrico por una doble vía: mediante efectos
transcripcionales directos sobre la maquinaria enzimática implicada y mediante efectos
metabólicos que conllevarían un aumento de la disponibilidad de arginina, el sustrato de
las enzimas óxido nítrico sintasas.
Los ratones tratados con ATRA presentaron, en comparación con los controles, niveles
plasmáticos significativamente incrementados de cistina. Este aminoácido resulta de la
oxidación del grupo tiol de dos moléculas de cisteína, que pasan a quedar unidas por un
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
102
puente disulfuro. La pareja cisteína/cistina en plasma funciona como un tampón redox que
puede afectar el estado de oxidación de los grupos tiol en proteínas extracelulares,
incluyendo proteínas de la membrana endotelial, con posibles implicaciones para la
enfermedad cardiovascular. Se ha descrito que la cisteína se encuentra relativamente más
oxidada con la edad, el tabaquismo y enfermedades relacionadas con el envejecimiento,
como la degeneración macular (Go and Jones, 2011). En cualquier caso, la forma oxidada,
la cistina, es habitualmente la forma predominante en plasma (Go and Jones, 2011).
Además, la cisteína se oxida fácilmente y nuestro protocolo pre-analítico no estaba
específicamente diseñado para evitar la oxidación de la cisteína ni para distinguir cisteína
y cistina. Por tanto, los niveles incrementados de cistina observados en el plasma de los
ratones tratados con ATRA son de difícil interpretación. En todo caso, cabe destacar que
no hubo diferencias entre los dos grupos experimentales en los niveles plasmáticos de
homocisteína, un homólogo de la cisteína (producto derivado de la desmetilación de la
metionina) que es considerado un factor de riesgo de enfermedad cardiovascular y que está
elevado en plasma en el síndrome metabólico. Tampoco hubo diferencias en los niveles
plasmáticos de homocistina, homólogo de la cistina que resulta de la oxidación de dos
moléculas de homocisteína.
Los ratones tratados con ATRA presentaron niveles plasmáticos significativamente
incrementados de creatina en comparación con el grupo control. El sistema creatina-
fosfocreatina juega un papel importante en la bioenergética muscular, especialmente en
momentos de trabajo intenso, cuando la reacción de la creatina quinasa puede, a partir de
fosfocreatina, liberar ATP en el citosol de la célula (Wyss and Kaddurah-Daouk, 2000). El
catabolismo de ácidos grasos en músculo esquelético y otros tejidos aumenta con el
tratamiento con ATRA (véase el apartado 1 Introducción), y sugerimos que, en estas
condiciones de “plenitud de combustible”, posiblemente los músculos descansen menos en
el sistema creatina-fosfocreatina y por tanto capten menos creatina de la circulación, lo que
explicaría el aumento de los niveles plasmáticos de creatina observado (hay que tener en
cuenta que el músculo no es un sitio de síntesis de creatina, sino que la capta de la
circulación). En favor de esta interpretación, se ha reportado que la entrada de [14C-
creatina] en músculo de ratón (tras inyección i.p. de [14C-creatina]) resulta inhibida en
condiciones de ayuno, cuando está incrementada la oxidación de ácidos grasos (Kim et al.,
1983). También hay trabajos que asocian la depleción de creatina intramuscular a
incrementos de la captación de combustibles (glucosa y ácidos grasos) y la oxidación de
ácido grasos por el músculo, lo que sugiere la existencia de un mecanismo regulador
compensatorio (Pandke et al., 2008). Un incremento de los niveles de creatina en plasma
puede ser de interés para la salud metabólica, considerando que la suplementación con
creatina se ha asociado a efectos beneficiosos en relación con la diabetes tipo 2 y el hígado
graso, especialmente cuando se administra en conjunción con ejercicio físico, además de
asociarse a posibles mejoras del rendimiento muscular durante el ejercicio (Deminice et al.,
2016; Gualano et al., 2012; Pinto et al., 2016).
Los niveles plasmáticos de taurina y, en menor grado, glicina claramente tendieron a ser
más altos en el grupo ATRA que en el grupo control. La diferencia alcanza la significancia
estadística si se comparan los niveles de ambos aminoácidos combinados (taurina+glicina,
Resultados y Discusión
Capítulo 2
103
unidades arbitrarias; control, 519855673; ATRA, 16468956231; n=11/grupo, P=0,050).
Taurina y glicina son aminoácidos específicamente relacionados con la producción de
ácidos biliares (la conjugación a estos aminoácidos incrementa la solubilidad de los ácidos
biliares y facilita su paso en forma de sales a la bilis), y el incremento observado de sus
niveles circulantes podría reflejar una inhibición de la síntesis hepática de ácidos biliares
por ATRA, que de hecho ha sido descrita (Yang et al., 2014). En todo caso, es importante
señalar que, aunque los ácidos biliares son la principal forma de excreción de colesterol del
cuerpo, en los ratones suplementados con ATRA la inhibición de la producción de ácidos
biliares no se acompaña de un incremento de la colesterolemia, que al contrario se ve
disminuida (o en todo caso, no modificada (Ribot et al., 2001)), lo que se ha atribuido a una
disminución de la absorción intestinal de colesterol por efecto del tratamiento (He et al.,
2013; Yang et al., 2014).
La taurina (y derivados como la cloramina de taurina) tiene efectos beneficiosos en el
contexto de la obesidad y el síndrome metabólico independientes de la producción de
ácidos biliares, incluyendo efectos antiinflamatorios y antioxidantes, efectos anorécticos y
modulación del metabolismo de glúcidos y lípidos (Murakami, 2015). Hay estudios que
relacionan un déficit de taurina con la obesidad y la diabetes. La concentración de taurina
en plasma está reducida en la obesidad y la diabetes humana, así como en modelos animales
de obesidad (revisado en (Murakami, 2015). La producción de taurina en el TAB podría
jugar un papel especialmente importante en la prevención de la obesidad, ya que en ratones
con obesidad dietética la expresión de la cisteína dioxigenasa (enzima clave en la
biosíntesis de taurina) está reducida selectivamente en TAB, pero no en otros tejidos
productores de taurina como TAM o hígado; incluso se ha propuesto que la taurina podría
ser considerada una adipoquina con efecto antiobesidad (Tsuboyama-Kasaoka et al., 2006).
En estudios en animales, la suplementación de dietas estándar o aterogénicas con taurina o
glicina, o la ingesta de fuentes proteicas especialmente ricas en estos aminoácidos, tiene
efectos positivos sobre los lípidos plasmáticos (Park and Lee, 1998) y en la prevención de
la obesidad inducida por la dieta y sus secuelas (Liaset et al., 2011; Tastesen et al., 2014;
Tsuboyama-Kasaoka et al., 2006). La suplementación dietética con taurina se acompaña de
un incremento de la taurina en plasma, del gasto energético basal y de la expresión de genes
para el metabolismo energético en TAB (e.g., Pgc1a, Ppara, Nrf2, Lpl, Aco y Ucp2; Ucp1
no fue analizado), más que en TAM (donde la expresión de Ucp1 no se vio afectada) o
músculo esquelético (Tsuboyama-Kasaoka et al., 2006). La suplementación con taurina
también se opone al desarrollo de obesidad en ratas tratadas con monosodio glutamato (un
modelo farmacológico), induciendo Pgc1a en TAB y TAM y por tanto posiblemente el
metabolismo oxidativo en ambos tejidos adiposos (Cao et al., 2016; Nardelli et al., 2011).
En humanos, hay estudios que han mostrado beneficios de la suplementación oral con
taurina (3g/día, 7-8 semanas) en la obesidad (Rosa et al., 2014; Zhang et al., 2004), aunque
los estudios al respecto en humanos son pocos y han empleado concentraciones mucho
menores que los estudios en animales.
Considerando lo expuesto en el párrafo anterior, se sugiere que el incremento observado en
los niveles de taurina podría contribuir causalmente a la reducción de la adiposidad corporal
y otros efectos metabólicos del ATRA. La taurina (ácido 2- aminoetanosulfónico) es
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
104
sintetizada endógenamente, pero también es proporcionada por la dieta (es especialmente
abundante en pescado y marisco). Un incremento de taurina en plasma como el observado
aquí puede tener diferentes orígenes: una mayor absorción intestinal y/o reabsorción renal,
un aumento de la producción endógena de taurina en los tejidos productores, y/o una
redistribución entre plasma y tejidos (quizás como consecuencia de cambios en la
producción de ácidos biliares). Los bajos niveles plasmáticos de taurina en la diabetes
humana se relacionan con una mayor excreción urinaria, sugiriendo que la reabsorción
renal de taurina está disminuida en la diabetes (Merheb et al., 2007). En este contexto es
interesante destacar que el ATRA o el ácido retinoico 9-cis, en sinergia con la vitamina D
y vía activación de VDR:RXR, induce la expresión de la proteína transportadora de taurina
(TauT) y la captación de taurina en una línea celular de epitelio renal (Chesney and Han,
2013). Este antecedente sugiere que el incremento de taurina en plasma en los ratones
tratados con ATRA podría obedecer, en parte, a un incremento de la reabsorción renal,
además de (posiblemente) un menor consumo de taurina para la producción de sales
biliares. Un incremento de la síntesis endógena de taurina ‒ que es sintetizada a partir de
cisteína o, en menor medida, metionina ‒ no se puede descartar, aunque choca con los
niveles plasmáticos aumentados de cistina y no alterados de metionina observados.
Los niveles plasmáticos de ácidos grasos poliinsaturados, especialmente los de DHA (n-
3), fueron significativamente más elevados en los ratones tratados con ATRA, que
presentaron un ratio ARA/EPA+DHA (n-6/n-3) en plasma significativamente menor que
los controles. Estos son efectos interesantes, porque los PUFA n-3 (EPA y DHA) han sido
relacionados con múltiples acciones metabólicas beneficiosas en el contexto del síndrome
metabólico, incluyendo la activación de la termogénesis en el TAM y de la marronización
del TAB ‒ vía efectos directos sobre los adipocitos mediados por la activación del receptor
4 de ácidos grasos libres (FFAR4, también conocido como receptor 120 acoplado a
proteína G, GPR120) y efectos indirectos, dependientes de la interacción de los n-3 con el
receptor TRPV1 en el tracto gastrointestinal y la subsecuente activación del sistema
nervioso simpático (Kim et al., 2016; Kim et al., 2015; Quesada-Lopez et al., 2016). La
reducción de la ratio n-6/n-3 es interesante en sí misma, ya que mientras que los ácidos
grasos n-3 promueven la marronización del TAB, el ARA (n-6) la inhibe y además podría
favorecer especialmente la adipogénesis blanca (Fleckenstein-Elsen et al., 2016; Pisani et
al., 2014). De hecho, ratios n-6/n-3 elevados en la dieta se han relacionan con el sobrepeso
y la obesidad (Muhlhausler and Ailhaud, 2013).
El origen de los niveles incrementados de PUFA, y especialmente DHA, en los ratones
tratados con ATRA es intrigante. Un estudio reciente indica que los adipocitos marrones
diferenciados en cultivo, pero no los blancos, pueden sintetizar DHA (22:6n-3) a partir de
ácido alfa-linolénico (18:3n-3) y otros estudios muestran que los tejidos con una alta tasa
oxidativa tienden a producir más DHA y que desaturasas implicadas en esta síntesis son
enzimas mitocondriales (Qin et al., 2016). Por tanto, una posibilidad a explorar en futuros
estudios es que la activación del TAM y de la marronización del TAB en respuesta a agentes
como el ATRA u otros conlleve un incremento en la producción por estos tejidos de PUFA
de cadena larga, con cambios en sus niveles relativos que podrían funcionar a modo de
Resultados y Discusión
Capítulo 2
105
retroalimentación positiva o negativa, y que tendrían también reflejo en sus niveles
plasmáticos.
Nuestro análisis ha incluido metabolitos puntuales especialmente relevantes en el
metabolismo intermediario. Aunque para ninguno de ellos hubo diferencias significativas
entre los grupos ATRA y control, los ratones tratados con ATRA tendieron a presentar
niveles aumentados de malato y lactato y reducidos de hexosas-fosfato en plasma.
Mayores niveles de malato en plasma podrían indicar una liberación aumentada de malato
desde los tejidos y ser consistentes con una acción del ATRA incrementando la capacidad
celular para el metabolismo oxidativo a través del ciclo de Krebs. En un estudio
metabolómico en humanos, esta fue la interpretación dada por los autores al aumento
observado de los niveles plasmáticos de malato tras una intervención que mejoró el estado
de salud metabólica en mujeres obesas, sedentarias y resistentes a la insulina (Campbell et
al., 2014). Además, en un estudio en el que se comparó el metaboloma de sangre arterial y
venosa humana, el malato ‒ junto con lactato, alanina, glutamina, fenilalanina, succinato y
ácido siálico ‒ exhibió un patrón “de liberación” con niveles significativamente
incrementados en sangre venosa versus sangre arterial (en oposición a un patrón “de
captación”, que se asociaría a niveles incrementados en sangre arterial) (Ivanisevic et al.,
2015). Por otra parte, niveles plasmáticos reducidos de hexosas-fosfato y aumentados de
lactato son consistentes con una mayor utilización de glucosa por la vía glucolítica en los
ratones ATRA, aunque el incremento de lactato también podría reflejar una menor
captación de lactato por los tejidos, que se explicaría por la mayor utilización de ácidos
grasos como combustible en las células. En conjunto, estos resultados casarían con
resultados previos, ya referidos, que muestran una mejor tolerancia a la glucosa y
sensibilidad sistémica a la insulina y una expresión aumentada de componentes del ciclo
de Krebs y la cadena respiratoria en diversos tejidos tras el tratamiento con ATRA en
ratones.
Las PBMC están en contacto directo con el plasma y producen acilcarnitinas; de hecho, las
células T naive (no activadas por antígeno) obtienen la energía fundamentalmente de la
oxidación de ácidos grasos (Wang and Green, 2012) y hasta se ha descrito un método para
la confirmación del diagnóstico de desórdenes genéticos del metabolismo de ácidos grasos
basado en el análisis del perfil de acilcarnitinas en PBMC humanas tras la carga de estas
células ex vivo con lípido (Schulze-Bergkamen et al., 2005). No obstante, la posible
contribución de las PBMC al pool de acilcarnitinas circulante es un aspecto que ha sido
poco estudiado. En nuestro experimento, parece poco probable que esta contribución haya
sido significativa, ya que en los ratones tratados con ATRA los niveles en PBMC de todas
las acilcarnitinas tendieron a estar disminuidos, en contraste con el aumento generalizado
observado en plasma para la mayoría de especies. Tampoco parece que haya una buena
correspondencia inversa, ya que las especies de acilcarnitinas más claramente reducidas en
las PBMC de los animales tratados con ATRA (AC4:0 y AC5:0) no fueron las más
claramente incrementadas en su plasma. No obstante, no puede descartarse que estos
resultados reflejen efectos distintivos del ATRA sobre las PBMC y que, en otras
condiciones, sí que las PBMC contribuyan al pool de acilcarnitinas circulante.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
106
Aunque en las PBMC de los ratones ATRA todas las especies de acilcarnitinas tendieron a
la baja, la única para la que la bajada fue significativa respecto de los niveles en el grupo
control fue la AC5:0. Esta acilcarnitina se deriva del catabolismo de BCAA, en concreto
del catabolismo de leucina e isoleucina, y forma parte de un clúster de metabolitos (que
incluye a los BCAA y productos finales de su catabolismo como AC3:0 y AC5:0) que se
encuentran aumentados en plasma en la obesidad y la resistencia a la insulina en humanos
y modelos animales, de acuerdo con estudios metabolómicos (Newgard, 2012; Newgard et
al., 2009). Los menores niveles de AC5:0 en PBMC de ratones tratados con ATRA se
avendrían con la tendencia a menores niveles de leucina+isoleucina en las PBMC en este
grupo. No obstante, hay que recalcar que la tendencia a la baja en las PBMC del grupo
ATRA fue evidente para todos los aminoácidos y no llegó a ser significativa para
leucina+isoleucina cuando sí lo fue para otros aminoácidos (aspartato, glutamina, histidina,
ornitina, serina y taurina). Estas observaciones nos llevan a descartar, en principio, la idea
de que la reducción de los niveles de BCAA y su metabolito AC5:0 en PBMC sea un efecto
específico del tratamiento con ATRA.
La reducción generalizada de los niveles relativos de acilcarnitinas, aminoácidos y demás
metabolitos analizados (a excepción del EPA) en las PBMC de los ratones tratados con
ATRA detectada en esta tesis llama la atención. Aunque no sabemos explicarla, cabe
recordar que el ácido retinoico es un modulador de la diferenciación de células inmunitarias
y de las respuestas inmunológicas e inflamatoria (Brown and Noelle, 2015; Escribese et al.,
2008). El ATRA podría condicionar cambios distintivos (respecto de su acción en otros
tejidos) en el metabolismo de las células inmunitarias, tal vez asociados a la funcionalidad
de estas, que podrían implicar una reducción del tono metabólico general y de la síntesis
proteica en PBMC.
En este sentido, cabe señalar que en nuestro experimento las PBMC han reflejado algunos
de los efectos transcripcionales del ATRA previamente descritos en tejidos, básicamente la
inducción de Cyp26a1 y de Cpt1a (descrita en diferentes tejidos), pero no otros, como la
modulación de Ucp1, Ucp2, Tmem26 o Aldh9a1 (descrita en tejidos adiposos) ((Amengual
et al., 2007; Berry and Noy, 2009; Mercader et al., 2006; Ozpolat et al., 2005) y esta tesis).
La expresión de Cpt1a en PBMC es particularmente sensible a cambios en el estado
nutricional y energético (Diaz-Rua et al., 2016). Cyp26a1 es una diana clásica de los RAR
que codifica para una enzima implicada en el catabolismo intracelular del ATRA, y su
inducción masiva indica que, efectivamente, en los ratones tratados el ATRA exógeno se
ha repartido bien y ha entrado en las PBMC (recordemos que el tratamiento aplicado es por
vía subcutánea). La inducción de Cpt1a y de Cyp26a1 ya fue descrita en sangre total de
ratones tratados con ATRA (Petrov et al., 2016a). La tendencia a menores niveles de
expresión de genes lipogénicos (Srebp1c y Fasn) en las PBMC de los ratones ATRA
detectada aquí podría ser reminiscente de los cambios a nivel hepático (Amengual et al.,
2010) y en todo caso concordaría con una ralentización general del metabolismo de las
PBMC tras el tratamiento con ATRA.
Volviendo a nuestro objetivo, hemos identificado marcadores sanguíneos del incremento
de la capacidad oxidativa/termogénica en tejidos adiposos explotando el modelo de
Resultados y Discusión
Capítulo 2
107
tratamiento con ATRA. Así, un análisis de componentes principales (PCA) realizado a
partir de los datos de eficiencia energética, adiposidad (peso de los tejidos adiposos), los
marcadores relacionados con la capacidad oxidativa/termogénica en los tejidos adiposos
estudiados en el capítulo 1 y el perfil metabolómico del plasma estudiado en este capítulo,
ha mostrado que los niveles plasmáticos de carnitina, AC2:0, AC3DH/AC4OH, AC8:0,
AC16DC y DHA son variables importantes para discriminar los animales tratados con
ATRA de los animales del grupo control. El análisis de correlaciones posterior indica que
los niveles plasmáticos altos de AC2:0, AC8:0, AC3DH/AC4OH, AC16DC y DHA se
correlacionan con un incremento de la capacidad termogénica del TAM y la capacidad
oxidativa/marronización del TAB (reflejada esta, entre otros, por la ratio entre la expresión
génica de Rarb y Rxrg) y con una disminución de la capacidad adipogénica/lipogénica en
el TAB visceral (con menores niveles de expresión de Pparg). Mientras que los niveles
plasmáticos altos de carnitina se correlacionan más específicamente con un incremento de
la capacidad oxidativa/marronización del TAB visceral.
4.2.4. Conclusiones
En este estudio hemos identificado marcadores plasmáticos de la interacción de la vitamina
A con el metabolismo oxidativo y la salud metabólica, entre los que destacan: niveles
incrementados de carnitina, acetilcarnitina y otras especies de acilcarnitinas; niveles
disminuidos de citrulina y mayor biodisponibilidad global de arginina; niveles
incrementados de creatina y de taurina; y una disminución de la ratio PUFA n-6/n-3.
Algunos de estos marcadores reflejarían fundamentalmente la estimulación de la
movilización y oxidación tisular de lípidos promovida por el ATRA (e.g., acilcarnitinas),
mientras que otros podrían jugar un papel más activo o causal, ya que su disponibilidad
podría mejorar la función mitocondrial y el metabolismo, directa o más indirectamente
(e.g., carnitina, creatina, taurina; biodisponibilidad global de arginina vía incrementos del
óxido nítrico). Además, los resultados del análisis metabolómico realizado estarían de
acuerdo con la idea de que, en condiciones de alta tasa de oxidación de ácidos grasos y
disponibilidad de carnitina, la síntesis y secreción de acetilcarnitina y otras acilcarnitinas,
con el consiguiente aumento en plasma, puede servir para favorecer un normal
funcionamiento de la actividad mitocondrial y del metabolismo celular de la glucosa.
En los ratones tratados con ATRA, el perfil metabolómico de las PBMC fue muy distinto
del plasma, lo que sugiere un diferente impacto del ATRA sobre el metabolismo de estas
células en comparación con los tejidos homeostáticos (hígado, músculo, tejidos adipososo),
posiblemente asociado a su funcionalidad, aunque los resultados de las PBMC deben
tomarse con cautela por el bajo número de muestras individuales disponibles. La expresión
génica de Cyp26a1 y Cpt1a en PBMC resultó de interés especial como biomarcadores del
tratamiento con ATRA.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
108
Anexo 2A
Varianza total explicada y Matriz de componente de los cinco primeros componentes
principales (PC) del análisis de reducción de datos (PCA) a partir de 117 variables de
ratones NMRI (de 13 semanas de edad) tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso
corporal o con vehículo (aceite de oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro
días previos al sacrificio (N = 11). En la Matriz de componente se destacan las 15 variables
que más contribuyen (en azul negativamente y en amarillo positivamente).
Total % de varianza % acumulado Total % de varianza % acumulado
1 26,502 22,651 22,651 26,502 22,651 22,651
2 21,296 18,202 40,853 21,296 18,202 40,853
3 11,620 9,931 50,785 11,620 9,931 50,785
4 6,994 5,978 56,762 6,994 5,978 56,762
5 6,390 5,461 62,224 6,390 5,461 62,224
1 2 3 4 5
peso TAM ,118 -,793 ,248 ,026 ,394
E. energética ,510 -,730 ,223 ,056 -,126
peso TABi ,161 -,712 ,296 ,172 ,307
rp_Tmem26 ,035 -,684 ,081 -,129 -,098
rp_Pparg ,016 -,655 -,482 -,081 -,215
peso TABrp ,182 -,480 ,524 ,079 ,467
e_Pparg ,057 -,359 ,201 ,362 ,022
peso TABe ,173 -,332 ,472 ,243 ,380
i_Tmem26 -,007 -,325 ,056 ,598 -,231
e_Tmem26 ,437 -,324 ,143 ,115 -,132
HexoseP ,137 -,284 ,700 -,225 ,274
i_Cox8b -,176 -,266 ,229 -,059 -,025
Palmitic acid -,572 -,252 ,515 ,190 -,155
Serotonin -,207 -,232 ,316 -,168 -,254
AC10:0 -,165 -,200 -,053 ,016 ,066
i_Atp5f1 -,447 -,181 ,046 -,173 ,151
i_Hoxc9 ,314 -,172 -,491 ,676 ,297
Citrulline ,716 -,166 ,438 -,015 ,086
tam_Tmem26 -,017 -,099 ,199 ,469 -,203
i_Yy1 ,263 -,063 -,375 ,682 ,388
AMP -,385 -,053 ,276 -,225 -,388
e_Hoxc9 -,284 -,042 -,102 -,533 -,223
Nicotinamide -,302 -,037 ,625 -,316 ,179
Aspartate ,329 -,013 ,681 -,155 -,015
rp_Tbx1 ,193 ,002 -,140 -,114 ,075
i_Pparg ,314 ,009 ,199 -,080 ,129
e_Ppara ,181 ,019 -,291 -,598 -,147
Oleic acid -,234 ,032 ,574 ,098 ,229
i_Tbx1 ,248 ,044 -,316 ,344 ,225
e_Yy1 -,480 ,082 -,235 -,328 ,349
Ornithine ,797 ,113 ,505 ,048 -,134
Urea ,782 ,120 ,200 -,094 -,094
Creatinine ,327 ,125 ,293 -,304 ,132
tam_Atp5f1 ,102 ,153 -,023 ,325 -,435
Proline ,862 ,159 ,263 ,036 -,216
Homocystine -,628 ,171 ,258 ,176 -,502
Homocysteine ,879 ,188 ,285 ,086 -,098
Tryptophan ,510 ,197 ,123 ,382 -,175
Glutamate ,465 ,199 ,647 -,145 -,006
rp_Pgc1b -,238 ,203 -,129 -,176 -,457
Cholesterol ,336 ,228 -,199 ,399 -,286
Continúa
Matriz de componente
Varianza total explicada
Componente
Autovalores iniciales Sumas de extracción de cargas al cuadrado
Método de extracción: análisis de componentes principales.
Variable
Componente
Resultados y Discusión
Capítulo 2
109
Continúa
AC14:0 -,718 ,228 ,457 ,123 -,082
tam_ratio ,356 ,245 ,040 -,191 ,208
i_Tfb2m -,721 ,254 ,249 -,042 ,272
Methionine ,799 ,255 ,247 ,045 -,079
AC16:0 -,693 ,263 ,412 -,079 -,050
i_Pgc1b -,089 ,270 ,005 ,031 ,204
i_Cd137 -,737 ,285 ,196 -,161 -,014
Valine ,743 ,288 ,438 ,016 -,156
Threonine ,850 ,304 ,168 ,004 -,076
e_Atp5f1 -,246 ,304 ,029 -,267 ,464
AC18:0 -,729 ,313 ,239 -,150 ,040
Choline ,325 ,315 ,729 ,057 ,102
Tyrosine ,880 ,315 ,208 ,165 ,044
AC4:0 ,411 ,316 ,164 -,117 -,401
Serine ,637 ,329 ,448 -,170 -,016
tam_Pparg -,149 ,329 ,325 ,484 -,259
e_Cox8b ,190 ,334 -,346 ,062 ,224
Leucine - Ile ,618 ,341 ,533 ,030 -,107
i_Ucp1 -,228 ,364 -,060 ,580 ,028
Arginine ,836 ,369 ,206 -,037 -,063
AC16:1 -,807 ,374 ,396 ,060 ,015
e_Pgc1b -,054 ,379 -,186 ,258 ,468
e_ratio -,476 ,383 -,047 ,552 -,072
rp_Tfb2m -,041 ,392 -,335 -,016 -,361
EPA -,516 ,392 ,430 -,013 ,329
AC12:0 -,768 ,396 ,407 ,065 -,050
AC5OH ,477 ,400 ,174 -,369 ,181
AC20:4 -,711 ,401 ,508 ,020 ,114
rp_Cd137 ,187 ,401 -,016 -,376 ,068
Citrate - isocitrate ,593 ,403 -,091 ,234 ,278
i_Ppara -,101 ,407 -,002 ,500 ,300
tam_Ppara -,409 ,411 ,297 ,447 -,155
AC18:1 -,814 ,419 ,353 ,038 ,067
Lactate ,225 ,422 -,121 ,186 ,169
Hexose ,683 ,429 -,151 ,198 ,288
rp_ratio -,042 ,432 -,422 -,102 ,439
AC4DC ,421 ,439 ,171 -,315 ,292
rp_Atp5f1 ,230 ,442 -,564 -,239 -,219
AC14:1 -,782 ,449 ,309 ,178 -,027
Arachidonic acid -,558 ,463 ,289 ,121 ,114
rp_Ucp1 ,179 ,473 -,238 -,061 ,084
AC18:2 -,785 ,483 ,314 ,073 -,053
e_Cd137 ,086 ,484 -,291 ,195 ,560
Phenylalanine ,697 ,485 ,292 ,142 -,076
e_Tfb2m -,551 ,486 -,285 -,185 ,365
Creatine ,341 ,486 ,131 -,462 ,293
Alanine ,768 ,487 ,083 -,267 -,003
i_ratio -,499 ,495 -,397 -,332 -,021
AC12:1 -,757 ,499 ,266 ,063 ,121
AC5:0 -,187 ,505 ,616 ,003 -,031
i_Slc27a1 -,090 ,509 ,098 ,163 -,262
rp_Cox8b ,326 ,527 -,270 -,217 -,331
rp_Hoxc9 ,128 ,533 -,241 -,255 -,315
e_Slc27a1 -,335 ,552 -,274 ,087 ,325
Glycine ,390 ,552 ,012 ,092 -,290
e_Tbx1 -,066 ,553 -,099 ,188 -,053
AC6:0 -,111 ,559 ,055 -,161 -,341
Malate ,367 ,564 -,150 ,126 ,077
e_Ucp1 ,087 ,567 -,379 -,277 ,452
Asparagine ,625 ,568 ,349 ,028 -,103
AC3:0 ,583 ,576 -,081 -,137 -,278
rp_Yy1 -,295 ,579 -,082 ,202 -,240
Histidine ,668 ,586 ,200 ,167 ,208
Cystine ,511 ,587 -,015 -,305 ,180
tam_Cox8b ,103 ,588 -,407 ,056 -,393
rp_Slc27a1 -,096 ,594 -,472 ,137 -,062
Continúa
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
110
Continúa
Taurine ,386 ,597 -,116 ,127 -,007
AC16DC -,402 ,606 ,060 -,087 -,021
AC8:0 -,570 ,609 ,042 ,109 -,097
rp_Ppara -,343 ,621 -,121 ,058 -,148
AC3DC/AC4OH -,557 ,625 ,282 -,173 -,045
Carnitine ,507 ,646 -,223 -,015 ,244
Glutamine ,668 ,650 ,173 ,167 ,103
DHA -,329 ,715 ,147 ,090 ,094
tam_Ucp1 -,215 ,761 -,370 ,037 -,172
AC2:0 -,117 ,894 -,069 -,045 ,137
Método de extracción: análisis de componentes principales.
Se ordena en PC2
4.3. Efectos nutriepigenéticos en el tejido adiposo de la suplementación con vitamina
A preformada o β-caroteno durante la lactancia (Capítulo 3)
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
112
Resultados y Discusión
Capítulo 3
113
Capítulo 3: Efectos nutriepigenéticos en el tejido adiposo de la suplementación con
vitamina A preformada o -caroteno durante la lactancia
4.3.1. Antecedentes y planteamiento experimental
La metilación del ADN en las citosinas de dinucleótidos CpG es la modificación
epigenética más ampliamente estudiada (Anderson et al., 2012), es esencial para el
desarrollo animal (Bird, 2002), contribuye a la regulación de la expresión génica (Wrzodek
et al., 2012) y responde a estímulos nutricionales y otros estímulos ambientales (Casanello
et al., 2016; Niculescu, 2012; Smith and Ryckman, 2015). En los últimos años está
creciendo el interés por el impacto de la dieta y la nutrición sobre la metilación del ADN y
sus posibles consecuencias funcionales y para la salud. Se ha investigado el impacto de
condiciones nutricionales genéricas (e.g., malnutrición proteica, restricción calórica global,
dieta alta en grasa) y de bioactivos y nutrientes específicos, principalmente nutrientes como
colina, metionina, ácido fólico o vitaminas B12 y B6 que participan en la biosíntesis de S-
adenosil metionina (SAM), la molécula que aporta directamente el grupo metilo en todas
las reacciones biológicas de metilación (Jimenez-Chillaron et al., 2012; Parle-McDermott
and Ozaki, 2011). En general, se va consolidando la idea de que factores ambientales,
incluyendo la dieta y la nutrición, pueden influenciar procesos fisiológicos y patológicos a
través de alteraciones epigenéticas, que a su vez influencian la expresión génica (Niculescu,
2012).
La influencia del ambiente en los fenómenos epigenéticos es especialmente importante en
etapas vitales críticas como el desarrollo embrionario, fetal y postnatal temprano, que son
etapas de gran actividad epigenética, en que se borran y reescriben muchas marcas. La
metilación del ADN en estas etapas juega un papel muy importante en los procesos de
diferenciación celular y tisular y posiblemente en los fenómenos de programación
metabólica (Casanello et al., 2016; Smith and Ryckman, 2015). Estudios en animales y
evidencia epidemiológica sólida indican que un entorno perinatal adverso puede aumentar
el riesgo de desarrollar enfermedades a largo plazo en la vida adulta, particularmente
obesidad y síndrome metabólico, por mecanismos que incluyen cambios epigenéticos
(Navarro et al., 2016; Pico and Palou, 2013; Tarry-Adkins and Ozanne, 2016).
Características de la dieta en estas etapas pueden afectar, en un sentido u otro, marcas
epigenéticas en genes relacionados con aspectos o procesos relevantes de cara al control de
la adiposidad corporal, como son la celularidad (número de adipocitos) y perfil metabólico
de los tejidos adiposos, el metabolismo oxidativo y lipídico en otros tejidos homeostáticos
o el control de la ingesta, entre otros.
La vitamina A puede afectar la formación de los adipocitos y la regulación de la expresión
de genes adipogénicos (Wang et al., 2016a) y, fundamentalmente en forma de ácido
retinoico (AR), impacta sobre eventos epigenéticos y en particular sobre la metilación del
ADN, ya sea a nivel genómico global o de genes específicos, provocando cambios que han
sido particularmente estudiados en los contextos del desarrollo embrionario y el cáncer
(Bar-El Dadon and Reifen, 2017; Vieira, 2011).
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
114
La lactancia es una etapa vital crítica para el desarrollo del tejido adiposo en la rata (Cryer
and Jones, 1979; Wang et al., 2016a). Resultados previos de nuestro grupo mostraron que
un exceso moderado de vitamina A en forma de retinil éster (RE, en concreto retinil
palmitato) durante este periodo produce en la rata cambios en el desarrollo del tejido
adiposo blanco (TAB) que favorecen la hiperplasia y el aumento de la adiposidad corporal
tras la exposición a una dieta alta en grasa. Estos cambios incluyen una menor expresión
del factor maestro adipogénico PPAR junto con la retención de una mayor capacidad
proliferativa, reflejada en una expresión aumentada del antígeno nuclear de células en
proliferación (PCNA), al destete (Granados et al., 2013). A diferencia de la suplementación
con RE, la suplementación durante la lactancia con un exceso equivalente de vitamina A
pero en forma de -caroteno (BC) no afecta la expresión de PPAR o PCNA en el TAB, a
pesar de que las ratas lactantes se demostraron capaces de absorber y metabolizar
parcialmente el BC que habían recibido por vía oral (Musinovic et al., 2014).
A partir de los resultados descritos en el párrafo anterior, surge nuestra hipótesis de que la
suplementación durante la lactancia con vitamina A puede afectar marcas de metilación del
ADN de genes específicos relacionados con el desarrollo y metabolismo del TAB, y de
manera diferencial según esta vitamina sea aportada en la dieta del lactante como retinil
palmitato o como BC. Para investigar en esta hipótesis, hemos analizado el estado de
metilación de promotores de genes relacionados con la diferenciación (Pparg) y
determinación adipogénica (Zfp423), la proliferación celular (Pcna), el transporte de retinol
(Rbp4) y la capacidad termogénica (Ucp1) en el TAB inguinal (TABi) de crías de rata
suplementadas durante la etapa postnatal temprana (los primeros 21 días de vida,
coincidentes con la etapa de lactancia) con 10-15 μL de vehículo (aceite de oliva; ratas
grupo control) o una emulsión de vitamina A en forma de retinil éster (en concreto retinil
palmitato, ratas grupo RE) o BC (ratas grupo BC) en aceite de oliva. La cantidad de
vitamina A administrada fue entre tres y cinco veces la proporcionada diariamente por la
leche materna (véase el apartado 3 de Materiales y Métodos). Los análisis se han hecho a
partir de ADN aislado de muestras de TABi de un experimento previo del LBNB
(Musinovic et al., 2014), empleando la técnica de secuenciación por bisulfito.
Para ahondar en la relevancia funcional de los cambios de metilación del ADN detectados
y su relación con el estatus en vitamina A al nivel tisular y sistémico, hemos realizado, para
cada uno de los genes estudiados, un análisis de correlaciones de Spearman entre el
porcentaje de metilación de los sitios CpG analizados ‒ considerados individualmente y en
conjunto ‒ con los niveles de expresión del correspondiente ARNm en TABi y con los
niveles de: retinol total en TABi; retinil ésteres, retinol libre y BC en hígado; y retinol y
BC en suero. También investigamos posibles correlaciones entre el estado de metilación
del ADN en estos sitios y parámetros biométricos y la glucemia de los animales. En los
análisis de correlaciones consideramos conjuntamente los diferentes grupos experimentales
(animales controles, RE y BC).
