Embed Size (px)
Citation preview
TESIS: ESTUDIO RADIOBIOLÓGICO DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS MEDIANTE RADIACIONES
GAMMA
SUSTENTACION PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON MENCIÓN EN FISICA MEDICA.
Lic. Bertha Milagros García Gutiérrez
INTRODUCCION
Mediante la aplicación de las Ciencias Físicas en la Medicina ha hecho posible el desarrollo de muchas técnicas, equipos, procedimientos como lo es Radioterapia, el hecho de irradiar un tejido y observar los efectos que causan en ellos y además ver las diferencias entre las reacciones del tejido sano y tumoral resulta interesante.
Todo esta enmarcado en lo que se denomina Radiobiologia que es la ciencia que estudia los efectos de las radiaciones ionizantes en los seres vivos.
Porque se realizo el estudio• Estudiar las diferencias de respuesta radiobiológico entre
los tipos de leucemias agudas.
• Observar respuesta celular causada por la irradiación.
• Establecer una metodología el cual permita realizar otros estudios usando cultivos celulares de los tumores.
• Se escogio estudiar y observar la respuesta de las células con leucemia por presentar una respuesta a la radiación es decir oor se mas radiosensibles.
Que es la Leucemia?• En la literatura encontramos citas desde hace mas de 150 años
Velpeu (1827).
• Es una enfermedad originada en la medula ósea por la proliferación incontrolada de las células madres del sistema hematopoyético, esta proliferación incontrolada de las células sustituye los elementos normales de la medula ósea, invade la sangre periférica pudiendo infiltrar cualquier órgano o tejido del cuerpo humano. (Vallejos C).
• Las Leucemias son un conjunto heterogéneo de células malignas que se caracterizan por la proliferación y acumulación anormal de los precursores de las células sanguíneas. (Urdaneta N; Radioterapia Oncológica. 2009).
Porque se estudio células leucémicas• Termino de agudo significa que se propaga rápido si no se trata
• linfocítico” significa que se origina en las primeras etapas (inmaduras) de los linfocitos, un tipo de glóbulo blanco.
• Esto es diferente de la leucemia mieloide aguda se desarrolla en otros tipos de células sanguíneas, se inicia en la médula ósea (la parte interior blanda de los huesos, donde se producen las nuevas células sanguíneas), pero en la mayoría de los casos pasa rápidamente a la sangre.
• Por lo tanto ambos tipos de Leucemia son radiosensibles a la radiación y presentan respuesta rápida.
Importancia• El comportamiento de los diferentes tipos de Cáncer
frente a las radiaciones ionizantes es complejo.
• En el Perú el cáncer causa una mortandad de 18465 casos/año (2008) es decir 18,9% de la población. (Minsa.2008).
• La incidencia global de cáncer es de 150.7 y mortandad de 78.3 por cada cien mil habitantes de nuestra ciudad capital es decir (Fuente INEN 2012).
MARCO TEORICO
• La aplicación de las radiaciones ionizantes en el tratamiento de cáncer se inicia con el descubrimiento de los Rayos X por William Roentgen en Noviembre de 1895. (Nobel 1901).
• Los primeros equipos de Rayos X producían rayos con voltajes máx. de 100kV.
• En 1921 se dieron a conocer los equipos de ortovoltaje que producen rayos X de 200kV.
• En 1931 se operaban equipos que producían rayos X en el rango de 250 a 400kV.
MARCO TEORICO• En 1951 se instala las dos primeras unidades de
teleterapia con cobalto-60 con energía de 1.25MeV en Canadá.
• Actualmente la manera de tratamiento de Cáncer utilizando radiaciones ionizantes a distancia denominado Teleterapia se da bajo dos modalidades utilizando los equipos de Cobalto-60 y los aceleradores lineales que producen energía del rango de 6 hasta 22 MeV para fines de tratamiento oncológico siendo actualmente las energías de 6, 10, y 15 MeV las mas usadas.
MARCO TEORICO
Propiedades física de una fuente de 60Co:
Energía de rayos gamma: 1,17 MeV y 1,33 MeV. Alta actividad específica de aproximadamente 9,3 TBq/g. Periodo de semidesintegración relativamente alto: 5,3 años. Constante de tasa de exposición: C [R.m2/ (Ci.h)] = 1,31. Constante de tasa de kerma en aire: C [nGy.m2/ (GBq.h)] =
309.
