Upload
others
View
7
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Tüm Genom Analizi ve
Klinik Mikrobiyoloji
Dr. Burak AksuM.Ü. Tıp FakültesiT.Mikrobiyoloji AD.
Tüm Genom Analizi ve Klinik Mikrobiyoloji
• DNA dizileme yöntemleri• Tüm genom analizi• Mikrobiyolojide kullanım alanları• Klinik Mikrobiyolojide kullanım alanları
• Bakteri tanımlama• Antibiyotik direnci saptama• Virulans saptama
• Klinik Virolojide kullanım alanları• Sonuç
DNA Dizileme Yöntemleri
•1975, Sanger
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5463–7.
•2002, Yeni nesil sistemler•2. nesil dizileme
DNA Dizileme Yöntemleri
Schadt EE, Turner S, Kasarskis A. 2010. A window into third-generation sequencing. Hum Mol Genet. 19(R2):R227-40.
DNA Dizileme Yöntemleri
•2005, 3. nesil dizileme
Schadt EE, Turner S, Kasarskis A. 2010. A window into third-generation sequencing. Hum Mol Genet. 19(R2):R227-40.
DNA Dizileme Yöntemleri
Bertelli C, Greub G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin Microbiol Infect. 2013;19(9):803-13.
DNA Dizileme Yöntemleri
Tüm Genom Dizileme
•1995, Haemophilus influenzae•1.8 Mb genom•13 ay•1.5 milyon $
•2016, Genomes OnLine Database (GOLD)•16150 bakteri genomu dizisi•1.8 Mb genom•
Tüm Genom Dizileme
Caboche S, Audebert C, Hot D. High-Throughput Sequencing, a VersatileWeapon to Support Genome-Based Diagnosis in Infectious Diseases: Applications to Clinical Bacteriology. Pathogens. 2014 2;3(2):258-79.
Son birkaç yıldır dizilemeye alınan genom sayısı her 6-9 ayda bir katlanmaktadır
Yeni Nesil Dizileme ve Mikrobiyoloji
Mikrobiyota çalışmaları Transkriptom• Barsak Virom• Cilt Mikobiyom• Mukoza …
Metagenomik çalışmaları• Deniz, göl…• Kanalizasyon• Toprak
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide Kullanım
•Bakteri tanımlama•2010•MALDI‐TOF MS (matriks‐aracılı lazer desorpsiyon‐iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometresi)
•Hızlı, doğru tanımlama*** • Epidemiyolojik tiplendirme• Toksin tespiti • Antibiyotik duyarlılığını saptama
•Mikroorganizmanın tüm özellikleri
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide Kullanım
•Bakteri tanımlama
16s rDNA~1500 bp
16s rDNA PCR
AGA GTT TGA TCM TGG CTC AGCGG TTA CCT TGT TAC GAC TT
DizilemeVeri tabanıyla karşılaştırma
Cins – tür düzeyinde tanımlama
Tüm Genom Dizisi
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide Kullanım
•Bakteri tanımlama
16s rDNA~1500 bp
16s rDNA PCRAGA GTT TGA TCM TGG CTC AGCGG TTA CCT TGT TAC GAC TT
DizilemeVeri tabanıyla karşılaştırma
Cins – tür düzeyinde tanımlama
Tüm Genom Dizisi
Veri tabanıyla karşılaştırmaCins – tür düzeyinde tanımlama
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
• Kültürden tanımlama• Doğrudan örnekten tanımlama
• Özgün primer seçimine gerek yok• Özellikle üretilmesi zor, zaman alıcı veya mümkün olmayan patojenler
• İnsan/patojen DNA oranı yüksek• Daha etkin nükleik asit saflaştırma yöntemleri gerekli• PCR duyarlılığına ulaşmak zor• Kullanılan solüsyonlarda bakteri kontaminasyonu
• 14 yaş erkek çocuk• 4 ay süren ateş ve başağrısı• Hidrosefali ve epilepsi nöbetleri• Menenjit?
• Menenjit?