Resultados y Discusión
Capítulo 3
115
4.3.2. Resultados
4.3.2.1. Efectos de la suplementación con vitamina A durante la lactancia sobre
parámetros biométricos y niveles tisulares de retinoides y carotenoides
En la Tabla 4.3.1 se recogen los valores medios de las variables biométricas y bioquímicas
de los animales para las que hemos analizado posibles correlaciones con los resultados de
los análisis de metilación de ADN. El experimento animal fue realizado y estos valores
publicados con anterioridad a esta tesis (Musinovic et al., 2014). Como se puede observar
en la Tabla, los niveles de retinol total en TABi y de retinil ésteres y retinol libre en hígado
(analizados por HPLC) fueron mayores en los grupos RE y BC que en el grupo control, y
mayores en el grupo RE que en el grupo BC. En lo que respecta al BC, este pudo detectarse
por HPLC únicamente en suero e hígado (pero no TAB) de los animales del grupo BC. Por
otro lado, la suplementación durante la lactancia con BC o RE no afectó de manera
significativa el peso corporal, el porcentaje de masa grasa, el peso del TABi, la glucosa
sérica o el retinol sérico de las ratas, todo ello en el momento del destete (punto final del
experimento, día 21 de vida).
Tabla 4.3.1. Variables biométricas y bioquímicas de ratas de 21 días tratadas durante el periodo de
lactancia (días 1 a 20 de vida) con vehículo (control) o una dosis moderada de vitamina A como
retinil palmitato (RE) o β-caroteno (BC)1
1 Los datos representan la media±SEM de 14-15 animales (machos y hembras) para los grupos
control y BC y 28 para el grupo RE. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos
(P<0,05) de acuerdo con el análisis post-hoc DMS, el cual se ha realizado cuando el test ANOVA
de una vía ha indicado diferencias con un valor de P<0,10 (valores mostrados en la columna de la
derecha). 2 Los valores de grasa corporal fueron determinados justo antes del sacrificio, mediante
Echo-MRITM y se expresan en relación al peso corporal. n.d., no detectado. n.s., no significativo.
En la Tabla 1 del Anexo 3B se muestra el análisis de correlaciones entre estas variables.
Los niveles de retinol total en TABi correlacionaron directa y fuertemente con los de retinil
ésteres (ρ=0,856) o retinol libre (ρ=0,671) en hígado, pero no en suero, lo que sugiere que
el estatus en vitamina A del TABi se corresponde con el del hígado. Los niveles de retinol
en TABi o hígado mostraron una correlación inversa significativa (débil, con valores de ρ
en torno a -0,3) con los de BC en suero o hígado, lo que sugiere que retinol y BC pueden
compensarse mutuamente, al menos en parte, a efectos funcionales. Hubo correlaciones
P
46,0 ± 0,7 45,5 ± 0,6 46,4 ± 0,9 n.s.
10,1 ± 0,3 10,5 ± 0,2 10,5 ± 0,3 n.s.
580 ± 25 576 ± 22 640 ± 36 n.s.
120 ± 4 119 ± 2 115 ± 3 n.s.
1,33 ± 0,08a
3,61 ± 0,19b
1,69 ± 0,09c
<0,001
76,6 ± 3,1a
389 ± 20b
136 ± 6c
<0,001
2,2 ± 0,11a
5,08 ± 0,33b
2,65 ± 0,18a
<0,001
34,4 ± 2,2
0,426 ± 0,019 0,436 ± 0,013 0,420 ± 0,021 n.s.
0,16 ± 0,02
Retinol en suero (µM)
β-Caroteno en suero (µM) n.d. n.d.
Glucosa suero (mg/dL)
Retinol total en TABi (nmol/g)
Retinil ester en hígado (nmol/g)
Retinol en hígado (nmol/g)
β-Caroteno en hígado (nmol/g) n.d.
Control RE BC
Peso corporal (g)
Masa grasa (g/100g) 2
Peso TABi (mg)
n.d.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
116
directas significativas de los niveles de retinol en suero con el peso corporal (ρ=0,399), el
porcentaje de masa grasa (ρ=0,311) y el peso del TABi (ρ=0,338), aunque estos parámetros
biométricos no fueran diferentes entre los grupos experimentales; estos resultados sugieren
que el estatus en vitamina A del animal puede influir sobre el crecimiento y el desarrollo
del tejido adiposo durante el período de lactancia, favoreciéndolos. Se encontraron otras
correlaciones directas previsibles, en concreto entre: los niveles hepáticos de retinol libre y
esterificado (ρ=0,844); los niveles de -caroteno en hígado y en suero (ρ=0,976); el peso
corporal y el porcentaje de masa grasa corporal (ρ=0,295); y el peso del TABi con respecto
al peso corporal o al porcentaje de masa grasa corporal (ρ=0,644 y ρ=0,571,
respectivamente).
4.3.2.2. Efectos de la suplementación con vitamina A durante la lactancia sobre los
niveles de expresión de los genes seleccionados en tejido adiposo
En la Figura 4.3.1 (A-D) se muestran, para los diferentes grupos experimentales, los niveles
en TABi del ARNm de los genes cuyo estado de metilación hemos analizado.
Figura 4.3.1. Niveles de
ARNm de los genes
indicados en el TAB inguinal
de ratas de 21 días
suplementadas durante la
etapa de lactancia con
vehículo (grupo control),
retinil palmitato (RE) o β-
caroteno (BC). Los datos
normalizados a la expresión
del gen de referencia β-
actina se expresan en
porcentaje respecto al grupo
control y son la media±SEM
de 12-15 animales por grupo
(26-28 para el grupo RE).
Letras diferentes indican
diferencias significativas
entre grupos (P<0,05) de
acuerdo con el análisis post-
hoc DMS, el cual se ha
realizado cuando el test
ANOVA de una vía ha
indicado diferencias con un
valor de P<0,10 (valores
mostrados en la figura). n.s.,
no significativo.
De acuerdo con resultados previos (Musinovic et al., 2014), la expresión génica de Pparg2
se encontró disminuida en el grupo RE pero no en el grupo BC (Figura 4.3.1A), mientras
que la expresión génica de Pcna tendió a encontrarse aumentada en el grupo RE más que
en el grupo BC (Figura 4.3.1B). La expresión de Zfp423 fue mayor en los dos grupos
Resultados y Discusión
Capítulo 3
117
suplementados con vitamina A, como RE o como BC (Figura 4.3.1C). La expresión de
Rbp4 tendió a ser menor en los grupos suplementados con vitamina A, y de manera más
clara en el grupo RE (Figura 4.3.1D). La expresión génica de Ucp1 en TABi estuvo por
debajo del límite de detección por qPCR a tiempo real (con valores de Ct >35 ciclos o sin
señal).
El análisis de correlaciones de los datos de expresión génica con los parámetros biométricos
y los niveles de retinoides y carotenoides reveló una única correlación significativa, directa
y débil (ρ=0,291) entre la expresión del ARNm de Rbp4 en TABi y los niveles de retinol
en suero (Tabla 1, Anexo 3B).
4.3.2.3. La suplementación con vitamina A durante la lactancia incrementa la
metilación del ADN en CpG específicos del promotor del Pparg2
PPAR es un factor de transcripción regulador clave para la adipogénesis y para el
mantenimiento del fenotipo funcional de los adipocitos. En esta tesis hemos analizado el
estado de metilación en TABi de los 4 CpGs contenidos en una región de 411 pb que
flanquea el sitio de inicio de la transcripción (TSS, del inglés transcription start site) del
ARNm del Pparg2 de rata, comprendida entre las posiciones -267 y +144 (Figura 4.3.2 A).
Estos 4 CpG, numerados de 1 a 4, se sitúan a -223, -207, +12 y +128, respectivamente. La
región analizada se corresponde con un tramo del promotor de Pparg2 que se desmetila
durante la adipogénesis de preadipocitos murinos 3T3-L1 y que se encuentra hipermetilada
en el TAB de ratones diabéticos (Fujiki et al., 2009). En el Anexo 3A de este capítulo se
presenta la alineación en hombre, rata y ratón del tramo de ADN analizado. En la rata, esta
región contiene 153 secuencias consenso de unión putativa a factores de transcripción
detectadas por Genomatix MatInspector (Genomatix Software v3.7); las que se han
considerado más relevantes en el contexto de esta tesis por unir factores de transcripción
relacionados con la biología de los tejidos adiposos y/o los retinoides se indican en la misma
Figura 4.3.2A. Entre ellas hay secuencias consenso para factores de transcripción de tipo
bZIP (C/EBPs) previamente descritas como funcionales en el control de la expresión de
Pparg2 (Fajas et al., 1997; Zhu et al., 1995). [NOTA: para todos los genes, hemos tomado
como TSS el primer nucleótido del primer exón del transcrito inmaduro (con intrones) de
acuerdo a las bases de datos del EMBL-EBI y del NCBI. Siguiendo la convención, se asigna
al TSS la posición +1, numerándose sucesivamente con signo menos las posiciones
corriente arriba, hacia 5’, y con signo + las corriente abajo, hacia 3’, sin cero].
En promedio, considerando conjuntamente los 4 sitios CpG del promotor del Pparg2
analizados, la metilación global fue mayor en los grupos suplementados con vitamina A,
tanto en forma de RE (14%) como de BC (17%), en comparación con el grupo control
(Figura 4.3.2B). Yendo a los niveles de metilación de los 4 sitios CpG individuales, la
metilación fue mayor para tres de ellos en el grupo RE (los CpG 1, 2 y 4) y para dos de
ellos en el grupo BC (los CpG 2 y 4) (Figura 4.3.2C). Al contrastar los resultados de los
análisis epigenéticos con los de expresión génica (disminuida en el grupo RE pero no en el
BC, Figura 4.3.1A), y asumiendo que generalmente más metilación del ADN conlleva
menos expresión, se sugiere que la metilación del CpG 1 (-223) podría ser especialmente
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
118
determinante de la tasa de transcripción del gen Pparg2 en nuestras condiciones
experimentales.
Figura 4.3.2. Localización de CpGs y de sitios putativos de unión de factores de transcripción en
la región promotora del gen Ppar g analizada (A). Los CpGs se muestran en negrita, numerados del
1 al 4 (situados a -223, -207, +12 y +128, de 5´a 3´); el sitio de inicio de la transcripción se indica
con +1. Los sitios de unión de factores de transcripción más relevantes se muestran subrayados en
su posición relativa. Nivel global de metilación del ADN (B) y niveles de metilación de los sitios
CpG individuales (C) de la región promotora de Pparg analizada en el TAB inguinal (TABi) de
ratas de 21 días suplementadas durante la etapa de lactancia con vehículo (grupo control), retinil
palmitato (RE) o β-caroteno (BC). Los datos son la media±SEM de 12-15 animales por grupo (26-
27 para el grupo RE). Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de
acuerdo con el análisis post-hoc DMS, el cual se ha realizado cuando el test ANOVA de una vía ha
indicado diferencias con un valor de P<0,10 (valores mostrados en la figura). n.s., no significativo.
Los resultados del análisis de correlaciones se muestran en la Tabla 2 del Anexo 3B. Entre
las correlaciones significativas (P<0.05) destacan: (i) una correlación inversa de la
metilación promedio en los 4 sitios CpG (ρ=-0,397) y en los CpG 1 (ρ=-0,340) y 3 (ρ=-
Resultados y Discusión
Capítulo 3
119
0,371) con los niveles de ARNm de Pparg en TABi; y (ii) una correlación directa de la
metilación promedio en los 4 sitios CpG con los niveles de retinol total en TABi o los de
retinil ésteres en hígado (ρ=0,323 para ambas) (Figura 4.3.3). Hubo asimismo una
correlación directa de la metilación del CpG 4 con los niveles de BC en hígado (ρ=0,431)
o suero (ρ=0,459). Finalmente, detectamos una correlación directa relativamente fuerte
(ρ=0,530) entre la metilación en los sitios CpG 1 y 2, que sugiere una regulación común por
vitamina A de la metilación de estos dos sitios, que están próximos entre sí (a -223 y -207), y
una correlación directa más débil (ρ=0,305) entre la metilación en los sitios CpG 3 y 4.
Figura 4.3.3. Correlación del nivel de metilación global de la región promotora de Pparg analizada
en TABi con los niveles de ARNm de Pparg2 en TABi (A), de retinol total en TABi (B) y de retinil
ésteres en hígado (C). ρ, Coeficiente de correlación de Spearman.
En conjunto, los resultados sugieren que la metilación del tramo de ADN promotor
analizado puede contribuir al silenciamiento de la expresión de Pparg2 en TAB y que
niveles altos de vitamina A, específicamente como retinol en TAB e hígado, favorecen esta
metilación.
4.3.2.4. La suplementación con vitamina A durante la lactancia disminuye la
metilación del ADN en CpG específicos del promotor del gen Zfp423
Durante la diferenciación de los preadipocitos en adipocitos intervienen críticamente el
PPARγ y factores que controlan la expresión y actividad del PPARγ, principalmente
factores de transcripción de la familia C/EBP (C/EBPβ y C/EBPδ) y la proteína de unión
al elemento de respuesta a esteroles (SREBP-1c). La proteína zinc-finger 423 (ZFP423,
también llamada ZNF423) se ubica funcionalmente corriente arriba de estos factores
adipogénicos “tradicionales”. Así, ZFP423 ha sido más recientemente descrita como un
regulador transcripcional de la determinación en preadipocito, capaz de inducir la expresión
de PPARγ2 y la diferenciación adipocitaria (Gupta et al., 2010).
Hay 7 CpGs en el tramo de 1324 pb que precede al sitio de inicio de la transcripción de
Zfp423 en la rata, identificado de acuerdo con los datos disponibles para esta especie en
NCBI. Hemos analizado el estado de metilación de tres de ellos, los situados en las
posiciones -769, -464 y -423 (CpG 1, 2 y 3, respectivamente); otros tres CpGs más
proximales al TSS (situados entre -100 y +1) se han presumido no metilados por analogía
con los resultados de (Yang et al., 2013). Estos autores han descrito en ratones la
transcripción del gen Zfp423 a partir de un promotor (distinto del aparentemente funcional
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
120
en la rata) excepcionalmente rico en dinucleótidos CpG que contiene tramos distales (entre
-1324 y -764) cuyo estado de metilación cambia en tejido fetal en función de la obesidad
materna y tramos más proximales al TSS cuyos CpG están invariablemente no metilados
(Yang et al., 2013). Para el análisis utilizamos dos parejas de cebadores, una para amplificar
el tramo de -784 a -725 (que contiene el CpG 1) y otra para amplificar el tramo de -484 a -
365 (que contiene los CpGs 2 y 3) (Figura 4.3.4A). El software Genomatix MatInspector
identificó la presencia de 21 sitios putativos para la unión de factores de transcripción en
el primer tramo analizado y 17 en el segundo, entre los que se destacan los indicados en la
Figura 4.3.4A. En el Anexo 3A se presenta la alineación en hombre, rata y ratón del tramo
de ADN genómico próximo al gen Zfp423 de rata investigado.
Figura 4.3.4. Localización de CpGs y de sitios putativos de unión de factores de transcripción en
la región promotora del gen Zfp423 analizada (A). Los CpG analizados se muestran en negrita,
numerados del 1 al 3 (situados a -769, -464 y -423, de 5´a 3´); el sitio de inicio de la transcripción
se indica con +1. Los sitios de unión de factores de transcripción más relevantes se muestran
subrayados en su posición relativa. Nivel global de metilación del ADN (B) y niveles de metilación
de los sitios CpG individuales (C) de la región promotora de Zfp423 analizada en el TAB inguinal
de ratas de 21 días suplementadas durante la etapa de lactancia con vehículo (grupo control), retinil
palmitato (RE) o β-caroteno (BC). Los datos son la media±SEM de 10-15 animales por grupo (25-
27 para el grupo RE). Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de
acuerdo con el análisis post-hoc DMS, el cual se ha realizado cuando el test ANOVA de una vía ha
indicado diferencias con un valor de P<0,10 (valores mostrados en la figura). n.s., no significativo.
Resultados y Discusión
Capítulo 3
121
Globalmente, considerando el promedio de metilación de los 3 CpGs, el promotor de
Zfp423 se encontró relativamente desmetilado en el grupo BC (36% menos metilación) e
igualmente metilado en el grupo RE en comparación con el grupo control (Figura 4.3.4B).
Considerando los 3 sitios CpG por separado, la metilación fue menor para los CpGs 1 y 3
en el grupo BC y para el CpG 3 en el grupo RE, siempre respecto del grupo control (Figura
4.3.4C). La metilación de cada uno de los 3 CpG correlacionó positivamente con la
metilación promedio, lo que sugiere que los tres sitios están regulados de manera similar
(Tabla 3, Anexo 3B). Como ya se ha comentado, los niveles de ARNm Zfp423 en TABi
fueron mayores en los dos grupos suplementados con vitamina A (RE y BC) que en el
grupo control (Figura 4.3.1C). Por tanto, en conjunto los resultados a nivel de grupo
sugieren que la hipometilación del promotor de Zfp423, particularmente la del sitio CpG 3,
podría contribuir al incremento del nivel de transcripción de Zfp423 en TABi observado en
los dos grupos suplementados.
No obstante lo anterior, los resultados del análisis realizado (Tabla 3, Anexo 3B) no sostienen
una correlación a nivel individual entre la regulación epigenética y la regulación
transcripcional, lo que indica que deben existir factores adicionales, sujetos a variabilidad
interindividual, que serían más determinantes de la expresión de Zfp423 en TAB que la
metilación de los CpGs estudiados. Por otro lado, detectamos una correlación inversa entre la
metilación (promedio y de CpGs individuales) en TAB del promotor de Zfp43 y los niveles de
BC en hígado o suero, especialmente fuerte y clara para el CpG situado más corriente arriba,
el CpG 1; en cambio, no hubo correlación entre la metilación del promotor de Zfp43 en TAB,
promedio o en CpGs individuales, y los niveles de retinol en TAB, hígado o suero. Estos
resultados refuerzan la idea de que la metilación del promotor Zfp43 sería especialmente
sensible a la suplementación con BC, que conlleva una menor metilación.
4.3.2.5. La suplementación con vitamina A durante la lactancia afecta la metilación
del ADN en CpG específicos del promotor del gen Pcna, de manera opuesta según sea
aportada como retinil palmitato o como -caroteno
PCNA es un cofactor de la ADN polimerasa que juega un papel clave en la replicación del
ADN y en la reproducción de las marcas epigenéticas de la cromatina de generación en
generación celular (Moldovan et al., 2007). Hemos analizado el estado de metilación en
TABi de los 17 CpGs presentes entre las posiciones -168 y +44 en torno al TSS del gen
Pcna de rata (Figura 4.3.5A). Este tramo presenta 66 sitios de unión a factores de
transcripción detectados por Genomatix MatInspector, entre los que se destacan los
indicados en la Figura 4.3.5A. En el Anexo 3A se presenta la alineación en hombre, rata y
ratón del tramo de ADN analizado. Es interesante destacar que 9 de los 17 sitios CpG
analizados se encuentran conservados en las tres especies (Anexo 3A).
Considerando conjuntamente los 17 CpGs del promotor de Pcna estudiados, respecto del
grupo control encontramos una hipometilación significativa (~32%) en el grupo RE y una
hipermetilación no significativa (~51%) en el grupo BC. Como resultado, el grupo BC
presentó el promotor de Pcna significativamente hipermetilado (~120%) comparado con el
grupo RE (Figura 4.3.5B). Considerados individualmente, 3 de los 17 CpGs presentaron
niveles de metilación significativamente menores en el grupo RE respecto del control
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
122
(CpGs 1, 14 y 15) y 6, niveles de metilación significativamente mayores en el grupo BC
respecto del control (CpGs 1, 2, 6, 7, 10,16); 14 CpGs presentaron niveles de metilación
significativamente mayores en el grupo BC respecto del RE (Figura 4.3.5C). Es destacable
que, exceptuando el sitio CpG 1, no hay coincidencia entre los sitios CpG hipometilados
en el grupo RE y los hipermetilados en el grupo BC.
Figura 4.3.5. Localización de CpGs y de sitios putativos de unión de factores de transcripción en
la región promotora del gen Pcna analizada (A). Los CpG analizados se muestran en negrita,
numerados del 1 al 17 (situados a -137, -129, -118, -116, -103, -101, -99, -87, -85, -75, -69, -65, -
48, -30, -16, -9 y +14, de 5´a 3´); el sitio de inicio de la transcripción se indica con +1. Los sitios
de unión de factores de transcripción más relevantes se muestran subrayados en su posición relativa.
Nivel global de metilación del ADN (B) y niveles de metilación de los sitios CpG individuales (C)
de la región promotora de Pcna analizada en el TAB inguinal de ratas de 21 días suplementadas
durante la etapa de lactancia con vehículo (grupo control), retinil palmitato (RE) o β-caroteno (BC).
Los datos son la media±SEM de 12-15 animales por grupo (28 para el grupo RE). Letras diferentes
indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con el análisis post-hoc DMS,
el cual se ha realizado cuando el test ANOVA de una vía ha indicado diferencias con un valor de
P<0,10 (valores mostrados en la figura). n.s., no significativo.
Los resultados del análisis de correlaciones se resumen en la Tabla 4 del Anexo 3B. La
metilación en cada uno de los 17 CpG individuales correlacionó positivamente con la
metilación promedio. Detectamos una correlación directa (ρ=0,359) significativa entre la
metilación del CpG 13 (situado en -48) y el peso corporal, y una correlación inversa (ρ=-
290) entre la metilación del CpG 11 (situado en -69) y la glucosa sérica, cuyo significado
biológico es dudoso. Como resultado más destacado, el porcentaje de metilación, promedio
Resultados y Discusión
Capítulo 3
123
y en diferentes CpGs individuales, correlacionó inversamente con los niveles de retinol
total en TABi, retinil ésteres en hígado o retinol libre en hígado, y positivamente con los
niveles de BC en hígado o suero. Por tanto, claramente hubo un efecto diferente, opuesto,
de la suplementación con vitamina A como RE o BC sobre la metilación del promotor del
gen Pcna. La hipometilación observada en el grupo RE, particularmente en los CpGs 14 y
15, se podría relacionar con la tendencia de este grupo a presentar una mayor expresión del
ARNm de Pcna en TABi (Figura 4.3.1B), si bien no se encontró correlación a nivel
individual entre el estado de metilación y los niveles de ARNm.
4.3.2.6. La suplementación con vitamina A durante la lactancia afecta la metilación
del ADN en CpG específicos del promotor del gen Rbp4, de manera opuesta según sea
aportada como retinil palmitato o como -caroteno
La retinol binding protein 4 (RBP4, o simplemente RBP) es una proteína específica para
el transporte de retinol en sangre que es producida por tejidos capaces de almacenar retinol
y movilizarlo, como el hígado y el TAB. El gen Rbp4 se induce fuertemente durante la
diferenciación de los preadipocitos en adipocitos, de modo que su expresión se considera
un marcador del adipocito maduro (Friebe et al., 2011).
Utilizando dos juegos de cebadores hemos podido analizar el estado de metilación de 34 de
los 37 sitios CpG presentes entre las posiciones -340 y +34 del promotor del gen Rbp4 de
rata (Figura 4.3.6A). Este tramo presenta 183 secuencias consenso putativas para la unión de
factores de transcripción detectadas por Genomatix MatInspector, entre las que se destacan
las indicadas en la Figura 4.3.6A. De los 37 CpGs contenidos en el tramo de ADN analizado,
17 están conservados en hombre, rata y ratón, según el alineamiento realizado (Anexo 3A).
En la Figura 4.3.6B se presentan los niveles globales de metilación del promotor del gen
Rbp4 en los tres grupos experimentales estudiados. La metilación promedio fue menor en
el grupo BC (32%) en comparación con el grupo control o el grupo RE. De los 34 sitios
CpG analizados, en el grupo BC se encontraron 2 hipometilados respecto del grupo control
(los CpGs 4 y 9) y 7 hipometilados respecto del grupo RE. Aunque la metilación promedio
no se vio afectada, 4 sitios CpG se encontraron hipermetilados en el grupo RE respecto del
grupo control (los CpGs 2, 6, 15 y 18) (Figura 4.3.6C). La metilación de los sitios 1 a 9,
15, 18, 28, 30, 32 y 33 correlacionó positivamente con la metilación promedio, y hubo
asimismo una fuerte correlación de la metilación de los sitios CpG 1 a 9 entre sí, sugiriendo
una regulación coordinada del estado de metilación de estos sitios (Tabla 5 del Anexo 3B).
No encontramos correlación de la metilación promedio o en sitios CpG individuales de los
analizados del promotor de Rbp4 con los niveles de expresión de su ARNm en TABi (Tabla
5 del Anexo 3B). Es de destacar, no obstante, que, a nivel de grupo, el RE presentó junto
con la ya mencionada hipermetilación de 4 sitios CpG una expresión de ARNm Rbp4 que
tendió a ser menor que la del grupo control (Figura 4.3.1D). Por otro lado, la metilación
promedio y la de CpGs individuales correlacionó directamente con la concentración de
retinol en TABi e hígado e inversamente con la concentración de BC en suero e hígado
(Tabla 5 del Anexo 3B). Por tanto, concluimos que la suplementación con BC favorece la
hipometilación del promotor del gen Rbp4 en TABi, si bien esto no se traduce en cambios
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
124
en el nivel de expresión del correspondiente ARNm, mientras que la suplementación con
RE favorece la hipermetilación de ciertos sitios CpG de este promotor, lo que se acompaña
de una expresión a la baja. Es destacable que no hay ninguna coincidencia entre los sitios
CpG hipermetilados en el grupo RE y los hipometilados en el grupo BC.
Resultados y Discusión
Capítulo 3
125
Encontramos una correlación directa, débil pero significativa, de la metilación promedio
del promotor de Rbp4 con el peso corporal (ρ=0,276) y el porcentaje de grasa corporal
(ρ=0,273), y una correlación también directa entre el grado de metilación en varios CpGs
específicos (17, 21, 26, 33, 34) y la glucemia (Tabla 5 del Anexo 3B). El significado de
estas correlaciones no es obvio, pero son resultados sugerentes, teniendo en cuenta que
RBP4 como adipoquina se ha descrito aumentada en la obesidad y relacionada con la
resistencia a la insulina (Kotnik et al., 2011).
4.3.2.7. La suplementación con -caroteno durante la lactancia disminuye la
metilación del ADN en CpG específicos del enhancer distal del gen Ucp1
El ácido retinoico todo trans, metabolito activo de la vitamina A, induce (principalmente vía
RAR:RXR) la expresión de la proteína desacoplante 1 (UCP1) en adipocitos marrones y
favorece la remodelación del TAB en ratones adultos, aumentando el metabolismo oxidativo,
disminuyendo el contenido tisular de triglicéridos e induciendo la expresión de UCP1, al
menos a nivel de ARNm (capítulo 1 y (Bonet et al., 2003; Mercader et al., 2006; Musinovic
et al., 2014). Aunque la suplementación con vitamina A durante la lactancia, ya sea como RE
o como BC, no indujo la expresión del gen Ucp1 en el TABi (donde el correspondiente
ARNm no pudo ser detectado por qPCR a tiempo real), hemos analizado posibles efectos de
la suplementación sobre la metilación del enhancer distal del gen Ucp1. Se trata de una región
potenciadora de 221 pb, muy conservada entre especies, que en rata y ratón se sitúa a -2.5 kb
corriente arriba del TSS y en la especie humana a -3,9 kb (Kozak et al., 1994). Este enhancer
contiene elementos cis que regulan la transcripción del gen Ucp1, incluyendo sitios de unión
para diversos receptores nucleares (PPARs, RARs, receptor de hormona tiroidea) y para el
factor de transcripción activado por la señalización adrenérgica, CREB (cAMP response
element binding protein) (del Mar Gonzalez-Barroso et al., 2000; Shore et al., 2010). En
concreto, para el análisis seleccionamos los 12 dinucleótidos CpG presentes en un fragmento
de 288 pb, localizado entre -2696 a -2415 corriente arriba del TSS del gen Ucp1 de rata, que
comprende el enhancer distal (Shore et al., 2010) (Figura 4.3.7A). El fragmento analizado
contiene 70 secuencias consenso putativas para la unión de factores de transcripción
detectadas por Genomatix MatInspector, entre las que se destacan las indicadas en la Figura
4.3.7A. En el Anexo 3A se presenta la alineación en hombre, rata y ratón del tramo de ADN
del enhancer de Ucp1 analizado.
◄ Figura 4.3.6. (Página anterior) Localización de CpGs y de sitios putativos de unión de factores de
transcripción en la región promotora del gen Rbp4 analizada (A). Los CpG analizados se muestran
en negrita, numerados del 1 al 9 (situados a -296, -278, -267, -249, -199, -192, -171, -159, -148) y
del 13 al 37 (situados a -105, -102, -91, -87, -81, -70, -68, -55, -53, -45, -39, -37, -23, -8, +1, +4,
+10, +13, +20, +22, +24, +26, +28, +32, +34, de 5´a 3´); el sitio de inicio de la transcripción se
indica con +1. Los sitios de unión de factores de transcripción más relevantes se muestran
subrayados en su posición relativa. Nivel global de metilación del ADN (B) y niveles de metilación
de los sitios CpG individuales (C) de la región promotora de Rbp4 analizada en el TAB inguinal de
ratas de 21 días suplementadas durante la etapa de lactancia con vehículo (grupo control), retinil
palmitato (RE) o β-caroteno (BC). Los datos son la media±SEM de 13-15 animales por grupo (28
para el grupo RE). Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de
acuerdo con el análisis post-hoc DMS, el cual se ha realizado cuando el test ANOVA de una vía ha
indicado diferencias con un valor de P<0,10 (valores mostrados en la figura). n.s., no significativo.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
126
La metilación promedio en la región potenciadora del gen Ucp1 fue ligeramente menor
(~3-4 %) en el grupo BC en comparación con el grupo RE (Figura 4.3.7B). Los resultados
CpG a CpG muestran hipermetilación de uno de los 12 CpG estudiados en el grupo RE
respecto del grupo control (el CpG 11) e hipometilación de dos de ellos en el grupo BC
respecto del grupo control (los CpGs, 10 y 12) (Figura 4.3.7C).
Figura 4.3.7. Localización de CpGs y de sitios putativos de unión de factores de transcripción en
el enhancer del gen Ucp1 analizada (A). Los CpG analizados se muestran en negrita, numerados
del 1 al 12 (situados a -2640, -2634, -2608, -2599, -2586, -2580, -2541, -2538, -2521, -2511, -2508
y -2455, de 5´a 3´); el sitio de inicio de la transcripción se indica con +1. Los sitios de unión de
factores de transcripción más relevantes se muestran subrayados en su posición relativa. Nivel
global de metilación del ADN (B) y niveles de metilación de los sitios CpG individuales (C) del
enhancer de Ucp1 analizada en el TAB inguinal de ratas de 21 días suplementadas durante la etapa
de lactancia con vehículo (grupo control), retinil palmitato (RE) o β-caroteno (BC). Los datos son
la media±SEM de 13-15 animales por grupo (27-28 para el grupo RE). Letras diferentes indican
diferencias significativas entre grupos (P<0,05) de acuerdo con el análisis post-hoc DMS, el cual
se ha realizado cuando el test ANOVA de una vía ha indicado diferencias con un valor de P<0,10
(valores mostrados en la figura). n.s., no significativo.
Los resultados del análisis de correlaciones se resumen en la Tabla 6 del Anexo 3B. La
metilación de cada uno de los 12 CpG individuales correlacionó positivamente con la
Resultados y Discusión
Capítulo 3
127
metilación promedio. Hay correlaciones significativas, directas y relativamente fuertes, de
la metilación promedio (ρ=0,459) y en múltiples CpGs específicos (CpGs 2, 3, 5, 6, 7, 9,
12) del enhancer de Ucp1 con la glucemia en el momento del sacrificio. Curiosamente,
encontramos correlaciones inversas, estas más débiles pero también significativas, de la
metilación promedio (ρ=-0,279) y específicamente de los CpGs 7 (ρ=-0,297) y 8 (ρ=-0,291)
con el peso corporal. Para estos mismos CpGs, 7 y 8, detectamos asimismo una correlación
inversa entre su grado de metilación y el peso del TABi (ρ=-0,268 y -0,280,
respectivamente). Finalmente, destacar que la metilación promedio o en CpGs específicos
del enhancer de Ucp1 no correlacionó con los niveles de retinol en suero o tejidos, pero sí,
inversamente, con los de BC en suero e hígado.
4.3.3. Discusión
Los mecanismos epigenéticos median interacciones entre genes, medio ambiente y factores
nutricionales, particularmente durante etapas vitales tempranas críticas. La actividad
epigenética de la vitamina A ha sido estudiada en relación al cáncer y la morfogénesis
durante el desarrollo embrionario, pero muy poco en relación con la salud metabólica y la
homeostasis energética y su programación. Recientemente, se han descrito efectos
epigenéticos de la vitamina A en la programación de circuitos neurales implicados en el
control de la ingesta en la rata (Sánchez-Hernández et al., 2014; Sánchez-Hernández et al.,
2016). Nuestro estudio es, que sepamos, el primero en abordar posibles efectos
nutriepigenéticos de la vitamina A durante la lactancia en relación con la diferenciación y
el desarrollo del tejido adiposo.
Los resultados más destacados son: (i) que un exceso moderado de vitamina A durante el
periodo de lactancia altera marcas de metilación en genes implicados en la diferenciación
y metabolismo del tejido adiposo (TAB) en formación en la rata y (ii) que, a estos efectos,
suplementar la vitamina A en forma de ésteres de retinol (vitamina A preformada) o BC
(carotenoide pro-vitamina A) no es equivalente, sino que hay efectos nutriepigenéticos
diferenciales en el TAB de la crías. Cabe recordar que la rata lactante se ha propuesto como
un modelo animal apropiado en estudios sobre la actividad biológica del BC ya que,
contrariamente a la rata adulta, no hidroliza a nivel intestinal todo el BC dietético, sino que
(aún a dosis moderadas) una parte lo absorbe intacto, asemejándose así a la situación en
seres humanos (Keijer et al., 2005; Musinovic et al., 2014). Las diferencias entre la
actividad nutriepigenética de la suplementación con RE o BC durante la lactancia tienen
que ver con los CpG concretos que se ven afectados y con el sentido del cambio (hipo o
hipermetilación respecto del grado de metilación observado en el grupo control). Las
diferencias más notables se han encontrado para los genes Pcna (hipometilación en
múltiples CpG en el grupo RE e hipermetilación de otros en el grupo BC), Rbp4
(hipermetilación en múltiples CpG en el grupo RE e hipometilación de otros en el grupo
BC) y Ucp1 (con enhancer ligeramente hipometilado en el grupo BC respecto del grupo
RE). También cabe destacar un sitio CpG en el promotor del PPAR2 (el CpG 1 de los
analizados, situado a -223), que se encontró hipermetilado en el grupo RE, pero no en el
grupo BC.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
128
La base molecular de la actividad nutriepigenética de la vitamina A sobre el TAB en
formación y de las diferencias al respecto entre la suplementación con RE y BC requiere
más estudio. Estas últimas podrían tener que ver con una cuestión de concentración: la
suplementación como RE conllevó un incremento mucho más importante de los niveles de
retinol en TAB que la suplementación con BC, y puede ocurrir que los efectos sobre la
metilación del ADN sean distintos dependiendo de la concentración de retinol en las células
adiposas. También puede tener que ver con efectos diferenciales del BC intacto respecto
de los retinoides: aunque no se pudo detectar la presencia de BC en el TAB de las ratas en
el momento del sacrificio (Musinovic et al., 2014), no se puede descartar que haya habido
internalización del BC circulante en el TAB inmaduro durante el periodo de la
suplementación, o que el BC circulante haya actuado sobre las células del TAB desde la
membrana de estas. Finalmente, no se puede descartar que las diferencias de metilación de
ADN observadas en TAB obedezcan a señales dirigidas al TAB procedentes del hígado u
otros tejidos (como el intestino), que se producirían secundariamente a las diferencias en el
estatus en retinol y BC observadas (o presumibles) en estos tejidos. Estos conceptos se
ilustran en la Figura 4.3.8, y también podrían atañer a las diferencias de expresión génica
en TABi observadas entre los grupos BC y RE. En este sentido, cabe señalar que, de todos
los genes analizados en el TABi de los animales usados en esta tesis – Pparg2, aP2, LPL,
Mest, Pcna, Rbp4, Zfp423 (esta tesis y (Musinovic et al., 2014) – el único gen cuya
expresión se vio afectada significativamente en el grupo BC respecto del grupo control fue
el Zfp423.
Figura 4.3.8. Posibles mecanismos de la actividad nutriepigenética de la vitamina A sobre el TAB
en formación y de las diferencias al respecto entre la suplementación con retinil palmitato y β-
caroteno (BC) en ratas lactantes. RE, retinil ésteres; Rol, retinol; RBP, proteína de unión a retinol;
Rald, retinaldehído.
Resultados y Discusión
Capítulo 3
129
Nuestros resultados en general parecen estar de acuerdo con el paradigma de que
habitualmente (aunque no siempre) la metilación del ADN silencia la transcripción, por
interferir con la unión de factores de transcripción y/o por otros mecanismos (Klose and
Bird, 2006). Esto es especialmente claro en el caso del PPAR2, para el que encontramos
una correlación negativa entre el grado de metilación de su promotor (global y en 2 de los
4 sitios CpGs analizados) y los niveles de su ARNm en TABi. También en el caso del
promotor de Rbp4, hipermetilado en ciertas posiciones sólo en el grupo RE y con tendencia
a presentar una menor expresión especialmente en este grupo. Recíprocamente, para Zfp423
y Pcna, la desmetilación de ciertos CpG en su ADN promotor se acompaña de una mayor
expresión (o tendencia a ella) a nivel de ARNm en uno o ambos grupos suplementados con
vitamina A.
