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Química Orgánica II Aminoácidos y Proteínas

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Trabajo Práctico de Laboratorio 4

Tema: Aminoácidos y Proteínas

Introducción Teórica

AMINOÁCIDOS

Propiedades químicas

Los aminoácidos poseen en su estructura un grupo ácido y un grupo básico, por lo cual presentan propiedades anfotéricas. Un anfolito es aquella especie que puede aceptar y donar protones (H+). En una solución de bajo pH, los aminoácidos están totalmente protonados y tienen una carga positiva. Si la solución es casi neutra, los aminoácidos existen como iones dipolares, o sea iones con una carga positiva y una carga negativa. Los iones dipolares también se conocen como zwitteriones. Un aminoácido que existe como un ion dipolar es neutro ya que las cargas, positiva y negativa, se cancelan. Para valores de pH altos, los aminoácidos se cargan negativamente. En solución se establece un equilibrio entre las tres formas.

Por ejemplo, para el aminoácido glicina:

• A pH 2 todos los grupos aparecen protonados: -COO- como -COOH y -NH2 como -NH3

+. El aminoácido tiene una carga positiva neta.

• A partir de pH 2,34 (pK1) el carboxilo se disocia (-COO-) y el amino sigue protonado (-NH3

+). El aminoácido tendrá simultáneamente carga positiva y negativa (zwitterion).

• A partir de pH 9,60 (pK2) el carboxilo sigue disociado (-COO-) y el amino pierde el protón (-NH2). El aminoácido queda con una carga negativa neta.

Si analizamos el movimiento electroforético de los aminoácidos a distintos valores de pH, encontraremos un valor al cual su movilidad es nula. Este valor de pH corresponde a la condición en la cual la especie dominante es aquella que no posee carga eléctrica neta. Este valor de pH recibe el nombre de punto isoeléctrico (pI). Podemos definir entonces al pI como el valor de pH al cual un aminoácido, un péptido o una proteína poseen carga neta “0”. Este valor se puede calcular a partir de la curva de titulación o empleando la siguiente ecuación: pI= (pK1+ pK2)/2.


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Titulación en presencia de formaldehido

Este procedimiento de titulación de aminoácidos con un hidróxido en presencia de formaldehido fue diseñado por Sørensen en 1907 y se basa en el consumo de la especie con el grupo amino libre, lo cual produce un desplazamiento a la derecha del equilibrio indicado como pK2, con la consiguiente liberación de protones y acidificación del medio. El descenso en los valores de pH se registra a partir de la generación de la especie nucleófila, es decir a partir del punto de inflexión correspondiente al valor de pK del grupo amino.

En el caso de un aminoácido dicarboxílico, como ácido aspártico como por ejemplo:


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En este caso, para calcular el pI deben considerarse los valores de pK que rodean a la especie de carga neta 0.

Por último, para el caso de un aminoácido dibásico, como arginina, se observa que:

Al igual que en caso anterior para calcular el pI deben considerarse los valores de pK que rodean a la especie de carga neta 0, encontrándose el zwitterion a pH básico.


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Una reacción característica de aminoácidos es la conjugación de su grupo amino con ninhidrina. Esta reacción es de gran utilidad porque genera un aducto coloreado que sirve como revelador en cromatografía en placa delgada (CCD).

Reacción general de un aminoácido con ninhidrina


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Mecanismo de reacción

Reacción de ninhidrina con el aminoácido prolina


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ENLACE PEPTÍDICO

Una unión peptídica es un enlace amida entre el grupo α-amino de un aminoácido y el α-carboxilo de otro. Como cualquier amida su estructura presenta más de una forma contribuyente con buen peso en su híbrido de resonancia:

Esta es una característica central de péptidos y proteínas, que determina no solo la arquitectura proteica, sino también cuestiones importantes en relación a su química. Una de ellas es la interpretación de su mecanismo de hidrólisis en medio ácido, dónde el análisis de las estructuras contribuyentes al híbrido de resonancia justifica la posición más básica del enlace.

