20

Chương 2 Cấu trúc và chức năng của tế bào vi sinh vật

I. Sinh vật nhân sơ 1. Các phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu 1.1. Phương pháp quan sát tế bào

Nhờ kính hiển vi quang học (kính hiển vi thường) với độ phóng đại 1500 - 2000 lần, đặc biệt nhờ kính hiển vi điện tử thường (TEM) và kính hiển vi điện tử quét (SEM) mà khoa học có thể thấy được tế bào, cấu trúc siêu hiển vi của vi khuẩn với đường kính khoảng 1μm.

- Quan sát vi sinh vật trên tiêu bản sống: vi sinh vật ở giữa lam và lamella, nhuộm mực nho để thấy rõ màng nhầy (capsule), đây là phương pháp hay dùng cho những vi sinh vật nuôi cấy trên môi trường lỏng với kính hiển vi thường, quan sát được khả năng vận động của chúng.

Bảng 2.1: Một số phương pháp nhuộm màu và nguyên tắc sử dụng Phươg pháp nhuộm màu Nguyên tắc sử dụng +Nhuộm đơn (xanh

methylene, carbolfuchsin, tinh thể tím, safranin…)

Dung dịch rượu hoặc nước của các kiềm, dùng để quan sát hình dạng vi sinh vật, cách sắp xếp tế bào

Với các phản ứng khác nhau với thuộc nhuộm có thể phân biệt được chúng

Chia các vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: Gram dương giữ màu tinh thể tím, Gram âm mất màu khi tẩy do đó sẽ nhuộm màu phụ hồng safranin

+Nhuộm phân ly - Gram - Ziehl - Nielsen Dùng để phân biệt các loài Mycobacterium và một số

loài Nocardia. Vi khuẩn acid nhuộm với carbolfuchsin và xử lý với dung dịch rượu acid, vẫn giữ màu đỏ. Vi khuẩn không acid sẽ mất màu do đó sẽ nhuộm màu phụ là xanh methylene.

Dùng để phát hiện sự có mặt của màng nhày, bởi vì

polysaccharide màng nhầy không bắt màu thuốc nhuộm bao quanh tế bào vi khuẩn nhuộm màu

Sử dụng để phát hiện bào tử vi khuẩn. khi dùng thuốc nhuộm lục malachite với tiêu bản có đun nóng, thuốc nhuộm sẽ thâm nhập vào nội bào tử và làm chúng nhuộm màu lục, khi bổ sung bằng đỏ safranin sẽ làm phần bao quang bào tử nhuộm màu đỏ hồng.

+Nhuộm đặc biệt - Nhuộm âm (negative) -Nhuộm nội bào tử

(endospore) -Nhuộm tiên mao

(flagella) Dùng để phát hiện tiên mao ở vi khuẩn, sử dụng thuốc làm phồng tiên mao rồi sau đó nhuộm bằng carbolfuchsin

21

- Quan sát vi sinh vật trên tiêu bản cố định và nhuộm màu: Phương pháp nhuộm Gram và Ziehl - Nielsen cho phép nhận biết 2 nhóm vi khuẩn Gram dương va Gram âm, hình dạng của bào tử, các vật thể ẩn nhập như hạt dự trữ polyphosphate (hạt dị nhiễm sắc, hạt volutin), các giọt mỡ, glycogen… Những tiêu bản cố định này được quan sát ở bội giác lớn X 90 hoặc X 100 (bội giác dùng dầu, vật kính có vòng đen). Tham gia vào cơ chế nhuộm màu có cấu trúc của thành tế bào và bản chất các hợp chất của sinh chất khác nhau ở hai loại vi khuẩn. Để quan sát những cấu trúc siêu hiển vi người ta dùng kính hiển vi điện tử TEM và SEM, có thể thấy được những cấu tạo rất nhỏ với độ lớn vài nanometre. Những vi khuẩn Gram+ có mối liên hệ chủng loại phát sinh gần gũi nhau, ở đây người ta chia thành hai nhóm phụ: nhóm có hàm lượng (G + X)% cao hơn 50% như các Actinomycetales, Corynebacterium, Cellulomonas… và nhóm có (G + X)% thấp hơn 50% như Clostridium, Bacillus, Staphylococcus,… Những vi khuẩn Gram- có mối quan hệ chủng loại phát sinh cách xa nhau và ở đây người ta phân ra rất nhiều nhóm phụ.

Bảng 2.2: Một số tính chất khác biệt giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm

Tính chất Gram dương Gram âm Phản ứng với hóa chất

nhuộm Gram giữ màu tinh thể tím,

do đó tế bào có màu tím hoặc tía

mất màu tím khi tẩy rửa, nhuộm màu phụ đỏ safranin hay Fuchsin

Lớp peptidoglucan dày, nhiều lớp mỏng, chỉ có một lớp Acid techoic có không có Lớp phía ngoài thành không có có Lớp lipopolysaccharide rất ít hoặc không có nhiều, hàm lượng cao Hàm lượng lipid và

lipoprotein thấp (vi khuẩn acid có

lớp lipid mỏng liên kết với peptidoglucan)

cao (tạo thành lớp ngoài thành)

Cấu trúc gốc tiên mao hai vòng ổ đĩa gốc bốn vòng ổ đĩa gốc Tạo độc tố chủ yếu là ngoại độc

tố (exotoxins) chủ yếu là nội độc tố

(endotoxins) Chống chịu với tác nhân

vật lý khả năng chống chịu

cao khả năng chống chịu

thấp Mẫn cảm với lysozyme rất mẫn cảm, dễ bị tan

với enzyme này ít mẫn cảm (cần phải

xử lý để phá lớp màng ngoài của peptidoglucan)

Mẫn cảm với Penicillin và sulfonamide

cao thấp

22

Mẫn cảm với Streptomycine, Chloramphenicol, Tetracycline

thấp cao

Kết hợp với thuốc nhuộm kiềm

cao, chặt chẽ thấp, lỏng lẻo

Mẫn cảm với các chất tẩy anionic

cao thấp

Chống chịu với muối Natri cao thấp Chống chịu với khô hạn cao thấp

1.2. Phương pháp tách ly các thành phần của tế bào Khi cần nghiên cứu các thành phần riêng biệt của tế bào, người ta

phải tách ly các thành phần này nhờ siêu âm, enzyme làm tan thành, các kháng sinh tác động vào thành, dùng áp suất thẩm thấu gây co nguyên sinh, dùng sức ép cơ học, dùng siêu li tâm hoặc li tâm trong đường gradient…

Nhờ các máy đo quang phổ (Spectrophotometer) chúng ta biết rõ ràng và nhanh chóng số lượng tế bào trong dịch huyền phù.

Nhờ phương pháp sắc ký giấy hoặc sắc ký cột chúng ta có thể thu được các hợp chất riêng biệt. 2. Hình dạng vi khuẩn và vi khuẩn cổ

Hình dạng vi khuẩn khác nhau giữa loài này và loài khác, đối với những vi khuẩn đa hình (polymorphysme) thì hình dạng có thể khác nhau trong các giai đoạn sống khác nhau của chu kỳ sinh trưởng. Những hình dạng chính của vi khuẩn:

- Cầu khuẩn (Coccus): Khi phân chia theo một phương và dính nhau ta có song cầu khuẩn (Diplococcus), hoặc liên cầu khuẩn (Streptococcus), phân chia hai phương và dính với nhau ta có tứ cầu khuẩn (Tetracoccus), phân chia 3 phương và dính nhau ta có bát cầu khuẩn (Sarcina) hoặc phân chia theo nhiều phương ta có tụ cầu khuẩn (Staphylococcus).

- Trực khuẩn: bao gồm trực khuẩn không sinh bào tử (như E.coli…) và trực khuẩn sinh bào tử như Bacillus, Clostridium với kích thước khoảng 2-3 x 1μm.

- Xoắn khuẩn: Spirillum, Campylobacter, xoắn thể với các vòng khác nhau: Spirochaeta, Leptospira với kích thước 1 x 5-500μm.

- Xạ khuẩn: gồm những vi khuẩn thuộc bộ Actinomycetales trong đó có các giống quan trọng như Streptomyces, Micromonospora…, có kích thước 1-2 x 100-500μm.

23

Hình 2.1: Các nhóm hình thái chính của vi khuẩn

- Vi sinh vật hình sao như giống Stella và vi sinh vật hình vuông như

giống Haloarcula, một loại "vi khuẩn" ưa mặn thuộc vi sinh vật cổ.

24

3. Sơ đồ cấu tạo tế bào vi khuẩn Nhờ kính hiển vi điện tử khoa học đã biết rất rõ các tổ chức dưới

mức tế bào của vi khuẩn như lớp màng nhầy, thành tế bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh và các thành phần quan trọng khác.

Hình 2.2: Mô hình và sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn 1. Thành tế bào, 2. Màng sinh chất, 3. Thể nhân, 4. Mexosome, 5.

Chất dự trữ, 6. Sinh chất, 7. Bào tử, 8. Tiên mao, 9. Khuẩn mao, 10. Khuẩn mao giới tính, 11. Bao nhầy, 12. Tầng dịch nhầy, 13. Ribosome, 14. Thể ẩn nhập, 15. Plasmid. 3.1. Màng nhầy (capsule)

Nhiều vi khuẩn được bao bọc bên ngoài bàng một lớp màng nhầy có bản chất hóa học là polysaccharide của một loại gốc đường (homopolysaccharide) hoặc của nhiều gốc đường khác nhau (heteropolysaccharide), ở một số vi khuẩn trong vỏ này còn chứa một ít lipoprotein. Khi làm khô, người ta xác định được 90 - 98% trọng lượng của màng nhầy là nước.

Màng nhầy có tác dụng hạn chế khả năng thực bào, do đó tăng cường độc lực đối với vi khuẩn gây bệnh, do cấu trúc hóa học của màng nhầy là polysaccharide và ít lipoprotein nên có liên quan đến tính kháng nguyên của vi khuẩn gây bệnh. Mặt khác, khi môi trường nghèo chất dinh dưỡng màng nhầy có thể cung cấp một phần các chất sống cho tế bào, trong trường hợp đó màng nhầy teo đi. Một khuẩn lạc gồm các vi khuẩn có màng nhầy nhìn thấy dạng nhẵn bóng - dạng S (smooth), còn khuẩn lạc gồm các vi khuẩn ít hay không hình thành màng nhầy sẽ có dạng nhăn

25

nheo - dạng R (rough), đối với những vi khuẩn trong điều kiện môi trường quá dư thừa carbon, như ở rảnh các nhà máy đường…, thì màng nhầy rất dầy và tạo ra khuẩn lạc nhầy nhớt - dạng M (mucoid). Ví dụ ở nhà máy đường thường gặp Leuconostoc mesenteroides có nhiều màng nhầy dày gấp 20 lần chiều ngang của tế bào vi khuẩn. Những màng nhầy như vậy được gọi là những màng nhầy lớn (macrocapsule) còn những màng nhầy nhỏ hơn 0,2μm (nghĩa là không nhìn thấy trên kính hiển vi thường, mà chỉ nhìn thấy trên TEM hay SEM) được gọi là màng nhầy nhỏ (microcapsule). Có những vi khuẩn chỉ hình thành màng nhầy trong các điều kiện nhất định, ví dụ Bac. anthracis (vi khuẩn gây bệnh nhiệt than) chỉ hình thành màng nhầy trong môi trường có protein động vật, Diplococcus pneumoniae (gây bệnh viêm màng phổi) chỉ hình thành màng nhầy khi xâm nhập vào cơ thể người và động vật.