A continuación, se discuten los resultados más destacados en relación con cada gen
investigado, enmarcándolos en la evidencia previa de regulación del gen en cuestión por
metilación del ADN y por vitamina A:
PPARγ2 es clave para la adipogénesis y para el mantenimiento del fenotipo de adipocito
maduro, implicado por tanto en la lipogénesis en los adipocitos, la prevención de la
lipotoxicidad por deposición de grasa en sitios ectópicos (páncreas, músculo,…) y la
sensibilización sistémica a la insulina (Kersten et al., 2000; Kintscher and Law, 2005).
Estudios previos han mostrado que durante la adipogénesis de preadipocitos murinos 3T3-
L1 la expresión de PPARγ2 se induce en paralelo a una desmetilación progresiva de su
promotor, y que la expresión de PPARγ2 está reprimida y su ADN promotor hipermetilado
en el TAB de ratones con obesidad y diabetes inducidas por una dieta hipergrasa (Fujiki et
al., 2009). La represión de la expresión de Pparg2 en el TAB de las ratas lactantes
suplementadas con RE está de acuerdo con el conocido efecto de los retinoides de inhibir
la adipogénesis y con resultados que indican que ácido retinoico y productos de la acción
de la BCO1 sobre el BC dietético inhiben la expresión y actividad transcripcional del
PPARγ2 en el TAB de ratones adultos (Amengual et al., 2011; Ribot et al., 2001) y en
adipocitos maduros en cultivo (Lobo et al., 2010). Los resultados de esta tesis sugieren que
la metilación del ADN promotor sería un mecanismo que podría contribuir a esta represión.
De los 4 CpGs contenidos en el tramo del promotor de Pparg2 estudiado, nuestros
resultados apuntan a un papel funcional destacado del CpG 1 (el situado a -223), ya que la
metilación de este sitio correlaciona inversamente con la expresión de Pparg2 en TABi y,
además, es el único CpG hipermetilado específicamente en el grupo RE, que es el grupo
que mostró una expresión significativamente reducida de ARNm de Pparg2 (otros CpGs
también se encontraron hipermetilados en el grupo BC, en el que en cambio los niveles de
ARNm de Pparg2 no fueron distintos a los del grupo control). Interesantemente, el CpG 1
es el único de los 4 CpGs estudiados que está conservado en el promotor de Pparg2 en
hombre, rata y ratón, según se desprende de nuestro análisis de alineación (Anexo 3A).
También es interesante destacar que este CpG 1 solapa con un sitio de unión a E2F1. Es
conocido que factores de transcripción de la familia E2F regulan la adipogénesis mediante
la modulación de la expresión del gen Pparg: en concreto E2F1 induce la expresión de la
isoforma PPARγ1, que se induce antes que la 2 y que juega un papel muy importante
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
130
durante la fase inicial de expansión clonal de los preadipocitos ya confluentes (Fajas et al.,
2002; Miard and Fajas, 2005). Que sepamos, no se ha estudiado específicamente la acción
de los E2F sobre el promotor del Pparg2, que es el que hemos estudiado parcialmente aquí
a nivel de metilación. Las isoformas PPARγ1 y PPARγ2, esta última de expresión
restringida en los tejidos adiposos, comparten la mayoría de exones C-terminal, pero se
transcriben a partir de promotores diferentes (Fajas et al., 1997).
ZFP423 es un iniciador de la determinación de células progenitoras en preadipocitos y un
inductor de la expresión de PPARγ (de manera indirecta) y de la diferenciación adipocitaria
(Gupta et al., 2010). De acuerdo con ello, Zfp423 es crítico para el desarrollo del TAB
subcutáneo durante el desarrollo fetal del ratón (Shao et al., 2016). Nuestros resultados
muestran que la suplementación durante la lactancia con una dosis moderada de vitamina
A, como RE o BC, favorece una expresión aumentada del gen Zfp423 en TABi y la
desmetilación en ambos grupos suplementados de uno de los sitios CpG analizados, el sitio
CpG 3. Este CpG se sitúa cerca de un sitio de unión putativo para factores de transcripción
HNF3 (hepatocyte nuclear factor-3, también llamados Foxa 1-3), que están implicados en
la adipogénesis (Wolfrum et al., 2003). No obstante, no hemos encontrado evidencia en la
bibliografía de una conexión entre HNF3 y la expresión de Zfp423.
La interacción de la vitamina A con el gen Zfp423 es compleja. En ratones carentes de
aldehído deshidrogenasa 1 (Aldh1), enzima que cataliza la producción de ácido retinoico
a partir de retinaldehído, la expresión de Zfp423 y Pparg se encuentra disminuida en un
70% en el tejido adiposo visceral, el cual se presenta muy atrofiado (Reichert et al., 2011).
Estos y otros resultados han llevado a proponer que el ácido retinoico sintetizado
endógenamente puede ser necesario para la adipogénesis in vivo por inducir la expresión
de Zfp423 (Reichert et al., 2011). Por otro lado, según un abstract reciente, el ácido
retinoico exógeno inhibe la adipogénesis de células madre totipotentes ya que previene la
desmetilación del ADN promotor del gen Zfp423, reprimiendo así su expresión. En el
mismo abstract se describe que la suplementación con vitamina A (retinol) en el agua de
bebida (30 UI/mL) inhibe el desarrollo de obesidad dietética en ratones adultos y atenúa la
expresión de Zfp423 y Pparg en el TAB (Wang et al., 2016b). La represión de Zfp423
podría contribuir a contrarrestar la obesidad dietética no sólo por inhibir la adipogénesis,
sino también favoreciendo la marronización (browning) del TAB, ya que se ha descrito que
la inactivación de Zfp423 in vivo promueve la conversión de los adipocitos maduros en
adipocitos beige (Shao et al., 2016). En este sentido, es sugerente que la administración de
ácido retinoico exógeno haga esto mismo en ratones adultos: inhibe la adipogénesis
promovida in vivo por una dieta obesogénica (Berry et al., 2012) y favorece el metabolismo
oxidativo y la marronización del TAB ((Mercader et al., 2006) y esta tesis), resultando en
un efecto anti-obesidad. En nuestro experimento, la suplementación con vitamina A durante
la lactancia se asoció a la desmetilación de un sitio CpG específico en el promotor de
Zfp423 y a una expresión aumentada de Zfp423 en el TABi al destete, lo que podría estar
de acuerdo con los resultados de (Reichert et al., 2011). Por tanto, los efectos de los
retinoides sobre la expresión del gen Zfp423 podrían ser dependientes de la dosis y del
momento del desarrollo, prevaleciendo un efecto estimulador a dosis moderadas y en
momentos tempranos del desarrollo. De hecho, contamos con resultados que indican que
Resultados y Discusión
Capítulo 3
131
la expresión de Zfp423 está reprimida en el TAB visceral (retroperitoneal) de ratones
adultos tratados con ácido retinoico (Anexo 3C).
En ratones, la obesidad materna disminuye la metilación del ADN promotor de Zfp423 en
tejido fetal (Yang et al., 2013) y en TAB (y específicamente en células progenitoras dentro
del TAB) al destete (Liang et al., 2016) y esto va en paralelo a una mayor expresión de
Zfp423 y una mayor adipogénesis de células progenitoras. Posiblemente a través de sus
efectos epigenéticos sobre Zfp423, la obesidad materna programa una diferenciación
adipogénica prematura, que agota el pool de células progenitoras adipogénicas, limitando
la expansibilidad por hiperplasia del TAB cuando (tras el destete) los ratones son
alimentados con una dieta rica en energía; esto conduce a una hipertrofia excesiva de los
adipocitos y a signos de inflamación y disfunción metabólica a los tres meses de edad
(Liang et al., 2016). La situación es distinta en nuestro experimento, porque en el grupo RE
la mayor expresión de Zfp423 en TAB no se acompañó de una mayor expresión de Pparg2,
sino todo lo contrario, esta fue menor. Los resultados apuntan por tanto a efectos
discordantes de la suplementación temprana con RE sobre la expresión de estos dos genes
pro-adipogénicos, Zfp423 y Pparg2, una discordancia que también se detecta al nivel de la
metilación de su respectivo ADN promotor. De hecho, cuando (tras el destete) las ratas
tratadas con RE son alimentadas con una dieta rica en grasas se detecta una mayor
expansión del TAB con predomino del componente hiperplásico (Granados et al., 2013).
PCNA favorece la síntesis de ADN durante la proliferación celular (Moldovan et al., 2007),
por lo tanto su estudio es relevante para la comprensión de procesos de desarrollo y
diferenciación. Es más, PCNA interviene críticamente en el desarrollo del TAB: la
fosforilación de PCNA en un residuo específico de tirosina (Y114) es necesaria para la
adipogénesis inducida por una dieta alta en grasa en ratones y para la expansión clonal
mitótica que precede a la diferenciación terminal de fibroblastos embrionarios de ratón en
adipocitos (Lo et al., 2013). Nuestros resultados muestran que la suplementación con RE
durante la lactancia promueve en TABi la desmetilación del ADN en los sitios CpG -137,
-30 y -16 del promotor de Pcna y sugieren que la desmetilación de estos sitios favorece la
transcripción a partir de este promotor, ya que los niveles de ARNm de Pcna tendieron a
ser más altos en el grupo RE (esta tesis y (Musinovic et al., 2014)). Es más, las ratas tratadas
con RE durante la lactancia presentan en el momento del destete adipocitos más pequeños
y más núcleos positivos para PCNA en TABi que las ratas controles (Musinovic et al.,
2014). De los 3 sitios CpG indicados, sería particularmente relevante la desmetilación de
los CpGs -30 y -16, próximos entre sí y al TSS, ya que la hipermetilación del sitio CpG -
137 no redundó en una menor expresión del ARNm de Pcna en el grupo BC. Cabe destacar
que el CpG -30 solapa con sitios putativos de unión de VDR y E2F4, factores de
transcripción que han sido implicados en la adipogénesis y otros aspectos de la biología del
tejido adiposo (Ding et al., 2012; Landsberg et al., 2003; Miard and Fajas, 2005; Mutt et
al., 2014) y también en el control de la expresión de PCNA (Eelen et al., 2004; Takashima
et al., 2001).
La hipermetilación de múltiples sitios CpG en el promotor Pcna observada en el grupo BC
respecto del grupo control no se acompañó de cambios en el nivel de expresión de su
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
132
ARNm. En todo caso, es interesante destacar que, en el estudio de Musinovic et al. (2014),
las ratas que recibieron BC durante la lactancia presentaron en el momento del destete
menos núcleos positivos para PCNA en TABi que las que recibieron RE (Musinovic et al.,
2014), un resultado que podría estar en consonancia con los de esta tesis, que muestran
hipermetilación del ADN promotor de Pcna en el grupo BC respecto del grupo RE.
RBP4 es responsable del transporte y distribución de la vitamina A en el organismo y es
producida principalmente por el hígado y el tejido adiposo. Sus niveles circulantes están
incrementados en la obesidad y la RBP4, particularmente la de origen adiposo, ha sido
implicada en la resistencia a la insulina, aunque hay resultados controvertidos (Kotnik et
al., 2011; Norseen et al., 2012). La expresión de RBP4 está estrechamente ligada a la
diferenciación de los adipocitos (Friebe et al., 2011), por lo que puede ser considerada un
marcador del adipocito maduro. Además de resultar inducida durante la adipogénesis,
RBP4 modula en conjunción con su receptor de membrana (STRA6) la adipogénesis en
modelos celulares de preadipocitos (Muenzner et al., 2013) y se ha descrito que RBP4
inhibe la adipogénesis de preadipocitos en cultivo (Cheng et al., 2013) y la adipogénesis in
vivo en ratones jóvenes (Cheng et al., 2014).
La expresión de RBP4 está modulada por vitamina A. En el genoma humano, el promotor
de Rbp4 contiene un elemento de respuesta a ácido retinoico particular, funcional en células
de origen hepático (HepG2), consistente en dos sitios de unión a RAR degenerados
separados por un fragmento de 30 nucleótidos que incluye un sitio de unión a Sp1
(Panariello et al., 1996). Este elemento no está conservado en la rata, en donde sólo se
reconoce el sitio de unión a Sp1 (véase la alineación en hombre, ratón y rata en el Anexo
3A). La modulación de la expresión de RBP4 por vitamina A es diferente en hígado y tejido
adiposo: el tratamiento con ácido retinoico suprime la expresión de RBP4 en TAB de
ratones y en adipocitos en cultivo, mientras que no afecta o induce la expresión de RBP4
en hígado de ratones y células hepática en cultivo (Jessen and Satre, 2000; Mercader et al.,
2008; Mourey et al., 1994). Hay también evidencia de que la metilación del ADN juega un
papel en el control de la expresión del gen para RBP4: en mujeres con diabetes gestacional
se ha descrito hipometilación del gen RBP4 ligada a una mayor expresión de su ARNm en
la placenta (Rong et al., 2015). Esto estaría de acuerdo con una implicación de la RBP4 en
la resistencia a la insulina y específicamente la diabetes gestacional.
La suplementación con BC conllevó la hipometilación global y de varios sitios CpG del
tramo promotor de Rbp4 analizado, lo que no se acompañó de cambios destacables de los
niveles de ARNm. Por otro lado, nuestros resultados indican hipermetilación de otros
cuatro sitios CpG de dicho tramo en los animales suplementados con RE (los CpGs 2, 6,
15 y 18, distintos de los hipometilados en el grupo BC y situados entre -278 y -55) y una
tendencia a menores niveles de expresión del ARNm de Rbp4 en este grupo. Este último
resultado estaría en consonancia con literatura previa que indica que el ácido retinoico
suprime la expresión del ARNm de Rbp4 en el tejido adiposo y en adipocitos en cultivo
(Mercader et al., 2008). De los 4 sitios hipermetilados en el grupo RE, la metilación de tres
de ellos, los CpGs 2, 15 y 18, correlacionó positivamente con los niveles de retinol total en
TABi. Los CpGs 15 y 18 se encuentran próximos a sitios de unión para factores de
Resultados y Discusión
Capítulo 3
133
transcripción de las familias E2F y Kruppel-like, muy relacionadas con la adipogénesis
(Miard and Fajas, 2005; Wu and Wang, 2013). No se ha encontrado evidencia bibliográfica
de un papel de estos factores de transcripción en el control del gen Rbp4.
Los retinoides derivados de la vitamina A son activadores transcripcionales de la expresión
génica de UCP1 en adipocitos y estudios en animales indican que el estatus en vitamina A
condiciona la capacidad termogénica del tejido adiposo marrón y que el tratamiento con
ácido retinoico promueve la expresión de UCP1 en TABi (Bonet et al., 2012). Además, el
gen Ucp1 está controlado por metilación de sus elementos reguladores, particularmente la
región potenciadora (enhancer) distal. La expresión selectiva de Ucp1 en tejido adiposo
marrón se asocia a una menor metilación de CpGs de dicho enhancer en este tejido, en
comparación con otros (Shore et al., 2010). Adicionalmente, hay evidencia de que RIP140,
un correpresor de receptores nucleares que suprime la transcripción de numerosos genes
metabólicos oxidativos, dirige la metilación de la región potenciadora de Ucp1 en
adipocitos blancos (Kiskinis et al., 2007). Aunque no se pudo detectar expresión de Ucp1
en el TABi en ninguno de los grupos experimentales, nuestros resultados muestran una
desmetilación ligera pero significativa de tres sitios CpG específicos del enhancer de Ucp1,
los CpGs 10, 11 y 12, en el grupo tratado con BC respecto de los grupos control o RE. Los
sitios 10, 11 y 12 son próximos o solapantes a sitios de unión para factores de transcripción
CREB y PPAR importantes para la expresión de Ucp1 (Rim and Kozak, 2002).
4.3.4. Conclusiones
En conclusión, la suplementación temprana con vitamina A modula en el TABi el perfil de
metilación de regiones reguladoras de Pparg2, Zfp423, Pcna, Rbp4 y Ucp1 de manera
diferencial según sea aportada por vía oral como retinil palmitato o como -caroteno. Los
efectos observados podrían subyacer a diferencias en fenómenos de programación de las
características y respuestas del TAB en etapas posteriores de la vida.
Los resultados muestran efectos discordantes de la suplementación con RE durante la
lactancia sobre la expresión y la regulación epigenética en TABi de Zfp423 y Pparg2:
aumento de la expresión génica de Zfp423 acompañada de hipometilación de un CpG
específico su promotor y disminución de la expresión génica de Pparg2 acompañada de
hipermetilación de su promotor. Los cambios inducidos por la suplementación con RE
sobre la expresión y metilación de Rbp4, un marcador de adipocitos maduros, van en el
mismo sentido que para el Pparg2: disminución de la expresión e hipermetilación. Además
la expresión de Pcna se encuentra aumentada en el TABi en el grupo RE, en paralelo a la
hipometilación de su ADN promotor. En conjunto, vemos que un exceso moderado de
vitamina A como RE resulta en un TAB que mantiene células altamente comprometidas a
diferenciarse en adipocitos pero relativamente poco diferenciadas y que retienen más
capacidad proliferativa. Estas características propician una expansión mayor, pero tal vez
más “saludable” del TAB subcutáneo ante una dieta rica en grasa administrada tras el
destete (Granados et al., 2013), y a ellas contribuirían efectos sobre la metilación de ADN
en el promotor de estos cuatro genes.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
134
La suplementación con BC tiene efectos similares a los de la suplementación con RE sobre
la metilación y expresión de Zfp423, pero diferentes sobre la metilación del promotor de
Pcna, Rbp4 y (parcialmente) Pparg2, si bien los cambios de metilación de estos últimos no
se traducen en cambios a nivel de expresión.
Resultados y Discusión
Capítulo 3
135
Anexo 3A
Alineamiento de secuencias de rata, ratón y humano de la región promotora/enhancer de los
genes: Pparg2, Zfp423, Pcna, Rbp4 y Ucp1 (CLUSTALW v.1.83, DNA Data Bank of Japan:
http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html). Las secuencias se obtuvieron de las bases de datos
del EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/). Para todos los genes, la secuencia analizada de cada
gen se muestra en azul con los CpGs estudiados subrayados y en negrita. La secuencia del
transcrito inmaduro (con intrones) se muestra resaltada en gris claro y la secuencia codificante
en gris oscuro; hemos tomado como sitio de inicio de la transcripción (TSS) el primer
nucleótido del primer exón del transcrito inmaduro de acuerdo a las bases de datos del EMBL-
EBI y del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Para el gen Zfp423 la región promotora
estudiada (5’ corriente arriba del TSS descrito en rata) se corresponde con una región
intragénica en humanos y ratones (se resaltada en verde la secuencia del exón).
Gen Pparg2
Homo sapiens GTACAGTTCACGCCCCTCACAAGACACTGAACATGTGGGTCACCGGCGAGACAGTGTGGC
Mus musculus GTACAGTTCACGCCCCTCACAGAACAGTGAATGTGTGGGTCACTGGCGAGACAATGTAGC
Rattus novergicus GTACAGTTCACACCCCTCACA-AACACTGAATGTGTGGGTCACTGGCGAGACAGTGTAGC
*********** ********* *** **** ********** ********* *** **
Homo sapiens AATATTTTCCCTGTAATGTACCAAGTCTTGCCAAAGCAGTGAAC---ATTATGACACAAC
Mus musculus AACGTTTTCCTTGTAATGTACCAAGTCTTGCCAAAGCAGCAGACAGCATTATGACACACC
Rattus novergicus AACGTTTTCCTTGTAATGTACCAAGTCTTGCCAAAGAAGCAGACAGCATTATGACACACC
** ****** ************************* ** ** *********** *
Homo sapiens TTTTTGTCACAGCTGGCTCCTAAT-AGGACAGTGCCAGCCAATTCAAGCCCAGTCCTTTC
Mus musculus ATTTTGTCACAACTGGCTCTCAGTCAGGACAGTGCCAGCCAATTCAGGCCTGATTCTTTC
Rattus novergicus ATTTTGTCACAGCTGGCTCTCAATCAGGACAGTGCCAGCCAATTCAGGCCTGATCCTTTC
********** ******* * * ********************* *** * *****
Homo sapiens TGTGTTTATTCCCATCTCTCCCAAATATTTGGAAACTGATGTCTTGACTCATGGGTGTAT
Mus musculus TGTGTTTATTCCCACCTCTCCCAAATATTTGAAAACTGGTGTCTTGACTTATTAGCATAT
Rattus novergicus TGTGTTTATTCCCACCTCTCCCAAATATTTGAAAACTGGTGTCTTGACTCATTAGCATAT
************** **************** ****** ********** ** * ***
Homo sapiens TCACAAATTCTGTTACTTCAAGTCTTTTTCTTTTAACGGATTGATCTTTTGCTAGATAGA
Mus musculus TCATAAGCTCGATGACCATAAGCCTTTTTCCTTTAACCAACCAATCTTTTGCAAGACATA
Rattus novergicus TCATAAGCTCAATGACCACAAGCCTTTTTCCTTTAACCAACCGATCTTTTACAAGACACA
*** ** ** * ** *** ******* ****** * ******* * *** * *
Homo sapiens GACAAAATATCAGTGTGAATTACAGCAAACCCCTATTCCATGCTGTTATGGGTGAAACTC
Mus musculus GACAAAACACCAGTGTGAATTACAGCAAATCTCTGTTTTATGCTGTTATGGGTGAAACTC
Rattus novergicus GACAAAACATCAGTGGGAATTAAGGCAAATCTCTGTTTTATGCTGTTATGGGTGAAACTC
******* * ***** ****** ***** * ** ** *********************
Homo sapiens TGGGAGATTCTCCTATTGACCCAGAAAGCGATTCCTTCACTGATACACTGTCTGCAAACA
Mus musculus TGGGAGATTCTCCTGTTGACCCAGAGCATGGTGCCTTCGCTGATGCACTGCCTATGAGCA
Rattus novergicus TGGGAGATCCTCCTGTTGACCCAGAGCATGGTGCCTTCGCTGATGCACTGCCTATGAGCA
******** ***** ********** * * ***** ***** ***** ** * **
Gen Zfp423
Homo sapiens CAAACTCTTCGTGGCTCTCACTACCTGTAAGACCTCAGACACCCCTCTGAGAGTCCGTTG
Mus musculus C-----TTTGATAGGAGAAAATGCCTGCAAGA--TTAGGGACTGTTCTGAGT-TCTGC--
Rattus norvergicus C-----TTTGATAGCAGAAAATGCCTGCAAGA--TTAGGGGCTGTTCTGAGT-TTTGC--
* ** * * * * **** **** * ** * ****** * *
Homo sapiens AGGAAGACGAAACCCAGTGATGGCTGCAAAGCCCCAGCACAGTGCCTGGCTCAGTGTGCA
Mus musculus -------CTCATTTCTGTG--GGTGGCAGTTATTTTGCTCG-TGAGTGGAA-ACTATGTA
Rattus norvergicus -------CTCGTTTCTGTG--GGTGGCAGATGTTTTGCTCA-TGAGTGGAA-ACTATGTT
* * *** ** *** ** * ** *** * * **
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
136
Homo sapiens CCCAC----GTGGTGCC----AGCAAGAACATC-GACA-----GTGCAGAGAGAACTGG-
Mus musculus CTAATGGTTGTAGCACTGAATAGAAAAAGCTTCTGAT--GTCTGTATGGAGGCAGT-GCT
Rattus norvergicus CTAATGGTTGTAGTACTGAATAGAAAAAGCTTCTGATATGTCTGTCTGGAGACAGTTGCT
* * ** * * ** ** * * ** ** ** *** * *
Homo sapiens GTGGTTCAT-GGTGGCTTCAGCCTGCACATATGCAGAGCTAGAAAGGCCATTAAATCTGA
Mus musculus GGGATTGATTAGTGATGTCTGCCAGGT----TGCAGGGCTGTGGAAAC-AT--AGTGGAG
Rattus norvergicus GTGATTGATTAGTGATGTCTGTCAGAA----TGCAGGGCTGTGGAAAC-AT--AGTGGAG
* * ** ** *** ** * * * ***** *** * * ** * *
Homo sapiens AAAATACTGTGTATGCACATTTTTGGCTTAAACAAAGTTCCATTTACAAAGTCCATAACC
Mus musculus ACAGTACT-TACCCGC-CGTTCATG-TTTGA------TTCGTTTTATTA--TTTATAATC
Rattus norvergicus ACAGTACC-TACCTGC-CATTCATG-TTTGA------TTCTTTTTACTA--TTTATAATC
* * *** * ** * ** ** ** * *** **** * * **** *
Homo sapiens CAGCTTTA----------------------------------------------------
Mus musculus T--CT-------------------------------------------------------
Rattus norvergicus T--CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTCTCTCTCTGTGTGTG
**
Homo sapiens ---ATAT-TAT-TACATGCCCCAGACTGGGATTAATTCCAGGACAA----GAGTGTTG--
Mus musculus ---GTGTGTGTGTACATGTGTATGTGTAGGACAAA-----GAGTGACATTGGGAGTTGGT
Rattus norvergicus TGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTGTGTAGGATGAA-----GGACGACATTCAGTGATGGT
* * * * * ** * * *** ** * * * * **
Homo sapiens --TTATGCTGTGTAGTGTTTCTCCCATATTCTCCTAGTG--CATGGCCTCTACCAGCCTG
Mus musculus CCTTGCTATTTATCTTGTTTGAGACAGAATCTCTTGTTTGCCATTGTGTCCATCAGGCTA
Rattus norvergicus CCTTGCCCTTTATTTTGTTTGCAACGGTATTTCTTGTTTGCCATTGTATACACCAGGCTA
** * * * ***** * * ** * * *** * * * *** **
Homo sapiens GGCTTATGTCCTGGGGTGTGGGATGGTGGGGACACCCTATCTCTGCCCAGCTTGGTTC-T
Mus musculus ---------CCAGACCTATGAGCTGCTGGAAATTTCCCGTCTTCGCCT--CCACTCTCAT
Rattus norvergicus ---------CCAGACCTATGAAGTTCTGGAAATT-CCCATCTTCACCT--CCAAGTTCAT
** * * ** * *** * ** *** ** * ** *
Homo sapiens GTGGGGTCCTGGGTGGAAT----------GGGGGGGAGGCTGGTTGCCTTCTGA------
Mus musculus AAAAGCACTTGGATTAGA------------------------------------------
Rattus norvergicus AAAAGTGCCTGGATTAGATACATGCTATGGACAGAGATACATGCTATGGACAGAGATACA
* * *** * *
Homo sapiens TGTTGTCAGCTCATGAGT-TGCAGTGCTCAGA----CGTGCTGTCATTGGGAGA------
Mus musculus ------------------------------------------------------------
Rattus norvergicus TGCTATGGACAGAGATACATGCTATGGACAGAGATACATGCTATGGATGAGAGATACATG
Homo sapiens --GTTGACCTCAGCGTGTCCT--------GAGGTCTAT-CTGTGGGTCAGGTCT------
Mus musculus ------------------------------------------------------------
Rattus norvergicus CTATGGACAGAGATACATGCTATGGATCAGAGATATATGCTATGGGTTAGAGATACATGC
Homo sapiens -------------------CAGCAGGGTCATGAGCACTCACCACTTTGCTGATCTCTGAG
Mus musculus -------------------------------GA-TACACGCTA------TGGTGTC----
Rattus norvergicus TATGGGGTAGAGATACATGCTATGGGGTAGAGA-TACATGCTA------TGGTGTC----
** ** * * ** * **
Homo sapiens AGCAACCTTAT-TGGTTTCTTGAGGCAGTGCTGAGATTGATTAGTGATGTCTGCCAGGGG
Mus musculus --CAGCTTTGTGTGGGTTCTGGGGAC----TCGAACTCAGGTCCTCATGCTTGCA-----
Rattus norvergicus --CAGCTTCGTGTGGGTTCTGGAGGC----TCGAACTCAGCTCCTAA-GCTTGCA-----
** * * * *** **** * * * ** * * * * * ***
Homo sapiens CACAGGGCTGGGGAAACCATAACTGATCCAGCACTTAACTTGCTTGCTATTCCTGTTTTA
Mus musculus --------TGACAGTACTTTATC--------CACTGATCCTGGTC-CTGT----GCCTTA
Rattus norvergicus --------TGGTGGTAC-----C--------CACCGTACATGCTC-CTGT----GCTTTA
** ** * *** * ** * ** * * ***
Resultados y Discusión
Capítulo 3
137
Homo sapiens TTCCGATCATT-TTACATCTCTGTGAAACCAATAAAGGCCTCTTTG---TAGGCTTTGCC
Mus musculus TTCTGATCACCATTGCATCTCTGTGAGACCAACAAA------TTTG---TAGGTTTTGTG
Rattus norvergicus GTCTCATCCCTATTTGATCTGTGTGACACCAACAAAAGCTATCTTGGCATAGATTTTGTG
** *** ** **** ***** ***** *** *** *** ****
Homo sapiens CCCTCTCC----CCTGGTGATGGGTATTATAATAAGGACCCCCACAAATGTTCCTTCTTC
Mus musculus CCCCCCCCTTGCCCCCGTG---GATAGCATA-TAAATACTCCCACAGGGCTCCCATCTTC
Rattus norvergicus TCCCTTCC--ACCCCAATGTCAGATAGCATA-TAGATACCCCTGTAGGGTTCCCATGTTC
** ** ** ** * ** *** ** ** ** * * ** * ***
Homo sapiens CTCGCCCTGTGCCTT----ACC---TGATCTATTTGTACAGCCTTCAAACTCACAGGCCC
Mus musculus TCTGACCTGTGTCTT----ACCCCATGACCCGTGTATGCAGCTTCCAAACTCACAGCCCT
Rattus norvergicus TCTGACCTGTGTCCTACCTACCCCATGACCTGTGTGTTCAGCTTCCAAACTCACAGCCCT
* ****** * * *** *** * * * * **** * *********** **
Homo sapiens ATCTCTGTTCTCTCTTTCAGTTGAAGAGGGGGAGGCCTCAGACTTCTCGCTGGCCTGGGA
Mus musculus ---TCTTTCTTCTCTTCCAGTTGAAGAGGGGGAGGCCTCGGACTTCTCGCTGGCCTGGGA
Rattus norvergicus ---TCTTTCTTCTCTTTCAGTTGAAGAGGGGGAGGCCTCGGACTTCTCGCTGGCCTGGGA
*** * ****** ********************** ********************
Gen Pcna
Homo sapiens GCCCCGCCCTGCGCCCGCTTCCTCCAATGTATGCTCTAGGGGGCGGGCCTCGCGGGGAGC
Mus musculus GCCCCGCCTT-----------------TGCATACGCGGTGGGGCGGGCCTTGCTCAAACC
Rattus novergicus GCTCCGCCTC-----------------TGTATACGCGGCGGGGCGGGCCTTGCTCAAACC
** ***** ** ** * * *********** ** * *
Homo sapiens ATGGACACGATTGGCCCTAAAGTCTTCCCCGCAAGGCCGTGGGCTGGACAGCGTGGTGAC
Mus musculus ACGGGTACGATTGGTCCTTGAG--------GAGAGG---TGGGTGGATCAGCGCTGTGGC
Rattus novergicus ACGGATACGATTGGTTCTAGAG--------GAGAGG---TGGGTGGGTCAGCGCTGTGAC
* ** ******** ** ** * *** **** * ***** *** *
