TEXTO flUSTRlBO DI

Biologa Molecular e Ingeniera Gentica

Concenos. Tcnicas y Aplicacion(:S en Cienci.1s de la Salud

TEXTO ILUSTRAD O DE

Biologa Molecular e Ingeniera Gentica

Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud

Jos Luque Cabrera Catedrti('tl de Universidad

Angel Herrez Snchez Proflsor TiiUiar dC' UniveNidad

Ocpanamcntv tk Bic.J.qumka y Biologa Molecular Universidad de Alcal.i

AlcJij de llenares. Miidl'it.l

GLSE.VIER \ 111\lnd 8fi1\JCIVna Atlb4fnlam l~tllll Fila.leiiM

I..Qml:l:" C)rl.lndO 1~ Rwm Sydne} T)).:i

ELSEVIER

() M\ U f.lw,wt t...p.ta,a. r. \ C"iltatm .a., 17 1 ~ . ... \t.hl ~

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S.~~t .. liNW" ~ .. por&, ~da,__., uA rl ~~dllldlo .. edlttlr n kf E.o,~o ~ 1f'111.1 rrt JW'-UW .t f l'c'1",.'"""" ... , ..... lrilda\tt.l p..__. P ,......,_IC'Illtr\H~ de

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------

A nuestros alumnos, Inspiradores de

Prlogo En la Preseotaclon de egloo y lO aPliCado, abor dando to esoocial y rechazando. en roos de la daridad. Jo complejo y no bfen es.tab\eoeiCio. Es e~o ~ 0$10S obie INOS reQI..M.Itian, PQI parte de los atllores, lanto un oonocrn!entoprotundo yaciJJa!lzado ~k>$ c;liWtt$(1$ tomM tr;.tados co mo ~ conocirr.eo amplio y completo de tos contet>os de la e.oq..,1m1ca y B10tog1a Motea.Mr. y un conoci"*"o do lOS contenidO$ rormaliVO$ de las diversas hcenaatu1as: a la VE"Z que e>~g!an una gran capaclao Oldclica. Sin Ol.l:ftl. la prolol'lg!WiA e inten$a d&dieaort do lo.$ autQft$ oa tea dioooncia urwer&ltana ha Sido un factor dOOSI'/0 para CUif'tW'Ial con JCAo la efl'~Clre$8 BCOmectda. El ~locto oe ttt\bbjo 5e9Jid para 1a elaboracin del teXIo. e

Presentacin OBJETIVO

LOS 3v3JIICC$ y ili)IICo'(:iOI'Ie$ de 13 inves1lgac::Ic'l bloquiiTIICa y genbca ocupan hoy dia una poSicin pnvleglada en el e:u'l"fX>

xu

da preparacu)n re

Revisin y asesoramiento Revisores

Nos es grato hacer mencion oe1 esfuerzo generoso reatlzado pot' las pec"90na9 que han remado temas concre-;os (~e-~ libro, en algt.nO de tos motnentos de su elaboracin. A pesar de eMa OO!.abcM'aelon.la responsabilidad de los PSbles etrO.

XIV

Lu is A.. GonzJez Guijarro Pt-oCew Tit!A31, Opto. ~miel vS!OI(lga Mofular Univet$idad de Abl (T.,., 5) Jos6 M. Gonui~ de Bultrago Cateorlluc:o. ~. BloqulmiCa y Blolog!a Molecular y JefQ de Seccin de Sloquim~ca, Hosp~,al Un!vei'SICallo UolveNcW! de Satarnat)tG (Tnas28y29) Pilar lnielta CAno Profesora TIIular. Opio, BOQulmica y B1olog!a Molecular 11 Untverstdad C~ense de Madnd (Temas 20. 2t y 26) Antonio Jlmnez Ru Profesor Tllular. Opto 8ioquim1Ca y Biologl

UI~n Puebla J1mnez Ptolesom Tltu\;u tnterlna. Opto. S!OqU"lmlca y 8101ogfa Moeecutar Unwetsidad de AlCal {Tema 16) Carmen P\IQ:yo d" '"' Cucttlt

Catodr,fl1~ . OPio. 8ioqufm~ y BiOIOOIB Molecular Uni~ad de COfC!Oba (Tema 25) Juan A.. PulidO MOfa Doctor en CJeocias Biolgica& y Supe.rviSOt de lns.talaclones. Aadiacuvas (T(IIn;l$ 16 y 24) ngel Regleto Chilln ProleG Tilultu, ~. BIOQuimtC

XVI

Cfrl'nt'n Lltano Vaquero OOCiora; industria l~11mt~o6uliCC'I Lu is AHredo LOIOt'O r.ta.rtln cenaado; IOdUSITia farmacutica: Luisa L~.s Panas IOveEifl9iO'Ml posdoctorBI Antonio Jos M.attf~z Osorlo Uccnoado; ll'ldustri& fttrm:u:6u!ic.a

Paul~ l.tat.eiU NUM:t Secaria prodoctoral (Tema "1 Elena Mollino Centeno

~;,x,afumna Juan CaiiOS Murciano Fcm&nctez lnvesligador ~oral M lnmacut.a

' lndice I' REI.I(IUOCIM 97 t.a CIOO'Ifttitla en 13 interfase 98 OIVISil'l 01 meiQs;i$ 99 Unin 00 10$ g~metos ~s wmnw.

ta tecundacaot~ 1 06 Resumen inl.eQiado 106

Tom~ 10: Orgt'niz

XVIII

11. TRAK.S:'\IIS IN DE I.A IN"FORMACIN GEN"tTICA Y1'EC!\'0~0CAS RLAC10NADAS Tema 12:

RepUcacln del ONA 141 Caracteuslieas generaf,es d& la teQ!ieacln 141 EnllmologM. de la repfie&ein t45 Etapas en el prooe$0 de teplleaein 150 AepUcacJon m!IOOOitd'lal 160

Tema 13: t-ll bfldacln de cido& n~telco&: fuodamenlo y mitodo dCI ensayo t63

lntroduoeln: OesnaWr'aliz.acin y renaturaizacln detONA 163

Anlisis moiEIC\Uf de ta hibridacin de CJdos nucleiCO$ 16'1

Metodos de ensa)'OS de hlbtldacln 169 T~m~a14

Prepo~r-acln y miltct~ie de sonda& pa111 hfbridad o 175 Proparaon de $01'1dt\& genticas 175 Marcaje de las soncia.s 180

Temn 15 Ck>n.aei6n acelut.ar: Reocci6n en cadena de la. pOilimetasa (PCR) 187

tniJO(h,tCX:Il'l 9CI(I

XIX

IV. t\.SPt"rHS AI'I .IC',\00~ Tema 25:

Ba.s.e$ moleeulares de la I'I'UJt&eln y la repar&ein ~lONA 343

Conoepo de mu~acln 344 Clasl!icacon oe las mutaciones 344 npo de clula que sufre a mutacin 344 Mutaciones. a pequea escala o p~uales 346 Causas y mecanrsf'l\06 bSICOS ele

las !'Nl1adooes 352 FlepataCiOn del ONA 356 EnfeoneaOOs humana& a&OCt~dt~& ;:a

la repatacin 363 Tema 26:

Diversidad del genoma: pollmotfl$mO& 365 ltttroduccen 3&5 Otversldad genica dentro de

una especre 366 Mecansmos tmpl~doS on 41 V\U'Ieln 379 An\\li$1$ 00 901'1(!$ 3Wl Deteccin Gel pollmOffismo de secuenaa

deONA361 Aplicaciones de los pol!morlsmos

de ONA 384

Rolert ncl:t$ hl$t rka$ ..:141 Blbliogrefia 4-47

lndice analitico 449

Tem;:a 28: Enfttmod

Tema 1

Introduccin y aspectos generales en eucariotas

1.1 1.2 1.3

Tran&mi-s.io dct ., inform.ac~n genbtiea - -" .. - - ................... ~ ...... _ El ONA como m:ttafi~l genhtico! p.11sado, pr.sen te y futu,o .............................. - ..................................... ..

Ca~ctcui-5ticas ~-neraJcs del ge.netna ..................................................................... ,,,,,,,,,,,, ....................... . 1 3 .1 1 3.2 1.3.3

~de PfocaM&a:s y eucanocss ........................ . Magnllud del genoma nuclear de eucariotas, , Magnii!Jd y catacteristicas del gcnoma mitooo~l

1 2 5 5 6

A modo~ inltO

2 lNTRODUCCtN Y ASPECTOS GENERAUS EH EUCARIOTAS

Fr;)nci$ Crick. intn.xkljo "' 1rmino "Dogma oontral de Ja gen!Jea molewla,. pera desak, lnek.19o a"'es de CQO()(:OflO su import.tv~cia rNI en lo& &$$ vivos, el flujo de la Informacin gendca y la utlllza016n oeU.v de diChO' infQm'IOOn En ooncro10.1a lransmisin de ia informacin conteflida en la secuencia del ONA alas o&Jias y organismos (lesoetdie"'es tnedi&llto 1...., tepfic~cin, y s' o_xpre$in en blomolruras fvndoflales medlarue 10s proce909 de

ttat~SCIIpeiOn y tradl..eOien. COI'I'IQ(endo, Pl.l"$ ti ()()l"'j..ttto ~ rel3eion05 gene...- exiS1on!M entre el ONA. el RNA y las prolei'MS

()et)e resaltar.5e Que l.;i tf)C)(e$01\ttlei6tl ~vi;llda DNA ~ RNA - Protolnn de una mOie&U en 0178. 1~1 oorno te indica norm~lmonte on t.$ wtM metablicas. sino que cada elemento en la &ee:uerecia aporta le~ lnf0rmaei61'1 l'leoe'lll!lrin para 13 t inleliS ~ siguionto En este &Onlido, a importante el ooncepiO de planll'lta o molde molecular: aunque cad8 paso est catallzado por una f!f'l21ma. los sustratos. (nuetetido$, J~mlnokidot) no .&on seleccionados pot ela. smo que ....enen especlbdos por ia lntetvenclon del rnotcle. en concreto pct su $COJetc:, de nuclel:ldo&.

El progreo en 4lf conocimiesllo de 106 prooe&Os de lr.tn&mlsin de la infotmadn genbea oblig a la afYIJ*aCI6n diJ n!e esQVema bsieo origf\811 para acomodar otfOS proce506 ~ tcwnbiM oo.::urren. al mell05 en algunO& orgarusmos l)&t1iOOI.are$, ~mo N d c::MO dt3 c-1 ckt mo:&lli< dtl lallacll _.,/

Visin aclual de la replicacin repNcacfn de; RNA

n~n tmnsmisin de la inronn.'ICln gcnCsi

EL ONA COMO MATERIAL GENTtCO: ~A~N.cTE:!C:!E'.':O:!'E~N.cTE=:S,__ _______________ --".3

F;xpt-rhnenro de Avery. MacLcod y McCar1y (1944)

B,...f'tllll.fiO\'ml!cmactenlll -...- ..ukn111

Culll.llltJo') wdeJdM JI"' 11110\ c.ip,.11b de ~,...:ando)' b'ten~.o; h '"'\- tdcl inglb \f'RI

.X'aSI(tl!ll!l llll'llu\C 1""" fi61(lt!CS.

(.llrn~ C'CJ'~ dt ncu!~'ql~

1rr~wnronmr cm b.~U\ 1o.bd mmd{lnname. el c 11ul !V~oa 11-. OOfYII)(I;Io:il'ln ~lnt~o:..t '>~'"'*a 1;. del

ONA y f"J((pei.!Jd..~ hS.,.'\1-q.t~lfllh.~ fll~cltC~ (\~(\U~ll .. , llr-J\ Cll\111~11~)1\11 (JihlN:\ es el n.'SJXIflS.

4

H 'tt\1!> ,e; m:m::~ ,.,. ftl el 0' A (\IIU\:;) ll!l)\t-l.'liJI

.:oo fslim}

INTRODUCCIN Y ASPECTOS GENERALES E.N EUCARIOTAS

Expt'rimento de Rersbey )' Chue (1952)

1 --=-. Vin.s fl. d~; l.tpo IMn !I!.J:I) (. Al lwlmosenl

CCI)Ln'o~ ~ pul{dcJt $C:PIIr'.l(l(l~ ~truiUo!m:ttildatlt~) \le biS-N,;terins(~lfimciUAI .. p('OC'11ldistil\'l() tumaflo

n'"'icbb \lO.. -as rlldi~th'll.\

(.r.S)

111 )~ (, " 11 +

k-!t.U.: r:HI.IMd 'l'lU (JSP) U"O

CAAACTERISTICAS GENERALES DEL GENOMA 5

1.3 CARACTERISTICAS GENERALES DEL GENOMA

1.3.1 Genoma de procarlotas y oucariotas Con:ptuattnen:te, el geooma (ce la ralz grieg proa,.,...,,_ ,o.~ lo Qlllodad 0.0 ~A 1 ~o'IJHp>lld!nti~ll'floll~ f"'>(~ot tg.oallfll.'n!t. h C11lfll0o!l MI)'OI'e> 11;' J,r,. rtuni!IM

R~(!ldese que los Otganlsmos procat lota.s ('o procarlontes) 501'1 olllas (ecJbacterias y arq~lenas) de IM'\&1'10 pe y relativamentil sencillo. Se n:~duoe a un nJCO CIOmQ$QI'OO formt~do por una mol&wl~ c:.'Cult\1 ~ ONA, loea!iUldQ et\ $U$ponsin en el (:ill)$0!. 01'11~ llt'mado\ zona Jk.\Cft:M ttUCiltOidtJ. Sin meml)tan& que la delimite. E!llree~le enoon!far. ;,c;lcm.b. una pequet\a cantidad de material gentico extra. no esenCial. en forma de pequMas molOJias dtartares de DNA, 1:3macas pfl)smidos. Los plsmldos poseen la propiedad dG replicacin autnof'l'lrlll.. ea decr. sin ooohnaclbn alguna: eon M di'hSIOn celular. JU(!9an un papel lmpottanie, al eod!!'tcal p-or.elnas que confieren res.slet'laa a tos MllbiOtieos. u otros m~uerlale11 t6Jucos. y ofrecen l.tn8 imponaMe ~ como herramlenlas en la teCt\Ofogfa del DNA reeomblt\an:le. conctetamente como vectores para la lllOOtPCit'8clOo de ONA a clulas..

t.as ot!I\Jias de eoeartot.as (o eueartontes}. &anlo mllloetulares (animales y planta&) COO'IO vnloeOJiares y multitlulares $imptos (Pto1o:oos. hongos y ~lgtldriat et1 t'lf'lm'lales y pltl1'113!1 cJofoplastos 81'1 plantas. li.SOSOtM$ IN\ a~~~. e1e.) y ceras esti\JICb.ll'as (ret/ct4o endop(cisnuco. COfTII)I8jC de Golgf. etc.) El nctoo oone oomo caracterislica esenoal la pf'@WIC13 de una doble mamOrarm nucle

6 lNTRODUCCIN Y ASPECTOS GENERALES EN EUCARJOTAS

caractertstlcas dlfer.nclatH humano

1.3.2 Magnitud del genoma nuclear de eueariotas El material gentiCO conwnldo en el ncleo supot1e generalmeota ms def 90% del total de ONA celular. Por 1an10,

el ptlmar aspecto a des&acar es &u magnitud con re&peeto al genoma rMocondrial y el de procariotas. A ditereocla de sto&, el genoma nudear est repaltido en varios cromoeomas. en nmero variable segon la espec:i&, 9(!tlenda l:t lnurumi&d ( lll:malmet~l

8 INTRODUCCIN Y ASPECTOS GENERALES EN EUCARIOT AS

~bargo, se ~llmil hoy en dil qoo ~

Tema 2

Componentes fundamentales de los cidos nucleicos

2.1

2.2 2.3

C.omponen.t.e 6eido: Foslalos ................................... " .................................................................................. . 2.1.1 Monof06fatos ...... ......................... --2.1.2 Oifosfatos ..... . , .... . . 2 1.3 Ttifoofalo$ .. , , .... 2.1.4 Tiposdeenlaoes6osrt~w.... .. ..... - ...

