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Tutorial on gene-c ancestry es-ma-on: How to use LASER Chaolong Wang Sequence Analysis Workshop June 2014 @ University of Michigan

Tutorial)on)gene-c)ancestry)es-maon:)) How$to$use$LASERGenerate)reference)coordinate)file)(PCA)) Use)LASERto)perform)PCA)on)the)reference)genotypes:))./laser -g ./example/HGDP_238_chr22.geno

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Tutorial  on  gene-c  ancestry  es-ma-on:    How  to  use  LASER  

Chaolong  Wang  Sequence  Analysis  Workshop  

June  2014  @  University  of  Michigan  

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LASER:  Loca-ng  Ancestry  from  SEquence  Reads  

•  Download:  hFp://www.sph.umich.edu/csg/chaolong/LASER/    wget  hFp://www.sph.umich.edu/csg/chaolong/LASER/LASER-­‐2.01.tar.gz  

•  Wiki:  hFp://genome.sph.umich.edu/wiki/LASER  

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•  Main  func:ons  of  the  so<ware:  –  Place  samples  in  an  ancestry  space  using  sequence  reads  

•  Works  well  for  very  low-­‐coverage  data  •  Easy  for  parallel  computa-on  

–  Pace  samples  in  an  ancestry  space  using  genotype  data  •  Follows  the  same  framework  as  for  sequence  data  •  Fast  and  robust  to  family  relatedness  

–  Perform  standard  PCA  on  genotype  data  •  Fast  •  Can  handle  very  large  data  sets  

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•  What  can  you  find  in  the  package?  •  Input  files  •  How  to  run  LASER?  •  Output  files  and  interpreta-on  •  Some  advanced  op-ons  •  Prac-ce    

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Outline  of  this  tutorial  

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What  can  be  found  in  the  soXware  package?  

•  Two  main  programs:  laser:  es-mate  ancestry  using  sequence  reads    trace:  es-mate  ancestry  using  genotype  data  

•  Two  tools  for  preparing  input  files:  vcf2geno:    convert  VCF  files  to  input  genotype  files  pileup2seq:  convert  pileup  files  to  input  sequence  files  

•  R  codes  for  ploZng  results  (in  the  “plot”  folder)  •  User’s  manuals  (in  the  “doc”  folder)  •  Example  data  and  commands  •  Source  codes  (in  the  “src”  folder)  

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Preparing  input  files  for  LASER  

Processed  BAM  

(one  per  sample)  

VCF  (all  reference  samples)  

GENO  (all  reference  samples)  

Pileup  (one  per  sample)  

SEQ  (all  study  samples)  

vcf2geno  

samtools   pileup2seq.py  

Reference  panel  

Study  samples  

REF_COORD  (all  reference  samples)  

LASER   SEQ_COORD  (all  study  samples)  

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Reference  genotype  file  and  vcf2geno  _.geno  (tab-­‐delimited)  

_.site  (tab-­‐delimited,  with  a  header)  

The  -­‐-­‐updateID  op-on  to  specify  the  popID  and  indivID  in  the  output  file.    

You  can  convert  from  vcf  to  geno  format  using  our  vcf2geno  tool:    

./vcf2geno --inVcf HGDP.vcf.gz --updateID newID.txt --out HGDP

Genotype  data  are  provided  in  the  geno  file,  with  columns  represen-ng  loci  and  rows  represen-ng  samples.    Genotypes  are  coded  as  0,  1,  2,  represen-ng  counts  of  the  reference  alleles.  Missing  data  are  coded  as  -­‐9.    Marker  informa-on  are  provided  in  the  site  file  (one  locus  one  line).      Important  notes:    1.  Reported  on  forward  strand  2.  Consistent  genomic  posi-on  (b37)  3.  Tab-­‐delimited  

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Generate  reference  coordinate  file  (PCA)  Use  LASER  to  perform  PCA  on  the  reference  genotypes:    

./laser -g ./example/HGDP_238_chr22.geno -k 20 -pca 1 -o HGDP

-­‐g  specifies  the  reference  genotype  file  -­‐k  specifies  the  number  of  PCs  to  compute  -­‐pca  turns  on  the  PCA  mode  -­‐o  specifies  the  prefix  of  the  output  files  

_.RefPC.coord  (tab-­‐delimited)  

LASER  will  output  the  PC  coordinates  and  propor-on  of  variance  explained  by  each  PC,  and  has  an  op-on  to  output  the  SNP  loadings  (use  -­‐pca  3).  

