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Tierärztliche Hochschule Hannover
Pharmakokinetik von Clarithromycin
nach der Monotherapie mit Clarithromycin und nach
der kombinierten Gabe von Clarithromycin mit
Rifampicin beim Fohlen
INAUGURAL – DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Wiebke Block
Hannover
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. Monica Venner PhD, Dipl. ECEIM
Klinik für Pferde
1. Gutachterin: PD Dr. Monica Venner, PhD, Dipl. ECEIM
Klinik für Pferde
2. Gutachter: Prof. Dr. W. Bäumer, Institut für Pharmakologie, Toxikologie
und Pharmazie
Tag der mündlichen Prüfung: 04. Mai 2010
In Liebe und Dankbarkeit
meinen Eltern,
meinem Bruder und meinen Freunden
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung....................................... ......................................................... 1
2 Literaturübersicht ............................... ................................................... 3
2.1 Grundlagen und Hintergründe zum Einsatz von Ant ibiotika zur Therapie der
Rhodococcus equi Pneumonie beim Fohlen............. ............................................ 3
2.2 Therapie der Rhodococcus equi Pneumonie beim Fo hlen.................................. 4
2.3 Pharmakokinetische Grundlagen zur Therapie der Rhodococcose ................... 7
2.4 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Rifampi cin beim Fohlen ........... 10
2.4.1 Allgemeines zu Rifampicin.............................................................................. 10
2.4.2 Wirkmechanismus und Wirkspektrum von Rifampicin .................................... 10
2.4.3 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Rifampicin ............................... 11
2.4.4 Nebenwirkungen von Rifampicin beim Fohlen und beim adulten Pferd.......... 14
2.4.5 In vitro minimale Hemmstoffkonzentrationswerte von R. equi für Rifampicin . 15
2.4.6 Resistenzen von R. equi gegenüber Rifampicin beim Fohlen ........................ 15
2.5 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Clarith romycin beim Fohlen .... 16
2.5.1 Allgemeines zu Clarithromycin........................................................................ 16
2.5.2 Wirkmechanismus von Clarithromycin............................................................ 16
2.5.3 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Makroliden, insbesondere von
Clarithromycin beim Fohlen............................................................................. 17
2.5.4 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Clarithromycin beim Fohlen .... 18
2.5.5 Nebenwirkungen von Clarithromycin beim Fohlen.......................................... 20
2.5.6 in vitro MHK-Werte von R. equi für Clarithromycin ......................................... 20
2.6 Modell möglicher Transportmechanismen für Clari thromycin in die PELF und
in die bronchoalveolären Zellen .................... ....................................................... 21
2.6.1 Beeinflussung der Expression und Wirkung von Transporterproteinen .......... 22
2.7 Arzneimittelinteraktionen von Rifampicin und Cl arithromycin ......................... 27
2.8 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit............ ........................................................ 29
3 Material und Methode ............................. ............................................. 30
3.1 Probanden...................................... ........................................................................ 30
3.1.1 Allgemeine Haltungsbedingungen der Fohlen ................................................ 30
3.1.2 Bedingungen für die Aufnahme der Fohlen in die Studie................................ 31
Inhaltsverzeichnis
3.2 Methoden....................................... ......................................................................... 31
3.2.1 Untersuchung der Fohlen ............................................................................... 31
3.2.1.1 Allgemeinuntersuchung ......................................................................... 31
3.2.1.2 Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes................................... 31
3.2.1.3 Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut ............................................... 32
3.2.1.4 Sonographische Untersuchung der Lunge............................................. 32
3.2.2 Wiegen der Fohlen ......................................................................................... 33
3.2.3 Applikation von Clarithromycin und der Kombination von Clarithromycin mit
Rifampicin ....................................................................................................... 33
3.3 Spezielle Untersuchung vor der bronchoalveoläre n Lavage (BAL) .................. 34
3.4 Klinische Durchführung der Studie .............. ....................................................... 34
3.4.1 Übersicht über den Ablauf der Studie ............................................................. 35
3.4.2 Blutprobenentnahme zur Bestimmung der Blutchemie und für die Bestimmung
der Konzentrationen von Rifampicin und/oder Clarithromycin im Plasma....... 38
3.4.3 Durchführung der bronchoalveolären Lavage (BAL)....................................... 41
3.4.4 Abschlussuntersuchung der Fohlen................................................................ 44
3.5 Analytische Untersuchungen der biologischen Pro ben .................................... 44
3.5.1 Konzentrationsbestimmung von Rifampicin und Clarithromycin und derer
Metaboliten...................................................................................................... 44
3.5.1.1 Herstellung von Stamm- und Arbeitslösungen....................................... 44
3.5.1.2 Ansatz und Aufarbeitung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen........ 45
3.5.1.3 Aufbereitung der gewonnenen Plasmaproben und des BAL-Überstandes
............................................................................................................... 47
3.5.1.4 Aufbereitung der bronchoalveolären Zellen ........................................... 47
3.5.1.5 Flüssigkeitschromatographie (LC) mit nachgeschalteter Tandem-
Massenspektroskopie (MS/MS-System) ................................................ 48
3.5.1.6 Untersuchung zur Genexpression der bronchoalveolären Zellen und der
Bronchialschleimhautbioptate für p – Glykoprotein, Multidrug resistance
Protein und das Housekeeping gene 18s............................................... 49
3.5.1.7 Auswertungen der Detektionsergebnisse zur Bestimmung der
Konzentrationen von Rifampicin und/oder Clarithromycin und ihrer
Metaboliten............................................................................................. 50
Inhaltsverzeichnis
4 Ergebnisse....................................... ..................................................... 53
4.1 Etablierung der Essays zur Quantifizierung von Clarithromycin und Rifampicin
................................................................................................................................. 53
4.2 Konzentrationen der Antibiotika im Plasma bei d en Fohlen (1. und 2. Kinetik)56
4.2.1 Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma nach der Monotherapie (1.
Kinetik) ............................................................................................................ 56
4.2.2 Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma bei gleichzeitiger Gabe von
Rifampicin (2. Kinetik) ..................................................................................... 56
4.2.3 Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin im Plasma (1. Kinetik)................ 59
4.2.4 Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin im Plasma bei gleichzeitiger Gabe
von Rifampicin (2. Kinetik)............................................................................... 61
4.2.5 Konzentrationen von Rifampicin im Plasma nach der kombinierten Gabe mit
Clarithromycin ................................................................................................. 65
4.2.6 Konzentrationen von 25-O-Desacetylrifampicin im Plasma nach der
kombinierten Gabe mit Clarithromycin ............................................................ 66
4.3 Menge der rückgewonnenen bronchoalveolären Flüssigkeit, PELF und
Konzentrationen der Antibiotika in der PELF................................................... 67
4.3.1 Konzentrationen von Clarithromycin in der BALF und in der PELF nach der
Monotherapie und nach der Kombination Clarithromycin/Rifampicin .............. 68
4.3.2 Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin in der BALF und in der PELF nach
der Monotherapie und nach der Kombination Clarithromycin/Rifampicin ........ 71
4.3.3 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desacetylrifampicin in der BALF
und in der PELF .............................................................................................. 73
4.4 Konzentrationen der Antibiotika in den bronchoa lveolären Zellen................... 74
4.4.1 Gesamtzellzahl und Zellfraktionen in der BALF.............................................. 74
4.4.2 Konzentrationen von Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen nach
alleiniger Gabe von Clarithromycin und nach kombinierter Gabe mit Rifampicin
(Tag 7 und Tag 21).......................................................................................... 74
4.4.3 Konzentration von 14-OH-Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen nach
alleiniger Gabe von Clarithromycin und nach kombinierter Gabe mit Rifampicin
(Tag 7 und Tag 21).......................................................................................... 77
4.4.4 Konzentration von Rifampicin in den bronchoalveolären Zellen ..................... 79
Inhaltsverzeichnis
4.5 Genexpression von ABCB1 und ABCC2 in Zellen der Bronchialschleimhaut
und in bronchoalveolären Zellen .................... ...................................................... 80
4.6 Ratios......................................... ............................................................................. 88
4.7 Korrelation der Konzentration von Clarithromyci n im Plasma und in den
bronchoalveolären Zellen........................... ........................................................... 92
4.8 Ergebnisse der Blutchemie nach der Monotherapie und nach der Kombination
Clarithromycin/Rifampicin.......................... ........................................................... 94
4.9 Auftreten von Nebenwirkungen ................... ........................................................ 95
5 Diskussion....................................... ..................................................... 96
5.1 Probanden...................................... ........................................................................ 96
5.2 Ergebnisse ..................................... ........................................................................ 97
5.2.1 Hintergründe zum Design der Studie.............................................................. 97
5.2.2 Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma von Fohlen........................... 97
5.2.3 Konzentrationen von Clarithromycin in der PELF und in bronchoalveolären
Zellen bei neun Fohlen.................................................................................. 100
5.2.4 Gemeinsame Betrachtung der Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma,
in der PELF und in den bronchoalveolären Zellen......................................... 102
5.2.5 Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin im Plasma, in der PELF und in den
bronchoalveolären Zellen .............................................................................. 102
5.2.6 Beeinflussung der Konzentration von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin
durch die zusätzliche Gabe von Rifampicin im Plasma................................. 103
5.2.7 Beeinflussung der Genexpression für ABCB1 und ABCC2 in
Bronchialschleimhautzellen und in bronchoalveoläre Zellen durch Rifampicin
...................................................................................................................... 105
5.2.8 Beeinflussung der Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-
Clarithromycin durch Rifampicin im Plasma, in der PELF und in den
bronchoalveolären Zellen .............................................................................. 106
5.2.9 Betrachtung der Konzentration von Clarithromycin im Hinblick auf die
erforderliche MHK von R. equi für dieses Antibiotikum ................................. 107
5.2.10 Konzentrationen von Rifampicin im Plasma, in der PELF und in den
bronchoalveolären Zellen .............................................................................. 109
5.3 Akzeptanz der verabreichten Arzneimittel ....... ................................................. 109
Inhaltsverzeichnis
5.4 Nebenwirkungen von Clarithromycin und Rifampici n ..................................... 109
5.5 Beeinträchtigung der Fohlen durch die bronchoal veoläre Lavage................. 110
5.6 Schlussfolgerungen ............................. ............................................................... 110
6 Zusammenfassung .................................. .......................................... 112
7 Summary.......................................... ................................................... 114
8 Literaturverzeichnis ............................. .............................................. 116
9 Anhang ........................................... .................................................... 142
Abbildungsverzeichnis .............................. ........................................... 171
Tabellenverzeichnis ................................ .............................................. 174
Danksagung ......................................... ................................................. 178
Abkürzungsverzeichnis
Verzeichnis der Abkürzungen
Abb. Abbildung
ABC ATP binding cassette (ATP-abhängiger Transporter)
ABCB1 P-gp
ABCC2 MRP2
AST Alanin-Aspartat-Transferase
ATP Adenosintriphosphat
AUC Area under the curve (Fläche unter der Konzentrations-
Zeit-Kurve)
AP Alkalische Phosphatase
BAC bronchoalveoläre Zellen
BAL bronchoalveoläre Lavage
BALF bronchoalveoläre Spülflüssigkeit
BCRP breast cancer resistance protein
BP Blutprobe
bzw. Beziehungsweise
C Clarithromycin
°C Grad Celsius
CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
cm Zentimeter
Cav durchschnittliche Konzentration (average)
Cmax maximale Konzentration
Cmin minimale Konzentration
Crea Creatinin
Ct Konzentration zum Zeitpunkt t
C12h Konzentration 12 Stunden nach der letzten Applikation
von Clarithromycin
Abkürzungsverzeichnis
CT-Wert Cycle threshold – Wert
CYP Cytochrom – P – System
DNA Desoxyribonucleinsäure
∆∆CT-Wert delta delta Cycle threshold – Wert
EHV Equines Herpes Virus
G Giga
GGT Gamma-Glutamyl-Transferase
GI Gene of interest
GLDH Glutamatdehydrogenase
GLP Gute Laborpraxis
GZ Gigazelle
h Stunde
HKG Hauseigenes Kontrollgen
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatografie
IE Internationale Einheiten
i.g. Intragastral
IS Interner Standard
i.v. Intravenös
K Kalibratoren
kg Kilogramm
L Liter
λz Steigung der Geraden
LC-MS/MS Flüssigkeitschromatografie mit doppelt nachge-
schalteter Massenspektroskopie
LDH Laktatdehydrogenase
M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
MDR multidrug resistance
mg Milligramm
Abkürzungsverzeichnis
ml Milliliter
mmol Millimol
µmol Micromol
MRP Multidrug resistance Protein
MS Massenspektroskopie
n Stichprobenumfang
ng Nanogramm
µg Microgramm
µl Microliter
MHK minimale Hemmstoffkonzentration
MHK90/MHK50 minimale Hemmstoffkonzentration 90%/50%, beschreibt
die Konzentration bei der 90% bzw. 50% der Isolate im
Wachstum gehemmt wurden
MHz Megaherz
mtRNA mitochondrale RNA
OATP organic anion transporting peptide
PBS Phosphat buffered saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PELF Pulmonary epithelial lining fluid
p.o. per oral
P-gp P-Glykoprotein
PTF Peak trough fluctuation
PXR Pregnane-X-Rezeptor
QK Qualitätskontrolle
qRT-PCR Quantitative Realtime PCR
R Rifampicin
R2 Rangkorrelationskoeffizient
R. equi Rhodococcus equi
Abkürzungsverzeichnis
RNA Ribonucleinsäure
s. Siehe
S. Seite
sid semel in die (einmal täglich)
s. o. siehe oben
SLC Solute carrier family
Tab. Tabelle
t Zeitpunkt
t1/2 Halbwertszeit
tmax Zeit bis zum erreichen von Cmax
U Units
Urea Harnstoff
V/V Verdünnung
14-OH-Clarithromycin 14-Hydroxyclarithromycin
z. B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
Einleitung
- 1 -
1 Einleitung
Clarithromycin, aus der Familie der Makrolidantibiotika, wird in der Humanmedizin zur
Therapie von Infektionen der Atemwege eingesetzt. Im Jahr 2002 wurde es erstmals zur
Therapie der Rhodococcus equi (R. equi) Pneumonie des Fohlens vorgeschlagen
(JACKS et al., 2002).
Das Bakterium R. equi verursacht schwere, oft lebensbedrohliche, abszedierende
Bronchopneumonien beim Fohlen im Alter von vier bis zwölf Lebenswochen. Für die
Pferdeaufzucht spielt diese Erkrankung weltweit eine bedeutende Rolle, da in
endemisch betroffenen Betrieben Erkrankungsraten von 40-80% und Todesraten von 5-
17% verursacht werden können. Weltweit gehen bis zu 5% aller Todesfälle bei Fohlen
auf eine Erkrankung mit R. equi zurück.
Die Therapie der Rhodococcose dauert mindestens vier Wochen, ist damit lang und
sehr kostenaufwendig, mit Nebenwirkungen verbunden und führt nicht in jedem Falle zur
vollständigen Genesung des Patienten. Die Therapieerfolge und die
Überlebenschancen sind größer und die Dauer der Behandlung dieser Fohlen ist umso
kürzer, je früher die erkrankten Fohlen erkannt werden.
Neben der frühen Erkennung der erkrankten Fohlen reduziert eine Therapie mit
adäquaten Antibiotika die Verluste an Fohlen durch die Rhodococcose.
Die Auswahl der Antibiotika, die zur Therapie einer Rhodococcose eingesetzt werden
können, ist durch die Erregereigenschaften stark begrenzt. So sind in vitro gegen R.
equi wirksame Antiinfektiva in vivo häufig wirkungslos. Nur wenige Antibiotika gelangen
in Makrophagen und in abszedierend eingeschmolzene Lungenbereiche und können
dort ihre antimikrobielle Aktivität entfalten. Lediglich Makrolide und Rifampicin weisen
eine hohe Lipophilie auf und erreichen deshalb eine wirksame intrazelluläre
Konzentration. Deshalb wird als Mittel der Wahl zur Behandlung der Rhodococcose
Rifampicin in Kombination mit einem Makrolidantibiotikum eingesetzt. Zu den bisher
häufiger eingesetzten Makrolidantibiotika gehören nach Erythromycin, Azithromycin,
Tulathromycin und weniger häufig Clarithromycin.
Um die Therapie der an R. equi-Pneumonie erkranken Fohlen zu optimieren bedarf es
neuer Erkenntnisse über die Pharmakokinetik der eingesetzten Wirkstoffe, ihrem
Einleitung
- 2 -
Interaktionspotential und über die Grundlagen der Erregerbekämpfung in der Lunge
beim Fohlen. Obgleich Clarithromycin beim Fohlen für diese Indikation eingesetzt wird,
liegen bisher keine pharmakokinetischen Untersuchungen über Clarithromycin in
Kombination mit Rifampicin beim Fohlen vor.
In der vorliegenden Studie sollen die Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma, in
der Pulmonary epithelial lining fluid (PELF) und in den Alveolarzellen von Fohlen bei
paralleler Verabreichung von Rifampicin bestimmt werden. Die Ergebnisse sollen
daraufhin mit den notwendigen MHK-Werten von R. equi gegenüber beider Antiinfektiva
verglichen und bewertet werden.
Literaturübersicht
- 3 -
2 Literaturübersicht
2.1 Grundlagen und Hintergründe zum Einsatz von Ant ibiotika zur Therapie der
Rhodococcus equi Pneumonie beim Fohlen
Rhodococcus equi (R. equi) ist ein grampositives, pleomorphes, unbewegliches
Bakterium mit einer Polysaccharidkapsel (WILSON, 1955; SMITH, 1966; WOOLCOCK
und MUTIMER, 1978; SELBITZ, 2002) und wurde 1923 erstmals von MAGNUSSON auf
Gestüten in Schweden als Corynebacterium equi beschrieben. Es ist dem Erreger der
Tuberkulose des Menschen, Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), sehr ähnlich.
Beiden ist es möglich in Phagozyten zu überleben, sich in ihnen zu vermehren und dort
zu persistieren (ELLENBERGER et al., 1984; PRESCOTT und SWEENEY, 1985;
HONDALUS und MOSSER, 1994). Durch diese Fähigkeit gelangt R. equi in
therapeutisch schwer zugängliche Kompartimente und entzieht sich dadurch zu großen
Teilen der Immunabwehr des Wirtes.
R. equi verursacht beim Fohlen im Alter von vier bis zwölf Wochen schwere und oft
lebensbedrohliche, abszedierende Bronchopneumonien (MARTENS et al., 1982; ZINK
et al., 1986; ELLENBERGER und GENETZKY, 1986; AINSWORTH, 1999, GIGUÈRE,
2000). Seltener treten extrapulmonale Erkrankungsbilder wie Enteritis, Polysynovitis,
Osteomyelitis und Abszesse in allen Körperregionen auf (PRESCOTT und HOFFMANN,
1993; AINSWORTH, 1999). Das Krankheitsbild, welches als Rhodococcose bezeichnet
wird, betrifft vor allem Fohlen bis zum siebten Lebensmonat, wobei es im Alter von vier
bis zwölf Wochen vermehrt zum Auftreten von Todesfällen kommt (BEECH und
SWEENEY, 1991). Adulte Pferde erkranken in der Regel nicht an R. equi, scheiden den
Erreger aber aus (BARTON und HUGHES, 1984; CARMAN und HODGES, 1987). Die
Symptome bei einer R. equi Pneumonie sind nicht pathognomonisch und können somit
nicht von jenen Lungenerkrankungen unterschieden werden, die ihre Ursache in der
Infektion mit anderen Erregern haben (LAVOIE et al. 1994; AINSWORTH, 1999).
Zur Behandlung der Rhodococcose steht die antimikrobielle Therapie im Vordergrund.
Für eine erfolgreiche Therapie muss neben einer frühen Diagnosestellung und einem in
vivo wirksamem Antibiotikum gewährleistet sein, dass die Therapie über eine Zeit von
Literaturübersicht
- 4 -
vier bis zwölf Wochen erfolgt (PRESCOTT und SWEENEY, 1985; HILLIDGE, 1987;
KNOTTENBELT, 1993; PILTZ, 2004). PRESCOTT und SWEENEY (1985) erklären die
notwendige, lange Dauer der Therapie mit dem weit reichenden Ausmaß des
Lungenschadens, der Größe der Abszesse und dem sich intrazellulär vermehrenden
und persistierenden Erregers.
Aufgrund der Ähnlichkeit der Erregereigenschaften von M. tuberculosis und R. equi kann
davon ausgegangen werden, dass auch die erfolgreiche Behandlung der R. equi
Infektion beim Fohlen einen, der Tuberkulose des Menschen entsprechenden Verlauf
nehmen wird. Beobachtungen zeigen, dass sich die klinischen Befunde bei einer R. equi
Pneumonie bereits einige Tage nach Beginn der Behandlung verbessern, frühestens
aber nach vier Wochen mit einer Besserung oder Normalisierung der Befunde in den
bildgebenden Verfahren zu rechnen ist (HILLIDGE, 1987; KNOTTENBELT, 1993).
Ähnliches wurde bei Menschen mit Tuberkulose beschrieben. Bei der Infektion des
Mensches mit M. tuberculosis kommt es zu Beginn der Therapie mit geeigneten
Antibiotika ebenfalls zu einer schnellen aber unvollständigen Vernichtung der Keime.
Die Abtötung verbleibender Erreger erfolgt im Anschluss an diese erste Phase über
einen deutlich längeren Zeitraum (DAVIES et al. 2006a/b). Grund für die zunächst
schnelle Abtötung von M. tuberculosis ist die gute Erreichbarkeit der Erreger im
extrazellulären Raum. Die zweite Phase der Bekämpfung ist allerdings durch Erreger
geprägt, die sich in geschützten Räumen, wie zum Beispiel den Makrophagen befinden,
und somit für Antibiotika nur schwer zugänglich sind (DAVIES et al., 2006a/b). Die
Defizite im Abtöten intrazellulärer Keime gelten als die Ursache für die extrem lange,
zum Teil über Monate andauernde Therapie, für Therapieversagen und für das Auftreten
von Rezidiven (MITCHISON, 2006).
2.2 Therapie der Rhodococcus equi Pneumonie beim Fohlen
Zur Therapie der R. equi bedingten, abszedierenden Bronchopneumonie stehen beim
Fohlen nur wenige Antibiotika zur Verfügung. Obwohl sich R. equi in vitro gegen viele
Antibiotika sensibel oder intermediär sensibel zeigt (PRESCOTT, 1981; NORDMANN
und RONCO, 1992), ist die Wirksamkeit der Wirkstoffe in vivo, aufgrund der
Besonderheiten von R. equi, längst nicht für alle gegeben (SUAREZ-MIER et al., 2007).
Literaturübersicht
- 5 -
Zum Beispiel verstarben trotz der Behandlung mit der Kombination aus Penicillin und
Gentamicin alle 17 Fohlen mit R. equi Pneumonie, obwohl alle Isolate für Gentamicin
empfindlich waren (SWEENEY et al. 1987). Als Mittel der Wahl für die Therapie der R.
equi Pneumonie beim Fohlen wird unter Berücksichtigung der unter 2.1 genannten
Grundvoraussetzungen Rifampicin in Kombination mit einem Makrolidantibiotikum
eingesetzt. Als Makrolid wurde seit 1980 zunächst Erythromycin eingesetzt. Dadurch
konnte die Überlebensrate der erkrankten Fohlen von 20% auf fast 90% gesteigert
werden (HILLIDGE, 1987; SWEENEY et al. 1987). Nachteile an der Behandlung mit
Erythromycin sind jedoch neben einer hohen Nebenwirkungsrate beim Patienten und bei
der Begleitstute die geringe und variable orale Bioverfügbarkeit beim Fohlen (LAKRITZ
et al., 1999; STRATTON-PHELPS et al., 2000). Aufgrund dieser Tatsache muss
Erythromycin viermal täglich verabreicht werden. Zu den Nebenwirkungen von
Erythromycin zählen zum Beispiel oft tödlich verlaufende Colitiden bei den Mutterstuten
der behandelten Fohlen (GUSTAFFSON et al., 1997; BÅVERUD et al., 1998) und
Durchfälle, Hyperthermie und Atemnot bei den Fohlen (STRATTON-PHELPS et al.,
2000). In den vergangenen Jahren wurde Erythromycin durch Azithromycin (JACKS,
2001), Clarithromycin (JACKS, 2002) und Tulathromycin (VENNER et al. 2007), drei
Makrolide der neueren Generation, ersetzt. Auch diese Makrolid-Antibiotika werden in
Kombination mit Rifampicin eingesetzt (GIGUÈRE et al. 2004). Vorteile dieser neuen
Antibiotika sind beim Fohlen eine bessere Bioverfügbarkeit, eine verlängerte
Halbwertszeit und ein höheres Verteilungsvolumen (LAKRITZ et al., 1999; JACKS et al.,
2001; DAVIS et al., 2002; WOMBLE et al., 2006). Aufgrund dieser Vorteile sind
geringere Dosierungen und längere Dosierungsintervalle möglich.
Für eine optimale Behandlung der R. equi Pneumonie gibt es aus
Untersuchungsberichten zur Wahl der Antibiotika unterschiedliche Angaben. In einer
retrospektiven Studie an 81 Fohlen mit R. equi Pneumonie konnte auf der Grundlage
radiologischer Befunde gezeigt werden, dass die Gabe von Clarithromycin (10 mg/kg, q
24 h, 7,5 mg/kg, q 12 h) in Kombination mit Rifampicin (5 mg/kg , q 12 h; 10 mg/kg, q 12
h; 10 mg/kg, q 24 h) die Erfolgsrate im Vergleich zur Gabe von Rifampicin und
Erythromycin (25 mg/kg alle 6 h, 25 mg/kg alle 8 h, 37,5 mg/kg, q 24h) beziehungsweise
Azithromycin (10 mg/kg, q 24 h; 7,5 mg/kg, q 24 h) steigert. Die mit Clarithromycin
behandelte Gruppe weist eine höhere Prozentzahl in der Verbesserung radiologischer
Literaturübersicht
- 6 -
Befunde und eine insgesamt erfolgversprechendere Behandlungstendenz auf.
Insbesondere bei Fohlen mit schweren röntgenologischen Lungenveränderungen hat
sich die Kombination Rifampicin mit Clarithromycin als Wirksamste gezeigt. Die
Klinikaufenthaltsdauer war in den Gruppen, die mit Clarithromycin oder Erythromycin
behandelt wurden, signifikant kürzer. Die Anzahl der Fiebertage war hingegen bei der
mit Erythromycin behandelten Gruppe gegenüber den anderen signifikant erhöht
(GIGUÈRE et al. 2004). In einer weiteren Studie wurde die pulmonale Disposition der
drei Makrolidantibiotika beim Fohlen verglichen, indem die Konzentrationen von
Erythromycin, Clarithromycin und Azithromycin (jeweils einmalig 10 mg/kg i.g.) in der
Pulmonary epithelial lining fluid (PELF), in den Zellen der bronchoalveolären Lavage
(BAC) und im Serum bestimmt wurden. Im Rahmen dieser Untersuchung konnten keine
signifikanten Unterschiede in den Konzentrationen von Clarithromycin bzw. Azithromycin
nachgewiesen werden. Ebenfalls konnte die Überlegenheit der Makrolide Clarithromycin
und Azithromycin gegenüber Erythromycin bewiesen werden. So wurden für
Azithromycin und Clarithromycin signifikant höhere Konzentrationen in den
bronchoalveolären Zellen, gefolgt von den Konzentrationen in der PELF und wiederum
geringeren Konzentrationen im Serum, erreicht (SUAREZ-MIER et al., 2007). Die
Konzentrationen von Clarithromycin lagen in dieser Studie in der PELF nach 24 Stunden
und in den bronchoalveolären Zellen nach 48 Stunden über der Minimalen
Hemmstoffkonzentration (MHK) von R. equi für Clarithromycin (SUAREZ-MIER et al.,
2007).
Eine ebenfalls wirksame Behandlung der an R. equi erkrankten Fohlen stellt die
Kombination Rifampicin mit dem Makrolidantibiotikum Tulathromycin dar
(HÖHENSTEIGER, 2005; VENNER et al., 2007; SCHOCK, 2008). Die alleinige Gabe
von Tulathromycin ist der Therapie mit Azithromycin in Kombination mit Rifampicin bei
einer Rhodococcose nicht unterlegen (VENNER et al., 2007).
AINSWORTH et al. veröffentlichte 1998 eine Studie an 115 Vollblut- und
Trabrennpferden, die alle als Fohlen an einer R. equi Pneumonie erkrankten und mit
Erythromycin und Rifampicin therapiert worden waren. Die Überlebensrate lag bei 72%.
54% dieser überlebenden Fohlen starteten mindestens einmal bei einem Rennen, in der
Kontrollpopulation betrug der Anteil 65%. Wenn diese Pferde aber weiterhin an Rennen
teilnahmen, unterschied sich ihre Leistung nicht mehr von der der Gesamtpopulation.
Literaturübersicht
- 7 -
Bei der selteneren, von deutlichen Symptomen wie hohem Fieber, Dyspnoe und mukös
bis purulentem Nasenausfluss begleiteten, oft innerhalb von 24 – 48 Stunden tödlich
endenden akuten Form (ROONEY, 1966) der Rhodococcose ist die Prognose, auch bei
angemessener Behandlung, als schlecht einzustufen (GIGUÈRE, 2001), so dass nach
wie vor ein dringender Bedarf an der Optimierung bisheriger Therapien und bei der
Entwicklung neuer Strategien gegeben ist. Zusätzlich besteht die Gefahr, dass der
Erreger zunehmend Resistenzen gegen die bisher eingesetzten Antibiotika bildet.
Bereits 1994 (KENNEY et al.) und 1997 (TAKAI a/b) wurden in Einzelfällen Resistenzen
von R. equi gegen in vivo wirksame Therapieprotokolle beschrieben. In einer weiteren
Studie konnte über einen Zeitraum von zehn Jahren ein Anstieg der MHK von R. equi
für Rifampicin und Erythromycin gezeigt werden. Es wurden von 1996 bis 2006 94
Isolate von an R. equi erkrankten Fohlen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass
die MHK von R. equi für Rifampicin von 0,081 µg/ml (vor 2000) auf 0,187 µg/ml (2006)
stetig angestiegen ist. Ähnliches haben die Autoren für die MHK Werte von
Erythromycin beschrieben. Hier sehen sie Anstiege der MHK von R. equi von 0,258
µg/ml hin zu 0,538 µg/ml (BUCKLEY et al., 2007). Die Autoren BUCKLEY et al. (2007)
weisen in Ihrer Arbeit auf die Gefahr einer stetig steigenden MHK von R. equi
gegenüber den eingesetzten Antibiotika wie Rifampicin und Erythromycin hin und
warnen vor einer zukünftigen Resitenzproblematik, die zwangsläufig mit einer weniger
effektiven Behandlung der Rhodococcose verbunden ist. Auch in der Humanmedizin
werden vermehrt Resistenzen gegen diese beiden genannten Antibiotika beschrieben
(ASOH et al., 2003).
2.3 Pharmakokinetische Grundlagen zur Therapie der Rhodococcose
Die Pharmakokinetik eines Wirkstoffes beschreibt dessen Resorption, Verteilung,
Metabolisierung und Elimination im Organismus. Während dieser Vorgänge verändern
sich die Konzentrationen von Arzneimitteln in den verschiedenen Körperflüssigkeiten
und Geweben. Die Resorption umfasst alle Prozesse, die zu einer Abnahme der
Arzneimittelkonzentration am Ort der Applikation führen und das Erscheinen des
Arzneistoffes im Blut. Mit der Blutzirkulation werden die Medikamente in die
verschiedenen Körpergewebe verteilt. Der Wirkstoff kann dabei in Körperflüssigkeiten
Literaturübersicht
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gelöst oder in verschiedenen Geweben gebunden sein (DERENDORF et al., 2002). Als
Körpergewebe wird der extravaskuläre Raum bezeichnet. Der Arzneistoff kann sich hier
wiederum im extrazellulären Raum, wozu die PELF zu zählen ist, oder intrazellulär in
den Gewebezellen, wozu die bronchoalveolären Zellen, Zellen der Bronchialschleimhaut
und das alveoläre Epithel zu rechnen sind, wieder finden. In diesen benachbarten
Mikrokompartimenten werden unterschiedliche Konzentrationen von eingesetzten
Wirkstoffen erreicht. Als Ursache dafür werden verschiedene Aufnahmemechanismen in
Zellen und verschiedene Überwindungsmöglichkeiten biologischer Barrieren (zum
Beispiel in die PELF) angenommen. Auf welchem Weg Arzneimittel, insbesondere
Antibiotika in diese besonderen Gewebe gelangen, ist noch unzureichend bekannt
(KROEMER et al., 2008). Im Rahmen der Therapie der Rhodococcose werden an das
Antibiotikum, aufgrund der genannten Erregereigenschaften besondere Anforderungen
gestellt. Um intrazellulär liegende Keime abzutöten, müssen die Antiinfektiva in die
entsprechenden Gewebe gelangen (DERENDORF et al., 2002) und dafür verschiedene
Barrieren, wie zum Beispiel die Epithelzellen des Magen-Darm-Traktes, Endothelzellen
der Blutgefäße, Zellen des Alveolarepithel oder die Membranen der bronchoalveolären
Zellen in der PELF, überwinden. Darüber hinaus gehören zu den Zielkompartimenten
das gesamte Lungenparenchym und hier insbesondere abszedierend eingeschmolzene
Bereiche. An allen physiologischen Grenzflächen stehen prinzipiell die gleichen
Resorptionsmechanismen zur Verfügung (DERENDORF et al., 2002). Die Aufnahme in
die verschiedenen Gewebe hängt ebenso wie Resorption und Elimination von den
physikochemischen Eigenschaften des Arzneimittels und den physiologischen
Bedingungen des Organismus ab (DERENDORF et al., 2002). Zu diesen Eigenschaften
gehören die Lipophilie, die Proteinbindung, das Molekulargewicht, die
Serumproteinbindung des Wirkstoffes, die Affinität zu Membranproteinen und der pH-
Wert beziehungsweise in welcher Ionisationsform der Wirkstoff vorliegt (BERGOGNE-
BÉRÉZIN, 1981; PENNINGTON, 1981; HONEYBOURNE und BALDWIN, 1992). So
werden zum Beispiel Antibiotika mit einem basischen Charakter im sauren Milieu
protoniert, sie können dann als geladene Moleküle nicht mehr durch Zellwände
diffundieren und reichern sich so in entsprechenden Geweben und Zellen an
(KLEMPNER und STYRT, 1981; DONOWITZ, 1994). Die Eigenschaften des
Arzneimittels bedingen den Prozess, über den der Stoff Barrieren überwindet. Zu den
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Mechanismen zählen die passive Diffusion, bei der der Arzneistoff aufgrund eines
Konzentrationsgefälles über die Membran gelangt und die Resorption durch Poren.
Arzneistoffe können außerdem mit Hilfe eines Trägermoleküls, ebenfalls entlang eines
Konzentrationsgefälles, durch die Zellmembran geschleust werden. Dieser Vorgang wird
als „erleichterte Diffusion“ bezeichnet und erfolgt vor allem bei hydrophilen Substanzen,
die durch die Kopplung an so genannte „Carrier“ lipophile Eigenschaften erlangen
(DERENDORF et al., 2002). Eine weitere Möglichkeit zur Überquerung von Membranen
stellt der Ionenpaar-Transport dar, bei dem vor allem im Gastrointestinaltrakt Stoffe die
in ionisierter Form vorliegen an Gegenionen gebunden werden, so dass sie elektrisch
neutral sind und diffundieren können. Als weiterer Prozess wird die Pino- und
Phagozytose beschrieben (DERENDORF et al., 2002). Einen weiteren großen Bereich
stellt der aktive Transport von Arzneistoffen mithilfe von Transporterproteinen dar. Als
aktiv werden Prozesse bezeichnet für die Energie in Form von Adenosintriphosphat
(ATP) aufgebracht werden muss (DERENDORF et al., 2002). Membrantransporter sind
wichtige Proteine zur Regulation des zellulären Nährstoff- und Flüssigkeitshaushaltes.
Eine Vielzahl dieser Membrantransporter spielt auch für den Transport von Xenobiotika
und Arzneimitteln eine Rolle. Sie können den Transport über physiologische Barrieren
erleichtern oder verhindern. Diese Transporterproteine haben in der Regel verschiedene
physiologische Funktionen im Rahmen des Transportes endogener Substanzen wie
Zucker, Lipide, Aminosäuren, Gallensäuren, Steroide und Hormone. Für Organe wie
Leber, Niere, Darm oder das zentrale Nervensystem sind die Proteine, die am Transport
von Arzneimitteln beteiligt sind beim Menschen gut untersucht.