9 9

10 10 11

Componente neutro: AzUc:"*''"' '''' '"""'' ' ''- - .. .. .. 11 Componente b.lsk:o: Ba.'" nitrogen

10

2.1.2

~i(h.'t fo;l!l')-1 t vrnpuc lo v1 ,:atlt pttlfr ... l:.hao.kll

El crifosf;~to (PPP1) e preseda a pH I!Skllgloo oomo t-etraanin. No aparece en forma libre, M10 foonaodo parte. o&cn(::iefr'nen1e, ese nuclecldos-trifoslato (por ejemplo. ATP).

ki(lo tn(oc-l~o JI4P~Otll

COMPONENTE N.EUTRO: AZCARES 11

2.1.4 Tipos de enlacas fosfato Pueden distinguirse canco tipos -k\~\l)i H'~

0 11 0 11 f.lfalllllilt!r co

12 COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS CJOOS HUCLEICOS

2.3 COMPONENTE BSICO: BASES NITROGENADAS Son moleculas OO!erodcllcss, con ms deo Uf'l tomo de nitrgeno.. lormadas por un anillo llnloo (pltlmdine) o por

dos atlllkle condensados (porina),. Obs.tVense en 5os ejemplos de bases qoe lfltervlenen en lOe cldos nuclekos f.a numtf8Ci0n de lOS tomos del helefocldo y la posi016fl de los wshtuyentes eltlemos.

2.3.1 Bases nitrogenadas ms frecuentes: 2 tipos

P{lm~uln:s )' nomencl:uum d~ BASES PIRIMIDiNICAS

() N

NH, l~ o " 11

.;:i tosinu nclet) pirimuJin:e (2 - N ~ OOt:nmil

( {>~.11'1< nl)plif'lllfl)

' .,;'11 .....

' l

2 )'4

' 6

2)4

bm u ll.4-.tloxt>$.mc"olrnmJJII>

( S.metdurki.loi

CH,

5

guanina U-..niD!H'>~I.Ipwortl)

COMPONENTE BSICO: BASE'S NITR.OGEHADAS 13

2.3.2 Otras bases de inters b iolgico y clinico Ei$t9tt QCt :\K\1 t

" " '~\ w . ' " hp.:O. Mlln'IUfi(IDh

14 COMPONENTES f UNDAMENTALES OEJ.O~_CIOO~CLEJCOS

2.3.3 Propiedades fisicoqumicas de las bases purnicas y pirimid nicas

2.3.3.1 Existencia de dipolos Toda ~s bl'ltell PQSeen lomOS: eleclronegativos de O (e~toeplo aho.' 41. ri 1rupv o:o:1o f.;ttJ~~ pa~dt un cnlu!X' ...-.Jn ~i~l~. o;./.rt;ra-. Al cai~P~~r el

)l(oulo) .Y J 1 dNk d N nudo:;n al O li:t ll'VJ'!I t'(kl. K OIIIIV~\IC' ~ d la tU

COMPONENTE BSK:O : BASES NITROGENADAS

En oon&eQJencaa.las tao~omerias de la& bases nitrogenadas 90n las sgu.entes;

tina OOsc (A) rrcsenta u~ sola tsulomcra:

La ltlul (lmC.ria de A es im1ns-amina primari:l. t~ l:tuWn~m' mrnt ~~ nnmbnm

pcmeo.SC \ 111 .11~t

16 COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS CIDOS NUCLEtCOS

2.3.3.5 Carcter bsico Todas las bases nitrogenada5 &OO ba&~n d~blle$. J)Ve$ M lrtQITIC)$ do N, tanto nuelot~~ros eotnO extraMJelerot.."

pueden protonar. oon valore& de Pl

COMPOHENTE BSICO: BASES NITROGENADAS 17

E&.la di&OGiacin. oomo cido$. de 10$ grupos enol oompensa en parte el det;equi!ibtiO tautomric.o antenonnente con&tderado, a..mentando la presenCJa de las formas lactim;~ (enof). No e$orci6n de la Jl.lz en el ullr.IWO(e43 (UV), ton un rrW.imo cerea de 260 nm para kM:ia& ellas.

14

7

; U>() 1111\ ~~ ll!llok b nu:;eda o.k ~

u;knion

21ro nm rflltctl'iertt ron b medida de prod~

Q,:=>"'-r-', ' \ guanma

1 1

' 1 1

' ' ,, ,_

longitud de ond.'l (nm)

El mantcnimiemo .-esta propiedad en noclosidos. nt.ltlebdos y ados nucleico5. de los que las bases forman Pilr'W. POrmito &u vti!iJQ6n C~nalftie

Tema 3

Nuclesidos y nucletidos

3.1

3.2

3.1

E&l ruc-tura de nu

20 NUCLESfOOS Y NUCUTIOOS

3.1.1 Caracteristicas generales La \P6o oovalente (~..ce N-gJico$ldico) onV. ao bMe y ol O'llli~~~ ~tibost'l o oesoxirrbQ$8} toe ~s:lablece enlte el

C-1' {carbono ancmrico) del azUcen y el N-1 del anillo pirimidinico o ~1 N-9 ~Millo purlruc::o, oot1 prdida de un~t mol6eult'l ele~

3.1.2

oildwdo llll n\o!ollt~c-~.111~

dr;o~>m"l>o."'iil. ll:t';.t\l""t..,. r'floueflll'illl &'11 d U 'lA lle-IITibon~KWsicli lf'!IU~Al (tn R"' (t n. DNA)

"' "'~\). Nli o o ~~> -~ :!:("' IIN ~~~~ 1 e O;l_No "_~ , o ' :; H~~ 1 ~ 11J.Ji

9-1!' "-1-1 -jl.i). !lo(~ ............. . ~ O- lll' dC'!IIctl!I'-IHl 1-(l' -lbol.l l' ,_.,_ ...... nllu{o;o, ....... lldlmiiM "~""';_!) ......... nhc>r111_.._l~ ni'Ciflllll-1) tunin "~" - ;'c\,

la Cfi$1Anclon antf9 nbonCJCieSidos y desoxlrrlbonllde$~ esllit'la, obviamente. en la presencia do rl>o$

ESTRUCTURA DE NUCLESIOOS 21

3.1.2.2 Otros nuclesidos de interCs biolgico y clinico Adems de los oompotle:l'\1es de 1\uCieObcfOS y ic:ICIO!I nucteleo!l. eiste' en lf'l Mtu1111ez:a 0110$ nu

22

u

NUCLESJOOS Y NUCLETIOOS

l

Cmfl!lll.. "'''llo._"'f''"'k.o.' A. B. C, D \lhlllll)-' \11: ..('U,

h!Kto.lo.>) A ti lo:

ESTRUCTURA DE NUCI.Enoos 23

3.1.2.3 Anlogos de nuclesldos, lnhlbldores de la transcrlptasa Inversa Se~*' para combatir tos rettovlrus de la lnrnunodellclencra tunana (V1H1 y VIK-2). causan~es da! SIDA. En retWK:S~ aeWM como l)f'Of;';rrrtaOO$ ya que ta celu!a an.flVIOtla tos eotwierte en lOs eoespor.tte.ntes desoxitludeOsiCIOS 5' trifo~fato. que son los verdadeltos firmaoos. pues eompiti!fl oon los de$0J~irribonuelettc>$ normales. 1mpicliendo ~ ea ttansetiCltasa lnYBtsa. ptopla del v.f\ls, sintetice el OHA COI"'lPlementanoal RNA vinco

" 1 !IUtUkO\ lk.'\t 1 '\

Uased: la fmliru Cit'l!\in:. Hi(k"3ntin;l ..uc d~n\

24 NUCLEOSIDOS Y HUCLEOTIOOS

Otras carac!Kr~leas . atas que slo se alude ocasiOnalmente: Proeo

ESTRUCTURA DE NUCLETIOOS 25

3.2.2.1 Nomenclatura lO$ A~~Cietidos s.c nombran se-gn dOS Criterios: a) Como steres fosfato del n1.1closido. P(l( ei~: adenosina-monofosfato, guanosina-difosfalo. unchtl~rlfosfato,

etc.- (llble'Vi8CIOS.. respeC1ivamen!e, como AMP. GOP. UlP), b) Como icldos. sustitttyendo la terminaeiOn del nombre de ta base por el sufijo -iNco. Este criterio slo se ul:litll

norrnaiMMte para tos nudet5idosmonQfO$fMo. Por q .: 6Cido adef'tllco, ciOO guan!lroo, cido undilico. etc.. (respectivameole. ~1'3 AMP. GMP y UMP). En el caso de nuclebsidos.-i'l$0. anteponienOo '" lctr

26 NUCLESIDOS V NUCLETIDOS

llMf'KLATURA DE NUCLE!niOOS SENCILLOS Pt.RINICOS

2' --adeni lato adcnosina 2' IOsf:uo

5'-udeniLuo ndo:nosina-S' fosf

ESTRUCT\JR.A DE NUCU 0 TIOOS

3.2.2.2 Estructura de los nuclesidosmonofosfat o que forman parte de los cidos nucleicos

f\udco.\~idc-mc~noti~f:,to :omponcnlt's dd RNA ( - ribont.K:Icilcidos) Putiniooe 1 PimidinJCos

~fe, oo,.l~) 001-fu rl) =I~"~ ~ ,, 8 "8 o=r-.~l'~u. l. ( MI', ~t-\tl'. l .

,J- j' IOO-fMO , ... no,ill o~ f't..f..., .,,...,...s.r,nr~t" 'll .. ~-f .... fr.Sil

Nuckh~ mooof~fa1o compo1~1MCS del DNA ( = dcso,ilribonuclccidos) PurCI.OOS 1 Pirimidlnicos

l~) o "1{(00 Sil 1.,~} () lf:.."' N o '

"8 =~~ =L,~ ooaL>L~ o= t-()

28 NUCLESIDOS Y NUCLETIOOS

3.2.3.3 Absorcin de la luz en el ultravioleta Los nuCieSicJo$ y lO$ nvCIOOii

ESTRUCTURA DE NUCL E TIOOS 29

3.2.4 Nucletidos cclicos Son nuclesidO&mono'o$f.ttlo en bs que un miStnO lostato &e une a do~ poaeclone~ del a:cVcilr (do& OH

diferentes), generalmenle 3' y 5' Actcln oomo $8900(10$ men~~. ttaMI'I'Iillendo sellales desde el enlomo (POr 9J$mplo. hQnnoMs o prime>S

mensajeros) a 1nterior celular .

3.2.5

.:o~.:r """'k .. ,. ""'""' f ... r.v ... ~

lflll.~~o>:

'~'""'' "~ ,~o,;h,'l))

3'.5 -fosiUto cidko de adc:n

30 NUCLESIOOS Y NUCLEn DOS

' OP'Cll\1 \ (i RII)O>, Mononudeudo ' roochOOidll

11- - nldMidc" o-\ 11 " 0:) ""'~ , . .., ~ \U cbfOffut.J ~':.-o- ~~ , en d NAIJf', Wl '( ~tuf'l' l~idJO Mh~e~mf..:.

.\,, , ' ""

!k) ou 2'

o=l>- ( llkC111mrll ' n!:I~'J!III. ,,,,,mm rt''IDIAU de ,.,. CUO."IWI~ N:\ o ) ~AOJ ,, 1 b

Tema 4

Estructura primaria de cidos nucleicos

4.1

4.2 4.3

4A

4.1

Aspecto& gener;~.les ,,,,,,,,,,,.,, ........................................................................................ _,,, .............. ,_,.,,,~...... 31 1 1 Niv

ESTRUCTURA PRIMARtA DE CIDOS NUCLEICOS

Exl$1en 00$ 111)0$ O& &eido$ nut~eiC:OS, cattlcler 1'1'181CroMOieo.Aar, kitmedas por la tr.iOrl de nuctebsldos mediante enlaces cova .. ntes 3'5'fosfodlster. Por tatiSO. la uniOM ~a es el nudetldo, o nuele661dc>11'10f'10fosfato (generalmente c:ontemplado como 5'-NMP).

Los ~idO$ nudeioos son. por tanto, pottmeros de nuc:letldos o potlnuc:letldos, con t.Wl esqueleto ll.neal 1~ oor u~ allemas de foslato y pentosa (parte oons&ante de la secuencia), del c:ual sobtesalen lateralmente las bt'lses (pat1e varia!*!>, que define la secuenc:U), unidas al azcar respectlYO por enlaces n.glc:osktic:os.

Por convenio, ta secuencia siempre se Indica en direccin 5' ... 3', es dec:lr, con el extremos terminal (5'P) a la Izquierda y el exlremo 3' terminal {3' OH) a la derecha.

j j ~ j 5" .. -P-ok -P-oJa-P-oJ..-P-ola-... 3

Dentro de oste ni~ o&truct\.1111 110 esWdior6n a c:on~uadM tas 6istintas formas de repteSentaeiOft. fas ditel'~las on c:omposiei6n quimlea de los dos tipos de ddos nuc:telooe y~& propiedades 1\~lmicas ms represenlativas.

