TRANSKRIPTOM IN TRANSKRIPTOMIKA

Transkriptom je zbirka RNA molekul (mRNA, rRNA, tRNA, in druge nekodirajoe RNA); ki jih proizvede ena celica, populacija celic, ali celotni organizem, v katerem koli asu.

Transkriptomika preiskuje transkriptom.

OSNOVE TEHNOLOGIJE DNA IPOV

1. Definicije osnovnih pojmov.

2. Razlini pristopi tehnologije DNA ipov.

Analiza genomske DNA (genotpizacija enojnih nukleotidnih polimorfizmov SNP, analiza variance tevila kopij CNV oz. CGH, resekvenciranje).

Analiza izraanja genov (ekspresijsko profiliranje: 3' ekspresijski, eksonski ali genski ipi, ipi za sledenje izraanja miRNA).

tudije uravnavanja izraanja genov (kromatinska imunoprecipitacija na ipu ChIP-on-Chip, mapiranje prepisov).

DNA mikromrea je zbirka mikroskopskih DNA tok, ki so naneene na trdo podlago. Tvorijo mreo DNA molekul, s katero preverjamo izraane (ekspresijo) tisoih genov hkrati.

DNA MIKROMREA-DNA IP

Principle of expression profilingVRSTE DNA MIKROMREglede na vrsto DNA molekul, ki predstavljajo doloen gen

DNA ipi: Kemina sinteza kratkih, do 20 bp dolgih oligonukelotidovna matrici in situ (npr. tehnologija Affimetrix)

Vsak gen je predstavljen z veimi razlinimi oligonukleotidi

DNA mikromree z dolgimi oligonukleotidi: na podlago naneeni 50 80 bp dolgi oligonukleotidiVsak gen je predstavljen z enim do tremi razlinimi oligonukleotidi

1.

2.

3. cDNA mikromree : na podlago naneene delne ali popolne cDNA dolin 300 5000 bp (tehnologija Patt Brown)Vsak gen je predstavljen z eno cDNA

Robust, simple representation focusing on the 3' ends.

Genome-wide, exon-level analysis on a single array a survey of alternative splicing and gene expression.

High-density tiled microarrays for transcript mapping.

NA MIKROMREI SO LAHKO KOT PROBE PRISOTNI RAZLINI DELI GENA

http://www.affymetrix.com/products/arrays/index.affx

VRSTE MIKROMRE GLEDE NA PROBE

Mikromree s 5 regulatornimi zaporedji

miRNA mikromree

HIBRIDIZACIJA MIKROMRE

http://www.ieee.org/portal/cms_docs_sscs/sscs/07Fall/HamFig1s.jpg

HIBRIDIZACIJA NA MIKROMREI

DVOJNO ALI ENOJNO OZNAEVANJE

ANALIZA GENOMSKE DNA Z MIKROMREAMI

SNP mikromree - razpoznavanje genetskih razliic posameznikov znotraj populacije. Mikromree vsebujejo krakte ologonukleotide z vsemi monimi razliicami zaporedij.

CGH ali CNV mikromree za ugotavljanje vejih nepravilnosti v genomu (amplifikacije, delecije, druge prerazporeditve)-

Mikromree za re-sekvenciranje so imele ivljenjsko dobo le nekaj let

METODEZAUGOTAVLJANJERAZLIKNARAVNIDNA

Mendlova genetika,

Direktno sekvenciranje DNA,

RFLPanaliza(polimorfizmi doin restrikcijskih fragmentov),

Alelno specifini oligonukleotidi,

DNAmikromree,

Nove generacije sekvenciranja

Affymetrix uses a unique combination of photolithography and combinatorial chemistry to manufacture GeneChip Arrays.

MIKROMREE AFFYMETRIX

http://www.mun.ca/biology/scarr/DNA_VDA_chip_schematic.jpg

To determine which alleles are present, genomic DNA from an individual is isolated, fragmented, tagged with a fluorescent dye, and applied to the chip.

The genomic DNA fragments anneal only to these oligos to which they are perfectly complementary.

A computer reads the position of the two fluorescent tags and identifies the individual as a C / T heterozygote.

The single spots in the other three columns indicate that the individual is homozygous at the three corresponding SNP positions.

SNP IPI

http://flysnp.imp.ac.at/images/microarray_principle.jpg

DETEKCIJA POLIMORFIZMOV Z DNA IPI

Komparativna genomska hibridizacija na ipih (CGH) je orodje za ugotavljanje tevila kopij DNA ali odsekov DNA (CNV) v vzorcu.

Tehnika se je razvila iz konvencionalne CGH, kjer so diferenno oznaili vzorec pacientove in referenne DNA (od zdravega mokega/enske) in pregledali razmaz metafaznih kromosomov.