H3N CH C

CH3

OHHN CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

H3N CH C

CH3

OHHN CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

H3N CH C

CH3

OHHN CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

HO

H

H3N CH C

CH3

OHHN CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

OH2

H3N CH C

CH3

OHH2N CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

OH

H3N CH C

CH3

OHH2N CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

OH

H3N CH C

CH3

OH

H3N CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

O

lenta


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INSULINA

La insulina es una hormona polipeptídica formada por 51 aminoácidos, producida y secretada por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas. La insulina es una hormona anabólica por excelencia, ya que permite disponer a las células del aporte necesario de glucosa para los procesos de síntesis con gasto de energía. Esta hormona reduce el nivel de glucosa en la sangre y promueve el almacenamiento de glucosa como glucógeno y grasa.

La insulina está constituida por dos secuencias de aminoácidos. La cadena A tiene 21 aminoácidos, y la cadena B tiene 30 aminoácidos. Las cadenas están unidas entre sí a través tres puentes disulfuro. Las hormonas peptídicas por lo general son diferentes para cada especie, aunque conservan similitudes importantes. La insulina humana es idéntica a la insulina de cerdo, excepto que el último aminoácido de la cadena B del cerdo es alanina (Ala) en vez de treonina (Thr).


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ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

La electroforesis es una técnica basada en los movimientos de moléculas cargadas en un campo eléctrico, cada molécula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (cátodo y ánodo), este movimiento denominado “electroforesis” da nombre a la técnica. En el transporte electroforético, a la fuerza del campo eléctrico se opone la resistencia viscosa del medio, produciéndose, cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de las partículas.

En resumen, puede asumirse que cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo tanto de su densidad de carga y de la intensidad del campo eléctrico.

La electroforesis se aplica en el campo de la Bioquímica a la separación de compuestos que poseen grupos ionizables (aminoácidos, péptidos, proteínas y ácidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias dependerá del pH del medio en que se encuentren. Si la molécula tiene carga positiva migrará hacia el cátodo y si tiene carga negativa migrará hacia el ánodo. La fuerza iónica de la solución buffer tiene una importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migración de los solutos más rápidas y con menor desprendimiento de calor.

Como se describió previamente, las proteínas pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente o permanecer eléctricamente neutras, según la proporción de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. En su pI una proteína tiene carga neta cero. Por debajo de los valores de pI las proteínas estarán cargadas positivamente y por encima, negativamente.

Las proteínas de suero humano se pueden separar mediante esta técnica. Sus puntos isoeléctricos están entre 4,9 (albúmina) y 7,4 (γ -globulinas). Al realizar la electroforesis con un buffer de pH= 8,6, todas las proteínas del suero tendrán carga negativa. La albúmina, al tener el punto isoeléctrico más alejado del pH, tiene más carga negativa y avanza más rápido, quedando más cerca del polo positivo que las γ -globulinas, que migran muy poco por ser el pH del buffer de corrida próximo a su pI. Las restantes proteínas séricas quedan situadas entre estas dos.

En suero humano la composición normal es:

Albúmina 54 - 62%

α-globulinas 9 - 15%

β-globulinas 8 - 13%

γ-globulinas 14% - 19%


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El perfil de un electroforetograma de un suero humano adulto normal es similar al representado en el siguiente esquema.


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Parte práctica

Parte 1: Propiedades anfotéricas de los aminoácidos. Curva de Titulación de Glicina

Objetivo: Obtener la curva de titulación en función del pH, de glicina, en ausencia y presencia de formaldehido. Comparar las curvas obtenidas, calcular los pKa correspondientes y el punto isoeléctrico del aminoácido.

Conocimientos necesarios para la realización e interpretación del trabajo

• Equilibrio ácido-base. Nomenclatura y formulación de Bronsted-Lowry y Lewis. pH. Curva de titulación de ácidos débiles.

• Aminoácidos como iones dipolares. Curvas de titulación, en medio acuoso y con el agregado de formol, etanol o acetona. pH observados. Formas iónicas.

• Punto isoeléctrico de un aminoácido. Cálculo del mismo.