Homo sapiens GTCGCAACGCGGCGCAGGGTGAGAGCGCGCGCTTGCGGACGCGGCGGCATTAAACGGTTG
Mus musculus GTCATGACCTCGCGCAGGGAAAAGGCGCGCGCCTA-GGAAGCCGCGGCATTAGACGGTTG
Rattus novergicus GCCACAACCTCGCGCACTGAAAGAGCGCGCGCCTA-GGAAGCCGCGGCATTAGACGGTTG
* * ** ***** * * ******** * *** ** ********* *******
Homo sapiens CAGGCGTAGCAGAGTGGTCGTTGTCTTTCTAGGTCTCAGCCGGTCGTCGCGACGTTCGCC
Mus musculus CGGGCGCAGAGGGTTGGTAGTTGTCGCTGTAGGCCT-------TCGCTGCCGCTTCTGCA
Rattus novergicus CGGGCGCAGGTGACTGGTTATCGTCCCTCCTGGTCT-------TCAC-GCTACTTCTGCA
* **** ** * **** * *** * ** ** ** ** * * **
Homo sapiens CGCTCGCTCTGAGGCTCCTGAAGCCGAAACCAGCTAGACTTTCCTCCTTCCCGCCTGCCT
Mus musculus TCGTGAATCGGGGGACCTTG---------GCAGCCAGACCTCGTTCCTCTTAGAGTAGCT
Rattus novergicus TCGTGAGTCGGGGTACCTTG---------TCAGCAAGACCTCGCTCCCCTTACAGTAACT
* ** * * * ** **** **** * *** * **
Homo sapiens GTAGCGGCGTTGTTGCCACTCCGCCACCATGTTCGAGGCGCGCCTGGTCCAGGGCTCCAT
Mus musculus CTCATCTAGTCGCCACAACTCCGCCACCATGTTTGAGGCACGCCTGATCCAGGGCTCCAT
Rattus novergicus CTCATCTAGACGTCGCAACTCCGCCACCATGTTTGAGGCACGCCTGATCCAGGGCTCCAT
* * * * **************** ***** ****** *************
Gen Rbp4
Homo sapiens GTCCGCTCTCGCTCTGTGAGGCCACGGTCTTCCCGCCAGGTTGACTCGAGCCTCCTGCCA
Mus musculus GTCCCTTTTCGCTCAGTGAGGCCACCATCACCACACCATGGCCACGTAGGCCTCCAGCCA
Rattus novergicus GTCCCTTCTTGCTCAGTGAGGCCACCATCATCACACCATGGCCACGTAGGCCTCCAGCCA
**** * * **** ********** ** * * *** * ** ****** ****
Homo sapiens GAGCCACTGGCCCCGGAGGCCACCCTAGACCGCAGCTGGCG-----GCCGCTGG--CACG
Mus musculus GGGCAACAGGACCTGGAGGCCACCCAAGACTGCAGCTGGCT-----GCCGCTGGGTCCCC
Rattus novergicus GGGCAACAGGACCTGGAGGACACTCAAGACCGCAGCTGGCTGTGCTGTCGCTGGATTCCC
* ** ** ** ** ***** *** * **** ********* * ****** *
Homo sapiens AGTGCAGGGTAACTGAGCC--AGGGCC-------GCTGGCGCATTTGGCCTGGCCGAGGC
Mus musculus GGGCCAGCTC--TTGGCCCCGATGGATCCTCTGGGCTGGAGAGTTTGGCTCCACCGAGAC
Rattus novergicus GGCCCAGCTC--TTGGCCCCGATGGCTCGTCTGGGCTGGAGAGTTTGGCTCCACCAAGAC
* *** ** ** * ** ***** * ****** ** ** *
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
138
Homo sapiens CACCCCGCGCGGCCGCTCCACTGTGCCCGAGGCTGTCCTGGA--GGTGAGGCCGGCCCAC
Mus musculus CACCCTGAGCGGA-GCTC----GGAGCATAGGC-GACGTGGGACGGCAAGGCTGAC--GG
Rattus novergicus CACCCTGAGCGGA-GCTC----GTAGCCTAGGC-ATCATGGGGCGGCAAGGCTGAC--GG
***** * **** **** * * **** * *** ** **** * *
Homo sapiens AGGGACCCTGCCCGTGCCCGGGCTCCGGTGAGTCAGGGCGCGTTATGCAAGT--------
Mus musculus AGGGGCCCCGCGTGCGTTCAGG----AGTGAGTCAGGGAGCGTTATGCAAGCTCGGCCGC
Rattus novergicus AGGGGCCCCGCGTGCGTTCAGGC---GGTGAGTCAGGGAGGGTTATGCAAGCTCCGCCGC
**** *** ** * * * ** *********** * **********
Homo sapiens -------------GCCCCCGGCGCCTCCCCTTCGGTCTTTCACCCCGCGCGGTTACGAAA
Mus musculus CCCCCCCCCTCCCGCCCCCGGCACCTCCCCG-CGGTCTTTCACCCCGCGCGGTTACGAAA
Rattus novergicus CCCCCTCCCGCCCGCCCCCGGCACCTCCCCG-CGGTCTTTCACCCCGCGTGGTTACGAAA
********* ******* ***************** **********
Homo sapiens GCGCGACCCCCTCCCCCCGGCGCTATAAAGCAGCGGGGCGGCCGCGGCGCGCTCGCCTCC
Mus musculus GCGCGACCCCCTCCCCCCGGAGCTATAAAG--GACCGACGGCCGC-------TCGGCTCC
Rattus novergicus GCGCGACCCCCTCCCCCCGGAGCTATAAAG--GTCGGGAAGCCGC-------TCGCCTCC
******************** ********* * * ***** *** ****
Homo sapiens CTCGCTCCACGCGCGCCCGGACTCGGCGGCCAGGCTTGCGCGCGGTTCCCCTCCCGGTGG
Mus musculus GTCGCTCCACGCGCGCGCGAACGCGGCGGCCAGGCTTGCACGCGG-----CTCCTGCTGG
Rattus novergicus GTCGCTTCACGCGCGCGCGAACGCGGCGGCCAGGCTTGCACGCGG-----CTTCTGCTGG
***** ********* ** ** **************** ***** ** * * ***
Homo sapiens TGAGTCGCGGC-CGGGGCCTCGGGGCCGGCGGCGGGATGGGCCGGGGTGGGGTGGGGTGG
Mus musculus TGAGCCGCCGCGCGCTCCCCCGGGGAC--CTGCAGGG-----CGGGGTGGGGCGGGAGGG
Rattus novergicus TGAGCGGTCGCGCGCTCCCCCCGGGAC--CTGCGGGG-----CGGGGTGGGGTGGGAGGG
**** * ** ** ** * *** * * ** ** ********** *** **
Homo sapiens GGTGAGGTGGGATACGGCGGCGGGGGTCGGCTGCCGG----GCACTGACGGAGGCGCGTC
Mus musculus GGCGACG--------GGCGGCCTCGGTC--CT-CCGGCCCCGCGTTTACCC-TGCGCCTG
Rattus novergicus GGCGACG--------GGTGGC-TCGGTC--CT-CCGGATCCGCGCTCACCC-GGCGCCTG
** ** * ** *** **** ** **** ** * ** **** *
Homo sapiens TCCCGCAGGGCGGATTCCTGGGCAAGATGAAGTGGGTGTGGGCGCTCTTGCTGTTGGCGG
Mus musculus TCCCGCAGGGCAGACTCCGGGGTGAGATGGAGTGGGTGTGGGCGCTCGTGCTGCTGGCGG
Rattus novergicus TCCTGCAGGGCAGACTCCGGTGTGAAATGGAGTGGGTGTGGGCGCTCGTGCTGCTGGCGG
*** ******* ** *** * * * *** ***************** ***** ******
Gen Ucp1
Homo sapiens ATAACAGGGTATTTCCCAGTGGTGGCTAATGAGAGA--ATTATGGGAAAGTA--------
Mus musculus ACGCCCTGACACGTCCTCCTGGAGACAGATAAGAAGTTACGACGGGAGGAGCAGATGGAG
Rattus novergicus ACGCCCTGACCTTTCCTGCTGGAGACAGATAAGAGGTCATGCTGGGAGGGTT--------
* * * *** *** * * ** *** * ****
Homo sapiens -TAGAACACTATTCAAATGCAAAGCACTGTATG---ATTTTTATTTAATAGGAAGACATT
Mus musculus GCAAAGCGCTGTGATGCTTTTGTGGTTTGAGTGCACACATTTGTTCAGTG-------ATT
Rattus novergicus -CAGACCCCTGCT-CACAGCAGAGCACTGAAGGCACGAGTTCGTTCACTG-------ATC
* * * ** * ** * ** ** * * **
Homo sapiens TTGTGCAGCGATTTCTGATTGACCACAGTTTGATCAAGTGCATTTGTTAATG-TGTTCTA
Mus musculus CTGTGAA-------ATGAGTGAGCAAATGGTGACCGGGTGC-CCTGTAAATGGTGTTCTA
Rattus novergicus CTGTGAG-------CACACAGCGCACACAGCGAGCAGGTGC-CCCGTAAACGGTGTTCTA
**** * * ** * ** * **** ** ** * *******
Homo sapiens CATTTTCAAAAAGGAA--AGGAGAATTTGTTACATTCAGAACTTGCTGCCACTCCTTTGC
Mus musculus CATCTTAAGAGAAGAACACGGACACTAGG---TAAGTGAAGCTTGCTGTCACTCCTCTAC
Rattus novergicus CATCCTAAGAGAAGAACTAGGACACTGGGCGGCGAGTGAACCTTGCTGCCGCTCCTTTGC
*** * * * * *** *** * * * * ******* * ***** * *
Homo sapiens TACGTCATAAAGGGTCAGTTGCCCTTGCTCATACTGACCTATTCTTTACCTCTCTGCTTC
Mus musculus AGCGTCACAGAGGGTCAGTCACCCTTGACCACACTGAACTAGTCGTCACCTTTCCACTCT
Rattus novergicus GACGTCACAGTGGGTCAGTCACCCTTGATCACACTGCACCAGTCTTCACCTTTCCACGCT
***** * ******** ****** ** **** * * ** * **** ** *
Resultados y Discusión
Capítulo 3
139
Homo sapiens TTCTTTGTGCCAGAAGAGTAGAAATCTGACCCTTTGGGGATACCACCCTCTCCCCTACTG
Mus musculus TCCT----GCCAGAAGAGCAGAAATCAGACTCTCTGGGGATATCAGCCTCACCCCTACTG
Rattus novergicus TCCT----GCCAGA---GCATGAATCAGGCTCTCTGGGGATACCGGCCTCACCCCTACTG
* ** ****** * * **** * * ** ******** * **** *********
Homo sapiens CTCTCTCCAACCTGAGGCAAACTTTCTCCTACTTCCCAGAGCCTGTCAGAAGTGGTGAAG
Mus musculus CTCTCTCCATTATGAGGCAAACTTTCTTTCACTTCCCAGAGGCTCTGGGG-GCAGCAAGG
Ratus novergicus --------------AGGCAAACTTTCTCCCACTTCTCAGAGGCTCTGAGG-GCAGCAAGG
************* ***** ***** ** * * * * * *
Homo sapiens CCAGCCTGCTCCTTGGAATCCAGAACTACTTTCAGAATCTTGAACTTCTGTGACCTCTCA
Mus musculus TCAACCCTTTCCTCAGACTCTAGAACCACTCCCTG--CCTTGAGTT-----GACATCACG
Ratus novergicus TCAGCCCTTTCTTTGGAATCTAGAACCACTCCCTG--TCTTGAGCT-----GACATCACA
** ** ** * ** ** ***** *** * * ***** * *** ** *
Homo sapiens GGGTCCCC-TTGTGTGAAGTTTTTGACGTCAGCTTCTCCTGTGACCCTTAGAAGTCAC-T
Mus musculus GGGCCTCC-TTGAGCGAGAATTTCA-----------TTCTGCCAT------ATGCCACAT
Ratus novergicus GGGCCCCCCTTGAGTGAGGTTTTCA-----------TCTGGCCAC------ATGCCACGT
*** * ** *** * ** *** * * * * * *** *
Homo sapiens CTTGTGTCTAGCACATCCCAGGTGCTCAGTCACCATTGAACTAC-AGTCATACTATCT-C
Mus musculus TTTGGGCTCAGGAGTTCAGGAAAGCCT--TTGC---TGGGTAATAATTCTTTCTATTCAC
Ratus novergicus TCTGGGGTCAGCA-TTCATGAAAGCCT--TCGCCGCTAGGTGATGAGTCTTCCTGTTGGC
** * ** * ** ** * * * * * ** * ** * *
Homo sapiens CTGGCAAAGGCTCTTAACTGTCCATGTTAGCCTGATATTAATATCCTGGAAGCTTATACT
Mus musculus ATCACAGAAAT----GACTTGATGTGTGGAGCTGA-----GTAGCC--GAAG--------
Ratus novergicus ACCGCAGAGAC----GACACGGTGTGTTGAGCTGA-----GTGTCT--GAAG--------
** * ** *** **** * * ****
Homo sapiens GTCGTTCTTCCTTCCAGGTTTAAATAAGGCAGCCCCTTTATCCTGTCACAGGTCCTCTCT
Mus musculus ----------------GGTTCAG----GGTGGTC---------------GGGACCT----
Ratus novergicus ----------------AGTTCAG----GGTGGCT---------------GGAACCC----
*** * ** * * **
Homo sapiens CCCTACCTATCCTTACCTGTTTTGGATAACAACCTTTCTTATTTCTAATAGATTTATTTA
Mus musculus ----------------------TGGTGAGAAACA-------------ACAGA--------
Ratus novergicus ----------------------TGGTGAGGAACC-------------ACAGA--------
*** * *** * ***
Hom sapiens TTTCTCACATTTCCTTCCCTTATCATAGTTTTCCTCTCACTTTCTCCTCTAGTTTGTCAT
Mus musculus --------AGCTCCTAT-------CTGGTC--CCTCTCA-----------AGCATACCAT
Ratus novergicus --------GGTGCCTTC-------AAGGTG--CCTCTCA-----------AGCATGACAC
*** ** ******* ** * **
Homo sapiens ACTCTGGCTTTAAAACATGCAAACATGTGCCTTATGGGGAAAAAAAGACAATTTTAATTT
Mus musculus CCTC---------------------------------------AAGGGCA--TTTGA---
Ratus novergicus CCTC---------------------------------------AAGGACG--TTTGACTT
*** ** * * *** *
Homo sapiens ACCTTGCTTCTTCTTTACAAATGTATTGTGGCTTCTTCTTATAGTCCAAATCTAAAACTC
Mus musculus ---------TTTTTTTA------TGCCGTG------------------------------
Ratus novergicus -------TGTTTTTTTA------TGCAGTG------------------------------
** **** * ***
Homo sapiens TTTACCCACCCACTGCCTTGAACTCCTTCCTCGTTGTGAAAGTAGGATGGGGCAAAGAGA
Mus musculus ---GCCCA-----------GGGCTCC-------------GAGT-----------------
Ratus novergicus ---ACCCA-----------GGGCTCC-------------AAGT-----------------
**** * **** ***
Homo sapiens GAATGCATGCCCCTCCCAACTGCTCAAACAAGTAAAGGTGCTGTTACAGTTATCTTTTGC
Mus musculus --------GCCACTCCT-----CTTAGACCA-TA-----GCTGT----GGTTCCCAGGGC
Ratus novergicus --------GCCATTCCT-----CTTAGACCA-TA-----GCTGT----GTTTCCT-----
*** *** ** * ** * ** ***** * * *
Homo sapiens TACCTTAATACAATAATTATTTTATTATATCTCACAATTTTATGGATCAGGAAT----TT
Mus musculus T--CCGAGTGCCACTCCTCTTAGACCATAGCT-GTGGTTCCCAGGGCTCCGAGTGCCATT
Ratus novergicus -------------------------------T-ACGGTTT--------------------
* **
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
140
Homo sapiens AGACTGGGCTCAGCTAGGCGATTCTTCTGCTTTACTGACATCATAGGAGATCACTTGGTG
Mus musculus CCTCTAAGACCATAGCTTGGTTCCTCATGCTTTGTTCCTGTCTCCTT---TCA-------
Ratus novergicus -------------------GTTCCC--TGCCTCGTTC-------------TCA-------
* * * *** * * ***
Homo sapiens GTATTCAACTGTCAGGTAGGCTTATCTGGAGGGTCCA-AGATAGCTGTACTCTGGTGCCT
Mus musculus --ATCCGGCTGT-------GCTCATTC-------CCACAGAAAGTT-----------ACC
Ratus novergicus --ATCCCACTGT-------GCTCATTC-------CCACAGAAAGTT-----------CCT
** * **** *** ** *** *** ** * *
Homo sapiens GGTGCCTTGGTAAAGAGGGATGATGATGTGGGGCCTCTCCAGCATGAACAGC---CTCAG
Mus musculus AGTTCCTT--------------------------CACTACCCTACTAACCAC---CTCCG
Ratus novergicus ACTTCCTT--------------------------TCCCCCCACACCGACGACGACTTCCG
* **** * * * ** * ** *
Homo sapiens AGAAGTTTGCTTTCTTACATGCTGGCCCAGGGCTCCAAGAGCAAATGTTGCAGTGAGTAA
Mus musculus A------TACCT-------------CTCAG------------------------------
Ratus novergicus AG-----CACCT-------------CTCAG------------------------------
* * * * ***
Homo sapiens AGCAGAAGATACAAGGACTTTTATAATCTGGTCTCAGAAGCCACATGGCATCAGTTCTGT
Mus musculus -----------------CTTTGAT-------TCTCTGATG-CAAGTAGCATGACGCTT--
Ratus novergicus -----------------TTTCCAT-------TCTCTG----CATGTAGCATGACTTTC--
** ** **** * ** * **** *
Homo sapiens ATTATTCTATTGGTCAAAACATTCATAAGCCTGCCAGATGCAAGGGGAAGGCATATGTAC
Mus musculus -----CCTATGGG--------------ATCATGATGCAAGCAG-----------------
Ratus novergicus -----TCTATGGG--------------AGC------------------------------
**** ** * *
Homo sapiens CCTCATCTTTTGATGGGAGGAATGTGATGGATTTGCAATTATGTTTTAAAACTACTACAG
Mus musculus CATGATGTTTTAATGAAAACAT-------------CAATGCCATTTT----CTCCTA---
Ratus novergicus -------TTCTCAC-AAAGCAC-------------CAATGACGTTTT----CTCCTA---
** * * * * **** **** ** ***
Homo sapiens ACAGAACCACTGAGAAAGATTCATGGGTAGCTTTGGGGTGAGGACTGGGAATTAACCTGT
Mus musculus --ATAATC-CTAAAACGGA-----------------------------------------
Ratus novergicus --ACAATC-CTAAGACAGA-----------------------------------------
* ** * ** * * **
Homo sapiens TGATAGCAGAGGTTCACTAGAGTCAACAAGGAATAAGGTCTCCTCTTGTACACTTTAGTC
Mus musculus ---------AAGTT-------------------------------------------GCC
Ratus novergicus ---------AAGTT-------------------------------------------GTC
* *** * *
Homo sapiens ATACTATACCAACATTCTTAACCACTGCTTAGCCATCAGCCTCACAACATAACAACTCCA
Mus musculus ATCTTATA--AAGAGTAT------TTACTT-GCCAACTGCTTTGTGACA-ATCAA-----
Ratus novergicus GTCTTATG--AAGAGTCTAAAA-GCCACCT-GCCAACGGCTTTGGGACA-ATTGA-----
* *** ** * * * * * **** * ** * *** * *
Homo sapiens TCATAGTTGTACTCCCTAAGATCACCAACAATGTTAGAGTCAAATCCGGTAGGTTTTTCT
Mus musculus --GTGGAAACA-TTGCCAAGACTGC-GGCCATCTTC---TCAAGT---GTAGAGTCATTT
Ratus novergicus --GTGGCAACA-TCGCCAAGACCGC-GACCATCCTC---TCGAAT---GCAGAGTCATCT
* * * * * **** * * ** * ** * * * ** * * *
Homo sapiens TTGTTTTTGTCCTCCTGACATTTTTTCTAAACTTGACACTGGTCAGACCCAATCTTTCTT
Mus musculus T-------------CTAATAATCTCT---GACTCCATAGT------AACC---CTTTCTT
Ratus novergicus T-------------CTAATAATGTTT---GACTCCATAGT------ACCC---CTTTCTT
* ** * * * * * *** * * * * ** *******
Homo sapiens TAATCATATTCTTAAATACCAGTTCTATCACTGGATATGTTACTGTTTCTTGTTCTCACT
Mus musculus AAGCTGTATT-------ATCTG-------GTTAGATGTGTCA----TTCATGT-------
Ratus novergicus AAGCTGTGTT-------AGCTG-------GCGAGATGAGTCG----TTCGTGT-------
* * ** * * * *** ** *** ***
Homo sapiens CTACCTTTGACAAAGCCATTCTTTCCAGACTATAACTCTGGGTCTGGGTCCCCCTATGGT
Mus musculus -----------GAGCACA--GTTTACGATCTA-----CCAAGCCC---------TGCA--
Ratus novergicus -----------AAGACCA--CTTTACAGTCTG-----CCAAGCCCAAG-CCCCTTACA--
* ** *** * ** * * * *
Resultados y Discusión
Capítulo 3
141
Homo sapiens TTGGCCCTTGAATTCTTTTCCTAGTCCTATTTGACTAGCCCCATTTTCCCGTGAAAAGCA
Mus musculus -CAACATAT-AA--------------------GATGAACTCA-----CATGCAGAAAGGA
Ratus novergicus -CGGGGTAAGAA--------------------GATGAACCCA-----CACGCAGAAAGGG
** ** * * * * * ****
Homo sapiens TGCCCCTTTCATTGCATCCATATCATGACTAC-CAAATACCTCCTCTATTTCTTCCTCTT
Mus musculus TGCTC--------ACAGACTGCCGTTTATTATACTGTTGTTGCTGCTG-------CTGTT
Ratus novergicus TGCTC--------ACGGCC--------ATTACACAGTGG---CCGCTG-------CTGTT
*** * * * * ** * * ** ** **
Homo sapiens TTAGCATGTTAAATGCAGCTTCCTAAGCTCTCTATCTGGATATCAACAGTATTCTCTCCA
Mus musculus TGGG------------GGTTT------------------ATTCTAG--------CCTC--
Ratus novergicus CTGG------------AGTTT------------------ATTTGAGACAGGGTTCCTCTG
* * ** ** * ***
Homo sapiens AATAATTCTAAGACTTTAAAAATTGGTTTAATCTTCTTACCCCTAAAATCACCCCCCTTA
Mus musculus GGCAGCCCT--GGCTGT------------------------CCTAGAA--------CTCA
Ratus novergicus AGTAGCCCT--GGCTGT------------------------CCTAGAA--------CTCA
* ** * ** * **** ** ** *
Homo sapiens CCAACTGCCTCATGACAATCATTGGTACTGTCACTGAGCTTGCAACCCATGTTCTTAAAC
Mus musculus CT--CTG---------------TAG-------ACCAGGCTGGC--CTCAAACTCACAAAG
Ratus novergicus CT--CTG---------------TAG-------ACCAGGCTGGC--CTCA------CAAAG
* *** * * ** *** ** * ** ***
Homo sapiens ATAGA--GTAATCTTTGACTCCACATCTAATCATTCATAAAGCTGTATTGTCTATCAAAT
Mus musculus ACCCCTTGCTGCTTTGGCCTCTGCCTC--------CCTGGTGCTG-----------GGAT
Ratus novergicus ACCC------ACCT--GCCTCTGCCTC--------CTGAGTGCTG-----------GGAT
* * * *** * ** * **** **
Homo sapiens TAAATCTGACATTTATGTGAGAGCACTTCATAGTCTGTAAAGCACTACACAGGTGATAAC
Mus musculus TAAAGGTG-----TGTGT------------------------CACCAC-----------C
Ratus novergicus TATAGGTG-----TGTGT------------------------CACCAC-----------C
** * ** * *** *** ** *
Homo_sapiens ATGAAGCTACACTCATAATGGATTTGCAGGCTCTGCTTCTCATTTGGCTTCTACAGCCTC
Mus_musculus ACTAGGCTGCT----TA------TTACA-------CTTTTCAT-------CCATAGGTC-
Ratus_novergicus ACCTGGCTGTG----TA------TTACA-------CTGTTCAT-------CCATAGCT--
* *** ** ** ** ** **** * * **
Homo sapiens ATCCCTCACCAACTTCTTGCCCTACCTCTCTCTTTCTTCCCCATC----ACCCAATTTCC
Mus musculus ------TTGCAGCTTCCTGCCCC-TGCCCCTCTTTTCTCCCCGCCCCCCATTCAGTTTCC
Ratus novergicus ------TAGCAGCTTCCTGCCCC-TATCCCTCTTT-CTCCCCATC----ACTCAGTTTCC
** **** ***** * ****** ***** * * ** *****
Homo sapiens CAGTCAGTCAGGCCAACAGAATGCATTCTATATACGCGACTTGCTTTCCCCAACATCTTT
Mus musculus CAGCCC-CC-----------AGGCATTCT-------------GCTCCCCTCCATATCATT
Ratus novergicus CAGCCA-CTGGGCCAACAAAAGGCATTCT-------------GCTTGCCTC--------T
*** * * ******* *** ** * *
Homo sapiens GCCTGTATGCATGCCACTTATTTGCCTCAGTTGATCTTTATTTCAACAAGTGTTTGCAGA
Mus musculus GTCTTCACACACACCACT-GACTG---------CTCATCACTGC------TGTT------
Ratus novergicus GTCTTCACACATGTCACT-GCCCGTCTCTGTTACTCATCACTGC------GGTT------
* ** * ** **** * ** * * * * ***
Homo sapiens GGAGAAACCTCGCTGGCTCCTTCTCCTTTCTATTTTTTTTCAGAGGCTACCCGTCAGGTC
Mus musculus ------------CTGGCTC------------------------AAGTT-----CCAGGTG
Ratus novergicus ------------CTGGGTC------------------------AAGCT-----CCAGGTG
**** ** * * * *****
Homo sapiens AACAT---------------TGCCTTTTTCAGGGAAGCTCTGCAAGCCTGACCTCCCTTG
Mus musculus TGTAT---------------------------------TTTAT-----TG--------TG
Ratus novergicus TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG--------TG
* * * ** **
Homo sapiens GAAGTGCCTTAGGACTGGCTTCTTGCACAGTACACAACCTT---TACTTATAGAGGGT-T
Mus musculus GAAGC-TCCCAGGACTAGGTTCTTGCTTAGTGTGCACGCTTGCCCCTTTAAATGTGGTGT
Ratus novergicus TGTGT-TATTGCCTCAGGGTTCTTGCTTATTGTGCACACTT-TCCCTTTACATGTAGT--
* * * ******* * * ** *** *** * **
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
142
Homo sapiens TGGAGATTATTCTTTATTCATGTCTTATTTCTCCTGCTCCTGGAGGAGATGACTCTGACT
Mus musculus CCAGGGGTGTT--------GTCTCTTACATGCCCCAATCCAGG---AGATGAGTCCCACC
Ratus novergicus --AGGGGTGTT--------GTGTCTTACATGCTGTACTCCTG----AGAGGAGTCTGACT
* * ** * ***** * *** * *** ** ** **
Homo sapiens TCCACTGACTCTTTTGGGGGGCTTAAGTCAGGGTTGAGTACCAGAGGCCCTAAATAGCTG
Mus musculus T-CCTTCACTCTCCTGGG-------A-CCACG-CTGAGTAGCAGAA--CCTGGCCAACCA
Ratus novergicus TGCCTTCACTCTCCCGGG-------AACCATG-CTGCAGAGCAGAA--CCTAGACACTGA
* * * ***** *** * ** * ** * **** *** *
Homo sapiens GACGTGGATTCTGGTAATATCAAATCCATCTTTGGCTTAACTGAGAGGTTCTGAAAGCTG
Mus musculus GG-GAGGATACAGAGAACAGG-----CATCG-----------------------------
Ratus novergicus GG-GAGAATGTGGATAATGTG-----CCTCGCTGGTGTCTTTGGGGGATCCTG-------
* * * ** * ** * **
Homo sapiens GGACCTGACCTTGTCCATTTCCCTCTTTCTCCA--GTTTCCTATTATTTCCCACTGTTTT
Mus musculus -GCTCCAGCC------TGCTCTCTTTCTCACCA---TTTCTTA------CGTAGTATTTT
Ratus novergicus -GACCCAGCC------AGCTCTCTTTCTCATCACAGTTTCTTA------CCGAGTATTTT
* * ** ** ** * ** ** **** ** * * * ****
Homo sapiens TTTTAAAAGTTTTTTGTTTTCTTAAGTTTTCACAAGAATAAACATTGAAAATAAAATTTG
Mus musculus TTTT-AAAGCTTTT------------------CAAATACAAATCTT------------TG
Ratus novergicus TA---AAAGCTTTT------------------CAAATGTAAATCTT------------TG
* **** **** *** *** ** **
Homo sapiens CACAAAGATCGAACTAGGAAAGGC---CACACAACCAACACATA----------TTACAT
Mus musculus CTCAAAGATAGAAGTAAGAAACACCCCCCCCCCACACACACACACACCAACAAACCACCT
Ratus novergicus CTCAAAGACAGAAGGAAGAAAAACTTTCCCTTACCA-ATACAC-----------CCACCT
* ****** *** * **** * * * * * *** ** *
Homo sapiens CATTATAGGTAAGTTAGCAG-GGAGATTTCAGACCTGGGCTAGCTCTGGAACCACATTTT
Mus musculus TACAATGTCTGAACTGGCACTAGGGATAACAAGAGT---TCAAATCTGGGACTATATTTG
Ratus novergicus TGCAATGTCTGAACTGGCACTAGGGGTAACAGGATT---TCAA-TCTGGGACTATATTTG
** * * * *** * * * ** * * ***** ** * ****
Homo sapiens ACACTGTTGAAAATAAAAGCTGGAGTACAGATGACTTTCCCAGGTTCACAGAGTTGGTAA
Mus musculus ACACAATCACAAACCAAAGCTAGAG-------GACTTTCTCAGGGTCACGAAGCTGGTCA
Ratus novergicus GCACAGTCACAAACCAAAGCTGGAG-------GACTTTCTCGGGGTCACGAAGCTGGTCA
*** * *** ****** *** ******* * ** **** ** **** *
Homo sapiens GCTGGAG-AGCTGCACCTGGAGCCAAGCAACCTGCCCTGTCCTTTCCACTGCACCCTCTA
Mus musculus GATGGCTTGGTTGCATCTGCAGCCAACCAACC--CTCTGTCCTT-CCAGGGCTCCTGCTA
Ratus novergicus GATGGCTTAGTTGTGTCTGCAGCCAAGC------CTCTGCCCTT-CTAGGGCTCCTGCTA
* *** * ** *** ****** * * *** **** * * ** ** ***
Homo sapiens AGAAATCTAATTAGAAGGAACAGGTGGTATCTCATTTTGTACGGTGCTTTAGCAATGTAC
Mus musculus AGAACT---ATTCAAAGGAGCAAGGGCT--------------------------------
Ratus novergicus AGAGCT---ATCCAAAGAAGCAAAGGCTAGCCTTCCCTGCAGAGATCCACAA--------
*** * ** *** * ** * *
Homo sapiens TATTTGCTTTCTAG-TGTGTCTATTGTCTCGTTTGACATCTTCTCTCAAAAAGTGATGAA
Mus musculus ----GGCTTA-----TGAG--------CTTAGTTGATCTCGCCCAACTAAAAGTGACCAC
Ratus novergicus ----GGCTTGCTAGCTGAG--------CTCTATTGACATCTCCTTAATAAAAGTGACCAC
**** ** * ** **** ** * ******** *
Homo sapiens ACGAAACGCTCTTTTT----GACAAGTTCAGAGTGCTCTTGGTTCCTGTGTGGGATTCTT
Mus musculus ACGATGCACTCACTTTCTCGAAAAAGTTTAGGGCGTTATTAGTTTTTGCATGGATTCCCT
Ratus novergicus ACAAAGCACTCACTTTCTGGGGAAAGTTTAGAGCGTTATTAGTTTTTGCACGGATTTCCT
** * * *** *** ***** ** * * * ** *** ** ** * * *
Homo sapiens CC---------AAGTCT-------------------------GAATTTGGTAGTGGGAA-
Mus musculus CC---CCTCCCACATCCTCATCCCCACCCCATCCAGTCACCCAAATCTGAAGGTGACATT
Ratus novergicus CCCCCCCTCCCACACCCCCACCCGCGCCCCATCGG--------AATCTGAAGGTGACATT
** * * *** ** *** *
Homo sapiens -GAGAAGGAATCCGGAGGAAGGAGGATGAGAAGTTTAAAGGAGAGGAAAGGGAAGCAGAG
Mus musculus TGAAAAGGAATGTAAAGAAAGGGACATTCAGAATTGAAAGGAGAAGAATCAGTAG----C
Ratus novergicus TGGAAAGGAATGTAAAGAAAGGCTCGTTCAGAACTGAAAGGGGAAGAAAGGGTAG----G
* ******* ** **** * * * ***** ** *** * **
Resultados y Discusión
Capítulo 3
143
Homo sapiens AAGGCCGCAAGGTGCCTGCAAGATGTCTGGGGAGTTGGAGGAATGGAAGAGTGCCCCGCT
Mus musculus CAAGT----AGATGCATG--GGA-----AGGGGGCCCG-GGACTGGGA--------CGTT
Ratus novergicus CAGGC----AGATGCCAGCCAGG-----GAAGGGCCTG-GGACTGGGA--------CGTT
* * ** *** * * * * * *** *** * ** *
Homo sapiens CTTCCTTCTGGGAGAGCTCCAGCTAGGCAGAACCTTTCACCAAGG-CTCTGAT-------
Mus musculus CATCCTAC---AGCTATTCTAGCT--GTGGAACTTTTCAGCAAAATCTCGGAGGAGATCA
Ratus novergicus CATCCTAC---AAGAA----AGCT--GTGGAACTTTTCAGCAACATCTCAGAA---ATCA
* **** * **** * **** ***** *** *** **
Homo sapiens -ATCGTGCTGGTTTCCGAAAGCCCCAGCCGAAGGTGTGCAGCC-----------------
Mus musculus GATCGCGCTTATT--CAAGGGAACCAGCCCCTGCTCTGCGCCCTGGTCCAAGGCTGTT--
Ratus novergicus GATCGCACTTATT--CAAAGGAGCCAGGCCCTGCTCTGCGCCCTGGTG-GAGGCTCCTCA
**** ** ** * * * **** * * * *** **
Homo sapiens ---AAAGGGTGACAGAAGGTGAGGCACG-TGCGGGGGCGCGGGTGCTGACCGCCGCGGTG
Mus musculus ---GAAGAGTGACAAAAGGCAC--CACGCTGCGGGGACGCGGGTG--AAGCCCCTCTGTG
Ratus novergicus TGTGAAGAGTGACAAAAGGCAC--CATGTTGTGGATACG-GGGCG--AAGCCCCTCCGTG
*** ****** **** ** * ** ** ** *** * * * ** * ***
Homo sapiens CGCCCTCCCTCCGACGTGCGGTGTGCGGGGCGCAGACAACCAGCGGCCGGCCCAGGGCTT
Mus musculus TGTCCTCT-----GGGCATAAT---CAGG--------AACTGGTG-CCAAATCAGAGGTG
Ratus novergicus TGTCCTCC-----AGGCATCAT---CAGG--------AACTAGTG-CCAAAGCAGAGGTG
* **** * * * ** *** * * ** *** * *
Homo sapiens TCGGGGAGCGAAGCAGGGCTCCCGAGGCACCGAGCGAGAATGGGAATGGGAGGGACCCGG
Mus musculus ATGTG--GC----CAGGGCTTTGGGAGTGACGCGCGGC--------TGGGAGG---CTTG
Ratus novergicus CTG----GC----CAGGGCTTTGGGAGTGACGCGCGTC--------TGGGAGG---CTTG
* ** ******* * * ** *** ******* * *
Homo sapiens TGCTCCC-GGACACGCCCCCGGCAGGTCCCACGCCCGGGTCTTCTGAGACCTCGCGCGGC
Mus musculus CGCACCCAAGGCACGCCCCTGCCAAGTCCCACTAGCAGCTCTTTGGAGACCTGGGCCGGC
Ratus novergicus TGCGCCCAGGGCACGCCCCTGCCGATTCCCACTAGCAGGTCTTGGGGGACCTGGGCCGGC
** *** * ******** * * ****** * * **** * ***** * ****
Homo sapiens CCAGCC-----------------CGGGAGCGGCCCAGCTATATAAGTCCCAGCGGAAGAC
Mus musculus TCAGCCACTTCCCCCAGTCCCTCCTCCGGCAAG-GGGCTATATAGATCTCCC----AGGT
Ratus novergicus TCTGCC-------------CCTCCTCCAGCAATCGGGCTATAAAGCTCTTCC----AAGT
* *** * ** ****** * ** *
Homo sapiens CGGAACGCAGAGGGTCCTGCTGGCGCGAGGGTGGGTAGGAGGG--------------GAC
Mus musculus CAGGGCGCAGAAG----TGCCGG-GCAATC-TGGGCTTAACGGGTCCTCCCTGCCCGAGC
Ratus novergicus CAGGGCGCAGAAG----TGCCGG-GCGATC-CGGGCTTAAAG---------------AGC
* * ****** * *** ** ** * *** * * *
Homo sapiens GCGGGGACTCGGCCCCCAACACCGCGCTCCGTCTGCAGCCGCCGCCTCTGCACCGCCG—
Mus musculus AAGAGGAAGGGACGCTCACCTTTGAGCTGC-TCCACAGCG-CCGCCTCTGCACTGGCACT
Ratus novergicus GAGAGGAAGGGACGCTCACCTTTGAGCTCC-TCCACAAA---------------------
* *** * * * ** * * *** * ** **
Homo sapiens ---CTGCCC-GGCGGTCGGTTCAAAAAACAGAAATC--GGGTTTGCTGCCCGGCGGACAG
Mus musculus ACCTAGCCCAGGTGGCT-CTGCAGGAGTCCGAAGTCGCGGGTTTCGTGCCC-----GCA-
Ratus novergicus ---TAGCCCTGGTGGCTGCCACAGAAGTTCGAAGTTGAGAGTTCGGTACCC-----ACA-
**** ** ** ** * *** * * *** * *** **
Homo sapiens GCGTGAAGAGCAAGGGAAAGGAACTTCCTCCACCTTCGGGGCTGGAGCCCTTTTCCTCT-
Mus musculus ----------TCAGGCAACAGTGCCACTGTTGTCTTCAGGGCTG-AGTCCTTTTGTTCTT
Ratus novergicus ----------TCAGGCAACAGTGCCACTGTTGTCTTCAGGGCTG-ATTCCTTTTGGTCT-
*** ** * * * **** ****** * ****** ***
Homo sapiens --------GCATCTCCAGTCTCTGAGTGAAGATGGGGGGCCTGACAGCCTCGGACGTACA
Mus musculus GCACTCACGCCTCTCTGCCCTCCAAGCCAGGATGGTGAACCCGACAACTTCCGAAGTGCA
Ratus novergicus --------------CTGCCCTCCGAGCCAAGATGGTGAGTTCGACAACTTCCGAAGTGCA
* *** ** * ***** * **** * ** ** ** **
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
144
Anexo 3B C
orr
elac
iones
entr
e lo
s dif
eren
tes
par
ámet
ros
anal
izad
os.
Se
uti
lizó
el
coef
icie
nte
de
corr
elac
ión d
e S
pea
rman
. E
n l
as t
abla
s se
mues
tra
el c
oef
icie
nte
de
corr
elac
ión (
ρ).
La
corr
elac
ión
posi
tiva
signif
icat
iva
se m
ues
tra
resa
ltad
a en
am
aril
lo y
la
neg
ativ
a en
azu
l; l
as
corr
elac
iones
sig
nif
icat
ivas
más
fuer
tes
(ρ≥
0,5
00
) se
res
alta
n c
on u
n c
olo
r am
aril
lo o
azu
l m
ás o
scu
ro y
las
más
déb
iles
(ρ<
0,5
00)
con
un c
olo
r am
aril
lo o
azu
l m
ás c
laro
. ** i
ndic
a que
la c
orr
elac
ión e
s si
gnif
icat
iva
en e
l niv
el 0
,01 (
bil
ater
al)
y *
indic
a que
la c
orr
elac
ión
es s
ignif
icat
iva
en e
l niv
el 0
,05 (
bil
ater
al).
Tab
la 1
. C
orr
elac
ion
es e
ntr
e p
arám
etro
s m
orf
om
étri
cos,
par
ámet
ros
circ
ula
nte
s, n
ivel
es t
isula
res
de
reti
noid
es y
car
ote
noid
es y
lo
s niv
eles
de
AR
Nm
en t
ejid
o a
dip
oso
bla
nco
ingu
inal
(T
AB
i) d
e lo
s gen
es e
studia
dos.
TA
Bi
Peso
Gra
saP
eso
Glu
cosa
Reti
no
l to
tal
Reti
nil é
stere
sR
eti
no
lβ-C
aro
teno
Reti
no
lβ-C
aro
teno
corp
ora
l (g
)co
rpo
ral (g
/10
0 g
)T
AB
i (m
g)
(md/d
L)
(nm
ol/g
)(n
mo
l/g
)(n
mo
l/g
)(n
mo
l/g
)(μ
M)
(μM
)
0,1
41
-0,0
10
0,2
53
0,2
36
-0,2
30
-0,1
82
-0,2
17
0,1
26
0,0
90
0,1
41
-0,0
65
-0,1
47
-0,0
95
0,2
07
0,1
95
0,1
39
-0,0
38
0,1
78
-0,0
41
0,1
94
-0,2
37
0,0
69
0,0
63
0,0
99
0,0
92
0,1
77
0,0
85
0,0
01
-0,1
24
0,0
13
0,1
41
0,0
67
-0,0
25
0,1
21
-0,0
39
-0,0
73
-0,0
55
-0,1
08
0,2
91*
-0,1
34
--
--
--
--
--
0,2
95*
0,6
64**
-0,0
45
-0,1
06
-0,0
99
0,0
80
0,0
69
0,3
99**
0,1
13
0,5
71**
0,0
46
-0,0
41
0,0
85
0,1
59
0,0
27
0,3
11*
0,0
70
-0,0
49
-0,1
02
-0,0
81
0,0
34
0,1
99
0,3
38*
0,2
45
-0,0
41
-0,0
50
-0,1
35
-0,1
63
0,0
80
-0,1
35
0,8
56**
0,6
71**
-0,3
09*
-0,0
42
-0,3
29*
0,8
44**
-0,1
97
0,0
15
-0,2
18
-0,2
87
0,1
59
-0,3
23*
-0,1
17
,976**
-0,0
81
β-C
aro
teno
en h
íga
do
(nm
ol/g
)
Reti
no
l en s
uero
(µ
M)
β-C
aro
teno
en s
uero
(µ
M)
Peso
TA
Bi (m
g)
Glu
cosa
suero
(m
g/d
L)
Reti
no
l to
tal en T
AB
i (n
mo
l/g
)
Reti
nil é
stere
s en h
íga
do
(nm
ol/g
)
Reti
no
l en h
íga
do
(nm
ol/g
)
AR
Nm
Rbp4
(%
)
AR
Nm
Ucp
1 (
%)
Peso
Co
rpo
ral (g
)
Gra
sa c
orp
ora
l (g
/10
0g
)
AR
Nm
Zfp
42
3 (
%)
AR
Nm
Ppa
rg (
%)
AR
Nm
Pcn
a (
%)
Híg
ado
Suero
Resultados y Discusión
Capítulo 3
145
T
ab
la 2
. C
orr
elac
iones
entr
e el
% d
e m
etil
ació
n d
e lo
s si
tios
CpG
y d
el
pro
med
io e
n l
a re
gió
n e
stud
iad
a d
el g
en P
parg
y l
os
niv
eles
de
AR
Nm
en
teji
do ad
iposo
bla
nco
in
gu
inal
(T
AB
i),
los
par
ámet
ros
morf
om
étri
cos
y
circ
ula
nte
s,
y
los
niv
eles
ti
sula
res
de
reti
noid
es
y
caro
tenoid
es
(A).