4.3 FORMAS DE REPRESENTACIN LINEAL P\ledon emplttaf'&O M~ 6 niveles. de SiMJ)IitleaeiOr'l creciente. En general. se haoe uso de la letra Inicial de las

bases, en may~, JNirtl representat a Sias o a sus nuc:tesldos. El c:ldo nudeioo propuesto oomo ejemplo es~ RNA (~Cic

DOS TIPOS DE ACIDOS NUCUICOS SEGN SU COMPOSICtON

4.3.2

,~ucle~n CO\IIII'n!c liftefll de fllld~

~ l...L)

:\\ \ \

tsq11cleso !p.>ll( "'''* '!

-~"

...r;;;;; l...L)

Representaciones esquemticas

1 ~ 1 l h .~ ~

33

6~- ~ ,. ,.

0 A G u ("

34 ESTRUCTURA PRIMARIA DE CIDOS NUCLEICOS

Segn la fl04aeion de fi'ITI.lla completa. la tepttscnl

PROPIEDADES FISICOQUiMICAS DE LOS CIDOS HUCLEICOS

4.5.3 Hidrlisis qumica de cidos nucleicos

4.5.3.1 Hidrlisis cida

35

Los k idos fuertes escinden tanto lo& enla085 fosfodi&ter entre nueseoSidos como tos f!I'Wioes Ni!!loosldlocos de cada nuetetldo. P tanto. sirven P

36

....

' l

"" ,.

lf IIIOl~'OIIM(OOII dl,;tlfii.U haola.) dt nuo:!mnl(>-1' J mo~t'Jto d d .:o

(l',J'...:NM I")

--

011

011

ESTRUCTURA PRIMARIA DE CIDOS NUCL EICOS

f'Jronplo hidro)t;t~j sleliln ck ao RNA lnll(lrCriQO ~do) por

( llMIO _.rcOu.:ktl (un to:trwribunudc6ti)

o \-

Tema 5

Estructura secundaria del B-DNA

.5. 1 Prop

38 ESTRUCTURA SECUNDARIA DEl. 8 -0NA

5.1 PROPORCIN DE BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF A pesar de que la COf'lllOSicin de bases puede perecer un aspecto ligado a la eslructura primaria, su estudio se ~e en este temtt por eMar diroctamonte relacioflada oon la esttucwra secundarla del ONA. En un ptlndplo se ~&yO Q~ et ONA ost 1.36 .... u . 23,1 T011uga 29,7 27,9 22,0 21,3 1,06 1,03 1.05 ~ .. _ 29,7 29,1 2

MOOEL.O DE WATSON Y CR.CK! FORMA B DEL DNA 39

5.1.1.3 Relacin entre aminobases y oxobases N observarse QI.Nt A/T-= CtG-= 1 ltlmbib'l se h.tl d~e c:un~ir (por razones ~ltlclaf'IWite matem&~lcas) QUe lA~Cl t

(T +G) = ' Por tanto. puede conduir$&. c::omo tttaOIOn ~ICional ($1rt un signdkado especial). que: 8--aminoplnl(l$ (Al+ .!.;;ffiinopnimitlinas(C) 6-oxopurlnas fG) ~ 4-oxopwmid!nas {T)

5.1.2 Otras relaciones son diferentes segn fa especie

r~On de .:tslmehla. A - T Ci +- C'

que. adems de tener oo vator d-'orente paro eaa ospocit, no -10 t~proKitn.'l a la unidad como !.MI mmoes anlerlorea (..-er labia). Por ejemplo, "" ;:~nimo:~lc:$ la ro~OO de: as.melri& !!':S s.etnpte supet~or a uoo; lo rr;-smo oourre en planeas superiore$ y hongos Por contrsto. en baClerlas y virus 10!1 valores son mucho mas variados &Uperiores o nf9:1'\10te$ a l

40 ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL BDHA

P.,.& un;) mop comprensi6n de 1

MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA 8 DEL ONA

(:7\ Al re'lre,cow uo par debo~ )C tu'lpk--J la f.1n'lula de upo : parot

42 ESTRUCTURA SECUNDARlA DEL B.ONA

1

5.2.1.2

lluscrdOO. mediante ut1 ejt1npt.o lup(llil.co bl"~ ~ 1:1 ~s:ic)(Jn del ONA humano. de cc'lrl1o0 1:. dobk hcl:m del DNA pcnni1e c::(plicnr las reglas de Oargaff:

C:ornp

MODELO DE WATSON V CRICK : FORMA 8 DEL ONA 43

5.2.2 Geometr1a de los pares de bases A pesar de la dlfM:ullad de vi&ualizar !al geometdn

44 ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL BDHA

5.2.3 Antlparalellsmo de las dos hebras Ya se ha ncicado que el apareamiento oompleto eotre &es dos hebras exiQe que sus secuonCJN sot\n

compklmentaas. Debe al'ladir&e ah01'8 que estructuralrnen1e e!Uo slo se puede conseguit Si ambas l'lcbms $0 di$900Cn en senticlos ()JNfliO$; a una avanza de 5' a 3', la otra debe t\acerlo de 3 a S'. Se dloe que las hebnls llenen polarictad opue!Aa, o que son antip;~rilleias, El concep(O de an~lellsmo va, pues, esuec::hamente lig3d0 t~l c:se complementariedad

5.2.4

'o' e"! n j .;o ~ '!.

Diferencias en la secuencia de ambas hebras

~l')(qutla ~.k la~ !lo.

~(,w.:mpu llo.:lltlldC'J' a~'(tn

Co)mn. tkl :.C)Ih'C'M) C$hMt~OO p~~r, d b

WO:UC'J>n.l dC'-.:lll&:oa)

Debe desta %(1'--C"-'""'' %(A G).,.tul o!%( r C\.,.,,..,z

corno consecuencia:

%(A~{i~""'' > %(A+G~ctrct.! %( 1-.-l').,tnl < %( f ( ~,r,]

MODELO OE WATSONY CRtCK : FORMA 8 DEL ONA 45

En prinQpio, la existenCia do hebrt'S equilibradas o no w refiere a rogiOn$5 lot dll!...:kh00.,.((orrrlo;lt'o(11htt() .. T(' )' GA

(dt.l:c prndC' ~ u~io:oJ;etn 1~ ~~oet'ICU!I

(.,..r T ' A o;!i el plll'l(l rt'lfo;llo)f, pr C 'fG ~" cl pl~no ~ ,.

...~ ~"' s

,

~~dpo(.k#')dt .,.., ... "'' ,jt .. ~~ t>;'OI

"f!CCO> .. Ql!lttl(lf ,.

.~.

46

5.2.6

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B OHA.

Parmet ros cuantitatjvos de la doble hlice

Ejrn;.do:

""'" ,...,.,. .. 2.~ nm (22 J

liiAmetro de la hliceo 2.)1 tiM (23.7 }

.. ..

Dobl-e: pc:riodicidad a k> largo del e-je longiludinal:

1 t j C dt b hlice (.-conttc' l.:e pucnlb

de" h i~otk bpm'sdc ~)

A pan ir dd dllto de $C:'p.1nu.:.16n enll't c:ub

MODELO DE WATSON 'f CRIC K: FORMA 8 DEl ONA

Lu ~":SCakrn Fnmdsco 1 del c.-.sullo didcradn como

u.OOdv tk lalubk hlicr dd 1>1\A,

48 ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B..ONA

5.2.7.2 Coplanariedad, apilamient o de las bases y carcter hidrofbico

r~-~~e""""'~ wtllkll me..:" y~l(llbl't"< ~~de 11 w....,

Resumen de ftlcrtas que

e>tabilizan la doble hlice del

!)NA:

Las f)ages ~inlcas y piM'IIdlniC89 de ambas cadenas se encuentran dirigidas hacia el interior de la doble hlioe. superpues&as. bmanOO un apilamiento similar it un ITI()I'ltn de monedas Como consoooenci;t de !al proldmidad y paralelismo de los

MODELO DE WATSON Y CRJCK: FORMA B DEL DNA

T

5.2.9

,\~ddo Sll! lph ftdlit) JXII".I :q~l:lf b l(MTI\ III;;()n 41.: los SlPt'O'S. Co11l11) c~uhu.!IICi:l tk l.lu~unclrl3 de 11,..,.

(llltS,

e

' '"=~ ... \~" .... ~ ... . ..,.-.... ...... .......... _ ..... ,,.._ ....... ---~ .... ........ .,...._ ............. .., ... -

Significado biolgico: idoneidad para la replicacin El mooeJo de doble hliCe de WM$0n y Oick oonnilc olqlic;v

que se mant&PQ& una eslt\lclura ~ular a ~~ de 1

Tema 6

Variaciones en la estructura del DNA

6.1

6.2

6.3

Varlant~s en dob&e hebra: fonnas A y Z ........................................ ,_,,, .. , ... _,,,, ........................... _................. 52 6.1 1 forma A del ONA. en compc~racin ron la forma 8 .. , .. , , . , . . . , , , . . 52 6. 1.2 F()tma z del ONA. en comparaciOn 001'1 las formas By A.. - . . ...... . . . ... . . . . .... . . . . --- . SS Variantes toeales de la esti'Uetu ta s&eundarta del BONA ............................ - .............................. 56 6.2 1 Cl.IVatl.lra de la doble hlice .................................... , .... _,_,,, .......... ,,_,,,.............. ............. .... . . ...... 57 6.2.2 Palfndrornos .... -,_ ........ - ....... .,_, ........... _,_ ........ _,_ .... _,. ,_ ..... ,_ ...... _,. ,_ ...... _,. ,_ ..... --- ..... _,_ ...... ,,_,_,,... 57

6.2.2.1 Conceptoycartteterlslleas , , , ... , , , . , , , ........ ,_ , ........ 57 6.2.2 .2 Jtpeticionesde~i

52 VARiACIONES EH LA ESTRUCTURA DEL ONA

6.1 VARIANTES EN DOBLE HEBRA: FORMAS A Y Z El ant\li$1$ POt ditraccin de rayos X a reSOiuciOn aiiOmiea revel la emteneia de dos nuevas lormas esttucrurates

o QQrr!ormaciones diferentes a la BONA ttacJicional. en 199 que se mantienen las caracteRsucas bsicas de ste (compemenlarledad, amlpara~mo. helic:idad, etc.), JM.If'O ll"'Will

VARIANTES EN DOBL~RA: FORMAS A Y Z

Pra tn{hlnr- ln,'> diferenci:t!i c....,ln~elurnlc!. .!>C put.'c."CU!!Ill"iil t'.n ambrn. Cibl"'- .sla 1msmn: 15', GGGTATACGC ( n

{3) CCCATATGCG (S'l

E~1c mismo nwlO desde su plltc :.uperior) 1)cnn1h: tluslrot que f:t hChcc .\ c m.1s :thu:na.

54 VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DMA

Un:l '*j, complcmcnwria !1 la anterior. all.l: \'Cl que ms Cit"n::ana n la r.,'"'lidad, es la dd modelo espaciaJ compacto.

la-: t~sc~~ C'ltn colorc:ldM en roo;a y el C$qudcto de pcni0'\3'> y fosfatos etl \'Cfdc.

hf~fl) put>d4'

~ ... 1S3nnt

11 pb-. o.:J nrn

los Mll'l!OS

VARIANTES EN DOBLE HEBRA: FORMAS A Y Z SS

6.1.2 Forma Z dol ONA, en comparacin con las formas By A La oxiswn

56

modelo LridtmcnsionnJ

del par de nuclc(ilidos CEG

en un Z-ONA

C: tdn t"u cvufum~ tmti bas

VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDA RIA DEL BDNA 57

6.2.1 Curvatura do la doblo hlice A pesar de ta regularidad del mooeto ele Wa1$on y Cnck. e.1usten P$QI.Ie!'IM diferenOO$ IOcilh~s en la ~!1\IChJr.t de

tos ONAs depe.ncllendo de 106 nuclelido& integrantes. Por ejemplo, on detQrmn(l(!'a$ $OC\IenciM: los p;)rt$

58 VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA OEL ONA

. ...... -

~q t lf JIJG le 1 J c c;: 1 f Id JC 1 t Ji 11 p- hctnl q x 11 1 t 1 e 1 e 1 f 1 e xe 1 x 1 e 1 a t x 1 t 1 + )f hcbD 2

( - ~ ITITiliGICii i CI '< Ji lll lf i C IG !f IG 1

( 'I T!TiliCICP.Jel ~ ~-- " x 11 1 t 1 e 1 a 1 t 1 G 1

~ h 1 , t " l lll"' nmrkm-:ontiiOI

6.2.2.2 Repeticiones de secuencia En OCIIIIonH H ubl~ZJ como Sinnimo

de CllifnclrOI'IO ti ~ ~ ~.~que leen en~ opMtol .. do. ftllllade6 Mnen la '*'-

~ e .mbol lados del c.ervo ca. ..,....... """*"'o no)

()lro temwlo ~ 95 .. dt ~IOirc:lnN dnc:tn, ~ M emplea Cl.lai'IO .,. "" ONA M)' repeCICibn O. una ~~ (\DCIId t rapet.cln), "ida $itmpre en ti mismo tonbdo No son I)CIIIindr011'10$ J)Otqut no cumple el criteriO de igul ONAI. ocupando W\8 parte impoa~nle dt w 141C:!UeftCia no tienen ~ tn cuanto a ti M!N(11Jtl seaJI'ICiaria de lol 6ddot ~ por 10 que Plfbt de ..,. i'ft01rIIOI6to M r""*" tos~

~ llumtllll j()G l~t$ ~ lo(' kt'll C1t lotfltiI. ~O.; ~ 1 m!Ud ( ); ~umnll tn.1tad ~~ ~: '' nAGCAC 3 ' , 'T1AGtAC l ' AA1CG1C ~TCGT~

-~~ ................ La.~"*",...~ w lea ncianmo-.dbdo

\a....,.. l,.uc( t ~-:-~1 t: !>- r..ttOCAO:: 3' 'M'A A.C 1'

MT .. G!G Mfe';TC

11'-t.GCAO Suloo 1~ V .. ~ W' ~CII ~WMr.t...t. ckras

1' !TAGCAC ~ M":'CGTG

VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL BONA 59

6.2.2.3 Palindromos en molculas do hebra sencilla p.,,_, el C3$0 de bCdO$ MJCieieos de hebra ser.cma, la deJinieln de pal~omo no se puede aplle:al esttiCial'l'lef'lte.