Transporterproteine beeinflussen die Resorption, Verteilung und Exkretion zahlreicher
Arzneistoffe. Sie gehören zur Superfamilie der ABC- (ATP-binding cassette) oder SLC
(Solute carrier family)-Transporter. ABC-Transporter stellen eine Familie von
transmembranären Proteinen dar, die eine Vielzahl von Substraten energieabhängig
über biologische Membranen transportieren können (LANGMANN et al., 2003;
NISHIMURA und NAITO, 2005). Diese agieren als Efflux-Transporter und sind somit in
der Lage, Substanzen auch gegen einen Konzentrationsgradienten aus dem
intrazellulären in den extrazellulären Raum zu pumpen. Viele der Transporter aus der
Superfamilie der ABC-Transporter zählen zu den so genannten Multi-drug-resistance
Proteinen. Dieser Name rührt daher, dass bei Überexpression dieser Proteine, wie es
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zum Beispiel in Tumoren vorkommt, die therapeutischen intrazellulären Wirkstoffspiegel
von eingesetzten Arzneimitteln nicht mehr erreicht werden (VAN DER DEEN et al.,
2005).
Eine weitere Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche Therapie mit Antiinfektiva ist
neben dem Erreichen der MHK, die erhaltene intrazelluläre, antimikrobielle Aktivität.
Verkäsende und große Abszesse müssen von dem Antibiotikum durchdrungen und
sterilisiert werden können (ZERTUCHE und HILLIDGE, 1987; VAN DEN BROEK, 1989).
2.4 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Rifampi cin beim Fohlen
2.4.1 Allgemeines zu Rifampicin
Rifampicin, aus der Gruppe der Ansamycinantibiotika, wurde erstmals 1969 in British
Columbia zur Therapie einzelner Tuberkulosefälle beim Menschen eingesetzt
(SCHONELL et al., 1972). Es ist für die Tuberkulosetherapie in Kombination mit
Isoniazid, Ethambutol und Pyrazinamid das Mittel der Wahl (BARONTI und
LUKINOVICH, 1968; FARR und MANDELL, 1982; MUTSCHLER et al. 2001;
AKTORIES et al., 2005). In der Veterinärmedizin wird Rifampicin zur Behandlung von
therapieresistenten Staphylococceninfektionen und bei der R. equi Pneumonie des
Fohlens eingesetzt (LÖSCHER et al., 2006). In Kombination mit einem
Makrolidantibiotikum gilt es auch bei der Rhodococcose des Fohlens als Mittel der Wahl.
2.4.2 Wirkmechanismus und Wirkspektrum von Rifampic in
Auf proliferierende Keime wirkt Rifampicin bakterizid. Durch die Hemmung der DNA-
abhängigen RNA-Polymerase in den Mitochondrien der Bakterien wird die Bildung von
mitochondrialer RNA (mtRNA) und damit einhergehend die Proteinsynthese gestoppt
(MANDELL, 1983). Die Proliferation des Bakteriums wird dadurch verhindert. In
therapeutischen Dosierungen wird die mtRNA Synthese in den Zellen der Säugetiere
nicht beeinflusst (FARR und MANDELL, 1982).
Das Wirkspektrum umfasst vor allem grampositive Keime wie zum Beispiel
Staphylococcus aureus, einige gramnegative Keime und M. tuberculosis (FURESZ,
1970; FARR und MANDELL, 1982; WILSON et al., 1988). Gramnegative
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Enterobacteriaceae sind gegenüber Rifampicin resistent (WILSON et al., 1988).
Rifampicin zeigt sich gegenüber R. equi 90 mal potenter als Penicillin und fünfmal
potenter als Gentamicin (ZERTUCHE und HILLIDGE, 1987).
2.4.3 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Rifam picin
Rifampicin wird nach oraler Gabe bei Kälbern, Hunden, Pferden und Menschen schnell
resorbiert (SWEENEY et al., 1988; FRANK, 1990), dennoch ist die Bioverfügbarkeit von
Rifampicin bei Pferden und Schafen nicht besonders hoch. Die orale Bioverfügbarkeit
beträgt beim erwachsenen Pferd nach der einmaligen Gabe von 10 mg/kg p.o. 48,8%
(KOHN et al., 1993). Wird Rifampicin über das Futter verabreicht beträgt die
Bioverfügbarkeit nur 39,5% (BURROWS et al., 1985). Nach einer intramuskulären
Applikation erreicht die Bioverfügbarkeit 59,8 ± 3,2% (BURROWS et al., 1985). Bei
erwachsenen Schafen, die mit 10 mg/kg Rifampicin gedrencht wurden beträgt die
Bioverfügbarkeit 36,6 ± 3,2% (SWEENEY et al, 1988). Möglicherweise verursacht die
längere Passage durch den Pansen beim adulten Schaf die geringere Bioverfügbarkeit
von Rifampicin (FRANK, 1990). Rifampicin weist einen stark lipophilen Charakter auf
und wird in viele Gewebe verteilt (FRANK, 1990; KOHN et al., 1993). Es konnte bei
verschiedenen Tierarten in allen Körpergeweben einschließlich Milch (Schafe), Knochen
(Ratten), Cerebrospinalflüssigkeit (Kaninchen), Exsudaten und Aszitesflüssigkeit in
antimikrobiellen Konzentrationen nachgewiesen werden (ZIV et al., 1974; CHAN, 1986;
FRANK, 1990; O`REILLY et al., 1992). Rifampicin kann Membranen von Phagozyten
passieren und intrazellulär gelegene Bakterien abtöten (WILSON et al., 1988; KOHN et
al., 1993). Für das Pferd werden verschiedene Verteilungsvolumina von Rifampicin
angegeben: 0,93 ± 0,29 L/kg (WILSON et al., 1988), 0,63 ± 0,06 L/kg (BURROWS et al.,
1985) und im Steady State 0,76 L/kg (KOHN et al., 1993). Die Proteinbindung von
Rifampicin ist beim Pferd hoch und beträgt 78% bei Serumkonzentrationen von 2 – 20
µg/ml (KOHN et al., 1993). Beim Schaf ist sie mit 84% ebenfalls hoch (ZIV et al., 1974).
Beim Menschen wird Rifampicin vor allem durch Desacetylierung in der Leber
metabolisiert (MUTSCHLER et al., 2001), dabei entsteht das ebenfalls gegen
Mycobakterien wirksame 25-Desacetylrifampicin. Die Ausscheidung von Rifampicin
erfolgt über die Galle und mit dem Urin. Rifampicin unterliegt nach der Ausscheidung
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über die Galle dem enterohepatischen Kreislauf (MUTSCHLER et al., 2001). Die
Biotransformation und Elimination von Rifampicin ist beim Tier nur wenig untersucht. Die
Induktion von Leberenzymen durch Rifampicin gibt Hinweise auf seinen eigenen Abbau.
Der Hauptmetabolit, das Desacetylrifampicin wurde jedoch nicht regelmäßig
nachgewiesen (ADACHI et al., 1985; BURROWS et al., 1992). Beim Pferd wurde
Desacetylrifampicin nach der einmaligen Gabe von 10 mg/kg i.v. oder nach der
siebenmaligen Gabe von 10 mg/kg p.o. alle 12 Stunden im Serum nicht nachgewiesen,
im Urin hingegen schon. Hier lagen die Konzentrationen aber unter denen des
Rifampicins (KOHN et al., 1993). Es wurden allerdings insgesamt nur 6,8% der
Gesamtdosis als Rifampicin oder des Metaboliten im Urin nachgewiesen. Rifampicin ist
dazu in der Lage, die Aktivität von Leberenzymen zu steigern und somit seinen eigenen
Abbau zu fördern (ADACHI et al., 1985, BURROWS et al., 1992). Diese Induktion von
Leberenzymen durch die Gabe von Rifampicin konnte bei verschiedenen Tierarten
einschließlich Pferden, Hunden, Schweinen und Kaninchen nachgewiesen werden
(WHITEHOUSE et al., 1985; BURROWS et al., 1992; KALTENBACH et al., 1996).
Normalerweise wird beim Pferd bei einer Therapiedauer von weniger als fünf Tagen
keine gesteigerte Aktivität der Leberenzyme beobachtet, allerdings gibt es einen Anstieg
der Enzymaktivität nach mehr als zwei Wochen nach Beendigung der Behandlung
(BURROWS et al., 1992). Die Eliminationshalbwertszeit für Rifampicin beträgt beim
Fohlen im Alter von einer Woche nach der einmaligen oralen Gabe von 10 mg/kg 25,4 ±
1,2 Stunden, im Alter von 10 Wochen bei gleicher Dosierung 7,9 ± 1,5 Stunden
(BURROWS et al., 1992). In einer weiteren Studie wird für das Fohlen im Alter von
sechs bis acht Wochen eine Halbwertszeit für Rifampicin, nach der einmaligen Gabe
von 10 mg/kg, von 17,5 Stunden angegeben bei einer konstanten Eliminationsrate von
0,04 µg/Stunde (CASTRO et al., 1986). Bei adulten Pferden beträgt die
Eliminationshalbwertszeit nach der einmaligen oralen Gabe von 10 mg/kg 13,3 Stunden
und nach der oralen Verabreichung von sieben Dosen im Abstand von zwölf Stunden
7,99 Stunden (KOHN et al., 1993). Im Vergleich dazu beträgt die Halbwertszeit beim
Hund nach einmaliger oraler Applikation von 10 mg/kg acht Stunden (FRANK, 1990;
FINEL et al., 1971). Nach der intravenösen Gabe von Rifampicin (10 mg/kg) beträgt die
Halbwertszeit beim Pferd 8,1 Stunden (KOHN et al., 1993), 7,3 Stunden (WILSON et
al.1988) beziehungsweise sechs Stunden (BURROWS et al., 1985). Die
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Halbwertszeiten nach der intravenösen Applikation sind damit beim Pferd deutlich länger
als die des Schafes (2,9 Stunden bzw. 4,56 Stunden (SWEENEY et al., 1988;
JERNIGAN et al., 1991). Nach der intramuskulären Applikation von 10 mg/kg beträgt die
Halbwertszeit beim Pferd 7,3 Stunden (BURROWS et al., 1985). Die Verabreichung
multipler Dosen an Pferde führt zu niedrigeren Serumkonzentrationen und zu einer
erniedrigten Eliminationshalbwertszeit aufgrund der Autoinduktion von Leberenzymen
und dem dadurch gesteigerten Abbau des Wirkstoffes (FRANK, 1990). Die maximalen
Serumkonzentrationen werden beim Pferd nach intramuskulärer Injektion von 10 mg/kg
nach 4,2 ± 0,2 Stunden erreicht und betragen 4 ± 0,3 µg/ml (BURROWS et al., 1985).
Beim Fohlen im Alter von sechs bis acht Wochen werden nach einmaliger oraler Gabe
(10 mg/kg) nach 4 Stunden Konzentrationen von 6,7 µg/ml erreicht, die innerhalb von 24
Stunden langsam auf Werte von 2,7 µg/kg sinken (CASTRO et al., 1986). Bei Fohlen,
die im Alter von vier bis zwölf Wochen wöchentlich mit 10 mg/kg Rifampicin behandelt
wurden, konnte gezeigt werden, dass die Maximalkonzentrationen im Serum mit
zunehmendem Alter sinken (BURROWS et al., 1992). Der Effekt des Alters steht in
Bezug zu einer gesteigerten Absorption oder einer gesenkten Elimination des
Arzneimittels beim jüngeren Fohlen. Die Dosierungen für junge Fohlen sollten jedoch
nicht herabgesetzt werden, da sie über eine lange Zeit therapiert werden und die
Dosierungen angeglichen werden müssten. Außerdem ist die Konkurrenz mit anderen
Medikamenten zu bedenken (BURROWS et al., 1992). Für das adulte Pferd werden von
verschiedenen Autoren und abhängig von der Applikationsart sowie der Dosierung,
unterschiedliche Konzentrationen von Rifampicin im Serum beschrieben. Nach einer
Gabe von Rifampicin in der Dosis von 10 mg/kg p.o. werden nach drei Stunden
maximale Konzentrationen von 3,9 µg/ml (KOHN et al., 1993) beziehungsweise 4,5 ±
1,1 µg/ml nach 1,6 ± 0,5 Stunden erreicht (BURROWS et al., 1992). Wird das
Rifampicin (10 mg/kg) gemeinsam mit Futter an die Pferde verabreicht, erreichen die
Konzentrationen nach 3,5 ± 1,7 Stunden maximale Serumkonzentrationen von 3,3 ± 2,9
µg/ml. Diese Konzentrationen fallen nach zwölf Stunden auf 2 µg/ml ab (BURROWS et
al., 1985, 1992). Bei einer Dosierung von 25 mg/kg werden nach 3,5 Stunden
Konzentrationen von 9,8 ± 1,9 µg/ml erreicht (BURROWS et al., 1985). Die höchsten
Serumkonzentrationen werden nach der intragastralen Gabe von 20 mg/kg beschrieben,
hier werden bereits nach 2,5 Stunden 13,3 ± 2,7µg/ml gemessen (WILSON et al., 1988).
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Im Vergleich zum Pferd werden bei Hunden nach der oralen Gabe von 10 mg/kg
Rifampicin nach zwei bis vier Stunden maximale Serumkonzentrationen von 40 µg/ml
gemessen und sind somit wesentlich höher (FINEL et al., 1971; FRANK, 1990). Bei
Kälbern im Alter von zwei bis drei Wochen liegen die Serumkonzentrationen bei 11,7 bis
24,6 µg/ml nach vier bis acht Sunden nach der oralen Applikation von 10 mg/kg
(SWEENEY et al., 1988).
BURROWS et al. (1985) empfehlen eine Dosierung von 10 mg/kg p.o., um beim Pferd
ausreichend hohe Konzentrationen für sensitive, grampositive Bakterien mit einer MHK
von weniger als 1 µg/ml zu erreichen. Für Bakterien mit einer MHK von über 1 µg/ml und
hierbei vor allem von gramnegativen Bakterien sind die Dosierungen von 10 mg/kg p.o.
zu erhöhen oder es ist eine andere Applikationsform zu wählen.
2.4.4 Nebenwirkungen von Rifampicin beim Fohlen und beim adulten Pferd
In einer täglichen Dosierung von 5 bis 10 mg/kg p.o. wird Rifampicin zur Anwendung
beim Fohlen als sicheres Arzneimittel eingestuft (BURROWS et al., 1992). Auch in
anderen Studien wird nur von geringen Nebenwirkungen berichtet. In einer initialen
Dosierung von zweimal täglich 7,5 mg/kg p.o., die anschließend auf 5 mg/kg p.o.
reduziert wird, über eine Gesamtdauer von neun Wochen konnten für Rifampicin beim
Fohlen keine Nebenwirkungen festgestellt werden (ZERTUCHE und HILLIDGE, 1987).
Beim Fohlen tritt in der ersten Woche der Behandlung mit Rifampicin in einer Dosierung
von 10 mg/kg oft ein milder, selbstlimitierender Durchfall auf (HILLIDGE, 1987). Beim
Fohlen ist, wie beim Menschen, eine Rotfärbung des Urins beschrieben worden
(GIGUÈRE und PRESCOTT, 1997; KERTH, 2005; HÖHENSTEIGER, 2005). Beim
adulten Pferd wurden nach der Verabreichung von 10 mg/kg i.v allergische Reaktionen
(BURROWS et al., 1992), kurzfristige, generalisierte zentralnervöse Depressionen,
geminderter Appetit (BURROWS et al., 1985), Unruhe, milde bis moderate
Schweißbildung und Schwäche (BURROWS et al., 1992) beschrieben. Die
Nebenwirkungen nach der intravenösen Applikation sind nicht zwangsläufig dem
Rifampicin zuzuordnen, da es zusammen mit Dimethylsulfoxid appliziert wurde. Nach
der intramuskulären Applikation zeigten zwei von vier Pferden eine Schwellung an der
Injektionsstelle und drei Stunden nach der Applikation trat leichtes Schwitzen ein. Nach
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der oralen Applikation zeigten die adulten Pferde keinerlei Nebenwirkungen (BURROWS
et al., 1985, 1992).
2.4.5 In vitro minimale Hemmstoffkonzentrationswert e von R. equi für Rifampicin
Die MHK von R. equi liegt für MHK90 bei 0,05 µg/ml (PRESCOTT und SWEENEY, 1985;
JACKS et al., 2003). Die MHK90 beschreibt die Konzentration bei der 90% der Isolate im
Wachstum gehemmt werden. Andere Autoren beschreiben MHK-Werte für die MHK50
von 0,03 – 0,06 µg/ml (PRESCOTT und NICHOLSON, 1984; NORDMANN und
RONCO, 1992). BUCKLEY et al. beschreiben 2007 einen Anstieg der MHK für R. equi
von 0,081 µg/ml vor dem Jahr 2000 auf 0,187 µg/ml im Jahr 2006 (94 Isolate von R.
equi).
2.4.6 Resistenzen von R. equi gegenüber Rifampicin beim Fohlen
Für Rifampicin wird eine schnelle Resistenzentwicklung beschrieben. Resistenzen
entstehen vor allem wenn Rifampicin als Monotherapie über einen längeren Zeitraum
angewendet wird. Aus diesem Grunde wird es meist in Kombination mit anderen
Antibiotika verabreicht (THORNSBERRY et al., 1983; FRANK, 1990; O`REILLY et al.,
1992). In einer Untersuchung an Isolaten von 99 R. equi infizierten Fohlen, die über vier
Wochen mit Rifampicin behandelt wurden, konnte gezeigt werden, dass am Ende der
Studie 90% der Isolate Resistenzen gegen Rifampicin aufwiesen (TAKAI et al.,1997).
Grund hierfür ist die hohe Mutationsrate von R. equi bei einer solchen Monotherapie.
Rifampicin sollte deshalb, wie auch in der Tuberkulosetherapie beim Menschen, immer
in Kombination mit einem weiteren Antibiotikum angewendet werden (BARONTI und
LUKINOVICH, 1968; FARR und MANDELL, 1982; NORDMANN und RONCO, 1992).
1994 wurde der Fall eines an Rhodococcen erkrankten Fohlens beschrieben, das mit
Rifampicin und Erythromycin behandelt wurde. Zu Beginn der Therapie und sieben
Wochen nach Therapiebeginn wurde R. equi aus dem Tracheobronchialsekret isoliert.
Die Probe nach sieben Wochen wurde entnommen, weil das Fohlen mit Dyspnoe und
gestörtem Allgemeinbefinden, sowie schlechteren radiologischen Lungenbefunden
auffiel. Zum Zeitpunkt des Therapiebeginns zeigte sich das Isolat gegenüber beiden
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Antibiotika sensibel. Das Isolat nach sieben Wochen wies eine moderate Sensibilität
gegenüber Erythromycin auf und zeigte sich gegenüber Rifampicin resistent (KENNEY
et al., 1994). Im Rahmen ihrer Studie an 94 R. equi Isolaten konnten BUCKLEY et al.,
2007 ebenfalls eine zunehmende Resistenz von R. equi gegenüber Rifampicin darlegen
(siehe 2.2).
2.5 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Clarith romycin beim Fohlen
2.5.1 Allgemeines zu Clarithromycin
Clarithromycin stellt eine sinnvolle Alternative zu anderen Makroliden in der Behandlung
der Rhodococcose des Fohlens dar und sein Einsatz wurde 2002 erstmals beschrieben
(JACKS et al., 2002). Es gehört zur Gruppe der Makrolid-Antibiotika und findet seinen
Einsatz bisher hauptsächlich in der Humanmedizin (FREY und LÖSCHER, 2002;
JACKS et al., 2002). Clarithromycin wird halbsynthetisch aus Erythromycin hergestellt
und wird auch als 6-O-Methylerythromycin bezeichnet (PERITI et al., 1993). Zur
Behandlung der abszedierenden Bronchopneumonie beim Fohlen weist Clarithromycin
im Vergleich zu anderen eingesetzten Makrolid-Antibiotika verschiedene Vorteile auf
(siehe 2.2). Nachteilig ist allerdings der sehr hohe Preis (CHARLES und SEGRETI,
1997; FREY und LÖSCHER, 2002).
2.5.2 Wirkmechanismus von Clarithromycin
In den meisten Fällen wirken Makrolide bakteriostatisch (BURROWS, 1980). In hohen
Konzentrationen sind sie bakterizid (NEU, 1991; PRESCOTT und BAGGOT, 1993). Die
optimale Wirksamkeit liegt bei einem pH-Wert von acht vor, bei einem pH-Wert unter
sechs findet eine signifikante Reduktion der Wirksamkeit statt (BURROWS, 1980).
Makrolide gelangen über Diffusion, möglicherweise auch mit Hilfe von
Transporterproteinen oder über Pinozytose in phagozytierende Zellen. Nach ihrer
Aufnahme gelangen Makrolide aufgrund ihres basischen Charakters in die Lysosomen
und kommen nach der Fusion von Phagosom und Lysosom zum Phagolysosom mit
dem Bakterium in Kontakt. Der Angriffspunkt an der Bakterienzelle ist die 50s
Untereinheit des bakteriellen Ribosoms, an der Makrolide durch kovalente Bindung an
Literaturübersicht
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das Peptidyltransferasezentrum, die bakterielle Proteinsynthese effektiv, aber reversibel
hemmen (VANNUFFEL und COCITO, 1996). Makrolide verhindern auf diese Art die
Verlängerung der bakteriellen Proteinkette und stören die Translokation der Peptidyl-
RNA von der Akzeptor- zur Donorstelle.
Das Wirkspektrum von Clarithromycin umfasst wie das von Erythromycin die meisten
grampositiven aeroben Bakterien. Darüber hinaus ist Clarithromycin gegen einige
gramnegative Bakterien aktiver als Erythromycin (ALVAREZ-ELCORO und ENZLER,
1999). Zusätzlich wird eine gesteigerte Wirksamkeit gegen grampositive Coccen
beschrieben (CHARLES und SEGRETI, 1997).
2.5.3 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Makro liden, insbesondere von
Clarithromycin
Makrolide werden beim Menschen nach der oralen Aufnahme im Darm absorbiert und
gelangen über die Vena portae zur Leber. Ein kleiner Teil des Medikamentes wird dort
inaktiviert, der größere Teil über die Galle in den Darm entlassen. Das auf diesem Wege
in den Darm zurückgelangte Antibiotikum unterliegt dem enterohepatischen Kreislauf
(WILLIAMS und SEFTON, 1993). Makrolide werden in der Leber hydrolytisch oder
enzymatisch in aktive Formen umgewandelt und erhalten ihren basischen Charakter.
Durch diesen Charakter werden sie in sauren, intrazellulären Kompartimenten wie
Lysosomen und Phagosomen ionisiert und in Geweben und Zellen angereichert. In
bestimmten Geweben wie Lunge, Leber und Euter erreichen sie Konzentrationen, die
die Serumkonzentration um das Drei- bis Zehnfache übersteigen (WILLIAMS und
SEFTON, 1993; FREY und LÖSCHER, 2002). Nur ein kleiner Anteil des verabreichten
Medikaments, der nicht in den verschiedenen Organen angereichert wird, ist im Serum
nachweisbar (WILLIAMS und SEFTON, 1993). Die hohen Konzentrationen von
Makroliden in der PELF spielen eine Schlüsselrolle in der Therapie von
Atemwegserkrankungen bei Mensch und Tier. Die Ausscheidung der Makrolide erfolgt
beim Menschen über die Galle (WILLIAMS und SEFTON, 1993), ein weiterer Anteil wird
in aktiver Form über die Niere ausgeschieden (BURROWS, 1980).
Literaturübersicht
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2.5.4 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Clari thromycin beim Fohlen
Einige Berichte über pharmakodynamische und pharmakokinetische Daten von
Clarithromycin beim Fohlen liegen bereits vor. An gesunden Fohlen wurde einmalig 10
mg/kg Clarithromycin intragastral (i.g.) verabreicht und im Anschluss daran die
Konzentrationen von Clarithromycin mit Hilfe eines Agargeldiffusionstestes im Serum
bestimmt (JACKS et al., 2002). Dabei wurden nach 1,5 Stunden maximale
Serumkonzentrationen von 0,92 ± 0,17 µg/ml erreicht. Innerhalb von 24 Stunden sank
diese Konzentration auf 0,03 µg/ml ab. Nach dieser einmaligen, peroralen
Verabreichung von 10 mg/kg Clarithromycin lagen die Konzentrationen im Serum über
einen Zeitraum von zwölf Stunden über dem MHK90-Wert von 0,12 µg/ml für R. equi. Die
Halbwertszeit für Clarithromycin beträgt nach der oralen Verabreichung von 10 mg/kg
4,8 Stunden (JACKS et al., 2002). Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde zur
Anwendung von Clarithromycin am Fohlen eine Dosierung von 7,5 mg/kg alle zwölf
Stunden abgeleitet (JACKS et al., 2002). Aufgrund der Ergebnisse einer retrospektiven
Studie 2004 wurde von den Autoren lediglich davon ausgegangen, dass Clarithromycin
beim Fohlen, analog zum Menschen, hohe Konzentrationen in der PELF und den
Alveolarmakrophagen erreicht (GIGUÈRE et al., 2004). Erst 2006 wurden bei gesunden
Fohlen die Konzentrationen von Clarithromycin in der PELF und in den BAL-Zellen
bestimmt (WOMBLE et al., 2006). In dieser Arbeit wurde die Pharmakokinetik und die
Konzentration von Clarithromycin nach der einmaligen intravenösen, bzw. intragastralen
Gabe von 7,5 mg/kg Clarithromycin im Serum bestimmt. Außerdem wurde die
Konzentration von Clarithromycin nach der sechsten intragastralen Applikation von 7,5
mg/kg zu den Zeitpunkten 0, nach 24, 36, 48, 60 und 72 Stunden in Serum, Synovia,
Bauchhöhlenflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, Urin, PELF und in den
bronchoalveolären Zellen bestimmt. Zusätzlich erfolgten vor jeder intragastralen
Applikation, sowie zu den Applikationszeitpunkten zwei, vier und sechs erneute
Blutentnahmen. Die bronchoalveoläre Lavage und alle weiteren Probenentnahmen
fanden zwei und zwölf Stunden nach der letzten (sechsten) intragastralen Applikation
statt. Die Bestimmung der Konzentrationen erfolgte mittels Agargeldiffusionstest, im
Serum zusätzlich mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Die
pharmakokinetischen Daten sind den Tabellen 17 und 18 im Anhang zu entnehmen.
Literaturübersicht
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Mit der HPLC wurden im Serum ähnliche Konzentrationen nachgewiesen wie mit dem
Agargeldiffusionstest (WOMBLE et al., 2006). Zwischen der Elimination nach der
intravenösen und der oralen Applikation von Clarithromycin in einer Dosierung von 7,5
mg/kg konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Nach der sechsten
intragastralen Applikation von 7,5 mg/kg Clarithromycin wurden in
Bauchhöhlenflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit und Synovia ähnliche oder geringere
Konzentrationen als im Serum gemessen. Die Konzentrationen im Urin, in der PELF und
in den bronchoalveolären Zellen lagen signifikant höher als die im Serum. Das beim
Abbau von Clarithromycin entstehende 14-Hydroxyclarithromycin (14-OH-
Clarithromycin) konnte beim Fohlen nachgewiesen werden (WOMBLE et al., 2006).
Dieser Metabolit entsteht in der Leber durch den Abbau mit dem Cytochrom P450
System (FERRERO et al., 1990). Die maximalen Konzentrationen für 14-
Hydroxyclarithromycin im Serum wurden nach 1,7 Stunden erreicht (i.v. und i.g.). Beim
Menschen werden maximale Serumkonzentrationen des 14-OH-Clarithromycin von 1,3
µg/ml hingegen erst nach drei Stunden gemessen (GAN et al., 1992). Der Nachweis des
Metaboliten kann nur durch die HPLC erfolgen. Der Agargeldiffusionstest ist nicht in der
Lage zwischen Clarithromycin und seinem Metaboliten zu differenzieren (WOMBLE et
al., 2006).
Die orale Bioverfügbarkeit beträgt beim Fohlen 57% (WOMBLE et al., 2006) und
entspricht somit in etwa jener des Menschen von 55% (CHU et al. 1992), ist aber
niedriger als die für den Hund beschriebene Bioverfügbarkeit von 70 bis 75%
(VILMANYI et al., 1996). Die orale Bioverfügbarkeit von Clarithromycin beim Fohlen
entspricht der von Azithromycin (38 bis 56%) und ist wesentlich höher als die von
Erythromycin (14%) (LAKRITZ et al., 2000; JACKS et al., 2001; DAVIS et al., 2002).
Die Halbwertszeit ist beim Fohlen mit 5,4 Stunden länger als die beim Hund
beschriebene von 3,9 Stunden (VILMANYI et al., 1996). Beim Menschen beträgt die
Halbwertszeit für Clarithromycin drei bis fünf, für seinen Metaboliten vier bis neun
Stunden. Im Vergleich zu den anderen, bei der R. equi Pneumonie eingesetzten
Antibiotika ist die Halbwertszeit länger als die von Erythromycin (eine Stunde) und
kürzer als die von Azithromycin (16 bis 20 Stunden) (PRESCOTT et al., 1983; LAKRITZ
et al., 1999; LAKRITZ et al., 2000; JACKS et al., 2001; DAVIS et al., 2002). Die
Halbwertszeit von Tulathromycin liegt nach single dose bei 105 ± 5 Stunden
Literaturübersicht
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(HÖHENSTEIGER, 2005; SCHOCK, 2008). Beim Fohlen wurden mit der einmaligen
oralen Gabe von 7,5 mg/kg im Abstand von zwölf Stunden Wirkspiegel von
Clarithromycin im Serum erreicht, die über der MHK90 für R. equi von 0,12 µg/ml lagen
(JACKS et al., 2003 WOMBLE et al., 2006). Die Konzentrationen von Clarithromycin in
der PELF und in den bronchoalveolären Zellen lagen in beträchtlichem Ausmaß über
der MHK90 für R. equi und lagen höher als die gemessenen Konzentrationen von
Clarithromycin im Serum (siehe Tabelle 18 im Anhang). Innerhalb von zwölf Stunden
kam es zu einem starken Abfall der Konzentrationen von Clarithromycin in der PELF. Im
Gegensatz dazu sinkt die Konzentrationen nach der Gabe von Azithromycin innerhalb
von 48 Stunden nicht (JACKS et al., 2001).
2.5.5 Nebenwirkungen von Clarithromycin beim Fohlen
Clarithromycin ist beim Fohlen besser verträglich als Erythromycin (CHARLES und
SEGRETI, 1997), es treten weniger gastrointestinale Nebenwirkungen auf. Bei der
einmaligen oralen Gabe von 10 mg/kg traten keine Nebenwirkungen auf (JACKS et al.,
2002). Bei der Gabe von 10 mg/kg Clarithromycin p.o., einmal täglich bzw. 7,5mg/kg
Clarithromycin p.o. zweimal täglich in Kombination mit Rifampicin, über einen Zeitraum
von mehreren Wochen, trat bei 28% der mit Clarithromycin behandelten Fohlen
Durchfall auf (GIGUÈRE et al., 2004). Bei den Fohlen, die mit Azithromycin behandelt
wurden zeigten nur 5% der Fohlen Durchfälle, während es in der Erythromycingruppe
bei 17% der Fohlen zu dieser Erscheinung kam. Eines von sechs Fohlen begann fünf
Minuten nach der intravenösen Applikation zu schwitzen (WOMBLE et al., 2006). Ein
Fohlen fiel nach der dritten, eines nach der letzten oralen Applikation von Clarithromycin
mit Durchfall auf, der innerhalb von 36 Stunden von alleine sistierte.
2.5.6 in vitro MHK-Werte von R. equi für Clarithromycin
Die Empfindlichkeit von R. equi für Azithromycin, Clarithromycin und 20 weitere
Antibiotika wurde in vitro untersucht. Dabei wurden 64 R. equi Isolate auf ihre
Empfindlichkeit getestet (JACKS et al., 2003). Die Isolate wurden aus dem
Tracheobronchialsekret von erkrankten Fohlen gewonnen. In der Studie wurden MHK90-
Literaturübersicht
- 21 -
Werte von 0,12 µg/ml Clarithromycin für R. equi festgestellt. Die MHK90 von
Azithromycin mit 1 µg/ml lag höher als die von Erythromycin (unter 0,25 µg/ml) und
Clarithromycin mit 0,12 µg/ml. Die MHK90 für Rifampicin wurde mit unter 0,5 µg/ml
angegeben. In einer weiteren Untersuchung an 127 Isolaten konnte eine MHK90 für R.
equi von 0,06 µg/ml ermittelt werden (ROTHHAAR 2006).
Bisher sind keine Resistenzen von R. equi gegen Clarithromycin beschrieben worden.
2.6 Modell möglicher Transportmechanismen für Clari thromycin in die PELF und
in die bronchoalveolären Zellen
Mit welchem Mechanismus Rifampicin und Clarithromycin in die PELF und in die BAL-
Zellen gelangen, ist unbekannt. Das Überqueren der Barrieren der Lunge ist von vielen
Faktoren abhängig (HONEYBOURNE und BALDWIN, 1992). Die zu überwindenden, für
den Menschen beschriebenen Barrieren im Bereich der Bronchien bestehen aus dem
Gefäßendothel, das nur wenige tight-junctions enthält und folglich relativ permeabel ist
(BARZA und CUCHURAL, 1985) und aus den weniger permeablen Zellen der
Bronchialschleimhaut. Im Bereich der Alveolen weist das Kapillarnetz eine sehr große
Gesamtoberfläche auf. Somit steht der Passage der Antibiotika im Bereich der Alveolen
und in den terminalen Bronchien eine große Fläche zur Verfügung, um in die PELF und
aus dieser in die bronchoalveolären Zellen zu gelangen. Das Kapillarendothel ist in
diesem Bereich ungefenstert (KAIBARA und KIKKAWA, 1971; WEIBEL und GIL, 1977)
und stellt somit eine schwierigere Barriere für Antibiotika dar. Zusätzlich ist die
Alveolarmembran aufgrund vieler tight-junctions relativ impermeabel (TAYLOR et al.,
1965; WEIBEL und GIL, 1977; EFFROS et al., 1986, 1988). Makrolide, wie zum Beispiel
Clarithromycin, gelangen vom Plasma über die PELF in die bronchoalveolären Zellen.
Dort reichern sie sich in Konzentrationen, die über den Plasmakonzentrationen liegen,
an (CONTE et al., 1995; JACKS et al., 2001; WOMBLE et al., 2006). Beim Menschen
bestehen genügend Beweise dafür, dass die intrapulmonale Verteilung von
Arzneimitteln in das Gefäßendothel, das Bronchial- und Alveolarepithel und in die
Alveolarmakrophagen von verschiedenen Transporterproteinen beeinflusst wird (VAN
DER DEEN, 2005).
Literaturübersicht
- 22 -
Die Akkumulation von Makroliden in der PELF und in den bronchoalveolären Zellen
könnte von Aufnahme- (Uptaketransporter) und Effluxtransportern abhängig sein. Diese
Transporter werden in der Lunge des Menschen und bei Mäusen in den Epithelien und
an Makrophagen exprimiert. In vitro Untersuchungen zeigten, dass Makrolide von
diesen Proteinen transportiert werden (SERAL et al., 2003a/b; SUGIE et al., 2004;
BOSNAR et al., 2005). Es gibt bisher allerdings keine Untersuchungen darüber, ob und
in welchem Ausmaß diese Transporterproteine die Verteilung von Makroliden in vivo
beeinflussen (KROEMER et al., 2008). An bronchoalveolären Zellen des Fohlens konnte
die Expression der Transporterproteine P-Glykoprotein (P-gp) und multidrug resistance
protein 2 (MRP 2) nachgewiesen werden (HÖHENSTEIGER, 2005). Das dabei
eingesetzte Tulathromycin wies in den bronchoalveolären Zellen und in der PELF hohe
Konzentrationen auf. Nach der zusätzlichen Gabe von Rifampicin sanken die
Konzentrationen des Makrolides. Tulathromycin weist jedoch keine Affinität zu P-gp und
MRP-2 auf. Aufgrund dieser Ergebnisse gehen die Autoren davon aus, dass die
Konzentration von Tulathromycin in den bronchoalveolären Zellen von noch
unbekannten Uptake Transportern abhängig ist, die wiederum durch die zusätzliche
Gabe von Rifampicin gehemmt werden.
2.6.1 Beeinflussung der Expression und Wirkung von Transporterproteinen
Arzneimittel erreichen intrazelluläre Erreger wie R. equi oder M. tuberculosis in
Makrophagen nur schwer. Die Gründe dafür sind bisher nur unzureichend erforscht.