MARCO TEORICO
MARCO TEORICO
MARCO TEORICO
MARCO TEORICO
Radiación electromagnética:
La radiación electromagnética es un tipo de campo electromagnético variable, es decir, una combinación de campos eléctricos y magnéticos oscilantes, que se propagan a través del espacio transportando energía de un lugar a otro
MARCO TEORICO• Radiación ionizante:
Los átomos mayormente se encuentran en la naturaleza de forma estable, es decir en estado neutro, sin embargo, algunos átomos se encuentran de forma inestables, y están emitiendo espontáneamente radiación electromagnética, que pueden modificar su estructura debido a la búsqueda de su estabilidad al perder un electrón.
MARCO TEORICO
La desintegración radioactiva, es un proceso físico y probabilístico, por lo que se puede predecir la frecuencia en que pueda suceder u ocurrir una desintegración, pero no podemos predecir en que momento ocurra, solo conocer la probabilidad de que se produzca el evento en un determinado intervalo de tiempo, esta probabilidad es independiente del momento en que un núcleo radioactivo es creado,
MARCO TEORICO• Radiación gama:
La radiación (γ) está constituida por fotones y puede ser producida por elementos radiactivos o procesos como la aniquilación de un par positrón-electrón o través de otros fenómenos de gran violencia.
MARCO TEORICO
Interacción de la radiación con la materia:
• Se da bajo las siguientes modalidades:• Efecto fotoeléctrico.• Dispersión Compton.• Producción de pares.
Podgorsak E. 2007
MARCO TEORICO
Dosimetría y dosis:La interpretación de datos de las unidades de tratamiento, es individual para cada
máquina y cada energía, por lo que se cuenta con un conjunto de tablas, que suministran los parámetros dosimétricos relevantes bajo determinadas condiciones clínicas.
El problema fundamental consiste en conocer la tasa de dosis en cualquier punto del medio irradiado.
De esta forma, al prescribir una dosis en un determinado punto, podemos calcular el tiempo de irradiación y la dosis en otros puntos de interés. Según la fórmula para calcular la tasa de dosis [5].
MARCO TEORICO• Gray (Gy): La unidad de dosis adsorbida es el (J/kg). Y el
nombre de la unidad de dosis absorbida es el Gray
• PDD: El porcentaje de dosis
Incrementa con la energía
del haz de radiación,
y a su vez varia
Con la profundidad
PDD: Dd x 100Dd0
MARCO TEORICORadiobiología:
Es uno de los temas principales a desarrollar en este trabajo de investigación.
Los cálculos que se realizan para observar cuanta energía se va a depositar en un determinado tejido y en función del tiempo está a cargo de la radiobiología, que a su vez incluyen diferentes parámetros como tipo de tumor, cantidad, volumen, origen tumoral, edad del paciente, estadio, tamaño, complicación de otros órganos adyacentes al tumor.
En términos generales la radioterapia se emplea en el tratamiento del cáncer, ya sea de modo paliativo o curativo actuando sobre la enfermedad; resecando el tamaño del tumor, eliminando, o controlando su crecimiento; la cantidad de radiación que se deposita en un tejido tumoral está determinada directamente por la radiobiología, mediante cálculos de tolerancia de dosis, y resistencia de dosis, etc.
MARCO TEORICOLos patrones de proliferación celular del tumor pueden cambiar después del tratamiento y están en relación con diversos factores.
En primer lugar: las radiaciones van a inducir una variedad de bloqueos impidiendo que las células sobrevivientes y aquellas destinadas a morir, puedan progresar a través de los primeros ciclos celulares después del tratamiento.
En segundo lugar: la irradiación va a matar preferencialmente las células de cierta edad, relacionado con la redistribución celular.
En tercer lugar: las células en estado de reposo pueden ser reclutadas haciéndolas entrar en las siguientes etapas de proliferación del ciclo celular.
Todos estos procesos diversos pueden ocurrir después de la irradiación del tumor, su parición dependerá del esquema de radiación.
MARCO TEORICO
Relación dosis-respuesta celular.