Sin embargo, dada ta relacin de oomplementane

60 VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DHA

6.2.3 H-ONA: triple hlice Se trata de IA'WI estructvr3 poco h

MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNIN DEL DNA CON PROTEINAS 61

El ftCii'I'Mie(lto se etetce a ltavs de regiones o elementos 9$tt\IChJreNx. Fue el primer molivo ptOieco de unin al ONA bien esludiado.

Se n.- enQ~:;~~Mr;)(SO en l)tOieir'laS regt.RaOOtas de \a expreSIOn gntea, tan.a en viru tomo en l)f~t\S y eucariolat. Est tormndo pot oos tegmeniOS pepUdloos en f.thlioe, de e&trvctura rigidl. ~rt'dO$ por una secuel'leia de aminokidos. nexll)te, que permite QUe las dos hlices se t~proximco entre si. una.

62 VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DHA

Es frocuente que uNt protelna p-eserne dos moUYos HTH o bien q~,~e $C -1 1:(10 d ONI\ (fl ~$1() \le b1 proto:irJII oo $C mu~r;a)

motho 2

lllll hficc:t de fl'l:lmoc'11ni~

doftl;,.,,-do$ doln111i~ lflfl

~tll.'f!Jatl Cll 111 m~,..1'108

MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNIN DEL DNA CON PROTEfNAS

' 11' . >1\1.; ... 1\1111

. .

M(liWO bc~t~t.:odo:mln)l) d 11n61CO )' S.U in1\~in ooo c:l O~A

r.'JOI ~ qu< ,,_...,..~'ffllu

tooo:oJd .. .....,-....

ZI\C'II(>J h(lw." _..,;.,..,,o

(,a, ~ lw!K..,. (,_ , .. e;.~-.. III>IUt ti dtrninlo;l ll1 11

6.3.1 .4 Motivo dedo de zinc

63

Se ha onoontra~' 6: 1W l'OAI'.:tlli:J\'m (J.: muennon ll "lgll\'ft t"l -.:o 1111)'(11 dd ONA

lll' .WS heb!b

64 VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL OHA

6.3.1.5 Motivo cremallera de leuclna So trata ele una regn de la ptolelna CIJYS secvene~a llene un te-9;10uo d& ~eir'lil ~ 7 aminobcidotl N ~

t.., confQrm;Jcin u.-beiiooiCSal &e ooooentran en un lado k>9 aml1'108cido, hldrOIObioos, d& tal tnlln(!rn que leu 110 repne en la msma cata cada sfalos. De algOOa manera, este modelO ~ asetne~ a un..1 "Y' en lt'l q~,~., ot talb

Tema 7

Estructuras de orden superior de DNAy RNA

7.1 SupcHtH'Ironamlento del ONA ................ ,.,_, ........ ~ ........................................... _,,,.......................................... 66 7.1 1 Superenrollamiento del ONA en procariol.a$ (y mi'looon

66 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA

7.1 SUPERENROLLAMIENTO DEL ONA El supere.nr~lento. como parte de la eondensac:iOr'l ae1 DNA et~ goner'CII, PQ$08 esoecial significado para

enlender ta organlzaclOn del cr01T10601Tla. En concreto. conttb.lye a e~icar como un DNA do !.Ortl66cen. Su ceuw. oomo s.t ~ 3

SUPERENROLLAMIENTO DEL DNA 67

7.1.1.2 Conformae1ones superenrolladas En tas cluiM el ONA generalmenle no se onQ1911trtl\lo!lllfloOIIIII.I llf"':l llflf.ollu11i1 u.'lk' ~1) l l'(_ ... (\'111 '11,_; '*' '~t~:hJ

t-o)IIflrtlwt.o(nf . ,. I HI\li

7.1.1.3 Demostracin experimental del superenrollamiento De e$I8S dos po!l!bl!ldades, ~ ONA se encoonre normalmente en las clula& oo un e&UKto de upe~enrollamlento negativo. la primera evodeflcia experimenta~~ que a.r--6 e Pf'OPOI"IOf ta twptMI5 del superenrollamiento de la& otadenM se obuvo gracias a la aplicaciOo de lit !tnica do IJ!jraOIN'ftflfugacin i.scpicnica (basada en el equlli'btbde &4:1dimt'n13Cin en un gr;'Jdlcntc

68 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA

b&n.U. 111. l-IS tmeno;w \'ekK:i\l.o\1 oJe dnM:I'*Innr. ONA de &lbk bcbn linul \'-''"-'t'llfil. melll)l; C(IIJllpiOC!Ia

bond;r 11. lt.S 1 \'C:IoK:i~ de -""'unern~ rnc.:nnedia)' DNA. do: dobk b.:bnl (lrrcular, rcobjad!l

banda l. 20S { trll)'ilt w~idad o): kdlllllent~o:i6n): DNA de doble he,. C'lro.ot. jUI)C(~:nrotla:ko tiiltuth.lf:i mM CO!tlpltlll

7.1.2 Aspectos tericos del superenrol lamiento El ~de la Topologia (rama de las Matemticas que e:srudia las propiedades de posicin r&latlva de tas

partes de \.1'\ objeto, propiedades que no cambian al ser somecldo a delormadn} ha permitido aClarar la eS4ructura def ONA 5\4)Etrenrollado. El signo y rnagnil\ld del &upetenrolfamiento se asignan oon base en dicho estudio topolgico. del

e~ llo &e comenl.iiblt.i du(lflf1ici.,.,..,. trona. .. & do.lcc htllnll t(l

ESTRUCTURA DE LOS RNAS 69

7.2 ESTRUCTURA DE LOS RNAs Como y

70 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR OE ONA Y RHA

7.2.2 Estructura tridimensional de los RNAs en general Existe una gran diversidad en la esttuc:rura trtdmenslonal de las t'l'l()j(!oCulas oe RNA. ~tia es oompteja. \mica pera

cada tipo de RNA, y resulta de la 00fl"'bit'I&CI6n de eSirueturat se(:l.lt'ldariM l~!es, estabilizadas por erce& de hidrO!)enO y por lntetaoclones l*!roleicas oe apil8mlento oe b*Ses. Sv e:sb.ldiO ooncrolO &e har mas adelante. para cada tipo de RNA.

tallo

A pcs:ar oo && tne.~~iMenci3 CIC una e~rucbKcl secvndarii'l propiamente diel\3 PN' 7$~.

3t~ ... ~ 16S uoo ,...._,., ... ..-..wi'C

ESTRUCTURA DE LOS RHAS 71

7.2.3.1 RNA mensajero (mRNA) La propuesl8 de la eJCi&)ncia de ~ molOI.Il

_c7!;2 ________________ -"ESe:Te:R,UC>Cc-T..,-UR.AS DE ORDEN SUPERIOR DE ONA Y RNA

b) Presencia de nuclesidos infrecuentes Una de tas caracteristtcas de 106 IRNAs es que en su composicin presentan, adems de tos eua!ro princ:ic>i'IIO$,

otros nucle6sidos no comentes o infrecuentes, que pueden suponer hasta un 10% del total. Generatmert!e $t tr313 do derivttdo$ do 101$

:):; "~ .. 11

l llo;)Sinll Cll

~ < ' '

~ "S : ~-i .., _

J~-, :;:

OU OH i ~"'iliOpC'llltnil.admn'IN ,

(ti) A)

~ -11 S ;,

""' ).. H ,,...-'.~ ' ' o "" :ce,

11

o

0 N

"

Sl!1l111uridma (nbo!lt llld rna. T)

diludrouri~ tD. OHU, Ull:)

ltN'JLNtl

( o

o E ; o w -, w ,

" e !'kU\l'llrillw ( '1' l ;;

5. l'+l'ib

ESTRUCTURAOELOSRNA~S------------------------------------------------~7~3

e) Apareamiento de bases intracatsnario A pesar de la abundancia de nuctetidos no usuales. los IRN.As muc&tr3n 1..1'1 Ciet\0 9fac:JO

74 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERtOR DE ONA Y RNA

d) Estrvct(Jra secundari8 en trbol Al coml)3rar l;t estJ\lchJrtt dt distiniO$ tRNAs M obMN.- oot~ notable Mmejarlu. El Ple9amiento rns probable e&

1:1 cstruetvt"a M

ESTRUCTURA DE LOS RNAS 75

e) Estructura tsrciada en L-Mediante anii!IStS por difraocin de rW)'OS X

76 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERtOR DE ONA Y RNA

7.2.3.3 RNA ribosmlco (rRNA) Es Ef soporte estructural y componente principal de los rfbosomas. Eld:s:ten dislintOS tipOS de rRNA en cada

otula pto:arlota y eucarlota. oon masas moleculares dlvet$8$, constituyendO la mayor patte del RNA 10181 {7$%). Al Igual que el tAHA. preseo~an un altO 0001enldo de nuclesldos Infrecuentes ('t'. T y aqullos con bases me~as, furlclafi"'E!!Olllmente).

tos RNAs mosmlcos adop4an ooa oonformacl6n compleja. Estn formados por una SOla hebra con regiones heUcolda1e& oorta& resultantes del apareamiento incraca:tenario de base&. Son molet.a oon mucflos repliegues sotlfe $i mi&m;ll5. muy 1'\eJcible& y~Orm3blc&. QuO so toi1'C)()r1an hidr

ESTRUCTURA DE LO S RNAS 77

7.2.4.1 Accin catalitJca en la maduracin de RNA El pnmet ejemplo conocido de molcula de RNA con acbvl(j(Jd calaH1ica fue la RNasa P (se ha e&Cudrado en

Proeiln04l.t$ pero pa~ existir vn(l t~elivi~ $imii

78 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERK>R DE DNA Y RNA

7.2.4.3 Accin catalitlca y autocatalltlca en viroides: ribozimas de posible aplicacin teraputica

Los vkoides son molculas droulatee de RNA monohebra oon capacidad pera Infectar plantas. en at(p..W'Ios de ellos &e han encontrac tambin ribozimas capaces de actuar. de flemense taiYIOin en el tRNA hOmlogo da eucatiotas (rANA 28S de la wbunld90 60S).

LOS RIBOSOMAS 79

tKNA llS

UlNA ( >!

--...!-.... + IR"-\ co-. ' 11 !U :!ti., "ill ( 11 aa,. " JI

A nivel fi$10k)g1oo. la RN.asa P y la peptdltransff!fU& nbosomlca son posiblemente 109 que me1or r(:flejan P.l paree-do de las ribolimas con las erqima$ Orot~J~~Ca&., a 5aber: actan sobre un sustrato esl)e()Rc:o.. aceleran ta reaceln

v~rba r~ de mttgnitud 00 ~1) dt$~ durtlnto C;t c~ttilisis y at PilfiJOOf se comportan de ac:uetdo con la ontiCS m~Ch

80 ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERtOR DE DNA Y RNA

7 .3.2 Caractersticas diferenciales de los ribosomas procarltlcos y eucaritlcos

7 .3.2.1 Origen Los ptee~~Sores del rRNA muestran una gran 4rver&idad en su secvencio AIIJOSJ

"'IIM~dM~,nsm~~ rftNA 1~ f'kN4 US rRNA 55

'" ~ e=:; IRSA. (6~ ....... 1

~ .. , / ..

20 ' '- 1 600000

..., ""'""'

--"""""~ / 70S t

ribosoma eucaritico 1'\fl\'tin\:S \IC IR~A Oc~&rtl)llll> e""~" Jllli~

lOS 1\IBOSOMAS 81

7.3.2.3 Estructura L:t ~truccum de 10$ iibo!ll)l'l\3$, igual en KldM las 06fllla$, es muy earaae,istlea se 1'1&

Tema 8

Condensacin del DNA y cromosomas

8.1 Condensacin del DNA en eu

84 CONDENSACIN DEL ONA Y CROMOSOMAS

La condensacin del DNA desde cromatina a cromosoma owrre de forma gr.~dual durante la tase G. del ciclo cerular (le(na 9 ). mienttas que el proceso Inverso. la descondensac:ln del ONA, oomienz:a despus de la divisin oetular ( !ase M) y contina duran!& la fase G1 hasta alcanzar de nuevo la oondiciOn 6fusa, que pemwte la fel)licacin (lase S). No se conocen con prec1&1n 106 aspectos moleculttre5 00

COHOENSACIN DEL ONA EN EUCARIOTAS 85

8.1.2 Niveles de condensacin del ONA nuclear eucaritico Se puecle resallar el graoo

86 CONOENSACIN DEL ONA Y CROMOSOMAS

ac:KIM sobre Ul'l ONA pre-viamente lberado de historias, los fragment06 son de cualquier tamao. Esto sugiri que la t.n0n de lar. histonas protege regiol"'8$ de ONA de unos 200 pb.

Cada nueJeosoma e~ klnnado POt 9 molculas de histonas y un cr...-no de ONA, Bajo CllfUI&

CONOENSACtON DEL ONA EN EUCARJOT AS 87

8.1.2.2 Formacin do la fibra de 30 nm En &as preparaciones de cromatina obtenidas in wrro a may fuerza inca (por ejemplo, Msta 100 mM), la fibra

de tO nm se arrolla en sentido levgiro para dar lugar a una iorma ms oondens.ada. denoi'IWiada &cNenolde o flbla de 30 nm. que supone un grado de empaquetnas denominado ncleo o andamiaje central, matriz nudear o pro en, o esqueleto nuclear. E Solo& buCleS sufren superenronamlento. regulado pot topOisomerasa& asociadas al esquete4o. Parece que, adems de contribuir al empaqueta!TIM!flto del ONA.Ios budes oonstitt.ryen unidades tran&eripcionales, al haben;e observado la presencia dentro de un $0lo buctt de un 9'" oomplcto o b

88 CONDENSACIN DEL ONA Y CROMOSOMAS

8.1.2.4 Cromosoma metafsico Avnove "' fiMI de la protase ead8 (tOI'n()$(!11\8 ya esta OOr'ldel'lsado corno heterOCI'Ot'Mt!na, dur&f'lte 1a I'IW!'Iatase se

COndon$0 an mA$, aoq~o el aspecto tipieo Cle lOS cromosOMas metaflisieos, corpseul09 observaflleS al miCtOSCOplo (lptlco que muesiTan. en general. aspecto de baslonclllos oon dos cromtidas ms o men06 separadas entre si.

la$ f1bras de heterocromatlna se arrollan en una primera espWaiz.acin para formar una espiral menOf de paso muy pequeno. que se arrola a su vez &Obre si rrama (en unas 1().30 'Neltas} ~radar la espirill somiltk 01 Con GQ doble espralizacin se acorta la c:romtida a \A'\il v~im~ P,,\ .-npl~ c.: 1 .,.,._.~ ~ ~)OJ

CroI'IUiiOna, lllt'l:actrkOJ:

br.:(o>s de 1nmni\o ,un:ilar

e roo\05011'4S 100 blll,.ladoltko~ h n!WII de llliJA.fil)

dl f etei'IIC:

Crom~lfll:lti 11Cfl)('ffl lric9S" un br.la'l muy

pcq~

en 10$ ttazos 00t1os de los crom060ma& acroc6nlri00$ {exoe~o el Y) existen, adems, otros estrecnarr.emos do la eromtitJa, denominados eonstrtecioon sec;t.~ndaas, :OI"'M en las que la espiral 901T1lica presenta un

ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAfAStCO

(~ifteaein clo.: kxo; C.:IQm~ll' hunmnQJ.. ~CJI.IIl' lrpoll\lo:'i iKi'nm~'(> \ut...no:~ln "n \~ft'o;~"f'>tnu! III!TilU;..,I(.;r.of)lk, \kdiWI(o, ruq\IICilv) !;!I'UJ".'l.k d~''"'-.-~~on l t\.IJadas del organismo mas aseqt.Dies.