Corr
elac
iones
entr
e el
% d
e m
etil
ació
n d
e lo
s si
tios
CpG
indiv
idual
es y
el
%
de
met
ilac
ión p
rom
edio
en
la
regió
n e
stu
dia
da
del
gen
Pparg
(B
).
A.
CpG
1 (
-22
3)
CpG
2 (
-20
7)
CpG
3 (
+1
2)
CpG
4 (
+1
28)
pro
medio
-0,3
40
*-0
,248
-0,3
71
**
-0,2
49
-0,3
97
**
-0,0
54
0,0
19
-0,0
51
-0,1
27
-0,0
81
0,0
93
0,0
00
0,0
25
-0,1
77
-0,0
52
0,1
41
0,0
47
-0,0
28
-0,1
57
-0,0
22
-0,1
78
-0,0
50
0,0
10
-0,0
18
-0,1
71
0,2
52
0,1
32
-0,1
13
0,2
24
0,3
23*
0,2
46
0,1
17
-0,1
89
0,2
61
0,3
23*
0,1
98
-0,0
22
-0,2
29
0,0
61
0,1
30
-0,0
08
0,2
55
0,1
57
0,4
31**
0,2
33
-0,0
61
-0,0
56
-0,1
89
-0,1
66
-0,1
82
-0,0
12
0,2
59
0,1
66
0,4
59**
0,2
41
B.
CpG
1 (
-22
3)
CpG
2 (
-20
7)
CpG
3 (
+1
2)
CpG
4 (
+1
28)
pro
medio
CpG
1 (
-22
3)
0,5
30**
0,1
48
0,2
55
0,7
66**
CpG
2 (
-20
7)
0,0
86
0,1
71
0,7
76**
0,3
05*
0,1
99
0,4
75**
Meti
laci
ón (
%)
Reti
no
l en s
uero
(µ
M)
β-C
aro
teno
en s
uero
(µ
M)
Pp
arg
2
Pp
arg
2
Meti
laci
ón (
%)
CpG
3 (
+1
2)
CpG
4 (
+1
28)
AR
Nm
Ppa
rg2
(%
)
Peso
Co
rpo
ral (g
)
Gra
sa c
orp
ora
l (g
/10
0g
)
Peso
TA
Bi (m
g)
Glu
cosa
suero
(m
g/d
L)
Reti
no
l to
tal en T
AB
i (n
mo
l/g
)
Reti
nil é
stere
s en h
íga
do
(nm
ol/g
)
Reti
no
l en h
íga
do
(nm
ol/g
)
β-C
aro
teno
en h
íga
do
(nm
ol/g
)
Tab
la 3
. C
orr
elac
ion
es e
ntr
e el
% d
e m
etil
ació
n d
e lo
s si
tio
s C
pG
y d
el
pro
med
io e
n l
a re
gió
n e
stu
dia
da
del
gen
Zfp
42
3 y
lo
s n
ivel
es d
e A
RN
m e
n
teji
do a
dip
oso
bla
nco
in
guin
al (
TA
Bi)
, lo
s p
arám
etro
s m
orf
om
étri
cos
y
circ
ula
nte
s,
y
los
niv
eles
ti
sula
res
de
reti
no
ides
y
caro
ten
oid
es
(A).
Corr
elac
iones
entr
e el
% d
e m
etil
ació
n d
e lo
s si
tios
Cp
G i
nd
ivid
ual
es y
el
% d
e m
etil
ació
n p
rom
edio
en
la
regió
n e
stu
dia
da
del
gen
Zfp
42
3 (
B).
A
.
CpG
1 (
-76
9)
CpG
2 (
-46
4)
CpG
3 (
-42
3)
pro
medio
-0,0
44
-0,0
56
0,0
08
0,1
74
-0,0
44
0,1
61
-0,1
54
0,0
20
0,0
45
0,1
71
0,0
12
0,0
21
-0,2
35
0,2
60
-0,1
89
-0,0
67
0,0
49
-0,1
12
0,2
33
0,1
55
0,1
18
0,0
89
-0,1
78
-0,0
80
0,0
62
0,0
67
-0,2
22
-0,1
14
0,0
82
0,1
38
-0,2
03
-0,0
80
-0,5
20
**
-0,3
01
*-0
,389
**
-0,3
93
**
0,1
48
0,0
53
-0,0
36
0,1
77
-0,4
58
**
-0,2
25
-0,3
55
**
-0,3
77
**
B.
CpG
1 (
-76
9)
CpG
2 (
-46
4)
CpG
3 (
-42
3)
pro
medio
CpG
1 (
-76
9)
0,2
68*
0,4
10**
0,5
19**
CpG
2 (
-46
4)
0,2
22
0,5
65**
CpG
3 (
-42
3)
0,6
99**
β-C
aro
teno
en s
uero
(µ
M)
Zfp
42
3
Meti
laci
ón (
%)
Glu
cosa
suero
(m
g/d
L)
Reti
no
l to
tal en T
AB
i (n
mo
l/g
)
Reti
nil é
stere
s en h
íga
do
(nm
ol/g
)
Reti
no
l en h
íga
do
(nm
ol/g
)
β-C
aro
teno
en h
íga
do
(nm
ol/g
)
Reti
no
l en s
uero
(µ
M)
Peso
TA
Bi (m
g)
Zfp
42
3
Meti
laci
ón (
%)
AR
Nm
Zfp
42
3 (
%)
Peso
Co
rpo
ral (g
)
Gra
sa c
orp
ora
l (g
/10
0g
)
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
146
A.
CpG
1 (
-137)
CpG
2 (
-129)
CpG
3 (
-118)
CpG
4 (
-116)
CpG
5 (
-103)
CpG
6 (
-101)
CpG
7 (
-99)
CpG
8 (
-87)
CpG
9 (
-85)
CpG
10 (
-75)
CpG
11 (
-69)
CpG
12 (
-65)
CpG
13 (
-48)
CpG
14 (
-30)
CpG
15 (
-16)
CpG
16 (
-9)
CpG
17 (
+14)
pro
medio
-0,0
18
0,1
28
0,0
84
0,1
14
0,1
37
0,0
59
-0,0
54
-0,0
33
0,1
92
0,0
92
0,0
33
0,0
58
-0,1
52
-0,0
86
0,1
27
0,0
87
-0,0
52
-0,0
73
0,0
32
0,0
85
0,1
21
0,0
13
0,0
75
0,2
26
0,0
73
0,1
59
0,1
63
0,2
17
-0,0
12
-0,1
91
0,3
59**
-0,1
88
0,0
46
-0,1
91
-0,0
83
0,0
85
-0,1
04
-0,0
11
0,0
45
-0,0
07
0,0
57
0,0
29
-0,1
12
0,0
15
0,0
10
-0,0
10
-0,2
13
-0,2
39
0,0
19
-0,2
42
-0,0
39
-0,1
57
-0,1
69
0,0
39
0,0
72
0,0
78
0,1
11
0,0
46
0,1
34
0,1
65
0,2
10
0,2
54
0,1
68
0,1
87
-0,1
39
-0,1
23
0,2
51
-0,0
99
0,1
61
-0,0
77
-0,0
51
0,2
13
-0,1
87
-0,1
28
0,1
37
-0,0
04
0,0
43
0,0
08
-0,1
98
-0,1
66
-0,1
32
-0,2
09
-0,2
90*
-0,2
31
-0,0
65
-0,2
37
-0,0
36
-0,1
87
-0,2
54
-0,0
39
-0,2
68*
-0,2
0-0
,445**
-0,1
49
-0,3
19*
-0,3
11*
-0,2
80*
-0,3
26*
-0,3
18*
-0,1
40
-0,3
23*
-0,3
12*
-0,1
94
-0,3
30*
-0,4
44**
-0,1
54
-0,1
62
-0,3
93**
-0,3
37*
-0,1
9-0
,330*
-0,1
05
-0,1
46
-0,2
15
-0,2
37
-0,2
86*
-0,1
33
-0,1
41
-0,1
87
-0,2
74*
-0,2
51
-0,3
28*
-0,3
85**
-0,1
93
-0,1
78
-0,3
54**
-0,3
02*
-0,1
8-0
,249
-0,1
08
-0,1
26
-0,1
96
-0,1
20
-0,2
16
-0,0
79
-0,1
17
-0,2
04
-0,1
88
-0,2
60
-0,2
86*
-0,3
19*
-0,2
07
-0,1
97
-0,2
73*
0,5
39**
0,3
76**
0,2
84*
0,1
52
0,3
34*
0,3
32*
0,3
43**
0,4
49**
0,3
59**
0,4
62**
0,2
84*
0,3
25*
0,3
67**
0,4
01**
0,3
26*
0,3
72**
0,3
61**
0,4
49**
-0,1
53
-0,2
10
-0,1
11
-0,1
68
-0,0
56
-0,0
53
-0,1
26
-0,1
40
-0,1
35
-0,1
58
-0,2
53
-0,3
00*
0,0
20
-0,2
37
-0,0
79
-0,2
59
-0,1
39
-0,2
13
0,5
09**
0,3
71**
0,2
66*
0,1
11
0,3
15*
0,3
05*
0,3
01*
0,4
23**
0,3
39*
0,4
25**
0,2
58
0,3
06*
0,3
40*
0,3
81**
0,3
22*
0,3
74**
0,3
59**
0,4
25**
B.
CpG
1 (
-137)
CpG
2 (
-129)
CpG
3 (
-118)
CpG
4 (
-116)
CpG
5 (
-103)
CpG
6 (
-101)
CpG
7 (
-99)
CpG
8 (
-87)
CpG
9 (
-85)
CpG
10 (
-75)
CpG
11 (
-69)
CpG
12 (
-65)
CpG
13 (
-48)
CpG
14 (
-30)
CpG
15 (
-16)
CpG
16 (
-9)
CpG
17 (
+14)
pro
medio
CpG
1 (
-137)
0,5
70**
0,2
40
0,2
27
0,1
98
0,2
54
0,3
48**
0,5
13**
0,2
31
0,5
98**
0,2
58
0,4
71**
0,3
87**
0,5
52**
0,4
03**
0,6
11**
0,4
95**
0,5
62**
CpG
2 (
-129)
0,4
30**
0,3
85**
0,4
08**
0,4
72**
0,3
78**
0,5
03**
0,4
17**
0,4
90**
0,2
50,3
00*
0,3
01*
0,1
75
0,4
64**
0,5
14**
0,4
80**
0,3
14*
CpG
3 (
-118)
0,7
25**
0,7
47**
0,8
18**
0,5
46**
0,6
03**
0,7
41**
0,3
45**
0,4
74**
0,1
93
0,1
88
0,3
09*
0,6
28**
0,3
43**
0,4
26**
0,5
69**
CpG
4 (
-116)
0,7
02**
0,6
94**
0,4
07**
0,5
03**
0,5
97**
0,3
30*
0,3
14*
0,1
15
0,0
24
0,2
19
0,5
09**
0,3
78**
0,5
03**
0,3
96**
CpG
5 (
-103)
0,8
69**
0,5
92**
0,5
35**
0,6
82**
0,3
94**
0,5
08**
0,1
99
0,1
28
0,2
52
0,5
62**
0,2
75*
0,4
51**
0,3
94**
CpG
6 (
-101)
0,6
30**
0,6
07**
0,7
24**
0,4
66**
0,5
19**
0,1
37
0,2
27
0,2
54
0,4
92**
0,3
10*
0,4
03**
0,4
18**
CpG
7 (
-99)
0,6
41**
0,6
19**
0,5
66**
0,5
40**
0,3
21*
0,3
99**
0,3
38*
0,5
21**
0,4
11**
0,5
11**
0,5
40**
CpG
8 (
-87)
0,5
80**
0,6
46**
0,3
97**
0,3
57**
0,2
49
0,3
52**
0,5
68**
0,5
36**
0,5
48**
0,5
81**
CpG
9 (
-85)
0,4
36**
0,6
08**
0,3
26*
0,1
95
0,2
49
0,5
98**
0,3
70**
0,4
48**
0,4
28**
CpG
10 (
-75)
0,3
91**
0,3
73**
0,5
46**
0,3
35*
0,3
67**
0,5
29**
0,4
93**
0,5
70**
CpG
11 (
-69)
0,5
30**
0,3
19*
0,4
89**
0,4
67**
0,3
06*
0,3
55**
0,4
31**
CpG
12 (
-65)
0,3
08*
0,7
35**
0,3
72**
0,5
85**
0,4
59**
0,4
86**
CpG
13 (
-48)
0,2
73*
0,2
97*
0,2
58
0,2
36
0,5
01**
CpG
14 (
-30)
0,3
40*
0,5
24**
0,4
22**
0,5
74**
CpG
15 (
-16)
0,5
06**
0,5
23**
0,5
12**
CpG
16 (
-9)
0,7
05**
0,4
94**
CpG
17 (
+14)
0,4
41**
AR
Nm
Pcn
a (
%)
Pcn
a
Meti
laci
ón (
%)
Glu
cosa
suero
(m
g/d
L)
Reti
nol to
tal en T
AB
i (n
mol/g)
Reti
nil é
stere
s en h
ígado (
nm
ol/g)
Peso
Corp
ora
l (g
)
Gra
sa c
orp
ora
l (g
/100g)
Peso
TA
Bi (m
g)
β-C
aro
teno e
n s
uero
(µ
M)
Pcn
a
Meti
laci
ón (
%)
Reti
nol en h
ígado (
nm
ol/g)
β-C
aro
teno e
n h
ígado (
nm
ol/g)
Reti
nol en s
uero
(µ
M)
Tab
la 4
. C
orr
elac
iones
en
tre
el %
de
met
ilac
ión d
e lo
s si
tios
CpG
y d
el p
rom
edio
en l
a re
gió
n e
studia
da
del
gen
Pcn
a y
los
niv
eles
de
AR
Nm
en
tej
ido
ad
ipo
so
bla
nco
inguin
al (
TA
Bi)
, lo
s p
arám
etro
s m
orf
om
étri
cos
y c
ircu
lante
s, y
los
niv
eles
tis
ula
res
de
reti
noid
es y
car
ote
noid
es (
A).
Corr
elac
ion
es e
ntr
e el
% d
e
met
ilac
ión d
e lo
s si
tio
s C
pG
in
div
idual
es y
el
% d
e m
etil
ació
n p
rom
edio
en l
a re
gió
n e
studia
da
del
gen
Pcn
a (
B).
Tab
la 5
. (P
ágin
a s
igu
ien
te)
Co
rrel
acio
nes
entr
e el
% d
e m
etil
ació
n d
e lo
s si
tios
CpG
y d
el p
rom
edio
en
la
regió
n e
stu
dia
da
del
gen
Rb
p4 y
lo
s n
ivel
es d
e A
RN
m
en t
ejid
o a
dip
oso
bla
nco
ingu
inal
(T
AB
i),
los
par
ámet
ros
morf
om
étri
cos
y c
ircu
lante
s, y
los
niv
eles
tis
ula
res
de
reti
noid
es
y c
arote
noid
es (
A).
Co
rrel
acio
nes
entr
e el
% d
e m
etil
ació
n d
e lo
s si
tios
Cp
G i
ndiv
idual
es y
el
% d
e m
etil
ació
n p
rom
edio
en l
a re
gió
n e
stu
dia
da
del
gen
Rb
p4
(B
).
▼
Resultados y Discusión
Capítulo 3
147
A
.
CpG
1 (
-296)
CpG
2 (
-278)
CpG
3 (
-267)
CpG
4 (
-249)
CpG
5 (
-199)
CpG
6 (
-192)
CpG
7 (
-171)
CpG
8 (
-159)
CpG
9 (
-148)
CpG
13 (
-105)
CpG
14 (
-102)
CpG
15 (
-91)
CpG
16 (
-87)
CpG
17 (
-81)
CpG
18 (
-70)
CpG
19 (
-68)
CpG
20 (
-55)
pro
medio
-0,1
60
0,1
69
0,0
13
-0,0
55
0,0
69
-0,0
45
-0,0
01
0,0
49
0,0
15
0,0
83
0,0
65
0,0
79
0,0
63
-0,0
82
0,1
02
-0,0
47
0,1
14
0,0
30
0,0
53
0,2
39
0,1
44
0,2
16
0,2
35
0,1
22
0,2
09
0,2
41
0,2
28
-0,0
40
0,2
32
0,0
09
-0,0
35
0,1
71
0,0
74
-0,1
78
0,0
65
0,2
76*
0,0
74
0,1
23
0,2
18
0,1
05
0,1
90
0,1
77
0,1
03
0,2
11
0,1
25
-0,0
30
-0,2
12
0,0
43
0,0
72
0,1
82
0,0
50
0,3
50*
0,2
89
0,2
73*
0,0
39
0,0
22
0,1
40
0,1
96
0,2
15
0,1
20
0,1
61
0,1
62
0,1
63
-0,1
59
-0,1
78
-0,1
44
0,0
18
0,1
81
0,0
76
0,0
21
0,0
49
0,1
19
-0,1
73
-0,0
34
-0,1
17
-0,1
99
-0,0
19
-0,0
59
-0,1
60
-0,1
43
-0,1
60
0,3
42*
0,1
79
0,1
54
0,1
59
0,3
45*
0,2
36
0,1
86
0,2
63
0,0
37
0,1
76
0,4
27**
0,0
38
0,0
83
0,2
37
0,2
57
0,1
55
0,0
64
0,0
63
-0,0
21
-0,2
31
0,3
34*
0,0
13
0,0
80
0,4
97**
-0,0
70
0,2
64
0,3
06*
0,1
47
0,4
00**
0,0
84
0,1
14
0,2
78*
0,2
99*
0,1
72
0,1
32
0,1
21
0,0
04
-0,2
64
0,2
54
0,0
43
0,1
47
0,4
15**
-0,0
04
0,2
15
0,2
26
0,1
48
0,3
71**
0,1
25
0,1
25
0,2
19
0,2
69*
0,1
63
0,1
51
0,1
56
0,0
15
-0,1
66
0,2
15
0,0
73
0,1
61
0,4
15**
0,0
55
0,0
98
0,3
14*
-0,2
67*
-0,2
03
-0,2
69*
-0,3
31*
-0,3
24*
-0,2
63*
-0,2
70*
-0,2
39
-0,3
42**
0,0
75
0,1
46
-0,2
90
-0,1
89
0,2
02
-0,1
42
-0,0
14
0,0
19
-0,4
28**
-0,0
42
0,1
69
0,1
22
0,0
64
0,1
81
0,0
92
0,0
76
0,0
46
0,0
99
0,2
45
0,1
07
-0,0
66
0,0
00
0,0
49
-0,0
20
0,0
27
0,1
90
0,1
93
-0,2
96*
-0,1
45
-0,2
18
-0,2
76*
-0,2
67*
-0,2
58
-0,2
13
-0,1
85
-0,2
52
0,1
10
0,1
76
-0,2
59
-0,1
72
0,2
15
-0,1
48
-0,0
11
0,0
61
-0,4
21**
B.
CpG
1 (
-296)
CpG
2 (
-278)
CpG
3 (
-267)
CpG
4 (
-249)
CpG
5 (
-199)
CpG
6 (
-192)
CpG
7 (
-171)
CpG
8 (
-159)
CpG
9 (
-148)
CpG
13 (
-105)
CpG
14 (
-102)
CpG
15 (
-91)
CpG
16 (
-87)
CpG
17 (
-81)
CpG
18 (
-70)
CpG
19 (
-68)
CpG
20 (
-55)
pro
medio
CpG
1 (
-296)
0,3
50**
0,6
87**
0,7
01**
0,5
20**
0,5
59**
0,6
59**
0,6
20**
0,6
70**
-0,3
33*
-0,2
93
-0,1
40
-0,0
31
-0,0
66
0,0
58
0,1
20
-0,1
56
0,4
03**
CpG
2 (
-278)
0,5
63**
0,5
29**
0,5
59**
0,4
96**
0,5
14**
0,5
33**
0,5
29**
-0,0
27
0,2
14
0,2
33
-0,0
56
0,2
45
0,3
15*
0,0
21
0,1
66
0,5
36**
CpG
3 (
-267)
0,8
02**
0,7
10**
0,7
25**
0,8
69**
0,8
44**
0,8
36**
-0,1
82
-0,0
51
0,0
05
0,0
11
0,0
45
0,0
73
0,2
20
-0,1
02
0,5
16**
CpG
4 (
-249)
0,7
98**
0,6
23**
0,8
63**
0,8
41**
0,9
53**
-0,2
18
0,0
14
0,0
35
0,0
39
-0,0
55
0,1
25
0,0
68
-0,1
14
0,4
84**
CpG
5 (
-199)
0,5
13**
0,7
80**
0,8
12**
0,8
09**
-0,1
11
0,1
04
0,1
15
0,0
26
-0,0
35
0,1
24
0,0
44
0,0
40
0,5
28**
CpG
6 (
-192)
0,6
43**
0,6
37**
0,6
30**
-0,1
42
-0,1
89
0,2
19
0,1
08
0,2
23
0,2
43
-0,0
09
0,1
09
0,4
47**
CpG
7 (
-171)
0,9
23**
0,8
70**
-0,2
81
0,0
55
0,0
00
0,0
48
-0,0
61
0,0
76
0,2
12
-0,1
07
0,4
05**
CpG
8 (
-159)
0,8
35**
-0,1
64
0,1
56
0,1
49
0,0
27
0,0
43
0,1
16
0,1
41
-0,0
04
0,4
10**
CpG
9 (
-148)
-0,1
87
0,0
28
0,0
66
0,1
00
-0,0
15
0,1
46
0,1
02
-0,0
75
0,5
00**
CpG
13 (
-105)
0,1
67
0,1
55
-0,0
57
0,0
66
0,2
51
0,1
74
,460**
0,0
61
CpG
14 (
-102)
0,0
64
-0,1
06
0,1
85
-0,2
09
-0,1
20
0,0
85
0,0
26
CpG
15 (
-91)
0,4
83**
0,4
23**
0,4
68**
0,0
16
,437**
0,3
90*
CpG
16 (
-87)
0,3
60*
0,2
99
0,1
02
0,2
42
0,2
52
CpG
17 (
-81)
0,2
95
-0,1
12
0,2
10
0,1
25
CpG
18 (
-70)
0,1
04
0,1
62
0,4
33**
CpG
19 (
-68)
0,2
57
0,1
37
CpG
20 (
-55)
0,2
91
CpG
21 (
-53)
0,1
55
CpG
22 (
-45)
0,1
37
CpG
23 (
-39)
-0,0
57
CpG
24 (
-37)
0,0
04
CpG
25 (
-23)
0,0
17
CpG
26 (
-8)
0,3
00
CpG
27 (
+1)
0,1
91
CpG
28 (
+4)
0,3
43*
CpG
29 (
+10)
0,2
54
CpG
30 (
+13)
0,3
07*
CpG
31 (
+20)
0,2
01
CpG
32 (
+22)
0,3
71**
CpG
33 (
+24)
0,5
15**
CpG
34 (
+26)
0,2
27
CpG
35 (
+28)
0,1
52
CpG
36 (
+32)
0,1
62
CpG
37 (
+34)
0,2
59
Rb
p4
Meti
laci
ón (
%)
Rb
p4
Meti
laci
ón (
%)
β-C
aro
teno e
n s
uero
(µ
M)
Reti
nol en s
uero
(µ
M)
AR
Nm
Rbp4 (
%)
Peso
Corp
ora
l (g
)
Gra
sa c
orp
ora
l (g
/100g)
Peso
TA
Bi (m
g)
Glu
cosa
suero
(m
g/d
L)
Reti
nol to
tal en T
AB
i (n
mol/g)
Reti
nil e
ster
en H
ígado (
nm
ol/g)
Reti
nol en H
ígado (
nm
ol/g)
β-C
aro
teno e
n H
ígado (
nm
ol/g)
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
148
A.
(con
t.)
CpG
21 (
-53)
CpG
22 (
-45)
CpG
23 (
-39)
CpG
24 (
-37)
CpG
25 (
-23)
CpG
26 (
-8)
CpG
27 (
+1)
CpG
28 (
+4)
CpG
29 (
+10)
CpG
30 (
+13)
CpG
31 (
+20)
CpG
32 (
+22)
CpG
33 (
+24)
CpG
34 (
+26)
CpG
35 (
+28)
CpG
36 (
+32)
CpG
37 (
+34)
pro
medio
0,2
02
-0,0
82
0,1
97
0,0
91
0,0
85
-0,0
22
-0,0
57
0,0
97
0,0
63
0,0
02
0,0
24
0,1
92
0,2
17
-0,0
34
-0,2
72
-0,2
38
0,0
19
0,0
30
0,1
34
-0,0
62
-0,2
04
0,0
68
0,0
21
-0,1
12
-0,1
71
0,2
42
0,2
20
-0,0
45
0,0
66
0,1
01
-0,0
95
-0,0
17
0,1
68
0,0
66
-0,0
14
0,2
76*
0,2
34
0,1
27
0,0
40
-0,1
25
-0,1
54
-0,0
63
-0,0
93
-0,0
45
0,1
85
-0,0
85
0,0
86
0,1
12
-0,0
65
-0,0
49
0,0
18
-0,1
16
-0,0
51
0,2
73*
0,0
66
-0,0
22
-0,3
96*
-0,1
95
-0,0
67
-0,1
17
-0,3
67*
-0,1
07
0,0
28
-0,1
84
0,0
04
-0,2
35
-0,2
59
-0,1
68
-0,0
10
-0,0
05
-0,0
69
0,1
19
0,3
72*
0,0
35
0,0
33
0,2
62
0,2
15
0,3
33*
0,0
94
0,0
84
-0,0
22
0,1
60
0,0
29
0,1
98
0,2
72*
0,3
37*
-0,1
84
-0,4
06**
0,0
98
0,0
37
-0,1
50
-0,0
30
-0,0
92
-0,0
21
-0,2
12
-0,0
12
-0,0
90
-0,1
39
-0,1
83
-0,0
17
0,0
91
0,1
42
0,1
96
-0,1
07
0,0
62
0,1
45
0,0
06
0,3
06*
-0,1
40
-0,0
30
-0,0
57
-0,1
32
-0,3
62*
-0,1
71
-0,0
83
-0,1
42
-0,2
22
-0,0
02
0,0
70
0,0
72
0,0
58
-0,1
98
0,1
45
0,1
81
0,0
25
0,2
26
-0,0
99
-0,0
37
-0,0
42
-0,1
26
-0,4
30**
-0,2
09
-0,0
04
-0,0
59
-0,1
82
0,0
19
0,1
07
0,0
45
0,0
88
-0,1
43
0,1
05
0,2
55
-0,0
21
0,3
14*
0,1
09
0,0
79
-0,2
26
0,0
42
-0,1
51
-0,0
78
-0,1
60
-0,1
41
0,0
78
-0,1
68
-0,2
35
-0,2
24
-0,2
90*
0,0
28
0,1
29
0,0
92
-0,0
37
-0,4
28**
0,0
31
0,0
13
0,0
35
0,1
58
0,1
39
-0,0
06
0,0
48
-0,0
83
-0,0
16
0,1
87
0,0
41
0,1
07
-0,0
70
-0,1
55
-0,0
34
-0,1
86
0,0
98
0,1
93
0,1
49
0,1
16
-0,2
38
0,0
69
-0,1
07
-0,0
49
-0,1
43
-0,1
40
0,0
74
-0,1
62
-0,1
93
-0,2
38
-0,3
10*
0,0
38
0,1
35
0,0
80
-0,0
50
-0,4
21**
B.
(con
t.)
CpG
21 (
-53)
CpG
22 (
-45)
CpG
23 (
-39)
CpG
24 (
-37)
CpG
25 (
-23)
CpG
26 (
-8)
CpG
27 (
+1)
CpG
28 (
-17)
CpG
29 (
-13)
CpG
30 (
-7)
CpG
31 (
-4)
CpG
32 (
+4)
CpG
33 (
+6)
CpG
34 (
+8)
CpG
35 (
+10)
CpG
36 (
+12)
CpG
37 (
+16)
pro
med
io
CpG
1 (
-296)
-0,0
26
-0,0
06
-0,0
90
0,0
94
-0,1
07
-0,0
20
0,0
33
-0,1
71
0,0
67
0,1
01
-0,0
95
0,0
15
0,0
46
-0,0
28
0,0
72
0,0
78
0,0
64
0,4
03**
CpG
2 (
-278)
-0,0
62
-0,1
73
-0,1
17
-0,1
29
-0,0
49
-0,1
16
0,0
55
0,2
58
0,1
06
0,0
60
0,0
67
0,0
95
0,1
19
0,0
15
-0,0
04
0,0
40
0,0
54
0,5
36**
CpG
3 (
-267)
-0,2
21
-0,1
54
-0,1
53
-0,1
42
-0,0
51
-0,1
87
-0,0
58
0,0
20
0,0
95
0,0
50
-0,0
31
-0,0
18
0,0
48
-0,0
20
0,0
08
0,0
51
0,0
40
0,5
16**
CpG
4 (
-249)
-0,0
71
-0,1
57
-0,1
68
-0,0
90
-0,0
49
-0,1
33
-0,1
28
0,1
58
0,0
83
0,0
28
0,0
38
0,0
01
0,0
83
0,0
81
0,0
17
0,0
83
0,0
60
0,4
84**
CpG
5 (
-199)
-0,2
47
-0,1
58
0,0
14
-0,1
51
-0,0
34
-0,0
65
0,0
80
0,1
46
-0,0
14
0,0
40
0,1
99
0,1
67
0,0
96
0,0
38
0,0
72
0,1
03
0,1
70
0,5
28**
CpG
6 (
-192)
-0,0
55
-0,2
09
-0,0
73
-0,1
32
-0,0
10
-0,2
31
-0,0
52
0,0
50
0,0
50
0,0
67
-0,0
27
0,0
29
0,0
92
0,0
02
-0,0
70
0,0
79
0,0
73
0,4
47**
CpG
7 (
-171)
0,0
10
-0,1
59
-0,1
41
-0,0
74
-0,0
82
-0,2
09
-0,0
99
0,0
07
0,0
32
-0,0
53
0,0
96
-0,0
70
0,0
58
0,0
34
-0,0
33
0,0
62
0,1
02
0,4
05**
CpG
8 (
-159)
-0,1
76
-0,1
85
-0,1
97
-0,1
34
-0,1
18
-0,2
29
-0,0
50
0,1
11
0,0
98
-0,0
74
0,0
69
0,0
46
0,0
74
0,0
41
0,0
63
0,0
39
0,1
04
0,4
10**
CpG
9 (
-148)
0,0
79
0,0
21
0,1
48
0,5
20**
0,2
34
0,1
67
0,1
50
0,1
35
0,0
21
0,0
12
0,0
27
-0,0
19
0,1
07
0,0
92
-0,0
05
0,0
65
0,0
34
0,5
00**
CpG
13 (
-105)
0,2
19
0,2
83
0,0
22
0,5
21**
0,4
50**
0,3
65*
0,2
12
0,1
23
-0,0
23
0,4
06**
0,0
72
0,3
01
0,3
90*
0,1
62
0,1
32
0,0
17
-0,0
65
0,0
61
CpG
14 (
-102)
0,1
00
0,2
78
-0,1
84
0,0
85
-0,0
43
0,4
11**
0,3
64*
0,2
90
0,2
81
-0,0
18
0,1
20
0,0
59
0,1
44
0,2
79
-0,0
26
-0,1
38
-0,0
06
0,0
26
CpG
15 (
-91)
,324*
0,0
23
-0,0
81
-0,2
07
-0,0
41
0,0
01
0,2
61
0,5
14**
0,3
12*
0,0
66
0,2
48
0,1
15
0,3
03
0,2
62
-0,0
78
-0,0
25
0,1
34
0,3
90*
CpG
16 (
-87)
0,2
29
0,0
78
-0,2
59
0,1
24
-0,2
12
0,1
89
,331*
0,2
98
-0,1
24
0,1
03
0,2
40
-0,1
37
0,2
51
0,3
23*
-0,1
84
-0,0
28
0,2
58
0,2
52
CpG
17 (
-81)
-0,0
03
-0,0
64
-0,1
98
0,0
04
-0,1
63
0,1
22
0,1
04
0,2
70
0,2
60
-0,0
38
-0,1
05
-0,1
39
0,0
50
0,1
67
-0,2
58
-0,1
87
-0,0
45
0,1
25
CpG
18 (
-70)
0,1
06
0,1
92
0,0
54
0,0
13
0,1
07
-0,0
94
0,1
48
0,1
34
0,1
08
0,0
22
0,0
98
0,0
69
0,2
47
0,0
90
-0,0
29
-0,0
47
-0,0
07
0,4
33**
CpG
19 (
-68)
0,1
78
0,3
00
-0,1
36
0,1
82
0,1
06
0,2
01
0,2
16
-0,0
97
0,2
66
0,3
92*
0,0
64
0,0
46
0,1
88
0,2
12
-0,0
13
-0,1
03
0,1
77
0,1
37
CpG
20 (
-55)
0,0
12
0,1
09
0,0
08
0,1
25
0,2
87
-0,0
75
0,1
99
0,1
17
0,3
31*
0,3
67*
0,2
13
,511**
0,2
99
0,1
06
-0,0
61
0,0
32
0,2
91
CpG
21 (
-53)
0,0
28
0,3
00
0,2
18
0,5
42**
,327*
0,1
16
0,0
73
-0,0
40
0,2
51
0,2
07
0,4
30**
0,4
63**
-0,1
74
0,0
23
0,2
09
0,1
55
CpG
22 (
-45)
0,2
62
0,3
50*
-0,0
05
0,1
38
0,2
38
0,3
32*
0,1
61
0,1
10
-0,0
52
0,1
57
0,1
70
0,0
09
-0,0
55
0,0
70
0,1
37
CpG
23 (
-39)
0,4
95**
0,2
75
0,1
89
-0,0
47
0,0
82
0,1
56
0,1
93
,339*
0,1
76
0,1
39
-0,2
14
-0,1
04
0,1
53
-0,0
57
CpG
24 (
-37)
0,3
94**
0,0
87
0,0
01
0,3
06*
0,2
54
0,0
35
0,2
50
0,3
54*
0,1
01
-0,0
92
-0,1
14
-0,0
43
0,0
04
CpG
25 (
-23)
0,3
55*
0,0
34
0,2
87
0,0
39
0,0
73
0,0
02
0,1
67
0,2
32
-0,2
72
-0,1
73
-0,0
25
0,0
17
CpG
26 (
-8)
0,3
57*
0,3
64*
0,0
93
0,1
76
0,2
24
0,2
56
0,2
96
-0,0
77
0,0
42
0,0
38
0,3
00
CpG
27 (
+1)
0,1
82
0,4
28**
0,4
02**
0,2
67
0,1
77
0,0
81
0,3
04*
-0,1
25
-0,1
47
0,0
49
0,1
91
CpG
28 (
+4)
0,3
08*
0,1
60
0,2
40
0,1
92
0,2
65
0,2
15
0,0
74
-0,0
47
0,1
04
0,3
43*
CpG
29 (
+10)
0,2
48
0,0
69
0,2
39
0,1
11
0,1
51
-0,1
06
-0,1
07
0,1
08
0,2
54
CpG
30 (
+13)
0,1
60
0,3
45*
0,4
20**
0,1
94
0,2
57
0,0
51
0,2
63
0,3
07*
CpG
31 (
+20)
0,3
10*
0,2
78*
0,1
14
0,1
88
0,2
96*
0,3
72**
0,2
01
CpG
32 (
+22)
0,4
29**
0,2
23
0,3
31*
0,1
87
0,1
73
0,3
71**
CpG
33 (
+24)
0,5
37**
-0,0
52
0,0
81
0,1
55
0,5
15**
CpG
34 (
+26)
-0,2
38
0,0
47
0,0
74
0,2
27
CpG
35 (
+28)
0,4
05**
0,1
25
0,1
52
CpG
36 (
+32)
0,2
50
0,1
62
CpG
37 (
+34)
0,2
59
Rb
p4
Meti
laci
ón (
%)
Rb
p4
Meti
laci
ón (
%)
β-C
aro
teno e
n s
uero
(µ
M)
Reti
nol to
tal en T
AB
i (n
mol/g)
Reti
nil e
ster
en H
ígado (
nm
ol/g)
Reti
nol en H
ígado (
nm
ol/g)
β-C
aro
teno e
n H
ígado (
nm
ol/g)
Reti
nol en s
uero
(µ
M)
AR
Nm
Rbp4 (
%)
Peso
Corp
ora
l (g
)
Gra
sa c
orp
ora
l (g
/100g)
Peso
TA
Bi (m
g)
Glu
cosa
suero
(m
g/d
L)
Resultados y Discusión
Capítulo 3
149
A.
