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Criao e produo de animais transgnicos e nocautes
Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay
SciELO Books / SciELO Livros / SciELO Libros ANDRADE, A., PINTO,
SC., and OLIVEIRA, RS., orgs. Animais de Laboratrio: criao e
experimentao [online]. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ, 2002. 388
p. ISBN: 85-7541-015-6. Available from SciELO Books .
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Criao e produo de animais transgnicos e nocautes
C riao e Produo de Animais Transgnicose Nocautes
Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay
INTRODUOAnimais transgnicos so aqueles cujo genoma foi
modificado pela introduo de seqncias de DNA de
outro organismo. Muitas vezes tais seqncias so manipuladas por
engenharia gentica de tal forma queconstituem uma mistura de pedaos
de DNA vindo de diversas origens.
No caso de animais nocautes, a modificao gentica introduzida
capaz de interromper ou anular umgene que, ento, no mais se
expressa, sendo denominado de nocauteado.
A idia de se introduzir material gentico em um embrio data da
dcada de 70 do sculo XX quando atecnologia de DNA recombinante se
tornou uma realidade. As primeiras tentativas se valeram da infeco
porvrus que carreavam em seu interior pedaos de DNA exgenos, mas
logo as tcnicas de microinjeorevolucionaram a capacidade de se
introduzir um gene clonado no interior do ncleo do embrio.
Hoje em dia algumas metodologias so utilizadas na produo de um
camundongo transgnico, como:
MICROINJEO NO PR-NUCLEO MASCULINO
A microinjeo no pr-nucleo consiste na introduo de uma soluo de
DNA diretamente no pr-nucleo de um ocito recm-fecundado. Em cerca
de 30% dos ocitos assim manipulados, o DNA exgeno vaise integrar no
genoma e embries transgnicos sero produzidos.
OBS.: animal nocaute um animal que nulo para um determinado
gene, ou seja, esse gene teve seusalelos modificados geneticamente
de modo a no mais produzirem uma protena ativa.
Figura 1 Esquema de microinjeo pr-nuclear
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ANIMAIS DE LABORATRIO
A) Introduo da agulha de microinjeo no pr-ncleo masculino do ovo
fertilizado.B) Aps a injeo, verifica-se o aumento do pr-ncleo. Em
ambos os casos o ovo est mantido em
posio por uma pipeta de sustentao (Hogan et al., 1994).
TRANSGNESE MEDIADA POR CLULAS ES
Uma maneira diferente de se introduzir genes exgenos em uma
linhagem de camundongo pelatransformao inicial de clulas-tronco
embrionrias e posterior introduo dessas clulas no embrio em fasede
mrula ou blastocisto. As clulas totipotentes utilizadas nesses
experimentos so as clulas ES (EmbryonicStem Cell). Clulas ES so
clulas obtidas da massa interna de um blastocisto e que so mantidas
em sua formaindiferenciada, podendo gerar toda e qualquer clula do
organismo. Em geral o transgene contm, alm doDNA a ser estudado, um
gene de resistncia a drogas (neomicina) e um gene-reprter como o
gene Lac Z deEscherichia coli ou GFP. Esse transgene transferido
para as clulas ES por eletroporao e 1% destas tero deuma a vrias
cpias do DNA exgeno integrado. Aps a eletroporao, aquelas que contm
o transgene seroselecionadas pela presena do antibitico no meio de
cultura. As clulas transformadas sero ento injetadaspara a formao
de um embrio quimrico, isto , formado por clulas ES transformadas e
clulas do embriorecipiente.
Essa tcnica a nica que pode ser utilizada para fazer o nocaute
de um gene, uma vez que a troca do genenormal pelo DNA exgeno que
ir anular o gene ocorre por recombinao homloga e esse fenmeno
aconteceem maior freqncia nas clulas ES.
Figura 2 Modificao gentica introduzida em um lcus
Fonte: modificado de Stephane Viville em Houdebine (1997).
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Criao e produo de animais transgnicos e nocautes
A) Modificao por troca do DNA no lcus.B) Modificao do lcus pela
insero de um fragmento de DNA.
INFECO POR RETROVRUS
Neste caso, o DNA exgeno deve ser inserido num vetor retroviral
que ser, ento, injetado diretamenteno ocito fertilizado.
Figura 3 Construo retroviral para transferncia de um
transgene
Outras metodologias tm sido tentadas alternativamente, mas com
menor eficincia.Em todos os casos o primeiro passo dessa tecnologia
consiste na obteno de ocitos fertilizados ou
embries no incio do desenvolvimento. Tendo em vista que cada
fmea de camundongo produz, por ciclo,cerca de 8 a 12 ovos que sero
liberados naturalmente, torna-se necessrio encontrar maneiras de se
aumentaro nmero de ovos obtidos. Isso possvel estimulando as fmeas
com um regime hormonal; este consiste nainjeo de 5UI de PMS
(pregnant mare serum) e 46 horas aps 5UI de HCG (human chorionic
gonadotrophin).