Computa:onal  speed:  LASER  takes  about  15  mins  to  perform  PCA  on  the  HGDP  data  set  of  938  samples  and  632,958  SNPs  (on  a  2.8GHz  CPU).  

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From  BAM  files  to  pileup  files  (samtools)  

Format  of  a  pileup  file  

Processed  BAM  

(one  per  sample)  

Pileup  (one  per  sample)  

samtools  

CHR                          POS                                                      REF                      DEPTH                      BASES                QUAL  

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From  BAM  files  to  pileup  files  (samtools)  

Step  1:  make  a  BED  file  to  specify  a  list  of  loci  to  extract  from  BAM  files.    

awk ‘{if (NR>1){print $1, $2-1, $2, $3;}}’ HGDP.site > HGDP.bed

An  example  line  in  the  BED  file:  

Step  2:  use  the  mpileup  op-on  in  samtools  to  generate  pileup  files.  

samtools mpileup -q 30 -Q 20 -f hs37d5.fa.rz -l HGDP.bed A.bam > A.pileup

The  above  command  processes  sample  A.  Repeat  for  other  samples.  

-­‐q  :  minimum  mapping  quality  score  -­‐Q  :  minimum  base  quality  score  -­‐f  :  the  reference  file  (human  genome  sequence  in  the  FASTA  format)  -­‐l  :  the  BED  file  (regions  to  pileup)  

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From  pileup  files  to  a  SEQ  file  (pileup2seq)  

_.seq  (tab-­‐delimited)  

Pileup  (one  per  sample)  

SEQ  (all  study  samples)  

pileup2seq.py  

In  the  seq  file,  loci  are  in  the  same  order  as  the  reference  panel.  Each  locus  has  3  space-­‐delimited  numbers:    

1.  sequencing  depth  (total  number  of  reads);    2.  number  of  reads  that  match  the  reference  allele;    3.  mean  base  quality  score  in  phred  scale.    

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From  pileup  files  to  a  SEQ  file  (pileup2seq)  

python pileup2seq.py -m HGDP.site -o test A.pileup B.pileup C.pileup …

-­‐m  specifies  the  reference  site  file.  -­‐o  specifies  the  prefix  of  the  output  file.    Other  op-ons:  -­‐b  target.bed  specifies  target  regions  to  exclude.  -­‐i  newID.txt  specifies  popID  and  indivID  to  output.  

newID.txt  

A  typical  command  to  generate  a  SEQ  file  named  “test.seq”:  

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All  input  files  are  ready.  Get  started  with  LASER!  

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Parameters  in  LASER  laser.conf  

There  are  21  parameters  in  LASER,  whose  descrip-ons  can  be  found  in:  (1) LASER_Manual  (sec-on  5)  (2) The  paramter  file  (laser.conf)  

Ways  to  specify  parameter  values:  (1) Command  line  (2) The  parameter  file  (3)  If  not  (1)  or  (2),  default  values  

If  a  parameter  file  is  not  specified  (using  -­‐p),  laser  will  search  for  a  file  named  “laser.conf”  under  the  working  directory.  If  not  found,  laser  will  create  a  template  “laser.conf”  file  under  the  working  directory.  

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Basic  usage  Use  the  parameter  file:  ./laser  -­‐p  ./example/example.conf Or  ./laser  (use  laser.conf)  

The  LASER  alogrithm  

Use  command  lines:  ./laser  -­‐g  ./example/HGDP_238_chr22.geno  \          -­‐c  ./example/HGDP_238_chr22.RefPC.coord  \          -­‐s  ./example/HapMap_6_chr22.seq  \          -­‐K  10  -­‐k  5  \          -­‐o  test

-­‐p  :  the  parameter  file  (default:  laser.conf). -­‐g  :  the  reference  genotype  file.  -­‐c  :  the  reference  coordinate  file.  -­‐s  :  the  sequence  file  for  study  samples.  -­‐K  :  the  dimension  of  the  space  to  project  from.  -­‐k  :  the  dimension  of  the  reference  space.  -­‐o  :  the  prefix  of  the  output  files.  

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Output  results  

_.SeqPC.coord  

L1  :  number  of  loci  being  covered  by  at  least  one  read Ci  :  mean  sequencing  depth  (averaged  across  loci)  K  :  number  of  PCs  used  for  projec-on  t  :  sample-­‐specific  Procrustes  similarity  score  PCs  :  coordinates  of  sequenced  samples  in  the  reference  ancestry  space  

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Visualiza-on  and  interpreta-on  

Example  R  scripts  for  ploZng  results  can  be  found  in  the  folder  “plot”  in  the  soXware  package.  