MARCO TEORICO
Clasificación de la radiación desde el punto de vista Radiobiológico:
ICRU: Define “LET de partículas cargadas en un medio es el cociente dE/dl, donde dE es la energía media impartida localmente al medio por una partícula cargada de energía especificada al atravesar una distancia de dl.”
Centra la atención en la velocidad lineal de la absorción de energía por el medio absorbente.
Para el caso de 60Co es considerado de bajo LET.
MARCO TEORICO
Características de los efectos biológicos de las radiaciones ionizantes:
• Aleatoriedad • Rápido depósito de energía. • No selectividad • No especificidad lesiva • Latencia
MARCO TEORICO
La radiosensibilidad y radioresistencia celular en los tumores y tejidos normales se da por la medida de respuesta celular, ocasionada por las radiaciones ionizantes.
MARCO TEORICOLey de Bergonie y Trinbodeau (1906):Esta ley nos hace entender el comportamiento celular, frente a las radiaciones en función a su actividad mitótica y diferenciación celular, se establecen los tres puntos:
• Una célula es tanto más radiosensible, cuanto mayor es su actividad reproductiva.
• Una célula es tanto más radiosensible, cuanto más largo sea su porvenir de división, es decir, cuantas más divisiones deba cumplir en el futuro.
• Una célula es tanto más radiosensible, cuanto menos diferenciadas estén desarrolladas sus funciones
MARCO TEORICO
Las Leucemias:
• Son neoplasias derivadas del sistema hematopoyético, que inicialmente proliferan en la médula ósea antes de diseminarse a la sangre periférica, bazo, ganglios linfáticos y por último infiltrar otros organismos del sistema nervioso central.
• Las leucemias se caracterizan por la acumulación y proliferación anormal de los precursores de las células sanguíneas. Existe una variación considerable entre los diferentes tipos de leucemia (Ebert BL). Que se agrupan según la rapidez con la que la enfermedad avanza y empeora. La leucemia puede ser crónica (la cual normalmente empeora en forma lenta) o aguda (la cual empeora rápidamente).
MARCO TEORICO
Proceso de maduración de los glóbulos blancos.
MARCO TEORICO
En una persona con leucemia, la médula ósea produce glóbulos blancos (leucocitos) anormales. Las células anormales son células leucémicas. A diferencia de las células sanguíneas normales, las células leucémicas no mueren cuando deberían morir. Estas se aglomeran alrededor de los leucocitos, de los glóbulos rojos (eritrocitos) y plaquetas. Esto dificulta el funcionamiento de las células sanguíneas normales
MARCO TEORICO
• Leucemia linfocítica (linfoblastica aguda) (LLA). Afecta a células linfoides y es de crecimiento rápido. Hay más de 6,020 casos nuevos de leucemia cada año. La LLA es el tipo de leucemia más común entre niños(0-14).
• Leucemia mieloide aguda (LMA). Afecta a células mieloides y es de crecimiento rápido. Hay más de 18,860 casos nuevos de leucemia cada año. Afecta tanto a adultos como a niños. (American Cancer Society. Atlanta 2014).
MARCO TEORICO• Leucemia en el Perú:
La leucemia en el Perú ocupa unos de los 10 primeros tipos de cáncer. Según Ministerio de Salud del Perú (MINSA
en 2005).LOCALIZACION HOMBRES MUJERES TOTAL
Estomago 1324 1279 2603
Hígado y vías biliares 696 954 1650
Bronquios y pulmón 729 599 1328
Cuello uterino 1244 1244
Próstata 1100 1100
Mama 14 770 784
Tumor de origen incierto 360 416 776
Colon 326 412 738
Leucemia 380 344 724
Páncreas 276 289 565
Linfoma no Hodgkin 291 230 521
Boca 114 72 186
Piel 59 57 116
MARCO TEORICO
Viabilidad celular:
La viabilidad celular es una determinación de las células de vivir o de estar muertas, sobre la base de una muestra total de células. La medición de la viabilidad puede ser usada para evaluar la muerte o la vida de las células cancerosas
MARCO TEORICOViabilidad celular:
Las pruebas que por lo general consisten en examinar una población de células de la muestra y la tinción de las células o la aplicación de productos químicos para mostrar que están viviendo y que son muertos.