90

f'repuucin de elul:~s pam csruditsr el c.-vi ((!f> .,.,dio (m.,;(>. ~ U'MJn ~~~I!l h!I'(!IOII;. ~~l.ll

$. l..a. .-.;lulw., ~uc pnt!LIIIIo."O (tlt(f'ti '/ N0t

""'(---~ . ..CC.:It(lot;WI>Jcto1 11 H ' '

11 '

JI

u

u

u 11 "

,,

u 11 ' V 11 11 .. .. "

- JI '

Aetualml!:l'lte. se parte ya no slo de cuttivos de leuoocito6. con la 00$'1801aja de su vida~ oorta. de 3 a 4 d.i~$. $ino dt t uliNO$ a largo plazo de ot!Uas de dfversos tipos de tejidos (fibroblastos. m60ul3 $0.31, ll~idO amniOiico, biOPsias, etc:.). Las ms usadas 901\ las de ma)'Ot pot.enclal de divisin o mav folc::ifid.OO de cultivo A$imismo. exisAe una variOd*Ct de lratar'l"'lenlos de desnaturalizacan yto degradacin enzimMiCCI de &a cromalina. y

ESTUDIO DEl CROMOSOMA METAfAStCO

RESOLUCION CRECIENTE ra === tfllOII)(I:oll!l\1 t'Jd:l n lltflil!lda; 'an:" b.,..a, (~.,., 2 rollili\la)l dtn b.- (;ro~ndn. I.Onfl)l

..-

Uls~-~M' n-.;.,n.. ... C'ft ""' )>J 1,a111Mlo,o )' b !!(lOo.' 1ql '1 "

1 }' '" l "' l,. rr" ,,;1}' 11; " J \ \ t =~; ~ ~ ~ ~~,.;. A~ 11>(110}1 '"'*ioD )11 ~-..., rr .. llflltllnd.~ ~ o.. ... .,\)f

' r !Whnll"" - ~~-, 1\'ooluooo '~""" dt 1~~< l!o ~111'>~tl

92 CONOENSACION DEL ONA Y CROMOSOMAS

8.2.2 Regiones con significado funcional Los CIQfi'IO&omas eucarilioos muestran tres elemoniO$ f:t$G;ntialos para uM funcin OOfi'9Cia del ciclo celular y la

divisin. imllt9$cindibles ~~ l;a 9XP'e$in, dvpUct~cin, y sogrogrntna-. ;.n'tll!'fll:ti.ll> tcklo.n'ICf'i;a_,

fll :' i;b (1'1 l"ll'l'IIJ (1-12 l.b ~'TI tutah

.$., c.:eA~crAA t \'1 ,, . ., .t;G("..,\TTGGChTT-

fq1

DOTAC+H GENTICA EH EUCARIOT AS 93

8.3 DOTACIN GENTICA EN EUCARIOTAS Es conveneente oompletar el oonOOO'Iiento de la ~i6n del material gen&tieo cons."dert~ndo 01 oorneniOO \0131

~.,,n:~.;

.sexuaJ~

94 OONOEHSACtN DEL DNA Y CROMOSOMAS

cromosomas SCXU

OOT ACIH GEN~TICA EN EUCARJOl A$ 95

En eu31Qulf!r clula de \RI mcsma espeae, ~ gen ocupe s1empre el mismo lugar en un cromo~ detlWI'IiM(fc), '1 la posiCIOO equivatnte en su h(m(:IIOg (P.ot 3hn;un1o de 1:1 pobl{leiQn e~ti$101'1 mAS de dO!I alelO$ dllerentes pan~ un locus. El e&tudio de IWstornos dlf!ICOIS ht.l ponnitido lclcnt.1il;$r numerosos alelo& ~IIQ$ mnno,; fracur:ntes. en la pobl&ciOn, que SII'Yen tlO)' como mate&Ootes para .OOrMi~ dic;l'l~s pa!Ologias

8.3.4 Genotipo. fenotipo y dominancia

E.'>lodk) l'e~ringrOO : un soJo lot:U!>. ~'t1 CU

96

1

CONOEHSACIOH DEL DNA Y CROMOSOMAS

Rtllleiil nure d ni m~ dt ltt~K ni~Tftn t la pobtacW. par llitlll.I IOCIIS ~ 1~ J:l'IIOti~ diflltlllllltt 1 le$ 1("1'-(ltltdt11 dtr lg.tt

' 1

"" 1

~,.de v.'llilhiiOi lk:~~m~t.l~ttiCO!I

Rdkitldc liii.OOMJ1

1 o

rri'CIM'IICiO

Tema 9

Ciclo celular

9. 1 lntfod...ce~n ................... , , ........ .. , ............ ., - ... . .. .. .. .. ..................................................... 91 9.2 La ctom.;~ tin.tl en 1~ interflls.t ..................................... -..................................................... ~ .......... ,................... 98

9 2 1 V~cioncs et1 tonde-Maei:)n y contenido en ONA de la aomatll'lill , , , , - . ...... 98 9.3 Divisin~ clulas somatleas por mitosis ............. -.............................................................. .,.,.,,.............. 99 9.4 Divisin dt cilul.-s genninales pl'imarfas por m.elosls ...................... ~~- ........................ .. ........................ 99

9.4.1 GametogneS4 . .. ...,.,_,_,_,,,............................................. .. ........... ,.,_,.,_.,,_ -- 99 9.4 1 1 Espennatognesi9 ..................... . . ....... ........... . . . .. t02 9.4 1.2 Oognesls ........... ,.,_,_,_,,,..................... ....... ----... .... t03

9.4.2 Reparto del ma1ena1 gentiooen la meio&i$ ........... _,_,_,_,_,,.,,_,_,_, ,_.,.,., ..................... ,_.,.,,_,_,_., t04 9.4.2 .-1 Car

98 CICLO CELULAR

ciclo &e plantea en torno el proceso de replicacin, o 4UC!Iie$Cin del ONA nvelei'll. oon lo que se definen dentro de ia interfase tres elapes: ta fase S (durante la cual tie~ lug~r la repliCC~oeiOn). la fase G. (previa) y la fase G, (pos1erior), Mientras ~ algunas clulas entran en divisin tras COtJ1)Ie4ar caaa lntettase, otrM ~$31'1 a ~ estadio mcxilicado de

Gt.lam~ f.;:uc Go o QUIH(:$nt. en -que pennaneeen das o inc:Liso &"ca hasta cmpronder \lr1 nvevo clcio. o del que nunco Sillon {C61utas ~no se dividen. como es el caso de las neuronas).

Fa~ PQ$1 "inl~b d~ ON\

o..n.:u ... ....,;,... ...,,.... ~ topo~ .:clubr, ok un~..,.._.~.,..,~-..

o i111.'lu110 Jm ll:$1\'IKI M ~cckl.

Siigtliendo el pt8flteamiento genetal de este texto. interesa relacionar iOs aspectOS 9f:lll!tieo$ Cl$$101>$ 001 Cielo oon aquellos cxros de 11\doie ms bloqulnw:a y molecular. Para ello, se aborcsatlln en Totma oe1a11Bd3 13 interf.-se y lOS dos tlpos de dlvi&iOO celular. con un,_.,~ objetivo.

Poner de manifiesto la enorme variacin estruaural que supone, durante !a lnteffase, la condensac:aOn de: la molcula de ONA desde cromatina a cromosoma y su desoonclensacin en senlido irrverso.

Re:salltlr ell)n)08$0 de la rc~n. ~ tambin liene ll.lgar durante la Interfase, pero en !Al momento diferente del 8r'lte(IOr. Su car~et l"r''IOeCCA8t y enzim:iltieo se estudiar6 oot1 Cletane en el toma. 12.

EstableCer &as ar'lalogias y aireter'IOias er'ltre la disin por mitosis de las Qlulas so~icas y la divisin tXJt meiOfi$ de las oii.Aas gei'ITII'lales primaria& pata dar lugar a clulas getmif'l8le:s ITI8dl.nls o game4o&.

9.2 LA CROMATINA EN LA INTERFASE la l r'ltetfase, o lapso Que transcurre entre dos tivisiones celulares, es nonnalmente el periodo mas prolongado del

ciclo celular, con sus tres fases G~. S y

OfVISIH DE CL ULAS SOMTICAS POR MITOSIS 99

ta tase G2 dQncfe se ir'liela ta condensaclon gradual de la cromabnl en por primern vez las 2 cromiltldas de cada cromosoma y lOS 2n erOtnOSomas migran haaa el plano ecua10rial de la clula. (3) Metafase: tos 2n CtOmOSomas, ~a!mente oorw)eosados al)3tCQet'l atine&dOs en e p&ano ecual0r181, independtentes unos ele OliO$. (4 ) Analau: los cromosomas se rviden POf ~$

100

Condmacjn wdyal del DNfl : fllw!uk llhun . r lwu 11) .. "' o ( fHIIWII'IIi it

(1\)!l"''" 'fi'W l~~~t"fl.hl\" 1 llrnrfllll .. ,.. 11.,1Cfll\'l"!.nolhiM

(. 41.111" ~""' fl!,t.aiJi~~~

CICLO CELULAR

ltti..W..n.tQ .............

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DIVlSIN DE CELULAS GERMINALES PRIMARIAS POR MEIOSIS

@ Z l\l,i411 rtort.:-~

IC(I.lh" iL"' dt lu d,'\t \'f'l'lnlJI ll.i.l'> ']11( lo'lflll:lll .:ao.b numo.'t.Hua

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1

"hnu ~(lll~lm & 111\ ~;r~p,. de , ... ,mlihd;s. li~M

102 CIC LO C ELULAR

9.4.1.1 Espennatognesis En et caso del vaon. el proceso, que tiene lugar tel)t!Jdamentc t1 10 '"'90 de toda w Y1da. ~ina oon la

prOOUIX:iCor\ de es;pennatol.Oides o gametos maseullnos

mtoi!I(IIIH

"""''"

u

Pv1 tJ., k>!> ~(lUII1iii...,Mi~ dt ho.'mbre

DIVISIN DE CLULAS GERMINALES PRIMARIAS POR MEIOSIS 103

9.4.1.2 Oognesis Pot o:"l oorrlfafio. en 18 mutet la oogn$&1s ocurre en su mayor 1)9Me dtK Oo>:fl~ J'l..,_.. compk.,_.., .su tltoO(I)I~ 1 mr. du ''"Jli' .. (llo(K 1.,...daOO.y~ vu)M.. pMl -~

parlir de ~>ocolll:> l!fimari,. l"rodliOdot> tmtI: Nfl ddiilu miu ..

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( \lll~~t l>'o\j(t) J'!lll.\.'lk' d.:~ucm:M q\1( 111 :o~ (k ll>uiiK

1 04 CICLO CELULAR

9.4.2 Reparto del malerial gentico en la meiosis

9.4.2.1 Carcter reductor de la meiosis En la 1neioSiS 1, e' gamtl'!Oc:rt

DIVISIN OE CELULAS GERMINALES PRIMARIAS POR M.E10SIS 105

9.4.2.3 Segregacin de cromosomas y diversidad gontlca En ambas melosls. el teparto ele lo& cromosomas hofn6loOos de cada par (meio&~& 1} y de las aomlida& de cada

etomosom.a (meiosb 11) se hace el azar, de forma lOCalmente indepenciente para cada cromo:sorna (2 tev de Mendel) En delinltlva.. se a&egura ron creoes Que cOOi! g.-meto .-.c:ibc difer fw p prop~ Jl(lr ctlrottrHI \lo:.,.lel c. ~u ~,.e)" ok la~liln)

meiOSIS 1 -

4 ~ibiLGisione: deuda 91-metocoito rirn ~ ---.-.-. .. -01'1:;,-.... 1::;::::'~--~---~

AOC' ~ .\lk ' f\1\ A~ ~ >6C ' ~ ~~ ~~ ""~ .. ,~ 1. 1. 1. 1

1,11 ten:a:lo ~~ ptfldiiC'C ! ~ ,_;111u ('t)OOOllia.:Mr.n(~ di' ttoln ..... m:o, t~cl ~ll:fllplo), l) 3), P.ua 1M hunmnc~,(rlJJ 11.,.2 8.4.M(II~ U ~ilill'l aj'llmir d,_ n. cihl.ltfPiflloMI pruf'SI'Jfll. A~ '"'"nidYd ~Ir lil.llmla n:tuiPnlo ~ b n~-wu~,ilooo \1(11...,: ~~JO!IIQ;I.omlll' C1l b pft!liil~ck: b mcillliU I (no~da)..

fmo~ n t t t t t t

1 1 1 1 1

J ! "

106 CtCLO CELULAR

9.4.2.4 Recombinacin meitica Durante la profase e la melosis 1 (Profase 1) llene ligar un prooeeo de gran ITascenoeocla en cuanto a aa. ttereneio

y a la generacin de la diversaclad gentka de cada lndllftduo: se trata de la reeombltutcl6n mel6tiea, o simotem&nle reeombinaeln. Los detalles de este prooeso no se tratan aqul, pero bscamente consiste en 61 ~atll'1t.levWO. o ir.tetearnbio de regiones de OHA entre cromtidas de los dos cromosomas homlogos (es decir, nunca 1\ay recombinacin entre cromA1idas de distinto par). De ahl que se llame tambin reeomblnaciOn homOloga.