CpG
1 (
-2640)
CpG
2 (
-2634)
CpG
3 (
-2608)
CpG
4 (
-2599)
CpG
5 (
-2586)
CpG
6 (
-2580)
CpG
7 (
-2541)
CpG
8 (
-2538)
CpG
9 (
-2521)
CpG
10 (
-2511)C
pG
11 (
-2508)C
pG
12 (
-2455)
pro
medio
--
--
--
--
--
--
-
-0,2
62
-0,1
21
-0,0
68
-0,2
45
-0,1
16
-0,1
04
-0,2
97*
-0,2
91*
-0,3
38*
-0,1
58
-0,0
19
-0,2
80*
-0,2
79*
-0,0
31
-0,1
38
-0,1
42
-0,1
31
-0,2
03
-0,2
11
-0,1
45
-0,1
52
-0,2
03
-0,0
72
-0,2
44
-0,0
94
-0,0
79
-0,1
21
-0,1
16
-0,1
30
-0,1
71
-0,2
33
-0,1
54
-0,2
68*
-0,2
80*
-0,2
48
-0,2
15
-0,0
50
-0,1
24
-0,2
17
0,1
83
0,4
37**
0,3
04*
0,2
57
0,4
23**
0,4
88**
0,2
67*
0,1
51
0,3
20*
0,2
65
0,0
93
0,2
94*
0,4
59**
-0,0
35
0,2
14
-0,0
96
-0,0
70
0,0
90
0,0
17
0,0
80
0,1
81
0,1
66
0,0
93
0,3
33*
0,0
22
0,1
90
0,0
47
0,0
16
-0,1
65
-0,1
25
-0,0
06
-0,1
01
-0,0
06
0,1
42
0,0
60
0,0
61
0,2
36
-0,1
68
0,0
76
0,0
12
-0,0
82
-0,1
31
-0,1
71
-0,0
03
-0,1
49
-0,0
69
0,1
74
-0,0
76
0,0
37
0,2
18
-0,2
34
-0,0
75
-0,2
98*
-0,3
55**
-0,1
10
-0,1
33
-0,1
51
-0,1
32
-0,0
79
-0,1
16
-0,0
75
-0,4
19**
-0,3
75**
-0,3
44**
-0,3
99**
0,0
03
-0,1
11
0,0
32
0,0
37
0,0
57
0,0
24
-0,1
96
-0,0
68
-0,2
27
-0,1
43
-0,0
51
-0,1
72
-0,1
53
-0,3
30*
-0,3
69**
-0,0
98
-0,1
30
-0,1
49
-0,1
45
-0,0
87
-0,1
46
-0,1
19
-0,3
77**
-0,4
04**
-0,3
65**
-0,4
16**
B.
CpG
1 (
-2640)
CpG
2 (
-2634)
CpG
3 (
-2608)
CpG
4 (
-2599)
CpG
5 (
-2586)
CpG
6 (
-2580)
CpG
7 (
-2541)
CpG
8 (
-2538)
CpG
9 (
-2521)
CpG
10 (
-2511)C
pG
11 (
-2508)C
pG
12 (
-2455)
pro
medio
CpG
1 (
-2640)
0,2
50
0,2
14
0,3
96**
0,1
47
0,2
73*
0,2
37
0,4
01**
0,3
96**
0,4
12**
0,4
96**
0,4
76**
0,5
52**
CpG
2 (
-2634)
0,2
89*
0,4
43**
0,4
66**
0,4
41**
0,2
82*
0,3
04*
0,5
19**
0,2
11
0,3
31*
0,4
46**
0,5
16**
CpG
3 (
-2608)
0,7
16**
0,6
25**
0,6
34**
0,5
81**
0,3
14*
0,4
94**
0,4
20**
0,3
76**
0,2
65*
0,4
42**
CpG
4 (
-2599)
0,5
80**
0,6
53**
0,5
63**
0,3
62**
0,6
00**
0,4
57**
0,4
33**
0,4
29**
0,4
79**
CpG
5 (
-2586)
0,5
76**
0,3
98**
0,1
08
0,5
59**
0,2
56
0,2
60
0,2
33
0,2
78*
CpG
6 (
-2580)
0,6
38**
0,3
74**
0,4
55**
0,4
57**
0,4
44**
0,4
48**
0,5
40**
CpG
7 (
-2541)
0,4
29**
0,5
11**
0,4
93**
0,4
83**
0,2
12
0,5
72**
CpG
8 (
-2538)
0,3
04*
0,3
28*
0,4
74**
0,2
55
0,3
87**
CpG
9 (
-2521)
0,3
28*
0,4
22**
0,3
07*
0,5
61**
CpG
10 (
-2511)
0,4
94**
0,2
98*
0,4
83**
CpG
11 (
-2508)
0,3
31*
0,4
83**
CpG
12 (
-2455)
0,6
46**
Ucp
1
Meti
laci
ón (
%)
Reti
nol en h
ígado (
nm
ol/g)
β-C
aro
teno e
n h
ígado (
nm
ol/g)
Reti
no
l en
su
ero
(µ
M)
Reti
nil é
stere
s en h
ígado (
nm
ol/g)
Peso
Co
rpo
ral
(g)
Gra
sa c
orp
ora
l (g
/10
0g
)
Peso
TA
Bi
(mg
)
β-C
aro
ten
o e
n s
uero
(µ
M)
Ucp
1
Meti
laci
ón (
%)
AR
Nm
Ucp
1 (
%)
Glu
co
sa s
uero
(m
g/d
L)
Reti
no
l to
tal
en
TA
Bi
(nm
ol/
g)
Tab
la 6
. C
orr
elac
iones
en
tre
el %
de
met
ilac
ión d
e lo
s si
tios
CpG
y d
el p
rom
edio
en l
a re
gió
n e
studia
da
del
gen
Ucp
1 y
los
niv
eles
de
AR
Nm
en
tej
ido a
dip
oso
bla
nco
inguin
al (
TA
Bi)
, lo
s p
arám
etro
s m
orf
om
étri
cos
y c
ircu
lante
s, y
los
niv
eles
tis
ula
res
de
reti
noid
es y
car
ote
noid
es (
A).
Corr
elac
ion
es e
ntr
e el
% d
e
met
ilac
ión d
e lo
s si
tio
s C
pG
in
div
idual
es y
el
% d
e m
etil
ació
n p
rom
edio
en l
a re
gió
n e
studia
da
del
gen
Ucp
1 (
B).
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
150
Anexo 3C
Niveles de expresión de Zfp423 en el tejido adiposo marrón (TAM) y en los tejidos adiposos
blancos inguinal (TABi), retroperitoneal (TABrp) y epididimal (TABe) en ratones NMRI (de 13
semanas de edad) tratados con 50 mg de ATRA por kg de peso corporal o con vehículo (aceite de
oliva) por inyección subcutánea diaria durante los cuatro días previos al sacrificio. Los datos
normalizados a la expresión del gen de referencia Actb se expresan en porcentaje respecto al
grupo control y son la media ± SEM de 8-11 animales por grupo. * Diferente del grupo control
tratado con vehículo (P<0,05; prueba t de Student de dos colas)
5. Recapitulación
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
152
Recapitulación
153
Esta tesis doctoral parte de y da continuidad a la investigación de nuestro grupo del LBNB
sobre la actividad biológica de formas activas de la vitamina A (retinoides) y carotenoides
provitamina A en relación con el control de la adiposidad corporal y la salud metabólica.
La tesis se enfoca en el estudio de la interacción de la vitamina A con la biología del
tejido adiposo y emplea diseños experimentales en animales adultos, crías lactantes y
adipocitos en cultivo. Hemos estudiado el impacto del ácido retinoico todo trans (ATRA)
‒ el retinoide más activo, requerido para una amplia gama de procesos biológicos ‒ sobre
la capacidad oxidativa mitocondrial del tejido adiposo blanco (TAB) en ratones adultos
in vivo y en adipocitos primarios cultivados, y perseguido la identificación de nuevos
biomarcadores tisulares y circulantes del impacto metabólico del ATRA, derivados de
análisis de expresión génica y por metabolómica dirigida. Además, hemos continuado
estudios previos de nuestro grupo sobre la interacción de la vitamina A con el TAB en
desarrollo in vivo, abordando un aspecto novedoso que puede proporcionar nuevas claves
mecanísticas: la posible implicación de cambios epigenéticos en genes clave para la
diferenciación adipocitaria. En conjunto, pues, en esta tesis tratamos la interacción de la
vitamina A con la biología del tejido adiposo en diferentes etapas del desarrollo: desde
efectos en etapas tempranas del desarrollo postnatal que pueden condicionar la
programación metabólica del TAB a largo plazo hasta efectos sobre el TAB a corto plazo
de la intervención con ATRA en animales adultos que pueden beneficiar la salud
metabólica.
La función mitocondrial (medida como potencial de membrana, utilización de fosfato
inorgánico o actividad de la cadena respiratoria) está reducida en el TAB en modelos
animales de obesidad (e.g., ratones ob/ob) y en humanos obesos y esta reducción ha sido
relacionada con alteraciones metabólicas asociadas a la obesidad, como la resistencia a la
insulina y la diabetes (Boudina and Graham, 2014). La estimulación de la capacidad
oxidativa mitocondrial de los adipocitos blancos es, por tanto, un posible objetivo en el
control de la obesidad y sus complicaciones médicas asociadas (Bonet et al., 2013; Flachs
et al., 2013). El conocimiento de nutrientes y co-factores capaces de optimizar la función
mitocondrial en el TAB y sus mecanismos de acción es de interés, ya que puede contribuir
al diseño de nuevas estrategias de tratamiento.
En el primer capítulo de la tesis ahondamos en mecanismos y biomarcadores tisulares
de la activación del metabolismo oxidativo en los tejidos adiposos inducida por ATRA.
Sabíamos por estudios previos que el tratamiento con ATRA incrementa la lipólisis y la
capacidad para la oxidación de ácidos grasos y la disipación de energía en TAB y otros
tejidos (Berry and Noy, 2009; Bonet et al., 2012; Mercader et al., 2006). No obstante, el
impacto del ATRA sobre la biogénesis y la capacidad funcional de las mitocondrias del
TAB había sido poco estudiado. Tampoco se había estudiado cómo afecta el tratamiento
con ATRA a la expresión en TAB de marcadores de marronización o de adipocitos
beige/BRITE propuestos en la literatura reciente, ni si la expresión génica relacionada
con la señalización por ATRA tiene potencial como fuente de nuevos marcadores de
marronización. Así pues, diseñamos dos experimentos que nos permitieron estudiar
efectos del tratamiento con ATRA sobre las capacidades funcionales de las mitocondrias
y la expresión de marcadores de marronización y de adipocitos beige/BRITE en el TAB
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
154
de ratón in vivo y en cultivos primarios de adipocitos establecidos a partir de diferentes
depósitos adiposos.
El primer experimento fue llevado a cabo en ratones adultos que recibieron una
inyección subcutánea diaria de ATRA o vehículo (controles) durante cuatro días. Tras el
sacrificio se obtuvieron distintos depósitos de TAB (inguinal, epididimal y
retroperitoneal). En estos depósitos cuantificamos los niveles de expresión de una serie
de genes relacionados con la termogénesis y la fosforilación oxidativa (OXPHOS)
mitocondrial: Ucp1, codificante de la proteína desacoplante termogénica por excelencia,
cuya actividad desacopla la OXPHOS para producir calor; Ppara, un receptor nuclear
activador de genes del catabolismo de ácidos grasos que se considera un marcador
distintivo del tejido adiposo marrón frente al blanco (Villarroya et al., 2007); Ppargc1b,
que codifica para PGC1β, un coactivador transcripcional que induce específicamente
(más que el PGC1α) la función mitocondrial en adipocitos blancos (Gao et al., 2011; Ji et
al., 2012; Pardo et al., 2011); Tfb2m, codificante del factor de transcripción mitocondrial
B2, implicado en la transcripción y mantenimiento del ADN mitocondrial; Yy1 (yin-yang
1), que codifica un factor de transcripción para muchos genes mitocondriales respiratorios
(Cunningham et al., 2007; Lescuyer et al., 2002); Atp5f1, que codifica una subunidad de
la ATP sintasa mitocondrial; y Cox8b, el gen de la subunidad VIIIb de la citocromo c
oxidasa de la cadena respiratoria. Previamente, nuestro grupo había comprobado
(mediante análisis transcriptómico) que estos genes son fuertemente inducidos por ATRA
en adipocitos maduros 3T3-L1 cultivados, junto con otros genes relacionados con la
mitocondria. También cuantificamos los niveles de expresión en los diferentes depósitos
de TAB de una serie de genes que han sido propuestos como marcadores de adipocito
beige/BRITE: Slc27a1, Cd137, Tmem26, Hoxc9 y Tbx1 (descritos en (de Jong et al.,
2015; Garcia-Ruiz et al., 2015; Wu et al., 2012)). Además, realizamos tinción
inmunohistoquímica con anticuerpos anti-COXIV y anti-UCP1 y determinamos los
niveles de ADN mitocondrial respecto al ADN nuclear.
Cuando comparamos la expresión de los genes seleccionados en los tres depósitos de
TAB en los animales control, vemos que nuestros resultados están de acuerdo con
resultados previos que indican que el TAB subcutáneo es más propenso a la
marronización que el TAB visceral (Seale and Lazar, 2009), mostrando mayores niveles
de expresión de marcadores de adipocito marrón (como Ucp1 y Ppara) y de adipocitos
beige/BRITE, mientras que los depósitos de TAB visceral tienen una mayor capacidad
oxidativa mitocondrial que los adipocitos subcutáneos (Deveaud et al., 2004; Kraunsoe
et al., 2010), mostrando una mayor expresión de genes que codifican para la maquinaria
OXPHOS (especialmente Atp5f1 y Cox8b) y una mayor ratio ADN mitocondrial/ADN
nuclear, indicativo de un mayor número de mitocondrias (aunque muy por debajo de la
ratio en el tejido adiposo marrón (TAM)).
Al analizar los efectos del tratamiento con ATRA, vemos niveles aumentados de los
ARNm de genes relacionados con la termogénesis y la función OXPHOS mitocondrial
(Ucp1, Ppara, Ppargc1b, Tfb2m, Yy1, Atp5f1 y Cox8b) en los depósitos de TAB de los
ratones tratados, especialmente en los depósitos de grasa visceral, en donde prácticamente
todos los genes de esta categoría analizados resultaron inducidos, más que en el depósito
Recapitulación
155
de TAB subcutáneo inguinal, en donde el tratamiento indujo específicamente la expresión
de Ucp1, Ppara y Tfb2m. Aunque los niveles de ADN mitocondrial respecto al nuclear
no se encontraron aumentados en los depósitos de TAB tras el tratamiento con ATRA in
vivo, el estudio inmunohistoquímico reveló, junto a adipocitos más pequeños, una mayor
positividad de COXIV en todos los depósitos de TAB estudiados en los animales tratados
con ATRA, lo que está de acuerdo con un incremento de la capacidad para la OXPHOS.
No obstante, la presencia de adipocitos multiloculares positivos para UCP1 por
inmunohistoquímica sólo fue visible en el TAB subcutáneo de los animales tratados con
ATRA, en concordancia con estudios previos (Mercader et al., 2006). Referente a los
genes relacionados con el fenotipo beige/BRITE, el tratamiento con ATRA aumentó o
tendió a aumentar la expresión de Cd137 y Slc27a1 en los tres depósitos de TAB
estudiados, pero los resultados fueron menos claros para Hoxc9 y Tbx1, cuya expresión
no aumentó de manera consistente en los distintos depósitos, y para Tmem26, para el que
incluso encontramos una disminución de su expresión en todos los depósitos de TAB en
los ratones tratados con ATRA.
Este primer experimento también lo utilizamos para analizar el impacto del tratamiento
agudo in vivo con ATRA sobre la expresión génica de IRISINA en tejidos adiposos e
hígado. La IRISINA es una señal proteica codificada en el gen Fndc5, identificada como
un regulador metabólico secretado por el musculo esquelético capaz de promover la
marronización del TAB (Bostrom et al., 2012). Nuestro interés en analizar la expresión
de IRISINA en hígado y tejidos adiposos de los ratones tratados con ATRA se justifica
por varios motivos: (i) aunque los resultados en modelos celulares apuntan a efectos
directos del ATRA sobre el metabolismo oxidativo mitocondrial en adipocitos, no se
puede descartar la contribución de mecanismos indirectos implicando mediadores
humorales como la IRISINA; (ii) es más, sabíamos que el tratamiento con ATRA (en las
mismas condiciones usadas en esta tesis) incrementa los niveles circulantes de IRISINA
pero no su expresión en el músculo esquelético de los animales (Ribot J, Bonet ML y
Palou A, datos no publicados); y (iii) se ha descrito que, además del músculo, tejidos
adiposos (Moreno-Navarrete et al., 2013; Roca-Rivada et al., 2013) e hígado (Mo et al.,
2016) expresan el gen Fndc5 y secretan IRISINA.
Los resultados mostraron que el tratamiento con ATRA incrementa significativamente
los niveles de expresión del gen Fndc5 en hígado, TAM y TAB epididimal, y tendió a
incrementarlos en los otros dos depósitos de TAB estudiados. También es de destacar que
la expresión del gen Fndc5 fue mucho más alta en hígado que en todos los tejidos
adiposos. En conjunto, nuestros resultados sugieren un origen hepático de la IRISINA
circulante en los animales tratados con ATRA y que incrementos de la IRISINA de origen
hepático y adipocitario pueden contribuir a potenciar la marronización del TAB inducida
por el tratamiento con ATRA, por mecanismos endocrinos y autocrino/paracrinos. En
concordancia, se ha descrito que la sobreexpresión de Fndc5 en hígado induce la
marronización del TAB (Mo et al., 2016) y que la marronización de los adipocitos
favorece su secreción de IRISINA (Moreno-Navarrete et al., 2013). Esto último sugiere
un lazo de retroalimentación positiva entre la marronización de adipocitos y la IRISINA
de origen adiposo.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
156
El segundo experimento se realizó en cultivos primarios de adipocitos establecidos a
partir de preadipocitos derivados de diferentes depósitos adiposos de ratones adultos:
TAM, TAB inguinal y TAB epididimal. Las células en vías de diferenciación fueron
expuestas a ATRA y noradrenalina (NA), dos estímulos marronizadores, por 24h, al
objeto de contrastar marcadores de marronización o de adipocito beige/BRITE basados
en ARNm previamente propuestos en la literatura e identificar nuevos marcadores de
marronización con una función bioquímica/metabólica. Concretamente, nos interesaba
estudiar si la expresión en TAB de proteínas implicadas en la señalización por ATRA ‒
factores de transcripción de la superfamilia de receptores nucleares y proteínas de unión
a lípidos que, en conjunto, median las acciones celulares del ATRA ‒ podía servir como
fuente de marcadores de marronización funcionales o de activación del metabolismo
oxidativo en adipocitos blancos.
Los resultados de este segundo experimento mostraron que la estimulación aguda (1µM
durante 24h) con ATRA o NA induce características de adipocito tipo marrón en todos
los cultivos primarios, tanto los derivados de TAM como los derivados de TABs, en
concreto la expresión de Ucp1 y también la de Ppargc1a en el caso de la exposición a
NA. No obstante los marcadores de marronización o de adipocito beige/BRITE Slc27a1,
Cd137, Tmem26, Hoxc9 y Tbx1 no cumplieron los criterios esperables de aumentar tras
un estímulo de activación de la capacidad termogénica como son el tratamiento agudo
con NA o ATRA. Al considerar los efectos de los dos tratamientos pro-termogénicos
aplicados sobre la expresión de genes clave de la señalización por ATRA, observamos
inducción de Rarb tras la exposición a ATRA (en adipocitos marrones derivados de TAM
y beige/BRITE derivados de TAB) y represión de Rxrg tras la exposición a NA (en
adipocitos beige/BRITE derivados de TAB). Además, al considerar los niveles de
expresión basales de estos genes (en los adipocitos no estimulados), observamos una
expresión de Rarb mucho mayor en los adipocitos derivados de TAM que en los
derivados de TABs. A partir de estas observaciones, definimos la ratio entre el nivel de
expresión de Rarb y de Rxrg como un nuevo marcador de marronización en adipocitos
derivados de TAB. Esta ratio se encontró significativamente incrementada en los
adipocitos derivados de TAB (epididimal o inguinal) tratados con NA y con ATRA
respecto de sus respectivos controles, mientras que en los adipocitos derivados de TAM se
encontró incrementada con el tratamiento con ATRA. Para validar este nuevo marcador de
marronización utilizamos el modelo animal caracterizado en el primer experimento
(tratamiento agudo in vivo con ATRA) y observamos que, efectivamente, la ratio
Rarb/Rxrg estaba incrementada significativamente en todos los depósitos de TAB (pero
no en el TAM) de los animales tratados. Sería interesante comprobar si la ratio Rarb/Rxrg
como marcador transcriptómico en TABs responde in vivo a otros estímulos inductores
de marronización.
En conjunto, los resultados de esta primera parte de la tesis muestran que el ATRA, en su
efecto antiobesogénico, impacta en las mitocondrias del TAB, favoreciendo una mayor
funcionalidad mitocondrial, necesaria tanto para los mecanismos de disipación de energía
dependientes de UCP1 como los independientes de UCP1 (e.g., ciclo fútil de hidrólisis
de triacilgliceroles intracelulares y reesterificación de ácidos grasos) (Bonet et al., 2013;
Recapitulación
157
Flachs et al., 2013). Además, los resultados sugieren que el tratamiento con ATRA puede
potenciar capacidades intrínsecas diferenciales de cada tipo de depósito de TAB,
favoreciendo la aparición de adipocitos tipo marrón multiloculares y que expresan la
UCP1 en el TAB subcutáneo (inguinal) y de adipocitos con una capacidad oxidativa
mitocondrial incrementada, pero uniloculares y negativos para UCP1, en los depósitos
viscerales (retroperitoneal y epididimal). De los nuevos marcadores de marronización o
de adipocito beige/BRITE ensayados (Cd137, Slc27a1, Tmem26, Hoxc9 y Tbx1), sólo
Cd137 resultó inducido de una manera consistente en los diferentes depósitos de TAB
(subcutáneo y viscerales) en los ratones tratados con ATRA, y ninguno resultó inducido
en los adipocitos cultivados derivados de TABs en respuesta a estímulos que sí
aumentaron la capacidad termogénica (vía Ucp1), como son la exposición a NA o ATRA.
Por tanto, la utilidad de estos genes como marcadores funcionales de marronización o
activación metabólica del TAB es limitada. Por otro lado, nuestros datos apoyan la idea
de que los efectos del ATRA sobre la capacidad oxidativa de los adipocitos está
canalizada vía Rarb/Crabp y apuntan a la ratio Rarb/Rxrg como un nuevo marcador
funcional de adipocito beige/BRITE, que marca asimismo la marronización o activación
metabólica del TAB inducida por el tratamiento con ATRA in vivo. Además, in vivo este
nuevo marcador es capaz de discriminar entre la activación del TAM y la marronización
del TAB, al menos en los animales tratados con ATRA.
En el segundo capítulo de la tesis se identificaron y validaron biomarcadores sanguíneos
del incremento de la capacidad oxidativa y termogénica en tejidos adiposos y otros
tejidos, explotando el modelo de tratamiento con ATRA in vivo. Contar con
biomarcadores fácilmente accesibles que reflejen los cambios inducidos por agentes
terapéuticos candidatos en tejidos internos, y que se asocien a efectos sistémicos
beneficiosos, es de interés de cara a la identificación, evaluación y optimización de nuevas
terapias. Puesto que el tratamiento con ATRA induce la capacidad oxidativa y
termogénica en diferentes tejidos, incluyendo la marronización del TAB, este modelo
puede ser utilizado para identificar biomarcadores circulantes asociados a estos efectos,
que son de interés en el contexto del control y tratamiento de la obesidad y sus co-
morbilidades.
Empleando el modelo animal del primer experimento del capítulo 1, realizamos un
análisis metabolómico en PBMC y plasma de ratones tratados con ATRA y sus controles.
También evaluamos la expresión en PBMC de genes relacionados con el metabolismo
oxidativo. En los ratones tratados con ATRA, el perfil metabolómico del plasma mostró
niveles incrementados de carnitina, acetilcarnitina y otras especies de acilcarnitinas;
niveles disminuidos de citrulina, con aumento del índice de biodisponibilidad global de
arginina (ratio entre los niveles de arginina y los de citrulina+ornitina); niveles
incrementados de creatina; niveles incrementados de taurina; y una disminución de la
ratio PUFA n-6/n-3. El perfil metabolómico en PBMC, por su parte, mostró una reducción
generalizada de los niveles relativos de prácticamente todos los metabolitos analizados
(e.g., acilcarnitinas, aminoácidos), excepto el EPA, en los ratones tratados con ATRA. La
expresión génica de Cyp26a1 y Cpt1a en PBMC se encontró incrementada después del
tratamiento con ATRA.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
158
En conjunto, en este experimento identificamos marcadores plasmáticos de la interacción
de la vitamina A con el metabolismo oxidativo y la salud metabólica. Principalmente las
acilcarnitinas reflejarían la estimulación de la movilización y oxidación tisular de lípidos
promovida por el ATRA, mientras que otros metabolitos como la carnitina, creatina y
taurina, así como la biodisponibilidad global de arginina, podrían jugar un papel más
activo o causal, ya que su mayor disponibilidad podría mejorar la función mitocondrial y
el metabolismo, directa o indirectamente, de acuerdo a la bibliografía. En los ratones
tratados con ATRA, el perfil metabolómico de las PBMC fue muy distinto del plasma, lo
que sugiere un diferente impacto del ATRA sobre el metabolismo de estas células en
comparación con los tejidos homeostáticos (hígado, músculo, tejidos adiposos),
posiblemente asociado a su funcionalidad. No obstante, los resultados de la expresión de
genes específicos en PBMC, en concreto Cpt1a, sí reflejaría la respuesta a ATRA en otros
tejidos que da lugar a aumentar el uso de los ácidos grasos como fuente de energía; sin
embargo, los resultados en PBMC deben tomarse con cautela dadas las limitaciones del
estudio (n pequeña para los análisis en PBMC).
En el tercer capítulo de la tesis estudiamos eventuales efectos nutriepigenéticos de la
suplementación durante la lactancia con vitamina A, preformada o como -caroteno, de
posible relevancia en la programación metabólica del TAB. Estudios previos de nuestro
laboratorio habían mostrado que, en ratas, la suplementación dietética a las crías durante
el periodo de lactancia con una dosis moderada de vitamina A en forma de retinil
palmitato produce cambios en el TAB que favorecen su hiperplasia con la exposición a
una dieta alta en grasa tras el destete (Granados et al., 2013), y que el tratamiento con una
dosis equivalente de vitamina A en forma de -caroteno no tiene los mismos efectos sobre
el TAB en desarrollo que el tratamiento con retinil palmitato (Musinovic et al., 2014). La
lactancia es un periodo crítico del desarrollo del tejido adiposo en el que pueden quedar
condicionados cambios epigenéticos que impactan las características del tejido a largo
plazo, y los retinoides se sabe que influencian la metilación del ADN en el contexto del
cáncer y el desarrollo embrionario. A partir de aquí, hipotetizamos que la suplementación
durante la lactancia con vitamina A puede afectar el estatus de metilación en el TAB de
promotores génicos diana relacionados con el desarrollo y metabolismo del tejido, y de
manera diferencial según esta vitamina sea aportada en la dieta del lactante como retinil
palmitato o como BC.
Para testar esta hipótesis, utilizamos el experimento animal descrito en (Musinovic et al.,
2014), en el cual las crías de rata fueron suplementadas durante la etapa postnatal
temprana (los primeros 21 días de vida, coincidentes con la etapa de lactancia) con -
caroteno (BC), retinil éster (RE, en concreto retinil palmitato) o vehículo. En este
experimento, la cantidad de vitamina A extra administrada fue entre tres y cinco veces la
proporcionada diariamente por la leche materna. Analizamos el estado de metilación de
promotores de genes relacionados con la diferenciación (Pparg) y determinación
adipogénica (Zfp423), la proliferación celular (Pcna), el transporte de retinol (Rbp4) y la
capacidad termogénica (Ucp1) en el TAB inguinal de los animales de este experimento,
utilizando la técnica de secuenciación por bisulfito.
Recapitulación
159
Los resultados mostraron un perfil alterado de metilación de las regiones promotoras
estudiadas por la suplementación moderada de vitamina A, con efectos diferenciales entre
los grupos RE y BC. Las diferencias se relacionaron con CpG específicos afectados en su
grado de metilación con respecto al grupo control. Los resultados más notables fueron
para Pcna (hipometilación de varios CpGs en el grupo RE e hipermetilación de otros en
el grupo BC), Rbp4 (hipermetilación de varios CpGs en el grupo RE e hipometilación de
otros en el grupo BC) y Ucp1 (hipometilación en varios CpGs en el grupo BC y ausencia
de efectos en el grupo RE). También cabe destacar un sitio CpG en el promotor del
Pparg2 (localizado a -223) que se encontró significativamente hipermetilado en el grupo
RE, pero no en el grupo BC. Los resultados de expresión génica obtenidos en general
están en consonancia con el concepto de que la metilación del ADN suele silenciar la
transcripción. Esto fue especialmente claro en el caso del Pparg2, para el cual los niveles
de metilación se correlacionaron inversamente con los niveles de ARNm y directamente
con los niveles de retinol en TAB inguinal.
Los resultados indican que la suplementación con vitamina A durante la lactancia modula
el perfil de metilación de regiones reguladoras de Pparg2, Zfp423, Pcna, Rbp4 y Ucp1 en
el TAB inguinal de ratas, y de manera diferencial según sea aportada en la dieta como
retinil palmitato o como -caroteno. Los efectos observados podrían subyacer a
diferencias en fenómenos de programación de las características y respuestas del TAB en
etapas posteriores de la vida.
Los resultados de esta tesis definen al ATRA como un agente capaz de potenciar la
función mitocondrial en diferentes depósitos de TAB in vivo. El conocimiento generado
podría ser de interés en el contexto de la obesidad y sus secuelas metabólicas. Por un lado,
la modulación del metabolismo oxidativo del tejido adiposo puede contribuir a la
reducción de la adiposidad y, más allá de la obesidad, el conocimiento de factores capaces
de modular las mitocondrias podría encontrar aplicación en el tratamiento de trastornos
causados por el mal funcionamiento de estos orgánulos. Por otro lado, la identificación
de marcadores tisulares y circulantes de perfiles/procesos metabólicos en el tejido adiposo
puede facilitar el seguimiento de su evolución y, en definitiva, la gestión de la obesidad.
Además, los resultados del análisis metabolómico realizado abren la puerta a nuevas
hipótesis de trabajo sobre los mecanismos de la actividad anti-síndrome metabólico del
ATRA. Finalmente, esta tesis es, que sepamos, pionera en abordar posibles efectos
nutriepigenéticos de la vitamina A durante la lactancia en relación con la diferenciación
y el desarrollo del tejido adiposo.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
160
6. Conclusiones
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
162
Conclusiones
163
1. El tratamiento con ATRA, en su efecto antiobesogénico, incrementa la capacidad
funcional de las mitocondrias del tejido adiposo blanco (TAB) y potencia
capacidades intrínsecas diferenciales de cada depósito de TAB. Así, el tratamiento
favorece la aparición de adipocitos tipo marrón, multiloculares y que expresan la
UCP1, en el TAB subcutáneo (inguinal) y de adipocitos con una capacidad oxidativa
mitocondrial incrementada, pero uniloculares y negativos para UCP1, en los depósitos
viscerales (retroperitoneal y epididimal).
2. El tratamiento con ATRA induce en el TAB subcutáneo y visceral algunos
marcadores de adipocito beige/BRITE, notablemente Cd137 y en menor medida
Slc27a1, que serían por tanto útiles como marcadores de marronización o
activación metabólica del TAB, al marcar in vivo tanto los adipocitos tipo marrón
inducidos como los adipocitos uniloculares con la función mitocondrial incrementada.
No obstante, otros marcadores de adipocitos beige/BRITE ensayados de los
propuestos en la literatura no se ven inducidos con el tratamiento con ATRA, lo que
vendría a sumarse a la controversia en torno a la utilidad de estos marcadores para
identificar la marronización del TAB in vivo.
3. Los efectos del ATRA sobre la capacidad termogénica/OXPHOS de los
adipocitos estarían canalizados por la vía Rarb/Crabp2. Además, el efecto
marronizante o de activación metabólica del TAB inducido por el tratamiento
con ATRA in vivo podría estar potenciado por mecanismos de acción
endrocrinos/paracrinos indirectos, a través de la IRISINA de origen hepático y
del propio tejido adiposo.
4. La ratio entre el nivel de expresión de Rarb y de Rxrg se muestra como un nuevo
marcador de marronización o activación metabólica del TAB in vivo. Este nuevo
marcador incrementa en los adipocitos derivados de TAB estimulados con dos
tratamientos “pro-termogénicos” (noradrenalina y ATRA) y en los depósitos de TAB
(pero interesantemente no en el TAM) de los animales tratados con ATRA.
5. El tratamiento con ATRA afecta de manera diferencial el metaboloma
(acilcarnitinas + aminoácidos) del plasma y de las PBMC. El análisis
metabolómico en plasma de ratones tratados con ATRA muestra niveles
incrementados de carnitina, acetilcarnitina y otras especies de acilcarnitinas; niveles
disminuidos de citrulina y una mayor biodisponibilidad global de arginina; niveles
incrementados de creatina y taurina; y una disminución de la ratio PUFA n-6/n-3.
Algunos de estos marcadores reflejarían fundamentalmente la estimulación de la
movilización y oxidación tisular de lípidos promovida por el ATRA (e.g.,
acilcarnitinas), mientras que otros podrían jugar un papel más activo o causal. Por otra
parte, el perfil metabolómico de las PBMC sugiere un diferente impacto del ATRA
sobre el metabolismo de estas células en comparación con los tejidos homeostáticos,
posiblemente asociado a su funcionalidad en el sistema inmunitario.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
164
6. Los niveles plasmáticos altos de AC2:0 (especialmente), AC8:0,
AC3DH/AC4OH, AC16DC y DHA se muestran como marcadores plasmáticos
de activación del TAM y, junto con los niveles plasmáticos altos de carnitina, de
la activación metabólica del TAB visceral in vivo, al menos en los animales tratados
con ATRA.
7. Un exceso moderado de vitamina A durante el periodo de lactancia altera marcas
de metilación en las regiones promotoras de genes implicados en la
diferenciación y metabolismo (Pparg2, Zfp423, Pcna, Rbp4 y Ucp1) del tejido
adiposo (TAB inguinal) en formación en la rata, que podrían subyacer a
fenómenos de programación de las características y respuestas del TAB en
etapas posteriores de la vida.
8. Suplementar la vitamina A en forma de ésteres de retinol (vitamina A
preformada) o β-caroteno (carotenoide pro-vitamina A) no es equivalente, sino
que hay efectos nutriepigenéticos diferenciales en el TAB de la crías, que tienen
que ver con los CpG concretos que se ven afectados y con el sentido del cambio (hipo
o hipermetilación respecto del grado de metilación observado en el grupo control).
7. Referencias
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
166
Referencias
167
Adams, S.H., Hoppel, C.L., Lok, K.H., Zhao, L., Wong, S.W., Minkler, P.E., Hwang, D.H.,
Newman, J.W., and Garvey, W.T. (2009). Plasma acylcarnitine profiles suggest incomplete long-
chain fatty acid beta-oxidation and altered tricarboxylic acid cycle activity in type 2 diabetic
African-American women. Journal of nutrition 139, 1073-1081.
Aguer, C., McCoin, C.S., Knotts, T.A., Thrush, A.B., Ono-Moore, K., McPherson, R., Dent, R.,
Hwang, D.H., Adams, S.H., and Harper, M.E. (2015). Acylcarnitines: potential implications for
skeletal muscle insulin resistance. FASEB journal: official publication of the Federation of
American Societies for Experimental Biology 29, 336-345.
Ahn, M.Y., Seo, Y.J., Ji, S.D., Han, J.W., Hwang, J.S., and Yun, E.Y. (2010). Fatty Acid
Composition of Adipose Tissues in Obese Mice and SD Rats Fed with Isaria sinclairii Powder.
Toxicological research 26, 185-192.
Al Tanoury, Z., Piskunov, A., and Rochette-Egly, C. (2013). Vitamin A and retinoid signaling:
genomic and no genomic effects. Journal of lipid research 54, 1761-1775.
Alvarez, R., de Andrés, J., Yubero, P., Viñas, O., Mampel, T., Iglesias, R., Giralt, M., and
Villarroya, F. (1995). A novel regulatory pathway of brown fat thermogenesis. Retinoic acid is a
transcriptional activator of the mitochondrial uncoupling protein gene. Journal of biological
chemistry 270, 5666-5673.
Amengual, J., Gouranton, E., van Helden, Y.G., Hessel, S., Ribot, J., Kramer, E., Kiec-Wilk, B.,
Razny, U., Lietz, G., Wyss, A., et al. (2011). Beta-carotene reduces body adiposity of mice via
BCMO1. PLoS One 6, e20644.
Amengual, J., Petrov, P., Bonet, M.L., Ribot, J., and Palou, A. (2012). Induction of carnitine
palmitoyl transferase 1 and fatty acid oxidation by retinoic acid in HepG2 cells. International
journal of biochemistry and cell biology 44, 2019-2027.
Amengual, J., Ribot, J., Bonet, M.L., and Palou, A. (2007). Effect of acute treatment with retinoic
acid on lipid metabolism in liver of mice. International journal of obesity 31, S66.