Nach gegenwärtigem Kenntnisstand befinden sich auf den Membranen von
Makrophagen Effluxtransporter (P-gp, MRP-1). Diese Auswärtspumpen sind dazu in der
Lage, eine Vielzahl endogener Stoffe als auch Xenobiotika aus den Zellen zu entfernen
oder ihr Eindringen in die Zelle zu verhindern. Sie stellen einen Teil der physiologischen
Funktionsbarriere dar. Das MDR1 Gen (multi drug resistance) codiert für das P-
Glykoprotein (P-gp; ABCB1), welches das bisher am besten untersuchte
Transporterprotein ist. P-gp spielt eine wichtige Rolle bei der Abwehr der Zelle
gegenüber der Umwelt. In den Zellen von exkretorisch aktiven Organen wie Leber,
Darm oder Niere ist es in der Regel apikal lokalisiert und transportiert Stoffe aus dem
Zellinneren nach Extrazellulär. Wechselwirkungen von Arzneimitteln mit dem
Literaturübersicht
- 23 -
Transporterprotein P-gp können sich generell auf die Pharmakokinetik von Arzneistoffen
im Organismus (SIEGMUND et al., 2003a/b) auswirken. So können zum Beispiel oral
applizierte Arzneimittel bereits an den Enterozyten direkt nach deren Resorption wieder
zurück in das Darmlumen transportiert werden. Bei Schlachtpferden wurde das
Vorkommen von P-gp mittels PCR im Ileum nachgewiesen (NATALINI und LINARDI,
2005). Bei gesteigerter Aktivität von P-gp reichern sich Wirkstoffe, die mit diesem
Transporter interagieren, im Inneren der Zelle weniger an (VAN DER DEEN et al.,
2005). Eine bedeutende Rolle hat P-gp durch seine Beteiligung an Organschranken, wie
der Blut-Hirn-Schranke oder der Plazentarschranke. Wird P-gp durch einen Gendefekt
an den Endothelzellen dieser Schranken nicht exprimiert, können normalerweise gut
verträgliche Wirkstoffe über diese Barrieren gelangen und tödliche oder teratogene
Folgen haben (SCHINKEL et al., 1994; KIM et al., 1998; LANKAS et al., 1998; KWEI et
al., 1999; SMIT et al., 1999).
In der Lunge des Menschen wird P-gp an Zilien tragenden Zellen und an Zellen
bronchialer Drüsen gefunden (LECHAPT-ZALCMAN et al., 1997). In den
Alveolarepithelzellen wurde P-gp bei Mensch und Ratte nur in Typ 1 Zellen an der
luminalen Seite gefunden (siehe Abb. 1b) (CAMPBELL et al., 2003). Hingegen wurde
dieses Transporterprotein in anderen Studien in den Pneumozyten gar nicht gefunden
(CORDON-CARDO et al., 1990). Im Endothel der Lungenkapillaren konnte P-gp nicht
regelmäßig nachgewiesen werden (CORDON-CARDO et al., 1990; VAN DER VALK et
al., 1990 LECHAPT-ZALCMAN et al., 1997;). Auch zum Vorkommen von P-gp in
Alveolarmakrophagen und Makrophagen des peripheren Blutes liegen uneinheitliche
Ergebnisse vor (VAN DER VALK et al., 1990; PUDDU et al., 1999; SCHEFFER et al.,
2002). Aufgrund der epithelialen Expression von P-gp in der Lunge wird angenommen,
dass dieses Membranprotein eine Rolle im Transport von Arzneimitteln vom Interstitium
zum Lumen spielt. Die genauere Funktion von P-gp in der Lunge ist allerdings bisher
nicht definiert (VAN DER DEEN et al., 2005). Makrophagen von Mäusen exprimieren
zum Beispiel P-gp und MRP-1, wodurch unter anderem die Akkumulation von Antibiotika
der Makrolid- und Chinolongruppe im Inneren der Makrophagen erschwert wird (SERAL
et al., 2003a; SERAL et al., 2003b; MICHOT et al., 2004, 2005). Auch Rifampicin und
Ethambutol scheinen Substrate von P-gp zu sein. So erklärt sich die nur langsame
Abtötung phagozytierter Tuberkuloseerreger (HARTKOORN et al., 2007). Ein weiteres,
Literaturübersicht
- 24 -
bekanntes Transporterprotein ist das Multidrug Resistance Protein 1, (MRP1 auch
ABCC1 genannt). Es ist für Resistenzen gegenüber vielen Chemotherapeutika
verantwortlich. Physiologischerweise transportierte Stoffe für dieses Protein sind zum
Beispiel Leukotriene und Glutathione (LEIER et al., 1994). MRP-1 wurde beim
Menschen im Bronchialepithel, in Becherzellen, in Alveolarepithelzellen, seromukösen
Drüsen und in Alveolarmakrophagen gefunden (BRECHOT et al., 1998; SCHEFFER et
al., 2002; TORKY et al., 2005). Im Lungenepithel befindet sich das Protein auf der
basolateralen Seite und ist möglicherweise für die Clearance von der luminalen zur
interstitiellen Seite beziehungsweise zum extrazellulären Gewebe verantwortlich
(WIJNHOLDS et al., 1998). MRP-2 wurde in der Lunge, wenn auch nicht einheitlich in
allen Untersuchungen, an den gleichen Lokalisationen wie MRP1 gefunden. Eine
Ausnahme stellten die Alveolarmakrophagen und Drüsen dar, hier konnte MRP-2 bisher
beim Menschen nicht nachgewiesen werden (SCHEFFER et al., 2002; HOLLAND et al.,
2003; TORKY et al., 2005). Weitere in der Lunge vorkommende Transporterproteine
sind der cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR (ABCC7)) und das
breast cancer resistance protein (BCRP). Mutationen am CFTR-Gen führen zur
cystischen Fibrose, was diesem Protein seinen Namen gab (RIORDAN et al., 1989).
BCRP wird weniger häufig als MRP und P-gp in der Lunge nachgewiesen. Es befindet
sich vor allem im Bronchialepithel, im Endothel der Kapillaren (siehe Abb. 1a) und an
seromukösen Drüsen (SCHEFFER et al., 2002).
Die Situation ist in den Atemwegen bei Mensch und Tier sehr viel komplexer als sie sich
bei isolierter Betrachtung von Effluxpumpen der Makrophagen in vitro darstellt. Auch an
Bronchial- und Alveolarepithelzellen werden Auswärtstransporter wie P-gp, MRP und
BCRP exprimiert (VAN DER DEEN et al., 2005). Durch eine Hemmung dieser
Transporter würde sich die Konzentration von Antibiotika in der PELF, also in der
Umgebung der Alveolarmakrophagen vermindern lassen, anstatt sie, wie erforderlich, zu
erhöhen. In den Alveolarmakrophagen würde sich die Konzentration dagegen erhöhen.
Ein weiteres Problem stellt die zur Therapie der R. equi Pneumonie notwendige
Kombination des Makrolides mit Rifampicin dar. Rifampicin ist nachweislich ein starker
Induktor von P-gp und MRP im Darm und in der Leber (SIEGMUND et al., 2002). Dieses
könnte dazu führen, dass nach der oralen Applikation bereits im Darm Makrolide in das
Lumen zurück transportiert und nicht ausreichend resorbiert werden. Sollte Rifampicin
Literaturübersicht
- 25 -
auch induktorisch auf die Effluxtransporter der Makrophagen und in der Lunge wirken,
käme es dort zum Anstieg der Makrolidkonzentration in der PELF und zum Abfall in den
Makrophagen.
Neben den Auswärtstransportern werden in den Makrophagen auch
Aufnahmetransporter vermutet, durch die zum Beispiel Makrolide wie Azithromycin oder
Clarithromycin in Makrophagen angereichert werden und dadurch eine vielfach höhere
Konzentrationen als im Blut erreichen (BOSNAR et al., 2005; LABRO et al., 2004,
2005). Die Nettoakkumulation von Arzneimitteln in Makrophagen könnte sich also aus
dem Zusammenspiel von Influx- und Effluxtransportern ergeben. Eine ähnliche Situation
ist auch an den Bronchial- und Alveolarepithelzellen denkbar (KROEMER et al., 2008).
Beim Fohlen vermindert Rifampicin als Induktor die Konzentration von Tulathromycin auf
der Oberfläche der respiratorischen Schleimhaut deutlich. Parallel dazu kommt es in den
Makrophagen hingegen zu einer Erhöhung der Konzentration des Makrolides
(HÖHENSTEIGER, 2005). Daraus ergibt sich die Überlegung, ob Aufnahmetransporter
in den Makrophagen eine entscheidende Rolle in der erhöhten Konzentrations- von
Tulathromycin geführt haben können. OATP Transporter (organic anion transporting
polypeptide) umfassen eine Gruppe von Aufnahmetransportern, die übiquitär exprimiert
werden. In der Leber sind diese Transporter an der Aufnahme von Stoffen aus dem
Pfortaderblut in die Hepatozyten beteiligt, ebenso in der Niere und im Zentralen
Nervensystem (ZNS). Im ZNS sind die Aufnahmetransporter an der Bildung der Blut-
Hirn-Schranke beteiligt. Es besteht die Möglichkeit, dass auch diese Transporter an
Epithelien der Lunge, an Endothel und/oder an Makrophagen exprimiert werden (HO
und KIM, 2005). Rifampicin ist ein Substrat dieser Transporter (HO und KIM, 2005).
Literaturübersicht
- 26 -
Blutgefäß
Basalzelle
Zilien tragende Zelle
PELF P-gp
MRP 1
MRP 1 MRP 1
CFTR
BCRP
Zellen
MRP 1
P-gp
BAL - Zelle
Lungenkapillare
PELF
Zellen
MRP 1
Interstitium
Interstitium
a – Bronchialepithel
P-gp
b - Alveolarepithel
Literaturübersicht
- 27 -
Abb. 1a-b: Wege der Antibiotika aus der Blutzirkulation in PELF und Zellen der
bronchoalveolären Spülflüssigkeit und Expression von ATP–bindenden
Transporterproteinen bei verschiedenen Zelltypen der menschlichen Lunge (modifiziert
nach VAN DER DEEN et al., 2005). ABC, ATP-binding cassette; BCRP, breast cancer
resistance protein; CFT, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; MRP,
multidrug resistance-associated protein; P-gp, P-glycoprotein
2.7 Arzneimittelinteraktionen von Rifampicin und Cl arithromycin
Bei dem Einsatz von Arzneimittelkombinationen zur Therapie einer bestimmten
Erkrankung kann es zu Interaktionen zwischen den Arzneimitteln kommen. Diese sind
bei synergistisch wirkenden Arzneistoffen erwünscht. Es kann aber auch zu
unerwünschten Wirkungen kommen, wenn die Wirkung eines der verwendeten
Arzneimittel durch den Einsatz des anderen herabgesetzt wird. Interaktionen entstehen
zum Beispiel durch Induktion oder Hemmung von Enzymsystemen, die am
Metabolismus der Medikamente beteiligt sind oder durch mögliche Effekte auf
Transporterproteine. Viele der bisher bekannten Inhibitoren und Induktoren
metabolischer Enzymsysteme beeinflussen zudem das Transporterprotein P-gp
(SIEGMUND und WEITSCHIES, 2002).
Enzymsysteme werden kompetitiv und nicht kompetitiv gehemmt. Die kompetitive
Hemmung von Enzymen entsteht, wenn beide eingesetzten Wirkstoffe auf den gleichen
metabolischen Prozess angewiesen sind und eines der beiden zu diesem eine höhere
Affinität aufweist. Ein häufig betroffenes Enzym ist das mikrosomale, mischfunktionelle
Cytochrom P450-abhängige Monooxygenasesystem (CYP). Von diesem Enzym werden
zahlreiche Wirkstoffe wie Rifampicin, Erythromycin und Clarithromycin in der Leber
abgebaut, wodurch ihre Metaboliten entstehen. Makrolide wie Erythromycin und
Clarithromycin sind starke Inhibitoren des CYP-Systems (PAI et al., 2000; WESTPHAL
et al., 2000). Roxithromycin wirkt als neueres Makrolid weniger inhibitorisch und für
Azithromycin konnte keine entsprechende Wirkung nachgewiesen werden (PAI et al.,
2000; WESTPHAL et al., 2000). Enzyminduktoren beschleunigen in der Regel den
Abbau ihres Kombinationspartners und können somit Ursache für eine mangelnde
Wirksamkeit desselben sein. Ein starker Enzyminduktor des CYP-Systems ist
Literaturübersicht
- 28 -
Rifampicin. Die Konzentrationen von Clarithromycin und Erythromycin werden beim
Menschen bei der zusätzlichen Gabe von Rifampicin durch den gesteigerten Abbau im
CYP-System gesenkt (SIEGMUND et al., 2002). Von praktischer Bedeutung ist, dass
Makrolide einerseits den Abbau von Rifampicin hemmen und somit dessen Wirkung
verstärken, andererseits aber könnten die Makrolide infolge der CYP-Induktion durch
Rifampicin schneller verstoffwechselt werden und weniger wirken. Rifampicin stellt den
wichtigsten CYP-Induktor dar, wobei die Mechanismen der Induktion bisher größtenteils
ungeklärt sind. Für Rifampicin konnte gezeigt werden, dass es zu einer gesteigerten
Synthese des Enzyms kommt, nachdem Rifampicin am Pregnane-X-Rezeptor (PXR,
CYP3A4), der die Transkription im Zellkern erhöht, gebunden hat (FUHR, 2000). Die
Bindung der Kernrezeptorkomplexe an die jeweiligen Promotor-Bindungsstellen ist nicht
spezifisch, was wiederum erklärt, dass nicht nur CYP-Enzyme sondern unter anderem
auch Proteine, die Arzneimittel über Biomembranen transportieren, betroffen sind
(FROMM et al., 2000; GEICK et al., 2001; RAE et al., 2001).
Eine weitere Erklärung für die schwierige Eradikation von R. equi mit Antibiotika wäre,
dass die eingesetzten Antibiotika mit dem Arzneimitteltransporter P-gp interferieren.
Dieses kann von klinischer Relevanz sein, da P-gp an der Verteilung und Elimination
vieler Wirkstoffe beteiligt ist. Als Inhibitor dieser Transporterproteine sind die Makrolide
Erythromycin und Clarithromycin bekannt. Das Risiko der Inhibition und daraus
resultierender Effekte lässt sich durch den Einsatz von Azithromycin verringern
(SIEGMUND et al., 2002, 2003). Rifampicin hingegen induziert duodenales P-gp, was
beim Menschen zum Beispiel dazu führt, dass gleichzeitig verabreichtes Digoxin stark
verminderte Plasmakonzentrationen aufweist (GREINER et al., 1999). Durch die
Kombination von Makroliden oder Rifampicin mit Arzneimitteln, die eine hohe Affinität zu
P-gp aufweisen, besteht grundsätzlich ein hohes Interaktionsrisiko (DESMOND et al.,
1997; HERBERT et al., 1999; BÖGER et al., 2001).
Wenn davon ausgegangen wird, dass Makrolide mit Transporterproteinen, die in der
Lunge exprimiert werden (P-gp, MRP oder OATP), interagieren und somit die Makrolid-
Konzentrationen in der Lunge von diesen Transportern abhängig sind, kann ihre
pulmonale Konzentration von zusätzlich verabreichten Wirkstoffen, wie zum Beispiel
Rifampicin, beeinflusst werden. Führt die zusätzliche Verabreichung von Rifampicin zu
Literaturübersicht
- 29 -
einer Verringerung der Konzentration des Makrolides in den BAL-Zellen oder in der
PELF, ist darüber zu entscheiden, ob die Dosierung entsprechend zu erhöhen ist.
2.8 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
In der vorliegenden Arbeit sollen die Steady-State-Konzentrationen von Clarithromycin
und seinem Metaboliten im Plasma, in der PELF und in Zellen der bronchoalveolären
Lavageflüssigkeit bei gesunden Fohlen bestimmt werden, um daraus Aussagen über die
Absorption, Verteilung und Elimination des Wirkstoffes abzuleiten. Im Rahmen dieser
Studie soll weiterhin untersucht werden, ob die zusätzliche Gabe von Rifampicin die
Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma, in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit
oder in Alveolarmakrophagen verändert. Falls eine Interaktion der beiden Antibiotika
besteht, sollen die erreichten Konzentrationen in den verschiedenen Geweben mit der
MHK von R. equi für die eingesetzten Antibiotika verglichen werden. Liegen die
Konzentrationen unter der MHK sollen aus den Ergebnissen Dosierungen für
Clarithromycin abgeleitet werden, um eine ausreichende MHK beider Antibiotika in den
Alveolarmakrophagen, der alveolären Flüssigkeit und im Plasma zu gewährleisten.
Material und Methoden
- 30 -
3 Material und Methoden
Ziel der vorliegenden Studie war die Bestimmung der Steady State Konzentrationen von
Clarithromycin im Plasma, in der PELF und in den bronchoalveolären Zellen beim
Fohlen. Dabei wurden die Konzentrationen nach der alleinigen Gabe von Clarithromycin
und nach der kombinierten Gabe mit Rifampicin bestimmt.
3.1 Probanden
Es wurden neun Warmblutfohlen, fünf Hengst- und vier Stutfohlen, auf einem deutschen
Gestüt in die Studie aufgenommen. Diese neun Fohlen wurden in vier Gruppen
aufgeteilt. Zu Beginn der Studie waren die Fohlen 41 bis 61 Tage alt, ihr Körpergewicht
betrug zu diesem Zeitpunkt 120 bis 170 kg. Es handelt sich hier um einen genehmigten
Tierversuch (Aktz.: LALLF M-V/TSD/7221.3-1.1-066/08).
3.1.1 Allgemeine Haltungsbedingungen der Fohlen
Alle Pferde des privaten Gestütes, auf dem die Studie stattfand, wurden regelmäßig
gegen das equine Herpesvirus 1 und 4 (EHV 1 und 4), Influenza und Tetanus geimpft.
Darüber hinaus wurden die Stuten und Fohlen regelmäßig mit wechselnden Wirkstoffen
entwurmt.
Die Unterbringung der Fohlen und Stuten erfolgte in den ersten (mindestens sieben)
Lebenstagen in einer Einzelbox. Nachfolgend wurden jeweils 10 Stuten mit ihren Fohlen
in Laufställen untergebracht. Diese Laufställe waren mit Stroh eingestreut und die
Gruppe hatte jederzeit die Möglichkeit, sich in einem angrenzenden, betonierten Auslauf
frei zu bewegen. Die Laufställe wurden vor jeder Neubelegung gereinigt und desinfiziert.
Die Fütterung erfolgte zweimal täglich mit einer Gras- und Maissilage, ergänzt mit Hafer,
Pellets und Mineralfutter. Heu, Salzlecksteine und Wasser standen den Pferden
jederzeit zur Verfügung.
Material und Methoden
- 31 -
3.1.2 Bedingungen für die Aufnahme der Fohlen in di e Studie
Voraussetzung zur Aufnahme der Fohlen in die Studie war, dass die Fohlen zum
Zeitpunkt des Studienbeginns klinisch Allgemein- und sonographisch Lungengesund
waren. In einer ultrasonographischen Untersuchung musste nachgewiesen werden,
dass die Fohlen keine Lungenabszesse oder andere Lungenbefunde aufwiesen.
Darüber hinaus durften die Fohlen über einen Zeitraum von 14 Tagen nicht
vorbehandelt sein.
Die Leukozytenzahl im Blut durfte nicht mehr als 13.000 Zellen/µl betragen.
3.2 Methoden
3.2.1 Untersuchung der Fohlen
Die Fohlen wurden während und nach der Studie, von Geburt an bis zum 150.
Lebenstag, einmal in der Woche untersucht. Es wurde jeweils eine allgemeine
Untersuchung und eine spezielle Untersuchung des Respirationstraktes durchgeführt.
Entsprechende Untersuchungen fanden ebenfalls vor und nach jeder BAL statt.
3.2.1.1 Allgemeinuntersuchung
Die Allgemeinuntersuchung der Fohlen fand von Geburt an einmal wöchentlich statt. Sie
umfasste die Beurteilung von Haltung, Verhalten und Ernährungszustand, Beurteilung
der Kotkonsistenz sowie die Messung der rektalen Körpertemperatur. Die Gelenke
wurden adspektorisch auf Umfangsvermehrungen und Auffälligkeiten untersucht. Die
Untersuchung des Nabels auf entsprechende Veränderungen erfolgte durch Palpation.
Darüber hinaus wurde adspektorisch auf Verletzungen und andere Auffälligkeiten des
Fohlens geachtet.
3.2.1.2 Spezielle Untersuchung des Respirationstrak tes
Zusammen mit der allgemeinen Untersuchung der Fohlen fand eine spezielle
Untersuchung des Respirationstraktes statt. Bei der speziellen Untersuchung wurde das
Vorliegen sowie die Qualität von Nasenausfluss beurteilt (serös, mukös, purulent) sowie
Material und Methoden
- 32 -
Größe, Konsistenz und Schmerzhaftigkeit der Mandibularlymphknoten. Trachea und
Lunge wurden mit einem Stethoskop auskultiert und die Atemgeräusche beurteilt. Dabei
wurden Geräusche wie Rasseln oder Giemen dokumentiert (siehe Abb. 21 im Anhang).
Die Auskultation der Lunge fand auf beiden Thoraxseiten an jeweils drei verschiedenen
Punkten statt: im cranioventralen Bereich, in der Mitte und caudodorsal. Sowohl Trachea
als auch die Lunge wurden über mindestens zwei Atemzyklen auskultiert.
3.2.1.3 Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut
Im Rahmen der unter 3.2.1.2 genannten Untersuchung wurde den Fohlen mit Hilfe einer
Kanüle (BD MicrolanceTM, 1,2mm x 40mm, Becton Dickinson, Drogheda, Irland) zwei
Milliliter Blut aus der Vena jugularis externa entnommen und in einem mit der
Stutennummer beschrifteten Kalium-EDTA-Probenröhrchen (EDTA K, 4 ml Sarstedt AG,
Nümbrecht) aufgefangen, um die Leukozytenzahl im Blut zu bestimmen.
Die Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut erfolgte mit einem automatischen
Hämatologie-Analysator (Sysmex KX-21N, Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg,
Deutschland), der die Anzahl der Leukozyten pro Mikroliter Blut durch eine
Widerstandsmessung bestimmt.
3.2.1.4 Sonographische Untersuchung der Lunge
Wenn bei der allgemeinen oder bei der speziellen Untersuchung des Respirationstraktes
krankhafte Befunde festgestellt wurden, wurde eine ultrasonographische Untersuchung
der Lunge durchgeführt und auf einem speziellen Untersuchungsbogen dokumentiert
(siehe Abb. 20 im Anhang). Vor Beginn der Studie und folgend im Abstand von einer
Woche bis zum 150. Tag wurde jedes Fohlen ultrasonographisch untersucht. Außerdem
fand eine solche Untersuchung vor und nach jeder BAL statt.
Für die ultrasonographische Untersuchung der Lunge wurde ein transportables
Ultraschallgerät (Tringa Linear, Esaote Piemedical, Maastricht, Niederlande) eingesetzt.
Es wurde dazu ein Linearschallkopf mit einer Frequenz von 7,5 MHz, einer Länge von
7,5 cm und einer Breite von 2 cm verwendet. Mit diesem Schallkopf konnten auch die
schmalen Interkostalräume der jungen Fohlen untersucht werden. Vor der Untersuchung
Material und Methoden
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wurde das Fell zur Entfettung im Bereich des Lungenfeldes mit 99,5prozentigem
Isopropylalkohol (Isopropylalkohol, 2-Propanol, 99,5%, Rebo-Pharm, Bochholt,
Deutschland) eingesprüht, um eine gute Ankopplung zu gewährleisten. Für einen
besseren Kontakt wurde zusätzlich ein Transmissionsgel (Schoblocher Medizinaltechnik
GmbH, Landsberg am Lech, Deutschland) aufgetragen. Im zwölften Interkostalraum
beginnend wurde die Lunge von dorsal nach ventral und von caudal nach cranial auf
beiden Seiten des Thorax untersucht. Das Untersuchungsfeld wurde hierbei dorsal
durch den Musculus longissimus dorsi, cranial durch das Schulterblatt mit seiner
Muskulatur (Musculus triceps brachii, Musculus tensor fasciae antebrachii) und nach
ventral durch das Sternum beziehungsweise durch das Zwerchfell begrenzt.
Zu Beginn der Studie wiesen die Fohlen in dieser Untersuchung keine pathologischen
Lungenbefunde auf.
3.2.2 Wiegen der Fohlen
Jedes Fohlen wurde innerhalb der 23 Studientage zweimal auf einer Pferdewaage („Die
mobile Pferdewaage“, Deutschland) gewogen, um die genauen Dosierungen für die
beiden Antibiotika sowie der Medikamente zur Allgemeinanästhesie berechnen zu
können.
Die Waage wurde in einem Untersuchungszwangsstand für Pferde aufgestellt. Die
Mutterstute wurde zusammen mit Ihrem Fohlen herangeführt und neben die Waage
gestellt. Das Fohlen wurde durch Hilfspersonen auf die Waage geführt, fixiert und alleine
gewogen.
3.2.3 Applikation von Clarithromycin und der Kombin ation von Clarithromycin mit
Rifampicin
Das Clarithromycin (Klacid Saft Forte®, 250 mg/5ml, Abbott GmbH&Co. KG) in einer
Dosierung von 7,5 mg/kg per os (p.o.) wurde entsprechend der Anweisung der Firma
zubereitet und in einer 60 ml Spritze (Soft Ject® Katheter, 60ml, Henke Sass Wolf,
Tuttlingen/Deutschland) aufgezogen. Die Rifampicin Tabletten (Rifa®600 Dragees,
Grünenthal) wurden mit einem Mörser zerkleinert und durch die Zugabe von 30 ml
Material und Methoden
- 34 -
Wasser wurde eine Suspension mit einer Konzentration von 60 mg/ml Rifampicin
hergestellt. Das Rifampicin wurde den Fohlen in einer Dosierung von 10 mg/kg p.o.
zusammen mit Clarithromycin in einer Dosierung von 7,5 mg/kg p.o. verabreicht. Das
Rifampicin wurde für den Abschnitt der kombinierten Behandlung mit in die
Clarithromycin-Spritze aufgezogen, da die Akzeptanz der Fohlen so verbessert werden
konnte. Das Clarithromycin und die Kombination Clarithromycin/Rifampicin wurde den
von einer Hilfsperson an Kopf und Schweif fixierten Fohlen mit der 60 ml Spritze in das
leere Maul eingegeben. Der Kopf des Fohlens wurde dabei von einer Hilfsperson leicht
nach oben gehalten und es wurde gewartet bis das Fohlen die eingegebenen Antibiotika
vollständig abgeschluckt hatte, ehe es losgelassen wurde.
3.3 Spezielle Untersuchung vor der bronchoalveoläre n Lavage (BAL )
Vor jeder BAL wurden die Fohlen wie unter 3.2.1.1 bis 3.2.1.4 beschrieben untersucht.
Um das Narkoserisiko für die Fohlen abschätzen zu können und möglichst gering zu
halten wurde zusätzlich eine klinische Untersuchung von Herz und Kreislauf
durchgeführt.
3.4 Klinische Durchführung der Studie
Insgesamt wurden vier Studienzyklen durchgeführt. Die Studiendauer betrug für jedes
Fohlen 23 Tage. In dieser Zeit wurde jedes Fohlen in einem ersten, siebentägigem
Abschnitt zweimal täglich mit Clarithromycin (Klacid Saft Forte®, 250 mg/5ml, Abbott
GmbH&Co. KG) in einer Dosierung von 7,5 mg/kg per os (p.o.) behandelt worauf
Blutentnahmen und eine BAL folgten. Im Anschluss daran wurden alle Fohlen, von Tag
neun bis Tag 21 zweimal täglich mit der Kombination aus Clarithromycin und Rifampicin
(Rifa®600 Dragees, Grünenthal) behandelt. An Tag 21 erfolgten erneut Blutentnahmen
und eine BAL, an Tag 22 und 23 erfolgten weitere Blutentnahmen.
Material und Methoden
- 35 -
3.4.1 Übersicht über den Ablauf der Studie
Untersuchung und Wiegen der Fohlen
Tag 0
Vor Beginn der Untersuchung wurden die Krankengeschichte und die medikamentöse
Vorgeschichte des Tieres überprüft. Die Fohlen wurden vor Beginn der Studie einer
klinischen Allgemein- und einer Lungenuntersuchung (s.o.) sowie einer
sonographischen Untersuchung des Thorax unterzogen. Außerdem wurde die
Leukozytenzahl im Blut bestimmt.
Die Fohlen wurden gewogen, um das Körpergewicht zur Berechnung der
entsprechenden Dosierungen der Präparate zu ermitteln (s. 3.2.2).
Erster Abschnitt der Studie, 1. Kinetik: Applikation von Clarithromycin
Tag 1 bis 6
Jeweils drei Fohlen wurden zweimal täglich im Abstand von zwölf Stunden (7:00 Uhr
und 19:00 Uhr) mit 7,5 mg/kg Clarithromycin p.o. behandelt.
Am sechsten Tag wurden die Fohlen abends zu unterschiedlichen Zeitpunkten
behandelt. Ein Fohlen um 19:00 Uhr, das zweite um 20:00 Uhr und das dritte um 21:00
Uhr. Am Abend des sechsten Tages wurden die Stuten mit ihren Fohlen für die
Blutentnahmen und die BAL am siebten Tag aus den Laufställen in Einzelboxen
gebracht.
Blutentnahmen und bronchoalveoläre Lavage (BAL)
Tag 7:
Am Morgen des siebten Tages wurde den Fohlen mit einer Braunüle ein venöser
Zugang zur Vena jugularis externa gelegt (s. 3.4.2). Über den Tag hinweg fanden zu
bestimmten Zeitpunkten Blutentnahmen statt. Nach der ersten Blutentnahme wurde dem
Fohlen das Clarithromycin entsprechend dem Abend des sechsten Tages um 07:00 Uhr,
08:00 und 09:00 Uhr, wie oben beschrieben p.o. verabreicht.
Am Abend des siebten Tages wurde zwölf Stunden nach der Applikation des
Clarithromycins, eine BAL inklusive der Entnahme einer Bronchialschleimhautbiopsie
durchgeführt.
Material und Methoden
- 36 -
Blutentnahmen und Wiegen
Tag 8:
Am achten Tag fanden zwei Blutentnahmen im Abstand von zwölf Stunden statt,
außerdem wurden die Fohlen erneut gewogen.
Zweiter Abschnitt der Studie, 2. Kinetik: Applikation von Rifampicin und Clarithromycin
Tag 9 bis 19:
Nach einer Blutentnahme begann der zweite Abschnitt der Studie. Den Fohlen wurde
zweimal täglich Clarithromycin in einer Dosierung von 7,5 mg/kg zusammen mit
Rifampicin in einer Dosierung von 10 mg/kg im Abstand von jeweils 12 Stunden
verabreicht (07:00 Uhr und 19:00 Uhr).
Tag 20:
Am 20. Tag wurden die Fohlen nur mit Clarithromycin behandelt, um eine direkte
Interaktion der beiden Antibiotika an den beteiligten Transportmechanismen
auszuschließen. Dabei wurde die Behandlung der Fohlen am Abend wieder zu
versetzten Zeiten durchgeführt (Vergleiche Tag 6) und die Fohlen zusammen mit ihrer
Mutter wieder in eine Box gebracht.
Blutentnahmen und bronchoalveoläre Lavage
Tag 21:
Am 21.Tag fanden, wie für Tag sieben beschrieben, Blutentnahmen und eine BAL mit
Entnahme einer Bronchialschleimhautbiopsie auf der kontralateralen Lungenseite statt.
Blutentnahmen an Tag 22:
An Tag 22 fanden, analog zu Tag acht, zwei Blutentnahmen im Abstand von zwölf
Stunden statt.
Blutentnahme an Tag 23 und Abschlussuntersuchung der Fohlen
Tag 23:
Am Morgen des 23.Tages wurde die letzte Blutentnahme durchgeführt. In der Folge
wurden die Tiere zurück in den Laufstall gebracht.
Material und Methoden
- 37 -
Die Fohlen wurden einer Abschlussuntersuchung unterzogen, die eine klinische
Allgemeinuntersuchung, eine spezielle Untersuchung des Respirationstraktes und eine
ultrasonographische Untersuchung der Lunge umfasste.
Studienende am 24. Tag.
Die Studienübersicht ist zusammengefasst in Tabelle 1 wiedergegeben.
Material und Methoden
- 38 -
Tab. 01: Studienübersicht
Kinetik Tag 07:00 Uhr 07:00 - 19:00 Uhr 19:00 Uhr
1 - 6 Applikation von C - Applikation von C
7 BPBC
BPC-Konz. Applikation von C
10 BPC-Konz. BPC-Konz. und BAL 1
8 BPC-Konz. - BPC-Konz.
9 BPC-Konz. Applikation von R/C
- Applikation von R/C
10 - 19 Applikation von R/C - Applikation von R/C
20 Applikation von C - Applikation von C
21 BPBC
BPR/C-Konz. Applikation von C
10 BPR/C-Konz. BPR/C-Konz. und BAL
22 BPR/C-Konz. - BPR/C-Konz.
2
23 BPR/C-Konz. - -
C: Clarithromycin; R: Rifampicin, BPBC: Blutprobe für die Blutchemie; BPC-Konz: Blutprobe
für die Bestimmung der Konzentration von Clarithromycin; BPR/C-Konz: für die
Bestimmung der Konzentration von Rifampicin und Clarithromycin; BAL:
bronchoalveoläre Lavage
3.4.2 Blutprobenentnahme zur Bestimmung der Blutche mie und für die
Bestimmung der Konzentrationen von Rifampicin und/o der Clarithromycin im
Plasma
An den Tagen der BAL sowie an den jeweils darauf folgenden zwei Tagen, also an Tag
sieben, acht und neun, sowie an Tag 21, 22 und 23 wurde den Fohlen zur Gewinnung
Material und Methoden
- 39 -
von Plasma Blut abgenommen. Aus der ersten Blutprobe erfolgte später zusätzlich die
Bestimmung von blutchemischen Parametern.
Innerhalb der ersten zwölf Stunden erfolgten die Blutentnahmen über eine Braunüle
(Braunüle MT® Luer Lock, Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland). Dafür wurde
im Bereich des oberen Halsdrittels das Fell über der Vena jugularis externa rasiert, die
Haut gesäubert, die Braunüle in die Vene verbracht und mit Hilfe eines Fadens an der
Haut fixiert. Auf die Braunüle wurde ein Durchstechstopfen (Injection Cap, Fresenius
Kabi AG, Bad Homburg/Deutschland) geschraubt. Danach wurde zur Sicherheit des
Fohlens und zum Schutz der Braunüle eine Coflexbinde (CoFlex®, Andover Healthcare,
Salisburg, USA) um den Hals gewickelt.
Um 07:00 Uhr erfolgte, vor Applikation der Antibiotika, die erste Blutentnahme. Es
wurden mit Hilfe einer 20 ml Spritze (Injekt® Luer Solo 20ml, B.Braun Melsungen AG,
Melsungen/Deutschland) und einer Kanüle (BD MicrolanceTM, 1,2mm x 40mm, Becton
Dickinson, Drogheda, Irland) erst 10 ml Blut aus der Braunüle entnommen und
verworfen und anschließend 20 ml Blut entnommen. Diese Blutprobe wurde dann in
fünf, mit CRF-Nummer, Datum und Entnahmezeitpunkt beschriftete Lithium-Heparin
Röhrchen (Li-Heparin, 4 ml Sarstedt AG, Nümbrecht) aufgeteilt. Eines der Röhrchen
diente zur Bestimmung der Blutchemie im Plasma, die übrigen zur Bestimmung der
Clarithromycin- beziehungsweise Rifampicinkonzentration. Über den Tag verteilt
erfolgten weitere Blutentnahmen (siehe Tabelle 2) bei denen jeweils 16 ml Blut über die
Braunüle entnommen wurden, die dann in vier, wie oben beschriftete Lithium-Heparin
Röhrchen, aufgeteilt wurden. Die Lithium-Heparin Röhrchen wurden sofort nach dem
Gewinn des Blutes bei 2100 U/min für 10 Minuten zentrifugiert (Hettich Zentrifuge
Universal 32). Das Plasma wurde anschließend abpippetiert und in fünf ebenfalls mit
CRF-Nummer, Datum und Entnahmezeitpunkt beschriftete Cryoröhrchen (Cryo`s, PP,
2ml, Greiner BIO-ONE GmbH, Frickenhausen, Deutschland) aufgeteilt.