Muốn quan sát màng nhầy người ta làm tiêu bản âm với mực nho hoặc nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm kiềm. 3.2. Thành tế bào

Ngày nay khoa học đã biết khá rõ về thành tế bào các cơ thể nhân sơ. Dựa vào sự nghiên cứu cấu trúc phân tử của thành tế bào, kiểu trao đổi chất… mà ta có thể xếp chúng vào hai giới: vi sinh vật cổ với loại thành tế bào đặc biệt và kiểu trao đổi chất khác thường và vi khuẩn với ba nhánh tiến hóa: nhánh có thành tế bào dày là các vi khuẩn Gram dương, nhánh có thành tế bào mỏng là các vi khuẩn Gram âm và nhóm tiêu giảm, không có hay thành tế bào rất mỏng.

Nhờ các phương pháp tách ly tế bào như lắc dịch huyền phù vi khuẩn với các hạt thủy tinh có đường kính 0,1 mm hoắc ép dịch huyền phù qua màng có lỗ nhỏ hơn đường kính tế bào, hoặc đưa tế bào vào môi trường ưu trương để gây co nguyên sinh… rồi sau đó qua siêu ly tâm, người ta có thể thu được lớp thành tế bào khá tinh khiết. Thành tế bào của các vi sinh vật cổ rất khác biệt với thành tế bào của vi khuẩn và hoàn toàn khác với cơ thể nhân chuẩn.

Đối với vi khuẩn, thành tế bào chiếm khoảng 20 - 30% trọng lượng khô của tế bào, đặc biệt ở Corynebacterium diphteria thành tế bào chiếm tới 76 - 78% trọng lượng khô của tế bào. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương dày 150 - 800A0 Còn ở vi khuẩn Gram âm lớp thành murein mỏng hơn: từ 50 - 180A0.

Hợp chất cơ bản của thành tế bào vi khuẩn là hai chất dị cao phân tử (heteropolyme): glucopeptid và acid teichoid. Glucopeptid (hay còn gọi là peptidoglucan, mucopeptid, murein) là khung rắn chắc giữ vững hình dạng vi khuẩn, khi thủy phân glucopeptid ta sẽ đựoc 2 hợp chất với số phân tử

26

Gram như nhau là: N-acetyl glucosamin và acid N- acetyl muramic, chúng liên kết với nhau qua liên kết 1,4 ß glucozid.

Enzyme lysozim cắt liên kết glucozid giữa C1 còn lại của acid N- acetyl muramic và C4 còn lại của N-acetyl glucosamin (liên kết ß – 1,4). Các gốc N- acetyl muramic liên kết với nhau qua dây nối peptid, tạo ra mạng lưới chằng chịt như tổ ong, trong thành phần của N- acetyl muramic có mặt của các acid amin với trọng lượng phân tử Gram: 2 D.L.alanin, 1 D. glutamic và 1 acid diamin. Acid diamin này ở Sta. aureus là lizin, ở E.coli là acid L – diaminpimelic (ADP), các acid diamin này có thể kết hợp với mạch peptid của chuỗi bên, do đó mà hình thành một mạng lưới murein chắc chắn.

Đối với nhóm vi khuẩn tiêu giảm thành tế bào (Mycoplasmatales, Mollicustes, Tenericutes) người ta không tìm thấy hợp chất murein, những vi khuẩn này không có thành rắn chắc cho nên chúng có thể thay đổi hình dạng, phần lớn chúng là những cơ thể đa hình như các dạng PPLO, Mycoplasma (vi khuẩn nhỏ nhất có thể nuôi cấy trên môi trường).

Trong thành tế bào vi khuẩn còn có một loại hợp chất đặc biệt đó là acid teichoic, hợp chất thấy nhiều ở vi khuẩn Gram dương (có thể chiểm tới 50% trọng lượng khô của thành), ở vi khuẩn Gram âm hiện chưa tìm thấy hợp chất này. Acid teichoic liên kết với acid muramic qua mạch phosphodieste. Acid teichoic có hai loại ribiteichoic và glycerin teichoic.

Thành tế bào vi khuẩn có chức năng quan trọng là giữ hình dạng ổn định của tế bào , tham gia vào việc duy trì áp suất thẩm thấu, sư phân bào, tham gia vào quá trình nhuộm Gram...

Vi khuẩn Gr+ Vi khuẩn Gr-

Hình 2.3: Mô hình cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram(+) và Gram(-)

27

3.3. Màng sinh chất Màng sinh chất của vi khuẩn và các vi sinh vật cổ có thể thấy được

nhờ co nguyên sinh, lớp màng này dưới kính hiển vi đối pha là lớp có độ dày khoảng 7,5nm, nằm ngay dưới lớp thành hoặc các lớp màng ngoài, nó bao bọc toàn bộ khối chất nguyên sinh. Khoa học gọi nó là màng cơ sở vì có cấu tạo giống hầu hết các màng trong tế bào như màng nhân, màng ty thể, lục lạp, màng lưới nội chất, màng bào tương…

Phân tích hóa sinh cho thấy màng sinh chất gồm 3 loại phân tử: lipid (chủ yếu ở dạng phospholipid - chiếm khoảng 30 - 40%), protein (gồm rất nhiều hệ enzyme, trong đó có các hệ permease, thành phần protein này có thể chiếm tới 60 - 70%) và một ít hợp chất glucid.Các phospholipid có thể là phosphatidiglycerol và/hoặc là phosphatidylethanolamin. Các phospholipid dưới kính hiển vi điện tử gồm 2 lớp nằm ở giữa, trong suốt trong khi các lớp protein bên ngoài có màu đậm tối.

Các phân tử phospholipid có đầu ưa nước (hydrophyle) gồm có choline - phosphate và glycerol còn đuôi kỵ nước (hydrophone) là các phân tử acid béo.

Do cấu trúc các phân tử phospholipid như trên nên chúng phải sắp xếp các đuôi kỵ nước với nhau và đầu ưa nước quay ra phía ngoài và phía trong sinh chất, chính cách sắp xếp này có lợi nhất cho chức năng vận chuyển các chất (đưa các dòng proton nhờ các enzyme), chức năng hô hấp…

Chức năng chủ yếu của màng sinh chất là tấm bình phong ngăn trở dòng các chất ra cũng như cho đi qua các hợp chất từ phía ngoài vào. Nó đảm bảo tế bào hấp thụ được các chất dinh dưỡng, các nguyên tố có lợi cho quá trình trao đổi chất. Nó lựa chọn cho đi qua cả các phân tử chất hữu cơ loại nhỏ đồng thời ngăn cản các hợp chất phân tử lớn. Đối với các phân tử bé kị nước như O2, N2, CH4, N2O, H2 hoặc các phân tử có cực nhưng không tích điện như H2O, urea, CO2,…màng sinh chất thể hiện như một màng vật lý cho đi qua theo quy luật vật lý học.

Đối với các phân tử có kích thước lớn quan trọng đối với tế bào và

ưa nước thì màng cho đi qua theo cơ chế khuếch tán theo nồng độ chất hòa tan, có thể là khuếch tán thụ động từ nồng độ cao đến nồng độ thấp hoặc khuếch tán tích cực chủ động nhờ các enzyme vận chuyển permease, nhờ đó mà cơ thể tập trung vào trong các hợp chất cần thiết cho tế bào.

28

Có một cách vận chuyển khác là do sự thay đổi vị trí các nhóm chức năng, ví dụ khi phân tử glucose đi vào đã được phosphoryl hóa và giải phóng vào bên trong màng tế bào là hợp chất glucoso - phosphate.

Màng sinh chất chứa các enzyme sinh tổng hợp kiểm soát các khâu kết thúc tổng hợp lipid của màng và các hợp chất kiến tạo thành tế bào.

Cuối cùng, màng sinh chất là nơi định vị của nhiều enzyme tham gia tổng hợp ATP. Ở các cơ thể nhân chuẩn, các enzyme này có mặt trong ty thể. Các chuỗi hô hấp của màng sinh chất của vi khuẩn và vi sinh vật cổ làm chức năng tương tự như màng trong của ty thể. 3.4. Sinh chất và Ribosome

Sinh chất của cơ thể nhân sơ gồm có 80 - 90% là nước, nước có thể ở trạng thái tự do (chiếm phần lớn) làm nhiệm vụ hòa tan các chất và tạo nên dung dịch keo với các chất cao phân tử. Nước ở trạng thái kết hợp (chiếm phần nhỏ) thường liên kết trong các vi cấu trúc như protein, lipid và hydratcarbon. Phần còn lại của sinh chất là lipoproteid (chiếm 10 - 20%). Hệ keo của sinh chất bao gồm 2 pha: pha thứ nhất là dung dịch muối khoáng và các hợp chất hòa tan có bản chất là lipoproteid, pha thứ 2 là pha huyền phù gồm các hạt nucleoprotein, lipid và nhiều loại hạt có kích thước rất khác nhau.

Khi còn non, đang sinh trưởng, chất nguyên sinh có cấu tạo đồng nhất và bắt màu giống nhau. Khi trưởng thành, trong chất nguyên sinh xuất hiện các vật thể ẩn nhập, không bào khí làm cho sinh chất có dạng huyền phù lổn nhổn, bắt màu không đồng đều và có tính chiết quang khác nhau. Sinh chất của vi khuẩn có pH bình thường là 7 - 7,2. Để nghiên cứu sinh chất, người ta dùng siêu li tâm cao tốc để tách chất nguyên sinh và các cấu trúc siêu hiển vi riêng ra.

* RNA và Ribosome Một tế bào vi khuẩn chứa trung bình khoảng 18.000 ribosome, hạt

70S (S là chữ đầu của Sverberg - 10-3 cm/giây trong siêu li tâm) với đương kính từ 10 - 30nm, trọng lượng phân tử 3.106 daltons. Mỗi ribosome, khi giảm nồng độ Mg2+ của dung dịch sẽ tách ra thành 2 tiểu phần trong siêu li tâm: tiểu phần lớn (50S) và tiểu phần be (30S). tiểu phần lớn liên kết với tiểu phần bé bàng mối liên kết trung gian RNA - protein và protein - protein. Các ribosome chứa phần chủ yếu là RNA (63%) và phần kia là protein (37%).

Ngoài RNA và protein, ribosome có thể còn chứa một lượng nhỏ lipid và enzyme ribonuclease, lepxinaminopeptidase, galactosidase và một ít chất khoáng giàu Mg và nghèo Ca.

29

Sự tổ hợp của tiểu phần lớn vào tiểu phần nhỏ bởi liên kết bên trong ribosome, liên kết RNA - protein, ở đây có 2 site (chốt) đặc biệt có vai trò quan trọng trong quá trình dịch mã (translation) từ chuỗi RNA sang protein. Các site này gọi là site "P" (như peptidyl) và "A" (như aminoacyl).

Ribosome là cơ quan tổng hợp protein của tế bào, nhưng chỉ có một số nhỏ ribosome (khoảng 5 - 10% tổng số ribosome) ở dạng liên kết với RNAm đòi hỏi phải có sự tham gia của nhiều yếu tố làm dài chuỗi polypeptide. Một trong các yếu tố đó là EF-2 thường thấy ở các vi sinh vật cổ và cơ thể nhân chuẩn, nhưng không thấy ở vi khuẩn, các yếu tố này thay đổi vị trí phiên âm của histidine (cho diphtamide) làm mẫn cảm với độc tố diphteria, đây là một sự khác biệt nữa giữa các vi sinh vật cổ và vi khuẩn. 3.5. Các hạt dự trữ ở vi khuẩn

Ở cuối pha trưởng thành, trong tế bào vi khuẩn xuất hiện những hạt có độ lớn và thành phần hóa học khác nhau. Kích thước và số lượng các hạt này tùy thuộc vào loài vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy chúng. Trong khi sinh trưởng, vi khuẩn tích lũy dần các chất dự trữ hữu cơ và vô cơ, các chất dự trữ này đạt đến kích thước nhất định thì hình thành nên hạt dự trữ (vật thể ẩn nhập) có thể thấy dưới kính hiển vi. Các chất dự trữ carbon o vi khuẩn thường thấy là glycogen, tinh bột, poly-β- hydroxy butyrate…

Các hạt dự trữ carbon dễ dàng nhìn thấy khi nhuộm bằng dung dịch có iod, hợp chất này nhuộm các chất đang trung hợp (polymer) không phân nhánh của glucose (tinh bột) thành màu xanh thẩm và các hydratcarbon phân nhánh (glucogen) thành đỏ nâu. Các hợp chất poly-β-hydroxy butyrate được nhuộm màu bởi Soudan đen như màu các giọt mỡ.