O acasalamento das fmeas logo aps a ltima injeo pode levar
obteno de 30 a 60 ovos de cada fmeadependendo da linhagem
utilizada. Desses ovos, aqueles que estiverem fertilizados podero
ser, ento, utilizadospara microinjeo. No caso de se estar
trabalhando com a transgnese via clulas ES, os ovos s devero
serrecuperados nos estgios de mrula ou blastocisto (2,5 ou 3,5 dias
ps-coito) quando sero injetados com asclulas ES transgnicas. Nos
dois casos, os ovos ou embries injetados devero ser reimplantados
em camundongasbarriga de aluguel. Estas so pseudogrvidas obtidas
pelo cruzamento de fmeas no perodo de estrus commachos
vasectomizados. A implantao se dar na ampola do oviduto, para os
ocitos fertilizados; no ovidutopara as mrulas, e no tero para os
blastocistos.
SEQNCIAS VIRAIS
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ANIMAIS DE LABORATRIO
Figura 4 Esquema geral da obteno de um fundador portando um
transgene
Portanto, um aspecto importante para se produzir animais
transgnicos o acesso a um biotrio dequalidade que fornea uma
quantidade razovel de camundongos de idades e linhagens
determinadas.
PSEUDOGRVIDA
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Criao e produo de animais transgnicos e nocautes
O BIOTRIO IDEAL PARA SE CRIAR ANIMAIS TRANSGNICOSIdealmente todo
animal de experimentao deve ser mantido num ambiente livre de
patgenos como
vrus, bactrias e parasitas que podem alterar os resultados de um
experimento. No caso de animaistransgnicos ainda mais importante a
qualidade do biotrio, tendo em vista que eles so mais frgeisdevido
manipulao gentica. Portanto, um biotrio projetado especialmente o
ideal quando se desejaproduzir ou criar animais transgnicos.
Nos casos mais restritos, como quando se estabelecem colnias de
camundongos nocautes para genesimunolgicos, barreiras devem ser
criadas para se aumentar o isolamento da colnia. Nesses casos, os
bioteristase pesquisadores devem tomar uma ducha e trocarem toda a
vestimenta ao entrar no biotrio. Todo o materialde consumo como
gua, comida, maravalha, suplementos, gaiolas etc. devem ser
autoclavados antes de penetrarno ambiente. Os animais vindos de
outros laboratrios ou fornecedores devem passar por uma quarentena
eserem testados para diferentes patgenos. Em casos em que a
imunidade dos animais no est em questo,barreiras menos rgidas so
exigidas. Por exemplo, o banho dos que adentram o biotrio pode ser
eliminado.No entanto, quando os animais so extremamente frgeis, o
melhor manter a colnia pequena e dentro deisoladores. O mesmo deve
ser feito quando o problema for a sade do experimentador e no a do
animal.
Um aspecto importante a climatizao do biotrio. Biotrios com
patgenos controlados, geralmente,tm de manter as salas de animais
com presso positiva para que os germes tenham dificuldade de
entrar.Porm, biotrios que mantenham animais geneticamente
modificados devem, por lei, manter uma pressonegativa em relao ao
meio ambiente, uma vez que o que deseja conter so os animais
modificados. Assimsendo, num projeto de biotrio em que se mantenham
animais do tipo selvagem e aqueles geneticamentemodificados deve-se
pensar em ter salas com presso positiva e filtros esterilizantes
para se manter as colniasselvagens e os animais imunologicamente
deficientes. Entretanto, animais modificados que possam
representarum risco para o meio ambiente ou para o homem devem ser
mantidos em salas com presso negativa. Obiotrio como um todo por
sua vez deve ser mantido em presso negativa em relao ao meio
externo.
Um desenho que pode ser tomado como modelo para um biotrio desse
tipo pode ser visto na figura a seguir.
Figura 5 Planta de um biotrio de transgnicos
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ANIMAIS DE LABORATRIO
QUE ANIMAIS DEVEM SER UTILIZADOS NA PRODUO DE TRANSGNICOSO
background gentico parece ter influncia na penetrao de um fentipo
nocauteado; portanto, muitas
vezes linhagens especficas tm de ser utilizadas.Em princpio,
qualquer linhagem de camundongo pode ser modificada geneticamente,
mas algumas
apresentam vantagens experimentais. Linhagens inbred ou hbridas
F1 variam em relao ao nmero de ovosque produzem aps superovulao.