Los tintes o las mediciones de prueba utilizados para la determinación de la viabilidad celular son frecuentemente llamados reactivos. Estas son sustancias diseñadas para provocar reacciones químicas. Cuando los reactivos se aplican a las células, se pueden realizar varias acciones, que permiten a los científicos examinar células de diferentes maneras (Brayner M.2011)
MARCO TEORICO
Azul de tripan:
Es un colorante vital, usado para colorear selectivamente los tejidos o las células muertas de color azul. Es un colorante de tipo diazo, llamado así porque presenta un componente que es una amina aromática (también llamada componente diazo) y es transformado en un componente diazonio que a su vez reacciona con un componente de acoplamiento, que pueden ser phenol, naphtol o una amina, para formar el colorante
MARCO TEORICO
Azul de tripan:
Las células vivas o tejidos con membranas celulares intactas no son de color. Debido a que las células son muy selectivas en los compuestos que pasan a través de la membrana, en un azul de tripán de células viables no es absorbida, sin embargo, atraviesa la membrana en una célula muerta. Por lo tanto, las células muertas se muestran como un distintivo color azul bajo un microscopio.
MATERIALES Y METODOS
El estudio fue un trabajo prospectivo de corte transversal, se evaluó el efecto de una dosis única de radiación Gamma, en la viabilidad celular en distintos linajes de leucemias agudas.
Se recolectaron 20 muestras consecutivas de aspirado de medula ósea de pacientes con leucemias agudas.
De las cuales 10 correspondieron a leucemias linfoblásticas agudas (LLA) y 10 a leucemias mieloides agudas (LMA), conforme se colectaron las muestras fueron sometidas a criopreservación.
MATERIALES Y METODOSColección de muestras biológicas:
Se colectarán 3 ml de aspirado de médula ósea en pacientes nuevos portadores de leucemias agudas (Mieloides o Linfoides).
Las muestras fueron procesadas dentro de las 2 horas de la colección. En un tubo cónico de 15 ml se adicionó 3 ml de la muestra más 3 ml de solución buffer fosfato salino (PBS). En otro tubo de similar características se adicionó 3 ml de Ficoll (lymphoprep) y se añadió 6 ml de la suspensión anterior, posteriormente se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos.
Luego de este tiempo, con una pipeta estéril se colectó la interfase (células nucleadas), se colocó en un tubo cónico de 15 ml adicionándole 3 ml de PBS, se homogenizo suavemente y se centrifugo a 1500 rpm por 10 minutos. Con una pipeta estéril se descartó el sobrenadante. Al botón celular obtenido se le adiciono 3 ml de PBS, se homogenizo suavemente y se centrifugo a 1500 rpm por 10 minutos. Con una pipeta estéril se descartó el sobrenadante y se adicionó 1.5ml de medio Hanks (Invitrogen).
MATERIALES Y METODOS
Criopersevacion:
La criopreservación de estas células se realizó en viales criogénicos de 1.8 ml, para lo cual se adiciono 1.44 ml de la suspensión celular más 0.36ml de DMSO (Cryostore).
Para congelar las células, se usó una cámara de congelamiento (forma científica) con un programa de descenso de temperatura. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta el momento de la irradiación.
MATERIALES Y METODOS
Irradiación de las muestras:
Antes de la irradiación, los viales se descongelaron en un baño maría a 37°C. Luego se diluyeron en PBS para posteriormente colocar la suspensión en frascos de cultivos. Todas las muestras se irradiaron simultáneamente con 1Gy en una maquina Cobalto modelo Theratron 80, a una distancia de 80 cm de la fuente a la muestra. Luego de la irradiación, los cultivos fueron centrifugados para colectar las células mononucleares y así poder realizar las pruebas de viabilidad celular.
MATERIALES Y METODOS
Pruebas de viabilidad celular:
La viabilidad celular fue evaluada antes y 20 minutos luego de la irradiación. En un tubo de 1,5 ml se colocó 0,5 ml de HBSS (Invitrogen) mas 0,3 ml de una solución azul de tripán al 0,4% (Merck) mas 0.2 ml de la suspensión celular a una dilución 1:5 con HBSS (Invitrogen). Se dejó en reposo durante 10 minutos. Se tomó 100 ul y se colocó en la cámara de Neubauer (Brand). La evaluación de la Viabilidad celular se realizó en un microscopio óptico a 400 aumentos. Se consideraron como células viables aquellas que no se colorearon con el azul de tripán.