- Các hạt dị nhiễm sắc (metachomatic granulation) hay hạt volutin được tìm thấy lần đầu ở xoắn khuẩn Spirillum volutans. Chúng bắt màu với thuốc nhuộm kiềm như xanh methylene, xanh toluidine thành màu đỏ tía trong khi sinh chất của vi khuẩn lại có màu xanh. Các hạt volutin có dạng hình tròn, đường kính có thể đạt tới 0,3μm, có thể tan trong nước nóng 800C, trong dung dịch kiềm hoặc dung dịch NaCl 5%, trong dung dịch HCl 1N…không tan trong rượu, ester, chlorofor. Hạt volutin là những hạt dự trữ polyphosphate vô cơ.

- Các vi khuẩn Chromatium, Beggiatoa có thể tích lũy lưu huỳnh bên trong tế bào do oxy hóa H2S giải phóng ra S.

Các vi khuẩn oxy hóa sắt có thể tích lũy sắt trong sinh chất dưới dạng Fe3O4.

30

- Các hạt carboxysome thường thấy ở Cyanobacteria, ở một số vi khuẩn màu tía, vi khuẩn nitrat hóa, vi khuẩn oxy hóa lưu huỳng như Thiobacillus, đó là những hạt ribulose diphosphat carboxylase (hay carboxydis mutase) được bao bọc bởi sự gấp nếp của màng sinh chất, có đường kính khoảng 50 - 100nm.

- Tinh thể diệt côn trùng thường thấy ở một số loài vi khuẩn sinh bào tử như Bacillus thuringiensis, Bacillus dechrolimus, tinh thể này xuất hiện khi hình thành bào tử, chúng có bản chất là protein và ngày nay được dùng để diệt sâu hại. 3.6. Các thể mang màu và sắc tố

Ở vi khuẩn quang hợp cơ quan thực hiện quá trình quang hợp là các thể mang màu (chromatophores) (ở tảo và thực vật là lục lạp - chlorophaste) vì cấu trúc siêu hiển vi của các thể mang màu khác với lục lạp. Mặt khác bản chất của các sắc tố quang hợp cũng khác biệt, ở tảo và thực vật là diệp lục tố (chlorophyll) trong khi ở vi khuẩn quang hợp là các sắc tố gần với chlorophyll mà người ta gọi là khuẩn diệp lục tố (bacteriochlorophyll).

Halobacterium halobium (cơ thể sống trong môi trường mặn) có chứa bacteriorhodopsine ở màng sinh chất, sắc tố gần giống với sắc tố võng mạc mắt.

Ngoài ra, chúng ta có thể gặp các sắc tố sau: - Vitamine K2 (hợp chất quinon) ở Bacillus subtilis và Bacillus cereus. - Sắc tố carotenoid chống tia tử ngoại ở Corynebacterium. - Pyocyanine, violaceine ở Chromobacterium violaceum, sắc tố có hoạt

tính kháng sinh. - Một số sắc tố tạo thành màu đặc trưng của khuẩn lạc như

zeaxanthine (carotenoid), sắc tố vàng ở Staphylococcus aureus; xanthophyll và sarcinaxanthine (carotenoid) là loại sắc tố đỏ ở Sarcina.

- Sắc tố pyocyanine xanh pyoverdine xanh lục huỳng quang ở P. aeruginosa.

- Dẫn xuất sắc tố pyrolic đỏ ở Serratia marcescens. 3.7. Không bào khí

Đây là một loại túi chứa đầy khí thường gặp ở nhiều loài thuộc 3 nhóm vi khuẩn quang hợp: vi khuẩn lam (Cyanobacteria), vi khuẩn tía và vi khuẩn lục. Không bào khí giúp vi khuẩn quang hợp trôi lơ lửng trong nước và nổi lên mặt nước.

31

3.8. Chất nhân của vi khuẩn DNA của tế bào vi khuẩn chiếm khoảng 1 - 2% trọng lượng khô của

chúng, đó là hợp chất chứa thông tin di truyền chủ yếu của tế bào. Chất nhân của vi khuẩn không có màng bọc, hình dạng rất khác

nhau và chỉ có 1 sợi gồm 2 mạch DNA. Chiều dài của nó trong tế bào E.coli đo được là 1mm, tức là gấp 500 - 1000 lần chiều dài của vi khuẩn. Vòng thể nhiễm sắc được định vị tại một điểm trên màng sinh chất lúc sắp phân chia. Độ lớn DNA vào khoảng 5.106 pb (cặp base nitơ) với trọng lượng phân tử vào khoảng 3.109 dalton (4,5.108 đối với Mycoplasma, 1.109 đối với Acholeplasma). Khong thấy protein histone kiểu tế bào nhân chuẩn mà chỉ có các polyamine như specmidin và specmine làm chức năng củng cố ổn định DNA. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy ở Thermoplasma (một loại vi sinh vật cổ - Archaea) đã tìm thấy histone.

Vòng DNA xoắn kép của vi khuẩn thường được gọi là thể nhiễm sắc vi khuẩn hay genophore. Những nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử cho thấy genophore của vi khuẩn có nhiều vòng, mỗi vòng nhỏ có khoảng 400 cặp base nitơ, nhiều vòng tạo thành búi xoắn. Ở E.coli có 50 búi xoắn và có gần 500 vòng trong một búi, điều đó giải thích tại sao chuỗi DNA của vi khuẩn dài tới 1mm và gồm khoảng 5.106 pb.

- Ở E. coli đã tìm thấy ít nhất là 4 loại protein liên kết với DNA, đó là những protein kiềm, bền nhiệt nên rất gần gũi với histone của các sinh vật nhân chuẩn:

+ Hu được hình thành bởi 2 tiểu phần α và β (nhị phân protein ProteinII) nên rất gần với histone H2B.

+ H gần giống với histone H2A. + H1 và HLP1, những protein liên kết DNA này có chức năng điều

hòa không đặc hiệu trong quá trình sao mã. Sự có mặt của các protein trên làm cho cấu trúc thứ cấp DNA của E.

coli vững chắc hơn. Mặc dù chỉ có một thể nhiễm sắc đối với một tế bào vi khuẩn, nhưng

trong môi trường nuôi cấy liên tục khi có sự sinh sản nhanh, có thể dẫn tới sự có mặt của 2 thậm chí 4 thể nhiễm sắc trong một tế bào vi khuẩn đang phân chia.

- Ba loại DNA polymerase đã được chiết từ E. coli: + DNA polymerase I: làm chức năng khôi phục, sửa chữa bổ sung,

xúc tác bổ sung desoxyribonucleotide vào đầu của chuỗi DNA. Phản ứng chỉ xảy ra khi DNA đã được đinh vị ở màng sinh chất.

32

+ DNA polymerase II có hoạt tính ngoài nhân, nó cần thiết cho hoạt động của RNAm.

+ DNA polymerase III là loại có hoạt tính nhất trong 3 loại polymerase.

- Các DNA-ligase xúc tác hình thành các đầu nối 2 mạch DNA - cầu phosphodiester giữa nhóm hydroxyl 3' ở đầu mạch và nhóm phosphate 5' ở đầu mạch kia. DNA-ligase có thể thực hiện các chức năng sau:

+ Sửa chữa, cắt bỏ một đoạn của mạch trong DNA xoắn kép. + Đóng và tạo thành vòng các phân tử DNA xoắn kép mạch thẳng. + Hàn các đoạn DNA trong quá trình tái tổ hợp di truyền. + Tham gia vào quá trình nhân DNA cùng với DNA polymerase. Các enzyme tháo mạch của chuỗi xoắn kép làm cho các mạch DNA

trong chuỗi xoắn kép được tách ra để nhân lên. từ hai mạch làm khuôn tổng hợp hai mạch mới bổ sung để tạo thành hai chuỗi DNA xoắn kép hoàn toàn giống nhau. Đấy là cơ chế nhân đôi DNA bảo đảm tính di truyền của các thế hệ vi khuẩn. Các thông tin di truyền từ DNA được sao mã (transcription) sang mRNA và sau đó được dịch mã (translation) thành chuỗi polypeptide hay enzyme. Bằng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiogragh) khoa học cỏ thể chụp được quá trình nhân lên của nhiễm sắc thể ở E.coli và nhiều cơ thể nhân sơ khác.

DNA của cơ thể có cấu tạo đặc trưng, số lượng adenine bằng số lượng thymine và số lượng guanine bằng số lượng cytosine. Tỷ lệ (G+X)/(A+T) là một chỉ số sinh hóa quan trọng giúp phân loại đến giống và loài trong phân loại sinh hóa (Chemotaxonomy), ví dụ chỉ số Chargaff của Micrococcus luteus là 4 và của Clostridium perfringens là 0,34. 3.9. Plasmid

Ngoài các gen nằm trong genophore ra, tế bào vi khuẩn (và một số loài nấm men) có thể chứa các yếu tố di truyền ngoài thể nhiễm sắc, chúng có thể tự nhân lên. Vì vậy mà năm 1952, Lederberg đã gọi chúng là plasmid để chỉ tính chất độc lập của chúng với các gen nằm trên thể nhiễm sắc.

Khái niệm vật chất di truyền ngoài thể nhiễm sắc bao gồm DNA của các ty thể, lục lạp (nếu có), các plasmid, các yếu tố giới tính, các yếu tố "diệt", một số prophage…

Khoa học đã xác định plasmid có ở rất nhiều loài vi khuẩn như E. coli, các trực khuẩn đường ruột và vi khuẩn Gram âm, tụ cầu khuẩn

33

Staphylococcus aureus, xạ khuẩn Streptomyces coelicolor và ở Rhizobium melitoli…

Plasmid là phân tử DNA vòng kín 2 mạch, hiếm thấy 2 mạch thẳng, nằm ngoài thể nhiễm sắc, có kích thước nhỏ (bằng khoảng 1/100 thể nhiễm sắc của vi khuẩn, gần giống một prophage), có khả năng tự nhân lên độc lập với tế bào và chúng được phân sang các tế bào con khi nhân lên cùng với sự nhân lên của tế bào. Các plasmid có thể tăng lên hoặc giảm đi khi có yếu tố bất lợi như nhiệt độ, thuốc màu, kháng sinh, các chất dinh dưỡng… Các plasmid có thể ở trạng thái cài vào thể nhiễm sắc, có khả năng tiếp hợp hoặc không tiếp hợp, có thể có một hoặc nhiều bản sao cùng loại ngay trong một tế bào vi khuẩn.

Các plasmid không phải là yếu tố nhất thiết phải có đối với sự sống tế bào, nhưng khi có mặt, chúng đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh… Thường thì các plasmid nhân lên khi tế bào nhân lên hay tế bào tiếp hợp, nhưng không có nghĩa sự nhân lên của plasmid phụ thuộc vào sự nhân lên của tế bào. trong trương hợp cùng nhân lên, chắc phải có cơ chế kiểm soát đảm bảo đồng thời sự nhân lên, số lượng bản sao và sự phân chia đồng đều các bản sao cho hai tế bào con, cho đến nay cơ chế này còn chưa sáng tỏ. Có những plasmid có thể chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ tiếp hợp (tiếp hợp được), ngược lại có plasmid không tiếp hợp được. Các plasmid qua tụ cầu khuẩn Staphylococcus chỉ có thể chuyển sang tế bào nhận nhờ tải nạp.