Nach jeder Blutentnahme wurde die Braunüle mit jeweils fünf Milliliter einer
heparinhaltigen Natriumchloridlösung gespült (20.000 IE Natrium-Heparin (Heparin-
Natrium Braun, 25.000IE/5ml, B. Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland) in 500
ml Natriumchloridlösung (Isotonische Natriumchlorid Lösung ad. us. vet. - Für Tiere -, B.
Braun Melsungen AG, Melsungen/Deutschland).
Material und Methoden
- 40 -
Die Plasmaproben wurden bei -20°C eingefroren. Sie wurden auf Trockeneis zum Labor
der Ernst-Moritz-Arndt-Universität in Greifswald und für die Bestimmung der
blutchemischen Parameter zum Labor der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover transportiert.
Im Labor der Klinik für Pferde wurden diese Proben mit Hilfe der Trockenchemie auf
folgende Parameter untersucht: Harnstoff (Urea), (Vitros® DT60 II Modul für UREA),
Alkalische Phosphatase (AP), Aspartat-Amino-Transferase (AST), Calcium (Ca),
Creatinin (Crea), Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) und Laktatdehydrogenase (LDH)
(Vitros® DTSC II Modul für AP, AST, Ca, CREA, LDH, GGT). Die Elektrolyte Natrium
(Na), Kalium (K) und Chlorid (Cl) wurden bestimmt (Lactat Vitros® DTE II Modul für
Elektrolyte; Ortho-Clinical Diagnostics, Johnson & Johnson Company, Rochester, N.Y.
USA). Mit Hilfe der Nasschemie wurde der Gehalt der Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)
(Eppendorf Photometer PCP 6121 für GLDH, Netheler & Heinz GmbH, Hamburg) im
Plasma bestimmt.
12 Stunden später und nach der BAL wurde die Braunüle aus der Vene entfernt und die
weiteren Blutentnahmen erfolgten über die direkte Punktion der Vene.
Material und Methoden
- 41 -
Tab. 02: Zeitpunkte der Blutentnahmen an Tag 7, 8 und 9 sowie an Tag 21, 22 und 23
zur Bestimmung der Konzentrationen von Clarithromycin (C) und Rifampicin (R) im
Plasma
Entnahme- zeitpunkt
Zeit (h nach Applikation)
Entnahme- zeitpunkt
Zeit (h nach Applikation)
1 0 9 4
Applikation von C 10 6
2 0,33 11 8
3 0,66 12 12 + BAL
4 1 13 16
5 1,5 14 24
6 2 15 36
7 2,5 16 48
8 3 Ende -
C: Clarithromycin; BAL: bronchoalveoläre Lavage
3.4.3 Durchführung der bronchoalveolären Lavage (BA L)
Zur Bestimmung der Konzentration des Clarithromycins und des Rifampicins in der
bronchoalveolären Spülflüssigkeit und in den enthaltenen Zellen wurden BALs
durchgeführt. Jedes Fohlen wurde zweimal einer BAL unterzogen. Die BAL wurde an
Tag 7 und an Tag 21, zwölf Stunden nach der Applikation von Clarithromycin
beziehungsweise Rifampicin und Clarithromycin durchgeführt. Um die 12 Stunden
Abstand zwischen der Applikation und der BAL zu gewährleisten, wurden die Fohlen am
Abend zuvor sowie am Morgen zeitlich versetzt behandelt. Entsprechend fanden die
Blutentnahmen versetzt statt. Das erste Fohlen wurde um 19:00/07:00 Uhr behandelt
und um 19:00 Uhr fand die BAL statt. Das zweite Fohlen startete um 20:00/08:00 Uhr
und die BAL fand um 20:00 Uhr statt. Das dritte Fohlen wurde um 21:00/09:00 Uhr
behandelt und zwölf Stunden später in Narkose gelegt.
Material und Methoden
- 42 -
Zur Durchführung der BAL wurden die Probanden in Allgemeinanästhesie gelegt. Dazu
wurden die Fohlen mit Xylazin (0,8 mg/kg i.v.) (Xylazin 2%®, Riemser Arzneimittel AG,
Greifswald-Insel Riems/Deutschland) sediert und circa fünf Minuten später mit Ketamin
(Ursotamin® 100mg/ml, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg/Deutschland) (2,2 mg/kg
i.v.) und Diazepam (Diazepam® 10mg Rotexmedica, 5 Ampullen zu 2ml, Rotexmedica
GmbH, Trittau/Deutschland) (0,2 mg/kg i.v.) in Narkose gelegt. Die Fohlen wurden auf
einer Schaumstoffmatte abgelegt und nach Erreichen des Toleranzstadiums in
Brustlage verbracht. Hierfür wurde der Thorax des Fohlens durch Sandsäcke stabilisiert
und der Kopf durch eine Person fixiert. Das Fohlen wurde so in Brustlage verbracht,
dass die jeweils zu spülende Lungenseite oben war. Bei jedem Fohlen wurde die BAL
einmal in der linken und einmal in der rechten Lunge durchgeführt. Vor der BAL wurde
eine der beiden Nüstern mit einem Tupfer gereinigt. Das flexible Endoskop
(endoskopische Videoeinheit Tel Pack, Videoendoskop 138XX, Typ SG22-140, Karl
Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Außendurchmesser: 0,9 cm, Länge: 140 cm) wurde
nachdem es an eine Lichtquelle (Xenon 1000, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen)
angeschlossen wurde, durch den ventralen Nasengang eingeführt und bis zur Carina
tracheae vorgeschoben. Zur Identifizierung von Transporterproteinen in der
Bronchialschleimhaut mittels PCR wurden Schleimhautbiopsien entnommen. Hierfür
wurde über den Arbeitskanal des Endoskops eine Biopsiezange eingeführt und auf
Höhe der Carina tracheae, am Übergang zu den Bronchien, an zwei Stellen eine Biopsie
der Schleimhaut entnommen. Das Ganze fand vor Durchführung der BAL und auf der
gleichen Lungenseite, auf der auch gespült wurde statt. Das gewonnene Biopsiematerial
wurde sofort in ein Probengefäß mit RNAlater (RNAlater®, Quiagen, Germany) gegeben
und über Nacht bei Kühlschranktemperaturen inkubiert. Die Proben wurden am Morgen
des darauf folgenden Tages gekühlt nach Greifswald transportiert, aus dem RNAlater
genommen und bei -80°C bis zur Analyse eingefroren.
Im Anschluss an die Biopsieentnahme wurde das Endoskop weiter vorgeführt bis es in
einem Bronchus eingekeilt war und dieser so durch das Endoskop abgedichtet war. Nun
wurden insgesamt 400ml, im Wasserbad auf circa 37°C erwärmte Phosphat buffered
saline (PBS) (Dulbecco’s PBS (1x) Withaout Ca & Mg, PAA Laboratories GmbH,
Pasching, Austria) Lösung durch den Arbeitskanal des Endoskops in die Lunge
gegeben. Dabei wurden jeweils 100 ml in einer 100 ml (100ml BD PlastipakTM, BD
Material und Methoden
- 43 -
Drogheda, Ireland) Spritze appliziert, dann 20 ml Luft nachgegeben und daraufhin
wurde die eingegebene Flüssigkeit sofort zurückgewonnen. Dieser Vorgang wurde
viermal wiederholt.
Die zurückgewonnene Spülflüssigkeit der ersten 100 ml wurde nach Bestimmung des
Volumens aufgrund des zu erwartenden hohen Anteils bronchialer Zellen, der nicht
repräsentativ wäre, verworfen. Die restlichen drei zurückgewonnenen Fraktionen der
Spülflüssigkeit wurden vereint. Nachdem das Gesamtvolumen der zurückgewonnen
Flüssigkeit bestimmt worden ist, wurde die Spülflüssigkeit durch zwei Lagen Mull
(Gazin® 10x10cm, Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG) filtriert und in 50
ml Falcon Röhrchen (BD FalconTM, BD Drogheda, Ireland) aufgefangen. Daraufhin
wurde die Nativlösung der BAL bei 400 x g und 4°C z entrifugiert. Der Überstand wurde
dekantiert und in 1,5 – 2ml Portionen aufgeteilt (jeweils acht Röhrchen (Cryo`s, PP, 2ml,
Greiner BIO-ONE GmbH, Frickenhausen, Deutschland)) und bis zur weiteren Analyse
bei -80°C eingefroren. Das erhaltene Zellpellet wur de mit circa 20 ml PBS-Lösung
(Dulbecco’s PBS (1x) without Ca & Mg, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria)
gewaschen. Für die Zählung der Zellen wurden 10 µl entnommen und eine Zellzählung
mittels einer Neubauer Zählkammer (Karl Hecht, Sondheim, Germany) unter dem
Mikroskop (Laboval 4, Zeiss Jena) bei einer 40er Vergrößerung durchgeführt. Nach der
Bestimmung der Zellzahl in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit wurde eine
entsprechende Menge an Flüssigkeit, die 5 x 106 Zellen enthält, abgenommen, in
Cryoröhrchen gefüllt und zentrifugiert. Nachdem der Überstand (PBS) abpipettiert
worden ist, wurde RNAlater hinzugegeben und die Proben wurden über Nacht im
Kühlschrank inkubiert, der Transport zum Labor erfolgte am darauffolgenden Tag auf
Trockeneis. Der Rest der mit 20 ml PBS resuspendierten Lösung wurde erneut bei 400 x
g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgeno mmen und das Zellpellet mit circa
7ml PBS-Lösung versetzt. Aus den 7 ml wurden fünf Zellausstriche angefertigt. Zwei
sind zur Differenzierung der Zellen luftgetrocknet worden und wurden im Labor der Klinik
für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover nach May-Grünwald gefärbt,
um die prozentualen Anteile der alveolären Makrophagen, Lymphozyten, Mastzellen und
neutrophilen Granulozyten zu bestimmen. Die übrige Lösung wurde in vier Cryoröhrchen
aufgeteilt, bei -80°C eingefroren und auf Trockenei s zum Labor transportiert, sie diente
der Analyse der Antibiotikakonzentrationen in den Zellen der BAL.
Material und Methoden
- 44 -
3.4.4 Abschlussuntersuchung der Fohlen
Die Fohlen wurden sowohl am Tag nach der ersten als auch nach der zweiten BAL einer
klinischen Allgemeinuntersuchung, einer speziellen Untersuchung des
Respirationstraktes und einer ultrasonographischen Untersuchung der Lunge
unterzogen, um eine eventuelle Beeinträchtigung durch die BAL zu überprüfen. Nach
Studienende, ab Tag 23, wurden die Fohlen bis zum Absetzalter von 150 Tagen
wöchentlich wie oben beschrieben untersucht.
3.5 Analytische Untersuchungen der biologischen Pro ben
Die Bestimmung der Konzentrationen von Clarithromycin und Rifampicin und deren
Metabolite in den gewonnenen Proben erfolgte mittels Flüssigkeitschromatographie mit
nachgeschalteter Tandemmassenspektroskopie (LC-MS/MS) in der Abteilung für
Klinische Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt Universität in Greifswald.
3.5.1 Konzentrationsbestimmung von Rifampicin und C larithromycin und derer
Metaboliten
Alle Proben wurden bis zum Zeitpunkt der Analyse unverdünnt bei –80°C gelagert. Die
analytischen Untersuchungen wurden erst nach Entwicklung und Validierung einer
geeigneten Messmethode durchgeführt. Alle Messungen wurden in einem GLP-
zertifizierten analytischen Labor unter Berücksichtigung der entsprechend geltenden
Richtlinien durchgeführt. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte mit einer LC-
MS/MS-Methode.
3.5.1.1 Herstellung von Stamm- und Arbeitslösungen
Zur Erstellung von Kalibriergeraden und Qualitätskontrollproben wurden Stamm- und
Arbeitslösungen mit verschiedenen, bekannten Konzentrationen der zu ermittelnden
Analyten hergestellt. Für die Herstellung der Stammlösungen von Clarithromycin
(Clarithromycin >95% HPLC, Sigma, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland),
Rifampicin (Sigma-Aldrich-Chemie) und 25-O-Desacetylrifampicin (Synfine research,
Material und Methoden
- 45 -
Richmond Hill, Canada) wurden jeweils 20 mg Arzneistoff in 100 ml bidestilliertem
Wasser gelöst (Konzentration von 20 µg/ml).
Aus diesen Stammlösungen wurden durch jeweilige 1+9 Verdünnung (V/V) mit einer
Acetonitril-Zitronensäure (1%)-Lösung (50%/50%, V/V) (Acetonitril LC-MS-Chromasolv,
Fulka Analytical, Sigma-Aldrich; Zitronensäure: Citronensäure-Monohydrat >99,5% Ph.
Eur., Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland; Ascorbinsäure: L-Ascorbic acid 99+%, A.C.S.
reagent, Sigma-Aldrich) insgesamt drei Arbeitslösungen hergestellt. Die so erhaltenen
Arbeitslösungen besaßen folgende Konzentrationen der genannten Antibiotika: 200
ng/ml, 20 ng/ml und 20 µg/ml.
Das Makrolidantibiotikum Roxithromycin wurde als interner Standard verwendet. Durch
Zugabe eines internen Standards zu jeder zu analysierenden Probe wurde eine
Korrekturgröße für eventuell auftretende Abweichungen der Probenaufarbeitung oder –
messung eingeführt.
Zur Herstellung der entsprechenden Stammlösung des internen Standards wurden 2 mg
Roxithromycin (Roxithromycin >90% HPLC, Sigma-Aldrich) in 100 ml bidestilliertem
Wasser gelöst und diese Stammlösung durch Zugabe der bereits erwähnten Acetonitril-
Zitronensäure-Lösung auf eine Konzentration von 100 ng/ml zur genutzten
Arbeitslösung verdünnt.
Alle Stammlösungen wurden bei -20°C gelagert und er wiesen sich bei dieser
Temperatur für mindestens vier Wochen als stabil. Die Arbeitslösungen wurden bei 4°C
für maximal eine Woche gelagert und wöchentlich frisch aus den Stammlösungen
hergestellt.
3.5.1.2 Ansatz und Aufarbeitung der Kalibratoren un d Qualitätskontrollen
Kalibratoren werden hergestellt, indem einer der biologischen Matrix entsprechenden
oder zumindest nachempfundenen Lösung, hier Plasma, BAL-Puffer und BAL-Zell-
Imitat, ansteigende Konzentrationen der bekannten Arzneistoffe zugesetzt werden. Die
Kalibrationsgerade dient hierbei als Bezugsfunktion zwischen Messkonzentration und
dem analytischem Signal zur Bestimmung der Arzneistoffkonzentration in den
biologischen Originalproben. Kalibratoren und Originalproben werden einem identischen
Prozedere der Probenaufbereitung und LC-MS/MS-Vermessung unterzogen.
Material und Methoden
- 46 -
An jedem Messtag wurde obligat eine Kalibrationsreihe angefertigt und vermessen, um
jederzeit gleiche Bedingungen zu gewährleisten.
Qualitätskontrollproben (QK) stellen mit Arzneistoff im unteren, mittleren und oberen des
zu erwartenden Konzentrationsbereich gespickte Proben dar, die als Improzesskontrolle
für die Richtigkeit der erhobenen Messergebnisse während einer analytischen
Messreihe dienen. Entsprechen weniger als vier von sechs aller QK-Proben den zu
erwartenden Konzentrationen, so gilt der analytische Lauf als ungültig. Als
Akzeptanzkriterium für die Richtigkeit einer Messung gelten hierbei maximal zulässige
Abweichungen von ± 15% vom Ist-Wert der jeweiligen QK-Konzentration. Am
Detektionslimit (2,5 ng/ml) beträgt die maximal zulässige Abweichung dagegen 20%.
Diese Qualitätskontrollproben stellten jeweils mindestens 10% aller Messwerte dar und
wurden vor, während und nach dem jeweiligen analytischen Messlaufs vermessen.
Die Herstellung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen erfolgt aus den unter 3.1.3.2
genannten Stamm- und Arbeitslösungen. Hierzu wurde humanes Plasma, BAL-Puffer
(PBS-Lösung) und BAL-Zellimitat (Monozyten der Zelllinie THP-1, Monozyten von einem
Patienten mit acute monocytic leukaemia (5,4*107 Zellen)) als jeweilige biologische
Leermatrix für die zu untersuchenden Fohlenplasma-, BAL-Überstands- und BAL-
Zellproben verwendet. Aufgrund mangelnder Linearität über den zu vermessenden
Konzentrationsbereich, wurden zwei Kalibrationsbereiche definiert. Die jeweiligen
Kalibrationsgeraden bestanden aus folgenden Proben: Doppelblindprobe (nur
biologische Leermatrix), Blindprobe (Matrix mit internem Standard) und aus sechs bzw.
sieben Matrixproben mit internem Standard und den eingestellten Konzentrationen von
Clarithromycin, Rifampicin und 25-Desacetylrifampicin 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 ng/ml
für den unteren und 25, 50, 75, 100, 175, 250 ng/ml für den oberen
Konzentrationsbereich. Für die Erstellung der Kalibratoren wurden 200 µl Plasma mit
300 µl Wasser verdünnt und mit 25 µl der Arbeitslösung des internen Standards und mit
50 µl Zitronensäure-Lösung (1%), die als Stabilisator für das oxidationsempfindliche
Rifampicin fungiert, versetzt und intensiv gemischt. Die Qualitätskontrollproben wurden
in gleicher Weise hergestellt und beinhalteten die Konzentrationen 5, 10, 25 ng/ml und
50, 100, 250 ng/ml.
Material und Methoden
- 47 -
3.5.1.3 Aufbereitung der gewonnenen Plasmaproben un d des BAL-Überstandes
Die unverdünnten, eingefrorenen Proben wurden bis zum Zeitpunkt der Analyse bei -
80°C gelagert. Am Tag der Analyse wurden die Proben bei Raumtemperatur aufgetaut.
Aufgrund der stark variierenden Konzentrationen des Analyten in den jeweiligen Proben
wurden die Proben vierfach, unter Anwendung unterschiedlicher Verdünnung der
Proben aufgearbeitet und vermessen.
Die Messproben für Clarithromycin und Rifampicin der Entnahmezeiten unter 24
Stunden wurden vor der weiteren Aufbereitung mit Leerwertplasma verdünnt (1+9), die
Messproben der Entnahmezeiten über 24 Stunden hingegen unverdünnt vermessen.
Die Plasmaproben zur Bestimmung von 25-O-Desacetylrifampicin wurden ebenfalls
unverdünnt vermessen. Zur Bestimmung der Konzentrationen wurden 200 µl des
gewonnenen Fohlenplasmas beziehungsweise des verdünnten Fohlenplasmas mit 300
µl Ammoniumacetat-Lösung (20 mM, pH 8,5), 25 µl Arbeitslösung des internen
Standards und 50 µl Natriumazid-Lösung (0,2%) versetzt und intensiv gemischt.
Anschließend erfolgte die Zugabe von fünf Millilitern tertiärem Butylmethylether (Merck
KGaA, Darmstadt, Deutschland) und die Proben wurden für 15 Minuten bei
Raumtemperatur im Horizontalschüttler (Thys 2, MLW) extrahiert. Dabei kommen die
wässrige und organische Etherphase unter Ausbildung einer großen Kontaktoberfläche
intensiv in Kontakt und die Analyten gelangen in Abhängigkeit Ihrer lipophilen
Eigenschaften in unterschiedlichem Ausmaß aus der Plasmaphase in die Etherphase.
Es handelt sich hierbei um eine Flüssig-Flüssig Extraktion. Im Anschluss daran wurden
die Probenröhrchen bei 4000 U/min für zwei Minuten zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge
Abbott, Darmstadt, Deutschland). Die organische, die Analyten enthaltende Etherphase,
wurde in Reagenzgläser überführt und bei Raumtemperatur im Luftstrom bis zur
Trockne eingedampft (Sample concentrator, Techne, DRI Block, DB.3). Die
getrockneten Proben wurden abschließend in 100 µl mobiler Phase (50% Acetonitril,
50% 0,1%ige Ameisensäure) aufgenommen und in Probengefäße überführt.
3.5.1.4 Aufbereitung der bronchoalveolären Zellen
Auch diese Proben wurden wegen stark variierenden Konzentrationen der Analyten
vierfach aufgearbeitet und vermessen. Die Proben wurden vor der weiteren
Material und Methoden
- 48 -
Aufbereitung mit BAL-Puffer (PBS-Lösung) 1+9 beziehungsweise 1+39 verdünnt. Zum
weiteren Zellaufschluss wurden 200 µl der BAL-Zellsuspension mit 25 µl einer 2%-SDS-
Lösung (SDS = Sodium-dodecylsulfat = Natriumdodecylsulfat (m/m)) versetzt und für
fünf Minuten im Ultraschallbad inkubiert und nachfolgend mit 300 µl Ammoniumacetat-
Lösung, 25 µl Arbeitslösung des internen Standards und 50 µl Natriumazid-Lösung
(0,2%) versetzt und intensiv gemischt. Der weitere Aufbereitungsprozess dieser Proben
zur Bestimmung der Konzentrationen der Analyten in den BAL-Zellen entspricht dem
oben (3.2.1.3) beschriebenem.
3.5.1.5 Flüssigkeitschromatographie (LC) mit nachge schalteter Tandem-
Massenspektroskopie (MS/MS-System)
Die chromatographischen Untersuchungen wurden mit dem HPLC-System Hewlett
Packard series 1100 (Hewlett Packard, Waldbronn, Deutschland), bestehend aus einer
binären Pumpe, einem Entgaser, einem auf 10°C geküh lten Probengeber und einem auf
40 °C temperierten Säulenofen, durchgeführt. Die Ch romatographie erfolgte isokratisch
mit einem Elutionsmittelgemisch bestehend aus Acetonitril und 0,1%iger Ameisensäure
(50%/50%) (Merck, Darmstadt, Deutschland) mit einer Flussrate von 200 µl/min. Als
analytische Säule wurde eine XTerra MS (100 x 2,1 mm, 3,0 µm) der Firma Waters
(Milford/Taunton, USA) verwendet. Vor der Trennsäule befand sich zusätzlich ein 0,5
µm PEEK Mikrofilter, um partikuläre Verunreinigungen abzufangen. Das vom
Probengeber injizierte Volumen betrug 5 µl.
Zur Detektion der Substanzen wurde die HPLC an ein Tandem-Massenspektrometer
(MDS Sciex API 4000, Applied Biosystems) unter Nutzung des Turbolon Interface
gekoppelt. Clarithromycin, Rifampicin, 25-O-Desacetylrifampicin, 14-Hydroxy-
Clarithromycin und der interne Standard Roxithromycin wurden anhand ihrer
unterschiedlichen Massenübergänge nach Ionisation und Fragmentierung der
Mutterionen in die substanzspezifischen Tochterionen im positiven Ionisationsmodus
detektiert. Folgende Massenübergänge wurden zur Quantifizierung verwendet:
Clarithromycin: 748,5 � 590,1 m/z; Rifampicin: 821,1 � 789,2; 25-O-Desacetyl-
Rifampicin: 779,1 � 747,1; Roxithromycin: 837,3 � 679.2; 14-Hydroxy-Clarithromycin;
764,1 � 606,1.
Material und Methoden
- 49 -
Die Auswertung aller Chromatogramme erfolgte mit der validierten Software Analyst 1.4.
(Applied Biosystems) nach der internen Standardmethode über die jeweiligen
Peakflächen-Verhältnisse zwischen Analyt und dem internem Standard. Die
Kalibrationsgeraden wurden mit 1/x gewichteter linearer Regression erstellt und dienten
als Grundlage zur Berechnung der unbekannten Konzentrationen.
3.5.1.6 Untersuchung zur Genexpression der bronchoa lveolären Zellen und der
Bronchialschleimhautbioptate für p – Glykoprotein, Multidrug resistance Protein
und das Housekeeping gene 18s
In den Bronchialschleimhautproben und in den bronchoalveolären Zellen wurde mit der
quantitativen Real Time PCR (qRT-PCR) die Genexpression der Transporterproteine P-
gp (ABCB 1), MRP-2 (ABCC 2) und 18s, ein hauseigenes Kontrollgen, untersucht. Die
Auswertung der Ergebnisse erfolgte nach der sogenannten ∆∆CT-Methode, die erstmals
von LIVAK et al. 2001 publiziert wurde. Bei dieser Methode wird die relative Expression
des Zielgens (Gene of interest, GI) auf ein Kontrollprobenmaterial bezogen und der
Expressionsunterschied bestimmt. Die Normalisierung der Expressionsergebnisse
erfolgt im Vorfeld über ein Referenzgen, das hauseigene Kontrollgen (HKG). In dieser
Studie wurde als solches 18s genutzt, es kodiert für die 18s Untereinheit des Ribosoms
und wird in jeder Zelle exprimiert. Außerdem wurde als Kontrolle für die Genexpression
in dieser Studie nicht eine unbehandelte Probe genutzt sondern die Genexpression von
ABCB1/P-gp, ABCC2/MRP-2 und 18s in den Bronchialbioptaten und bronchoalveolären
Zellen der Fohlen nach der Monotherapie mit Clarithromycin. Das war in sofern möglich
als dass die Fragestellung darauf abgezielt hat, ob die Expression der Gene durch die
zusätzliche Gabe von Rifampicin als starker Induktor zahlreicher Enzymsysteme
(SIEGMUND und WEITSCHIES, 2002) beeinflusst wird. Die Zielgene sind P-gp und
MRP-2 in den gewonnenen Proben nach der Kombinationstherapie mit Clarithromycin
und Rifampicin. Es stellt also jedes Fohlen seine eigene Bezugsgröße und Kontrolle dar.
Nach der Normalisierung der Ergebnisse über das Referenzgen (∆CT = CT (GI) – CT
(HKG)) wurde vom ∆CT-Wert der Probe (Behandlung mit Clarithromycin und Rifampicin)
der Mittelwert aller ∆CT-Werte der Kontrollen abgezogen (∆∆CT = ∆CT (Behandlung) –
Mittelwert ∆CT (alle Kontrollproben)). Daraus wurde der relative Expressionsunterschied
Material und Methoden
- 50 -
nach der arithmetischen Formel 2-∆∆CT berechnet. Als Bezugspunkt wurde der 2-∆∆CT -
Wert betrachtet, der sich aus der Differenz zwischen ∆CT der Kontrolle und dem
Mittelwert aller ∆CT – Werte der Kontrollen ergibt. Wird der 2-∆∆CT– Wert der Probe im
Vergleich zum 2-∆∆CT-Wert der Kontrolle größer, zeigt das eine Hochregulation der
Genexpression an, bei Abnahme eine entsprechende Downregulation. Diese
Berechnungsmethode setzt eine Verdopplung der DNA Menge in jedem Zyklus voraus,
man geht von einer optimalen qRT-PCR Effizienz in allen Proben aus.
3.5.1.7 Auswertungen der Detektionsergebnisse zur B estimmung der
Konzentrationen von Rifampicin und/oder Clarithromy cin und ihrer Metaboliten
Alle Chromatogramme wurden nach der internen Standardmethode über die jeweiligen
Peakflächen ausgewertet. Die Berechnung der Konzentrationen erfolgte über die Peak
Area Ratios (PAR) mit 1/x gewichteter linearer Regression online mit der LC-MS
Software „Analyst 1.4“.
Mit Hilfe der LC-MS/MS wurden die Konzentrationen von Clarithromycin, 14-OH-
Clarithromycin, Rifampicin und 15-O-Desacetylrifampicin im Plasma, in der PELF und in
den bronchoalveolären Zellen bestimmt. Die ermittelten Steady State Konzentrationen
der eingesetzten Antibiotika wurden daraufhin in einer Konzentrations-Zeit-Kurve
aufgetragen und die verschiedenen Parameter aus deren Verläufen berechnet (siehe
Abb. 02). Die statistische Auswertung erfolgte für die folgend genannten
Pharmakokinetischen Parameter mit Hilfe des WILCOXON Tests.
Material und Methoden
- 51 -
0 3 6 9 12
Ct
t (h)
Cmax
Cmin
tmax
Cav
AUC
PTF
Abb. 02: Darstellung pharmakokinetischer Parameter
Cmax: Maximalkonzentration; tmax: Zeitpunkt der Maximalkonzentration; Cmin:
Minimalkonzentration; Cav: durchschnittliche Plasmakonzentration; Ct: Konzentration
zum Zeitpunkt t; t: Zeit in Stunden; PTF: Peak-through-fluctuation; AUC: Fläche unter
der Konzentrations-Zeit-Kurve („area under the curve“)
Die maximale (Cmax) und minimale (Cmin) Arzneistoff-Konzentration und die Zeit bis zum
Erreichen der maximalen Arzneistoff-Konzentration (tmax) wurden direkt aus der
Konzentrations-Zeit-Kurve abgelesen (siehe Abb. 02). Im Anschluss daran wurden über
die neun erhaltenen Einzelwerte für die Cmax, Cmin und tmax die Mittelwerte gebildet und
die entsprechenden Standardabweichungen berechnet.
Als Maß für die Gesamtkonzentration des Arzneimittels im Organismus wurde die
Gesamtfläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve („area under the curve“, AUC)
bestimmt. Die Berechnung erfolgte mit der Trapezregel, bei der aus jeweils zwei
Material und Methoden
- 52 -
Messzeitpunkten ti und ti+1 mit den dazugehörigen Konzentrationen Ci und Ci+1 die
Fläche der einzelnen Trapeze bestimmt wird. In der Folge werden die Flächeninhalte
der einzelnen Trapeze addiert und man erhält die Gesamtfläche unter der Kurve. Im
Rahmen einer Steady State Kinetik wird die AUC im Dosierungsintervall berechnet, das
heißt für diese Studie erfolgte die Berechnung über einen Zeitraum von null bis zwölf
Stunden (n = 12). Für die Berechnung der AUC gilt: ( ) ( )
∑−
=
++−
−⋅+=
1n
0i
i1ii1it0 2
ttCCAUC
n.
Die durchschnittliche Plasmakonzentration über den Zeitraum von zwölf Stunden wurde
mit Cav angegeben. Die Berechnung erfolgt auf Grundlage der AUC dividiert durch das
Dosierungsintervall (zwölf Stunden): 12
AUC 12h-0=avC .
Cav beschreibt eine Maximalkonzentration die erreicht werden würde wenn man das
verabreichte Medikament in der gleichen Dosierung als intravenöse Dauertropfinfusion
verabreichen würde. Da die Medikamente in dieser Studie per os verabreicht wurden
bestimmt man als weiteren Parameter die Peak-through-fluctuation (PTF), um zu
beschreiben, wie weit sich die Kinetik vom Ideal der Dauertropfinfusion entfernt. Aus der
Cmax, der Cmin und der Cav kann die Peak-through-Fluctuation (PTF) berechnet werden:
PTF (%) = ((Cmax - Cmin)/ Cav)
Als weiterer pharmakologischer Parameter wurde die Eliminationshalbwertszeit (t1/2)
bestimmt. Sie beschreibt die Zeit in der die Konzentration eines Stoffes auf die Hälfte
des ursprünglichen Wertes abfällt: ZZ
tλλ693,02ln
2/1 == .
λz ist die Steigung der Geraden: ZZt CtC +×= λln (Cz beschreibt den Schnittpunkt der
Geraden mit der Ct Achse) und entspricht annähernd der Eliminationskonstanten. Zur
Berechnung von λz wurde eine logarithmische Darstellung der Konzentrations-Zeit-
Kurve gewählt. Dabei wurde durch die aufgetragenen Konzentrationen, aber mindestens
durch die drei letzten Messzeitpunkte eine Gerade gelegt und an dieser die Steigung
bestimmt. Dieser Methode liegt die Hypothese zugrunde, dass in dieser Phase der
Kinetik angenommen werden kann, dass die Eliminationsprozesse zu diesem Zeitpunkt
überwiegen und nur wenig durch Resorptions- und Distributionsprozesse beeinflusst
werden.
Ergebnisse
- 53 -
4 Ergebnisse
4.1 Etablierung der Essays zur Quantifizierung von Clarithromycin und Rifampicin
Die chromatographische Quantifizierung von Clarithromycin, seinem Metaboliten und
Rifampicin erfolgte im Institut für klinische Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt
Universität in Greifswald mit einer flüssigchromatographischen Methode mit doppelt
nachgeschalteter Massenspektroskopie (LC-MS/MS). Die Messungen erfolgten nach
einer für Plasma, BALF und Zellen validierten Bestimmungsmethode entsprechend den
international geltenden Richtlinien.
Als Quantifizierungsgrenze wurde der niedrigste Kalibrierwert von 2,5 ng/ml definiert,
Präzision und Richtigkeit waren für diesen Kalibrationswert mit < 15% erfüllt.
Tab. 03: Konzentrationsbereiche und Korrelationkoeffizienten der biologischen Matrices
für Clarithromycin und Rifampicin
Matrix Analyt Korrelationskoeffizient bei 2,5 bis 25 ng/ml
Korrelationskoeffizient bei 25 bis 250 ng/ml
Clarithromycin 0.9937 - 0,9983 0,9943 - 0,9989
Plasma
Rifampicin 0,9937 - 0,9988 0,9950 - 0,9999
Clarithromycin 0,9934 - 0,9999 0,9956 - 0,9985
BALF
Rifampicin 0,9914 - 0,9988 0,9954 - 0,9988
Clarithromycin 0,9939 - 0,9997 0,9951 - 0,9984
BAL - Zellen
Rifampicin 0,9956 - 0,9989 0,9933 - 0,9994
BALF: bronchoalveoläre Spülflüssigkeit, BAL: bronchoalveoläre Lavage
Ergebnisse
- 54 -
Die Qualitätsparameter „Richtigkeit“ und „Präzision“ zu den in dieser Studie
gemessenen Konzentrationen von Clarithromycin und Rifampicin sind in Tab. 04
dargestellt. Präzision und Richtigkeit waren für die Kalibratoren und Qualitätskontrollen
mit < 15 % erfüllt.
Ergebnisse
- 55 -
Tab. 04: Richtigkeit und Präzision (Between-day und Within-day) für die Bestimmung
der Konzentration von Clarithromycin und Rifampicin (n = 6).
Clarithromycin Rifampicin
Between-days Präzision (%) Richtigkeit (%) Präzision (%) Richtigkeit (%)
K 2,8 - 5,8 - 9,7 - 9,3 4,2 - 7,9 - 3,7 - 3,0 Plasma niedrig
QK 6,2 - 10,0 0,1 - 6,2 8,2 - 10,9 -3,3 - 3,5
K 2, 8 - 9,6 - 6,2 - 6,3 2,2 - 8,7 - 5,4 - 3,3 Plasma hoch
QK 5,1 - 8,9 - 0,1 - 8, 6 6,6 - 9,4 - 1,4 - 2,1
K 3,9 - 11,3 - 3,7 - 2,8 5,4 - 10,7 - 5,6 - 4,8 BALF niedrig
QK 7,0 - 9,2 2,0 - 5,7 5,3 - 7,0 4,5 - 6,9
K 1,8 - 5,5 - 12,0 - 10,7 2,1 - 5,8 - 9,4 - 10,2 BALF hoch
QK 3,2 - 4,6 0,9 - 9,8 1,6 - 9,5 - 4,0 - 8,2
K 2,9 - 9,4 - 6,6 - 11,9 2,7 - 9,1 - 5,1 - 11,2 BAL-Zellen niedrig
QK 2,6 - 9,6 0,9 - 14,2 3,9 - 12, 4 4,8 - 11,4
K 2,9 - 10,3 - 4,2 - 4,8 3,6 - 10,4 - 5,1 - 4,3 BAL-Zellen hoch
QK 3,8 - 6,3 4,2 - 4,7 5,3 - 11,4 2,8 - 8,3
Within-day
Plasma niedrig QK 10,3 - 7,1 - 4,1 - 2,5 8, 2 - 10,9 - 3,3 - 3,5
Plasma hoch QK 4,2 - 7,6 - 1,6 - 6,6 7,6 -8,9 -1,9 - 10,4
BALF niedrig QK 2,7 - 5,7 - 0,1 - 9,0 5,9 - 7,9 - 8,0 - 8,5
BALF hoch QK 2,8 - 7,1 0,9 - 6,6 2,6 - 5,4 - 2,4 - 11,4
BAL-Zellen niedrig QK 4,2 - 7,9 - 4,6 - 8,2 5,7 - 14,2 - 5,2 - 5,6
BAL-Zellen hoch QK 3,5 - 6,1 -1,9 - -1,8 5,1 - 12,0 -1,1 - 1,3
BAL: Bronchoalveoläre Lavage; BALF: Bronchoalveoläre Flüssigkeit, K: Kalibratoren,
QK: Qualitätskontrollen
Ergebnisse
- 56 -
4.2 Konzentrationen der Antibiotika im Plasma bei d en Fohlen (1. und 2. Kinetik)
4.2.1 Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma nach der Monotherapie (1.
