D i e Nahrung 30 (1986) 3-4, 463 - 465

St.-Elisabeth-fiankenhaus Halle (Leitender Chefarzt: Frau Dr. med. Ch. Wuttke), Klinisch-chemische Laborabteilung, Halle. DDR

Trennung und Visualisienurg multipler Amylaseformen durch isoelektrische Fo- kussienq (Wissenschaftlicher Kurzbericht)

K. Peisker

Einleitung

aber auch pflanzenphysiologische und lebensmittelchemische F'ragestellunpen wichtige T I - ~ M U ~ ~ mltipler Aqylaseformen beschrieben. Diese Verfahren weisen in Abhanglgkeit von der Methode eine Reihe von Nachteilen auf. die vor allem in der schlechten Vergleichbarkeit von Probe zu Probe (Trenn~mg im Rohrchen). bei langen Bearbeitungszeiten, im relativ hohen Chemikalienverbrauch. in der Verwendung zeit- und arbeitsaufwendiger "Sandwich"-Verfahren (4 . 5) und in den schlechten Dokumentationsmoglichkeiten zu sehen sind . Anliegen dieser Arbeit sol1 es sein. eine methodische Variante vorzustellen.

die dele der hier genannten Nachteile nicht besitzt und damit die Analytik praktikabler gestaltet. Als Methode der Wahl empfiehlt sich die isoelektrische Fokussierung mit ihrer ausgezeichneten Trennsch&fe. Z u r Reduzierung des Chemikalienverbrauches wid von vornherein auf ultradiinne Polyacrylamldgele (0.18 mn) orientiert. deren weitere Vorteile anderweit beschrieben sind (3. 8. 9) . Die Verwendung von Folie a l s Geltrger (GEL-FIX von SERVA. BRD) M3t bessere Dokumentationsmo@;lichkeiten erwarten. Flaterial und Methoden Ultradiinne Polyacrylamidgele sind mch Einfihrmg der "Klapptechnik" fast

miihelos herstellbar (8. 9 ) . Als Ampholyt komnt Servalyt T 4-9 zur Anwendung. Die Trennung erfolgt in der Flachbettkamner FBE 3000 mit zugehoriger Gleich- spannungsquelle ECPS 3000 mit Voltstundenintegrator (PHARMACIA. Schweden). Gelzusamnensetzung und Spannungsfihrung bei der Elektrophorese entsprechen den BedilWungen in (8). Auch fiir die Amylase erbringt das dort beschriehene stufenweise Hoherstellen der S p a n n u bessere Trennergebnisse. als sie bei leistungsstabilisiertem Verlauf und einer vorgegebenen bdspannung von 2000 V erreicht werden. Die Fixierung der Proteine und ihre Anfabung erfol- gen wie in (8). Zur Visualisierung der Amylaseformen werden die Elektropherogramne fiir

2 min in eine Losung von 5 6 Stiirke und 200 mg NaCl in 100 m l Tris-kleat- Puffer pH 6.0 (12) eingeleqt. Nach dem Herausnehmen und qutem Ablaufen- lassen iiberschussiger St&kelosung erfolgt eine je nach Amylaseaktivitat 2-20min. Inkubation bei Raumtemperatur. Durch anschlieBendes Einbringen der Elektropherogramne in ein Gemisch aus 100 m l Trichloressigsaure (20%ig) und 50 m l einer Iod-Kaliumiodid-Losung (2.2 g Iod + 4.4 g K I in 100 m l Wasser (4)) stellen sich Zonen mit Amylaseaktivitat a l s helle Elanden auf dunkelbraunem Untergrund dar. D a s iiberschiissige Iod wird mit "Universalge- misch" (11) (Wasser:Wethanol:Eisessig wie 5:4:1) entfernt. wobei ein Fmb- mchlag mch blauviolett zu beobachten ist. Das beim Trocknen der Zymogramne auftretende Verblassen der Iodf&bung emeist sich als nachteilig bei der

In einer Vielzahl von Arbeiten (1. 2. 6. 7, 10) wird die fiir medizinische.