Một số plasmid (ví dụ yếu tố giới tính F) có thể xâm nhập vào thể nhiễm sắc ở vị trí đặc biệt có trật tự nucleotide bổ trợ với đoạn nucleotide trên plasmid, những site như vậy gọi là những yếu tố gia nhập (IS), những IS này gồm khoảng 1000bp và thấy ở E. coli như IS 1 (768bp) và IS 2 (1327bp). Như vậy, các yếu tố gia nhập (yếu tố điền vào - IS) là đoạn nucleotide nhỏ (700 - 1500bp) thường chỉ mã hóa sự chuyển vị (transposition) (tạo ra các site - tự cắt đứt trước của DNA).

Các yếu tố di truyền vận động (Transposon - Tn) là những đoạn nucleotide dài hơn (vài ngàn đến vài vạn bp) mã hóa khả năng thay đổi tính chất (như chống chịu) thường định vị bên cạnh IS. Các gen vận động này có thể di chuyển trong nôi bộ một thể nhiễm sắc hoặc giưa các thể nhiễm sắc. Các yếu tố Tn thấy ở E.coli như Tn5 (5700bp) chống chịu Kanamycine, Tn681 (2100bp) sinh độc tố ruột, Tn2571 (23000bp) chống chịu Chloramphenicol, Tn3 (4597bp) chống chịu Ampicillin. Tần số của sự chuyển vị (Transposition) cũng như tần số của các đột biến tự phát ngẫu nhiên (10-5 - 10-7).

34

3.10. Tiên mao (Flagelles), tiêm mao (Cils) và nhung mao (Pili) Tiên mao thường thấy ở Vibrio, Spirillum và nhiều loài vi khuẩn

Gram âm. Số lượng tiên mao có thể từ 1 - 30 sợi tùy thuộc vào loài vi khuẩn. Một tiên mao có chiều dài từ 6 - 30μm và đường kính 10 - 30nm (12nm ở Proteus, 20 - 25nm ở Vibrio và Pseudomonas). Khi tiên mao ngắn thì người ta thường gọi là tiêm mao. Tiên mao có cấu tạo từ một loại protein gần với Keratin mà người ta gọi là flagelline, protein có trọng lượng phân tử khoảng 40.000 (trong đó có các acid amin chủ yếu là arginine, lysine, acid aspartic, acid glutamic và tyrosine), những protein này có tính kháng nguyên (H, kháng nguyên ứng nhiệt).

Tiên mao giúp cho vi khuẩn chuyển động, khi vi khuẩn di động tiên mao xoáy vào nước hoặc môi trường lỏng (có thể tới 100 vòng trong 1 giây), trong khi tiêm mao chuyển động như que gạt. Mặc dù vậy, trong vi sinh học người ta thường dùng tiên mao và tiêm mao với cùng một nghĩa, chúng khác với nhung mao (pili) là những sợi mảnh và ngắn hơn nhiều, thường có xung quanh tế bào Gram âm và ít thấy ở tế bào vi khuẩn Gram dương. Người ta chia nhung mao (pili hoặc fimbria) làm 2 loại: loại nhung mao phổ thông (Type I) và loại nhung mao giới tính (Type II). Loại nhung mao phổ thông phân bố với số lượng lớn trên bề mặt tế bào vi khuẩn (vài trăm), người ta cho rằng loại nhung mao này có liên quan đến tính chất kết dinh máu của vi khuẩn, loại nhung mao này ngắn hơn nhung mao giới tính (loại II có thể dài tới 10μm), số lượng nhung mao giới tính rất ít, khoảng 1 - 4, ở đầu cùng có chổ phình ra, nhung mao loai II có vai trò quan trọng trong quá trình tiếp hợp (conjugation) giữa 2 tế bào vi khuẩn.

Trong số các sợi (tiêm mao và nhung mao) trên bề mặt tế bào vi khuẩn thì tiên mao được nghiên cứu kỹ hơn và người ta chia chúng làm 2 nhóm phân bố: phân bố ở cực (polaire) và phân bố xung quanh (peritriche).

Sự chuyển động của tế bào vi khuẩn có thể đạt tới 10μm/s (tức là trong 1 giây vi khuẩn có thể đi được khoảng cách dài gấp 10 lần nó) nên đòi hỏi một năng lượng rất lớn (khoảng 2% năng lượng trao đổi chất của tế bào). Bộ máy xoay tiên mao ở gốc nằm trong màng sinh

35

chất và thành tế bào gồm 2 vành khuyên, vành trong gồm 16 đơn phần protein có thể dịch chuyển rất nhanh nhờ dòng proton (H+) đi vào.

Cách sắp xếp tiên mao là một tiêu chuẩn trong phân loại hình thái (Morphology taxonomy) vi khuẩn:

- Đơn mao ở cực (Monotriche polaire hay parapolaire) đặc trưng cho nhiều loài Vibrio hoặc chùm mao ở cực (Lophotriche) đặc trung cho nhiều loài Pseudomonas, Chromatium và Thiospirillum.

- Lưỡng cực (Amphitriche hay Cephalotriche) có thể chùm mao ở lưỡng cực như các loài Spirillum.

- Chu mao (Peritriche) hay tiên mao sắp xếp xung quanh thân tế bào vi khuẩn đặc trưng cho nhiều loài Prote 3.11. Nội bào tử vi khuẩn (Endospores)

Một số vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng, khi chất dinh dưỡng ở môi trường cạn kiệt và chất qua trao đổi độc hại quá nhiều, hoặc do có sự thay đổi đột ngột các điều kiện sinh trưởng có khả năng hình thành bào tử ở bên trong tế bào, được gọi là nội bào tử (endospores). Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ tạo một nội bào tử nên loại bào tử này không phải là bào tử sinh sản, khác với các loại đính bào tử (conidiospores), bào tử túi (ascospores) hay bào tử đảm (basidiospores) ở nhiều loài nấm, chúng là những bào tử sinh sản vô tính hay hữu tính.

Những vi khuẩn có khả năng hình thành nội bào tử gồm nhiều loài thuộc các giống Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces.

Vỏ bào tử đặc trưng bằng sự có mặt của acid dipicolinic (dưới dạng dipicolinate calcium), hợp chất này có thể chiếm tới 10 - 15% trọng lượng khô của bào tử. Vai trò của hợp chất dipicolinate calcium làm cho bào tử chống chịu được nhiệt độ cao, khi thí nghiệm người ta đã thay calcium bằng strontium thì khả năng chịu nhiệt của bào tử thu được kém đi.

Một hợp chất khác của vỏ bào tử mới tìm thấy là acid L.N-succinyl-glutamic không có trong tế bào sinh dưỡng và chỉ được tổng hợp khi hình thành bào tử, ngay giai đoạn đầu khi hình thành vách ngăn DNA mới với một ít nguyên sinh chất, hợp chất này giúp cho bào tử bền nhiệt.

Khi hình thành bào tử, tế bào có thể mất đi đến 70% nước. Một số vi khuẩn khi hình thành bào tử có thể tồn tại rất lâu trong tự nhiên, ví dụ Bac. anthracis có thể sống tiềm sinh trong nhiều năm. Trong một số chất độc tế bào vi khuẩn bị chết rất nhanh nhưng bào tử có thể tồn tại được khá lâu, ví dụ trong phenol có thể vẫn sống trong 15 ngày, trong HgCl2 1% tồn tại

36

trong 2 ngày. Thời gian để hình thành bào tử khác nhau tùy loài (từ vài giờ đến 20 giờ).

Khi đưa bào tử vào môi trường thuận lợi để phát triển, bào tử sẽ có hàng loạt thay đổi tích cực và mọc mầm, quá trình mọc mầm gồm 3 giai đoạn chủ yếu: hoạt hóa, nứt vỏ và mọc ra. muốn quan sát được bào tử người ta dùng phương pháp nhuộm đơn hoặc kép. 4. Xạ khuẩn và vi khuẩn nội bào

Những vi khuẩn thuộc bộ Actinomycetales (nhóm bậc thấp và bậc cao) là những vi khuẩn có hình sợi Gram dương, sợi có thể phân nhánh, thường gặp chúng trong đất và nước. Nhưng xạ khuẩn rất gần với nấm về hình dạng hệ sợi phát triển trong cơ chất như bộ "rễ" hấp thụ chất dinh dưỡng, hệ sợi mặt có chất tạo nên khung của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh tận cùng bằng những cuống mang bào tử. Đó là những loài thuộc giống Streptomyces, một giống đã khai thác được khoảng 50% số kháng sinh hiện biết, đường kính sợi khoảng 1- 2μm (nhỏ hơn nhiều so với đường kính sợi nấm 7 - 9μm). Xạ khuẩn cũng giống như vi khuẩn là chưa có nhân được bao bọc bằng màng, thành tế bào xạ khuẩn khong chứa cellulose hay chitine mà chứa hợp chất điển hình của vi khuẩn là glucopeptide. Xạ khuẩn cũng có quá trình sinh sản phân bào theo kiểu amitose (phân bào không tơ), loại vi khuẩn này cũng chưa có giới tính, nghĩa là chưa có sự phân hóa thành tế bào đực, cái và có thể hình thành hợp tử từng phần nhờ tiếp hợp, tải nạp và biến nạp, xạ khuẩn cũng bị phage tấn công và gọi là Actinophage.

Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm 1943. Chúng có vị trí tiến hóa cao trong số các giống thuộc vi khuẩn Gram dương, có trị số % mol Guanine và Xytozin rất cao (69 - 77% (G + X) trong DNA).

Xạ khuẩn sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi khí sinh của Streptomyces hình thành cuống bào tử và chuỗi bào tử. Sợi mang bào tử có những hình dạng khác nhau tùy theo loài: thẳng-lượn sóng (Retiflexibilis), xoắn (Spirales) hoặc có móc, vòng (Retinaculiaperti)… đoạn tận cùng của cuống mang bào tử bằng phương pháp cắt khúc (segmentation) hay kết đoạn (fragmentation) mà hình thành nên chuỗi bào tử.

Bào tử xạ khuẩn (Arthrospores bào tử đốt) hình bầu dục, hình lăng trụ hoặc hình cầu với đường kính khoảng 1,5μm. Màng bào tử xạ khuẩn có thể nhẵn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), khối u (warty), nếp nhăn (rugose)… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn. Những tiểu tiết này có thể thay đổi theo quy luật trên môi trường nuôi cấy, thường thì xạ khuẩn có tiểu tiết

37

có thể có màng nhẵn trên môi trường có nguồn nitơ hữu cơ, trên môi trường có đạm vô cơ và glucose các bào tử dễ biểu hiện các tiểu tiết rõ nhất. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau, chính vì vậy mà ủy ban quốc tế về phân loại xạ khuẩn (ISP) đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm vi sinh vật này. Hiện nay khoa học đã mô tả được khoảng 600 loài xạ khuẩn bậc cao này.

- Rickettsia là một giống của Rickettsiaceae, Rickettsiales, đây là vi khuẩn ký sinh nội bào, có 3 nhóm (Tribus): Rickettsiae, Ehrlichiae và Wolbachiae với 2 giống chủ yếu là Rickettsia và Coxiella, ký sinh ở động vật có xương. Những vi khuẩn này cũng có 2 loại acid nucleic, thành tế bào cũng có hợp chất đặc trưng của thành tế bào vi khuẩn, sinh sản bằng cách chia đôi khi ở trong tế bào động vật.