KOMPARATIVNA GENOMSKA HIBRIDIZACIJA

NEKATERE BOLEZNI SO POVEZANE Z VELIKIMI DELECIJAMI ALI REPLIKACIJAMI DNA PODROIJ ZNOTRAJ KROMOSOMOV

CGH oz. CNV omogoa visokozmogljivostno doloevanje in mapiranje teH genomskih nepravilnosti, z resolucijo le nekaj bp.

http://www.nature.com/labinvest/journal/v85/n9/images/3700312f2.jpg

PRIMER HIBRIDIZACIJE CGH IPA IN REZULTAT ANALIZE

METODEZAMERJENJEIZRAANJAGENOV

Northern blot

In situ hibridizacija

qPCR

DNA mikromree

EKSPRESIJSKO PROFILIRANJE Z DNA MIKROMREAMI

EKSPRESIJSKOPROFILIRANJE doloanjekoliineizraenihgenov

Postopek:1) EkstrakcijamRNA2) PripravaoznaenecDNA,3) Hibridizacijanamikromreo,4) Skeniranjeinanalizaslike5) Iskanjediferennoizraenihgenov(normalizacija,bioinformatinaobdelava,gruanje,

GO,itd.)

Principle of expression profilingitalec

oznaevanje

Obratno prepisovanje

Emisija

Prekrivanje

Raunalnika analiza

Laser 1Test Referenca

Laser 2

ko-hibridizacija

Ekspresijsko profiliranje z DNA mikromreami dvojno oznaevanje

Geni zastopani scDNA ali z oligonukleotidi

Robot-nanaalec(spotter)

mikromree s cDNA in dolgimi oligonukleotidi s 3-konca

Expression Profiling with E. coli

Ekspresijski profil 50 genov E. coli pod vplivom temperaturnega oka (barvili cy3/cy5)

PRIMER TEMPERATURNI OK E. COLI

37C 50C

ENOJNO OZNAEVANJE PROB S 3-KONCA GENOV

ZA EKSPRESIJSKO PROFILIRANJE SE NAJVE UPORABLJAJO IPI S PROBAMI NA 3 KONCU ALI t.i. GENSKI IPI

Primer: tehnologija Affymetrix

Omogoajo analizo ekspresijskge profila kot tudi alternativnega spajanja (angl. splicing).

.

EKSONSKI IPI ZA DOLOEVANJE ALTERNATIVNEGA POVEZOVANJA EKSONOV

Complex organisation and structure of the ghrelin antisense strand gene GHRLOS, a candidate non-coding RNA geneSeim I et al., BMC Molecular Biology 2008, 9:95

http://www.genomictree.com/images/bioimg09.jpg

KOMBINACIJA EKSPRESIJSKEGA PROFILIRANJA IN CGHPRI TUDIJAH RAKA

KVANTITATIVNI PCR METODA VALIDACIJE REZULTATA EKSPRESIJSKEGA PROFILIRANJA IN DOLOEVANJA SNP

Omogoa doloanje specifinih PCR produktov v realnem asu med pomnoevanjem.

Omogoa kvantifikacijo specifinih DNA molekul v zaetni PCR meanici.

Z MIKROMREAMI LAHKO TUDI MERIMO IZRAANJE miRNA(drugane mikromree kot za ekspresijsko profiliranje)

Zanka na 5' koncu probe za specifino prepoznavanje. Source: Agilent

PRIMER HIBRIDIZACIJE miRNA MIKROMRE

IZOLACIJA miRNA

- Iz celokupne RNA s Trizolom, brez ienja na kolonah.

- Kvantifikacija z Nanodrop spektrofotometrom.

- Analiza kvalitete z Agilent bioanalizatorjem.

Analiza z Agilent 2100 Bioanalyizatorjem elektroferogram s TRIZOLom izolirane celokupne RNA.

RNA

DOLOANJE INTERAKCIJ MED DNA IN PROTEINI NA IPU:

KROMATINSKA IMUNOPRECIPITACIJA NA IPU (CHIP-Chip)

1. Imunoprecipitacija proteinov, ki so vezani na DNA2. Loitev proteinov od DNA3. Hibridzacija DNA na ip, ki vsebuje regulatorna zaporeja genoma

Princip imunoprecipitacije proteinov

e s protitelesi izloimo proteine, ki so vezani na DNA, postopek imenujemo kromatinska imunoprecipitacija.

SHEMA KROMATINSKE IMUNOPRECIPITACIJE NA IPU

POSTOPEK KROMATINSKE IMUNOPRECIPITACIJE

1. DNA in proteine (in tudi proteine med sabo) kemino poveemo s formaldehidom

2. DNA, ki e ima vezane proteine, razcepimo na manje fragmente

3. S protitelesi izloimo tiste fragmente, ki imajo vezan izbrani protein

4. Proteine loimo od DNA, le to pa pomnoimo s PCR

5.Hibridiziramona ipu

Vsaka DNA, ki je po imunoprecipitaciji na ipu obogatena, predstavlja potencialno mesto vezave proteina, s katerim smo izvedli imunoprecipitacijo.