Kinetik)
Am siebten Tag nach Beginn der Verabreichung von Clarithromycin (7,5 mg/kg p.o., q
12 h) betrugen die Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma der neun Fohlen zum
Zeitpunkt der ersten Blutentnahme zwölf Stunden nach der letzten oralen Applikation im
Mittelwert 322,13 ng/ml mit einer Standardabweichung von 293,32 ng/ml. Die
maximalen Plasmakonzentrationen (Cmax) wurden nach 3,73 ± 1,79 Stunden erreicht
und betrugen 614 ± 365 ng/ml. Die durchschnittliche Plasmakonzentration (Cav) betrug
462 ± 368 ng/ml. Zum Zeitpunkt der BAL, zwölf Stunden nach der Behandlung am
Morgen, betrug die Konzentration von Clarithromycin im Plasma 301,17 ± 269,80 ng/ml.
48 Stunden nach der letzten peroralen Gabe von Clarithromycin konnten im Plasma
Konzentrationen von 9,03 ± 14 ng/ml ermittelt werden. Bei zwei Fohlen konnte
Clarithromycin zu diesem Zeitpunkt nicht mehr nachgewiesen werden. Die minimale
Plasmakonzentration (Cmin) wurde mit 262 ± 254 ng/ml berechnet. Die AUC0-12h als Maß
für die Substanzmenge des Arzneistoffes im Körper innerhalb der ersten zwölf Stunden
lag für Clarithromycin bei 5545 ± 4420 ng x h/ml.
Die ermittelte Halbwertszeit (t1/2) für Clarithromycin betrug 6,11 ± 0,83 Stunden.
4.2.2 Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma bei gleichzeitiger Gabe von
Rifampicin (2. Kinetik)
An Tag 21, unmittelbar im Anschluss an die kombinierte Gabe von Clarithromycin und
Rifampicin, betrugen die Plasmakonzentrationen für Clarithromycin zum Zeitpunkt der
ersten Blutentnahme im Mittel 8,51 ± 10,79 ng/ml. Bei zwei der neun Fohlen lag die
Clarithromycinkonzentration im Plasma zu diesem Zeitpunkt unterhalb der
Nachweisgrenze.
Die Cmax von Clarithromycin nach der kombinierten Behandlung der Fohlen war mit 65,0
± 51,5 ng/ml signifikant (p = 0.008) niedriger als nach der alleinigen Applikation von
Clarithromycin. Die Cmax wurde nach 2,84 ± 1,79 Stunden schneller erreicht als nach der
Monotherapie. Signifikante Abweichungen fanden sich bei der Cav mit 29,8 ± 26,3 ng/ml
Ergebnisse
- 57 -
(p = 0.008), bei der Cmin mit 9,26 ± 9,63 ng/ml (p = 0.008) und bei der AUC0-12h (p =
0.008), hier wurden Werte von 357 ± 315 ng x h/ml gemessen. Zum Zeitpunkt der BAL,
d. h. 12 Stunden nach der letzten Gabe von Clarithromycin, betrug die Konzentration
des Clarithromycin im Plasma 13,87 ± 15,82 ng/ml. Nach 24 Stunden konnte
Clarithromycin im Plasma von sechs Fohlen nachgewiesen werden, nach 36 Stunden
wurde es nur bei einem Fohlen, nach 48 Stunden konnte es bei keinem Fohlen mehr
nachgewiesen werden. Bei einem Fohlen konnte Clarithromycin im Plasma nur bis zur
sechsten Stunde nach der Applikation nachgewiesen werden.
Die ermittelte Halbwertszeit für Clarithromycin im Plasma nach der kombinierten Gabe
der beiden Antibiotika lag bei 6,88 ± 3,44 Stunden und entsprach somit annähernd jener
nach der Monotherapie (siehe Tab. 05).
Ergebnisse
- 58 -
0 6 12 18 24 30 36 42 480
200
400
600
800
1000 ohne Rifampicin mit Rifampicin
Cla
rithr
omyc
in (
ng/m
l)
Zeit (h)
Abb. 03: Clarithromycinkonzentrationen im Plasma bei neun Fohlen nach der alleinigen
Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der
kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h).
Ergebnisse
- 59 -
Tab. 05: Pharmakokinetische Daten für die Konzentration von Clarithromycin im Plasma
beim Fohlen (n=9), nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q
12 h) und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)
mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h); Angaben in Mittelwert ± Standardabweichung.
Clarithromycinkonzentration im Plasma
Ohne Rifampicin mit Rifampicin p-Wert
AUC0-12h (ng×h/ml) 5545 ± 4420 357 ± 315* 0,008
Cmax (ng/ml) 614 ± 365 65,0 ± 51,5* 0,008
tmax (h) 3,73 ± 1,79 2,84 ± 1,79 0,086
Cmin (ng/ml) 262 ± 254 9,26 ± 9,63* 0,008
Cav (ng/ml) 462 ± 368 29,8 ± 26,3* 0,008
PTF (%) 94,6 ± 35,8 191 ± 66* 0,008
t½ (h) 6,11 ± 0,83 6,88 ± 3,44 0,515
C12h – Plasma 301 ± 270 13,9 ± 15,8* 0,012
* signifikant unterschiedliche Werte 1. und 2. Kinetik
AUC0-12: Area under the curve vom Zeitpunkt 0 bis 12 Stunden; Cmax: maximale
Plasmakonzentration; tmax: Zeit bis zum Erreichen der maximalen Konzentrationen
(Cmax) im Plasma; Cmin: minimale Plasmakonzentration; Cav: durchschnittliche
Plasmakonzentration; PTF: Peak-trough-fluctuation; t1/2: Halbwertszeit; C12h-Plasma:
durchschnittliche Plasmakonzentration 12 Stunden nach der letzten Applikation von
Clarithromycin.
4.2.3 Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin im P lasma (1. Kinetik)
Die Konzentrationen des Metaboliten 14-Hydroxy-Clarithromycin betrugen am siebten
Tag zum Zeitpunkt der ersten Blutentnahme im Mittelwert 118,33 ng/ml mit einer
Standardabweichung von 80,78 ng/ml. Die maximale Plasmakonzentration betrug 161 ±
69,9 ng/ml und wurde für 14-OH-Clarithromycin nach 3,56 ± 2,59 Stunden erreicht (tmax).
Ergebnisse
- 60 -
Die durchschnittliche Konzentration lag bei 132 ± 86,0 ng/ml. Zum Zeitpunkt der BAL, d.
h. 12 Stunden nach der letzten Gabe von Clarithromycin, lagen die
Plasmakonzentrationen der neun Fohlen bei 52,98 ± 29,07 ng/ml. 48 Stunden nach der
letzten Applikation von Clarithromycin konnte der Metabolit noch bei sechs Fohlen
nachgewiesen werden. Die minimale Plasmakonzentration (Cmin) von 14-OH-
Clarithromycin lag bei 84,7 ± 68,1 ng/ml. Für die AUC0-12h wurden Werte von 1581 ±
1032 ng x h/ml ermittelt. Die Halbwertszeit (t½) für den Metaboliten von Clarithromycin
betrug 8,11 ± 1,61 Stunden. In der Abb. 04 sind die Konzentrationen von Clarithromycin
und seinem Metaboliten zum Vergleich dargestellt.
0 6 12 18 24 30 36 42 480
200
400
600
800
10007.5 mg/kg Clarithromycin p.o.
Clarithromycin 14-OH-Clarithromycin
Kon
zent
ratio
n (n
g/m
l)
Zeit (h)
Abb. 04: Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin im Plasma von
neun Fohlen nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o.,
q 12 h).
Ergebnisse
- 61 -
4.2.4 Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin im P lasma bei gleichzeitiger
Gabe von Rifampicin (2. Kinetik)
Zum Zeitpunkt der ersten Blutentnahme an Tag 21, unmittelbar nach der kombinierten
Behandlung der Fohlen mit Clarithromycin und Rifampicin, betrugen die
Konzentrationen bei den neun Fohlen für 14-OH-Clarithromycin 23,91 ± 21,77 ng/ml.
Maximale Plasmakonzentrationen wurden nach 2,89 ± 1,76 Stunden in der Höhe von
109 ± 54,3 ng/ml gemessen. Die Cmax war somit signifikant (p = 0.038) geringer als die
des Metaboliten nach der alleinigen Gabe von Clarithromycin. Die durchschnittliche
Konzentration von 14-OH-Clarithromycin betrug 60,4 ± 36,8 ng/ml und war ebenfalls
signifikant (p = 0.008) geringer. Bei zwei Fohlen lagen die letzten messbaren
Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin bei der Blutentnahme nach 16 Stunden, bei
sechs Fohlen wurden die letzten Konzentrationen nach 24 Stunden bestimmt. Bei einem
Fohlen konnte der Clarithromycin Metabolit nach 48 Stunden im Plasma noch
nachgewiesen werden. Im Mittelwert lag die minimale Plasmakonzentration bei 21,0 ±
21,3 ng/ml und war signifikant geringer als die Cmin nach alleiniger Behandlung mit
Clarithromycin (siehe Tab. 06). Die AUC0-12h betrug, ebenfalls signifikant geringer, 725 ±
442 ng x h/ml. Die Halbwertszeit für den 14-OH-Metaboliten bei der kombinierten
Verabreichung mit Rifampicin war signifikant erniedrigt und betrug 5,10 ± 0,88 Stunden.
Zum Zeitpunkt der BAL, d. h. 12 Stunden nach der letzten Gabe von Clarithromycin,
betrug die Konzentration von 14-OH-Clarithromycin 29,56 ± 26,68 ng/ml.
Ergebnisse
- 62 -
0 6 12 18 24 30 36 42 480
50
100
150
200
250 ohne Rifampicin mit Rifampicin
14-O
H-C
larit
hrom
ycin
(ng
/ml)
Zeit (h)
Abb. 05: Plasmakonzentrationen von 14-OH-Clarithromycin bei neun Fohlen nach der
Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der
kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h).
Ergebnisse
- 63 -
Tab. 06: Verhältnis der Konzentrationen von Clarithromycin zu 14-OH-Clarithromycin im
Plasma nach der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der
kombinierten Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10
mg/kg, p.o., q 12 h)
Clarithromycin/14-OH-Clarithromycin
ohne Rifampicin mit Rifampicin p-Wert
AUC0-12h (ng×h/ml) 3,23 ± 0,85 0,44 ± 0,15* 0,008
Cmax (ng/ml) 3,62 ± 1,10 0,53 ± 0,21* 0,008
Cmin (ng/ml) 2,77 ± 1,21 0,46 ± 0,20* 0,008
* signifikant unterschiedliche Werte 1. und 2. Kinetik
AUC0-12: Area under the curve vom Zeitpunkt 0 bis 12 Stunden; Cmax: maximale
Plasmakonzentration; Cmin: minimale Plasmakonzentration
Ergebnisse
- 64 -
Tab. 07: Pharmakokinetische Daten von 14-OH-Clarithromycin im Plasma beim Fohlen
(n=9), nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und
nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q12 h) mit
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h); Angaben in Mittelwert ± Standardabweichung.
14-OH-Clarithromycin im Plasma
ohne Rifampicin mit Rifampicin p-Wert
AUC0-12h (ng×h/ml) 1581 ± 1032 725 ± 442* 0,008
Cmax (ng/ml) 161 ± 69.9 109 ± 54.3* 0,038
tmax (h) 3,56 ± 2,59 2,89 ± 1,76 0,314
Cmin (ng/ml) 84,7 ± 68,1 21,0 ± 21,3* 0,008
Cav (ng/ml) 132 ± 86,0 60,4 ± 36,8* 0,008
PTF (%) 70,4 ± 35,0 155 ± 37,5* 0,008
t½ (h) 8,11 ± 1,61 5,10 ± 0,88* 0,008
C12h – Plasma 92,0 ± 64,3 29,6 ± 26,7* 0,008
* signifikant unterschiedliche Werte 1. und 2. Kinetik
AUC0-12: Area under the curve vom Zeitpunkt 0 bis 12 Stunden; Cmax: maximale
Plasmakonzentration; tmax: Zeit bis zum Erreichen der maximalen Konzentrationen
(Cmax) im Plasma; Cmin: minimale Plasmakonzentration; Cav: durchschnittliche
Plasmakonzentration; PTF: Peak-trough-fluctuation; t1/2: Halbwertszeit; C12h-Plasma:
durchschnittliche Plasmakonzentration 12 Stunden nach der letzten Applikation von
Clarithromycin.
Ergebnisse
- 65 -
0 6 12 18 24 30 36 42 480
30
60
90
120
150
7.5 mg/kg Clarithromycin+10 mg/kg Rifampicin p.o.
Clarithromycin 14-OH-Clarithromycin
Kon
zent
ratio
n (n
g/m
l)
Zeit (h)
Abb. 06: Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin im Plasma von
neun Fohlen nach der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)
und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12
h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h).
4.2.5 Konzentrationen von Rifampicin im Plasma nach der kombinierten Gabe mit
Clarithromycin
Die Konzentration von Rifampicin im Plasma lag 36 Stunden nach der letzten
Applikation, an Tag 21 bei 1242,91 ± 709,38 ng/ml. Die maximale Plasmakonzentration
betrug 1273 ± 669 ng/ml und wurde nach 0,92 ± 2,66 Stunden erreicht. Die
durchschnittliche Plasmakonzentration lag bei den neun Fohlen bei 677 ± 291 ng/ml.
Zum Zeitpunkt der BAL, d. h. 48 Stunden nach der letzten Gabe von Rifampicin und 12
Stunden nach der letzten Applikation von Clarithromycin, wurden im Plasma
Konzentrationen von 363,17 ± 184,22 ng/ml gemessen. 48 Stunden nach der BAL war
Ergebnisse
- 66 -
Rifampicin mit Konzentrationen von 17,61 ± 8,82 ng/ml noch bei allen Fohlen im Plasma
nachweisbar. Die AUC0-12h wurde mit 8128 ± 3487 ng x h/ml berechnet. Die ermittelte
Halbwertszeit für Rifampicin im Plasma beim Fohlen betrug 8,81 ± 1,71 Stunden.
4.2.6 Konzentrationen von 25-O-Desacetylrifampicin im Plasma nach der
kombinierten Gabe mit Clarithromycin
Am Tag 21 wurde ebenfalls der Metabolit von Rifampicin, das 25-O-Desacetylrifampicin
bestimmt. Der Metabolit wurde bei fünf der neun Fohlen im Plasma nachgewiesen. Bei
diesen Fohlen lagen die Konzentrationen vor der letzten Applikation von Clarithromycin
an Tag 21 bei 3,41 ± 3,92 ng/ml. Nach 0,53 ± 0,59 Stunden wurde eine maximale
Plasmakonzentration von 7,65 ± 5,13 ng/ml erreicht. Die durchschnittliche
Plasmakonzentration von 25-O-Desacetylrifampicin betrug 3,79 ± 2,80 ng/ml. Zum
Zeitpunkt der BAL, d. h. 48 Stunden nach der letzten Gabe von Rifampicin und 12
Stunden nach der letzten Gabe von Clarithromycin, wurden im Mittelwert 25-O-
Desacetylrifampicinkonzentrationen von 1,77 ± 2,27 ng/ml erreicht. Zu diesem Zeitpunkt
konnte der Metabolit nur bei zwei Fohlen im Plasma nachgewiesen werden. Bei einem
Fohlen konnte 25-O-Desacetylrifampicin nach sechs Stunden nachgewiesen werden,
bei vier Fohlen enden die messbaren Konzentrationen nach acht Stunden und bei nur
einem Fohlen konnte nach 16 Stunden eine Konzentration von 5,093 ng/ml gemessen
werden. Die minimale Plasmakonzentration für den Metaboliten betrug 3,63 ± 1,59 ng/ml
und die AUC0-12h 45,5 ± 33,6 ng x h/ml. Die Halbwertszeit für den Rifampicinmetaboliten
betrug beim Fohlen 14,4 ± 6,12 Stunden.
Ergebnisse
- 67 -
Tab. 08: Pharmakokinetische Daten von Rifampicin und seinem Metaboliten, 25-O-
Desacetylrifampicin im Plasma beim Fohlen (n=9), nach der kombinierten Applikation
von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h);
Angaben in Mittelwert ± Standardabweichung
Rifampicin 25-O-Desacetylrifampicin
AUC0-12h (ng×h/ml) 8128 ± 3487 45,5 ± 33,6
Cmax (ng/ml) 1273 ± 669 7,65 ± 5,13
tmax (h) 0,2 ± 2.66 0,53 ± 0,59
Cmin (ng/ml) 363 ± 184 3,63 ± 1,59
Cav (ng/ml) 677 ± 291 3,79 ± 2,80
t½ (h) 8,81 ± 1,71 14,4 ± 6,12
AUC0-12: Area under the curve vom Zeitpunkt 0 bis 12 Stunden; Cmax: maximale
Plasmakonzentration; tmax: Zeit bis zum Erreichen der maximalen Konzentrationen
(Cmax) im Plasma; Cmin: minimale Plasmakonzentration; Cav: durchschnittliche
Plasmakonzentration; t1/2: Halbwertszeit
4.3 Menge der rückgewonnenen bronchoalveolären Flüs sigkeit, PELF und
Konzentrationen der Antibiotika in der PELF
In der vorliegenden Studie wurde die bronchoalveoläre Lavage mit 4 x 100 ml PBS-
Lösung durchgeführt. Die erste Fraktion der zurückgewonnenen Spülflüssigkeit wurde
nach der Bestimmung des Gesamtvolumens der BALF verworfen. Bei der ersten BAL
wurden durchschnittlich insgesamt 234,6 ± 45,5 ml zurückgewonnen, das entspricht
einem Anteil von 58, 7 % der instillierten PBS-Lösung. Bei der zweiten BAL betrug das
durchschnittlich zurückgewonnene Volumen 250 ± 35,5 ml. Der Anteil der
rückgewonnenen Spülflüssigkeit betrug hier 62,5 %. Die einzelnen Volumina der
zurückgewonnenen Spülflüssigkeiten sind der Tabelle 25 im Anhang zu entnehmen. Die
Ermittlung der Pulmonary epthelial lining fluid (PELF) erfolgte nach der Berechnung von
Ergebnisse
- 68 -
RENNARD et al. (1986) auf Grundlage der Harnstoffbestimmung in Plasma und
Spülflüssigkeit. Das Volumen der PELF in der ersten BAL betrug im Durchschnitt 16,3 ±
5,6 ml, bei der zweiten BAL 14,6 ± 7,2 ml.
Die Konzentrationen der eingesetzten Antibiotika und ihrer Metaboliten wurden in der
BALF bestimmt und daraus wurde in der Folge die Konzentration in der PELF
berechnet.
Tab. 09: Menge der zurückgewonnenen Spülflüssigkeit bei neun Fohlen bei jeweils zwei
bronchoalveolären Lavagen nach der Instillation von jeweils 4 x 100 ml PBS-Lösung
Menge der rückgewonnenen Spülflüssigkeit
BAL 1 BAL 2
Minimale Menge (ml) 150 169
25 % Quantil (ml) 170 202
Median (ml) 203 213
75 % Quantil (ml) 233 235
Maximale Menge (ml) 250 241
Mittelwert (ml) 201,89 212,67
Standardabweichung (ml) 36,85 26,51
BAL: bronchoalveoläre Lavage
4.3.1 Konzentrationen von Clarithromycin in der BAL F und in der PELF nach der
Monotherapie und nach der Kombination Clarithromyci n/Rifampicin
Zum Zeitpunkt der ersten BAL, an Tag 7 nach Beginn der Gabe von Clarithromycin in
einer Dosierung von 7,5 mg/kg, p.o., q 12 h und zwölf Stunden nach der letzten
Ergebnisse
- 69 -
Applikation von Clarithromycin betrug die Konzentration dieses Antibiotikums in der
BALF im Mittel 740,79 ± 554,16 ng/ml. Für die PELF wurde eine
Clarithromycinkonzentration von 9497,92 ± 6124,80 ng/ml errechnet. Nach der
kombinierten Gabe von Clarithromycin mit Rifampicin betrug die Konzentration des
Clarithromycins in der BALF an Tag 21 nach Beginn der Gabe von Clarithromycin (7,5
mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) und zwölf Stunden nach der
letzten Applikation von Clarithromycin 40,21 ± 36,51 ng/ml. Die Konzentration von
Clarithromycin in der PELF betrug zu diesem Zeitpunkt 695,66 ± 658,4 ng/ml und war
somit signifikant (p = 0,008) niedriger als bei der Monotherapie. Die Konzentrationen
sind in Abb. 07 dargestellt.
Die einzelnen Werte für die verschiedenen Clarithromycinkonzentrationen der neun
Fohlen sind den Tabellen 28 und 29 im Anhang zu entnehmen.
Ergebnisse
- 70 -
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
8, 4
5
9, 6, 3
1
2
7
Monotherapie mit Kombinationstherapie Clarithromycin Clarithromycin/Rifampicin
Cla
rithr
omyc
in (
ng/m
l)
Abb. 07: Konzentrationen von Clarithromycin in der PELF von neun Fohlen nach der
alleinigen Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der
kombinierten Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin
(10 mg/kg, p.o., q 12 h).
Ergebnisse
- 71 -
Tab. 10: Clarithromycinkonzentration in der PELF von neun Fohlen nach der alleinigen
Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der kombinierten Gabe von
Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h).
Clarithromycinkonzentration in der PELF
ohne Rifampicin mit Rifampicin
Minimale Menge (ng/ml) 2245,29 123,34
25 % Quantil (ng/ml) 4886,41 396,11
Median (ng/ml) 8378,12 451,83
75 % Quantil (ng/ml) 15350,94 638,07
Maximale Konzentration (ng/ml)
18387,12 2345,02
Mittelwert (ng/ml) 9497,92 695,66*
Standardabweichung (ng/ml) 6124,8 658,4
PELF: Pulmonary epthelial lining fluid
4.3.2 Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin in d er BALF und in der PELF
nach der Monotherapie und nach der Kombination Clar ithromycin/Rifampicin
Die Konzentration des Metaboliten von Clarithromycin in der BALF betrug am 7. Tag
nach Beginn der Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) 31,68 ± 16,60 ng/ml.
Am 21. Tag nach der Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) kombiniert mit
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) lag die Konzentration von 14-OH-Clarithromycin bei
7,35 ± 5,98 ng/ml. Die Konzentrationen für 14-OH-Clarithromycin in der PELF betrugen
an Tag 7 409,55 ± 202,94 ng/ml und an Tag 21 119,88 ± 75,83 ng/ml (p = 0,008).
Ergebnisse
- 72 -
0
100
200
300
400
500
600
700
800
84
5
6
9
3
7
1
2
Monotherapie mit Kombinationstherapie Clarithromycin Clarithromycin/Rifampicin
14-O
H-C
larit
hrom
ycin
(ng
/ml)
Abb.08: Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin in der PELF von neun Fohlen nach
der alleinigen Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der
kombinierten Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin
(10 mg/kg, p.o., q 12 h).
Ergebnisse
- 73 -
Tab. 11: Clarithromycinkonzentration in der PELF von neun Fohlen nach der alleinigen
Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der kombinierten Gabe von
Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h).
Konzentration von 14-OH-Clarithromycin in der PELF
ohne Rifampicin
mit Rifampicin
Minimale Menge (ng/ml) 152,09 33,84
25 % Quantil (ng/ml) 247,45 76,53
Median (ng/ml) 409,55 101,12
75 % Quantil (ng/ml) 583,06 142,31
Maximale Konzentration (ng/ml) 713,3 292,69
Mittelwert (ng/ml) 410,25 119,88*
Standardabweichung (ng/ml) 202,93 75,83
* signifikant unterschiedlicher Wert 1. und 2. Kinetik
PELF: Pulmonary epithelial lining fluid
4.3.3 Konzentrationen von Rifampicin und 25-O-Desac etylrifampicin in der BALF
und in der PELF
In der BALF konnten 48 Stunden nach der letzten Applikation von Rifampicin in einer
Dosierung von 10 mg/kg, p.o., q 12 h über einen Zeitraum von elf Tagen keine
Konzentrationen für Rifampicin und seinen Metaboliten bestimmt werden, sie lagen
somit unterhalb der Nachweisgrenze. Selbiges gilt für die PELF.
Ergebnisse
- 74 -
4.4 Konzentrationen der Antibiotika in den bronchoa lveolären Zellen
4.4.1 Gesamtzellzahl und Zellfraktionen in der BALF
Die Gesamtzellzahl in der BALF der neun Fohlen lag zum Zeitpunkt der ersten BAL im
Mittel bei 0,51 G/L ± 0,20 G/L, die geringste Zellzahl lag bei 0,12 G/L, die maximalen bei
0,79 G/L. Bei der zweiten BAL betrug die Gesamtzellzahl eine Menge von 0,52 ± 0,32
G/L. Die Gesamtzellgehalte in der BALF der einzelnen Fohlen sind der Tab. 32 im
Anhang zu entnehmen.
Im Rahmen der Aufbereitung der BALF wurden die Zellen ausgezählt und ein Ausstrich
zur Differenzierung der Zellen angefertigt Die Anteile der verschiedenen Zellfraktionen
sind der Tab. 12 zu entnehmen.
Tab. 12: Anteile der unterschiedlichen Zellfraktionen in der BALF bei neun Fohlen.
Zellen Anteil in % BAL 1 BAL 2 Normwerte
Mastzellen 5,3 ± 2,1 3,1 ± 2,3 0 bis 5
Neutrophile Granulozyten 0 ± 0 0,5 ± 0,7 1,2 bis 18,3
Lymphozyten 14,8 ± 2,9 14,3 ± 6,3 5 bis 20
Makrophagen 79,9 ± 2,4 81,9 ± 8,4 71 bis 86
BAL: bronchoalveoläre Lavage
4.4.2 Konzentrationen von Clarithromycin in den bro nchoalveolären Zellen nach
alleiniger Gabe von Clarithromycin und nach kombini erter Gabe mit Rifampicin
(Tag 7 und Tag 21)
Die Konzentration von Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen (BAC) betrug
nach der ersten Kinetik im Mittelwert 316566,69 ng/GZ (GZ = Gigazelle) bei einer
Standardabweichung von 450425,9 ng/GZ. Um die erhaltenen Konzentrationen in den
Zellen besser mit jenen des Plasmas und der PELF vergleichen zu können, wurde die
Konzentration zusätzlich für das Zellvolumen in Milliliter angegeben. Für
Ergebnisse
- 75 -
bronchoalveoläre Zellen des Fohlens wird von JACKS et al. (2001) ein Zellvolumen von
1,2 µl/GZ angegeben. Auch WOMBLE et al. (2006) legen in Ihren Berechnungen dieses
Volumen zu Grunde. Die daraus resultierende Konzentration von Clarithromycin für die
neun Fohlen dieser Studie betrug 263805,57 ± 375354,91 ng/ml Zellvolumen. Die
Konzentrationen von Clarithromycin nach der zweiten Kinetik lagen mit 12200,57 ±
12207,75 ng/GZ und 10167,14 ± 10173,13 ng/ml Zellvolumen (1,2 ml/GZ) signifikant
unter denen der ersten Kinetik (p = 0,008).
Ergebnisse
- 76 -
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
54
9, 68, 3,
2
1
7
Monotherapie mit Kombinationstherapie Clarithromycin Clarithromycin/Rifampicin
Cla
rithr
omyc
in (
ng/m
l)
Abb. 09: Konzentrationen von Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen bei neun
Fohlen nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12
h) und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q
12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)
Ergebnisse
- 77 -
Tab. 13: Konzentrationen von Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen bei neun
Fohlen nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und
nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h).
1,2µl/GZ Konzentration von Clarithromycin in den BAC
Ohne Rifampicin mit Rifampicin
Minimale Menge (ng/ml) 21317,84 1842,80
25 % Quantil (ng/ml) 115325,45 4266,52
Median (ng/ml) 132933,86 4440,00
75 % Quantil (ng/ml) 226150,02 10695,90
Maximale Konzentration (ng/ml) 1231720,95 28779,18
Mittelwert (ng/ml) 263805,57 10167,14*
Standardabweichung (ng/ml) 375354,91 10173,13
* signifikant unterschiedlicher Wert 1. und 2. Kinetik
4.4.3 Konzentration von 14-OH-Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen
nach alleiniger Gabe von Clarithromycin und nach ko mbinierter Gabe mit
Rifampicin (Tag 7 und Tag 21)
Die Konzentration von 14-OH-Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen betrug im
Mittelwert 5679,74 ng/GZ bei einer Standardabweichung von 6593,21 ng/GZ.
Umgerechnet auf das Zellvolumen betrug die Konzentration 4733,11 ± 5494,34 ng/ml
Zellvolumen. Nach der zweiten Kinetik betrug die Konzentration in den
bronchoalveolären Zellen 2052 ± 1469,01 ng/GZ und 1710,55 ± 1224,18 ng/ml
Ergebnisse
- 78 -
Zellvolumen. Die Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin waren im Vergleich zu
denen der ersten Kinetik signifikant erniedrigt (p = 0.008).
0
4000
8000
12000
16000
20000
5468
9, 312
7
Monotherapie mit Kombinationstherapie Clarithromycin Clarithromycin/Rifampicin
14-O
H-C
larit
hrom
ycin
(ng
/ml)
Abb. 10: Konzentration von 14-OH-Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen bei
neun Fohlen nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o.,
q 12 h) und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)
Ergebnisse
- 79 -
Tab. 14: Konzentration von 14-OH-Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen bei
neun Fohlen nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)
und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)
1,2µl/GZ Konzentration von 14-OH-Clarithromycin in den BAC
ohne Rifampicin mit Rifampicin
Minimale Menge (ng/ml) 994,40 454,87
25 % Quantil (ng/ml) 2569,07 866,39
Median (ng/ml) 3411,63 1277,49
75 % Quantil (ng/ml) 4353,51 2507,23
Maximale Konzentration (ng/ml) 19036,70 4303,91
Mittelwert (ng/ml) 4733,11 1710,55*
Standardabweichung (ng/ml) 5494,34 1224,18
* signifikant unterschiedlicher Wert 1. und 2. Kinetik
BAC: bronchoalveoläre Zellen
4.4.4 Konzentration von Rifampicin in den bronchoal veolären Zellen
In den bronchoalveolären Zellen konnte 48 Stunden nach der letzten Applikation von
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) keine Konzentrationen für Rifampicin gemessen
werden.
Ergebnisse
- 80 -
4.5 Genexpression von ABCB1 und ABCC2 in Zellen der Bronchialschleimhaut
und in bronchoalveolären Zellen
Die Bronchialschleimhautproben und die bronchoalveolären Zellen wurden im Institut für
klinische Pharmakologie der Ernst-Moritz-Arndt Universität in Greifswald mit der
TaqMan® (PCR) Technologie untersucht. An den Proben der neun Fohlen wurde die
Genexpression quantitativ für die Gene p-Glykoprotein (pGp, ABCB1), Multidrug
resistance Protein 2 (MRP2, ABCC2) und 18S, als hauseigenes Kontroll-Gen, bestimmt.
Die ermittelten CT-Werte (engl.: Cycle Threshold, Schnittpunkt zwischen
Amplifikationsgraph und Schwellenwert) wurden mit Hilfe der ∆∆CT-Methode, nach
LIVAK und SCHMITTGEN (2001) ausgewertet. Die Entwicklung der CT-Werte nach
Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o. q 12 h) in der 1. Kinetik und nach
kombinierter Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o. q 12 h) mit Rifampicin (10
mg/kg, p.o., q 12 h) in der 2. Kinetik wird in den Abbildungen 11 - 14 gezeigt.
Ergebnisse
- 81 -
0
1
2
3
4
5
KombinationstherapieClarithromycin/Rifampicin
Monotherapie mitClarithromycin
∆∆C
T A
BC
B1
in b
ronc
hoal
veol
ären
Zel
len
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Abb. 11: ∆∆CT-Werte für ABCB1 in den bronchoalveolären Zellen bei neun Fohlen nach
der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 1. Kinetik
(Monotherapie) und nach kombinierter Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 2. Kinetik
(Kombinationstherapie). Bezifferung der Graphen entspricht Nr. des Fohlens in
der klinischen Studie.
Ergebnisse
- 82 -
0
1
2
3
4
5
KombinationstherapieClarithromycin/Rifampicin
Monotherapie mitClarithromycin
∆∆C
T A
BC
C2
in b
ronc
hoal
veol
ären
Zel
len
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Abb. 12: ∆∆CT-Werte für ABCC2 in den bronchoalveolären Zellen bei neun Fohlen nach
der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 1. Kinetik
(Monotherapie) und nach kombinierter Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 2. Kinetik
(Kombinationstherapie). Bezifferung der Graphen entspricht Nr. des Fohlens in
der klinischen Studie.
Ergebnisse
- 83 -
Wie in Abb. 12 dargestellt, sinkt die Expression von ABCC2 bei Kombination von
Clarithromycin mit Rifampicin in den bronchoalveolären Zellen signifikant (p = 0.036). In
den Zellen der Bronchialschleimhaut zeichnet sich die Tendenz ab, dass die Expression
von ABCC2 nach der zusätzlichen Gabe von Rifampicin sinkt, diese Veränderungen
waren jedoch nicht signifikant (Abb. 14).
Ergebnisse
- 84 -
0
1
2
3
4
5
6
7
KombinationstherapieClarithromycin/Rifampicin
Monotherapie mitClarithromycin
∆∆C
T A
BC
B1
in B
iopt
aten
1
23
4
5
6
7
8
9
Abb. 13: ∆∆CT-Werte für ABCB1 in den Bronchialschleimhautbioptaten bei neun Fohlen
nach der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 1. Kinetik
(Monotherapie) und nach kombinierter Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 2. Kinetik. (Bezifferung
der Graphen entspricht Nummer des Fohlens in der klinischen Studie)
Ergebnisse
- 85 -
0
1
2
3
4
5
6
7
KombinationstherapieClarithromycin/Rifampicin
Monotherapie mitClarithromycin
∆∆C
T A
BC
C2
in B
iopt
aten
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Abb. 14 : ∆∆CT-Werte für ABCC2 in den Bronchialschleimhautbioptaten bei neun Fohlen
nach der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 1. Kinetik
(Monotherapie) und nach kombinierter Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 2. Kinetik. Kinetik
(Bezifferung der Graphen entspricht Nummer des Fohlens in der klinischen
Studie).
Ergebnisse
- 86 -
Die Ergebnisse wurden statistisch mit dem nichtparametrischen WILCOXON-Test
ausgewertet. Es konnte bis auf ABCC2 der bronchoalveolären Zellen kein signifikanter
Unterschied zur 1. Kinetik festgestellt werden (siehe Tab.15).
Ergebnisse
- 87 -
Tab. 15: CT-Werte der qRT-PCR für die Gene ABCB1, ABCC2 und 18S für die Proben
der Bronchialschleimhaut und der bronchoalveolären Zellen bei neun Fohlen nach der
Applikation von Clarithromycin (7,5mg/kg) (1. Kinetik) und nach kombinierter Applikation
von Clarithromycin (7,5 mg/kg) mit Rifampicin (10 mg/kg) (2. Kinetik).
Bronchialschleimhaut
ABCB1 ABCC2 18S
Fohlen Nr. 1.Kinetik 2. Kinetik 1. Kinetik 2. Kinetik 1. Kinetik 2. Kinetik
1 33,4 29,2 32,9 34,2 16,7 14,4
2 31,4 30,7 33,9 35,3 14,3 14,9
3 30,9 31,4 32,8 34 15,5 14,7
4 30,6 30,2 32,6 34,9 16,7 16
5 30,9 30,9 31,5 34,5 15,3 15,8
6 30,2 30,4 31,5 35,1 15,3 16,2
7 30,1 31,1 31,4 34,9 15,5 16
8 30,9 29,9 31,8 34,8 15,3 15,6
9 29,9 29,9 32,4 34,9 15 17,3
Bronchoalveoläre Zellen
ABCB1 ABCC2 18S
Fohlen Nr. 1.Kinetik 2. Kinetik 1. Kinetik 2. Kinetik 1. Kinetik 2. Kinetik
2 35 37 33,9 33 14,1 15,3
3 35,3 34,4 32,8 34,7 14,5 14,6
4 33,8 34 32,6 33,3 15,9 14,9
5 36,3 33,9 31,5 32,8 16 14,3
6 36,4 34,5 31,5 33,6 14,7 14,7
7 36,6 36 31,4 34,5 16,3 15,2
8 34,3 35,3 31,8 33,3 16,1 14,9
9 35,5 34,1 32,4 33,4 15,9 14,9
Ergebnisse
- 88 -
4.6 Ratios
Die gemessenen Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin in den
verschiedenen Proben der neun Fohlen (Plasma, BALF/PELF und BAC) wurden
zueinander ins Verhältnis gesetzt, um zum Beispiel die Anreicherung eines Wirkstoffes
in einem der Gewebe deutlich zu machen.