- Chlamydia là một giống của Chlamydiaceae, thuộc bộ Chlamydiales, là những vi khuẩn ký sinh bắt buộc, Gram âm và có nhiều điểm giống Rickettsia, trong động vật có xương sống chúng không tạo ra ATP riêng mà sử dụng ATP của vật chủ, kích thước của chúng rất nhỏ (0,3 - 0,45μm) vì thế trong một thời gian dài trước đây người ta coi chúng là một loại virus (virus kiềm tính Van Royen).

- Mycoplasma thuộc họ Mycoplasmaceae, họ độc nhất của bộ Mycoplasmales (đôi khi là Mycoplasmatales - Freundt, 1955). Chúng là những vi khuẩn không có thành tế bào, thân mềm dễ biến hình, bất động. Trong bộ Mycoplasmales có các dạng vi khuẩn Mycoplasma dạng L và PPLO. Đây là những vi khuẩn thuộc Tenerecutes, lớp Mollicutes, đó là lớp vi khuẩn tiêu giảm thành, vi khuẩn có kích thước nhỏ nhất khoa học hiện biết (0,1 - 0,3μm) vì vậy chúng dễ qua màng lọc vi khuẩn, chúng là tác nhân gây các bệnh hô hấp, tiết niệu - sinh dục. 5. Vi sinh vật cổ (Archaea)

Các vi sinh vật cổ mà trước đây gọi là các vi khuẩn cổ (Archaeobacteria) là nhóm cơ thể nhân sơ có sớm nhất (khoảng 4 tỷ năm trước đây), được Woese R. và Woese C.R. tách ra thành một nhánh tiến hóa riêng. Những cơ thể còn lại hiện nay thường sống trong các điều kiện khác thường.

Những nghiên cứu gần đây về nhiệt độ và pH tối ưu của vi khuẩn ưa nhiệt và Archaea cho phép chia vi sinh vật cổ thánh 2 nhóm: Crenarchaeota và Euryarchaeota. Nhóm Crenarchaeota là những vi sinh vật cổ kị khí bắt buộc, ưa nhiệt và ưa acid (Thermoacidophiles, Thermophiles anaerobies stricts).

38

Nhóm Euryarchaeota là những vi sinh vật cổ ưa mặn, sinh methane (methanogenes) và một vài loài kị khí ưa nhiệt.

Bảng 2.3: So sánh một số tính chất giữa vi khuẩn và vi sinh vật cổ Tính chất Bacteria Archaea Thành phần thành tế bào Murein Pseudomurein,

protein, polysaccharide Lipid của màng Glycerol, acid

béo, aster Glycerol, ete

isopranyl Hình dạng tế bào có loại

hình vuông và dẹt - + (hoặc không)

Nội bào tử (endospore) + (hoặc không) - Chất "ở nhánh" của RNAt Ribothymidine Pseudouridine hoặc

L.methylpseudouridine Hình thành chất kích thích

methyonyl RNAt

+ -

Các intron trong gen - + Có Polymerase - RNA loại

nhân chuẩn - +

Có coenzyme đặc biệt - + Nhiệt độ sinh trưởng tối đa 900C 1100C Có quang hợp phức tạp Có thể - Có thể sinh methane - + Chu trình Calvin được sử

dụng khi cố định CO2

Có thể -

Những vi sinh vật cổ (số liệu chủ yếu dựa trên methanogenes) là những đơn bào nhỏ khoảng 1μm có thành tế bào gồm những hợp chất đặc biệt (thay vì murein ở đây có acid talosaminuronic, ester của acid béo mạch không thẳng và glycerol, sự phân nhánh của chuỗi dang ether (-O-) mà không phải dạng ester (-CO-O-) (lipide ether-phytanyl), có nhiều liên kết muối và hydro trong protein, có pseudouracil ở vị trí uracil trong RNAt, không có dihydrouracil, thymine trong vòng bên của RNAt, chất nhân phân tán trong sinh chất với lượng nhỏ (chỉ bằng khoảng 1/3 so với chất nhân của E.coli). DNA của chúng giàu hàm lượng G + X (mối liên kết 3 hydrrogen), ribosome loại cơ thể nhân sơ, có intron, có coenzyme đặc biệt (M), hầu như không có sự ổn định về quinon và cytochrome. Chính những đặc điểm đó đã giúp cho vi sinh vật cổ sống trong những điều kiện khác thường: nhiệt độ cao (có loài sống được ở 2500C) dưới 265 atm, chống chịu với lysozyme…

Có 3 nhóm sinh lý và sinh thái quan trọng là: * Các cơ thể sinh methane (methanogenes), đây có lẽ là nhánh cổ

xưa nhất, ở các lớp nước sâu, ở đáy, kị khí, một số loài tìm thấy trong

39

đường tiêu hóa của động vật nhai lại. Phân loại cơ thể sinh methane dựa chủ yếu vào khả năng và cơ chế sinh methane của chúng, gồm có 5 bộ:

- Methanobacteriales, có các loài: Methanobacterium ivanovii, M. thermoautotrophicum, M. smithii, M. fervidus, M. sociabilis.

- Methanococcales, có các loài Methanococcus voltae, M. vannielii, M. thermolithotrophicus.

- Methanomicrobiales, có loài Methanomicrococcus sp. - Methanosarcinales, có các loài Methanosarcina mazeii, M.

barkeri, M. thermophila, M. acetivorans, Methanothrix sp. - Methanopyrales có loài Methanopyrus sp. Những cơ thể sinh methane có thể thực hiện những cơ chế khác

nhau tùy theo loài (hầu hết là cơ thể kị khí bắt buộc): CO2 + 4H2 → CH4 + 2H2O (ΔG10 = -135,4 KJ/mol) CH3COOH → CH4 + CO2 (ΔG10 = -32,5 KJ/mol) HCOOH + 3H2 → CH4 + 2H2O CH3OH + H2 → CH4 + H2O (ΔG10 = -112,5 KJ/mol) CH3NH2 + H2 → CH4 + NH3

(CH3)2S + 2H2 → 2CH4 + H2S Người ta cho rằng những cơ thể sinh methane cùng với cơ thể dinh

dưỡng methane (methanotrophes) đã làm tuần hoàn nguyên tử carbon trong thời kỳ khí quyển không có hoặc rất ít oxy.

Sự biển đổi từ CO2 thành CH4 được biết ở vi sinh vật cổ có 4 giai đoạn: 2H+ 2H+ 2H+ 2H+

2e- 2e- 2e- 2e-

CO2 HCOOH HCHO CH3OH CH4

acid formic H2O formandehyde methanol H2O Trong khi đó, quá trình oxy hóa methane ở cơ thể dinh dưỡng

methane (methanotrophes) được thực hiện theo cơ chế như sau: CO2

CH4 CH3OH HCHO HCOOH CO2

2H+ H PQQ PQQH2 NAD+ NAD+H+ NAD+ NAD+H+2e-

Cơ thể đồng hóa

40

* Các cơ thể ưa mặn (halophiles) như Haloarcula, Halobacterium. Những cơ thể này sống trong môi trường có nồng độ muối cao (ở biển, ở các mỏ muối), hấp thu chất dinh dưỡng chủ yếu là do chênh lệch gradient nồng độ muối tạo ra, quá trình quang hợp ở đây khá đặc bieet nhờ Bacteriorhodopsine, hợp chất liên kết trong màng sinh chất chứ không phải là khuẩn diệp lục tố (bacteriochlorophyll).

* Các cơ thể ưa nhiệt, ưa acid (Thermoacidophiles), là những cơ thể sống ở nguồn đất - nước nóng, ở vùng núi lửa, chúng là những cơ thể hiếu khí hoặc hiếu kị khí.Ví dụ:

Sulfolobus acidocaldaricus có nhiệt độ sinh trưởng tối đa là 900C và tối ưu là 750C, ở pH tối ưu là 2,5.

Thermoplasma acidophilum có nhiệt độ sinh trưởng tối đa là 650C và tối ưu là 600C, ở pH tối ưu là 1,5. 6. Nguyên tắc phân loại cơ thể nhân sơ

Cơ thể nhân sơ ngày càng được phát hiện nhiều hơn, vì vậy để nhận biết và sử dụng chúng ta cần phải đặt tên cho nó và phải phân loại chúng.

Taxonomy là khoa học nghiên cứu sự đa dạng của vi sinh vật và mối liên hệ vốn có tồn tại giữa chúng. Khoa học định loại này bao gồm 3 lĩnh vực khác nhau: Classification (xếp loại), Nomenclature (đặt tên) và Identification (nhận biết).

Bảng 2.4. Bảng định loại các nhóm lớn cơ thể nhân sơ (Dựa chủ yếu vào Gergey's Manual, 1984, tên siêu giới đã được đề xuất)

Tên định loại Nhóm cơ thể

+ Siêu giói nhân sơ (Super kingdom procaryote)

Cơ thể nhân chưa có màng

A. Giới vi khuẩn (Kingdom Bacteria)

Cơ thể có thành tế bào với hợp chất murein

I. Ngành I: Gracilicutes Cơ thể nhân sơ có thành đặc trưng vi khuẩn Gram âm

Lớp 1: Scotobacteria 1. Vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ (Chimiolithotrophes)

2. Myxobacteria 3. Vi khuẩn có bao (Trichome). 4. Vi khuẩn dính kết và vi khuẩn có chồi 5. Spirochaete 6. Vi khuẩn Gram âm, hiếu khí và vi hiếu

khí 7. Vi khuẩn Gram âm, kị khí không bắt buộc

41

8. Vi khuẩn Gram âm, kị khí bắt buộc 9. Rickettsia và Chlamydia Lớp 2: Vi khuẩn quang hợp không thải oxy (Onoxyphotobacteria)

10. Vi khuẩn quang dưỡng

Lớp 3: Vi khuẩn quang hợp thải oxy (Oxyphotobacteria)

11. Cyanobacteria

II. Ngành II: Firmicute Cơ thể nhân sơ có thành vi khuẩn gram dương

Lớp 1: Fimibacteria 12. Vi khuẩn Gram+, không sinh bào tử 13. Vi khuẩn Gram+, sinh bào tử Lớp 2: Thallobacteria 14. Vi khuẩn tia và chỉ (Actinomycetales)

(xạ khuẩn) III. Ngành III: Tenericutes 15. Mycoplasmes B. Giới sinh vật cổ (Kingdom Archaea) Mendosicutes

Lớp 1: Archaea Cơ thể nhân sơ không có thành, hoặc có thành với hợp chất đặc trưng Pseudomurein, kiểu sinh lý rất đặc biệt. Đã từng chiếm đa số trên hành tinh cách đây 3 tỷ năm về trước, hiện nay chỉ còn lại vài nhóm: Methanogens, Halophiles và Thermoacidophiles…

Sự xếp loại (Classification) thiết lập các nhóm định loại (các taxon) căn cứ vào những tieu chuẩn hình thái và phân tử cấu tạo tế bào.

Sự đặt tên (Nomenclature) là đưa ra một tên cho một nhóm, một cá thể theo nguyên tắc của Linaeus gồm 2 từ, một từ latin chỉ giống và từ kế tiếp chỉ loài. Ví dụ tên của trực khuẩn cỏ khô là Bacillus subtilis.

Sự nhận biết (Identification) chỉ định các loài nghiên cứu vào một trong các loại (các taxon) đã mô tả.