MATERIALES Y METODOS
MATERIALES Y METODOS
Cálculo de la viabilidad celular corregida:
Dónde:
CV Post-i= células viables post irradiación;
CT Post-i= células totales post irradiación y
V Pre-i= Viabilidad pre irradiación.
MATERIALES Y METODOS
Análisis estadístico:
Se presentan estadísticas descriptivas sobre las medidas de tendencia central y medidas de dispersión. La comparación entre la viabilidad celular de las LMA y LLA fue realizada usando la prueba T de Student. Se consideró un nivel de significancia P<0.05 como estadísticamente significativo.
MATERIALES Y METODOS
Aspectos éticos:
Los pacientes aceptaron donar voluntariamente sus muestras para el estudio mediante la firma de un consentimiento informado. Este protocolo de investigación (INEN Nº 05-43) fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas.
RESULTADOS
Se colectaron 20 muestra:
• 10 correspondieron a LLA de estirpe B.
• Las 10 muestras de LMA correspondieron en 2 casos a LMA, M2, 2 casos a LMA M3; 4 casos, a LMA M4 y 2 casos, a LMA M5.
RESULTADOS: Viabilidad celular
RESULTADOSViabilidad celular post irradiación según el tipo de Leucemia aguda.
RESULTADOSNo existieron diferencias entre ambos grupos cuando se comparó la viabilidad
celular pre irradiación (medianas de 79,2% para LLA y 82,8% para LMA; P=0,531).
La mediana de células evaluadas antes de la irradiación fue de 85,5 para LLA (media 90,8; DE 11.1), mientras que para el grupo de LMA fue de 93 células (media 91,4; DE 9.5), sin observarse diferencias (P=0.899).
Del mismo modo, no existieron diferencias significativas con respecto al número de células evaluadas en ambos grupos, con una mediana de 85 células para el grupo de LLA (media 86,4; DE 14,9) y de 73 para el grupo de LMA (media 80; DE: 24,7; P=0,495).
La mediana de viabilidad celular corregida para las LLA fue de 66.5% (media 68.4%, Desviación Estándar [DE] 6,4), mientras que para las LMA, la Mediana fue de 73,0% (media 74,2%, DE 10,3).
A pesar de las diferencias observadas en las medianas, no se observaron diferencias estadísticamente significativas (P=0,149).
RESULTADOS : Post irradiación
Viabilidad celular post irradiación según el subtipo de LMA
RESULTADOS : Post irradiación
Cuando se compararon las medianas dentro del grupo de LMA, se observó que la mediana de viabilidad para la LMA M2 fue de 71,9%; para M3, de 72,5%; para M4, de 78,1% y para M5 de 69,7%.
DISCUSION:
Nuestra intención fue evaluar la muerte celular producida por la toxicidad aguda de la radiación gama.
En nuestro estudio pudimos observar que, a pesar de observarse una discreta diferencia en las tasas de viabilidad celular, observándose que las LMA son más radioresistentes, no existieron diferencias estadísticamente significativas, y quizá esto ocurra porque las leucemias agudas de estirpe mieloide son más heterogéneas, evidenciándose en una mayor desviación estándar en la viabilidad celular cuando se compara con las LLA.
DISCUSION:Dentro de las LMA, observamos que las leucemias M4 son
más radioresistentes.
Un sesgo de este estudio es el reducido número de subtipos de LMA, no obstante, este trabajo aporta datos interesantes con respecto a lo que ocurre con estos tumores hematológicos, evidenciándose una diferencia con respecto a las células mononucleares normales.
En un estudio reciente se ha reportado que la mortalidad celular en células normales no ocurre inmediatamente, sino más bien se pueden observar diferencias en la mortalidad (irradiados versus control) a partir de las 72 horas, siendo directamente proporcional a la dosis de radiación absorbida.
DISCUSION:
Probablemente, la maquinaria de reparación del DNA que trabaje en un corto plazo, sea menos eficiente en las células leucémicas que en las células normales.
CONCLUSION:
En conclusión, se observa una mayor radioresistencia en las células de leucemia mieloide aguda que en la leucemia linfoblástica aguda, aunque sin observarse diferencias significativas, constituyendo el grupo de leucemias mieloides, un grupo de radiosensibilidad heterogénea.
GRACIAS