Geralmente, elas podem ser divididas em duas categorias, as que so
boassuperovuladoras (colocam 40 a 60 ovos por camundonga) e aquelas
que superovulam mal (15 ou menos ovospor camundonga). Como o nmero
de ovos obtidos sempre um fator limitante num experimento de
transgnese,deve-se escolher uma linhagem boa superovuladora para
trabalhar. Entre estas podemos citar a C57BL/6J, aBALB/cByJ, a
129/SvJ ou ainda hbridas de C57BL/6J com CBA/CaJ, DBA/2J ou
BALB/cByJ.
A deciso de qual dessas linhagens utilizar levam em conta se a
cor do plo ser um indicador da transgnese.Isso ocorre nos
experimentos de nocaute em que o camundongo gerado uma quimera
formada por clulasdo blastocisto e por clulas ES transformadas.
Para se ter uma noo de quanto as clulas ES transgnicascontriburam
no desenvolvimento do animal, basta utilizar, por exemplo, clulas
de um camundongo de plomarrom num blastocisto obtido de camundongo
de plo preto. A quimera resultante apresentar o plo deduas cores,
como pode ser visto na figura a seguir.
Figura 6 Esquema geral de obteno de quimeras
Fonte: modificado de Stephane Viville em Houdebine (1997).
Na F1 verificamos que filhotestransmitiram a modificao
gentica
camundongo selvagemProle quimrica com plosde duas cores
implantao doblastocisto
Blastocistos socolocados em cultura para
gerar linhagens ES
As clulas manipuladasso injetadas de volta
em novos blastocistos,agora obtidos de fmea
de plo preto
OBTENO DE BLASTOCISTO3,5 dias aps a cpula, por
lavagem dos teros da fmeade plo branco
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Criao e produo de animais transgnicos e nocautes
Para se maximizar o nmero de ovos obtidos de camundonga
superovulada, deve-se cruz-la com machosque tenham uma alta
contagem de esperma e uma boa capacidade de cpula. Esses machos so
mantidos emgaiolas separadamente.
Portanto, o biotrio de transgnicos dever manter camundongos,
para diversas finalidades, que podemser de linhagens diferentes
como listado a seguir:
FMEAS JOVENS PARA PRODUO DE OVOS FERTILIZADOS
Como dissemos anteriormente, vrias linhagens inbred ou hbridas
podem ser utilizadas nessa etapa. Parase produzir o nmero necessrio
de fmeas jovens ( 3 semanas) para superovulao, necessrio um nmerode
20 gaiolas contendo um macho e uma fmea que iro produzir uma
prognie de cerca de 20 fmeas porsemana para experimentao.
MACHOS FRTEIS
Cerca de 20 gaiolas contendo machos jovens e frteis de pelo
menos 8 semanas devem ser mantidas nobiotrio de transgnese. Esses
machos sero utilizados para cpula com as camundongas superovuladas.
Elespodem ser hbridos como estas ou inbred de uma das linhagens
utilizadas para a produo das hbridas.
MACHOS VASECTOMIZADOS
Machos estreis so necessrios para gerao de camundongas
pseudogrvidas. Eles so vasectomizadose qualquer linhagem com boa
capacidade de cpula pode ser utilizada. Aps a vasectomia, eles
devemser testados para sua esterilidade antes de serem utilizados
para experimentos. Para se obter 4 a 8 fmeaspseudogrvidas 5 dias
por semana, so necessrios cerca de 20 machos estreis a serem
mantidos emgaiolas separadas.
FMEAS PARA SERVIREM COMO RECIPIENTES
Fmeas pseudogrvidas so preparadas pelo acoplamento de fmeas em
estrus natural com machosvasectomizados. As fmeas devem ter, no
mnimo, 6 semanas e pesar ao menos 20 g sem serem muito gordas.Fmeas
de algumas linhagens apresentam vantagens como recipientes. Por
exemplo, camundongos CD1 (CharlesRiver Laboratories) tm ampolas
muito largas que ajudam na transferncia para os ovidutos e hbridas
F1(B6x x CBA) so timas mes e so capazes de manter ninhadas to
pequenas como dois filhotes.
Como, em geral, cada fmea entra em estrus e ovula a cada 4 a 5
dias, numa colnia 20% a 25% das fmeasestar em estrus a cada dia.
Desse modo, so necessrias pelo menos 50 fmeas de idade entre 2 a 5
meses paraa produo de cerca de 20 plugs por semana.
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ANIMAIS DE LABORATRIO
REFERNCIAS BIBLIOGRFICASHOGAN, B. et al. Manipulating the Mouse
Embryo. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1994.
HOUDEBINE, L. M. (Ed.). Transgenic Animals generation and use.
Amsterdam: Harwood Academic Publishers,1997.
BIBLIOGRAFIAJOYNER, A. L. Gene Targeting a pratical approach.
Oxford: IRL Press, 1995. (The Pratical Approach Series)