Phân loại học vi khuẩn ngày nay sử dung phương pháp định loại hình thái (Taxonomy phenetic), hay sử dụng phương pháp định loại số (Taxonomy numeric), phương pháp này sử dụng một lượng lớn các tính trạng và so sánh các tính chất để rút ra sự giống nhau giữa hai cá thể, trong đó chỉ số Jaccard là dễ hiểu và thông dụng nhất trong nghiên cứu đại cương.

nS+ SAB = hệ số giống nhau giữa A và B SAB

= nS+ = số các đặc điểm giống nhau nS+ + nd nd = số các đặc điểm khác nhau.

42

Vi khuẩn học còn sử dụng phương pháp định loại di truyền (Taxonomy genetic), 3 tiêu chuẩn được sử dụng ở đây là chỉ số (G + X)% (hệ số Chargaff), tử số lai DNA - DNA, số lượng và trật tự các nucleotide trong 16sRNAt và 5sRNAt. chỉ số lai DNA - DNA là một tiêu chuẩn bắt buộc để phân tích vị tría các loài vi khuẩn, cho đến nay các loài của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae đã cho lai với nhau và thiết lập được mối liên hệ chủng loại phát sinh giữa chúng. Theo Woese (1981) trật tự nucleotide trong 16sRNAt là một chỉ số quan trọng xác định sự gần gũi của hợp chất protein và từ đó quy định mối quan hệ chủng loại phát sinh giữa các nhóm vi khuẩn. Chính nhờ phân tích 16sRNAt mà hình thành một hướng định loại mới - định loại chủng loại phát sinh (polygenetic taxonomy), nhờ đó có thể tách các vi sinh vật cổ ra khỏi vi khuẩn và chứng minh nó là nhánh tiến hoa độc lập khác xa xạ khuẩn. Các phương pháp định loại sinh hóa (chimiotaxonomy) ngày nay đã được sử dụng rộng rãi, như các hợp chất polymer của thành tế bào vi khuẩn (bao gồm vi khuẩn Gram dương, Gram âm và Cyanobacteria) là peptidogulcan (murein), hợp chất đặc trưng này không thấy ở nhóm vi khuẩn tiêu giảm thành Mycoplasmes và ở các vi sinh vật cổ. Các vi sinh vật cổ có hợp chất thành đặc trưng là pseudomurein, trong đó acid muramic được thay bằng acid talosaminuromic.

Các mức đơn vị phân loại dùng trong vi sinh vật học là: Clone → biotype → species → genus → familia → order → classe

→ division → kingdom - Dòng tế bào (clone): là một quần thể vi khuẩn (hay vi sinh vật) có

được từ một tế bào bố mẹ ban đầu nhờ sự phân chia vô tính. - Dạng (biotype): một nhóm cá thể có chung đặc điểm di truyền

tuyển chọn và những đặ điểm chủ yếu, dạng có được từ tuyển chọn các dòng, đây là đơn vị hay dùng trong công nghệ vi sinh.

- Chủng (nòi - souche): là từ thông dụng trong kỹ thuật thực hành, đó là taaoj hợp những cá thể có được do sự cấy chuyền từ một khuẩn lạc vi khuẩn.

- Loài (species): tập hợp những cá thể giống nhau về hình dạng, cách sống, có thể sinh sản bình thường giữa chúng và thường không có khả năng này với các cá thể thuộc loài khác.

- Giống (genus): tập hợp các vi khuẩn trong bảng xếp loại dưới họ, trên loài, tập hợp các loài rất gần nhau.

- Họ (familia): tập hợp các giống có một số đặc điểm chung.

43

- Bộ (order): một nhánh trong bảng xếp loại vi khuẩn, bao gồm một số họ gần nhau nằm dưới lớp.

- Lớp (class): một nhánh trong bảng xếp loại vi khuẩn, bao gồm vi khuẩn trong một số bộ gần nhau.

- Ngành (division): tập hợp các vi khuẩn ở một số lớp có chung một số đặc điểm cơ bản. II. Vi sinh vật nhân chuẩn. 1. Vi nấm

Các cơ thể nấm với cấu tạo thành tế bào, kiểu trao đổi chất và hệ enzyme khác biệt với các cơ thể nhân chuẩn khác (thực vật, động vật) và khác xa với cơ thể nhân sơ nên từ lâu đã được xếp thành một giới riêng - đó là giới nấm (Kingdom Fungi).

Có 3 danh từ thường dùng để chỉ nấm là: nấm men (Levures, Yeasts), nấm mốc (Moisissures) và nấm lớn hay nấm có quả thể. Trong vi sinh vật học, vi nấm được hiểu là các nấm có cơ thể hiển vi, bao gồm hai nhóm:

- Nấm đơn bào hay nấm men. - Nấm sợi hay nấm mốc. 1.1. Nấm men (Levures, Yeasts) Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào, nhân chuẩn, hiển vi. Nấm

men có thể thuộc về 3 lớp nấm là nấm túi (Ascomycetes), nấm đảm (Basidiomycetes) và nấm bất toàn (Deuteromycetes). Trong số 75.000 loài nấm hiện biết thì có hơn 500 loài nấm men thuộc khoảng 50 giống. Nấm men có hình trứng, quả dưa chuột đứng riêng lẻ hoặc tập hợp thành sợi dễ gẵy, kích thước tế bào từ 7 - 10μm.

Trên môi trường sống, có những loại nấm men sinh các sắc tố đặc trưng như đỏ, vàng… Nấm men sinh sản vô tính bằng đâm chồi hoặc phân chồi, giữa quá trình này có thể sinh sản hữu tính. Nấm men có 3 dạng chu trình sinh học:

- Chu trình đơn bội - lưỡng bội như loài Saccharomyces cerevisiae. - Chu trình ưu thế lưỡng bội như loài Saccharomycodes ludgyzii. - Chu trình ưu thế đơn bội như ở loài Schizosaccharomyces

octosporus. Nhờ kính hiển vi điện tử khoa học đã thấy có sự khác nhau về thời

gian hình thành thoi vô sắc trong sinh sản vô tính ở nấm men phân đôi và nấm men đâm chồi.

44

Nấm men nhân đôi thì trong chu kỳ phân bào cũng có các giai đoạn G1, S, G2 và M như sinh vật nhân chuẩn. Trong khi màng nhân chưa được phát tán, các thoi vo sắc của mitose được hình thành trong nhân và thể nhiễm sắc được đưa về hai cực, sau đó mới hình thành vách ngăn tạo thành hai tế bào riêng.

Ở nấm men đâm chồi có các pha G1 và S bình thường, nhưng thoi vô sắc ở đây được hình thành rất sớm ngay cuối pha S làm cho pha G2 không bình thường (ngắn lại) và trong khi chưa hình thành hai nhân thành tế bào đã bắt đầu gấp lại.

Cơ chế tách các thể nhiễm sắc ở phân bào có tơ của nấm men là nhờ các thoi vô sắc mà các thể nhiễm sắc trượt về hai đầu được diễn ra trong nhân. Trong khi ở phân bào vô tơ của các vi khuẩn, các thể nhiễm sắc con được hình thành vẫn đính lên màng sinh chất và chỉ được tách ra nhờ sự phát triển và phân vách của màng.

So sánh cấu tạo tế bào nấm men và tế bào vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhảy vọt từ cơ thể nhân sơ chuyển thành cơ thể nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hóa về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ…) ở cơ thể nhân chuẩn xuất hiện nhiều cơ quan tử không thấy ở các cơ thể nhân sơ như ty thể, lục lạp (ở cơ thể nhân chuẩn quang hợp)… Nghiên cứu các đặc điểm của cơ quan tử ta thấy rất nhiều điểm giống cơ thể nhân sơ như DNA mạch vòng (DNA nhân mạch thẳng), không có protein histone (thể nhiễm sắc trong nhân có histone), ribosome 70 S (trong tế bào là 80S) và phân bào trực phân trong khi tế bào phân bào gián phân.

Mặt khác, khoa học còn tìm thấy một ít loài động vật nguyên sinh như Microsporidia và Giardia là những đơn bào nhân chuẩn kị khí còn lại cho đến nay, không có ty thể, những cơ thể này đại diện cho một nhánh tiến hóa tiêu giảm không ty thể của các cơ thể nhân chuẩn, kị khí so với nhánh tiến hóa phát triển của các cơ thể nhân chuẩn hiếu khí.

Con đường tiến hóa hình thành ty thể trong các cơ thể nhân chuẩn hiếu khí được thúc đẩy nhanh hơn khi hàm lượng oxy trong khí quyển tăng lên. Người ta cho rằng một con đường tiến hóa để hình thành ty thể trong tế bào nhân chuẩn là do sự tiếp xúc của các vi khuẩn nội cộng sinh (endosymbiotic bacteria), những tế bào nhân chuẩn mang trong mình vi khuẩn hiếu khí nội cộng sinh, sau những thời kỳ nội cộng sinh kéo dài, có sự chuyển gen từ vi khuẩn vào nhân và chỉ còn lại một số gen tự trị trong ty thể, đó là tế bào nhân chuẩn hiếu khí mang ty thể như ngày nay.

Ngoài những cấu tạo đặc biệt của nấm men so với vi khuẩn, thành tế bào của nấm cũng là một nét rất đặc trưng. Thành tế bào nấm có đến 80%

45

là polysaccharide mang tính kháng nguyên, trong đó các hợp chất mannan, glucan và chitine là rất quan trọng, phần còn lại là protein có thể đến 10 - 20%, trong đó gần một nữa là mannoprotein, chúng tạo thành 3 lớp của thành tế bào nấm men.

Các polymer của thành tế bào có thay đổi chút ít phụ thuộc vào từng nhóm nấm.

Bảng 2.5: Bảng phân nhóm đơn giản các nấm men

Lớp (Classes)

Bộ Họ Họ phụ Giống

Nấm

túi (

Asco

myc

etes

)

Endo

myc

etal

es

Saccharomycetaceae Spermophthoraceae

Schizosaccharum vcetoideae Nadsonioideae Lipomycetoideae Saccharomycetoi-deae

Schizosaccharo-myces Hanseniaspora Lipomyces Debaryomyces Hansenula Kluyveromyces Pichia Sacharomyces Coccidiascus

N (ấm

đả

m

Basi

diom

y-ce

tes)

Ustilagi-nales Tremell-ales

Filobasidiaceae Leuvures Sirobasidiaceae Tremellaceae

Filobasidium Leucospiridium Sirobasidium Tremalla

Nấm

bấ

t to

àn

(Deu

tero

my-

cete

s)

Blas

tom

ycet

ales

Cryptococcaceae Sporobolomycetaceae

Cryptococcoideae Rhodotoruloideae Trichospororoideae

Brettanomyces Candida Cryptococcus Torulopsis Rhodotorula Trichosporon Sporobolomyces

Nấm men chiếm một vị trí đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm: làm nở bột mì, nấu rượu, làm rượu vang, làm pho mát, sản xuất sinh khối để chế protein (trong nấm men có thể chứa đến 40% đạm của trọng lượng khô). Riêng sản xuất bánh mỳ hằng năm thế giới đã tiêu thụ 1,7 triệu tấn nấm men bánh mỳ.

46

1.2. Nấm mốc Nấm mốc là loại nấm sợi điển hình. Cũng như nấm men, nấm sợi là

những cơ thể dị dưỡng, một số sống cộng sinh với thực vật, khi cộng sinh với tảo đơn bào hoặc tập hợp đơn bào thì hình thành địa y (Lichens).