Ancestry  of  the  study  samples  can  be  iden-fied  by  comparing  with  the  reference  individuals.  

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Running  mul-ple  LASER  jobs  in  parallel  Because  each  sample  is  analyzed  independently  with  the  reference  panel,  we  can  run  mul-ple  jobs  in  parallel.  

./laser  -­‐p  ./example/example.conf  -­‐x  1  -­‐y  3    -­‐o  test.1-­‐3  &

./laser  -­‐p  ./example/example.conf  -­‐x  4  -­‐y  6    -­‐o  test.4-­‐6  &

Submit  two  jobs  to  analyze  samples  1  to  3,  and  4  to  6:  

cp  test.1-­‐3.SeqPC.coord  test.SeqPC.coord more  +2  test.4-­‐6.SeqPC.coord  >>  test.SeqPC.coord  

Combine  results  

-­‐x  :  index  of  the  first  sample  to  analyze -­‐y  :  index  of  the  last  sample  to  analyze  

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-­‐r  :  number  of  repeated  runs -­‐R  :  if  output  detailed  results  of  each  run  (0:  No;  1:  Yes)  

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Using  repeated  runs  to  improve  accuracy  Repea-ng  LASER  to  analyze  a  sample  mul-ple  -mes  and  take  the  average  coordinates  can  improve  accuracy,  especially  for  es-ma-ng  fine-­‐scale  ancestry  at  very  low  coverage.  

Worldwide  ancestry   European  ancestry  

Wang  et  al.  2014  Nature  Gene:cs  

./laser  -­‐p  ./example/example.conf  -­‐r  5  -­‐R  1  -­‐o  test

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Excluding  loci  from  the  analysis  Why  we  want  to  exclude  some  loci?    

1.  Targeted  regions  or  special  regions.  2.  Memory  limit  (when  the  reference  panel  is  large).  3.  Computa-onal  speed.    

Four  op-ons  implemented  in  LASER  to  exclude  loci:    

-­‐ex  :  exclude  a  given  list  of  loci  (also  effec-ve  when  running  PCA  mode) -­‐minc  :  exclude  loci  that  have  mean  depth  lower  than  a  given  value  -­‐maxc  :  exclude  loci  that  have  mean  depth  higher  than  a  given  value  -­‐M  :  randomly  exclude  a  propor-on  of  loci  (from  the  reference  panel)    The  mean  coverage  per  locus  will  be  calculated  based  on  samples  being  analyzed  (results  can  be  different  when  using  together  with  -­‐x  and  -­‐y).  

Example:            ./laser  -­‐ex  ./example/snps2exclude.txt  -­‐minc  0.001  -­‐maxc  4  -­‐M  0.5    

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Checking  coverage  distribu-on  of  your  data  

Check  the  mean  sequencing  depth  across  samples  and  loci:    

./laser  -­‐p  ./example/example.conf  -­‐cov  2  -­‐o  test

-­‐cov  :    1,  check  coverage  and  perform  ancestry  es-ma-on;    2,  check  coverage  and  stop.    0,  do  not  check  coverage  (default).  

When  -­‐cov  is  set  to  1  or  2,  LASER  will  output  the  mean  coverage  for  each  sample  and  each  locus  to  files  named  “test.ind.cov”  and  “test.loc.cov”.  

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Prac-ce  •  Targeted  sequencing  data  (BAM  files)  for  6  HapMap  samples  

(two  trios)  are  in  the  “$BAM”  folder.  •  Targeted  regions  are  given  in  “$BAM/AMD_roi_1-­‐based.bed”.  •  Sample  IDs  are  given  in  “$BAM/AMD_hapmap_trios_id.txt”.  •  Reference  panel:  Human  Genome  Diversity  Panel  (HGDP).  

21  

Tasks:  1.  Generate  pileup  files  to  the  HGDP  loci  using  samtools  2.  Prepare  the  SEQ  file  using  pileup2seq.py  3.  Es-mate  ancestry  in  the  HGDP  ancestry  space  using  laser  4.  Visualize  results  using  R  scripts  Commands  and  explana-ons  are  given  on  the  wiki  page:  hFp://genome.sph.umich.edu/wiki/SeqShop:_Es-mates_of_Gene-c_Ancestry_Prac-cal  The  best  place  to  look  for  help:  LASER_Manual.pdf  

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