In der Abb. 15 ist das Verhältnis der Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-
Clarithromycin zwischen den bronchoalveolären Zellen und der entsprechenden
Konzentration im Plasma, 12 Stunden nach der letzten Applikation von Clarithromycin
dargestellt. Die Ratio BAC/C12h-Plasma betrug nach der alleinigen Applikation von
Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) für Clarithromycin 757,27 ± 478,28 und für
seinen Metaboliten 44,20 ± 17,12. Nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin
(7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) betrug die Ratio der
Clarithromycinkonzentration in den BAC zum Plasma 837,96 ± 448,58, die von 14-OH-
Clarithromycin 63,01 ± 19,97.
Des Weiteren wurde die Ratio PELF/C12h-Plasma ausgerechnet. Hier betrug die Ratio für
die Clarithromycinkonzentration nach der Monotherapie 36,09 ± 14,80 und nach der
Kombinationstherapie 61,95 ± 48,62. Das Verhältnis der Konzentration von 14-OH-
Clarithromycin in der PELF zum Plasma betrug nach Monotherapie 4,82 ± 1,86 und
nach Kombinationstherapie 4,88 ± 2,02. Diese Verhältnisse sind der Abb. 16 zu
entnehmen. Das Verhältnis der Clarithromycinkonzentration in den bronchoalveolären
Zellen zur PELF betrug nach der Monotherapie 25,75 ± 23,04 und nach der
Kombinationstherapie 14,27 ± 6,79. Für 14-OH-Clarithromycin lag das Verhältnis nach
der alleinigen Applikation von Clarithromycin bei 11,24 ± 9,14, nach der kombinierten
Applikation von Clarithromycin und Rifampicin 14,15 ± 4,90. Diese Ergebnisse sind in
der Abb. 17 dargestellt.
Ergebnisse
- 89 -
1. BAL 2. BAL0
300
600
900
1200
1500
BA
C/C
12 h
Clarithromycin 14-OH-Clarithromycin
Abb. 15: Verhältnis der Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin
in den bronchoalveolären Zellen zum Plasma zum Zeitpunkt der 1. BAL
(Monotherapie mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)) und zum Zeitpunkt der
2. BAL (Kombinationstherapie: Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)) bei neun Fohlen.
Ergebnisse
- 90 -
1. BAL 2. BAL0
30
60
90
120
PE
LF/C
12 h
Clarithromycin 14-OH-Clarithromycin
Abb. 16 : Verhältnis der Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin
in der PELF zum Plasma zum Zeitpunkt der 1. BAL (Monotherapie mit
Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)) und zum Zeitpunkt der 2. BAL
(Kombinationstherapie: Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin
(10 mg/kg, p.o., q 12 h)) bei neun Fohlen.
Ergebnisse
- 91 -
1. BAL 2. BAL0
10
20
30
40
50
60
BA
C/P
ELF
Clarithromycin 14-OH-Clarithromycin
Abb. 17 : Verhältnis der Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin
in den bronchoalveolären Zellen zur PELF zum Zeitpunkt der 1. BAL
(Monotherapie mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)) und zum Zeitpunkt der
2. BAL (Kombinationstherapie: Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)) bei neun Fohlen.
Ergebnisse
- 92 -
4.7 Korrelation der Konzentration von Clarithromyci n im Plasma und in den
bronchoalveolären Zellen
Die Berechnung der Korrelation der Konzentration von Clarithromycin im
Gesamtorganismus, angegeben als AUC mit der Konzentration in den
bronchoalveolären Zellen, um den Grad der Stärke der Abhängigkeit zwischen der
Konzentration von Clarithromycin in beiden Probenarten zu ermitteln, erfolgte nach
SPEARMAN. Der Rangkorrelationskoeffizient für die alleinige Applikation von
Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h ) beträgt für die AUC mit den BAC R2 = 0,841.
Nach der zusätzlichen Gabe von 10 mg/kg Rifampicin (p.o., q 12 h) beträgt R2 = 0,865.
Die Korrelation ist in den Abbildungen 18 und 19 dargestellt.
Ergebnisse
- 93 -
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
R2 = 0.841
Cla
rithr
omyc
in (
ng/m
l) in
BA
C
AUC (ng×h/ml)
Abb. 18: Korrelation der Konzentration von Clarithromycin in den bronchoalveolären
Zellen zur AUC nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h).
Ergebnisse
- 94 -
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00
5
10
15
20
25
30
R2 = 0.865
Cla
rithr
omyc
in (
ng/m
l) in
BA
C
AUC (ng×h/ml)
Abb. 19: Korrelation der Konzentration von Clarithromycin in den bronchoalveolären
Zellen zur AUC nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h).
4.8 Ergebnisse der Blutchemie nach der Monotherapie und nach der Kombination
Clarithromycin/Rifampicin
Im Rahmen der Blutentnahme an Tag 7 und an Tag 21 wurden in der ersten Blutprobe
im Plasma verschiedene blutchemische Parameter bestimmt. Die gemessenen Werte
sind der Tab 16 zu entnehmen.
Ergebnisse
- 95 -
Tab. 16: Biochemischen Blutparameter bei neun Fohlen an Tag 7 und an Tag 21
Parameter Tag 7 Tag 21
Natrium in mmol/L 132,11 ± 1,90 133,44 ± 1,01
Kalium in mmol/L 3,63 ± 0,22 3,69 ± 0,24
Chlorid in mmol/L 96,89 ± 2,52 97,78 ± 2,91
Calcium in mmol/L 2,91 ± 0,09 2,90 ± 0,11
AP in U/L 371,11 ± 72,65 373,89 ± 96,40
LDH in U/L 427,67 ±87,61 435,00 ± 85,72
Crea in µmol/L 97,11 ± 10,35 101,89 ± 9,08
Urea in mmol/L 1,63 ± 0,38 1,74 ± 0,59
AST in U/L 91,44 ± 9,81 90,00 ± 12,82
GGT in U/L 17,44 ± 2,74 16,56 ± 2,19
GLDH in U/L 4,71 ± 2,33 3,70 ± 1,05
AP: Alkalische Phosphatase; LDH: Laktatdehydrogenase; Urea: Harnstoff; Crea:
Creatinin; AST: Aspartat-Amino-Transferase; GGT: Gamma-Glutamyl-Transferase;
GLDH: Glutamatdehydrogenase
4.9 Auftreten von Nebenwirkungen
Nach der peroralen Verabreichung von Clarithromycin in einer Dosierung von 7,5 mg/kg
Körpergewicht, alle zwölf Stunden wurden über einen Zeitraum von sieben Tagen weder
bei Fohlen noch bei Mutterstuten Nebenwirkungen festgestellt. Auch bei der
kombinierten Gabe von Clarithromycin in einer Dosierung von 7,5 mg/kg und Rifampicin
in einer Dosierung von 10 mg/kg zweimal täglich über einen Zeitraum von 13 Tagen
traten bei den Fohlen und Mutterstuten keine unerwünschten Arzneimittelwirkungen auf.
Diskussion
- 96 -
5 Diskussion
Ziel der Arbeit war es, die Konzentration von Clarithromycin und seinem Metaboliten im
Plasma, in der PELF und in den bronchoalveolären Zellen beim Fohlen zu bestimmen
und daraus pharmakokinetische Parameter abzuleiten. Die Bestimmung der
Konzentrationen erfolgte bei den Fohlen nach der alleinigen Applikation von
Clarithromycin und nach der kombinierten Gabe von Clarithromycin mit Rifampicin.
Dabei sollte überprüft werden, ob bei einer kombinierten Therapie die Konzentration von
Clarithromycin in den verschiedenen Proben durch die zusätzliche Gabe von Rifampicin
sinkt. Sollte die Hypothese bestätigt werden, so müsste die Dosierung der Wirkstoffe
überdacht werden.
5.1 Probanden
In die Studie wurden neun gesunde Warmblutfohlen aufgenommen. Die Fohlen wurden
in einem Zeitraum von 10 Wochen auf einem Zuchtbetrieb geboren und unter gleichen
Bedingungen gehalten, so dass die Untersuchungsgruppe sehr homogen war. Zu
Studienbeginn waren die Fohlen zwischen 40 und 60 Tagen alt. Dieses Alter wurde
ausgewählt, da es dem Alter entspricht, in dem das Bakterium R. equi beim Fohlen
schwere und oft lebensbedrohliche, abszedierende Bronchopneumonien verursacht
(MARTENS et al., 1982; ELLENBERGER und GENETZKY, 1986; AINSWORTH, 1999;
GIGUÈRE , 2000) und die Fohlen mit Antiinfektiva behandelt werden. Zur Therapie der
Rhodococcose wird Rifampicin in Kombination mit einem Makrolidantibiotikum
eingesetzt. Eines der neueren eingesetzten Makrolidantibiotika ist Clarithromycin, also
das Antibiotikum für die die Konzentrationen in dieser Studie untersucht wurden. In einer
ähnlichen Untersuchung (WOMBLE et al. 2006) zur Pharmakokinetik von Clarithromycin
waren die Fohlen mit einem Alter von zwei bis drei Wochen jünger, so dass die
Ergebnisse mit denen der hiesigen Studie gut zu vergleichen sind.
Diskussion
- 97 -
5.2 Ergebnisse
5.2.1 Hintergründe zum Design der Studie
Um zu gewährleisten, dass es sich bei den gemessenen Clarithromycinkonzentrationen
um Steady-State Konzentrationen handelt, wurden die Fohlen über einen Zeitraum von
sechs Tagen zweimal täglich, in der für Menschen analogen und von JACKS et al.
(2002) empfohlenen Dosierung, mit 7,5 mg/kg per os behandelt. Der Zeitraum von
sechs Tagen wurde deshalb gewählt, weil Steady-State Konzentrationen nach fünf
Halbwertszeiten des eingesetzten Arzneimittels erreicht werden (MUTSCHLER et al.,
2001). Da die Halbwertszeit von Clarithromycin beim Fohlen nach der einmaligen
intravenösen Gabe von 7,5 mg/kg 5,4 Stunden beträgt (WOMBLE et al., 2006) wären
Steady-State Konzentrationen auf dieser Grundlage nach 27 Stunden erreicht.
Entscheidend ist dabei das gewählte Dosierungsintervall was in der Regel zwei
Halbwertszeiten betragen sollte. Möglicherweise würden Steady-State Konzentrationen
jedoch nach so kurzer Zeit nicht erreicht werden, da es sich bei diesem Model der fünf
Halbwertszeiten um eine rein mathematische Annahme unter optimalen Bedingungen
handelt (Annahme Kinetik 1. Ordnung, basierend auf nur einer Halbwertszeit und 1-
Kompartment System) und das Dosierungsintervall in der vorliegenden Studie zwölf
Stunden betrug. Deshalb wurde hier ein Studiendesign mit sieben Behandlungstagen
gewählt, so dass Steady-State Konzentrationen sicher erreicht wurden.
5.2.2 Konzentrationen von Clarithromycin im Plasma von Fohlen
Die Konzentration von Clarithromycin im Plasma der Fohlen der vorliegenden
Untersuchung, angegeben als AUC über das Dosierungsintervall von 12 Stunden,
beträgt 5545 ± 4420 ng x h/ml. Ähnliche Konzentrationen beschreiben JACKS et al.
(2002) im Serum nach der einmaligen intragastralen Gabe von 10 mg/kg über eine
Nasenschlundsonde mit einer AUC von 6600 ± 1420 ng x h/ml. WOMBLE et al. (2006)
wiesen nach der einmaligen intravenösen Gabe von 7,5 mg/kg eine ebenfalls ähnliche
AUC von 6200 ± 1500 ng x h/ml nach. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen,
dass Clarithromycin nach der sorgfältigen Applikation in das Fohlenmaul ausreichend
abgeschluckt wird, die Passage durch den Magen übersteht und im Darm gut resorbiert
Diskussion
- 98 -
wird. Dass die Konzentrationen in der vorliegenden Studie geringer sind (5545 ± 4420
ng x h/ml) als die von JACKS et al. (2002) mit 6600 ± 1420 ng x h/ml beschriebenen
liegt an der in der vorliegenden Studie gewählten, niedrigeren Dosierung von 7,5 mg/kg,
die als die übliche therapeutische Dosis gilt.
Nach der sechsmaligen intragastralen Gabe von 7,5 mg/kg, q 12h betrug die AUC bei
WOMBLE et al. (2006) mit 3400 ± 1100 ng x h/ml deutlich weniger als die Konzentration
von 5545 ± 4420 ng x h/ml die in der vorliegenden Studie ermittelt wurde. Es ist davon
auszugehen ist dass auch bei WOMBLE et al. (2006) nach 72 Stunden und
sechsmaliger Applikation von Clarithromycin Steady State Konzentrationen erreicht
worden sind. Für die Abweichungen in der Konzentration der AUC könnten
Unterschiede in der Methodik, z.B. in der Formulierung des Arzneimittels verantwortlich
gemacht werden. So verwendete WOMBLE et al. (2006) Tabletten, die sie zermörsert in
Wasser lösten, wohingegen in dieser Studie ein im Handel erhältlicher Saft verwendet
wurde. Die Autorin nimmt an dass diese unterschiedlichen Formulierungen einen
Einfluss auf die Bioverfügbarkeit des Clarithromycins haben und somit andere
Konzentrationen erreicht werden. Eine abschließende Begründung kann derzeit nicht
genannt werden. In der vorliegenden Studie fällt eine große Streuung in den
Clarithromycinkonzentrationen auf, was wiederum auf die variablen Konzentrationen die
bei einzelnen Fohlen im Plasma gemessen wurden, zurückzuführen ist.
Weitere Parameter wie die maximale Clarithromycinkonzentration im Plasma (Cmax) und
die Zeit (tmax) bis diese maximale Konzentration erreicht worden ist, wurden ermittelt. Die
Cmax wird überwiegend von der Geschwindigkeit und dem Ausmaß der Resorption
beeinflusst (DERENDORF et al., 2002) und die tmax wird vor allem von der Resorptions-
und der Eliminationsgeschwindigkeit bestimmt (DERENDORF et al., 2002). In der
vorliegenden Arbeit wurde im Plasma eine Cmax in Höhe von 614 ± 365 ng/ml bei einer
tmax von 3,7 ± 1,8 Stunden erreicht. JACKS et al. (2002) haben 1,5 Stunden nach der
intragastralen Applikation von 10 mg/kg Clarithromycin maximale Serumkonzentrationen
von 920 ± 170 ng/ml gemessen, WOMBLE et al. (2006) wiesen nach der sechsten
Applikation von 7,5 mg/kg p.o., q 12 h bei einer tmax von 1,6 ± 0,4 Stunden eine Cmax von
880 ± 119 ng/ml nach. Die maximale Clarithromycinkonzentration in der vorliegenden
Studie liegt also um 266 ng/ml unter der Konzentration, die WOMBLE et al. (2006) nach
drei Tagen Clarithromycingabe gemessen hat. Die tmax ist in der vorliegenden Studie
Diskussion
- 99 -
länger. Für diese unterschiedlichen Werte können Unterschiede in der
Verabreichungsform der Medikamente verantwortlich gemacht werden. Die Ergebnisse
könnten auf eine unterschiedliche Passagezeit der Antibiotika durch den Magen
hinweisen. Erklären lässt sich dies dadurch, dass die Magenmotilität von
Nahrungsmenge, Zusammensetzung, Konsistenz, Temperatur, Osmolarität und
Energiegehalt der Nahrung bestimmt wird (DERENDORF et al., 2002). Die Fohlen
hatten in beiden Studien jeder Zeit Zugang zur Stute, zu Wasser und Heu. Eine
raschere Resorption des Arzneistoffes durch einen nüchternen Magen kann folglich hier
ausgeschlossen werden. Darüber hinaus kann die Wahl der Arzneiform die
Zusammensetzung des Mageninhaltes beeinflussen. In der vorliegenden Studie wurde
ein im Handel für Menschen erhältlicher Saft eingesetzt und in den beiden anderen
Studien wurden Clarithromycin Tabletten in 50 ml (WOMBLE et al., 2006) bzw. in 100 ml
(JACKS et al., 2002) Wasser aufgelöst. Die Freisetzung des Clarithromycins aus dem
Saft könnte langsamer erfolgen als aus den in Wasser aufgelösten Tabletten. Auch die
Zusammensetzung des visköseren Saftes könnte die Magenmotilität beeinflussen. So
verzögern zum Beispiel fettreiche oder visköse Stoffe die Magenentleerung
(DERENDORF et al., 2002).
Die Halbwertszeit von Clarithromycin beträgt laut WOMBLE et al. (2006), gemessen
nach der einmaligen intravenösen Applikation von 7,5 mg/kg, 5,4 Stunden. Nach der
einmaligen Applikation von 10 mg/kg p.o. beträgt sie 4,9 Stunden (JACKS et al., 2002).
In der vorliegenden Untersuchung beträgt die Halbwertszeit für Clarithromycin nach der
dreizehnmaligen Applikation (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) 6,11 ± 0,83 Stunden und liegt
damit etwas höher als bei JACKS et al. (2002) und WOMBLE et al. (2006). Im Vergleich
zu den anderen bei der R. equi-Pneumonie eingesetzten Makroliden ist die
Halbwertszeit von Clarithromycin auch hier länger als die von Erythromycin und mit
einer Stunde und kürzer als die von Azithromycin mit 16 bis 20 Stunden (PRESCOTT et
al., 1983; LAKRITZ et al., 1999, 2000; JACKS et al., 2001; DAVIS et al., 2002). Die
Halbwertszeit von Tulathromycin mit 108 ± 25 Stunden (SCHOCK, 2008) ist deutlich
höher als die von Clarithromycin.
Da die Halbwertszeit in dieser Studie mit 6,11 Stunden über der von JACKS et al. (2002)
ermittelten (4,9 h) liegt, kann das von diesen Autoren vorgeschlagene
Dosierungsintervall für Clarithromycin von zwölf Stunden weiterhin empfohlen werden.
Diskussion
- 100 -
Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Studie 48 Stunden nach der letzten
Applikation von Clarithromycin im Plasma der neun Fohlen, bei zwei Fohlen keine
Clarithromycinkonzentrationen mehr gemessen werden. Dies zeigt, dass die Elimination
von Clarithromycin aus dem Körper schnell erfolgt.
5.2.3 Konzentrationen von Clarithromycin in der PEL F und in bronchoalveolären
Zellen bei neun Fohlen
Neben der Bestimmung der Clarithromycinkonzentrationen im Plasma wurden im
Rahmen der vorliegenden Untersuchung auch die Konzentrationen von Clarithromycin
in der PELF und in den bronchoalveolären Zellen der Fohlen bestimmt. Diese Proben
sollen am ehesten die Konzentration des Wirkstoffes im Zielorgan, nämlich in der Lunge,
widerspiegeln. WOMBLE et al. haben 2006 ebenfalls in diesen Kompartimenten die
Konzentrationen von Clarithromycin nach der sechsmaligen, intragastralen Applikation
von 7,5 mg/kg, q 12 h an sechs Fohlen bestimmt.
In der vorliegenden Untersuchung wurde die bronchoalveoläre Lavage mit 400 ml PBS-
Lösung durchgeführt und stets mehr als die Hälfte (58,6 %) der instillierten Flüssigkeit
wurde zurückgewonnen. Die Berechnung der PELF erfolgte wie auch bei WOMBLE et
al. (2006) nach der von RENNARD et al. (1986) beschriebenen Methode, die auf der
Bestimmung von Harnstoff in Plasma und BALF beruht. Bei wiederholten
Spülvorgängen diffundiert Harnstoff in die Alveolen, so dass unter Umständen zu hohe
Harnstoffkonzentrationen bestimmt werden, wodurch das Volumen der PELF häufig
überschätzt wird (PETERSON et al., 1993). Um diesen Fehler möglichst gering zu
halten, waren in der vorliegenden Studie sämtliche Vorgänge im Rahmen der
Probengewinnung (insbesondere die Wahl des Bronchus und die Verweilzeit der
Flüssigkeit im Alveolarraum) standardisiert. Hier zeugt die hohe und einheitliche
Rückgewinnung von einer optimalen Methode.
In der vorliegenden Studie betrug das errechnete Volumen der PELF 16,32 ± 5,65 ml.
An Tag 7 betrug die Konzentration von Clarithromycin in der PELF der neun Fohlen 9,50
± 6,13 µg/ml. WOMBLE et al. (2006) beschreiben zwölf Stunden nach der letzten
Applikation der sechs Dosen eine 2,5 fach höhere Konzentration von 21,36 ± 20,53
µg/ml in der PELF. Dieser Unterschied lässt sich teilweise dadurch erklären, dass
Diskussion
- 101 -
WOMBLE et al. (2006) die BAL mit insgesamt nur 200 ml, aufgeteilt auf vier Portionen,
durchgeführt hat. Die Autorin nimmt an, dass sich der Unterschied durch die in dieser
Studie eingesetzte größere Menge an Spülflüssigkeit (400 ml) erklären lässt. Die
Kontaktzeit der PBS-Lösung mit dem Lungenepithel ist durch das größere Volumen
verlängert und somit ebenfalls die Dauer der Rückgewinnung (KIRSCHVINK et al.,
2001), wodurch die Diffusion von Harnstoff in die BALF steigt. Insgesamt konnte der
methodische Fehler in der Durchführung der Rückgewinnung gering gehalten werden,
was die einzelnen Werte der Fohlen für die Volumina der PELF belegen. Die Autorin
geht davon aus, dass es in der vorliegenden Studie durch eine vermehrte Diffusion von
Harnstoff vom Interstitium in das Alveolarlumen zu einer Überschätzung des PELF-
Volumens gekommen ist. Dadurch erscheinen die in dieser Studie ermittelten
Konzentrationen in der PELF geringer als die von WOMBLE et al. (2006). Allerdings
machen WOMBLE et al. (2006) weder Angaben darüber wie hoch das Volumen der
BALF noch das der PELF der Fohlen war. Somit lässt sich keine abschließende
Aussage darüber treffen, ob das Volumen in deren Studie überschätzt worden ist.
Die gemessene Antibiotikakonzentrationen in ng/GZ wurden in der vorliegenden Studie
wie auch bei JACKS et al. (2001) auf ng/ml Zellvolumen umgerechnet, um sie mit den
Konzentrationen von Clarithromycin und seinem Metaboliten im Plasma, in der PELF
und mit den Werten anderer Arbeiten vergleichen zu können. Sie geben das Volumen
für eine Gigazelle mit 1,2 µl an, dieser Wert entspricht den von Ihnen gemachten
Beobachtungen. WOMBLE et al. (2006) übernahmen dieses Zellvolumen ebenfalls.
Die Konzentration von Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen der Fohlen der
vorliegenden Arbeit betrug 263,81 ± 375,36 µg/ml Zellvolumen und liegt somit um das
2,3 fache höher als die Konzentration, die WOMBLE et al. (2006) zwölf Stunden nach
der letzten Applikation gemessen haben (117,27 ± 107,84 µg/ml). Diese Abweichungen
können durch die höhere Empfindlichkeit der LC-MS/MS gegenüber einem
mikrobiologischen Test, wie WOMBLE et al. (2006) ihn verwendet haben, begründet
werden.
Diskussion
- 102 -
5.2.4 Gemeinsame Betrachtung der Konzentrationen vo n Clarithromycin im
Plasma, in der PELF und in den bronchoalveolären Ze llen
Zum Zeitpunkt der Gewinnung der PELF und der bronchoalveolären Zellen betrug die
Konzentration von Clarithromycin in der vorliegenden Studie im Plasma der Fohlen nach
Monotherapie 0,30 ± 0,27 µg/ml. Gleichzeitig betrug die Konzentration des Wirkstoffes
in den bronchoalveolären Zellen ein Tausendfaches und in der PELF ein Dreißigfaches,
so dass von einer starken Anreicherung von Clarithromycin in beiden Kompartimenten
auszugehen ist. Diese Unterschiede der Konzentrationen von Clarithromycin in den
verschiedenen Kompartimenten entspricht auch den von WOMBLE et al. (2006) und
SUAREZ-MIER et al. (2007) gemachten Beobachtungen und ist für den Erfolg Therapie
der R. equi Pneumonie des Fohlens wesentlich, da der Erreger sich in den
Makrophagen persistiert und sich in diesen Zellen vermehrt (ELLENBERGER et al.,
1984; PRESCOTT und SWEENEY, 1985; HONDALUS und MOSSER; 1994).
5.2.5 Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin im P lasma, in der PELF und in
den bronchoalveolären Zellen
14-OH-Clarithromycin ist einer der acht beim Menschen beschriebenen Metaboliten von
Clarithromycin und er ist der einzige, der eine antimikrobielle Aktivität aufweist
(FERNANDES et al., 1988; FERRERO et al., 1990). WOMBLE et al. (2006) wiesen
erstmals 14-OH-Clarithromycin im Serum von sechs Fohlen mittels HPLC nach. Im
Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurden die Konzentrationen von 14-OH-
Clarithromycin im Plasma und außerdem noch in der PELF und in den
bronchoalveolären Zellen bei Fohlen bestimmt. Dadurch sollte festgestellt werden, ob es
im Rahmen der Kombinationstherapie Clarithromycin/Rifampicin zu einer gesteigerten
Metabolisierung von Clarithromycin kommt. Nach 3,56 ± 2,59 Stunden werden maximale
Plasmakonzentrationen von 14-OH-Clarithromycin erreicht (161 ± 69,9 ng/ml). Diese
Ergebnisse lassen erkennen, dass bereits früh hohe Konzentrationen des Metaboliten
zu messen sind. Dies wiederum lässt auf einen schnell einsetzenden Abbau von
Clarithromycin schließen. Die Halbwertszeit des Metaboliten von Clarithromycin ist mit
8,11 ± 1,61 Stunden länger als die von Clarithromycin (6,11 ± 0,83 Stunden), das heißt
der Metabolit wird langsamer aus dem systemischen Kreislauf eliminiert als das
Diskussion
- 103 -
Clarithromycin. Die Metabolit-Konzentrationen in der PELF und in den
bronchoalveolären Zellen weisen, wie auch die Konzentrationen von Clarithromycin, auf
eine Anreicherung in den bronchoalveolären Zellen und in der PELF im Vergleich zu den
Plasmakonzentrationen hin. Diese Anreicherung des Metaboliten in der PELF und in
den bronchoalveolären Zellen kann wie beim Clarithromycin einen therapeutischen
Nutzen bedeuten, wenn der Metabolit wie für die Humanmedizin beschrieben auch
gegen R. equi eine antimikrobielle Aktivität aufweist (FERNANDES et al., 1988;
FERRERO et al., 1990).
5.2.6 Beeinflussung der Konzentration von Clarithro mycin und 14-OH-
Clarithromycin durch die zusätzliche Gabe von Rifam picin im Plasma
Ein Hauptfokus der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, wie die Konzentration
von Clarithromycin bzw. von seinem Metaboliten in den verschiedenen Proben durch die
zusätzliche Gabe von Rifampicin beeinflusst wird. Da Rifampicin als starker Induktor von
Enzymsystemen bekannt ist, ist zu erwarten, dass es bei der kombinierten
Verabreichung von Rifampicin mit Clarithromycin zu Interaktionen kommt. Die
kombinierte Therapie kann sogar die Wirkung des zweiten Präparates erheblich
reduzieren (SIEGMUND et al., 2002). Verschiede Mechanismen spielen dabei eine
Rolle. Rifampicin kann durch die Bindung an den Pregnane-X-Rezeptor (PXR) die
Transkription im Zellkern unspezifisch erhöhen (FUHR, 2000). Da die Bindung der
Kernrezeptorkomplexe an die jeweiligen Promotor-Bindungsstellen nicht spezifisch ist,
werden nicht nur am Abbau von Makroliden beteiligte CYP-Enzyme sondern auch
Proteine, die am Transport von Arzneimitteln beteiligt sind, vermehrt synthetisiert
(FROMM et al., 2000; GEICK et al., 2001; RAE et al., 2001).
Eine Arbeitshypothese der vorliegenden Untersuchung war, dass Rifampicin die
Expression transmembranärer Proteine beeinflusst, die am Transport von Clarithromycin
aus der Blutzirkulation in die PELF bzw. in die bronchoalveolären Zellen beteiligt sind.
Clarithromycin wird z. B. von ABCB1/P-gp und ABCC2/MRP-2 transportiert (SIEGMUND
et al., 2002, 2003). Entsprechende Transporterproteine könnten hierbei am Endothel der
Lungenkapillaren, an der Bronchialschleimhaut oder am Alveolarepithel lokalisiert sein.
Außerdem werden auch von Makrophagen Transporterproteine exprimiert (VAN DER
DEEN et al., 2005). Beim Menschen liegen genügend Beweise dafür vor, dass die
Diskussion
- 104 -
intrapulmonale Verteilung von Arzneimitteln über das Gefäßendothel, das Bronchial-
und Alveolarepithel und in die Alveolarmakrophagen von verschiedenen
Transporterproteinen beeinflusst wird (VAN DER DEEN et al., 2005). Die Akkumulation
von Clarithromycin in der PELF und in den bronchoalveolären Zellen könnte also von
Aufnahme- und Effluxtransportern abhängig sein. In einer anderen Arbeit wurde bereits
gezeigt, dass beim Fohlen die Transporterproteine P-gp und MRP-2 an
bronchoalveolären Zellen vorkommen (HÖHENSTEIGER, 2005). Würde beispielsweise
Rifampicin Effluxtransporter an den bronchoalveolären Zellen und an den Epithelien der
Atemwege hemmen, würde die Konzentration von Clarithromycin in den Zellen steigen
und in der PELF sinken. Andersherum würde bei einer Induktion, d. h. bei einer
gesteigerten Expression dieser Proteine, die Konzentration von Clarithromycin in den
bronchoalveolären Zellen sinken und in der PELF steigen.
Um hierüber Aussagen treffen zu können, wurden zwei aufeinander folgende Kinetiken
an Fohlen durchgeführt. So wurden die Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-
Clarithromycin nach Mono- und nach Kombinationstherapie verglichen. Hier wurde
methodisch dafür Sorge getragen, dass die Fohlen am Tag vor der BAL nur
Clarithromycin erhalten haben und somit eine direkte Interaktion mit Rifampicin an den
beteiligten Resorptions- und Verteilungsmechanismen ausgeschlossen wurde.
Nach der zusätzlichen Gabe von Rifampicin kam es zu einer signifikanten Senkung der
Clarithromycinkonzentration im Plasma im Vergleich zu der Monotherapie. Die Zeit bis
zum Erreichen der maximalen Plasmakonzentrationen von Clarithromycin nach der
kombinierten Behandlung der Fohlen war nicht signifikant kürzer (2,8 ± 1,8 Stunden
versus 3,7 ± 1,8 Stunden). Auch die Halbwertszeit von Clarithromycin wurde durch die
zusätzliche Gabe von Rifampicin nicht beeinflusst. Dies bedeutet, dass ein
beschleunigter Abbau von Clarithromycin, der die geringeren Konzentrationen erklären
könnte, unwahrscheinlich ist. Für den Metaboliten von Clarithromycin, 14-OH-
Clarithromycin, wurden die gleichen Beobachtungen gemacht. Außerdem verkürzte sich
die Halbwertszeit von 14-OH-Clarithromycin signifikant (8,1 ± 1,6 h zu 5,1 ± 0,9 h) nach
der Kombinationstherapie. Der Abbau des Metaboliten erfolgt demnach nach der
zusätzlichen Gabe von Rifampicin schneller. Möglicherweise wird der Metabolit von
Enzymsystemen abgebaut, die durch Rifampicin induziert werden. Vergleichsarbeiten
liegen hierfür nicht vor.
Diskussion
- 105 -
5.2.7 Beeinflussung der Genexpression für ABCB1 und ABCC2 in
Bronchialschleimhautzellen und in bronchoalveoläre Zellen durch Rifampicin
Bisher ist noch unklar in wieweit Transporterproteine in der Lunge des Fohlens an der
Anreicherung von Antibiotika beteiligt sind. In dieser Studie wurde dafür beispielhaft die
Expression von ABCB1 und ABCC2 in den Bronchialschleimhaut- und
bronchoalveolären Zellen von Fohlen untersucht. Diese beiden Proteine wurden
gewählt, da sie an bronchoalveolären Zellen des Fohlens bereits nachgewiesen wurden
(VENNER et al., 2009) und P-gp darüber hinaus das am besten untersuchte
Transporterprotein darstellt (SIEGMUND et al., 2003 a/b).
In der vorliegenden Untersuchung konnte erstmals festgestellt werden, dass sich die
Expression von ABCB1 (P-gp) in den bronchoalveolären Zellen nach der kombinierten
Behandlung der Fohlen mit Rifampicin und Clarithromycin im Vergleich zur alleinigen
Clarithromycin-Gabe nicht unterscheidet. Für ABCC2 (MRP-2) wurde nach der
kombinierten Gabe von Clarithromycin mit Rifampicin hingegen eine signifikante
Senkung der Genexpression in den bronchoalveolären Zellen nachgewiesen. Diese
Situation erklärt jedoch nicht den Abfall der Clarithromycinkonzentration in den
bronchoalveolären Zellen, da es sich hierbei um einen Auswärtstransporter handelt. Im
Gegenteil, nach der beschriebenen Theorie hätten die Clarithromycinkonzentrationen in
den Zellen steigen müssen. Ähnlich wie für ABCB1 in den bronchoalveolären Zellen
stellen sich die Ergebnisse von ABCB1 und ABCC2 in den Zellen der
Bronchialschleimhaut dar. Hier konnten für beide Proteine keine signifikanten
Unterschiede festgestellt werden. In den Zellen der Bronchialschleimhaut zeichnete sich
für ABCC2 die Tendenz ab, dass die Genexpression in den Schleimhautzellen nach der
zusätzlichen Gabe von Rifampicin gesunken ist. Um hier genauere Aussagen treffen zu
können müsste eine größere Gruppe von Fohlen untersucht werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass es keinen, wie zuvor angenommen, induktorischen
Einfluss von Rifampicin auf die hier gewählten Transporterproteine in den Membranen
der bronchoalveolären Zellen und in Bronchialschleimhautzellen gibt. Die verringerte
Konzentration von Clarithromycin in der PELF und in den bronchoalveolären Zellen der
Fohlen nach der Kombinationstherapie mit Rifampicin lässt sich aufgrund der
Expression dieser Effluxtransporter somit nicht belegen.
Diskussion
- 106 -
5.2.8 Beeinflussung der Konzentrationen von Clarith romycin und 14-OH-
Clarithromycin durch Rifampicin im Plasma, in der P ELF und in den
bronchoalveolären Zellen
Die Hypothese, dass die Konzentrationen von Clarithromycin und seinem Metaboliten
durch die zusätzliche Verabreichung von Rifampicin beeinflusst bzw. herabgesetzt
werden, konnte in dieser Studie bestätigt werden. Nicht belegt werden konnte die
Theorie, dass die Interaktion zwischen Rifampicin und dem Makrolidantibiotikum auf der
Ebene der hier untersuchten intrapulmonalen Transporterproteine abläuft. Dieses
Ergebnis schließt jedoch nicht aus, dass andere Transporterproteine an der
intrapulmonalen Verteilung der Antibiotika beteiligt sein können. Neben
Effluxtransportern wäre es zum Beispiel denkbar, dass an den Makrophagen lokalisierte
Aufnahmetransporter weniger exprimiert werden und es so zu einer Senkung der
Konzentration von Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen kommt. Die
Expression entsprechender Proteine wurde in dieser Studie nicht untersucht.
Einen anderen Erklärungsansatz für die geringeren Konzentrationen von Clarithromycin
im Plasma, in der PELF und in den bronchoalveolären Zellen nach der
Kombinationstherapie stellen Interaktionen auf intestinaler Ebene dar. Die AUC im
Plasma sinkt nach der kombinierten Gabe von Clarithromycin und Rifampicin im
Vergleich zur alleinigen Gabe signifikant. Das bedeutet, dass nach der
Kombinationstherapie insgesamt weniger Clarithromycin in den Körperkreislauf gelangt
ist. Es ist anzunehmen, dass deshalb ebenfalls die Konzentration in der PELF und in
den bronchoalveolären Zellen sinkt. Die Abhängigkeit der Konzentration in den
bronchoalveolären Zellen von der Gesamtkonzentration im Plasma kommt in der
errechneten Korrelation zum Ausdruck (Korrelation BAC/AUC Monotherapie R2 = 0,841;
Kombinationstherapie R2 = 0,865). Möglicherweise kommt es bereits bei der intestinalen
Resorption der beiden Antibiotika zu einer Interaktion. Clarithromycin wird in die
Enterozyten aufgenommen und gelangt an der basalen Seite in den systemischen
Kreislauf. Wird Rifampicin zusätzlich gegeben gelangt auch dieses in die Enterozyten.