Một số nấm ký sinh trên động vật và thực vật gây nên các bệnh nấm rất khó chữa. Nhiều nấm sống hoại sinh sử dụng rác thải hữu cơ động vật và thực vật hoặc phá hoại thức ăn, vật dụng hằng ngày. Chúng thường có những enzyme phân giải rất mạnh như hệ enzyme phân giải cellulose, phân giải pectin, các enzyme amylase, protease, lipase… Con người từ lâu đã biết sử dụng mặt có lợi của nấm mốc trong việc chế tương, nước chấm, sản xuất kháng sinh, tạo các enzyme…

Bảng 2.6: Bảng phân loại đơn giản một số giống nấm mốc

Ngành Ngành phụ Lớp Bộ Giống

Zygomycotina (Zygomycetes)

Zygomycetes Mucorales Mucor Rhizopus

Ascomycotina Plectomycetes Pyenomycetes Hemiascomycetes

Eurotiales Spahaeriales Endomycetales (nấm men)

Emericella (A. nidulans) Neurospora (N. grassa) Eremothecium

Basidiomycotina (Basidiomycetes)

Hemibasidiomycetes Urenidales Ustilaginales

Puccinia Ustilago Candida Geotrichum

Amastigo-mycota

Deuteromycotina (Deuteromycetes)

Hyphomycetes (dạng nấm men = Blastomycetes) Hyphomycetes

Moniliales

Aspergillus (A. flavus, A. niger) Penicillium P. votatum, P. camenbertii, P. roquefortii)

Sợi nấm có thể có vách ngăn như các lớp nấm bậc cao (Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes) hoặc hình ống trong đó sợi có nhiều nhân mà người ta gọi là sợi cộng bào (coenocytis). Những loài nấm sợi không vách ngăn thuộc về các nấm bậc thấp như Oomycetes

47

và Zygomycetes. Các vách ngăn không ngăn cách hoàn toàn giữa các tế bào của sợi mà chúng thường liên hệ với nhau qua lỗ vách. Một bào tử khi rơi vào môi trường thuận lợi sẽ nảy mầm và tạo thành khuẩn lạc gồm hệ sợi phát triển sâu vào cơ chất để hút thức ăn (sợi cơ chất - SM), sợi cơ chất tạo thành khung của khuẩn lạc và sợi khí sinh mang các cuống bào tử (sợi khí sinh - AM)

Các nấm bậc thấp có thể sinh ra các động bào tử một roi (chytridiomycetes) hoặc hai roi (Oomycetes) trong chu trình sinh sản của mình. Các nấm bậc cao như loài Aspergillus và Penicillium có thể hình thành cầu tiếp hợp giữa hai tế bào của hai sợi (+ và -), đó là hiện tượng sinh sản cận tính.

Các cuống mang bào tử phát triển từ một loại sợi khí sinh, có thể phân nhánh hoặc không, trên đầu cuống bào tử có thể hình thành túi mang bào tử (Mucor, Rhizopus) với các bào tử túi sinh sản vô tính hoặc trên đầu cuống bào tử bằng phương pháp đâm chồi mà sinh ra các bào tử đính (conidie hay conidiospore), các cuống sinh bào tử có thể tập hợp lại thành thừng hay khoang đính bào tử (pycnide). Đôi khi các bào tử được hình thành bằng cách phân đốt của sợi (Geo trichum) mà người ta gọi là bào tử đốt (athrospore).

Các bào tử hữu tính được hình thành nhờ quá trình hữu tính kết hợp các tế bào đực và cái (các giao tử) hoặc các sợi khác giới tính, hoặc do sự hợp nhất hai nhân trong sợi cộng bào (coenocytis) để hình thành hợp tử, sau đó nhờ giảm nhiễm mà hình thành các túi bào tử với các bào tử túi.

Ở các nấm đảm (Basidiomycetes) quá trình hình thành đảm và các bào tử đảm là giai đoạn cuối cùng, quả thể nhìn thấy được bằng mắt thường, trong khi phần lớn chu trình phát triển ở dạng sợi mốc. Ở các loài nấm đảm quá trình hợp nhân xảy ra muộn hơn so với quá trình hợp chất nguyên sinh. Giai đoạn sợi lưỡng nhân (một tế bào có 2 nhân) tồn tại khá lâu, chỉ ở giai đoạn hình thành đảm mới có tế bào có nhân là 2n.

* Tổng quát về nấm: Bảng 2.7: Các lớp nấm thường gặp

Lớp nấm Loại sợi Bào tử vô tính Bào tử hữu tính

Nới sống chính

Ví dụ

Oomycetes không có vách ngăn (coenocytic)

bào tử chuyển động Oospora thủy sinh, nhiều loài gây bệnh cho cá, mốc sương khoai tây

Allomyces

Zygomycetes coenocytic bào tử túi, đôi khi bào tử đính (conidia)

Zygospora (bào tử tiếp hợp)

đất, phân giải chất hữu cơ thực vật

Mucor, Rhizopus

48

Ascomycetes có vách ngăn, một số đơn bào

đính bào tử (đâm chồi) bào tử túi (ascospore)

đất, phân giải chất hữu cơ thực vật

Neurospora, Saccharo-myces, Morchella

Basidiomycetes có vách ngăn, một số đơn bào

Uredospora, conidia (đâm chồi)

bào tử đảm (basidio-spore)

đất, phân giải chất hữu cơ thực vật

Agaricus, Amanita

Deuteromycetes có vách ngăn, một số đơn bào

bào tử đính, bào tử đốt (arthrospora)

chưa thấy đất, thực vật và trên cơ thể động vật

Candida, Trychophyton, Epidermo-phyton

Bảng 2.8: Các kiểu bào tử nấm

Ví dụ giống nấm Kiểu bào tử Tính chất Saprolegnia Bào tử vô tính (động bào

tử) Zoospores) Bào tử đơn, có roi, chuyên động

Aspergillus, Penicillium

Đính bào tử (Conidiospore) Bào tử đơn hoặc tập hợp thành chuỗi được hình thành trên cuống bào tử (Conidiospore)

Mucor, Rhizopus Bào tử túi vô tính (Sporangiospores)

Bào tử được hình thành trong túi (bào tử vô tính)

Coccidioides Bào tử đốt (Arthrospores) Bào tử được hình thành bằng cách chia đốt các sợi khí sinh

Candida Bào tử dây (Chlamydospore), bào tử mầm (Blastospore)

Thành dày, bào tử đơn, được hình thành bằng phân đôi hay chồi giống nấm men

Saccharomyces, Neurospora

Bào tử túi Được hình thành trong túi (bào tử hữu tính), thường 4 - 8 bào tử trong một túi

Agaricus Bào tử đảm (Basidiospores)

Phát triển ở tận cùng của đảm (thường 4 bào tử)

Rhizopus Bào tử tiếp hợp (Zygospores)

Bào tử lớn được hình thành trong một thành dày (bào tử hữu tính)

Saprolegnia Bào tử noãn (Oospore) Bào tử phát triển trong Oogonium (nguyên bào trứng)

Các loài nấm đảm ăn được như các giống nấm mỡ (Agaricus bisporus), nấm rơm (Volvariella volvacea), mộc nhĩ (Auricularia), nấm hương (Lentinus), nhân nhĩ (Tremella)…đang trở thành đối tượng chủ yếu trong công nghệ nuôi trồng nấm ăn.

Phân loại nấm mốc chủ yếu dựa vào các tính trạng hình thái: cấu tạo sợi mang bào tử, cấu tạo bào tử và một số tính trạng sinh lý sinh hóa.

49

2. Vi tảo Vi tảo là tảo hiển vi có sắc tố quang hợp. Vi tảo đơn giản nhất là cơ

thể đơn bào, hoặc tập hợp đơn bào, có thể có roi như Clamydomonas, Peridium và Euglena (tảo mắt), hoặc không có roi như Chlorella (tảo lục), Diatomia (tảo cát).

Các vi tảo thường gặp hơn là các cơ thể đa bào hoặc tập hợp đơn bào, như các tập đoàn Volvox, Pediastrum, Scenendesmus (thuộc nhóm Archethalle) hoặc phức tạp hơn có bộ phận đính bám và bộ phận dựng đứng như các sợi mảnh phân nhánh hoặc không (có thể có vách ngăn tạo thành các tế bào tương đối độc lập hoặc không có vách ngăn như một ống cộng bào (coenocytic).

Những tảo này sinh sản bằng cách phân chia những tế bào lạ ở giữa hoặc bằng cách rụng tế bào ở đầu cùng (Sphacelaria, Ectocarpus…), chúng sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp đẳng giao (hai giao tử bằng nhau) hoặc dị giao (hai giao tử khác nhau).

Các sắc tố quang hợp và hỗ trợ ở các nhóm tảo khác nhau thì khác nhau, hiện nay người ta đã biết 6 nhóm tảo với các sắc tố đã được nghiên cứu tương đối kỹ. Bốn giống tảo lục là Clamydomonas (đơn bào 2 roi), Gonium (tập hợp đơn bào 2 roi), Pandorina (tập hợp đơn bào, phía ngoài còn có 2 roi, phía trong mất roi) và Volvox (tập hợp đơn bào, phía ngoài có 2 roi làm chức năng di động cho cả tập đoàn, phía trong tế bào mất roi làm chức năng quang hợp, hô hấp) là một ví dụ rõ nét chứng minh sự tiến hóa từ tổ chức đơn bào lên tổ chức đa bào phân hóa thô sơ.

Bảng 2.9: Sắc tố và một số tính chất của các nhóm tảo khác nhau Ngành

tảo Diệp lục

Carote-noid

Oxycaroten Một số tính chất

Chl

orop

hyta

(tảo

lục)

a và

b

α v

à một

ít

β

Lutein, Zeaxanthine, Neoxanthine, Violaxanthine

Tế bào 2 roi, sinh sản vo tính bằng chia đôi hoặc sinh sản hữu tính, chất dự trữ là tinh bột, thành tế bào chủ yếu là cellulose

Eugl

enop

hyt

a (tả

o mắt

)

a và

b

β

Astaxanthine, Neoxanthine

Đơn bào có 1 roi (một số có 2 - 3 roi), sinh sản vô tính bằng chia đôi hoặc hữu tính, chất dự trữ là mỡ và loại tinh bột paramylon, không có thành tế bào

Chr

ysop

hyta

(tả

o và

ng,

tảo

silic

)

a và

c

β

Lutein, Fucoxanthine, Diadinoxanthine, Diatoxanthine

Phần lớp là đơn bào, một số nhỏ dạng sợi có 1 - 2 roi, sinh sản vô tính hoặc hữu tính, chất dự trữ là dầu và lecucosin với silic, thành tế bào thấm pectin, silica

50

Pyro

phyt

a (Tảo

lử

a,

tảo

giáp

)

a và

c

β

Dinoxanthine, Diadinoxanthine, Peridinine

Đơn bào 2 roi ở bên, sinh sản vô tính bằng phân đôi, chất dự trữ là tinh bột, thành tế bào là cellulosse

Phae

ophy

ta (

tảo

nâu)

a và

c

β

Tucoxanthine, Lutein, Diatoxanthine, Xanthophylls

Đa bào, kích thước lớn, hai roi khác biệt ở bên, sinh sản vô tính bằng động bào tử, sinh sản hữu tính bằng giao tử chuyển động, chất dự trữ là Laminarian, thành tế bào có cellulosse và acid alginic

Rhod

ophy

ta

(tảo đỏ

) a và

d

α v

à β

Phycocyanine, Phycoerythrine, Neoxanthine, Lutein, Zeaxanthine, Violaxanthine

Hầu hết đa bào, kích thước lớn, bất động, sinh sản vô tính bằng bào tử, sinh sản hữu tính bằng giao tử, chất dự trữ là tinh bột, thành sinh chất chủ yếu là cellulosse

3. Động vật đơn bào Toàn bộ động vật được chia làm hai mức độ tổ chức: động vật đơn

bào (Protozoa) và động vật đa bào (Metazoa) (theo phân giới truyền thống thì đó là hai giới phụ). Động vật đơn bào (đôi khi người ta gộp vào nhóm này cả những động vật hiển vi dạng sợi nhiều nhân) là những cơ thể đơn bào nhân chuẩn, thường dinh dưỡng hữu cơ, một số nhỏ quang dưỡng. Những động vật đơn bào đầu tiên đã được Leeuwenhoek A.V phát hiện ra ngay từ thế kỷ XVII nhưng được nghiên cứu vào thế kỷ XVIII bởi Joblot L. và nhiều tác giả khác.