Realizar las siguientes curvas de titulación:

1) 200 ml de glicina 0,05 M en agua, titulado con NaOH 1 M.

2) 200 ml de glicina 0,05 M en agua, con formol (glicina 0,05 M; formol 1 M) titulado con NaOH 1 M.

Para realizar la curva 1 prepare la siguiente solución:

Glicina 1 M.............. 10,00 ml (exacto)

HCl 1 M................... 10,00 ml (exacto)

Agua destilada......... 180,00 ml (exactos)

Para realizar la curva 2 prepare la siguiente solución:

Glicina 1 M.............. 10,00 ml (exacto)

HCl 1 M................... 10,00 ml (exacto)

Formaldehído.......... 01,00 ml (exacto)

Agua destilada......... 170,00 ml (exactos)


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Colocar en un erlenmeyer de 500 ml la mezcla inicial a titular, preparar la bureta con la solución titulante de NaOH 1M. (Asegure el buen funcionamiento de los robinetes. El pHmetro deberá estar calibrado con buffer pH 4,0 a temperatura ambiente).

Precauciones: La medición de los volúmenes de glicina, ácido clorhídrico y formaldehído deberá realizarse con exactitud, para ello se utilizará pipetas de doble aforo (usar una pipeta distinta en cada caso).

Titulación

Colocar en el vaso de precipitación la solución a titular, a temperatura ambiente, con el agitador. Introducir con mucho cuidado el electrodo de vidrio hasta que el líquido cubra el bulbo y el orificio de unión líquida del electrodo. Acercar la bureta de modo que el pico de la misma esté dentro del vaso de precipitación.

Agitar por un momento; dejar reposar el líquido y medir el pH inicial de la solución. Dejar caer un volumen de la solución de titulación y agitar suavemente (los volumenes a agregar se encuentran en la tabla de valores). Dejar de agitar y proceder a la lectura del pH.

Continuar agregando la solución de titulación según lo indicado en la tabla de valores, agitando después de cada agregado y dejando de agitar, para luego realizar la lectura de pH. Proseguir la titulación hasta pH extremo (alrededor de pH 10-12) con NaOH.

Tabla de valores

NaOH 1M (ml) Glicina

pH

Glicina + Formaldehído

pH

0

0.3

0.6

1

2

3

4

5

6


12

7

8

9

10

10.3

10.6

11

11.3

11.6

12

13

14

15

16

17

18

19

20.0

Precauciones: Al llegar al pH extremo no dejar el electrodo de vidrio sumergido en la solución por más de 2 ó 3 minutos (especialmente en medio alcalino), dado que el vidrio con el que está fabricado el electrodo es atacado y pierde sensibilidad. Inmediatamente, sacar el electrodo y lavarlo con abundante agua bidestilada. Esta precaución es esencial y se considerará falta grave no tratar el electrodo con estos cuidados.

Al finalizar el trabajo práctico, lavar la microbureta con HCl al 10% y con agua destilada, para evitar de esta forma que se pegue el robinete y quede inutilizado.


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Trazar una curva de titulación con pH en las ordenadas y miliequivalentes de reactivo agregado en las abscisas.

Comparar las curvas de glicina con formaldehído y sin formaldehído; para ello grafique las dos curvas de glicina en una misma hoja de papel milimetrado. Indique los respectivos pK y calcule el punto isoeléctrico del aminoácido glicina.


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Parte 2: Aminoácidos y proteínas

Objetivo: Realizar la hidrólisis química de un péptido natural y observar sus aminoácidos constituyentes, por análisis cromatográfico en CCD.

1. Hidrólisis de Insulina

Técnica:

Colocar 1 ml de insulina (80-100 U) en un tubo ampolla y con cuidado, adicionar 1ml de HCl concentrado. Observe la coagulación de la proteína por adición del ácido. Cerrar el extremo del tubo sobre la llama de mechero (esta paso será llevado a cabo previamente por el ayudante de laboratorio). Colocar el tubo en un baño de agua a ebullición durante 45 minutos. La temperatura del baño no debe ser inferior a 100 °C, en caso contrario, utilizar un baño de glicerina.