Wahrscheinlich induziert Rifampicin in diesen Zellen die gesteigerte Expression von
Transporterproteinen, die die Stoffe zurück in das Darmlumen transportieren. Die
Autorin vermutet, dass hier Transporterproteine beteiligt sind, die eine Affinität für
Clarithromycin aufweisen, so dass sich die geringeren Clarithromycinkonzentrationen
Diskussion
- 107 -
nach der kombinierten Applikation erklären lassen. Ein beteiligtes Protein könnte P-gp
sein. Rifampicin wurde als starker Induktor von P-gp und MRP im menschlichen Darm
beschrieben (SIEGMUND et al. 2002) und NATALINI und LINARDI, (2005) konnten das
Vorkommen von P-gp im Ileum des Pferdes mittels PCR nachweisen. Die Autorin geht
davon aus, dass auch in anderen Darmabschnitten des Pferdes und entsprechend beim
Fohlen, P-gp und andere am Transport von Wirkstoffen beteiligte Proteine vorliegen. Um
die Hypothese der intestinalen Interaktion beider Antibiotika zu belegen, hätte hier
zusätzlich die Konzentration von Clarithromycin im Kot und im Urin bestimmt werden
müssen. Nur dann hätte die Bioverfügbarkeit von Clarithromycin genau bestimmt
werden können.
Weiterhin lassen sich die geringeren Clarithromycinkonzentrationen in den
verschiedenen Kompartimenten nach der Kombinationstherapie durch die Induktion der
am Abbau von Clarithromycin beteiligten Enzyme durch Rifampicin erklären. Es ist
belegt, dass Clarithromycin in der Leber durch das Cytochrom P450-abhängige
Monooxygenasesystem abgebaut wird (CYP) (MUTSCHLER et al., 2001; SIEGMUND et
al. 2002, 2003). Außerdem ist Clarithromycin ein starker Inhibitor (PAI et al., 2000;
WESTPHAL et al., 2000), Rifampicin hingegen ist ein starker Induktor dieses
Enzymsystems. Beim Menschen werden die Konzentrationen von Clarithromycin durch
seinen gesteigerten Abbau durch das CYP-System nach der zusätzlichen Gabe von
Rifampicin gesenkt (SIEGMUND et al., 2002). Die Ergebnisse der vorliegenden
Untersuchung zeigen, dass die Clarithromycinkonzentration nach der zusätzlichen Gabe
von Rifampicin signifikant sinkt. Die Autorin vermutet, dass nicht alleine der Abbau von
Clarithromycin den gesamten Abfall der Konzentration des Wirkstoffes zum Zeitpunkt
der zweiten BAL erklärt (s.o.). Die gesenkten Clarithromycin- und 14-OH-
Clarithromycinkonzentrationen sind wahrscheinlich viel mehr das Ergebnis des
Zusammenspiels Rifampicin induzierter intestinaler und metabolischer Prozesse.
5.2.9 Betrachtung der Konzentration von Clarithromy cin im Hinblick auf die
erforderliche MHK von R. equi für dieses Antibiotikum
In der vorliegenden Untersuchung sollte überprüft werden, ob die notwendige minimale
Hemmstoffkonzentration von R. equi gegenüber Clarithromycin im Plasma, in der PELF
Diskussion
- 108 -
und in den bronchoalveolären Zellen erreicht wurde. Insbesondere war hier die in der
Praxis übliche Applikation der beiden Antibiotika von Interesse. Rifampicin wird zur
Therapie der Rhodococcose grundsätzlich in Kombination mit einem
Makrolidantibiotikum eingesetzt, um die Selektion von resistenten Stämmen zu
vermeiden (AINSWORTH, 1999; GUIGÈRE et al., 2004). Es wäre ungünstig, wenn
durch die kombinierte Gabe beider Antiinfektiva die Konzentration von einem der beiden
oder gar beider Wirkstoffe unter die notwendige MHK sinken würden. Im Rahmen dieser
Untersuchung konnte gezeigt werden, dass die MHK90 von R. equi gegenüber
Clarithromycin von 120 ng/ml (JACKS et al., 2003) nach der alleinigen dreizehnmaligen
Applikation von 7,5 mg/kg, p.o., q 12 h Clarithromycin im Plasma erreicht wird. Nach der
zusätzlichen Gabe von Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) sinken diese Konzentrationen
im Plasma jedoch unter die MHK90 von R. equi gegenüber Clarithromycin. Dagegen
liegen die Konzentrationen von Clarithromycin in der PELF und in den
bronchoalveolären Zellen sowohl nach der Mono- als auch nach der
Kombinationstherapie deutlich über der MHK90 von R. equi gegenüber Clarithromycin.
Durch diese Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass die Behandlung von
Fohlen, die an einer R. equi Pneumonie erkrankt sind, mit der Kombination von
Clarithromycin und Rifampicin in der üblichen Dosierung wirksam sein sollte.
Da der Erreger sich hauptsächlich in den bronchoalveolären Zellen vermehrt und hier
persistiert (ELLENBERGER et al., 1984; PRESCOTT und SWEENEY, 1985;
HONDALUS und MOSSER, 1994) ist die hohe, oberhalb der MHK90 liegende
Konzentration von Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen von weitaus höherer
Bedeutung als jene im Plasma. Andere Studien haben bereits gezeigt, dass an
Rhodococcose erkrankte Fohlen während der Therapie mit Penicillin und Gentamicin
verstarben, obwohl beide Antiinfektiva sich in vitro als wirksam gegenüber R. equi
zeigten (SWEENEY et al., 1987). Das Ergebnis von SWEENEY et al. (1987) verdeutlicht
die besondere Situation bei der R. equi-Pneumonie, dass eine Therapie nur dann
erfolgreich sein kann, wenn die eingesetzten Antibiotika in die Lunge gelangen und dort
intrazellulär ausreichend hohe Wirkstoffspiegel erreichen.
Diskussion
- 109 -
5.2.10 Konzentrationen von Rifampicin im Plasma, in der PELF und in den
bronchoalveolären Zellen
Obwohl im Plasma zum Zeitpunkt der BAL, 48 Stunden nach der letzten oralen
Applikation von 10 mg/kg p.o., q 12 h noch Rifampicinkonzentrationen von 363,17 ±
184,22 ng/ml zu messen waren, ist nach wie vor unklar warum Rifampicin in der PELF
und in den bronchoalveolären Zellen zu diesem Zeitpunkt nicht nachgewiesen werden
konnte. Rifampicin wird aufgrund seines stark lipophilen Charakters in viele Gewebe
verteilt (FRANK, 1990; KOHN et al., 1993), kann Membranen von Phagozyten passieren
und intrazellulär gelegene Keime abtöten (WILSON et al., 1988; KOHN et al., 1993).
Von einer Anreicherung in der PELF und/oder in den bronchoalveolären Zellen kann
nach diesen Ergebnissen jedoch nicht ausgegangen werden. Um dieses genauer zu
untersuchen, müsste eine weitere Studie durchgeführt werden, in der die
Konzentrationen von Rifampicin im Plasma, in der PELF und in den bronchoalveolären
Zellen bestimmt werden müssten.
5.3 Akzeptanz der verabreichten Arzneimittel
Die Fohlen nahmen das zweimal täglich verabreichte Clarithromycin freiwillig und besser
als das Rifampicin auf. Diese Situation konnte durch die gemeinsame Applikation beider
Antibiotika in einer Spritze verbessert werden. Diese gemeinsame Applikation steigerte
die Akzeptanz der Fohlen auf das Maß der alleinigen Gabe von Clarithromycin.
5.4 Nebenwirkungen von Clarithromycin und Rifampici n
In der vorliegenden Studie konnten keine klinischen oder blutchemischen
Nebenwirkungen bei den Fohlen festgestellt werden. Rifampicin ist wie von BURROWS
et al. (1992) beschrieben als sicheres Arzneimittel einzustufen. Die von HILLIDGE
(1987) beschriebenen selbstlimitierenden Durchfälle in der ersten Woche nach der
Applikation von Rifampicin traten in der vorliegenden Untersuchung nicht auf. Auch
entsprechende Durchfälle nach der Clarithromycinapplikation, wie sie von GIGUÈRE et
al. (2004) beschrieben wurden, sind in dieser Studie nicht aufgetreten. Die gute
Verträglichkeit von Clarithromycin stellt einen Vorteil gegenüber anderen
Diskussion
- 110 -
Makrolidantibiotika, wie zum Beispiel Erythromycin dar. Für Erythromycin wurden
verschiedene Nebenwirkungen wie Durchfälle, Hyperthermie und Atemnot der Fohlen
oder tödlich verlaufende Colitiden bei der Begleitstute beschrieben (GUSTAFFSON et
al., 1997; BÅVERUD et al., 1998).
5.5 Beeinträchtigung der Fohlen durch die bronchoal veoläre Lavage
Die bronchoalveoläre Lavage gilt sowohl beim Menschen als auch beim adulten Pferd
und beim Fohlen als risikoarmes Untersuchungsverfahren, das dem Patienten mehrfach
zugemutet werden kann (ZINK u. JOHNSON, 1984; COSTABEL, 1986; WIEßMANN,
1987; McGORUM und DIXON, 1994). Allerdings wird beim Pferd von seltenen
traumatischen Hyperämien der Atemwegsschleimhaut, mildem Lungenbluten oder
kurzfristigem Husten, Fieber und einem Anstieg der neutrophilen Granulozyten (> 5 %)
in den Sekreten der Atemwege einige Tage nach der Lavage berichtet (McGORUM u.
DIXON, 1994).
In der vorliegenden Untersuchung stieg die Gesamtzellzahl zwischen der ersten und der
zweiten BAL Spülflüssigkeit nicht an. Auch die Differenzierung der Zellen im Sediment
der BALF liefert keinen Hinweis auf eine Entzündung, die durch die bronchoalveolären
Lavage verursacht wurde. Auch VENNER (2003) konnte an einer Gruppe der von Ihr
untersuchten Pferde zeigen, dass das von Ihr gewählte BAL-Verfahren zu keiner, weder
makroskopisch noch zellulären, wahrnehmbaren Entzündung der Atemwege führte.
In der vorliegenden Arbeit konnten auch im Rahmen der durchgeführten Zwischen- und
Abschlussuntersuchungen der Fohlen, inklusive der Ultraschalluntersuchung der Lunge,
keine pathologischen Veränderungen des peripheren Lungenparenchyms festgestellt
werden. Die Gesundheit der Fohlen wurde durch die bronchoalveolären Lavagen
demzufolge nicht beeinträchtigt.
5.6 Schlussfolgerungen
Die kombinierte Gabe von Clarithromycin mit Rifampicin im Rahmen der Therapie eines
an R. equi-Pneumonie erkrankten Fohlens führt zu einem signifikanten Abfall der
Konzentration von Clarithromycin im Plasma, in der PELF und in den bronchoalveolären
Diskussion
- 111 -
Zellen. Hier konnte der Mechanismus, der zu dieser Konzentrationssenkung führt, noch
nicht geklärt werden. Möglich wäre, dass intestinale Interaktionen der beiden Antibiotika
an dort lokalisierten Effluxtransportern die Resorption von Clarithromycin reduzieren
oder dass das Makrolidantibiotikums durch die zusätzliche Gabe von Rifampicin
vermehrt abgebaut wird.
Die hier vorgelegten Ergebnisse zeigen allerdings, dass trotz Gabe von Rifampicin die
MHK90 von R. equi gegenüber Clarithromycin in der PELF und in den bronchoalveolären
Zellen erreicht wird. So kann die übliche Dosierung von Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12
h) und Rifampicin (10 mg/kg, q 12 h) weiterhin für die Therapie der erkrankten Fohlen
empfohlen werden.
In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass 48 Stunden nach der letzten
Applikation von 10 mg/kg Rifampicin p.o. nur im Plasma Konzentrationen dieses
Antibiotikums gemessen werden konnten. In der PELF und in den BAC sank die
Rifampicinkonzentration zu diesem Zeitpunkt unter die Nachweisgrenze. Hier besteht
ein dringender Bedarf weitere Untersuchungen zur Pharmakokinetik von Rifampicin
beim Fohlen durchzuführen, inklusive der Bestimmung der Rifampicinkonzentration in
der PELF und in den BAC. Für die Therapie der an Rhodococcose erkrankten Fohlen
wird es im Abstand von zwölf Stunden eingesetzt. Ob zu diesem Zeitpunkt ausreichend
hohe Konzentrationen in den genannten Kompartimenten erreicht werden, wurde in
dieser Studie nicht ermittelt, ist aber anzunehmen.
Zusammenfassung
- 112 -
6 Zusammenfassung
Wiebke Block: Pharmakokinetik von Clarithromycin nach Monotherapie mit
Clarithromycin und nach kombinierter Gabe von Clarithromycin mit
Rifampicin beim Fohlen.
In der vorliegenden Untersuchung wurde im Rahmen zweier Studienabschnitte die
Konzentration von Clarithromycin im Plasma, in der PELF und in bronchoalveolären
Zellen von neun gesunden, 40 – 60 Tage alten Fohlen mittels LC-MS/MS bestimmt. Die
Messung der Konzentrationen in den genannten Proben erfolgte an Tag 7 nach der
alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h, p.o., Tag 1 – 7) und darauf,
an Tag 21, nach der gemeinsamen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h,
Tag 9-21) und Rifampicin (10 mg/kg, q 12 h, p.o., Tag 9-20).
Auf der Grundlage dieses Behandlungsprotokolls sollte bemessen werden, ob die
Konzentration von Clarithromycin in verschiedenen Probenfraktionen durch die
zusätzliche Gabe von Rifampicin beeinflusst wird. Darüber hinaus wurde an Zellen der
Bronchialschleimhaut und Alveolarmakrophagen mit Hilfe einer qRT-PCR, ausgewertet
nach der ∆∆CT- Methode, die Expression der transmembranären Transporterproteine
ABCB1 und ABCC2 bestimmt. Dadurch sollte festgestellt werden, ob diese
transmembranären Transporterproteine durch die zusätzliche Gabe von Rifampicin
vermehrt exprimiert werden und somit an einer Konzentrationsänderung von
Clarithromycin in der PELF und in den bronchoalveolären Zellen beteiligt sind. Neben
Clarithromycin wurde außerdem die Konzentration seines Metaboliten, 14-OH-
Clarithromycin, bestimmt .
Die kombinierte Gabe von Clarithromycin mit Rifampicin, wie sie im Rahmen der
Therapie eines an R. equi erkrankten Fohlens angewendet wird, führt zu einem
signifikanten Abfall der Konzentration von Clarithromycin im Plasma (AUC12h-Monotherapie:
5,55 ± 4,42 µg x h/ml; AUC12h-Kombinationstherapie: 0,36 ± 0,32 µg x h/ml (p = 0,008)), in der
PELF (C12h-Monotherapie: 9,50 ± 6,13 µg/ml; C12h-Kombinationstherapie: 0,696 ± 0,658 µg/ml (p =
0,008)) und in den bronchoalveolären Zellen (C12h-Monotherapie: 263,81 ± 375,36 ng/ml,
C12h-Kombinationstherapie: 101,67 ± 101,73 ng/ml). Da die Gesamtkonzentration im Plasma
Zusammenfassung
- 113 -
(AUC) ebenfalls sinkt, kann davon ausgegangen werden, dass aus diesem Grunde die
Clarithromycinkonzentrationen in der Lunge sinken. Außerdem wird die Genexpression
von Effluxtransportern wie ABCB1 oder ABCC2 durch die zusätzliche Gabe von
Rifampicin nur teilweise beeinflusst.
Das Sinken der Konzentrationen von Clarithromycin in der PELF und in den
bronchoalveolären Zellen bei der Kombinationstherapie mit Rifampicin ist also nicht
durch die beiden, in dieser Studie ausgewählten Effluxtransporter (ABCB1 und ABCC2),
die an der Bronchialschleimhaut und an den Alveolarmakrophagen exprimiert werden,
verursacht worden.
Daneben konnte bei der zusätzlichen Gabe von Rifampicin ein gesteigerter Abbau des
Makrolidantibiotikums, angegeben als das Verhältnis von Clarithromycin zu 14-Oh-
Clarithromycin nach Mono- und nach Kombinationstherapie, beobachtet werden (AUC0-
12h-Monotherapie: 3,23 ± 0,85 ng x h/ml, AUC0-12h-Kombinationstherapie: 0,44 ± 0,15 ng x h/ml (p =
0,008)). Da die Halbwertszeit von Clarithromycin sich aber durch die zusätzliche Gabe
von Rifampicin (t1/2: 6,11 ± 0,83 Stunden) nicht ändert, erklärt der gesteigerte
Metabolismus nicht alleine den starken Abfall der Clarithromycinkonzentration.
Möglicherweise spielen hier Interaktionen zwischen Rifampicin und Clarithromycin bei
intestinalen Resorptionsvorgängen eine Rolle.
Im Hinblick auf die Therapie der Rhodococcose beim Fohlen wurden die ermittelten
Konzentrationen nach kombinierter Gabe von Clarithromycin und Rifampicin mit dem
bekannten MHK90-Wert (120 ng/ml) von R. equi für Clarithromycin verglichen. Im
Plasma sinken die Konzentrationen von Clarithromycin unter die MHK90. In der PELF
und in den bronchoalveolären Zellen konnte hingegen eine Anreicherung des
Wirkstoffes beobachtet werden. Hier liegen die Clarithromycinkonzentrationen deutlich
über der MHK90 von R. equi für Clarithromycin. Da sich der Erreger in den alveolären
Zellen vermehrt und persistiert, sollte eine Behandlung mit diesen Antibiotika erfolgreich
sein. So kann die kombinierte Gabe von Clarithromycin und Rifampicin, auch wenn sie
sehr kostenaufwendig ist, empfohlen werden.
Summary
- 114 -
7 Summary
Wiebke Block: Pharmacokinetik of Clarithromycin in foals during monotherapy with
Clarithromycin and during combined application with Rifampin.
The goal of this study was to evaluate whether the concentration of Clarithromycin is
affected by the additional application of Rifampin in plasma, PELF and bronchoalveolar
cells of foals. It was also to determine whether the additional application of Rifampin
induces the expression of transporter proteins and as a consequence influences the
concentration of Clarithromycin in the PELF and in the bronchoalveolar cells. The
dosage of the antibiotics used in the treatment protocol follows the common practice for
the treatment of foals with pneumonia caused by Rhodococcus equi.
In two different study periods, the concentration of Clarithromycin in plasma, in the PELF
and in the bronchoalveolar cells of nine healthy, 40 – 60 days old warmblood foals was
determined by using LC-MS/MS.
The concentration of Clarithromycin and its metabolite 14-OH-Clarithromycin was
determined after the single application of Clarithromycin (7.5 mg/kg, p.o., q 12 h, day 1 –
7) on day seven. The second measurement followed on day 21 after the application of
Clarithromycin (7.5 mg/kg, p.o., q 12 h, day 1 – 7) in combination with Rifampin (10
mg/kg, p.o., q 12 h, day 9 – 20). Furthermore the expression of the genes encoding for
the membrane transporters ABCB1 and ABCC2 in the cells of the bronchial epithelium
and in the alveolar macrophages was evaluated with the qRT-PCR and the ∆∆CT-
Methods.
The combined application of Clarithromycin and Rifampin leads to a significant decrease
of the concentration of Clarithromycin in plasma (plasma AUC12h-monother.: 5,55 ± 4,42 µg
x h/ml; C12h- combined ther.: 0,36 ± 0,32 µg x h/ml, p = 0,008), in the PELF (C12h-monother.: 9,50
± 6,13 µg/ml; C12h-combined ther.: 0,696 ± 0,658 µg/ml, p = 0,008) and in the bronchoalveolar
cells (C12h-monother.: 263,81 ± 375,36 ng/ml, C12h-combined ther.: 101,67 ± 101,73 ng/ml, p =
0,008). Furthermore, the gene expression of ABCB1 and ABCC2 is partially affected by
the additional application of Rifampin.
Summary
- 115 -
The decline in concentration of Clarithromycin in the PELF and in the bronchoalveolar
cells is not influenced by a Rifampin induced expression of both effluxtransporter
proteins chosen here.
An increased degradation of the macrolides antibiotic calculated as the Ratio
Clarithromycin/14-OH-Clarithromycin after mono- and after combined therapy with
Rifampin was determined here (AUC0-12h-monother.: 3,23 ± 0,85 ng/ml, AUC0-12h- combined ther.:
0,44 ± 0,15 ng/ml, p = 0,008). As the half life of Clarithromycin is not influenced by the
application of Rifampin (t1/2: 6,11 ± 0,83 h), the increased metabolism alone does not
explain the strong decrease of the Clarithromycin concentration. Probably the intestinal
resorption of Clarithromycin might be reduced by Rifampin.
With regard to the therapy of a foal’s pneumonia due to R. equi, the concentrations of
Clarithromycin during combined therapy with Rifampin were compared with the minimum
inhibitory concentration (MIC: 120 ng/ml) of R. equi for Clarithromycin. The level of
Clarithromycin in plasma did decrease below the MIC but the accumulation of the
antibiotic with higher concentrations than the MIC of R equi for Clarithromycin could be
observed in the PELF and in the bronchoalveolar cells. In the light of these results
treatment of R. equi pneumonia with the combination of Rifampin and Clarithromycin in
the usual dosage has a high probability to be successful and can be recommended.
Literaturverzeichnis
- 116 -
8 Literaturverzeichnis
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Anhang
- 142 -
9 Anhang
Tab. 17: Pharmakokinetische Daten von Clarithromycin im Serum beim Fohlen nach
einmaliger intravenöser Applikation von 7,5 mg/kg und sechsmaliger Applikation von
Clarithromycin per Nasenschlundsonde (7,5 mg/kg, i.g., zu den Zeitpunkten 0, 24, 36,
48, 60 und 72 Stunden) (nach WOMBLE et al., 2006).
Variable Einheit Nach i.v. Gabe nach i.g. Gabe
kel (/h) 0,129 ± 0,022 0,141 ± 0,050
AUC µg x h/ml 6,2 ± 1,5 3,4 ± 1,1
MRT H 8,3 ± 1,0 7,1 ± 1,7
t1/2 H 5,4 -
Vd L/kg 9,9 ± 1,8 -
Vdss L/kg 10,4 ± 2,1 -
Cl L/h/kg 1,27 ± 0,25 -
tmax H - 1,6 ± 0,4
Cmax 0-24h µg/ml - 0,52 ± 0,17
Cmax 72-48h µg/ml - 0,88 ± 0,19
Cmin, 48h µg/ml - 0,20 ± 0,06
F % - 57,3 ± 12
i.v.: intravenous; i.g.: intragastral; kel: Eliminationskonstante; AUC: Fläche unter der
Konzentration-Zeit-Kurve; MRT: Mean residence time; t1/2: Halbwertszeit; Vd:
scheinbares Verteilungsvolumen; Vdss scheinbares Verteilungsvolumen im Steady
State; Cl: Clearance; tmax: Zeit bis zum Erreichen von Cmax; Cmax 0-24; maximale Plasma-
Konzentration in der Zeit von 0 – 24 Stunden; Cmax 72-48; maximale Plasma-
Konzentration in der Zeit von 72 - 48 Stunden, Cmin, 48h minimale Plasmakonzentration
nach 48 Stunden; F: Bioverfügbarkeit
Anhang
- 143 -
Tab. 18: Pharmakokinetische Daten von Clarithromycin in verschiedenen
Körperflüssigkeiten und Zellen der bronchoalveolären Lavage beim Fohlen nach der
letzten Gabe der sechsmaligen intragastralen Applikation von 7,5 mg/kg. (nach
WOMBLE et al., 2006).
Probe Einheit 2 Stunden nach
der letzten Applikation
12 Stunden nach der letzten Applikation
Serum µg/ml 0,83 ± 0,18 0,20 ± 0,06
Synovia µg/ml 0,27 ± 0,06 0,08 ± 0,02
Bauchhöhlenflüssigkeit µg/ml 0,43 ± 0,32 0,11 ± 0,06
Urin µg/ml 15,58 ± 11,66 2,53 ± 0,82
Cerebrospinalflüssigkeit µg/ml 0,22 ± 0,09 0,13 ± 0,09
PELF µg/ml 76,23 ± 59,43 21,36 ± 20,53
Bronchoalveoläre Zellen µg/ml 269,0 ± 234,24 117,27± 107,84
PELF: Pulmonary epithelial lining fluid
Anhang
- 144 -
Tab. 19: Plasmakonzentrationen von Clarithromycin in ng/ml bei neun Fohlen zu den einzelnen Blutentnahmezeitpunkten
nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h).
Blutentnahmezeitpunkte in Stunden
Foh
len
0 0,33 0,66 1 1,5 2 2,5 3 4 6 8 12 16 24 36 48
1 337,3 313,1 407,1 450,7 502,4 537,7 668,4 599,8 602,6 543,8 439 280,8 198,2 78,59 22,41 7,366
2 721,8 485,3 510,7 766,3 938,9 1148 1072 1195 979 824,9 509,9 521,9 348,5 100,11 26,92 5,826
3 357,5 256,3 324,2 433,2 485,9 550,2 532,7 536,2 628,4 584,8 398,4 337,3 183,85 76,975 13,6 4,426
4 72,09 70,69 84,04 89,44 108,7 112,1 122,4 141,1 131,4 164,5 200,8 115,4 64,49 15,61 4,901 n. n
5 59,55 58,98 53,76 87,22 105,5 147 174,8 174,9 181,3 156,7 130,6 93,86 55,47 20,28 2,867 n. n.
6 257,2 172,5 171,8 255,1 376,9 387,6 455,6 498,5 499,5 413,2 338 175,7 124 51,36 15,11 6,163
7 871,8 844,5 877,7 834,2 964,6 1060 1097 1142 1167 1154 1155 917,7 823,1 496,9 143,6 46,06
8 115,5 97,59 120,7 199,7 181,9 390 246,9 344 255,4 222,1 161,9 97,69 58,01 18,04 5,846 3,387
9 106,4 106,6 243,2 431,8 525 589,6 595,5 502,8 465,4 380,4 297 170,2 107,1 36,97 7,487 3,461
MW
322,13 267,28 310,36 394,18 465,53 546,91 551,7 570,48 545,56 493,82 403,4 301,17 218,08 99,426 26,971 10,956
SD
293,32 257,04 261,8 269,83 320,88 358,03 355,75 374,27 350,2 330,06 309,62 269,8 245,32 152,09 44,492 15,549
MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung; n. n.: nicht nachweisbar
Anhang
- 145 -
Tab. 20: Plasmakonzentrationen von Clarithromycin in ng/ml bei neun Fohlen zu den einzelnen Blutentnahmezeitpunkten
nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h) und Rifampicin (10mg/kg, q 12 h).
Blutentnahmezeitpunkte in Stunden
Foh
len
0 0,33 0,66 1 1,5 2 2,5 3 4 6 8 12 16 24 36 48
1 5,8 7,23 27,41 57,67 148,4 145,6 132,4 104,7 85,99 49,27 30,9 15,97 8,92 3,76 n. n. n. n.
2 n. n. 26,82 41,55 67,12 81,78 92,65 94,61 84,96 67,27 41,21 28,64 10,22 3,09 n. n. n. n. n. n.
3 8,62 8,59 8,37 13,76 22,66 26,41 26,68 20,39 15,82 11,55 8,24 8,16 5,22 2,85 n. n. n. n.
4 5,95 5,27 5,19 5,22 6,30 7,87 7,77 7,097 8,69 16,56 9,58 6,81 3,53 n. n. n. n. n. n.
5 n. n. 3,35 14,31 21,17 25,85 25,92 22,36 19,28 14,37 7,02 4,25 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
6 5,79 5,58 13,05 16,84 21,35 24 22,15 23,75 17,43 12,15 7,95 5,25 4,02 2,65 n. n. n. n.
7 36,62 34,4 38,39 45,46 51,8 68,48 64,7 64,92 103,8 128,6 92,05 52,07 31,08 11,38 2,89 n. n.
8 5,24 5,05 5,12 5,86 9,476 26,55 25,38 20,38 16,73 11,2 8,93 5,66 4,26 2,58 n. n. n. n.
9 5,97 15,58 46,36 58,1 93,59 77,04 66,54 55,96 37,04 18,89 11,97 6,79 4,06 2,58 n. n. n. n.
MW
10,57 12,43 22,19 32,36 51,25 54,95 51,40 44,60 40,79 32,94 22,5 13,87 8,02 4,3 2,89 -
SD
11,54 11,05 16,45 24,58 47,81 44,65 41,42 34,35 35,72 38,71 27,74 15,82 9,49 3,50 - -
MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung, n.n.: nicht nachweisbar
Anhang
- 146 -
Tab. 21: Plasmakonzentrationen von 14-OH-Clarithromycin in ng/ml bei neun Fohlen zu den einzelnen
Blutentnahmezeitpunkten nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h).
Blutentnahmezeitpunkte in Stunden
Foh
len
0 0,33 0,66 1 1,5 2 2,5 3 4 6 8 12 16 24 36 48
1 112,58 113,37 126,61 133,02 144,38 157,4 164,3 146,2 152,33 138,85 123,09 100,48 81,85 46,08 21,71 8,17
2 204,04 125,76 139,3 164,02 210,26 210,51 196,93 190,15 197,28 156,99 166,27 87,96 90,41 54,34 19,84 6,47
3 173,88 99,22 111,96 129,37 141,33 142,87 129,83 145,42 173,66 180,72 138,16 77,10 71,70 49,82 13,49 5,24
4 37,91 47,03 49,83 49,30 55,34 55,36 61,58 65,93 62,31 72,67 81,45 58,27 39,06 16,12 4,60 n. n.
5 37,93 38,19 34,62 49,23 50,95 60,32 69,01 64,66 75,0 69,04 60,61 53,70 41,74 17,5 5,41 n. n.
6 120,29 64,72 62,99 69,90 92,52 97,88 110,06 115,47 116,52 105,19 93,07 66,11 51,94 27,92 11,83 5,65
7 264,24 265,61 256,42 258,09 269,28 284,31 301,14 293,01 299,23 303,47 291,62 257,71 242,39 172,46 81,07 36,71
8 58,03 50,36 57,35 79,3 173 111,45 105,27 94,58 140,33 81,53 70,83 48,95 35,75 14,44 4,0 n. n.
9 56,1 57,4 83,9 115 128 125 142 126 124 117 104 77,7 60,9 32,3 10,7 3,81
MW
118,33 95,74 102,56 116,36 140,56 138,35 142,24 137,94 148,96 136,16 125,45 92,0 79,53 47,89 19,18 11,01
SD
80,78 70,94 68,05 66,47 70,94 72,81 73,44 70,69 70,95 73,54 70,78 64,33 64,03 49,07 24,06 12,67
MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung; n. n.: nicht nachweisbar
Anhang
- 147 -
Tab. 22: Plasmakonzentrationen von 14-OH-Clarithromycin in ng/ml bei neun Fohlen zu den einzelnen
Blutentnahmezeitpunkten nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h) und Rifampicin
(10mg/kg, q 12 h).
Blutentnahmezeitpunkte in Stunden
Foh
len
0 0,33 0,66 1 1,5 2 2,5 3 4 6 8 12 16 24 36 48
1 5,8 7,231 27,41 57,67 148,4 145,6 132,4 104,7 85,99 49,27 30,9 15,97 8,923 3,758 n. n. n. n.
2 n. n. 26,82 41,55 67,12 81,78 92,65 94,61 84,96 67,27 41,21 28,64 10,22 3,085 n. n. n. n. n. n.
3 8,615 8,59 8,369 13,76 22,66 26,41 26,68 20,39 15,82 11,55 8,235 8,161 5,218 2,848 n. n. n. n.
4 5,946 5,273 5,185 5,223 6,297 7,866 7,768 7,097 8,69 16,56 9,582 6,81 3,525 n. n. n. n. n. n.
5 n. n. 3,353 14,31 21,17 25,85 25,92 22,36 19,28 14,37 7,022 4,245 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
6 5,785 5,577 13,05 16,84 21,35 24 22,15 23,75 17,43 12,15 7,946 5,246 4,015 2,65 n. n. n. n.
7 36,62 34,4 38,39 45,46 51,8 68,48 64,7 64,92 103,8 128,6 92,05 52,07 31,08 11,38 2,894 n. n.
8 5,238 5,049 5,117 5,859 9,476 26,55 25,38 20,38 16,73 11,2 8,929 5,661 4,255 2,581 n. n. n. n.
9 5,966 15,58 46,36 58,1 93,59 77,04 66,54 55,96 37,04 18,89 11,97 6,789 4,063 2,583 n. n. n. n.
MW
10,567 12,43 22,193 32,356 51,245 54,946 51,399 44,604 40,793 32,939 22,5 13,866 8,021 4,3 2,894 -
SD
11,54 11,048 16,454 24,581 47,809 44,649 41,42 34,347 35,716 38,707 27,74 15,817 9,493 3,497 - -
MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung; n. n.: nicht nachweisbar
Anhang
- 148 -
Tab. 23: Rifampicinkonzentrationen im Plasma in ng/ml bei neun Fohlen nach der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
q 12 h) und Rifampicin (10 mg/kg, q 12 h).
Blutentnahmezeitpunkte in Stunden
Foh
len
0 0,33 0,66 1 1,5 2 2,5 3 4 6 8 12 16 24 36 48
1 1122 687,7 649,9 648,6 656,4 594,5 588,3 551,6 567,9 495,1 427,8 279 182 101,8 35,62 25,04
2 1077 956,2 904,9 955 809,6 856,4 737,8 871,2 850,9 673 590,1 225,5 151,4 79,36 38,99 19,82
3 319,6 556,6 536 527,6 507,8 566,1 505,4 435,9 403,3 347,4 576,7 228,1 91,08 47,27 15,73 9,039
4 2573 1828 1739 1421 1597 1498 1332 1484 1224 1047 789,7 650,9 450,3 185,5 74,62 35,02
5 1625 1563 1566 1362 1289 1200 1544 1415 1206 953,6 805,1 540,1 491,5 136,9 47,73 21,15
6 825,3 796 681,2 741,4 659 666,4 593,8 609,2 566,7 434,8 347,3 186,3 130,8 48,47 13,76 6,758
7 1421 1066 1018 979,8 902,3 908 911,5 984,3 865,7 709,4 562,1 411,6 237,9 97,05 26,49 11,96
8 413,3 427,7 386,5 375,9 339,4 388,4 350,5 338,9 310,2 249,4 220,1 174,4 107,5 60,26 24,53 12,88
9 1810 1641 1421 1372 1360 1301 1140 1382 1133 958 767,2 572,6 412,7 144,5 39,18 16,79
MW
1242,9 1058 989,17 931,48 902,28 886,53 855,92 896,9 791,97 651,97 565,12 363,17 250,58 100,12 35,183 17,606
SD
709,38 506,54 483,21 388,89 424,61 375,81 405,66 444,78 347,74 289,62 204,63 184,22 157,79 47,572 18,607 8,817
MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 149 -
Tab. 24: 25-O-Desacetylrifampicinkonzentrationen im Plasma in ng/ml bei neun Fohlen nach der Applikation von
Clarithromycin (7,5 mg/kg, bid) und Rifampicin (10 mg/kg, bid).
Blutentnahmezeitpunkte in Stunden
Foh
len
0 0,33 0,66 1 1,5 2 2,5 3 4 6 8 12 16 24 36 48
1 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
2 4,449 4,583 6,491 5,031 3,729 3,833 4,325 4,287 4,082 3,673 2,788 2,544 n. n. n. n. n. n. n. n.
3 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
4 11,71 11,32 6,499 7,959 16,74 12,47 8,399 6,44 10,17 9,515 7,157 7,04 5,093 n. n. n. n. n. n.
5 4,262 4,713 4,771 3,959 4,674 4,23 4,377 3,546 3,491 3,205 3,098 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
6 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
7 5,188 4,851 4,479 3,435 4,764 4,025 4,119 3,829 4,033 3,385 3,196 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
8 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
9 5,052 3,27 3,576 4,323 3,899 4,422 3,455 3,816 2,935 2,885 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
MW
6,132 5,748 5,163 4,941 6,761 5,796 4,935 4,384 4,942 4,533 4,06 4,792 5,093 - - -
SD
3,143 3,179 1,293 1,784 5,597 3,737 1,971 1,18 2,959 2,80 2,072 3,179 - - - -
MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung; n. n.: nicht nachweisbar
Anhang
- 150 -
Tab. 25: Bei der BAL von neun Fohlen zurückgewonnenen Volumen in ml nach der
Instillation von jeweils 400ml PBS-Lösung.