Amengual, J., Ribot, J., Bonet, M.L., and Palou, A. (2008). Retinoic acid treatment increases lipid
oxidation capacity in skeletal muscle of mice. Obesity (Silver Spring) 16, 585-591.
Amengual, J., Ribot, J., Bonet, M.L., and Palou, A. (2010). Retinoic acid treatment enhances lipid
oxidation and inhibits lipid biosynthesis capacities in the liver of mice. Cellular physiology and
piochemistry 25, 657-666.
Anderson, O.S., Sant, K.E., and Dolinoy, D.C. (2012). Nutrition and epigenetics: an interplay of
dietary methyl donors, one-carbon metabolism and DNA methylation. Journal of nutritional
biochemistry 23, 853-859.
Aranda, A., and Pascual, A. (2001). Nuclear hormone receptors and gene expression.
Physiological reviews 81, 1269-1304.
Aranyi, T., Varadi, A., Simon, I., and Tusnady, G.E. (2006). The BiSearch web server. BMC
bioinformatics 7, 431.
Balmer, J.E., and Blomhoff, R. (2002). Gene expression regulation by retinoic acid. Journal of
lipid research 43, 1773-1808.
Bar-El Dadon, S., and Reifen, R. (2017). Vitamin A and the epigenome. Critical reviews in food
science and nutrition 57, 2404-2411.
Bays, H.E. (2011). Adiposopathy is "sick fat" a cardiovascular disease? Journal of the american
college of cardiology 57, 2461-2473.
Berry, D.C., DeSantis, D., Soltanian, H., Croniger, C.M., and Noy, N. (2012). Retinoic acid
upregulates preadipocyte genes to block adipogenesis and suppress diet-induced obesity. Diabetes
61, 1112-1121.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
168
Berry, D.C., and Noy, N. (2009). All-trans-retinoic acid represses obesity and insulin resistance
by activating both peroxisome proliferation-activated receptor beta/delta and retinoic acid
receptor. Molecular and cellular biology 29, 3286-3296.
Berry, D.C., Soltanian, H., and Noy, N. (2010). Repression of cellular retinoic acid-binding
protein II during adipocyte differentiation. The Journal of biological chemistry 285, 15324-15332.
Bird, A. (2002). DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes and development 16,
6-21.
Blomhoff, R., and Blomhoff, H.K. (2006). Overview of retinoid metabolism and function. Journal
of neurobiology 66, 606-630.
Bock, C., Reither, S., Mikeska, T., Paulsen, M., Walter, J., and Lengauer, T. (2005). BiQ
Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing.
Bioinformatics 21, 4067-4068.
Bollati, V., Favero, C., Albetti, B., Tarantini, L., Moroni, A., Byun, H.M., Motta, V., Conti, D.M.,
Tirelli, A.S., Vigna, L., et al. (2014). Nutrients intake is associated with DNA methylation of
candidate inflammatory genes in a population of obese subjects. Nutrients 6, 4625-4639.
Bonet, M.L., Canas, J.A., Ribot, J., and Palou, A. (2015). Carotenoids and their conversion
products in the control of adipocyte function, adiposity and obesity. Archives of biochemistry and
biophysics 572, 112-125.
Bonet, M.L., Mercader, J., Ribot, J., Felipe, F., Murano, I., Madsen, L., Cinti, S., Kristiansen, K.,
and Palou, A. (2007). Remodelling effects of retinoic acid in rodent white adipose tissue and
mature 3T3-L1 adipocytes. International Journal of Obesity 31, S16.
Bonet, M.L., Oliver, J., Pico, C., Felipe, F., Ribot, J., Cinti, S., and Palou, A. (2000). Opposite
effects of feeding a vitamin A-deficient diet and retinoic acid treatment on brown adipose tissue
uncoupling protein 1 (UCP1), UCP2 and leptin expression. Journal of endocrinology 166, 511-
517.
Bonet, M.L., Oliver, P., and Palou, A. (2013). Pharmacological and nutritional agents promoting
browning of white adipose tissue. Biochimica et biophysica acta 1831, 969-985.
Bonet, M.L., Puigserver, P., Serra, F., Ribot, J., Vazquez, F., Pico, C., and Palou, A. (1997).
Retinoic acid modulates retinoid X receptor alpha and retinoic acid receptor alpha levels of
cultured brown adipocytes. FEBS Letters 406, 196-200.
Bonet, M.L., Ribot, J., Felipe, F., and Palou, A. (2003). Vitamin A and the regulation of fat
reserves. Cellular and molecular life sciences 60, 1311-1321.
Bonet, M.L., Ribot, J., and Palou, A. (2012). Lipid metabolism in mammalian tissues and its
control by retinoic acid. Biochimica et biophysica acta 1821, 177-189.
Bostrom, P., Wu, J., Jedrychowski, M.P., Korde, A., Ye, L., Lo, J.C., Rasbach, K.A., Bostrom,
E.A., Choi, J.H., Long, J.Z., et al. (2012). A PGC1-alpha-dependent myokine that drives brown-
fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature 481, 463-468.
Boudina, S., and Graham, T.E. (2014). Mitochondrial function/dysfunction in white adipose
tissue. Experimental physiology 99, 1168-1178.
Brown, C.C., and Noelle, R.J. (2015). Seeing through the dark: New insights into the immune
regulatory functions of vitamin A. European journal of immunology 45, 1287-1295.
Brun, P.J., Yang, K.J., Lee, S.A., Yuen, J.J., and Blaner, W.S. (2013). Retinoids: Potent regulators
of metabolism. Biofactors 39, 151-163.
Campbell, C., Grapov, D., Fiehn, O., Chandler, C.J., Burnett, D.J., Souza, E.C., Casazza, G.A.,
Gustafson, M.B., Keim, N.L., Newman, J.W., et al. (2014). Improved metabolic health alters host
metabolism in parallel with changes in systemic xeno-metabolites of gut origin. PloS One 9,
e84260.
Referencias
169
Cao, P.J., Jin, Y.J., Li, M.E., Zhou, R., and Yang, M.Z. (2016). PGC-1alpha may associated with
the anti-obesity effect of taurine on rats induced by arcuate nucleus lesion. Nutritional
neuroscience 19, 86-93.
Casanello, P., Krause, B.J., Castro-Rodriguez, J.A., and Uauy, R. (2016). [Epigenetics and
obesity]. Revista chilena de pediatria 87, 335-342.
Cha, Y.S. (2008). Effects of L-carnitine on obesity, diabetes, and as an ergogenic aid. Asia Pacific
journal of clinical nutrition 17 Suppl 1, 306-308.
Cheng, J., Li, Y., Wu, G., Zheng, J., Lu, H., Shi, X., and Yang, G. (2014). Ectopic expression of
RBP4 impairs the insulin pathway and inguinal fat deposition in mice. Journal of physiology and
biochemistry 70, 479-486.
Cheng, J., Song, Z.Y., Pu, L., Yang, H., Zheng, J.M., Zhang, Z.Y., Shi, X.E., and Yang, G.S.
(2013). Retinol binding protein 4 affects the adipogenesis of porcine preadipocytes through
insulin signaling pathways. Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologie cellulaire 91,
236-243.
Cheong, H.S., Lee, H.C., Park, B.L., Kim, H., Jang, M.J., Han, Y.M., Kim, S.Y., Kim, Y.S., and
Shin, H.D. (2010). Epigenetic modification of retinoic acid-treated human embryonic stem cells.
BMB reports 43, 830-835.
Chesney, R.W., and Han, X. (2013). Differential regulation of TauT by calcitriol and retinoic acid
via VDR/RXR in LLC-PK1 and MCF-7 cells. Advances in experimental medicine and biology
776, 291-305.
Cho, D.H., Choi, Y.J., Jo, S.A., Nam, J.H., Jung, S.C., and Jo, I. (2005). Retinoic acid decreases
nitric oxide production in endothelial cells: a role of phosphorylation of endothelial nitric oxide
synthase at Ser(1179). Biochemical and biophysical research communications 326, 703-710.
Choi, S.W., and Friso, S. (2010). Epigenetics: A New Bridge between Nutrition and Health.
Advances in nutrition 1, 8-16.
Choong, M.K., and Tsafnat, G. (2012). The implications of biomarker evidence for systematic
reviews. BMC medical research methodology 12, 176.
Cryer, A., and Jones, H.M. (1979). The early development of white adipose tissue. Effects of litter
size on the lipoprotein lipase activity of four adipose-tissue depots, serum immunoreactive insulin
and tissue cellularity during the first four weeks of life in the rat. The biochemical journal 178,
711-724.
Cunningham, J.T., Rodgers, J.T., Arlow, D.H., Vazquez, F., Mootha, V.K., and Puigserver, P.
(2007). mTOR controls mitochondrial oxidative function through a YY1-PGC-1alpha
transcriptional complex. Nature 450, 736-740.
D'Ambrosio, D.N., Clugston, R.D., and Blaner, W.S. (2011). Vitamin A metabolism: an update.
Nutrients 3, 63-103.
Das, B.C., Thapa, P., Karki, R., Das, S., Mahapatra, S., Liu, T.C., Torregroza, I., Wallace, D.P.,
Kambhampati, S., Van Veldhuizen, P., et al. (2014). Retinoic acid signaling pathways in
development and diseases. Bioorganic & medicinal chemistry 22, 673-683.
de Jong, J.M., Larsson, O., Cannon, B., and Nedergaard, J. (2015). A stringent validation of
mouse adipose tissue identity markers. American journal of physiology - endocrinology and
metabolism 308, E1085-1105.
de Mello, V.D., Kolehmanien, M., Schwab, U., Pulkkinen, L., and Uusitupa, M. (2012). Gene
expression of peripheral blood mononuclear cells as a tool in dietary intervention studies: What
do we know so far? Molecular nutrition & food research 56, 1160-1172.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
170
de Oliveira, D.L., Hirotsu, C., Tufik, S., and Andersen, M.L. (2015). Vitamin D and Sleep Apnea:
Beyond a Simple Association. Journal of clinical sleep medicine : JCSM : official publication of
the American academy of sleep medicine 11, 1345.
del Mar Gonzalez-Barroso, M., Pecqueur, C., Gelly, C., Sanchis, D., Alves-Guerra, M.C.,
Bouillaud, F., Ricquier, D., and Cassard-Doulcier, A.M. (2000). Transcriptional activation of the
human ucp1 gene in a rodent cell line. Synergism of retinoids, isoproterenol, and
thiazolidinedione is mediated by a multipartite response element. The Journal of biological
chemistry 275, 31722-31732.
Deminice, R., de Castro, G.S., Brosnan, M.E., and Brosnan, J.T. (2016). Creatine
supplementation as a possible new therapeutic approach for fatty liver disease: early findings.
Amino acids 48, 1983-1991.
Devaux, Y., Grosjean, S., Seguin, C., David, C., Dousset, B., Zannad, F., Meistelman, C., De
Talance, N., Mertes, P.M., and Ungureanu-Longrois, D. (2000). Retinoic acid and host-pathogen
interactions: effects on inducible nitric oxide synthase in vivo. American journal of physiology -
endocrinology and metabolism 279, E1045-1053.
Deveaud, C., Beauvoit, B., Salin, B., Schaeffer, J., and Rigoulet, M. (2004). Regional differences
in oxidative capacity of rat white adipose tissue are linked to the mitochondrial content of mature
adipocytes. Molecular and cellular biochemistry 267, 157-166.
Diaz-Rua, R., Palou, A., and Oliver, P. (2016). Cpt1a gene expression in peripheral blood
mononuclear cells as an early biomarker of diet-related metabolic alterations. Food & nutrition
research 60, 33554.
Ding, C., Gao, D., Wilding, J., Trayhurn, P., and Bing, C. (2012). Vitamin D signalling in adipose
tissue. The British journal of nutrition 108, 1915-1923.
Eelen, G., Verlinden, L., van Camp, M., van Hummelen, P., Marchal, K., de Moor, B., Mathieu,
C., Carmeliet, G., Bouillon, R., and Verstuyf, A. (2004). The effects of 1alpha,25-
dihydroxyvitamin D3 on the expression of DNA replication genes. Journal of bone and mineral
research : the official journal of the American Society for bone and mineral research 19, 133-146.
Erdely, A., Kepka-Lenhart, D., Salmen-Muniz, R., Chapman, R., Hulderman, T., Kashon, M.,
Simeonova, P.P., and Morris, S.M., Jr. (2010). Arginase activities and global arginine
bioavailability in wild-type and ApoE-deficient mice: responses to high fat and high cholesterol
diets. Plos one 5, e15253.
Escribese, M.M., Conde, E., Saenz-Morales, D., Hordijk, P.L., and Garcia-Bermejo, M.L. (2008).
Mononuclear cell extravasation in an inflammatory response is abrogated by all-trans-retinoic
acid through inhibiting the acquisition of an appropriate migratory phenotype. Journal of
pharmacology and experimental therapeutics 324, 454-462.
Esteller, M., Guo, M., Moreno, V., Peinado, M.A., Capella, G., Galm, O., Baylin, S.B., and
Herman, J.G. (2002). Hypermethylation-associated Inactivation of the Cellular Retinol-Binding-
Protein 1 Gene in Human Cancer. Cancer research 62, 5902-5905.
Fajas, L., Auboeuf, D., Raspe, E., Schoonjans, K., Lefebvre, A.M., Saladin, R., Najib, J., Laville,
M., Fruchart, J.C., Deeb, S., et al. (1997). The organization, promoter analysis, and expression of
the human PPARgamma gene. Journal of biological chemistry 272, 18779-18789.
Fajas, L., Landsberg, R.L., Huss-Garcia, Y., Sardet, C., Lees, J.A., and Auwerx, J. (2002). E2Fs
regulate adipocyte differentiation. Developmental cell 3, 39-49.
Fan, S., and Zhang, X. (2009). CpG island methylation pattern in different human tissues and its
correlation with gene expression. Biochemical and biophysical research communications 383,
421-425.
Fazi, F., Travaglini, L., Carotti, D., Palitti, F., Diverio, D., Alcalay, M., McNamara, S., Miller,
W.H., Jr., Lo Coco, F., Pelicci, P.G., et al. (2005). Retinoic acid targets DNA-methyltransferases
Referencias
171
and histone deacetylases during APL blast differentiation in vitro and in vivo. Oncogene 24, 1820-
1830.
Feigin, A. (2004). Evidence from biomarkers and surrogate endpoints. NeuroRx : the journal of
the American Society for Experimental Neurotherapeutics 1, 323-330.
Felig, P., Marliss, E., and Cahill, G.F., Jr. (1969). Plasma amino acid levels and insulin secretion
in obesity. New England journal of medicine 281, 811-816.
Felipe, F., Bonet, M.L., Ribot, J., and Palou, A. (2003). Up-regulation of muscle uncoupling
protein 3 gene expression in mice following high fat diet, dietary vitamin A supplementation and
acute retinoic acid-treatment. International journal of obesity 27, 60-69.
Felipe, F., Bonet, M.L., Ribot, J., and Palou, A. (2004). Modulation of resistin expression by
retinoic acid and vitamin A status. Diabetes 53, 882-889.
Felipe, F., Mercader, J., Ribot, J., Palou, A., and Bonet, M.L. (2005). Effects of retinoic acid
administration and dietary vitamin A supplementation on leptin expression in mice: lack of
correlation with changes of adipose tissue mass and food intake. Biochimica et biophysica acta
1740, 258-265.
Feng, Y., Zhao, L.Z., Hong, L., Shan, C., Shi, W., and Cai, W. (2013). Alteration in methylation
pattern of GATA-4 promoter region in vitamin A-deficient offspring's heart. Journal of nutritional
biochemistry 24, 1373-1380.
Flachs, P., Rossmeisl, M., Kuda, O., and Kopecky, J. (2013). Stimulation of mitochondrial
oxidative capacity in white fat independent of UCP1: a key to lean phenotype. Biochimica et
biophysica acta 1831, 986-1003.
Fleckenstein-Elsen, M., Dinnies, D., Jelenik, T., Roden, M., Romacho, T., and Eckel, J. (2016).
Eicosapentaenoic acid and arachidonic acid differentially regulate adipogenesis, acquisition of a
brite phenotype and mitochondrial function in primary human adipocytes. Molecular nutrition &
food research 60, 2065-2075.
Friebe, D., Neef, M., Erbs, S., Dittrich, K., Kratzsch, J., Kovacs, P., Bluher, M., Kiess, W., and
Korner, A. (2011). Retinol binding protein 4 (RBP4) is primarily associated with adipose tissue
mass in children. International journal of pediatric obesity : IJPO : an official journal of the
International Association for the study of obesity 6, e345-352.
Fujiki, K., Kano, F., Shiota, K., and Murata, M. (2009). Expression of the peroxisome proliferator
activated receptor gamma gene is repressed by DNA methylation in visceral adipose tissue of
mouse models of diabetes. BMC biology 7, 38.
Gao, C.L., Liu, G.L., Liu, S., Chen, X.H., Ji, C.B., Zhang, C.M., Xia, Z.K., and Guo, X.R. (2011).
Overexpression of PGC-1beta improves insulin sensitivity and mitochondrial function in 3T3-L1
adipocytes. Molecular and cellular biochemistry 353, 215-223.
Garcia, R.A., Roemmich, J.N., and Claycombe, K.J. (2016). Evaluation of markers of beige
adipocytes in white adipose tissue of the mouse. Nutrition & Metabolism (London) 13, 24.
García-Ruiz, E., Reynés, B., Díaz-Rúa, R., Ceresi, E., Oliver, P., and Palou, A. (2015). The intake
of high-fat diets induces the acquisition of brown adipocyte gene expression features in white
adipose tissue. International journal of obesity (London) 39, 1619-1629.
Giralt, M., and Villarroya, F. (2013). White, brown, beige/brite: different adipose cells for
different functions? Endocrinology 154, 2992-3000.
Go, Y.M., and Jones, D.P. (2011). Cysteine/cystine redox signaling in cardiovascular disease.
Free radical biology & medicine 50, 495-509.
Gopalan, V., Michael, N., Ishino, S., Lee, S.S., Yang, A.Y., Bhanu Prakash, K.N., Yaligar, J.,
Sadananthan, S.A., Kaneko, M., Zhou, Z., et al. (2016). Effect of Exercise and Calorie Restriction
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
172
on Tissue Acylcarnitines, Tissue Desaturase Indices, and Fat Accumulation in Diet-Induced
Obese Rats. Scientific reports 6, 26445.
Gottesman, M.E., Quadro, L., and Blaner, W.S. (2001). Studies of vitamin A metabolism in
mouse model systems. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental
biology 23, 409-419.
Granados, N., Amengual, J., Ribot, J., Musinovic, H., Ceresi, E., von Lintig, J., Palou, A., and
Bonet, M.L. (2013). Vitamin A supplementation in early life affects later response to an
obesogenic diet in rats. International journal of obesity 37, 1169-1176.
Gualano, B., Roschel, H., Lancha-Jr, A.H., Brightbill, C.E., and Rawson, E.S. (2012). In sickness
and in health: the widespread application of creatine supplementation. Amino acids 43, 519-529.
Gupta, R.K., Arany, Z., Seale, P., Mepani, R.J., Ye, L., Conroe, H.M., Roby, Y.A., Kulaga, H.,
Reed, R.R., and Spiegelman, B.M. (2010). Transcriptional control of preadipocyte determination
by Zfp423. Nature 464, 619-623.
Harrison, E.H. (2012). Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and
provitamin A carotenoids. Biochimica et biophysica acta 1821, 70-77.
He, Y., Gong, L., Fang, Y., Zhan, Q., Liu, H.X., Lu, Y., Guo, G.L., Lehman-McKeeman, L.,
Fang, J., and Wan, Y.J. (2013). The role of retinoic acid in hepatic lipid homeostasis defined by
genomic binding and transcriptome profiling. BMC genomics 14, 575.
Hessel, S., Eichinger, A., Isken, A., Amengual, J., Hunzelmann, S., Hoeller, U., Elste, V.,
Hunziker, W., Goralczyk, R., Oberhauser, V., et al. (2007). CMO1 deficiency abolishes vitamin
A production from beta-carotene and alters lipid metabolism in mice. Journal of biological
chemistry 282, 33553-33561.
Horakova, O., Hansikova, J., Bardova, K., Gardlo, A., Rombaldova, M., Kuda, O., Rossmeisl,
M., and Kopecky, J. (2016). Plasma Acylcarnitines and Amino Acid Levels As an Early Complex
Biomarker of Propensity to High-Fat Diet-Induced Obesity in Mice. PLoS One 11, e0155776.
Horakova, O., Medrikova, D., van Schothorst, E.M., Bunschoten, A., Flachs, P., Kus, V., Kuda,
O., Bardova, K., Janovska, P., Hensler, M., et al. (2012). Preservation of metabolic flexibility in
skeletal muscle by a combined use of n-3 PUFA and rosiglitazone in dietary obese mice. PLoS
One 7, e43764.
Hore, T.A., von Meyenn, F., Ravichandran, M., Bachman, M., Ficz, G., Oxley, D., Santos, F.,
Balasubramanian, S., Jurkowski, T.P., and Reik, W. (2016). Retinol and ascorbate drive erasure
of epigenetic memory and enhance reprogramming to naive pluripotency by complementary
mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
113, 12202-12207.
Hsu, S.M., and Raine, L. (1981). Protein A, avidin, and biotin in immunohistochemistry. Journal
of histochemistry and cytochemistry 29, 1349-1353.
Inadera, H. (2013). Developmental origins of obesity and type 2 diabetes: molecular aspects and
role of chemicals. Environmental health and preventive medicine 18, 185-197.
Ivanisevic, J., Elias, D., Deguchi, H., Averell, P.M., Kurczy, M., Johnson, C.H., Tautenhahn, R.,
Zhu, Z., Watrous, J., Jain, M., et al. (2015). Arteriovenous Blood Metabolomics: A Readout of
Intra-Tissue Metabostasis. Scientific reports 5, 12757.
Jessen, K.A., and Satre, M.A. (2000). Mouse retinol binding protein gene: cloning, expression
and regulation by retinoic acid. Molecular and cellular biochemistry 211, 85-94.
Jeyakumar, S.M., and Vajreswari, A. (2015). Vitamin A as a key regulator of obesity & its
associated disorders: Evidences from an obese rat model. Indian journal of medical research 141,
275-284.
Referencias
173
Ji, H., Lu, R.H., Chang, Z.G., Su, S.S., and Yang, G.S. (2012). PGC-1beta modulates the
expression of genes involved in mitochondrial function and adipogenesis during preadipocyte
differentiation. Reproduction in domestic animals = Zuchthygiene 47, 419-427.
Jiang, M., Zhang, Y., Fei, J., Chang, X., Fan, W., Qian, X., Zhang, T., and Lu, D. (2010). Rapid
quantification of DNA methylation by measuring relative peak heights in direct bisulfite-PCR
sequencing traces. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology 90,
282-290.
Jimenez-Chillaron, J.C., Diaz, R., Martinez, D., Pentinat, T., Ramon-Krauel, M., Ribo, S., and
Plosch, T. (2012). The role of nutrition on epigenetic modifications and their implications on
health. Biochimie 94, 2242-2263.
Jung, U.J., Seo, Y.R., Ryu, R., and Choi, M.S. (2016). Differences in metabolic biomarkers in the
blood and gene expression profiles of peripheral blood mononuclear cells among normal weight,
mildly obese and moderately obese subjects. British journal of nutrition 116, 1022-1032.
Kane, M.A., Folias, A.E., and Napoli, J.L. (2008a). HPLC/UV quantitation of retinal, retinol, and
retinyl esters in serum and tissues. Analytical biochemistry 378, 71-79.
Kane, M.A., Folias, A.E., Wang, C., and Napoli, J.L. (2008b). Quantitative profiling of
endogenous retinoic acid in vivo and in vitro by tandem mass spectrometry. Analytical chemistry
80, 1702-1708.
Keijer, J., Bunschoten, A., Palou, A., and Franssen-van Hal, N.L. (2005). Beta-carotene and the
application of transcriptomics in risk-benefit evaluation of natural dietary components.
Biochimica et biophysica acta 1740, 139-146.
Kersten, S., Desvergne, B., and Wahli, W. (2000). Roles of PPARs in health and disease. Nature
405, 421-424.
Kiec-Wilk, B., Polus, A., Mikolajczyk, M., and Mathers, J.C. (2007). Beta-carotene and
arachidonic acid induced DNA methylation and the regulation of pro-chemotactic activity of
endothelial cells and its progenitors. Journal of physiology and pharmacology : an official journal
of the Polish Physiological Society 58, 757-766.
Kiec-Wilk, B., Razny, U., Mathers, J.C., and Dembinska-Kiec, A. (2009). DNA methylation,
induced by beta-carotene and arachidonic acid, plays a regulatory role in the pro-angiogenic
VEGF-receptor (KDR) gene expression in endothelial cells. Journal of physiology and
pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society 60, 49-53.
Kiefer, F.W., Orasanu, G., Nallamshetty, S., Brown, J.D., Wang, H., Luger, P., Qi, N.R., Burant,
C.F., Duester, G., and Plutzky, J. (2012). Retinaldehyde dehydrogenase 1 coordinates hepatic
gluconeogenesis and lipid metabolism. Endocrinology 153, 3089-3099.
Kim, G.S., Chevli, K.D., and Fitch, C.D. (1983). Fasting modulates creatine entry into skeletal
muscle in the mouse. Experientia 39, 1360-1362.
Kim, J., Okla, M., Erickson, A., Carr, T., Natarajan, S.K., and Chung, S. (2016). Eicosapentaenoic
Acid Potentiates Brown Thermogenesis through FFAR4-dependent Up-regulation of miR-30b
and miR-378. Journal of biological chemistry 291, 20551-20562.
Kim, M., Goto, T., Yu, R., Uchida, K., Tominaga, M., Kano, Y., Takahashi, N., and Kawada, T.
(2015). Fish oil intake induces UCP1 upregulation in brown and white adipose tissue via the
sympathetic nervous system. Scientific reports 5, 18013.
Kintscher, U., and Law, R.E. (2005). PPARgamma-mediated insulin sensitization: the importance
of fat versus muscle. American journal of physiology - endocrinology and metabolism 288, E287-
291.
Kiskinis, E., Hallberg, M., Christian, M., Olofsson, M., Dilworth, S.M., White, R., and Parker,
M.G. (2007). RIP140 directs histone and DNA methylation to silence Ucp1 expression in white
adipocytes. The EMBO journal 26, 4831-4840.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
174
Klose, R.J., and Bird, A.P. (2006). Genomic DNA methylation: the mark and its mediators.
Trends in biochemical sciences 31, 89-97.
Kojima, T., Nishimura, M., Yajima, T., Kuwata, T., Suzuki, Y., Goda, T., Takase, S., and Harada,
E. (1998). Effect of intermittent feeding on the development of disaccharidase activities in
artificially reared rat pups. Comparative biochemistry and physiology part A: Molecular &
integrative physiology 121, 289-297.
Koppen, A., and Kalkhoven, E. (2010). Brown vs white adipocytes: the PPARgamma coregulator
story. FEBS Lett 584, 3250-3259.
Kotnik, P., Fischer-Posovszky, P., and Wabitsch, M. (2011). RBP4: a controversial adipokine.
European journal of endocrinology 165, 703-711.
Koves, T.R., Ussher, J.R., Noland, R.C., Slentz, D., Mosedale, M., Ilkayeva, O., Bain, J., Stevens,
R., Dyck, J.R., Newgard, C.B., et al. (2008). Mitochondrial overload and incomplete fatty acid
oxidation contribute to skeletal muscle insulin resistance. Cell metabolism 7, 45-56.
Kozak, U.C., Kopecky, J., Teisinger, J., Enerback, S., Boyer, B., and Kozak, L.P. (1994). An
upstream enhancer regulating brown-fat-specific expression of the mitochondrial uncoupling
protein gene. Molecular and cellular biology 14, 59-67.
Kraunsoe, R., Boushel, R., Hansen, C.N., Schjerling, P., Qvortrup, K., Stockel, M., Mikines, K.J.,
and Dela, F. (2010). Mitochondrial respiration in subcutaneous and visceral adipose tissue from
patients with morbid obesity. Journal of physiology 588, 2023-2032.
Kubota, N., Terauchi, Y., Miki, H., Tamemoto, H., Yamauchi, T., Komeda, K., Satoh, S., Nakano,
R., Ishii, C., Sugiyama, T., et al. (1999). PPAR gamma mediates high-fat diet-induced adipocyte
hypertrophy and insulin resistance. Molecular cell 4, 597-609.
Kumar, M.V., Sunvold, G.D., and Scarpace, P.J. (1999). Dietary vitamin A supplementation in
rats: suppression of leptin and induction of UCP1 mRNA. Journal of lipid research 40, 824-829.
Kuriyama, M., Udagawa, A., Yoshimoto, S., Ichinose, M., Sato, K., Yamazaki, K., Matsuno, Y.,
Shiota, K., and Mori, C. (2008). DNA methylation changes during cleft palate formation induced
by retinoic acid in mice. The Cleft palate-craniofacial journal : official publication of the
American Cleft Palate-Craniofacial Association 45, 545-551.
Lai, L.J., Wu, L.T., Chung, J.G., Huang, L.J., Liau, M.C., and Kuo, S.C. (1997). All-trans-retinoic
acid and indole-3-acetic acid inhibit methionine adenosyltransferase activity in human tumor
cells. Journal of Chinese pharmaceutical sciences 49.
Landrier, J.F., Marcotorchino, J., and Tourniaire, F. (2012). Lipophilic micronutrients and
adipose tissue biology. Nutrients 4, 1622-1649.
Landsberg, R.L., Sero, J.E., Danielian, P.S., Yuan, T.L., Lee, E.Y., and Lees, J.A. (2003). The
role of E2F4 in adipogenesis is independent of its cell cycle regulatory activity. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 2456-2461.
Lescuyer, P., Martinez, P., and Lunardi, J. (2002). YY1 and Sp1 activate transcription of the
human NDUFS8 gene encoding the mitochondrial complex I TYKY subunit. Biochimica et
biophysica acta 1574, 164-174.
Lesnefsky, E.J., He, D., Moghaddas, S., and Hoppel, C.L. (2006). Reversal of mitochondrial
defects before ischemia protects the aged heart. FASEB journal : official publication of the
Federation of American Societies for Experimental Biology 20, 1543-1545.
Li, L.C., and Dahiya, R. (2002). MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.
Bioinformatics 18, 1427-1431.
Liang, X., Yang, Q., Fu, X., Rogers, C.J., Wang, B., Pan, H., Zhu, M.J., Nathanielsz, P.W., and
Du, M. (2016). Maternal obesity epigenetically alters visceral fat progenitor cell properties in
male offspring mice. Journal of physiology 594, 4453-4466.
Referencias
175
Liaset, B., Hao, Q., Jorgensen, H., Hallenborg, P., Du, Z.Y., Ma, T., Marschall, H.U., Kruhoffer,
M., Li, R., Li, Q., et al. (2011). Nutritional regulation of bile acid metabolism is associated with
improved pathological characteristics of the metabolic syndrome. Journal of biological chemistry
286, 28382-28395.
Lien, L.F., Haqq, A.M., Arlotto, M., Slentz, C.A., Muehlbauer, M.J., McMahon, R.L., Rochon,
J., Gallup, D., Bain, J.R., Ilkayeva, O., et al. (2009). The STEDMAN project: biophysical,
biochemical and metabolic effects of a behavioral weight loss intervention during weight loss,
maintenance, and regain. Omics : a journal of integrative biology 13, 21-35.
Liew, C.C., Ma, J., Tang, H.C., Zheng, R., and Dempsey, A.A. (2006). The peripheral blood
transcriptome dynamically reflects system wide biology: a potential diagnostic tool. Journal of
laboratory and clinical medicine 147, 126-132.
Lillycrop, K.A., and Burdge, G.C. (2012). Epigenetic mechanisms linking early nutrition to long
term health. Best practice & research clinical endocrinology & metabolism 26, 667-676.
Lim, J.S., Park, S.H., and Jang, K.L. (2011). All-trans retinoic acid induces cellular senescence
by up-regulating levels of p16 and p21 via promoter hypomethylation. Biochemical and
biophysical research communications 412, 500-505.
Liu, Y., Chen, H., Mu, D., Fan, J., Song, J., Zhong, Y., Li, D., and Xia, M. (2016). Circulating
Retinoic Acid Levels and the Development of Metabolic Syndrome. Journal of clinical
endocrinology & metabolism 101, 1686-1692.
Lo, K.A., and Sun, L. (2013). Turning WAT into BAT: a review on regulators controlling the
browning of white adipocytes. Bioscience reports 33.
Lo, Y.H., Ho, P.C., Chen, M.S., Hugo, E., Ben-Jonathan, N., and Wang, S.C. (2013).
Phosphorylation at tyrosine 114 of Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) is required for
adipogenesis in response to high fat diet. Biochemical and biophysical research communications
430, 43-48.
Lobo, G.P., Amengual, J., Li, H.N., Golczak, M., Bonet, M.L., Palczewski, K., and von Lintig, J.
(2010). Beta,beta-carotene decreases peroxisome proliferator receptor gamma activity and
reduces lipid storage capacity of adipocytes in a beta,beta-carotene oxygenase 1-dependent
manner. Journal of biological chemistry 285, 27891-27899.
Long, J.Z., Svensson, K.J., Tsai, L., Zeng, X., Roh, H.C., Kong, X., Rao, R.R., Lou, J., Lokurkar,
I., Baur, W., et al. (2014). A smooth muscle-like origin for beige adipocytes. Cell metabolism 19,
810-820.
Longo, N., Amat di San Filippo, C., and Pasquali, M. (2006). Disorders of carnitine transport and
the carnitine cycle. American journal of medical genetics part C, Seminars in medical genetics
142C, 77-85.
Marchildon, F., St-Louis, C., Akter, R., Roodman, V., and Wiper-Bergeron, N.L. (2010).
Transcription factor Smad3 is required for the inhibition of adipogenesis by retinoic acid. Journal
of biological chemistry 285, 13274-13284.
Marshall, O.J. (2004). PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite
and real-time PCR. Bioinformatics 20, 2471-2472.
McCoin, C.S., Knotts, T.A., and Adams, S.H. (2015). Acylcarnitines--old actors auditioning for
new roles in metabolic physiology. Nature reviews Eendocrinology 11, 617-625.
McMullen, M.H., Rowling, M.J., Ozias, M.K., and Schalinske, K.L. (2002). Activation and
induction of glycine N-methyltransferase by retinoids are tissue- and gender-specific. Archives
of biochemistry and biophysics 401, 73-80.
Mercader, J., Granados, N., Bonet, M.L., and Palou, A. (2008). All-trans retinoic acid decreases
murine adipose retinol binding protein 4 production. Cellular physiology and piochemistry 22,
363-372.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
176
Mercader, J., Madsen, L., Felipe, F., Palou, A., Kristiansen, K., and Bonet, M.L. (2007). All-trans
retinoic acid increases oxidative metabolism in mature adipocytes. Cellular physiology and
biochemistry 20, 1061-1072.
Mercader, J., Palou, A., and Bonet, M.L. (2010). Induction of uncoupling protein-1 in mouse
embryonic fibroblast-derived adipocytes by retinoic acid. Obesity (Silver Spring) 18, 655-662.
Mercader, J., Ribot, J., Murano, I., Felipe, F., Cinti, S., Bonet, M.L., and Palou, A. (2006).
Remodeling of white adipose tissue after retinoic acid administration in mice. Endocrinology 147,
5325-5332.
Merheb, M., Daher, R.T., Nasrallah, M., Sabra, R., Ziyadeh, F.N., and Barada, K. (2007). Taurine
intestinal absorption and renal excretion test in diabetic patients: a pilot study. Diabetes care 30,
2652-2654.
Miard, S., and Fajas, L. (2005). Atypical transcriptional regulators and cofactors of PPARgamma.
International journal of obesity 29 Suppl 1, S10-12.
Miftakhova, R., Sandberg, T., Hedblom, A., Nevzorova, T., Persson, J.L., and Bredberg, A.
(2012). DNA methylation in ATRA-treated leukemia cell lines lacking a PML-RAR chromosome
translocation. Anticancer research 32, 4715-4722.
Mihalik, S.J., Goodpaster, B.H., Kelley, D.E., Chace, D.H., Vockley, J., Toledo, F.G., and
DeLany, J.P. (2010). Increased levels of plasma acylcarnitines in obesity and type 2 diabetes and
identification of a marker of glucolipotoxicity. Obesity (Silver Spring) 18, 1695-1700.
Mitschke, M.M., Hoffmann, L.S., Gnad, T., Scholz, D., Kruithoff, K., Mayer, P., Haas, B.,
Sassmann, A., Pfeifer, A., and Kilic, A. (2013). Increased cGMP promotes healthy expansion and
browning of white adipose tissue. FASEB journal : official publication of the Federation of
American Societies for Experimental Biology 27, 1621-1630.
Mo, L., Shen, J., Liu, Q., Zhang, Y., Kuang, J., Pu, S., Cheng, S., Zou, M., Jiang, W., Jiang, C.,
et al. (2016). Irisin Is Regulated by CAR in Liver and Is a Mediator of Hepatic Glucose and Lipid
Metabolism. Molecular endocrinology 30, 533-542.
Moldovan, G.L., Pfander, B., and Jentsch, S. (2007). PCNA, the maestro of the replication fork.
Cell 129, 665-679.
Moore, L.D., Le, T., and Fan, G. (2013). DNA methylation and its basic function.