• İdrar yolu enfeksiyonu şüphesi•35 idrar örneği
İdrar kültürü Örnekten Tüm Genom Dizileme
Klasik tanımlama•19 üreme (+) Koloniden Tüm Genom Dizileme
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
•Antibiyotik direnci saptama• In siliko antibiyotik duyarlılık testi
•Genotip Fenotip•Büyük hata:
• Bir genin varlığı, direnç ile eş anlamlı olmayabilir
•Çok büyük hata:• Bir genin yokluğu, direnç olmaması ile eş anlamlı olmayabilir
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
•Antibiyotik direnci saptama•Gen aktarımı ile gelişen direnç (beta laktamaz genleri gibi)
•Özgül genlerdeki mutasyonlara bağlı gelişen direnç (rpoB, gyrA..)
•Ekspresyon artışı, birden fazla geni ilgilendiren karmaşık düzenleyici sistemlerde oluşan değişiklikler
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
•Antibiyotik direnci saptama
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
•A.baumannii enfeksiyonu
•Tedavi sırasında tigesikline direnç
•Tedavi öncesi/sonrası izolatlarda genom analizi
•18 tek nükleotid değişimi (SNP) ve 3 delesyon
Hornsey M et al. Whole-genome comparison of two Acinetobacter baumannii isolates from a single patient, where resistance developed during tigecycline therapy. J Antimicrob Chemother 2011,66:1499–1503
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
•Tüm genom dizileme verisinin antibiyotik duyarlılığını belirlemede kullanımı sınırlı:
•Direnç geni veya mutasyonu,• dirence neden olmayabilir• indüklenebilir dirençle ilişkili olabilir• antibiyotik duyarlılığına ait kantitatif veri sağlamaz
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
•Antibiyotik duyarlılığını belirleme amacıyla hazırlanmış ve sürekli güncellenen veri tabanları
•Tüm genom dizileme verisinden antibiyotik duyarlılığına ait bilgiyi süzecek yazılımlar
•Sürekli kontrolün sağlanabilmesi için fenotipik direnç testleri de yapılmalı
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
•Virulans saptama•Hastadaki patolojik değişiklikler ve sonuçları ile patojenin genom bilgisi arasındaki ilişkinin incelenmesi ile yeni virulans faktörlerini belirleme imkanı
•Güncel veritabanı/yazılım gereksinimi
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
•Epidemiyolojik tiplendirme•Enfeksiyon kontrolü•Sürveyans
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
•Epidemiyolojik tiplendirme•Tüm genom dizileme verisi = son durak
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
Kong Z, Zhao P, Liu H, Yu X, Qin Y, Su Z, et al. (2016) Whole-Genome Sequencing for the Investigation of a Hospital Outbreak of MRSA in China. PLoS ONE 11(3): e0149844.
Tüm Genom Dizileme Klinik Virolojide Kullanım
•Tüm viral genom dizileme•Virus‐hastalık ilişkisi•Virus florasının içeriği ve insan sağlığına etkileri•Rezervuarların ve bulaş yollarının saptanması•Türümsülerin (quasispecies) aynı konakta veya konaklar arasında çeşitliliği, virus bulaşı, viral adaptasyon dinamiği ve hastalık progresyonu üzerindeki etkileşimleri
Tüm Genom Dizileme Klinik Virolojide Kullanım
•Antiviral ilaç direnci saptama• İlaca dirençli virus (mutant) oranı
•Sanger dizileme ile saptama sınırı >%15‐20•Yeni nesil dizileme ile saptama sınırı: %0.1‐1
•Reseptör tropizminin belirlenmesi•HIV
Tüm Genom Dizileme & Klinik Mikrobiyoloji
•Teknolojideki gelişmeler, rekabet ve maliyetlerin düşmesi ile bu yöntemler artık daha ulaşılabilir
•Elde edilen veri çok kapsamlı ve büyük•Veri depolama !!!•Biyoinformatik !!!•Kullanılan teknolojiden bağımsız veri analizi yazılımlarına gereksinim
•Sürekli güncellenen ve denetlenen veri tabanlarına gereksinim
Sonuç•Bugün için;•Düşük hata oranı, yüksek okuma kapasitesi ve uygun maliyete sahip, mükemmel bir yeni nesil dizileme platformu henüz yok…
•Tüm genom dizileme yöntemlerinin klinik mikrobiyolojide kullanıma girmesi artık sadece bir zaman meselesi…
İlginiz için teşekkürler…