~ ... --

9.5 UNIN DE LOS GAMETOS HAPLOIDES DURANTE LA FECUNDACIN Cuando los Oot; 9 q.e sutte le clula durante m procesos de tecundadn. divisin meitice y mhbca y ciclo celular.

f - . - . - . - . - Gamt~ciX'~n- diUc\n m:i;)ltCJ d.: d lulll.'l rcnn11101k~ - - - - - " ? t. 8"''""do:s 4 s-'l)o $ --- ~-:3> ...... ~~- 1

''< ,.::" "l ; .----- _-__-__-_ _-__-_____ _-__-_ ;e~:~~~~;~~=~:)-

( . -{- . - . - . - . - . -. - . - . -\ . I~I.Rb\SE

~'flubl-.io!IN~ ~ __ ,... 1 ln. X e::::::::;::::: Z..1C ~ 2n.

Tema 10

Organizacin del genoma eucaritico

10.1 Complejidad del genoma euc.-riOtic:o ........................................... ~ ............................................................. 107 10.2 ONA de copia nica, &imple o no repetitivo ................................. - ............................................................. 108 10.3 Ot.IA repetitivo ..................... , ,, ,, ,, ,, ,,,,_,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,~ . - .................................... ~ .. ,.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.,, .. ,,,,,,,, ...... 109

10.3 .1 OtilA repetivo CO(I!fic.an1c ,_,., ..... ,.,_,.,.,_,., ....... , ., .,.,.,_,_,_,_,., --, ... .,_,_,_,_,_,_,_, 110 10.3.1.1 ONAtepetltivocodificanleagrupado ..................................................... .... 110

a) Familia& 9fuc.as clsicas ............... --------... ,_,_,_ .,,_ ..... ,,._,_,_,_,_,_,_,_,_,_,.,.,._,_,_,_,_, 110 b) Familias molbgnic;as de get~91> agrupados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1 1 1

10. 1 1.2 ONA ~tilivo

108

I)NA do copia nica

DNA n:pl!lit\'t)

ORGANiZACIN DEl GENOMA EUCARITICO

Rcguladot (c:oturola la c-:

ONA REPElrTNO 109

a Q)n!Jnuacin EJ ootlc.GPIO dO gen avnQvt M $Ufri(S() unn grt~n OVOiuciQn en ~riotO\s, ()3la M08f'5e ms corl'lQicado y con mUI!Jt)los COI'l'lponetltos. s. ~ue definiet\do bajO un cM&rio es1ridamente funaonal. sJempre en relacin con la transmis-n de l

110 ORGANIZACtN DEL GENOMA EUCARITICO

10.3.1 DNA repetitivo codificante Se le llama tambif'l OHA repetitivo funcklnaJ, pues klrma genes que .se elq)f'eSan (aunque no todos, como se ver~ Su 1amano se esllma entre el 10 y el15% del genoma.Apweoe en forma de "familiBS de genes. CU)'OS miembros se caractenzan pcw su homologla, al haber&e origlln.ldo medfante dup(icac:ione& (pllg~ 367) y vari

ONA REPETITIVO 111

Contienen $rt!COOilCit:l$ repclid-V$ que codirgn un mismo RNA o proloin@ Familia.; de gcnC$ humanO$ dc la.o; csdena!l: a y fl de td\lbirw :

~ D O ------ - f11miliu ~ka d~: lu (-glubitu~

- en i:l cwm1~11llll 1 (i

1 i.Jt , .. !l ...... ,. -t i

t~ ,..,....., .. ,,. llln>lol>' ('>cudogfu th

" 1 111 1 1 111 1-

,,

w i'

u

112 ORGANIZACIN DEL GENOMA EUCARITtCO

Corno consecuencia de lOs ptocesos eVOIIJ,ivos que dan lugar a familias multlgnlcas, aparooen oon frecuencia en enas miembros coo caraaerlstlcas d1feronclale6:

Coplas de gene-s ( Yarlantes) con ~as diferencias de secuencia. que codifican prodt.JCtos Qrioos funcionales pero de caracteristicasligoramente distintas (pOr ojollll)lo, difefenciM en ~;...~ on.vmMie&. p,ttl"tllntlros cin6tieOS .specifiCid~d por ~Vslr..'lto, ;~f~nidnd por su ligandq, ~c.) , Es comUn que se &eliYe de forma alterna1iva la expresin kri;o:a. po.lf t n_,, Pl'f la p l\'lio."no.:l'l hW~oanu n ,. ) M onQriutu.. u J

10.3.1.2 ONA repetitivo codificante disperso: familias multlgnlcas de genos dispersos

Mienlr.l$ qvet en las familias Mltlgenlcas ameriore las ro~ic:iQnO$ 110 disponen agrupadas. prxlmas en te secuencia linet~l del genorna. en otras 106 genes

ONA REPETITIVO 113

10.3.2 ONA repetitivo no codificante Esca es la fracctn del genoma a la que el trmino DNA ropetJtivo se teflere ele lonna mas MbiMtl Su lam31\0 se

esW'I'Ia entre Uf'l 20 y un 40% del DNA gMOmico total. Como ya se ha indicado, se subdavlde en dos cacegorlas: e1 rnodcrOO;:trnon!c repetitivo, que ~ ubic-.t~ en fQmlt' disper&a, y el alumente repeiJitYO, que adamas es agrupaoo Su

114 ORGANIZACIN DEL GENOMA EUCARtn CO

10.3.2.2 ONA moderadamente repetitivo y disperso

Allitilt 1 ti~;2 y ) ~~tKiiltt u " lfu,k

~o:~U:btc fS .ek'l~m (hUIDIIIO.

2S-4X pb ,,.

171 pt.

"'"' ,,.

Cotno su nombre indica. e54e tipo de ONA M

ESTUDIO EXPERIMENTAl DE LA COMPLEJIDAD EN EL GENOMA DE EUCARJOT AS 115

hl) SI!CI~tmcias UNE: En es.le ~&O. se trata de elementO$ nuclear& dispersO$ la.rgos (Long ~ed NucJe8l Elet&&WS}. II'KII\~Uhll ~, 10" Mn .. . Em.o,W;;:,. oi l .;.,.,.a do.: ~oata""""' 10"" ~ d nilm~rodt ~' I'J: En una muN tl;l. J~ 11 PS ,.. "'> En o.ma muc.lra& 8 pt;'.J h~) 8 tntll""'-' de> ihlmmlll(.'w\1, e\l\IIJ!. t'*" 8 Mili'*" +le C>.'lpwuda 'lot\:IICf'l,;o:> .$1 - - --:-"'""\

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....,.... -'--

109 (TIQmoo) e, ~ "'

_j Gtn.- d~ ~b ~~~"'" a 1 ~~~ . fr.:~:mo:nt"" 1 "''P"' do: gcn~~ma pc..o .1 lf.,t' N ha ""' ->ltll de ll Pf< mi h11~ 1 r,_., UN~ de~ p.J)ml h.n

' " o:.Jola ouc'fi(U ( fU111 .u 0011'1111'1(~ 0:11~ UU!\ '01 .sc'l:l la r ~ .. ..... M I.>J~A flJII. ('"l"OC._,.1. o;'llnk +.'llo'KI $ JI} mi). I.'IIIIC'C'nfll);;w;I!l & llmM

" "'"-

116 ORGANIZACIN DEL GENOMA EUCARITICO

Pata oompensar e1 electo que ltndr14 1;) d:i$11M3 eonoenttacibn 1t11eiM de ONI\ en las llluoe$1f8!1, se IJ98 el proctuciO ~ x t en lugar del oompo de r~ci6n. r. E$t l)fOdveto se ~noce noona!rnet~te (()niO ..,_.lltfttble Col. la 1epresemadn gr.fica de la clntica do reosoc:;i;Jitin $CJ h;:~co por t$nlo, con ftaoclOn o pot()Onl:.jo te.II$0Ci""do en on:lenada.& y loQaritmo d& Coten ilbsci&M. y te ~:t cotoq(Ji3tmente de las -curvas Cot"

Ut ob$oNl)CJIf'l do un:. coneladn inversa entte la pos.cln de la curva de reesoclacin '/la mago.tud del genom flllllccu._ _.dlit

de: uli pwde~: 11111)

l ........ lllll~llill ~ ~~ 1r w w w w ~

---- ----

Adems, las cuM$ C4t tiOOen espec:ial lnl!!fea porque eponan tnformac:n caoe~ del c::onlefll()o en DNA ~lvo de un genoma. Esto ts deQ!do a que, para una misma conoemracin de ONA wcal (o. en $1,1 de:feeto. corregida usando la vanable Col), 10$ fr(l!)l'l"leliOS de secuenc.as repetida& em:ten en mayor conoontrOOn OQf 10 que se teasoclan m:s rpidamente. Se .,slr.J primeto e!lta dependencia con un ejemplo simplil'ircN1\ J'lllo:.:m\'IU -;r ro:u

Tema 11

Preparacin de muestras, extraccin y anlisis de cidos nucleicos

11 .1 Obtenc:in y p rep.ar11.9 PurlflcaeJn de eldos nucteleos f)Ot precipitacin salina d ifercnci01l ..................................................... 135 11.10 Recogida y con:&eNaeln de 141& muet&trs .................................................................................................. 13$ 11.11 Procedimientos alternatlv&S: ex:trac:c:IOn o a nA lisis d i rtc:-tos de-l ONA ...................................................... 135 11.12 Fraccionamiento d& cidos nuc&eleos ......................................................................

11 8 PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y AHU S IS DE CIDOS NUCLEICOS

Las teenlet'ls

OBTENCIN Y PREPARAC.C.N PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS 119

posibliclades, a\.I"'QUe stas puedan no darse ~ultilneamente on la realidad Se cs.lttbleec ~s.i ~,.~na, $0tic de e~s m&s o menos consecutivas, coneaedas entre si, en las o.aales &e aplican tcnicas nYJY diversas. en ocasiones sencillas y oomunes. a veoos muy complejas y especificas.

11.1 OBTENCIN Y PREPARACIN PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS La I'I'JJie$lnl celular &e obtiene y prepare~ a partir de e'ganos. w,de o fluido& blolgiCXl$. en toocin del obecivo ~o (clflWCO o de ionti~n de .,dividvo$), tipo ~ cCiu!t\ (somtioc11.1.1 Muestras de tejidos slidos NornW~I~nte se obtienen meocsiante biops.ia (metooo inva.srvo

120 PREPARACIH DE M UESTRAS. EXTRACCIN Y ANUSJS DE CIDOS NUCLEICOS

11.1.2.2 Liquido o fluido amni1ico A partir de la 11 semana de gestacin, el embrin queda protegido al e~r inmerso en el liqu)do amnitico,

contenido deniTO de \lna membrana llamada $C11C0 amnitioo o amnio.s. la compoSICin del liquido amn161lco, cuyo ~en llega hasta 1.100 mi a trmrlO, deponde de un equilibrio dinmico de intercambios oon el ie1o y la madre, y oontlene clulas epdeliale

OBTENCIN Y PREPARACIN PREUMINAR OE LAS MUESTRAS 121

11.1.2.7 Clulas en cultivo las ~lula6 al&ladas o pro08Oiismo oetebtal. Se encuentra en dos compa~Unen~os que recubren el oentbro y la mt!!OIAa espr\81, tonU\ICado9 entre si: el sistema vemnctlfar (30 mi) y el &S.Qacio sutlaraCYloio'eo. delimitado por las membranas piamadre y aracnoides (120m)_ Se produce y reabSOfbe conbnJ

122 PREPARACIH OE MUESTRAS, EXTRACCtN Y ANUSiS DE CIDOS NUCLEICOS

11.1.3.4 Muestras biolgicas menos habituales Pueden contener clulas y. por tan40, ONA, tRI. serie de muestras de lntets en casos OO!'W!ret.c>S: nuMOt acuoso

(cmara anterior del ojo). tunor vftreo (detrs del iris), lgrimas. endolinfa (1\Jbo espiral dej oldo interno) y perlllnfa (caoiiiEI$ del ecP!ibrio), mooo OOO'ical. liquidO$ l'oliQAcw, oviductal y vaginal. het:;e&, Meteciones nasales, utlas. etc..

Y orina, q~ nor~TW~I~e no oon!ieno ~h.Jiitt. $4t uliliu ptnt' ~ ~ metabolitos on enfermedades hereditarias relacionadas con el ~mo 00 los aminoc:idOf (~tonuri. *"plonuria, Qtto.e~ c61ul3$ il'dlvidu31eS o ftagrt~en~os llS\JI&IeS pequei'los que tacllllef\ su OblendtL

Oi$greg~cin quimie.a: La rotura de 13 m&.1tiZ. ettocelull.lt y de l&s uniOnes ln~ero&llat'es se suele te4'11i2at pof homogoneia~ciOon i:tOiniC:. O por &Onieac:iOtl (elq)OSicln a lArasonldos.. ondas sonoras o acsticas no percibidas por el oldo humano por po&eer una frecuenCia superiOr a 20kHZ). generalmente et1 l)(esenc:ta de detetgentes (inlcos. O(W'I'IO el doecilsulfalo &dioo o SOS. o no iOonicos. ((liTIO Tween.20 y Ttilon X-tOO). La elimirlaeiOf\ de catiOneS divalentes, en

e~ el C;t2' (CQt'l ~1es qudo1ntes como EDTA).. taMbin deseslabllll.a la adhesin de clulas entte si y ooo la m

SEPARACIN DE CLULAS

Recordc~ la. -....'J'I:II'llo.'ICl ' ''C'IJlflfl.lVA ''"\ --~ fk l1 fl\,bl d'lll lat f l. tkf !'tJMI do; Jlf\1 dd twbu. t rad1 -'.:1 w d..ft.'l..- ""'~ ~,;o,&.,,...t a. rn;co.IQ Ir 1 > ik 11 \ ('i,. 1~ ka~~t..-t. J"-ofll U'OU1har;a 1 ~" ~lfl'"''l."'h:l'll:lil. el u iJr t~~tWill ~ 1 f. k ~R:nc JJd.t f":lt'

'

lt K (I,I~(!J (~} 'N~Ji l [(~)cm]'"' t l 11.1'1 W t:r (:J V.j t l'rk lo rtu t l'lhl 1 1 , , ,, do: 11 h,..ttlnlllil \'1\ llfl f\tli""" Co;n1n1u~u . de 1 t:m d..- mthc, t\11! ~iru 1t 111\:1 \lllf l\:ldll\1 tiC Hltll)(hi'IIIH."; 1( M I IIH(I!Il ' :e )1.9 \ ( \ ~O,Il'

l .a \ ck o.:tJaol 11 b q~ M.'ltmwnlll \IMII n lul ill ( 11 1111.1 l"'l'l lcul l tn un nnl' 1~, ti U . 1~ 1) tonb..un~~>m