Fohlen 1. BAL 2.BAL
Zurück-
gewonnenes Volumen in ml
aspiriertes Volumen abzüglich
1.Portion in ml
Zurück-gewonnenes
Volumen in ml
aspiriertes Volumen abzüglich
1.Portion in ml
1 184 170 242 212
2 235 203 245 213
3 173 159 210 169
4 186 150 190 175
5 284 239 302 241
6 229 189 274 235
7 296 250 265 231
8 258 224 284 236
9 267 233 238 202
MW 234,67 201,89 250,00 212,67
SD 45,49 36,85 35,52 26,51
Anteil in % 58,67 50,47 62,50 53,17
BAL: bronchoalveoläre Lavage; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 151 -
Tab. 26: Zur Berechnung der PELF bestimmte Harnstoffkonzentrationen in ng/ml der
neun Fohlen im Plasma und in der BALF.
Fohlen 1. Kinetik Plasma
2. Kinetik Plasma
1. Kinetik BALF
2. Kinetik BALF
1 1,83 2,29 0,139 0,077
2 2,69 2,54 0,121 0,124
3 2,85 2,27 0,276 0,129
4 1,73 1,13 0,14 0,118
5 2,25 2,53 0,184 0,094
6 2,03 1,81 0,151 0,1
7 1,78 1,68 0,191 0,221
8 2,01 2,18 0,205 0,084
9 2,66 2,34 0,16 0,168
BALF: bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit
Anhang
- 152 -
Tab. 27: Nach RENNARD et al. (1986) berechnetes Volumen der PELF in ml bei neun
Fohlen (BAL 1 und BAL 2).
Fohlen Volumen PELF in ml
Volumen PELF in ml
1. BAL 2. BAL
1 12,91 7,13
2 9,13 10,4
3 15,4 9,6
4 12,14 18,27
5 19,54 18,95
6 14,06 12,98
7 26,83 30,39
8 22,85 9,09
9 14,02 14,5
MW 16,32 14,59
SD 5,65 7,19
PELF: Pulmonary epithelial lining fluid; BAL: bronchoalveoläre Lavage; MW: Mittelwert;
SD: Standardabweichung
Anhang
- 153 -
Tab. 28: Clarithromycinkonzentrationen in ng/ml in der PELF bei neun Fohlen während der ersten Kinetik.
1. Kinetik, ohne Rifampicin
Fohlen Volumen PELF Clarithromycin-
konzentration in der BALF (ng/ml)
Gesamtmenge Clarithromycin in der
BALF (ng)
Clarithromycin-konzentration in der
PELF (ng/ml)
1 12,91 1166 198220,00 15350,94
2 9,13 768,7 156046,10 17089,28
3 15,40 810,2 128821,80 8366,20
4 12,14 181,7 27255,00 2245,29
5 19,54 399,6 95504,40 4886,41
6 14,06 623,2 117784,80 8378,12
7 26,83 1973 493250,00 18387,12
8 22,85 235 52640,00 2304,15
9 14,02 509,7 118760,10 8473,76
MW 16,32 740,79 154253,58 9497,92
SD 5,65 554,16 136929,17 6124,79
PELF: Pulmonary epithelial lining fluid; BAL: bronchoalveoläre Lavage; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 154 -
Tab. 29: Clarithromycinkonzentrationen in ng/ml in der PELF bei neun Fohlen während der zweiten Kinetik.
2. Kinetik, mit Rifampicin
Fohlen Volumen PELF Clarithromycin -
konzentration in der BALF (ng/ml)
Gesamtmenge Clarithromycin in der
BALF (ng)
Clarithromycin -konzentration in der
PELF (ng/ml)
1 7,13 78,85 16716,20 2345,02
2 10,40 31,15 6634,95 638,07
3 9,60 22,51 3804,19 396,11
4 18,27 12,88 2254,00 123,34
5 8,95 11,92 2872,72 320,83
6 12,98 35,08 8243,80 634,95
7 30,39 121,4 28043,40 922,86
8 9,09 17,41 4108,76 451,83
9 14,50 30,72 6205,44 427,89
MW 13,48 40,21 8764,83 695,65
SD 7,20 36,51 8438,31 658,40
PELF: Pulmonary epithelial lining fluid; BAL: bronchoalveoläre Lavage; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 155 -
Tab. 30: 14-OH-Clarithromycinkonzentrationen in ng/ml in der PELF bei neun Fohlen während der ersten Kinetik.
1. Kinetik, ohne Rifampicin
Fohlen Volumen PELF 14-OH-Clarithromycin -
konzentration in der BALF (ng/ml)
Gesamtmenge 14-OH-Clarithromycin in der
BALF (ng)
14-OH-Clarithromycin -konzentration in der
PELF (ng/ml)
1 12,91 47,49 8072,51 625,17
2 9,13 32,09 6513,29 713,30
3 15,40 44,79 7121,67 462,51
4 12,14 13,42 2013,33 165,86
5 19,54 20,24 4836,44 247,45
6 14,06 24,79 4684,85 333,24
7 26,83 62,56 15640,96 583,06
8 22,85 15,51 3474,52 152,09
9 14,02 24,26 5652,41 403,31
MW 16,32 31,68 6445,55 409,55
SD 5,65 16,60 3912,39 202,94
PELF: Pulmonary epithelial lining fluid; BAL: bronchoalveoläre Lavage; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 156 -
Tab. 31: 14-OH-Clarithromycinkonzentrationen in ng/ml in der PELF bei neun Fohlen während der zweiten Kinetik.
2. Kinetik, mit Rifampicin
Fohlen Volumen PELF 14-OH-Clarithromycin-
konzentration in der BALF (ng/ml)
Gesamtmenge 14-OH-Clarithromycin in der
BALF (ng)
14-OH-Clarithromycin -konzentration in der
PELF (ng/ml)
1 7,13 9,84 2086,37 292,69
2 10,40 6,95 1479,85 142,31
3 9,60 6,12 1033,59 107,62
4 18,27 3,53 618,44 33,84
5 8,95 2,57 618,86 69,11
6 12,98 4,87 1144,55 88,15
7 30,39 22,04 5090,51 167,52
8 9,09 2,95 695,97 76,53
9 14,50 7,26 1466,49 101,12
MW 13,48 7,35 1581,63 119,88
SD 7,20 5,98 1401,83 75,83
PELF: Pulmonary epithelial lining fluid; BAL: bronchoalveoläre Lavage; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 157 -
Tab. 32: Gesamtzellzahlen in G/L bei neun Fohlen in der BALF der ersten und der
zweiten BAL.
Zellen in G/L
Fohlen 1. BAL 2. BAL
1 0,39 0,51
2 0,79 0,46
3 0,55 0,88
4 0,72 1,01
5 0,64 0,26
6 0,52 0,17
7 0,12 0,13
8 0,36 0,42
9 0,47 0,82
MW 0,51 0,52
SD 0,20 0,32
G:Giga; BAL: bronchoalveoläre Lavage;
MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 158 -
Tab. 33: Differenzierung der Zellen im Sediment der BALF bei neun Fohlen (ausgezählte Zellen: 200).
Makrophagen Lymphozyten Mastzellen Neutrophile
Fohlen 1. BAL 2. BAL 1. BAL 2. BAL 1.BAL 2.BAL 1. BAL 2. BAL
1 81 83 12 14 7 1 0 2
2 79 82 18 14 3 3 0 1
3 81 80,5 12 15 7 4 0 0,5
4 77,5 88,5 18,5 9,5 4 2 0 0
5 77 90,5 14,5 8,5 8,5 1 0 0
6 80,5 63 17 29,5 2,5 7,5 0 0
7 77,5 81,5 17 16 5,5 2,5 0 0
8 84,5 90 11,5 9 4 1 0 0
9 81 78 12,5 15,5 6,5 6 0 1
MW 79,89 81,89 14,78 14,56 5,33 3,11 0,00 0,50
SD 2,40 8,36 2,86 6,33 2,06 2,33 0,00 0,71
BAL: bronchoalveoläre Lavage; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 159 -
Tab. 34: Clarithromycinkonzentrationen in den bronchoalveolären Zellen bei neun Fohlen nach der 1. und nach der 2.
Kinetik.
1. Kinetik 2. Kinetik
Fohlen Clarithromycin-
konzentration (ng/GZ)
Clarithromycin- konzentration (ng/ml
Zellvolumen) (1,2µl/GZ)
Clarithromycin- konzentration (ng/GZ)
Clarithromycin- konzentration (ng/ml
Zellvolumen) (1,2µl/GZ)
1 408769,2 340640,97 31631,7 26359,75
2 271380,0 226150,03 12835,1 10695,90
3 159520,6 132933,86 5328,0 4440,00
4 45865,7 38221,40 2211,4 1842,80
5 25581,4 21317,84 5119,8 4266,52
6 138390,5 115325,45 7813,8 6511,52
7 1478065,1 1231720,95 34535,0 28779,18
8 177124,9 147604,08 5312,0 4426,63
9 144402,7 120335,58 5018,3 4181,94
MW 316566,6866 263805,57 12200,57 10167,14
SD 450425,8968 375354,91 12207,75 10173,13
GZ: Gigazelle; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 160 -
Tab. 35: 14-OH-Clarithromycinkonzentrationen in den bronchoalveolären Zellen bei neun Fohlen nach der 1. und 2. Kinetik.
1. Kinetik 2. Kinetik
Fohlen 14-OH-Clarithromycin-
konzentration (ng/GZ)
14-OH-Clarithromycin- konzentration
(ng/ml Zellvolumen) (1,2µl/GZ)
14-OH-Clarithromycin- konzentration
(ng/GZ)
14-OH-Clarithromycin- konzentration
(ng/ml Zellvolumen) (1,2µl/GZ)
1 5224,2 4353,51 3198,4 2665,37
2 5389,1 4490,92 3008,7 2507,24
3 4102,4 3418,63 1614,3 1345,25
4 1609,4 1341,18 545,8 454,87
5 1193,3 994,40 1039,7 866,40
6 3082,9 2569,07 1392,9 1160,73
7 22844,0 19036,70 5164,7 4303,92
8 3578,4 2981,99 976,5 813,73
9 4094,0 3411,63 1533,0 1277,49
MW 5679,74 4733,11 2052,7 1710,55
SD 6593,21 5494,34 1469,01 1224,18
GZ: Gigazelle; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 161 -
Tab. 36: Verhältnis der Konzentrationen (Ratio) von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin in den bronchoalveolären
Zellen zu den Konzentrationen im Plasma nach 12 Stunden.
Fohlen
BAC/C12h-Plasma 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MW SD
1. Kinetik 1213,11 433,32 394,11 331,21 227,12 656,38 1342,18 1510,94 707,03 757,27 478,29 Clarithromycin - konzentration
(ng/ml) 2. Kinetik 1650,58 1046,57 544,05 270,60 -* 1241,24 552,70 781,95 615,99 837,96 448,58
1. Kinetik 43,33 51,08 44,34 23,02 18,52 38,86 73,87 60,92 43,91 44,20 17,12 14-OH-Clarithromycin - konzentration
(ng/ml) 2. Kinetik 69,08 85,94 64,39 26,77 86,60 78,25 44,55 62,03 49,52 63,02 19,97
BAC: bronchoalveoläre Zellen; C12h-Plasma: Plasmakonzentration zum Blutentnahmezeitpunkt nach 12 Stunden;
MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
* Bei Fohlen Nr. 5 lag die Clarithromycinkonzentration im Plasma 12 Stunden nach der letzten Applikation unterhalb der
Nachweisgrenze.
Anhang
- 162 -
Tab. 37: Verhältnis der Konzentrationen (Ratio) von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin in der PELF zu den
Konzentrationen im Plasma nach 12 Stunden.
Fohlen
PELF/C12h-Plasma 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MW SD
1. Kinetik 54,67 32,74 24,80 19,46 52,06 47,68 20,04 23,59 49,79 36,09 14,80 Clarithromycin - konzentration
(ng/ml) 2. Kinetik 146,84 62,43 48,54 18,11 -* 121,04 17,72 79,82 63,03 61,95 48,62
1. Kinetik 6,22 8,11 6,00 2,85 4,61 5,04 2,26 3,11 5,19 4,82 1,86 14-OH-Clarithromycin - konzentration
(ng/ml) 2. Kinetik 7,59 4,88 5,15 1,99 6,91 5,94 1,73 5,83 3,92 4,88 2,02
PELF: Pulmonary epithelial lining fluid; C12h-Plasma: Plasmakonzentration zum Blutentnahmezeitpunkt nach 12 Stunden;
MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
* Bei Fohlen Nr. 5 lag die Clarithromycinkonzentration im Plasma 12 Stunden nach der letzten Applikation unterhalb der
Nachweisgrenze.
Anhang
- 163 -
Tab. 38: Verhältnis der Konzentrationen (Ratio) von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin in den bronchoalveolären
Zellen zu den Konzentrationen in der PELF.
Fohlen
BAC/PELF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MW SD
1. Kinetik 22,19 13,23 15,89 17,02 4,36 13,77 66,99 64,06 14,20 25,75 23,04 Clarithromycin - konzentration
(ng/ml) 2. Kinetik 11,24 16,76 11,21 14,94 13,30 10,26 31,19 9,80 9,77 14,27 6,79
1. Kinetik 6,96 6,30 7,39 8,09 4,02 7,71 32,65 19,61 8,46 11,24 9,14 14-OH-Clarithromycin - konzentration
(ng/ml) 2. Kinetik 9,11 17,62 12,50 13,44 12,54 13,17 25,69 10,63 12,63 14,15 4,90
BAC: bronchoalveoläre Zellen; PELF: Pulmonary epithelial lining fluid; C12h-Plasma: Plasmakonzentration zum
Blutentnahmezeitpunkt nach 12 Stunden; MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 164 -
Tab. 39a: Blutchemische Parameter von neun Fohlen nach sieben Tagen Behandlung mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q
12 h) (Tag 7) und nach 21 Tagen der Behandlung mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10 mg/kg, p.o.,
q 12 h) (Tag 21) (Na, K, Cl, Ca).
Natrium (mmol/L) Kalium (mmol/L) Chlorid (mmol/L) Calcium (mmol/L)
Fohlen Tag 7 Tag 21 Tag 7 Tag 21 Tag 7 Tag 21 Tag 7 Tag 21
1 129 133 3,4 3,7 96 99 96 99
2 130 132 3,8 3,9 94 94 94 94
3 133 132 3,8 3,4 95 94 95 94
4 134 134 3,8 3,5 96 96 96 96
5 133 134 3,9 3,9 101 100 101 100
6 133 135 3,4 3,3 97 99 97 99
7 134 133 3,6 3,7 95 97 95 97
8 133 134 3,7 4 101 103 101 103
9 130 134 3,3 3,8 97 98 97 98
MW 132,11 133,44 3,63 3,69 96,89 97,78 96,89 97,78
SD 1,90 1,01 0,22 0,24 2,52 2,91 2,52 2,91
MW: Mittelwert; SD: Standardabweichung
Anhang
- 165 -
Tab. 39b: Blutchemische Parameter von neun Fohlen nach sieben Tagen Behandlung mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q
12 h) (Tag 7) und nach 21 Tagen der Behandlung mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10 mg/kg, p.o.,
q 12 h) (Tag 21) (AP, LDH, Crea, Urea).
AP (U/L) LDH (U/L) Crea (µmol/l) Urea (µmol/l)
Fohlen Tag 7 Tag 21 Tag 7 Tag 21 Tag 7 Tag 21 Tag 7 Tag 21
1 256 301 350 425 95 101 1,1 1,8
2 320 293 369 393 110 103 1,6 2,3
3 374 340 420 443 90 88 1,9 2
4 414 521 570 514 100 105 1,3 0,8
5 340 406 451 455 101 101 1,7 1,8
6 352 319 365 431 90 101 1,5 1,3
7 508 526 398 359 78 95 1,4 1,1
8 344 264 354 299 111 122 1,8 1,9
9 432 395 572 596 99 101 2,4 2,7
MW 371,11 373,89 427,67 435,00 97,11 101,89 1,63 1,74
SD 72,65 96,40 87,61 85,72 10,35 9,08 0,38 0,59
AP: Alkalische Phosphatase; LDH: Laktatdehydrogenase; Crea: Creatinin; Urea: Harnstoff; MW: Mittelwert;
SD: Standardabweichung
Anhang
- 166 -
Tab. 39c: Blutchemische Parameter von neun Fohlen nach sieben Tagen Behandlung mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q
12 h) (Tag 7) und nach 21 Tagen der Behandlung mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10 mg/kg, p.o.,
q 12 h) (Tag 21) (AST, GGT, GLDH).
AST (U/L) GGT (U/L) GLDH (U/L)
Fohlen Tag 7 Tag 21 Tag 7 Tag 21 Tag 7 Tag 21
1 84 90 19 16 2,6 2,95
2 89 96 13 14 1,83 2,56
3 96 113 18 17 2,92 3,65
4 77 84 15 16 5,84 3,29
5 94 106 22 22 9,49 5,84
6 79 74 19 16 3,65 3,65
7 101 86 17 16 5,11 2,56
8 105 79 19 16 4,75 4,38
9 98 82 15 16 6,21 4,4
MW 91,44 90,00 17,44 16,56 4,71 3,70
SD 9,81 12,82 2,74 2,19 2,33 1,05
Alanin-Aspartat-Transferase; Gamma-Glutamyl-Transferase; Glutamatdehydrogenase; MW: Mittelwert; SD: Standard-
abweichung:
Anhang
- 167 -
Tab. 40: CT-Werte der neun Fohlen für die Genexpression von ABCB 1 und ABCC 2 in den Bronchialbioptaten.
ABCB1: P-Glykoprotein (P-gp); ABCC 2: Multidrug resistance protein 2 (MRP 2); CT: Cycle treshold
ABCB 1 ABCC 2
1. Kinetik 2. Kinetik 1. Kinetik 2. Kinetik
Fohlen CT CT 2∆∆CT CT CT 2∆∆CT
1 33,4 29,2 1,33 32,9 34,2 0,39
2 31,4 30,7 0,68 33,9 35,3 0,26
3 30,9 31,4 0,35 32,8 34 0,52
4 30,6 30,2 1,99 32,6 34,9 0,68
5 30,9 30,9 1,12 31,5 34,5 0,81
6 30,2 30,4 2,07 31,5 35,1 1,43
7 30,1 31,1 1,06 31,4 34,9 0,74
8 30,9 29,9 1,89 31,8 34,8 0,60
9 29,9 29,9 6,14 32,4 34,9 1,72
Anhang
- 168 -
Tab. 41: CT-Werte der neun Fohlen für die Genexpression von ABCB 1 und ABCC 2 in den bronchoalveolären Zellen.
ABCB 1 ABCC 2
1. Kinetik 2. Kinetik 1. Kinetik 2. Kinetik
Fohlen CT CT 2∆∆CT CT CT 2∆∆CT
1 n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n. n.
2 35 37 0,14 33,9 33 0,37
3 35,3 34,4 0,80 32,8 34,7 0,12
4 33,8 34 2,28 32,6 33,3 0,42
5 36,3 33,9 2,71 31,5 32,8 0,42
6 36,4 34,5 1,31 31,5 33,6 0,17
7 36,6 36 0,64 31,4 34,5 0,18
8 34,3 35,3 1,11 31,8 33,3 0,33
9 35,5 34,1 1,98 32,4 33,4 0,32
ABCB1: P-Glykoprotein (pGp); ABCC 2: Multidrug resistance protein 2 (MRP 2); CT: Cycle treshold
Anhang
- 169 -
Abb. 20: Befundbogen für die sonographische Untersuchung der Lunge
Anhang
- 170 -
Datum T° Lunge Trachea Nasenausfluss Lnn Hu Nabel Durchfall Leukos
Wochen
obB
verschärft
rasseln/giemen
obB
rauh
rasseln
ohne
Serös/m
ukös
purulent
obB
vergrößert
0 h=1 2 0 1 2 0 1 2 0 1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
…
Abb. 21: Formblatt zur Untersuchung der Fohlen
Abbildungsverzeichnis
- 171 -
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1a-b: Wege der Antibiotika aus der Blutzirkulation in PELF und Zellen der
bronchoalveolären Spülflüssigkeit und Expression von ATP–bindenden
Transporterproteinen bei verschiedenen Zelltypen der menschlichen Lunge
(modifiziert nach VAN DER DEEN et al., 2005). ................................................. 27
Abb. 02: Darstellung pharmakokinetischer Parameter.................................................. 51
Abb. 03: Clarithromycinkonzentrationen im Plasma bei neun Fohlen nach der alleinigen
Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der
kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h). .................................................................... 58
Abb. 04: Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin im Plasma von
neun Fohlen nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o.,
q 12 h)................................................................................................................. 60
Abb. 05: Plasmakonzentrationen von 14-OH-Clarithromycin bei neun Fohlen nach der
Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der
kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h). .................................................................... 62
Abb. 06: Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin im Plasma von
neun Fohlen nach der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)
und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12
h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h). .......................................................... 65
Abb. 07: Konzentrationen von Clarithromycin in der PELF von neun Fohlen nach der
alleinigen Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der
kombinierten Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin
(10 mg/kg, p.o., q 12 h). ...................................................................................... 70
Abb.08: Konzentrationen von 14-OH-Clarithromycin in der PELF von neun Fohlen nach
der alleinigen Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der
kombinierten Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin
(10 mg/kg, p.o., q 12 h). ...................................................................................... 72
Abb. 09: Konzentrationen von Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen bei neun
Fohlen nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12
Abbildungsverzeichnis
- 172 -
h) und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q
12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) ...................................................... 76
Abb. 10: Konzentration von 14-OH-Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen bei
neun Fohlen nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o.,
q 12 h) und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) ........................................... 78
Abb. 11: ∆∆CT-Werte für ABCB1 in den bronchoalveolären Zellen bei neun Fohlen nach
der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 1. Kinetik
(Monotherapie) und nach kombinierter Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 2. Kinetik
(Kombinationstherapie). Bezifferung der Graphen entspricht Nr. des Fohlens in
der klinischen Studie. .......................................................................................... 81
Abb. 12: ∆∆CT-Werte für ABCC2 in den bronchoalveolären Zellen bei neun Fohlen nach
der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 1. Kinetik
(Monotherapie) und nach kombinierter Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 2. Kinetik
(Kombinationstherapie). Bezifferung der Graphen entspricht Nr. des Fohlens in
der klinischen Studie. .......................................................................................... 82
Abb. 13: ∆∆CT-Werte für ABCB1 in den Bronchialschleimhautbioptaten bei neun Fohlen
nach der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 1. Kinetik
(Monotherapie) und nach kombinierter Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 2. Kinetik. (Bezifferung
der Graphen entspricht Nummer des Fohlens in der klinischen Studie) ............. 84
Abb. 14 : ∆∆CT-Werte für ABCC2 in den Bronchialschleimhautbioptaten bei neun Fohlen
nach der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 1. Kinetik
(Monotherapie) und nach kombinierter Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) in der 2. Kinetik. Kinetik
(Bezifferung der Graphen entspricht Nummer des Fohlens in der klinischen
Studie)................................................................................................................. 85
Abb. 15: Verhältnis der Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin
in den bronchoalveolären Zellen zum Plasma zum Zeitpunkt der 1. BAL
(Monotherapie mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)) und zum Zeitpunkt der
Abbildungsverzeichnis
- 173 -
2. BAL (Kombinationstherapie: Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)) bei neun Fohlen.......................................... 89
Abb. 16 : Verhältnis der Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin
in der PELF zum Plasma zum Zeitpunkt der 1. BAL (Monotherapie mit
Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)) und zum Zeitpunkt der 2. BAL
(Kombinationstherapie: Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin
(10 mg/kg, p.o., q 12 h)) bei neun Fohlen. .......................................................... 90
Abb. 17 : Verhältnis der Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin
in den bronchoalveolären Zellen zur PELF zum Zeitpunkt der 1. BAL
(Monotherapie mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)) und zum Zeitpunkt der
2. BAL (Kombinationstherapie: Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und
Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)) bei neun Fohlen.......................................... 91
Abb. 18: Korrelation der Konzentration von Clarithromycin in den bronchoalveolären
Zellen zur AUC nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h). ........................................................................................................ 93
Abb. 19: Korrelation der Konzentration von Clarithromycin in den bronchoalveolären
Zellen zur AUC nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h). .......................................... 94
Abb. 20: Befundbogen für die sonographische Untersuchung der Lunge................... 169
Abb. 21: Formblatt zur Untersuchung der Fohlen ....................................................... 170
Tabellenverzeichnis
- 174 -
Tabellenverzeichnis
Tab. 01: Studienübersicht ............................................................................................. 38
Tab. 02: Zeitpunkte der Blutentnahmen an Tag 7, 8 und 9 sowie an Tag 21, 22 und 23
zur Bestimmung der Konzentrationen von Clarithromycin (C) und Rifampicin
(R) im Plasma ................................................................................................. 41
Tab. 03: Konzentrationsbereiche und Korrelationkoeffizienten der biologischen Matrices
für Clarithromycin und Rifampicin ................................................................... 53
Tab. 04: Richtigkeit und Präzision (Between-days und Within-day) für die Bestimmung
der Konzentration von Clarithromycin und Rifampicin (n = 6). ........................ 55
Tab. 05: Pharmakokinetische Daten für die Konzentration von Clarithromycin im Plasma
beim Fohlen (n=9), nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5
mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin
(7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)..................... 59
Tab. 06: Verhältnis der Konzentrationen von Clarithromycin und 14-OH-Clarithromycin
im Plasma nach der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)
und nach der kombinierten Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h)
mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)............................................................ 63
Tab. 07: Pharmakokinetische Daten von 14-OH-Clarithromycin im Plasma beim Fohlen
(n=9), nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12
h) und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o.,
q12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)................................................. 64
Tab. 08: Pharmakokinetische Daten von Rifampicin und seinem Metaboliten, 25-O-
Desacetylrifampicin im Plasma beim Fohlen (n=9), nach der kombinierten
Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10
mg/kg, p.o., q 12 h); Angaben in Mittelwert ± Standardabweichung ............... 67
Tab. 09: Menge der zurückgewonnenen Spülflüssigkeit bei neun Fohlen bei jeweils zwei
bronchoalveolären Lavagen nach der Instillation von jeweils 4x100 ml PBS-
Lösung ............................................................................................................ 68
Tab. 10: Clarithromycinkonzentration in der PELF von neun Fohlen nach der alleinigen
Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der kombinierten
Tabellenverzeichnis
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Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10 mg/kg,
p.o., q 12 h). .................................................................................................... 71
Tab. 11: Clarithromycinkonzentration in der PELF von neun Fohlen nach der alleinigen
Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und nach der kombinierten
Gabe von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10 mg/kg,
p.o., q 12 h). .................................................................................................... 73
Tab. 12: Anteile der unterschiedlichen Zellfraktionen in der BALF bei neun Fohlen. .... 74
Tab. 13: Konzentrationen von Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen bei neun
Fohlen nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q
12 h) und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h)........................................ 77
Tab. 14: Konzentration von 14-OH-Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen bei
neun Fohlen nach der alleinigen Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg,
p.o., q 12 h) und nach der kombinierten Applikation von Clarithromycin (7,5
mg/kg, p.o., q 12 h) mit Rifampicin (10 mg/kg, p.o., q 12 h) ............................ 79
Tab. 15: CT-Werte der qRT-PCR für die Gene ABCB1, ABCC2 und 18S für die Proben
der Bronchialschleimhaut und der bronchoalveolären Zellen bei neun Fohlen
nach der Applikation von Clarithromycin (7,5mg/kg) (1. Kinetik) und nach
kombinierter Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg) mit Rifampicin (10
mg/kg) (2. Kinetik). .......................................................................................... 87
Tab. 16: Biochemischen Blutparameter bei neun Fohlen an Tag 7 und an Tag 21....... 95
Tab. 17: Pharmakokinetische Daten von Clarithromycin im Serum beim Fohlen nach
einmaliger intravenöser Applikation von 7,5 mg/kg und sechsmaliger
Applikation von Clarithromycin per Nasenschlundsonde (7,5 mg/kg, i.g., zu den
Zeitpunkten 0, 24, 36, 48, 60 und 72 Stunden) (nach WOMBLE et al., 2006)142
Tab. 18: Pharmakokinetische Daten von Clarithromycin in verschiedenen
Körperflüssigkeiten und Zellen der bronchoalveolären Lavage beim Fohlen
nach der letzten Gabe der sechsmaligen intragastralen Applikation von 7,5
mg/kg. (nach WOMBLE et al., 2006)............................................................. 143
Tab. 19: Plasmakonzentrationen von Clarithromycin in ng/ml bei neun Fohlen zu den
einzelnen Blutentnahmezeitpunkten nach der alleinigen Applikation von
Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h). ............................................................... 144
Tabellenverzeichnis
- 176 -
Tab. 20: Plasmakonzentrationen von Clarithromycin in ng/ml bei neun Fohlen zu den
einzelnen Blutentnahmezeitpunkten nach der kombinierten Applikation von
Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h) und Rifampicin (10mg/kg, q 12 h)........... 145
Tab. 21: Plasmakonzentrationen von 14-OH-Clarithromycin in ng/ml bei neun Fohlen zu
den einzelnen Blutentnahmezeitpunkten nach der alleinigen Applikation von
Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h) ................................................................ 146
Tab. 22: Plasmakonzentrationen von 14-OH-Clarithromycin in ng/ml bei neun Fohlen zu
den einzelnen Blutentnahmezeitpunkten nach der kombinierten Applikation von
Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h) und Rifampicin (10mg/kg, q 12 h)........... 147
Tab. 23: Rifampicinkonzentrationen im Plasma in ng/ml bei neun Fohlen nach der
Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, q 12 h) und Rifampicin (10 mg/kg, q
12 h). ............................................................................................................. 148
Tab. 24: 25-O-Desacetylrifampicinkonzentrationen im Plasma in ng/ml bei neun Fohlen
nach der Applikation von Clarithromycin (7,5 mg/kg, bid) und Rifampicin (10
mg/kg, bid). ................................................................................................... 149
Tab. 25: Bei der BAL von neun Fohlen zurückgewonnenes Volumen in ml nach der
Instillation von jeweils 400ml PBS-Lösung. ................................................... 150
Tab. 26: Zur Berechnung der PELF bestimmte Harnstoffkonzentrationen in ng/ml der
neun Fohlen im Plasma und in der BALF...................................................... 151
Tab. 27: Nach RENNARD berechnetes Volumen der PELF in ml bei neun Fohlen (BAL
1 und BAL 2). ................................................................................................ 152
Tab. 28: Clarithromycinkonzentrationen in ng/ml in der PELF bei neun Fohlen während
der ersten Kinetik. ......................................................................................... 153
Tab. 29: Clarithromycinkonzentrationen in ng/ml in der PELF bei neun Fohlen während
der zweiten Kinetik ........................................................................................ 154
Tab. 30: 14-OH-Clarithromycinkonzentrationen in ng/ml in der PELF bei neun Fohlen
während der ersten Kinetik............................................................................ 155
Tab. 31: 14-OH-Clarithromycinkonzentrationen in ng/ml in der PELF bei neun Fohlen
während der zweiten Kinetik ......................................................................... 156
Tab. 32: Gesamtzellzahlen in G/L bei neun Fohlen in der BALF der ersten und der
zweiten BAL .................................................................................................. 157
Tabellenverzeichnis
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Tab. 33: Differenzierung der Zellen im Sediment der BALF bei neun Fohlen
(ausgezählte Zellen: 200).............................................................................. 158
Tab. 34: Clarithromycinkonzentrationen in den bronchoalveolären Zellen bei neun
Fohlen nach der 1. und nach der 2. Kinetik................................................... 159
Tab. 35: 14-OH-Clarithromycinkonzentrationen in den bronchoalveolären Zellen bei
neun Fohlen nach der 1. und 2. Kinetik......................................................... 160
Tab. 36: Verhältnis der Konzentrationen (Ratio) von Clarithromycin und 14-OH-
Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen zu den Konzentrationen im
Plasma nach 12 Stunden. ............................................................................. 161
Tab. 37: Verhältnis der Konzentrationen (Ratio) von Clarithromycin und 14-OH-
Clarithromycin in der PELF zu den Konzentrationen im Plasma nach 12
Stunden......................................................................................................... 162
Tab. 38: Verhältnis der Konzentrationen (Ratio) von Clarithromycin und 14-OH-
Clarithromycin in den bronchoalveolären Zellen zu den Konzentrationen in der
PELF. ............................................................................................................ 163
Tab. 39a: Blutchemische Parameter von neun Fohlen nach sieben Tagen Behandlung
mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) (Tag 7) und nach 21 Tagen der
Behandlung mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10
mg/kg, p.o., q 12 h) (Tag 21) (Na, K, Cl, Ca)................................................. 164
Tab. 39b: Blutchemische Parameter von neun Fohlen nach sieben Tagen Behandlung
mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) (Tag 7) und nach 21 Tagen der
Behandlung mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10
mg/kg, p.o., q 12 h) (Tag 21) (AP, LDH, Crea, Urea). ................................... 165
Tab. 39c: Blutchemische Parameter von neun Fohlen nach sieben Tagen Behandlung
mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) (Tag 7) und nach 21 Tagen der
Behandlung mit Clarithromycin (7,5 mg/kg, p.o., q 12 h) und Rifampicin (10
mg/kg, p.o., q 12 h) (Tag 21) (AST, GGT, GLDH). ........................................ 166
Tab. 40: CT-Werte der neun Fohlen für die Genexpression von ABCB 1 und ABCC 2 in
den Bronchialbioptaten.................................................................................. 167
Tab. 41: CT-Werte der neun Fohlen für die Genexpression von ABCB 1 und ABCC 2 in
den bronchoalveolären Zellen. ...................................................................... 168
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Danksagung
Frau PD Dr. Monica Venner möchte ich sehr herzlich für die Überlassung des
interessanten Dissertationsthemas und für die Korrektur meiner Dissertation danken,
außerdem gilt Ihr ein ganz besonderer Dank für Ihre fachliche Unterstützung zu jeder
Zeit, für die vielen wertvollen Anregungen, für die Hilfsbereitschaft und für die Kritik bei
der Durchsicht dieser Arbeit.
Herrn P. Schockemöhle danke ich für die Bereitstellung der Pferde, für die großzügige
finanzielle Unterstützung und für die kooperative Zusammenarbeit.
Frau M. Müller-Eberstein, Herrn W. Treu, Frau I. Baak, Herrn M. Lämmer und allen
Mitarbeitern des Gestüts Lewitz danke ich für die unkomplizierte und kooperative
Zusammenarbeit und für die Hilfe bei der Durchführung dieser Studie.
Herrn Prof. Dr. W. Siegmund danke ich für die Analyse der Proben, für die finanzielle
Unterstützung und für die kooperative Zusammenarbeit.
Ein großer Dank gilt Jette Peters für die gute Zusammenarbeit, die vielen gelösten
Fragen und die einzigartige Unterstützung.
Ein riesiges Dankeschön an Kristina, Lisa, Nicole, und Sabrina für Eure großartige, wie
selbstverständlich erscheinende Hilfe an all den Abenden in D6, bei der Behandlung –
auch der schnellsten Raketen und für diesen tollen Sommer 2008.
Ganz besonders danke ich Marc Lämmer für seine großartige Unterstützung bei der
Durchführung der BALs, für seinen ehrlichen Rat, für die gute Betreuung der
Doktoranden und für seine Freundschaft.
Matthias und Sebastian danke ich herzlich für Ihre Hilfe vom Morgengrauen an bis tief in
die Nacht.
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Ich danke Stefan Osswald, Frau Schumacher und Frau Bade für die Analytik und die
jederzeit gewährte Unterstützung sowie Danilo Wegener für die Beantwortung aller
statistischen und pharmakokinetischen Fragen.
Ich danke meinen Eltern ganz herzlich dafür, dass sie mich auf meinem Lebensweg
jederzeit begleitet und unterstützt und mir das Studium sowie die Anfertigung dieser
Dissertation ermöglicht haben.
Ich danke meinen Wintermitbewohner/innen Henrik und Kristina für die tolle Vor-/
Weihnachts- und Nachweihnachtszeit, die Worldtour und die vielen nie aufgeführten
Performances, für das immer wieder Mut machen und all die Freude die wir gemeinsam
hatten.
Urs, ich danke Dir dafür dass Du auch aus der Ferne zu jeder Zeit erreichbar warst,
immer da warst und dafür, dass Du das nach Hause kommen so viel schöner gemacht
hast.