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Amylase

Abb. 1. Densitogrm der Proteinfkirbung und schemtische Darstellung der AmylasefSr- bung der Testamylase von Leithold Proteinf2irbung: 10 pl Auftragmenge eines Extraktes von 10 mg je 1000 111 AmylasefSkbung: 10 p1 Auftragmenge eines Extraktes von 2 me; je 1000

Dokumentation der Folien. Eine gleicMig und auch beim Trocknen stabile dunkelviolette Fkirirbung des Untergmmdes bei aufgehellten Zonen m i t Amylase- aktivitat ld3t sich erreichen, wenn die trockenen Zymogrme fiir 1 h in eine feuchte Kamner eingelegt und anschlieknd IoddZmpfen ausgesetzt werden. Ergebnisse und Diskussion

D a s beschriebene Verfahren fur die Trennung und Visualisiew multipler Aqylasefonnen erbringt bei sparsamsten Chemikalienverbrauch und im Vergleich zu anderen Visualisiemngsverfahren (z. B. 10) geringem zeitlichen Aufvmnd sehr gut getrennte und dokumentierbare "Isoamylasen". Aufgrund der Verarbeitung von bis zu 25 Proben auf einer Folie sind die multiplen Fomen. auch bei nur gering voneinander abweichenden isoelektrischen Punkten. ausgezeichnet zu diffe- renzieren und miteinander zu vergleichen. Einen sehr groRen Einflul3 auf das

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erhaltene Enzynxnuster zeigt die Wahl des Applikationsortes. dessen Variation zu vtjllig unterschiedlichen Bildern fiihrt. Die besten Trennungen mit der schefsten hdenausbildung ergeben sich. wenn die Proben, bei etwa 10 cm Gesamtlaufstrecke, 3.5 an von der Anode entfernt aufgetragen werden. Testarq,-lase von Leithold cder auch Extrakte von Pankxeasfennentprapwaten

(Pangrol, Mezym-Forte, VEB Berlin-Chemie. DDR) ergeben eine Vielzahl von Banden mit hlaseaktivitat im pH-Bereich von 5.5 - 7.0 fLir die Testamylase und von 4.7 - 7,3 fiir Pangrol und Mezyn-Forte.

Abhhgigkeit von der mlaseaktivitat ist die Zahl der Banden unterschiedlich. Mit steigender Aktivitat nirmrt sie zu. allerdings auf Kosten der Trennsch;irfe. da h d e n m i t hohen kzyrraktivittiten dann iiberlappen. Hier gilt es. einen guten KompromiD m finden. Die Coomassief3rbung zeigt. z. B. bei der Testamylase von Leithold, einige

zu den Amylasebanden sehr gut korrelierende Proteinbanden (Abb. I). Alle an- deren miissen als Verunreinigungen der jeweiligen Praparation angesehen werden. Zusamnenfassend 1;iRt sich sagen, daf3 das hier vorgestellte Verfahren, unter

Nut- dler Vorteile des Arbeitens in ultradiinnen Polyacrylamidgelschichten auf Folie, sehr gute Trennungen der &lase emoglicht und damit erfolgreich fiir eine Vielzahl von Untersuchungen eiwesetzt werden kann. In diesem Zusamnen- hang sei z. B. auf die Differenzierung von Ham- (1. 2) und Speichelamylasen. die Qualitatskontrolle bei Pankreasfermentpraparationen oder auch auf pflan- zenphysiologische Untersuchungen (6. 7) hingewiesen . Literatur

(1) (2) Finke. E.. und R. J. Haschen. Z. med. Lab.diw. 20 (1979). 328-336. (3) (4) Giinther. E., G. HaRelbeck und E. Biirger. Z. Lebensmittel-Unters. -Forsch.

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(6) rhhardt, L.. M. Viedmann und G. Giinther. Biochem. Physiol. Pflanzen

(7)

(8) Peisker. K.. 2. med. Labor.diagn. 26 (1985). 28-37. (9) (10) Rose, H.-J.. K. Lutcke und W. Haude. Z. chem. Labor.diagn. 4 (198337).

(11) Vorschrift z u Anwendung der Servalyt Precotes. SERVA Nr. 42965. (1 2) Wissenschaftliche Tabellen Geigy, Teilband H;imatologie und Humangenetik

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Multiple F o m n der Speichelamylase befinden sich im Fkreich um pH 6. In

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%-I 00.

Dr. K. Peisker, St.-Elisabeth-fiankenhaus. Laborabteilung. DDR-4020 Halle. Mauerstr. 5-10

Eingegangen 23.9.1985