124 PREPARACIH OE MUESTRAS, EXTRACCtN Y ANLISIS DE CIDOS HUClEICOS

11.3.1.2 Centrifugacin en gradiente de densidad

e) Mtodos de baf'1'9ra: cemrlfugacn a 1rovs de un m&dio de dens1dad cLe tnueslr:l

b) Centrifugacin zonal o de velocidad de sedimentacin P~ $0fimai tipo$ celulares euyo coe&lente de sedlmen1adn Olflere poco (p.e , llnloatos y monoo&os} es

proQ$Q ;~Q,Jdir 111 uso die Medios ~ forman oo gratliente de denAc~ad lo que ti'Yorece la concentracin de cada tipo oeuat en Uf'la banda o :zona estrecha por ello. a esla tawca so 1a: denomiM centrif~i,., UIOI)t El g1'8dicnt.e

SEPARACtN DE CEJ.ULAS 125

coo~. se u$81'1 gradientes continuos~ CUbren toOO etlntef\'alo de densidades ele las oilult'l$. en eJ t(ltl(lo oel tubo la densid~d del medio na de ser mayor que la de tas Olulas ms densas. De esta forma. Wldependientemente oet t;;e;npo de oentrlfugaclbn, las clulas oonC3 sediMef'olaran en el fondo. s-'\0 que aleUil~n dd ( UO.:Iin:l!ll: de joo:oliMI:o!IMO.'otl.o, q~~C" dtp.:nPilibrio. l>-idlld mlllll'l'l.l "~'

~lit < & n .. oi:ld dt ko wmx.m~o.k 1& muCiU11 ~~-..:~& '""""""~"'~~k ... .,....u.. ,...;hll( .. .;11;

('('ntnfug;.nm ..:!JIICnic:a &: t..'IJIUiihno di! !dim.:nUto:-i6n

f!.kwNm~I-S..Wttei(n (111 ru"~'''" c~ml':l ck b .-~Ua Ar!I{'..CI{oll Wl'\'t..:..""' .,,,)1,;.._.,.,. ck i.:-*'-.;l~ioo. I'U"f..;-.0011\k .kulo. nw.'lt~We~. ~u:.

11.3.1.3 Elutriacln centrifuga La erutriaein coMiste en la separacin de ~h;l01s (o pa.rtieui3S en gMetal) de acuerdo eon su velocidad de

S!XIimentaciOn. El proceso orignal. coo&istente en la realizacin de ddos sucesiV06 de secfmentacibn y decantaei6n. tue tadl1tado por la incorporaCIn al aslem

126 PREPARACIN DE MUESTRAS. EXTRACCtH Y ANLISIS DE CIDOS NUCLEICOS

una mayor ptOJIOfCI6n de clula!! vlaCies respec~o a la mUMtra origfl.al (al separarse las clulas d8118das,

SEPARACIN DE CfLUI..AS

.,,_,_,I. ,......w-. oholl--..'~"lt .

11n &.lf'"(_. .. ~ -"' .......

"'-! nv..,...~-we. UII~-.JiC>,

Alt.o n ..... c..cm! \....._ hll-""

b} ~ibn de Clulas Claslilcador de cehJias actwado por fluore&c.enelit (FACS)

127

D -

La c:omense de flquldo, tras p,ascw por el ~ do de1oc.cin, $0 t!1m$f()fl1'1(l on \.mn $UCe$16n de go~ muy pequenaa {Oooetai~T~e~Ke, oomo oonoec;ooPCitl de unt~ vibr

128 PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCJN Y ANLl$.1$ DE CIDOS NUCLEtCOS

detecmlnar el fenotipo de tejidos pwa trasplantes, ~r lOS IIPQ$ ~$ rt$p()n$t'lbkl5 do procesos en la respue61a wnurte. euaoblk:&r~ubi)Oblac.ones oetutafes, eie..

8 uso ele ant!c:tJetpOS ha dado lugar a una gran dt>.-ersldad oe mtodo$ inmunO {tubos. plae\\s ttq&Ut1t ~ IOIIII""nliml" uq I'~

CARACTERIZACIN CELULAR Y MEOIOAS DE VIABILIDAD 129

Esto$ proetdiiTIIIef'lto$, oe gran sencile-z y por ello en eJ~pansi6o tlet1.1811men!e ~en uso de microesferas disponilles oomercialmento en variOS tamanos (entre 0.5 y 10 pm. es decw. rt'190015 que las o6ful3$) y con o, P

130 PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y ANLISIS OE CIDOS NUCLEK:OS

11.4.2 Recuento de clulas viables por incorporacin de un marcador

ONA.

MtoOo a!tema\Alfi.IIM:UOI nromoitk11 plallll 1~;\'~cc In! m~ entre ICB P'J'."ll.~ bllse!! opi13(b; dd ON.A. PQSo..""Cn propiabdQ; lloo~cnt.c'$: al ,;u

~~dl:ldosoon 1u:t UV C"mit(fl k11. ~isibk

El __,Ja dC' ncridi&.~ C"n-tite uoa lluores~ dC' di.scimo color qn IC tncutt~w uUdo 11 k idos llll(lcio(l5dC" bebrll dob1C" o sencilla:

'v:rdc C4)n I)NA de dobk hebn~ ~

CARACTERIZACIN CELULAR Y MEDIDAS DE VIABILIDAD 131

11.4.3 Ensayos por medida de la funcin metablica Aetivld.adn enzlmtk.a-s la llf9Mntio en los ch.ll{lls

132 PREPARACION DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y ANLISIS DE CIDOS NUCLEICOS

Sintesls proteica: Wloorpotadn de radlactMdad a las protelfW~t aormadas dUrant ot evllivo de ~;~os oll,jas en pre&eneia de aminocidos marcados (generMnente. oon "~-~c. 3H o ~JMel ).

Sintesis de ONA: ineotpOracln de ooclesldos marcados. Reftea la IA&OIIldao en lerminos lCidad de ereeilrieniO o, m6s O$lrict;)monle, profrforadn celular.

S1lile al'lalk' Jc:'lobxtutudwa m3tC*Iu OOfl 't 1

(limkrma trilitrda) al m ('$lfUCiutlll de dl'. pu..-:; d

ilomo de Or 1.cne m uun~ simila:r allk-1 grupc.

melilo. Por ello K i...-otp0111 al 0NA nut:\'0 dura.-e 111 replicacin. en

lu;at de Jf. Se dttta medi:nle amic-..c:I'Jl(l;

C$1)C'CI.Iicos.. g

PREPARACIN DE FRACCIONES $U.~8,_C,EL,U,LA=R=:E::.S _________________ .:_13::;30

11.6 PREPARACIN DE FRACCIONES SUBCELULARES El prooeocfir'niento general, empleado clsicamente, parte el $0btont~dMtc que te$ulla de 1& ,

c

134 PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCt,. Y ANUSIS DE CIDOS NUCLEICOS

11.8 EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS POR SOLUBILIDAD EN FASES INMISCIBLES

En ~ill, dttda &u complejidad mc~teromolecular. lOs cidos nuctetcos son dlftCIIe$ de &epatar de sos oomPOnonlcs de membrana. proteina tNidual o afladida ( l81es oomo la& enzi'nas de restrlcclOn) y ollas molcUlas

~tlles (por ejemQio. poli$3~). 1.0$ ~ drstioos alteran sus estrucwras y sus caraaerlsticas. De ahl que sean muCh06 lOs mtodos suaves ecacoracl06 para eliminar la imp.reza de tas preparaciones. !Odot ciiQs tNI$l ~ullilllll el DNA.quCHI

q11M..tn~:n funna r@llruca (inft'J'I(If.

nW &o,;:,. Q~ll \os llpldof

dt mcmlnmo

l~~e~ pf'1111d~. ~r.dil'~

"""' doror

PURIFtCACIN DE CIDOS NUCUICOS POR PRECIPITACIN SAUNA DIFERENCIA L 135

11.9 PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS POR PRECIPITACIN SALINA DIFERENCIAL

Se 1ril!\ ""

.....

...il;bl~

..,,-...,.,,

-..lubili,.,. ~ ... IIU.:k-i..Ol ~.....:-~-~ t""'-'1

...

Pata es18 preopcacin &aitinit &e SUG!c util~~~ ~~. PCtO puede 1nmbin e,..,.enrse aee1ato Sdio::> sarurado. en oombinacin ron ilfooholc$ org.Anics, OOtlducieldo a resu!lados ind.Jso MejOres que COtl fenol y Clorofotmo. sobre lodo para cantidades pe.cueilas de ONA.

11.10 RECOGIDA Y CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS Uno '19l 5Cp;)r000S y eJtll81d09.. k:$ &ciClos nuctetcos deben ser conaetY8009 adecuacamenle. El preopitado seco

de tu;idO$ nvc:leico$ o el "&vilO de fibras de ONA obtenido oon la varilla pueden disolverse en disolUCin amortiguadora (O!II~Iif\3, en e1 caso oet ONA} y conservarse a 4 OC. o diSOlverse en agua y mantenerse oongelad06 para posteriores mlni~ioi'IO$ ~~imlttieas. El ONA geoOmlco en diSOlucin no se debe congelet, para ev!lar la rol\Jra de las molctJas pot 1as IUetZas de cizalla provocadas al solidificarse el l'llet) y al descongelarse. Por el oontrano. el RNA si puede conservarse OOflgelado a -70 OC en di&Oiucin acuosa, cuidando de atladir un ii\ID:Ior de Rl'fas deserllos. Ol()) el bajO eonlet~iCIO et~ ONA oe atguno$ I'I'IVe$1111$. pem, $il'l emW.tgo, pt.l&de ~Wdiarse el ONA de la mueslta Sin l'leCeSiCiaCI de mMipui$CiOn alguna, salvo lt'l liSis de las Clulas. Este es el caso de la amplificacin y detecCtiOn del ONA mediante la lcnlca de PCR (vet tema pos~arlot). Por ocro lado, cada vez es ms frecuef'(e y etlcaz: la exrraocln dilecta del ONA con mtoctos mas espec1rw:lOS. lclles. rpid06 de realizar y fl8bles. No se requiere la manipAa.cin previa de la muestra. oon lo que el ONA y RNA se pueden exlraer de fonna directa a panir de mt.teSITas l'letetognea& y de ~o volumen Exh;ten varios procedimlel'l!os.

Para muestra& forenses se na descrito. con resoltaclo6 prometedores. el empleo de un intercamblador inico {Chelex) y una suspens

136 PREPARACtN DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y ANUSIS DE CIDOS HUCLEJCOS

;; ICJ!IPI'' 11

EMr:.tc.:-in du-.:.c;Lu

dcONA

:qfll la ~t6t1 lk b umn llll; mkn:o.:J",..,.

11.12 FRACCIONAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS 11.12.1 Ultracentrlfugacin

I"..X1ra~;c(lll du~l~ dcmRI\A cuca61ioo

E.s1e mtodo se basa en ef aumento do Ji voloc:id;td de $edim~tadM COt campos centrifugos lo s.uflcaentemenl& anos (5UI*l0' a 100 ()()()g) ~Qmo per.~ supetar las ruenas de ditusiOn. Se emplea en espeaal para el ONA, tAAtc> con fine$ pu)p"r~ivos (gran CMidad de material) como analftloos (peque!\& canddad de material)

11.12.1.1 Centrifugacin zonal Oe forma sm1l

FRACCfONAMJENTO DE CIDOS NUCLEJCOS 137

11.12.1.2 Centrifugacin isopicnica El mfOdo isopeenioo o ~ equillf\o de sediol'l'lenlaCJOO es qull& el mas ulitl:ado 1)81'8 la sepernOIOn de disbntoS ~

138 PREPARACtN DE MUESTRAS, EXTRACCfN Y ANLISIS DE CIDOS NUCL EICOS

Mci3 e1 nodo () slo verva Ck!lerminada por e1 taMafiO e kl f'I"'IO&&Jia (I"Uneto de pares ele baSeS, Si es lil"'f!ffl). o.!lle destac819e que 109 CtOmOsomas eucarlo&as son demasiado grandes pera ser idet6lcados por este ~ de anlisis. por b que cocn'lnmenre se aplica sobre ONA hgmentado oon ru::teasas.

11.12.2.1 Soporte para la electroforesis La s.eparaoin 00 los frJ de ONA doblo M realizo ClOf elecl70b't$is on geles de aQalr0$8 (gonora!menee en

horizontal) o poliacriclmitt

FRACCIONAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS 139

Se emplean gele& de agal'()l;a al 1%. P8fO se a!teta peridicamcot~ 1(1 orionlon del ta~ o!ctrioo aplicado. activando allernativamente dos pares de electroOOs. El frecuente cambiO de direcei6n del campo elctnco con5igue Que la5 molcula& &e de&pJieguen y avancen a travft de lo& poros en oontormt~c:-6tl CKtentida A mayor tamallo, &e rconP.fllan con rnils difiCultad lXlf lO q~ avaruan ms despaciO. ASi se conSigue !W!9&rar fragn'W!fltoS de DNA de hast:t varias nw!gabases, lo que S41pone 1M'! a"~Snoe sQntlcatlvo pero an no sirve pera e&tudlar tos cromosomas humsnos enteros (de 50 a 250 ,..Cb cada W'\0}

'lllllJ.I'-' ~l+.ttM;.;

.... ., .. ~tff',.(. .. b:.f.IIL:>!~

[2~----~[1

,\ \' ~< DC'W 1.'11 ;un~ ColliCl>. 1.'11 fUDCIU dtll.lll'UifiCI

C) C) C) C) 00

= !! -

-

" i =

--

, _,, ,, . = lllk\'ll

= =

l.

Tema 12

Replicacin del DNA

12.1 CaraetfHfsUeas generale-s de la repUcacin ................... - ............................................................ - ....... - ...... 141 12.1.1 Can~ccet semlconservador .................................................... , .... _,_,_,, ,_,,,._ .. ., .... _,_,_,_.,,, .............. ,_,_,_,,,. 142

12.1.1 _1 Oemo61radn expe:nmental de la replicaCIn semconservadora..... . . . .......... . ....... . ... 142 12.1 2 SintesJ&simu!tnea . sewet~c~lybidire

142

C(!HJUnlodc

"'"""" n'I(IUbo.)l~ ddDNA

REPUCACfOH DEL ONA

La repllcac:i6n &e produoe de fonna ~da con la diwsl6n oelular (tcwn;~ 9), ooncrolclmentc en la f

R~lk:.cln semiconservadont Es el mecanismo real. Las d06 hebra& del

ONA progenifol" &i,....n de triQik:Je pt\r;J 10 &n osis ese sus resp&etivas hebras

oomplementanas. Cada ONA hijo est lormado por una hebra proge.nilof'a' y olla hi,j;J

{recin Wl4elizada}. El mecanismo se ropite en sucesivas generaciones de clula& Et nombre

alude, precl&amente, a que siempre &e conserva ti mil3d de 1;\ rnoleda or!gl!\81.