Neuropsychopharmacology 38, 23-38.
Moreno-Navarrete, J.M., Ortega, F., Serrano, M., Guerra, E., Pardo, G., Tinahones, F., Ricart,
W., and Fernandez-Real, J.M. (2013). Irisin is expressed and produced by human muscle and
adipose tissue in association with obesity and insulin resistance. Journal of clinical endocrinology
& metabolism 98, E769-778.
Mourey, M.S., Quadro, L., Panariello, L., and Colantuoni, V. (1994). Retinoids regulate
expression of the retinol-binding protein gene in hepatoma cells in culture. Journal of cellular
physiology 160, 596-602.
Muenzner, M., Tuvia, N., Deutschmann, C., Witte, N., Tolkachov, A., Valai, A., Henze, A.,
Sander, L.E., Raila, J., and Schupp, M. (2013). Retinol-binding protein 4 and its membrane
receptor STRA6 control adipogenesis by regulating cellular retinoid homeostasis and retinoic acid
receptor alpha activity. Molecular and cellular biology 33, 4068-4082.
Muhlhausler, B.S., and Ailhaud, G.P. (2013). Omega-6 polyunsaturated fatty acids and the early
origins of obesity. Current opinion in endocrinology, diabetes, and obesity 20, 56-61.
Muoio, D.M., and Koves, T.R. (2007). Lipid-induced metabolic dysfunction in skeletal muscle.
Novartis Foundation symposium 286, 24-38; discussion 38-46, 162-163, 196-203.
Murakami, S. (2015). Role of taurine in the pathogenesis of obesity. Molecular nutrition & food
research 59, 1353-1363.
Referencias
177
Murholm, M., Isidor, M.S., Basse, A.L., Winther, S., Sørensen, C., Skovgaard-Petersen, J.,
Nielsen, M.M., Hansen, A.S., Quistorff, B., and Hansen, J.B. (2013). Retinoic acid has different
effects on UCP1 expression in mouse and human adipocytes. BMC Cell biology 14, 41.
Musinovic, H., Bonet, M.L., Granados, N., Amengual, J., von Lintig, J., Ribot, J., and Palou, A.
(2014). beta-Carotene during the suckling period is absorbed intact and induces retinoic acid
dependent responses similar to preformed vitamin A in intestine and liver, but not adipose tissue
of young rats. Molecular nutrition & food research 58, 2157-2165.
Mutt, S.J., Hypponen, E., Saarnio, J., Jarvelin, M.R., and Herzig, K.H. (2014). Vitamin D and
adipose tissue-more than storage. Frontiers in physiology 5, 228.
Nardelli, T.R., Ribeiro, R.A., Balbo, S.L., Vanzela, E.C., Carneiro, E.M., Boschero, A.C., and
Bonfleur, M.L. (2011). Taurine prevents fat deposition and ameliorates plasma lipid profile in
monosodium glutamate-obese rats. Amino acids 41, 901-908.
Navarro, E., Funtikova, A.N., Fito, M., and Schroder, H. (2016). Prenatal nutrition and the risk
of adult obesity: Long-term effects of nutrition on epigenetic mechanisms regulating Gene
expression. Journal of nutritional biochemistry 39, 1-14.
Newgard, C.B. (2012). Interplay between lipids and branched-chain amino acids in development
of insulin resistance. Cell metabolism 15, 606-614.
Newgard, C.B., An, J., Bain, J.R., Muehlbauer, M.J., Stevens, R.D., Lien, L.F., Haqq, A.M., Shah,
S.H., Arlotto, M., Slentz, C.A., et al. (2009). A branched-chain amino acid-related metabolic
signature that differentiates obese and lean humans and contributes to insulin resistance. Cell
metabolism 9, 311-326.
Niculescu, M.D. (2012). Nutritional epigenetics. ILAR journal 53, 270-278.
Nisoli, E., Tonello, C., Briscini, L., and Carruba, M.O. (1997). Inducible nitric oxide synthase in
rat brown adipocytes: implications for blood flow to brown adipose tissue. Endocrinology 138,
676-682.
Noland, R.C., Koves, T.R., Seiler, S.E., Lum, H., Lust, R.M., Ilkayeva, O., Stevens, R.D.,
Hegardt, F.G., and Muoio, D.M. (2009). Carnitine insufficiency caused by aging and
overnutrition compromises mitochondrial performance and metabolic control. Journal of
biological chemistry 284, 22840-22852.
Norseen, J., Hosooka, T., Hammarstedt, A., Yore, M.M., Kant, S., Aryal, P., Kiernan, U.A.,
Phillips, D.A., Maruyama, H., Kraus, B.J., et al. (2012). Retinol-binding protein 4 inhibits insulin
signaling in adipocytes by inducing proinflammatory cytokines in macrophages through a c-Jun
N-terminal kinase- and toll-like receptor 4-dependent and retinol-independent mechanism.
Molecular and cellular biology 32, 2010-2019.
Noy, N. (2013). The one-two punch: Retinoic acid suppresses obesity both by promoting energy
expenditure and by inhibiting adipogenesis. Adipocyte 2, 184-187.
Osth, M., Ost, A., Kjolhede, P., and Stralfors, P. (2014). The concentration of beta-carotene in
human adipocytes, but not the whole-body adipocyte stores, is reduced in obesity. PLoS One 9,
e85610.
Otten, J.J., Pitzi Hellwig, J., and Meyers, L.D. (2006). Dietary Reference Intakes: The Essential
Guide to Nutrient Requirements (Washington, DC: The National Academies Press).
Ozpolat, B., Mehta, K., and Lopez-Berestein, G. (2005). Regulation of a highly specific retinoic
acid-4-hydroxylase (CYP26A1) enzyme and all-trans-retinoic acid metabolism in human
intestinal, liver, endothelial, and acute promyelocytic leukemia cells. Leukemia & lymphoma 46,
1497-1506.
Palou, A., Picó, C., Bonet, M.L., and Oliver, P. (1998). The uncoupling protein, thermogenin.
International journal of biochemistry and cell biology 30, 7-11.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
178
Panariello, L., Quadro, L., Trematerra, S., and Colantuoni, V. (1996). Identification of a novel
retinoic acid response element in the promoter region of the retinol-binding protein gene. Journal
of biological chemistry 271, 25524-25532.
Pandke, K.E., Mullen, K.L., Snook, L.A., Bonen, A., and Dyck, D.J. (2008). Decreasing
intramuscular phosphagen content simultaneously increases plasma membrane FAT/CD36 and
GLUT4 transporter abundance. American journal of physiology - regulatory, integrative and
comparative physiology 295, R806-813.
Pardo, R., Enguix, N., Lasheras, J., Feliu, J.E., Kralli, A., and Villena, J.A. (2011). Rosiglitazone-
induced mitochondrial biogenesis in white adipose tissue is independent of peroxisome
proliferator-activated receptor gamma coactivator-1alpha. PloS One 6, e26989.
Park, A., Kim, W.K., and Bae, K.H. (2014). Distinction of white, beige and brown adipocytes
derived from mesenchymal stem cells. World journal of stem cell 6, 33-42.
Park, T., and Lee, K. (1998). Dietary taurine supplementation reduces plasma and liver cholesterol
and triglyceride levels in rats fed a high-cholesterol or a cholesterol-free diet. Advances in
experimental medicine and biology 442, 319-325.
Parle-McDermott, A., and Ozaki, M. (2011). The impact of nutrition on differential methylated
regions of the genome. Advances in nutrition 2, 463-471.
Perumal, J., Sriram, S., Lim, H.Q., Olivo, M., and Sugii, S. (2016). Retinoic acid is abundantly
detected in different depots of adipose tissue by SERS. Adipocyte 5, 378-383.
Pesce, V., Fracasso, F., Cassano, P., Lezza, A.M., Cantatore, P., and Gadaleta, M.N. (2010).
Acetyl-L-carnitine supplementation to old rats partially reverts the age-related mitochondrial
decay of soleus muscle by activating peroxisome proliferator-activated receptor gamma
coactivator-1alpha-dependent mitochondrial biogenesis. Rejuvenation research 13, 148-151.
Petrov, P.D., Bonet, M.L., Reynes, B., Oliver, P., Palou, A., and Ribot, J. (2016a). Whole Blood
RNA as a Source of Transcript-Based Nutrition- and Metabolic Health-Related Biomarkers. PLoS
One 11, e0155361.
Petrov, P.D., Palou, A., Bonet, M.L., and Ribot, J. (2016b). Cell-Autonomous Brown-Like
Adipogenesis of Preadipocytes From Retinoblastoma Haploinsufficient Mice. Journal of cellular
physiology 231, 1941-1952.
Petrovic, N., Shabalina, I.G., Timmons, J.A., Cannon, B., and Nedergaard, J. (2008).
Thermogenically competent nonadrenergic recruitment in brown preadipocytes by a
PPARgamma agonist. American journal of physiology - endocrinology and metabolism 295,
E287-296.
Petrovic, N., Walden, T.B., Shabalina, I.G., Timmons, J.A., Cannon, B., and Nedergaard, J.
(2010). Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of
epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically
competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.
Journal of biological chemistry 285, 7153-7164.
Pico, C., and Palou, A. (2013). Perinatal programming of obesity: an introduction to the topic.
Frontiers in physiology 4, 255.
Pico, C., Palou, M., Priego, T., Sanchez, J., and Palou, A. (2012). Metabolic programming of
obesity by energy restriction during the perinatal period: different outcomes depending on gender
and period, type and severity of restriction. Frontiers in physiology 3, 436.
Pinto, C.L., Botelho, P.B., Pimentel, G.D., Campos-Ferraz, P.L., and Mota, J.F. (2016). Creatine
supplementation and glycemic control: a systematic review. Amino acids 48, 2103-2129.
Pisani, D.F., Ghandour, R.A., Beranger, G.E., Le Faouder, P., Chambard, J.C., Giroud, M.,
Vegiopoulos, A., Djedaini, M., Bertrand-Michel, J., Tauc, M., et al. (2014). The omega6-fatty
Referencias
179
acid, arachidonic acid, regulates the conversion of white to brite adipocyte through a
prostaglandin/calcium mediated pathway. Molecular metabolism 3, 834-847.
Poirier, Y., Antonenkov, V.D., Glumoff, T., and Hiltunen, J.K. (2006). Peroxisomal beta-
oxidation--a metabolic pathway with multiple functions. Biochimica et biophysica acta 1763,
1413-1426.
Power, R.A., Hulver, M.W., Zhang, J.Y., Dubois, J., Marchand, R.M., Ilkayeva, O., Muoio, D.M.,
and Mynatt, R.L. (2007). Carnitine revisited: potential use as adjunctive treatment in diabetes.
Diabetologia 50, 824-832.
Priego, T., Sánchez, J., García, A.P., Palou, A., and Picó, C. (2013). Maternal dietary fat affects
milk fatty acid profile and impacts on weight gain and thermogenic capacity of suckling rats.
Lipids 48, 481-495.
Puigserver, P., Vázquez, F., Bonet, M.L., Picó, C., and Palou, A. (1996). In vitro and in vivo
induction of brown adipocyte uncoupling protein (thermogenin) by retinoic acid. Biochemical
journal 317 ( Pt 3), 827-833.
Qin, X., Park, H.G., Zhang, J.Y., Lawrence, P., Liu, G., Subramanian, N., Kothapalli, K.S., and
Brenna, J.T. (2016). Brown but not white adipose cells synthesize omega-3 docosahexaenoic acid
in culture. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids 104, 19-24.
Quesada-Lopez, T., Cereijo, R., Turatsinze, J.V., Planavila, A., Cairo, M., Gavalda-Navarro, A.,
Peyrou, M., Moure, R., Iglesias, R., Giralt, M., et al. (2016). The lipid sensor GPR120 promotes
brown fat activation and FGF21 release from adipocytes. Nature communications 7, 13479.
Rauschert, S., Uhl, O., Koletzko, B., and Hellmuth, C. (2014). Metabolomic biomarkers for
obesity in humans: a short review. Annals of nutrition & metabolism 64, 314-324.
Redman, L.M., Huffman, K.M., Landerman, L.R., Pieper, C.F., Bain, J.R., Muehlbauer, M.J.,
Stevens, R.D., Wenner, B.R., Kraus, V.B., Newgard, C.B., et al. (2011). Effect of caloric
restriction with and without exercise on metabolic intermediates in nonobese men and women.
Journal of clinical endocrinology and metabolism 96, E312-321.
Reichert, B., Yasmeen, R., Jeyakumar, S.M., Yang, F., Thomou, T., Alder, H., Duester, G.,
Maiseyeu, A., Mihai, G., Harrison, E.H., et al. (2011). Concerted action of aldehyde
dehydrogenases influences depot-specific fat formation. Molecular endocrinology 25, 799-809.
Reuter, S.E., and Evans, A.M. (2012). Carnitine and acylcarnitines: pharmacokinetic,
pharmacological and clinical aspects. Clinical pharmacokinetics 51, 553-572.
Reynes, B., Diaz-Rua, R., Cifre, M., Oliver, P., and Palou, A. (2015). Peripheral blood
mononuclear cells as a potential source of biomarkers to test the efficacy of weight-loss strategies.
Obesity (Silver Spring) 23, 28-31.
Reynés, B., García-Ruiz, E., Palou, A., and Oliver, P. (2016). The intake of high fat diets induces
an obesogenic profile in peripheral blood mononuclear cells which is reverted by dieting. British
journal of nutrition 115, 1887-1895.
Rhee, E.J., and Plutzky, J. (2012). Retinoid metabolism and diabetes mellitus. Diabetes &
metabolism journal 36, 167-180.
Ribot, J., Felipe, F., Bonet, M.L., and Palou, A. (2001). Changes of adiposity in response to
vitamin A status correlate with changes of PPAR gamma 2 expression. Obesity research 9, 500-
509.
Rim, J.S., and Kozak, L.P. (2002). Regulatory motifs for CREB-binding protein and Nfe2l2
transcription factors in the upstream enhancer of the mitochondrial uncoupling protein 1 gene.
Journal of biological chemistry 277, 34589-34600.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
180
Ringseis, R., Wege, N., Wen, G., Rauer, C., Hirche, F., Kluge, H., and Eder, K. (2009). Carnitine
synthesis and uptake into cells are stimulated by fasting in pigs as a model of nonproliferating
species. Journal of nutritional biochemistry 20, 840-847.
Roca-Rivada, A., Castelao, C., Senin, L.L., Landrove, M.O., Baltar, J., Belén Crujeiras, A.,
Seoane, L.M., Casanueva, F.F., and Pardo, M. (2013). FNDC5/irisin is not only a myokine but
also an adipokine. PLoS One 8, e60563.
Rodriguez-Dorantes, M., Tellez-Ascencio, N., Cerbon, M.A., Lopez, M., and Cervantes, A.
(2004). [DNA methylation: an epigenetic process of medical importance]. Revista de
investigacion clinica; organo del Hospital de Enfermedades de la Nutricion 56, 56-71.
Rodríguez, A., Becerril, S., Ezquerro, S., Méndez-Giménez, L., and Frühbeck, G. (2017).
Crosstalk between adipokines and myokines in fat browning. Acta physiologica (Oxford) 219,
362-381.
Romani, M., Pistillo, M.P., and Banelli, B. (2015). Environmental Epigenetics: Crossroad
between Public Health, Lifestyle, and Cancer Prevention. BioMed research international 2015,
587983.
Rong, C., Cui, X., Chen, J., Qian, Y., Jia, R., and Hu, Y. (2015). DNA methylation profiles in
placenta and its association with gestational diabetes mellitus. Experimental and clinical
endocrinology & diabetes : official journal, German Society of Endocrinology [and] German
Diabetes Association 123, 282-288.
Rosa, F.T., Freitas, E.C., Deminice, R., Jordao, A.A., and Marchini, J.S. (2014). Oxidative stress
and inflammation in obesity after taurine supplementation: a double-blind, placebo-controlled
study. European journal of nutrition 53, 823-830.
Rosca, M.G., Lemieux, H., and Hoppel, C.L. (2009). Mitochondria in the elderly: Is
acetylcarnitine a rejuvenator? Advanced drug delivery reviews 61, 1332-1342.
Rowling, M.J., McMullen, M.H., and Schalinske, K.L. (2002). Vitamin A and its derivatives
induce hepatic glycine N-methyltransferase and hypomethylation of DNA in rats. Journal of
nutrition 132, 365-369.
Rutkowski, J.M., Stern, J.H., and Scherer, P.E. (2015). The cell biology of fat expansion. Journal
of cell biology 208, 501-512.
Rutkowsky, J.M., Knotts, T.A., Ono-Moore, K.D., McCoin, C.S., Huang, S., Schneider, D.,
Singh, S., Adams, S.H., and Hwang, D.H. (2014). Acylcarnitines activate proinflammatory
signaling pathways. American journal of physiology - endocrinology and metabolism 306,
E1378-1387.
Sailer, M., Dahlhoff, C., Giesbertz, P., Eidens, M.K., de Wit, N., Rubio-Aliaga, I., Boekschoten,
M.V., Muller, M., and Daniel, H. (2013). Increased plasma citrulline in mice marks diet-induced
obesity and may predict the development of the metabolic syndrome. PloS One 8, e63950.
Sampey, B.P., Freemerman, A.J., Zhang, J., Kuan, P.F., Galanko, J.A., O'Connell, T.M., Ilkayeva,
O.R., Muehlbauer, M.J., Stevens, R.D., Newgard, C.B., et al. (2012). Metabolomic profiling
reveals mitochondrial-derived lipid biomarkers that drive obesity-associated inflammation. PloS
One 7, e38812.
Sanchez-Hernandez, D., Cho, C.E., Kubant, R., Reza-Lopez, S.A., Poon, A.N., Wang, J., Huot,
P.S., Smith, C.E., and Anderson, G.H. (2014). Increasing vitamin A in post-weaning diets reduces
food intake and body weight and modifies gene expression in brains of male rats born to dams
fed a high multivitamin diet. Journal of nutritional biochemistry 25, 991-996.
Sanchez-Hernandez, D., Poon, A.N., Kubant, R., Kim, H., Huot, P.S., Cho, C.E., Pannia, E.,
Reza-Lopez, S.A., Pausova, Z., Bazinet, R.P., et al. (2016). High vitamin A intake during
pregnancy modifies dopaminergic reward system and decreases preference for sucrose in Wistar
rat offspring. Journal of nutritional biochemistry 27, 104-111.
Referencias
181
Schooneman, M.G., Achterkamp, N., Argmann, C.A., Soeters, M.R., and Houten, S.M. (2014).
Plasma acylcarnitines inadequately reflect tissue acylcarnitine metabolism. Biochimica et
biophysica acta 1841, 987-994.
Schooneman, M.G., Napolitano, A., Houten, S.M., Ambler, G.K., Murgatroyd, P.R., Miller, S.R.,
Hollak, C.E., Tan, C.Y., Virtue, S., Vidal-Puig, A., et al. (2016). Assessment of plasma
acylcarnitines before and after weight loss in obese subjects. Archives of biochemistry and
biophysics 606, 73-80.
Schooneman, M.G., Ten Have, G.A., van Vlies, N., Houten, S.M., Deutz, N.E., and Soeters, M.R.
(2015). Transorgan fluxes in a porcine model reveal a central role for liver in acylcarnitine
metabolism. American journal of physiology - endocrinology and metabolism 309, E256-264.
Schooneman, M.G., Vaz, F.M., Houten, S.M., and Soeters, M.R. (2013). Acylcarnitines:
reflecting or inflicting insulin resistance? Diabetes 62, 1-8.
Schug, T.T., Berry, D.C., Shaw, N.S., Travis, S.N., and Noy, N. (2007). Opposing effects of
retinoic acid on cell growth result from alternate activation of two different nuclear receptors.
Cell 129, 723-733.
Schulze-Bergkamen, A., Okun, J.G., Spiekerkotter, U., Lindner, M., Haas, D., Kohlmuller, D.,
Mayatepek, E., Schulze-Bergkamen, H., Greenberg, C.R., Zschocke, J., et al. (2005). Quantitative
acylcarnitine profiling in peripheral blood mononuclear cells using in vitro loading with palmitic
and 2-oxoadipic acids: biochemical confirmation of fatty acid oxidation and organic acid
disorders. Pediatric research 58, 873-880.
Schwarz, E.J., Reginato, M.J., Shao, D., Krakow, S.L., and Lazar, M.A. (1997). Retinoic acid
blocks adipogenesis by inhibiting C/EBPbeta-mediated transcription. Molecular and cellular
biology 17, 1552-1561.
Seale, P., and Lazar, M.A. (2009). Brown fat in humans: turning up the heat on obesity. Diabetes
58, 1482-1484.
Seiler, S.E., Martin, O.J., Noland, R.C., Slentz, D.H., DeBalsi, K.L., Ilkayeva, O.R., An, J.,
Newgard, C.B., Koves, T.R., and Muoio, D.M. (2014). Obesity and lipid stress inhibit carnitine
acetyltransferase activity. Journal of lipid research 55, 635-644.
Shabalina, I.G., Petrovic, N., de Jong, J.M., Kalinovich, A.V., Cannon, B., and Nedergaard, J.
(2013). UCP1 in brite/beige adipose tissue mitochondria is functionally thermogenic. Cell reports
5, 1196-1203.
Shao, M., Ishibashi, J., Kusminski, C.M., Wang, Q.A., Hepler, C., Vishvanath, L., MacPherson,
K.A., Spurgin, S.B., Sun, K., Holland, W.L., et al. (2016). Zfp423 Maintains White Adipocyte
Identity through Suppression of the Beige Cell Thermogenic Gene Program. Cell metabolism 23,
1167-1184.
Shen, W., Liu, K., Tian, C., Yang, L., Li, X., Ren, J., Packer, L., Cotman, C.W., and Liu, J. (2008).
R-alpha-lipoic acid and acetyl-L-carnitine complementarily promote mitochondrial biogenesis in
murine 3T3-L1 adipocytes. Diabetologia 51, 165-174.
Shete, V., and Quadro, L. (2013). Mammalian metabolism of beta-carotene: gaps in knowledge.
Nutrients 5, 4849-4868.
Shore, A., Karamitri, A., Kemp, P., Speakman, J.R., and Lomax, M.A. (2010). Role of Ucp1
enhancer methylation and chromatin remodelling in the control of Ucp1 expression in murine
adipose tissue. Diabetologia 53, 1164-1173.
Siersbæk, M.S., Loft, A., Aagaard, M.M., Nielsen, R., Schmidt, S.F., Petrovic, N., Nedergaard,
J., and Mandrup, S. (2012). Genome-wide profiling of peroxisome proliferator-activated receptor
γ in primary epididymal, inguinal, and brown adipocytes reveals depot-selective binding
correlated with gene expression. Molecular and cellular biology 32, 3452-3463.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
182
Silva, J.E., and Rabelo, R. (1997). Regulation of the uncoupling protein gene expression.
European Journal of endocrinology 136, 251-264.
Sirchia, S.M., Ferguson, A.T., Sironi, E., Subramanyan, S., Orlandi, R., Sukumar, S., and Sacchi,
N. (2000). Evidence of epigenetic changes affecting the chromatin state of the retinoic acid
receptor beta2 promoter in breast cancer cells. Oncogene 19, 1556-1563.
Smith, C., and Ryckman, K. (2015). Epigenetic and developmental influences on the risk of
obesity, diabetes, and metabolic syndrome. Diabetes, metabolic syndrome and obesity 29, 295-
302.
Soeters, M.R., Serlie, M.J., Sauerwein, H.P., Duran, M., Ruiter, J.P., Kulik, W., Ackermans,
M.T., Minkler, P.E., Hoppel, C.L., Wanders, R.J., et al. (2012). Characterization of D-3-
hydroxybutyrylcarnitine (ketocarnitine): an identified ketosis-induced metabolite. Metabolism:
clinical and experimental 61, 966-973.
Stallings, R.L., Foley, N.H., Bray, I.M., Das, S., and Buckley, P.G. (2011). MicroRNA and DNA
methylation alterations mediating retinoic acid induced neuroblastoma cell differentiation.
Seminars in cancer biology 21, 283-290.
Stefanska, B., Karlic, H., Varga, F., Fabianowska-Majewska, K., and Haslberger, A. (2012).
Epigenetic mechanisms in anti-cancer actions of bioactive food components--the implications in
cancer prevention. British journal of pharmacology 167, 279-297.
Szabova, L., Macejova, D., Dvorcakova, M., Mostbock, S., Blazickova, S., Zorad, S., Walrand,
S., Cardinault, N., Vasson, M.P., Rock, E., et al. (2003). Expression of nuclear retinoic acid
receptor in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy subjects. Life sciences 72,
831-836.
Sánchez-Hernández, D., Cho, C.E., Kubant, R., Reza-López, S.A., Poon, A.N., Wang, J., Huot,
P.S., Smith, C.E., and Anderson, G.H. (2014). Increasing vitamin A in post-weaning diets reduces
food intake and body weight and modifies gene expression in brains of male rats born to dams
fed a high multivitamin diet. Journal of nutritional biochemistry 25, 991-996.
Sánchez-Hernández, D., Poon, A.N., Kubant, R., Kim, H., Huot, P.S., Cho, C.E., Pannia, E.,
Reza-López, S.A., Pausova, Z., Bazinet, R.P., et al. (2016). High vitamin A intake during
pregnancy modifies dopaminergic reward system and decreases preference for sucrose in Wistar
rat offspring. Journal of nutritional biochemistry 27, 104-111.
Takashima, H., Matsumoto, Y., Matsubara, N., Shirakawa, Y., Kawashima, R., Tanino, M., Ito,
S., Isozaki, H., Ouchida, M., Meltzer, S.J., et al. (2001). Effect of naturally occurring E2F-4
alterations on transcriptional activation and proliferation in transfected cells. Laboratory
investigation; a journal of technical methods and pathology 81, 1565-1573.
Tamori, Y., Masugi, J., Nishino, N., and Kasuga, M. (2002). Role of peroxisome proliferator-
activated receptor-gamma in maintenance of the characteristics of mature 3T3-L1 adipocytes.
Diabetes 51, 2045-2055.
Tang, W.H., Wang, Z., Cho, L., Brennan, D.M., and Hazen, S.L. (2009). Diminished global
arginine bioavailability and increased arginine catabolism as metabolic profile of increased
cardiovascular risk. Journal of the American College of Cardiology 53, 2061-2067.
Tarry-Adkins, J.L., and Ozanne, S.E. (2016). Nutrition in early life and age-associated diseases.
Ageing research reviews. In press.
Tastesen, H.S., Keenan, A.H., Madsen, L., Kristiansen, K., and Liaset, B. (2014). Scallop protein
with endogenous high taurine and glycine content prevents high-fat, high-sucrose-induced obesity
and improves plasma lipid profile in male C57BL/6J mice. Amino acids 46, 1659-1671.
Theodosiou, M., Laudet, V., and Schubert, M. (2010). From carrot to clinic: an overview of the
retinoic acid signaling pathway. Cellular and molecular life sciences 67, 1423-1445.
Referencias
183
Tourniaire, F., Gouranton, E., von Lintig, J., Keijer, J., Bonet, M.L., Amengual, J., Lietz, G., and
Landrier, J.F. (2009). beta-Carotene conversion products and their effects on adipose tissue.
Genes and nutrition 4, 179-187.
Tourniaire, F., Musinovic, H., Gouranton, E., Astier, J., Marcotorchino, J., Arreguin, A., Bernot,
D., Palou, A., Bonet, M.L., Ribot, J., et al. (2015). All-trans retinoic acid induces oxidative
phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of lipid research 56, 1100-
1109.
Trasino, S.E., Tang, X.H., Jessurun, J., and Gudas, L.J. (2015). Obesity Leads to Tissue, but not
Serum Vitamin A Deficiency. Scientific reports 5, 15893.
Tripolt, N.J., Meinitzer, A., Eder, M., Wascher, T.C., Pieber, T.R., and Sourij, H. (2012).
Multifactorial risk factor intervention in patients with Type 2 diabetes improves arginine
bioavailability ratios. Diabetic medicine : a journal of the British Diabetic Association 29, e365-
368.
Tsuboyama-Kasaoka, N., Shozawa, C., Sano, K., Kamei, Y., Kasaoka, S., Hosokawa, Y., and
Ezaki, O. (2006). Taurine (2-aminoethanesulfonic acid) deficiency creates a vicious circle
promoting obesity. Endocrinology 147, 3276-3284.
Tsutsumi, C., Okuno, M., Tannous, L., Piantedosi, R., Allan, M., Goodman, D.S., and Blaner,
W.S. (1992). Retinoids and retinoid-binding protein expression in rat adipocytes. Journal of
biological chemistry 267, 1805-1810.
Tusnady, G.E., Simon, I., Varadi, A., and Aranyi, T. (2005). BiSearch: primer-design and search
tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic acids research 33, e9.
Uruno, A., Sugawara, A., Kanatsuka, H., Kagechika, H., Saito, A., Sato, K., Kudo, M., Takeuchi,
K., and Ito, S. (2005). Upregulation of nitric oxide production in vascular endothelial cells by all-
trans retinoic acid through the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway. Circulation 112, 727-736.
van Lieshout, M., West, C.E., Muhilal, Permaesih, D., Wang, Y., Xu, X., van Breemen, R.B.,
Creemers, A.F., Verhoeven, M.A., and Lugtenburg, J. (2001). Bioefficacy of beta-carotene
dissolved in oil studied in children in Indonesia. American journal of clinical nutrition 73, 949-
958.
Van Loo-Bouwman, C.A., Naber, T.H., and Schaafsma, G. (2014). A review of vitamin A
equivalency of β-carotene in various food matrices for human consumption. British journal of
nutrition 111, 2153-2166.
van Vlies, N., Ferdinandusse, S., Turkenburg, M., Wanders, R.J., and Vaz, F.M. (2007). PPAR
alpha-activation results in enhanced carnitine biosynthesis and OCTN2-mediated hepatic
carnitine accumulation. Biochimica et biophysica acta 1767, 1134-1142.
Venegas, V., Wang, J., Dimmock, D., and Wong, L.J. (2011). Real-time quantitative PCR
analysis of mitochondrial DNA content. Current protocols in human genetics Chapter 19, Unit
19 17.
Vieira, A. (2011). Epigenetic regulation by retinoids. In Nutrition in Epigenetics, M. Niculescu,
and P. Haggarty, eds. (Oxford, UK: Wiley-Blackwell), pp. 241-248.
Villarroya, F., Giralt, M., and Iglesias, R. (1999). Retinoids and adipose tissues: metabolism, cell
differentiation and gene expression. International journal of obesity 23, 1-6.
Villarroya, F., Iglesias, R., and Giralt, M. (2007). PPARs in the Control of Uncoupling Proteins
Gene Expression. PPAR research 2007, 74364.
Voigt, A., Ribot, J., Sabater, A.G., Palou, A., Bonet, M.L., and Klaus, S. (2015). Identification of
Mest/Peg1 gene expression as a predictive biomarker of adipose tissue expansion sensitive to
dietary anti-obesity interventions. Genes and nutrition 10, 477.
Tesis Doctoral
Andrea Arreguín Coronado
184
von Lintig, J. (2010). Colors with functions: elucidating the biochemical and molecular basis of
carotenoid metabolism. Annual review of nutrition 30, 35-56.
Walden, T.B., Hansen, I.R., Timmons, J.A., Cannon, B., and Nedergaard, J. (2012). Recruited vs.
nonrecruited molecular signatures of brown, "brite," and white adipose tissues. American journal
of physiology - endocrinology and metabolism 302, E19-31.
Wanders, R.J., Vreken, P., Ferdinandusse, S., Jansen, G.A., Waterham, H.R., van Roermund,
C.W., and Van Grunsven, E.G. (2001). Peroxisomal fatty acid alpha- and beta-oxidation in
humans: enzymology, peroxisomal metabolite transporters and peroxisomal diseases.
Biochemical Society transactions 29, 250-267.
Wang, B., Yang, Q., Harris, C.L., Nelson, M.L., Busboom, J.R., Zhu, M.J., and Du, M. (2016a).
Nutrigenomic regulation of adipose tissue development - role of retinoic acid: A review. Meat
science 120, 100-106.
Wang, B., Zhu, M., and Du, M. (2016b). All-trans-Retinoic Acid Inhibits Adipogenesis by
Interrupting Gadd45α Induced Zfp423. The FASEB Journal 30, 1 Supplement, 34.34.
Wang, R., and Green, D.R. (2012). Metabolic checkpoints in activated T cells. Nature
immunology 13, 907-915.
Wang, T.J., Larson, M.G., Vasan, R.S., Cheng, S., Rhee, E.P., McCabe, E., Lewis, G.D., Fox,
C.S., Jacques, P.F., Fernandez, C., et al. (2011). Metabolite profiles and the risk of developing
diabetes. Nature medicine 17, 448-453.
Wessels, B., van den Broek, N.M., Ciapaite, J., Houten, S.M., Wanders, R.J., Nicolay, K., and
Prompers, J.J. (2015). Carnitine supplementation in high-fat diet-fed rats does not ameliorate
lipid-induced skeletal muscle mitochondrial dysfunction in vivo. American journal of physiology
- endocrinology and metabolism 309, E670-678.
Wilson, A.S., Power, B.E., and Molloy, P.L. (2007). DNA hypomethylation and human diseases.
Biochimica et biophysica acta 1775, 138-162.
Wolfrum, C., Shih, D.Q., Kuwajima, S., Norris, A.W., Kahn, C.R., and Stoffel, M. (2003). Role
of Foxa-2 in adipocyte metabolism and differentiation. Journal of clinical investigation 112, 345-
356.
Woo, Y.J., and Jang, K.L. (2012). All-trans retinoic acid activates E-cadherin expression via
promoter hypomethylation in the human colon carcinoma HCT116 cells. Biochemical and
biophysical research communications 425, 944-949.
Wrzodek, C., Buchel, F., Hinselmann, G., Eichner, J., Mittag, F., and Zell, A. (2012). Linking the
epigenome to the genome: correlation of different features to DNA methylation of CpG islands.
PloS One 7, e35327.
Wu, J., Bostrom, P., Sparks, L.M., Ye, L., Choi, J.H., Giang, A.H., Khandekar, M., Virtanen,
K.A., Nuutila, P., Schaart, G., et al. (2012). Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic
fat cell in mouse and human. Cell 150, 366-376.
Wu, T., Guo, A., Shu, Q., Qi, Y., Kong, Y., Sun, Z., Sun, S., and Fu, Z. (2015). L-Carnitine intake
prevents irregular feeding-induced obesity and lipid metabolism disorder. Gene 554, 148-154.
Wu, Z., and Wang, S. (2013). Role of kruppel-like transcription factors in adipogenesis.
Developmental biology 373, 235-243.
Wyss, M., and Kaddurah-Daouk, R. (2000). Creatine and creatinine metabolism. Physiological
reviews 80, 1107-1213.
Xun, Z., Lee, D.Y., Lim, J., Canaria, C.A., Barnebey, A., Yanonne, S.M., and McMurray, C.T.
(2012). Retinoic acid-induced differentiation increases the rate of oxygen consumption and
enhances the spare respiratory capacity of mitochondria in SH-SY5Y cells. Mechanisms of ageing
and development 133, 176-185.
Referencias
185
Yang, F., He, Y., Liu, H.X., Tsuei, J., Jiang, X., Yang, L., Wang, Z.T., and Wan, Y.J. (2014). All-
trans retinoic acid regulates hepatic bile acid homeostasis. Biochemical pharmacology 91, 483-
489.
Yang, Q.Y., Liang, J.F., Rogers, C.J., Zhao, J.X., Zhu, M.J., and Du, M. (2013). Maternal obesity
induces epigenetic modifications to facilitate Zfp423 expression and enhance adipogenic
differentiation in fetal mice. Diabetes 62, 3727-3735.
Zhang, J.J., Wu, Z.B., Cai, Y.J., Ke, B., Huang, Y.J., Qiu, C.P., Yang, Y.B., Shi, L.Y., and Qin,
J. (2014a). L-carnitine ameliorated fasting-induced fatigue, hunger, and metabolic abnormalities
in patients with metabolic syndrome: a randomized controlled study. Nutrition journal 13, 110.
Zhang, M., Bi, L.F., Fang, J.H., Su, X.L., Da, G.L., Kuwamori, T., and Kagamimori, S. (2004).
Beneficial effects of taurine on serum lipids in overweight or obese non-diabetic subjects. Amino
acids 26, 267-271.
Zhang, R., Wang, Y., Li, R., and Chen, G. (2015). Transcriptional Factors Mediating Retinoic
Acid Signals in the Control of Energy Metabolism. International journal of molecular sciences
16, 14210-14244.
Zhang, X., Zhang, C., Chen, L., Han, X., and Ji, L. (2014b). Human serum acylcarnitine profiles
in different glucose tolerance states. Diabetes research and clinical practice 104, 376-382.
Zhu, Y., Qi, C., Korenberg, J.R., Chen, X.N., Noya, D., Rao, M.S., and Reddy, J.K. (1995).
Structural organization of mouse peroxisome proliferator-activated receptor gamma (mPPAR
gamma) gene: alternative promoter use and different splicing yield two mPPAR gamma isoforms.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 7921-7925.
Zou, F., Liu, Y., Liu, L., Wu, K., Wei, W., Zhu, Y., and Wu, J. (2007). Retinoic acid activates
human inducible nitric oxide synthase gene through binding of RARalpha/RXRalpha heterodimer
to a novel retinoic acid response element in the promoter. Biochemical and biophysical research
communications 355, 494-500.