Mesto za vezavo transkripcijskega faktorja prepoznamo po poveani vezavi probe na doloenem predelu DNA

PRIMER IZPISA ANALIZE IP-IP

( Agilent)

PRIMER IZPISA ANALIZE IP-IP

DNA ipi so zbirka mikroskopskih DNA tok, cDNA ali oligonukleotidov, pritrjenih na trdo podlago.

Uporabljajo se za:

Analizo genomske DNA (genotipizacija, SNP analiza, CHG, sekvenciranje).

Analizo izraanja genov (ekspresijsko profiliranje) , kjer probe lahko predstavljajo 3'konce genov, eksone ali razline dele genov. Posebni ipi pa so za sledenje izraanja miRNA.

tudije uravnavanja izraanja genov (doloanje vezavnih mest transkripcijskih faktorjev, metilacija kromatina), kjer probe predstavljajo 5-neprevedene dele in nerepetitivne dele genov.

Povzetek

http://bioinformatics.ubc.ca/about/what_is_bioinformatics/images/computer.gif

www.gwumc.edu

Bionformatika predstavlja kljuni del vseh visokozmogljivih tehnologij pogenomske dobe

BioinformaticsWikipedia

Making sense of the huge amounts of DNA data produced by gene sequencing projects.

Bioinformatics and computational biology involve the use of techniques from applied mathematics, informatics, statistics, and computer science to solve biologicalproblems.

Research in computational biology often overlaps with systems biology.

Major research efforts in the field include sequence alignment, gene finding, genome assembly, protein structure alignment, protein structure prediction, prediction of gene expression and protein-protein interactions, and the modeling.

The terms bioinformatics and computational biology are often used interchangeably, although the former typically focuses on algorithm development and specific computational methods, while the latter focuses more on hypothesis testing and discovery in the biological domain.

More hypothesis-driven research in computational biology.

More technique-driven research in bioinformatics.

A common thread in projects in bioinformatics and computational biology is the use of mathematical tools to extract useful information from noisy data produced by high-throughput biological techniques.

A representative problem in bioinformatics is the assembly of high-quality DNAsequences from fragmentary "shotgun" DNA sequencing.

In computational biology, a representative problem might be statistical testing of a hypothesis of common gene regulation using data from mRNA microarrays or mass spectrometry.

Bioinformatics

PRIBLINO 23.000 GENOV LOVEKEGA GENOMA LAHKORAZPOREDIMO V SMISELNE SKUPINE PRI TEM SI POMAGAMO

Z GENSKIMI ONTOLOGIJAMI

Mikael Hggstrm 25. maj 2011

- Genske ontologije so bioinformatina orodja, kiomogoajo predstavitev genov in genskih produktov v vseh organizmih.

- Predstavljajo neke vrste slovarje genov in genskihproduktov, ki omogoajo anotacijo genov (opis genana podlagi zbranih podatkov o genskem produktu) .

- Vsak gen opiemo s celino komponento (kje v celici se genski produkt nahaja), molekularnofunkcijo (i. e. strukturni protein, encim, etc.) in bioloko vlogo.

- Ontologije so dinamine, saj nova spoznanjaspreminjajo opise funkcije genov.

- Tudi anotacije so e vedno dimanine (2013)!! 3http://www.geneontology.org/

http://www.geneontology.org/GO.doc.shtml

http://www.geneontology.org/GO.database.shtml#dbtypes

GENSKA(E) ONTOLOGIJA(E) SO V POMO PRI OPREDELITVI FUNKCIJE GENOV

http://www.geneontology.org/

PRIMER UPORABE GENSKE ONTOLOGIJE

http://www.geneontology.org/GO.database.shtml

id: GO:0000016name: lactase activitynamespace: molecular_functiondef: "Catalysis of the reaction: lactose + H2O = D-glucose + D-galactose." [EC:3.2.1.108]synonym: "lactase-phlorizin hydrolase activity" BROAD [EC:3.2.1.108]synonym: "lactose galactohydrolase activity" EXACT [EC:3.2.1.108]xref: EC:3.2.1.108xref: MetaCyc:LACTASE-RXNxref: Reactome:20536is_a: GO:0004553 ! hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds

Primer GO klasifikacije

KEGG Klasifikacija

Mree interakcij med molekulami, reakcij in njihovih medsebjnih relacij.

OBSTAJA VE RAZLINIH ONTOLOGIJ, KI PRIVEDEJO DO RAZLINIH UVRSTITEV GENOV V SKUPINE

http://kt.ijs.si/software/SEGS/index.php?show=download_ONT