Transcurrido el tiempo de calentamiento, cortar el extremo del tubo ampolla y volcar su contenido con precaución, en un vidrio de reloj. Llevar a seco sobre un manto de evaporación. Una vez seco, retomar el extracto con 2-3 gotas de ácido acético diluido y realizar los cromatogramas correspondientes.

2. Cromatografía en placa del hidrolizado de insulina

Condiciones de la cromatografía

Material:

Fase estacionaria: Sílica gel.

Solvente de corrida: Butanol: ácido acético: agua (60:20:20)

Revelador: Ninhidrina (solución alcohólica 1.5 %)

Con el extracto obtenido, realizar la cromatografía empleando los patrones de aminoácidos disponibles disueltos en ácido acético. Una vez desarrollada la cromatografía, secar la placa, revelarla y colocarla en la estufa a 120 °C durante unos minutos.


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Parte 3: Fraccionamiento de proteínas séricas por electroforesis

Objetivo: Separar mediante la técnica electroforética las proteínas presentes en el suero, utilizando como soporte acetato de celulosa.

1. Obtención de suero

A partir de 10 ml de sangre extraída sin anticoagulante, separar el suero por centrifugación a 3000 rpm durante 5-10 minutos (esta paso será llevado a cabo previamente por el ayudante de laboratorio).

2. Puesta a punto de soporte

Sumergir las tiras de 8,5 cm por 2,5 cm de acetato de celulosa en solución buffer de veronal-veronal sódico, pH 8,6 y fuerza iónica 0,036, durante como mínimo 10 minutos o hasta saturación. Eliminar mediante suave presión entre papeles de filtro el exceso de buffer.

3. Ubicación del soporte en la cámara de electroforesis

Colocar las tiras (con pinzas) en el puente correspondiente. El contacto soporte- buffer, se efectúa mediante papel de filtro Whatman N°1 del mismo ancho de la tira. Se debe evitar el contacto directo de las tiras de soporte con la solución buffer, para prevenir distorsiones del frente.


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4. Sembrado de la muestra y desarrollo del electroforetograma

Sembrar (con capilar) el suero en una banda estrecha que no alcance los bordes de la tira de acetato de celulosa y a 2 cm del extremo catódico. Desarrollar la corrida electroforética durante 60 minutos aplicando un potencial de 200 V, resultando un amperaje de 1 a 1,5 Amp por tira.

5. Coloración

Una vez finalizada la operación anterior, retirar las tiras y sin secar, sumergir en la solución colorante (Negro de Amido 10 B (Amidoschwarz 10 B) al 0,5% en agua) durante 30 a 60 segundos.

6. Decoloración

Se procede a remover el exceso de colorante usando una mezcla de metanol-ácido acético (95:5), renovando la solución de lavado hasta que no extraiga más colorante.


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Algunas consideraciones a tener en cuenta:

a. Conservación de las tiras de acetato de celulosa:

El paquete abierto debe conservarse en posición vertical hasta que se utilicen todas las tiras. Si las 25 tiras se usan en el lapso de una semana, agregar agua dentro del paquete; pero si se usan en un período superior a los 15 días, conservarlas en un recipiente conteniendo metanol. No dejarlas secar al aire porque las tiras pierden las dimensiones y las características del gel.

b. Reconocimiento de la superficie permeable por las proteínas:

Sólo una superficie es permeable por las proteínas y se reconoce fácilmente porque es más opaca, después de secarse entre dos hojas de papel de filtro.

c. Composición del buffer pH 8.6

- Veronal sódico 0.04 (recomendado)

- Veronal sódico 5.15 + EDTA

- Veronal sódico + Veronal ácido

d. Solución de negro amido

- Metanol 450 ml

- Ácido acético 100 ml

- Negro amido 6,0 g


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- Agua destilada 450 ml

Precauciones: Utilizar guantes para manipular el suero. No abrir ni sacar las tiras de la cuba electroforética mientras el equipo se encuentre enchufado.

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