1.11 ttpli.:aci(m u-n~>C>."ln'Ct\' li&'lll*

dd DNA e~ rohtn:~~C~e .:.-d fl'l(llklo de bl.:

.. ~

......

...

, . .....

-

..... lujll

CARACTERISTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN 143

12.1.1.1 Demostracin experimental de la replicacin semiconservadora El mecat~~Smo real de la repllcaclon liJe emo~redo pot primera ve2 txW M&!l'leN Me~n y Frar,khn W St:Jhl en

1958. mediante experimemos m.ay egl\t\J

l\Y7\Y._ dr il'\!

Se UM:ulicr~ b .o.:tlula\" un mcdr,., oormaJ 1'011 1N1 SC' e p.:lll 1 '1111.' ICII~ Ju;llt

-~ tt lll lk 1\IIIIL cclulur

n"llll ~ ~rrn.o~,uL,,,. 1\lf" ,.f.:i.o m-

o.:ll.""d;l 1hu'ol'n , 't'IU-111.

Sto tltllUC ti f)' ,\

.. l\Y7\Y._

'\~: 11nah.1

Rl:PU CAC.ON DEL DNA

&JO 1~ bipOI:csl> de: rtpl~kln \."\lft.'lft'\ adora:) ~JCOOStf\adora.. ~ n:--.u~ fW"C'\ ~>.tbao scrun. compantt\ -arn.!TIC'"

,.,.... __

\\ll'loflk nu 'loe 'ln."l>"--ntJin. loi rnultadt~. lill REPLICAC.oN DISPERSA.~TE babri.a (lfl'lb: ~ n11~ua .. de 0' o\ +;:01'1 ltteidaafcjIIOfia de lllk;l

E.NZIMOLOGA DE LA REPUCACIN

FORMACIN Y AVANCE OE LAS HORQUILLAS OE REPLICACI en procariotas (ONA circular}

~llflllllr.l II!Jt:"' ok onkov 11 "';::lll'~::::o~;:;sr;..~n

..

12.1.3 Inicio monofocal o multifocal

en eucariotas (ONA lineal)

' K1 Jto K, ~*" Vfl)lt'l'l d! lutJf ~ 1-o inll;wo ,t.; un q:t\ln J;J 0' \

unidad run~ic>nal .il.

..... 11!'> btillrt\.-.;M!I! ~ .A~~;;;::;;;;~"-~ ~--

1 (

145

En e1 cromo~ (;i~ titlic:o e or~as '" re(llicacin comienza &~ampre en oo ~o det.etmlt\a(fo. dei'IQr't'linaoo origen (y mareaoo corno o e); se

146 REPLICACIN DEL DNA

12.2.2 Mecanismo de la reaccin Se iric;ialtl r~i6n Q:)l'l ol apare8H'I'Iientode un dNTP oomplemenuwto alnueletldo de fa hebra molde (DNA) en la

po$icin ~iMI

hebr.J

ENZIMOLOGIA DE LA A..EPliCACtON 147

12.2.4 Tipos de DNA polimerasas Aunque la reaet61'1 de Sintes.s ese ONA es vrwversal. es deeir. bene lugar de tnlita fonna en lodos lOs

organiSmos y ublcaelol\eS subCelulares $u CMCARACTERISTICAS DE LA DNA POLIMERASA 1 DE E coli ONApoll (unida al DNA)

uN. ~1>4 ~':'lllcnilp(>ll$'lt'Pit \' o>nud

'\locl\'(llo

1>.11\~~ J ..: .. ~ ..._.

ll n~lt>.~idc ~ ltnnnul. fll\1~'> polin~l M uy l.lcl> ~'Uu\lr.ldo. X

nnpko;J "'* frocno:"' (lllf~ 111 ..nle

143 REPUCACION DEl ONA

oompleiTl@nta la actwrdM 3'~)1.0fMJ(;Iens3i Ol)n'igiendo ei'I'OI'O$ de

ENZIMOLOGIA DE LA REPLICACION

Carae-toristic;as ostrueturates do 101s DNA polimernu PROCARIOTAS EUCARIOTAS ''1

Polimerasa: 1 11 111 o. B y 5 6 M, total (kDa) 171 103 90 c900 356 39 160 173 313 N11 ~Wbvnidadell 1 ;,:4 22 4 1 2 263 2 M, subunld&9s

" '" 125 125 258 35 48 55

\.0$ d3tc couesPOnoen a numanos. Pt Mt\$.1 molecular rc~t~tivtl $, con un~

150 REPLICACIN DEL OHA

12.3 ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACIN

12.3.1 Inic iacin Mienlras que et1 procaOOtas es proball6e que la re(lleaocl6n tenga lugar en conexin con ta membtana celular, pues

el ~o cromoSOO'Ia esta Mclaoo a ena en ta ZOt'la nucleolde. en eucarlotas el proceso ocum~. toglcamente. en ta matriz nu(:fet!r El DNA se tf!l)llca una vez por cldo oelutar. durante la fase S.

Inicio de la repllcadn: apertura de la dOOie hlioe en et Ofigen de replicacin,

creacin cte dos horquillas de replicacin y sintesis de cebadores

L:a um&n

ETAPAS EN EL PROCESO DE REPUCACIN 151

12.3.1 .2 Protenas de iniciacin Tanto en procariola$ oomo en ov~riOteviiM el ftaOOrelm.en&o de las hebr..s. Oe e51a forma. las bases nitrogenadas pueden acoger a los nucleotidos que se inoorPOt.,_ en l;l rec>li~i(ln , Se 1M~ oocnVnmont.e proteintrand bJnding PfOt~). en especial et1 prcx~riOio:l$ E.n oucariotas desempe;la esta func:iOn la proteina de repl icacin A (RPA).

e) Topoisomerasas La: separacin de hebras oca&lOnada por la progresin de la helicasa a 10 largo de la cadeM de ONA eonlleva I.J

apariCin de supe.retYOIIa~os pos!livog (X)( oelame ere la hc)fqull!a. Si se tr313$0 d$ un ONA lineal y corto. e1 superenrollamM!f\lO se podrfa ellmlr'lar pot Sir'np6e rotacin de la Mtioe en sentido con(r.)rio Sin embargo. s.ta no es posi)le en los ONAs 01cutares (ptocatlotas) ni en lOS lineales de grM lal'nSW\o (eue&nota&). que res.tltan k>rzado& tocxgicamente, detledo a su nal\l'aleza circular y a su unin a ptotelnas. respeeti~mem.e. P;)r;it olivittr e;a tensin de totsiOn te requiere

152 REPLICACIN DEL DNA

Alerdendo a su modo de aOCIOn. se distinguen dos gr\C)O$ de topol&omercu;as: l as topoisornera&a& de tl'po 1 9$Cinden 'ransitoamen1e una hOOfa del DNA (un enlace fo6fodi&Wr), dejan pasar

la olr.l por 1 niJCietldos. sino slo de alongar untt 1\ebr.t p-eexiStente: ~ ello, e.4 lnloo de las hebras nuevas requiere un cebador. Este es sirrtetizado por ~ polimeta$a de RNA dirigida ~ DNA (pg. 14 '1). denorrineda pr lmasa (oe pn'mef. cebador en ~r~gls). que pr~ ~ cortas de RNA, complementattas de ceda una de las hebras des-emparejadas en el ()rigen de replcadOn. En procarblas. la pRnasa es t.r~a protelna irdependienw que forma parte de un COMplejO proteico oenomlnado prlrno$om;) , ~ado ., 1S~multilnea

ETAPAS EN El PROCESO DE REPUCACIH 153

norqullla. COrno se -..eta en segukla, ra sJnte$$ de su compSetnentaria A~Quiere oo meC

154 A.EPLICACtON DEL ONA

Para que la slntes.ls de cada fragmento de Obz.aki se realice en el enlOMO de 18 norquilla, el l>uC:Ie do hebra molde en tomo al rep(soma debe sufrir algn tipo de eVOiudOn en cuaMo a su tatnal'iO y diSC!O$iC16n, deSde Que $0 comienza la sinle&IS del fragmento hasta que, una vez terminado. se libeta el bude. ya de doble hebra. Este mecanismo refuoru el ooncopiOdt dis

ETA.PA S EN EL PROCESO DE REPLICACIOH

lkpn:.')(l.'nl en li.l.; t.luhlcs lu.::bw"' l>fQstfll(le~l:,t un ecOOOOr lilo IJI ~:ocntnnlr,

.;imcti por la w;undud prim.1sa de In ONApol"

Lll>'-1 \pi! l) hila (;l \;tll Uil b .. m,_ .,!~ ti< 11la.-t.r.e nmdu./(1'/J d.:

155

l.:. ON:\(IUI o micia la cltl,g:tci(,n.l.'(lfllll ONA. d-.:1 R t-. A cch;s.:k> do: l:i

hdw.t. ;,)nthu::lot:l molde de 101 hcbm

s .:onductom

Ml't\ , proi.C'il)l de UI'IIOn a ho. .... l ll ~ACIIL

1 ,..-n111f 5' ~y ndkaOO ('r In~ llt.cl\ ;)7\ll~l .., - h 11.1 h:lnhl:u.!;~

IL'rl Ir ~ u:ntl'-. de o:...s/.11..11 .1/ '-:;:;:;::-;:-::;:-::--. doble hebn:

hija n~

m~.>lde di: IJ hdlr.l rctrn!;.'lda

Ln hcbm n1an.tada ncsltlt un L~hadorpara 1.-ad:e fmgnt.:lliO do:

Ok:v.ttkt, ~iiill'111.:11ti!) 'lolf' In fs.::li\ id.1d J'f'lrll.f,;.:j d..: la IP~API)I IX

156 REPLICACIN DEL DHA

12.3.2.3 Maduracin de los fragmentos de Okauki Para oompletar la slntesis de la hebra retardada. deben U"'lrse 10!1 ffagrnet'llos de Ot

ETAPAS EN EL PROCESO DE R.EPLICACIN 157

12.3.3 Terminacin Ul'la vez descrlt06 lO& detalles p

158 REPUCACt0N DEL DNA

Como ya &e ha estudtado,. bs tel6meros son reglones s.tuadas en 10$ e~etremQs dt m oom06011'1a& lineales de la ml'l~ de evc::uiola& (pag. 92,, a las que se unen ciertas protelnas. Estn constituidos por~ ele 1ar:s faiTilias de ONA repetitivO no eodHiCOU\1e (~ 113 ~ formando b5oqiJes de 1 a 12 k.b de long!lud, con unidados de 6 ;:~ 8 pb tt~peti!Jas en tanoem O!'!t'ltenMM o mit"s die V9Ce$ Para entender la impllcacl6n de los teiOmerO!I en ta roplla.ciOn debon rooord;115dos ~\U't:tiiiCI~ o 1tk'lm~~

Este acortamiento de las regiones telomricas (calculado entre 50 y 200 pb por cada di'l!sibn celular) 5UP008 la disminucKln ptQgfesiva de 1a in~

ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACION 159

caracterlsbca para cada especie, de 9 a 28 m y tomt'!ementari3 a 1a secuenca telomtlca respeal.a Por ejempio, el RNA ooml)(lnenle de la leloiTIE!fasa humana (hl'R) tiene 450 nt f)tltre 10$ Que My una se()l,l(!!t'l(:la f"'C3 en C.

(5')CCCU~3'), oomplemenu.ria y an~ra!ela a la hebra nca en G de 13 repetlctOn retomrlc:a (S')TT AGGG(3). Graaas a ona, oomo $t ~ h.Jt90. el hTR s1tve de molde para la sintesis de nuovns. soc~iM: etomMCM.

2 Componente proteico, que contJene la actividad nzimtica, o tr-attSCrlptasa inrersa oe la l~etasa ( TRT o TERT. de telomera.se lflve.t'S6 trooscnpt,se} SI

160 REPUCACtON DEL DNA

Segunda tase (8): la DNA polimerasa rellena la ooa hebra

12.3.3.5 Funcionalidad de la actividad telomerasa en las clulas En 1(11$ o61ula$ tomfrtiet'IS de 1

REPLICAC10N MJTOCOHDRIAL

ONA mi~~C~Cf rq~...._...,k .. n tfo>.ll) 6: hl:bolx:~ul.o !111 Clllplt'il~ NR1II ~

1, hdlf, li~'C'Q

la cl\lfiPOI,'fl W la~~U

Tema 13

Hibridacin de cidos nucleicos: fundamento y mtodos de ensayo

13.1 Introduccin: De-snatural izacin y renatvraliz:.ac:in del ONA. .............. ~ ..................................................... 163 13.1.1 Aglen4e& detsnalur;;a,lizOJntG$ .... , ., ........ ,........... ., ......... -- .. ................ . . ...... .. ..... .. . ....... . 164

13.1 1.1 DesMturali2&ein y renawra!lzacln por electo de la temperaiUra ......................... ---- 1&4 13. 1.1 .2 0-esMtura~lon por cu:tos y bases. .. .. . . .. .. .. . . . . 164 13. 1.1.3 Oesnatura~acin por agentes c:p.Jimioos ------"""'' , ... . ............. ,. 1~

13.1.2 tnlluencia de fa desnaiUratizaciOn &Obre tas propi~ del ONA 165 13. 1.2. 1 Influencia 60bte lot vi$C0$1dad ... .. .... , .. ......... ..... ------ . . .. ........ . ........ . . .... 165 13. 1 2 2 lnflvencirmaCiOt'l tri(Jimensional. et1 t$1)e(:i

164 HIBRfDACIOH DE CIDOS NUCLEICOS: FUNDAM.EHTO Y M TODOS DE ENSAYO

apiladas AJ

INTROOUCCIH: OESHA TURALIZACIN Y REHA TURALlZACIN DEL OHA 165

13.1.1.3 Desnaturalizacin por agentes qumicos Algunos de tos tot'l'lpUHIO$ tt"'l:lletldos con ftetuel'leia para d&Snarurauz.ar el ONA S(W'I motecutas &enellas

atlamente polares. con grupos amin