Theo hệ thống phân loại hiên nay thì động vật dơn bào được chia làm 4 nhóm:

1. Sarcomastigophora với các nhánh Sarcodina hay Rhizopodes (Rhizopodes và Actinopodes), nhánh Mastigophora hay Flagelles, nhánh Opalinata (cũng có tài liệu hợp nhất Rhizopodes và Flagelles vào dạng Rhizoflagelles).

2. Sporzoa (ký sinh trên động vật, một hoặc nhiều vật chủ). 3. Cnidospora (ký sinh trên động vật có xương và không xương). 4. Ciliophora hay cilie (roi ngắn - cils, có hai loại nhân: nhân to và

nhân bé). Với hơn 30.000 loài được mô tả, động vật đơn bào sống ở đất và

nước, nhiều động vật đơn bào có vai trò quan trọng ở các lớp bùn hoạt tính tại các trạm lọc nước thải.

51

Bảng 2.10: Một số nhóm động vật đơn bào và tính chất của chúng Nhóm Một số tính chất Nơi sống Ví dụ Mastigophora Một hoặc nhiều roi

(flagella), tế bào có thể chia dọc.

Nước ngọt, ký sinh trên động vật

Trypanosoma, Giardia, Leishmania

Sarcodina Dạng amip, giả túc, không roi, chia đôi.

Nước ngọt và mặn, ký sinh trên động vật

Amoeba, Entamoeba

Sporozoa Thường bất động, một số có thể trườn, bò, chia đôi, ký sinh động vật, sâu bọ.

Ký sinh sơ cấp trên động vật chân đốt, tác nhân truyền bệnh ký sinh

Plasmodium (gây bệnh sốt rét cơn Malaria), Toxoplasma

Ciliophora Nhiều roi ngắn (tiêm mao-cilia), chia đôi ngang, mỗi tế bào thường có 2 nhân, nhân lớn và nhân bé làm chức năng khác nhau.

Nước ngọt và mặn, ký sinh trên động vật, trong dạ con của động vật nhai lại

Paramecium, Balantidium

Cnidophora Hình thành chuỗi bào tử nhờ sợi phình ra và cắt khúc.

Ký sinh trên động vật có xương và không xương.

Nosema gây bệnh tầm gai (Pebrina)

Sau đây là so sánh một số tính chất của các nhóm vi sinh vật Bảng 2.11: So sánh một số tính chất của các nhóm vi sinh vật

Tính chất Vi khuẩn Nấm Tảo Động vật đơn bào

Ghi chú

Loại tế bào

nhân sơ nhân chuẩn nhân chuẩn nhân chuẩn

Kiểu dinh dưỡng

hóa dị dưỡng (một số quang dưỡng)

hóa dị dưỡng hữu cơ

quang tự dưỡng

hóa dị dưỡng hữu cơ

tính chất số đông

Đa bào, đơn bào

đơn bào đa bào (trừ nấm men)

một số đơn bào và một số đa bào

đơn bào

Cách sắp xếp tế bào

riêng lẻ, một số hình thành tập hợp

đơn bào, sợi không vách ngăn và sợi có vách ngăn

đơn bào, tập hợp sợi và bắt đầu hình thành mô

riêng lẻ, tập hợp

Phương pháp thu nhận thức ăn

hấp thụ

hấp thụ

quang hợp, hấp thụ

hấp thụ, thực bào

tính chất số đông

Tính chất đặc trưng

phân bào vô tơ (trực phân)

bào tử hữu tính và vô tính

sắc tố quang hợp và sắc tố hỗ trợ

chuyển động

Thành tế bào

Murein Hemicellulose và chitine

cellulose không có hoặc lipoproteid

pH tối ưu 6,5 - 7,5 3,8 - 5,6 gần trung trung tính tính chất

52

tính số đông Nhu cầu O2

kị khí đến hiếu khí

hiếu khí hiếu khí hiếu khí tính chất số đông

Chất dự trữ chính

các loại poly-saccharide

glucogen tinh bột glucogen và nhiều loại poly-saccharide

Số loài hiện biết

4000 80.000 (tất cả giới nấm)

15.000 (chỉ tính tảo đơn bào)

30.000 (chỉ tính động vật đơn bào)

Câu hỏi ôn tập chương 2 1. Vẽ sơ đồ cấu tạo tế bào vi khuẩn, trong đó ghi rõ các cấu tạo bắt buộc

phải có và cấu tạo không thường xuyên phụ thuộc vào nhóm vi khuẩn. 2. So sánh cấu tạo thành tế bào vi khuẩn và vi sinh vật cổ. Nói rõ vai trò

của thành trong hoạt động sống và trong phương pháp nhuộm Gram. 3. Vẽ sơ đồ cấu tạo màng sinh chất của vi khuẩn, nói rõ chức năng vận

chuyển các chất qua màng. 4. Bản chất của các vật thể ẩn nhập, cấu tạo của chúng và khả năng

nhuộm màu. 5. Chất nhân của vi khuẩn, những phát hiện mới trong vấn đề genophore

của cơ thể nhân sơ. 6. Plasmid ở cơ thể nhân sơ, vai trò và chức năng. 7. Màng nhầy và tiên mao, cấu tạo và chức năng các loại. 8. Nội bào tử, cấu tạo và nhuộm màu. 9. Nêu một số ví dụ vi khuẩn sinh bào tử và không sinh bào tử, ứng dụng

của chúng trong công nghệ vi sinh. 10. Vẽ sơ đồ cấu tạo tế bào nấm men. 11. Cấu tạo thành tế bào nấm. 12. Các chu trình sinh học của nấm men, đại diện nấm mốc. 13. Nguyên tắc và phương pháp phân loại vi sinh vật. 14. Định nghĩa và cho ví dụ các khái niệm sau: bào tử vô tính, bào tử

hữu tính, nội bào tử, bào tử đính, bào tử túi, bào tử đảm, sợi nấm có vách ngăn, sợi cộng bào, sợi hai nhân.

15. Nêu một số nấm có lợi và gây hại. 16. Các nhóm tảo, cấu tạo tế bào và thành tế bào. 17. Động vật đơn bào, cấu tạo đặc trưng khác với vi khuẩn. 18. So sánh tổng quát sự khác biệt của vi khuẩn, nấm, tảo đơn bào và động vật đơn bào.

53

Chương 3

Các khái niệm cơ bản về virus Virus là các tác nhân rất nhỏ có thể gây bệnh ở mọi cơ thể sống. Do cấu tạo rất đơn giản nên muốn nhân lên chúng bắt buộc phải ký sinh trong tế bào và nhờ bộ máy tổng hợp của tế bào.

I. Đặc điểm của virus Kích thước nhỏ. Virus có kích thước rất nhỏ từ 10nm đến 300nm

trong khi kích thước của vi khuẩn khoảng 1000nm và kích thước của hồng cầu là 7500nm. Vì vậy virus chỉ có thể quan sát được trên kính hiển vi điện tử.

Hình 3.1: Hình thái của một số virus 1.Đối xứng đa diện: [A] polio-, wart-, adeno-, rota-; [B] herpet. 2.Đối xứng xoắn: [C] khảm thuốc lá; [D] cúm;[E] sởi, quai bị, parainfluenza; [F] dại; 3.Đối xứng hỗn hợp:[G] poxvirus; [H] phage T chẵn • Genome virus chỉ chứa một loại acid nucleic, có thể là DNA hoặc

RNA, có thể ở dạng thẳng hoặc khép kín, chuỗi đơn hoặc chuỗi kép. Genome phân đoạn hoặc không phân đoạn.

Là dạng sống không có hoạt tính trao đổi chất. Virus không có ribosome hoạt động hoặc không có bộ máy tổng hợp protein. Cho nên mặc dù một số virus có enzyme riêng cuả mình nhưng virus chỉ có thể nhân lên

54

trong tế bào sống, điều khiển bộ máy tổng hợp của tế bào phục vụ cho mình để tạo thành các hạt virus mới.

II. Cấu trúc virus Virus có cấu tạo rất đơn giản, bao gồm lõi là acid nucleic, tức

genome nằm ở phía trong còn phía ngoài được bao bọc bởi vỏ protein, vỏ protein bảo vệ genome khỏi sự tác động của các yếu tố môi trường ví dụ như nuclease trong máu.

Vỏ protein được gọi là capsid. Capsid được cấu tạo bởi các đơn vị hình thái là capsome. Capsome lại được cấu tạo bởi các đơn vị cấu trúc là protome. Protome có thể là monome (chỉ có một phân tử protein) hoặc polyme (nhiều phân tử protein). Capsid và acid nucleic được gọi là nucleocapsid.

Hình 3.2. Cấu trúc cơ bản của virion Lõi là acid nucleic, vỏ là capsome là protein, hợp lại thành nucleocapsid.

Nucleocapsid được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài (lipoprotein) với các gai.

A.Sơ đồ virus đa diện đơn giản nhất, mỗi mặt hình đa diện là tam giác đều. Đỉnh do 5 cạnh hợp thành. Mỗi cạnh chứa 3 capsomer

B. Sơ đồ của virus hình que với cấu trúc đối xứng xoắn (virus khảm thuốc lá). Capsomer sắp xếp xoắn xung quanh sợi acid nucleic dạng xoắn ốc.

55

Một số virus còn chứa vỏ ngoài, bao bọc bên ngoài capsid. Vỏ ngoài có bản chất là lipoprotein chứa kháng nguyên của virus. Vỏ ngoài một phần bắt nguồn từ màng sinh chất của tế bào chủ khi virus chui ra ngoài theo lối nảy chồi. ở một số virus, vỏ ngoài có nguồn gốc từ màng nhân của tế bào. Hạt virus nguyên vẹn còn được gọi là virion.

Virus có 3 kiểu cấu trúc

• Cấu trúc hình khối. Capsid có cấu trúc hình khối 20 mặt tam giác đều.

• Cấu trúc xoắn. Nucleocapsid dạng kéo dài. Các capsome sắp xếp xung quanh theo chiều xoắn của acid nucleic. Đa số virus có cấu trúc xoắn có vỏ ngoài bao bọc nucleocapsid xoắn.

• Cấu trúc phức tạp. Cấu trúc hỗn hợp vùa dạng khối vừa dạng xoắn. Ví dụ phage có đầu dạng khối, đuôi dạng xoắn trông như con nòng nọc.

III. Nuôi cấy virus Do virus chỉ sinh sản bên trong tế bào sống nên phải có các phương

pháp đặc biệt để nuôi cấy chúng. Có 3 hệ thống chính dùng để nuôi cấy virus trong phòng thí nghiệm.

• Nuôi cấy mô tế bào. Các tế bào có nguồn gốc từ các mô của người hay động vật đươc nuôi trong bình chứa môi trường nhân tạo, cho phát triển và dùng làm nguồn nguyên liệu để cấy virus.

• Phôi gà. Một số virus có thể nhân lên trong tế bào phôi gà 6- 13 ngày. Ngày nay phương pháp nuôi này đã được thay thế bởi tế bào nuôi cấy mô. Tuy nhiên trong sản xuất một số loại vaccine, phương pháp này vẫn được sử dụng.

• Động vật thực nghiệm. Trước đây phương pháp này được dùng phổ biến để phân lập và nghiên cứu virus. Các động vật được sử dụng là chuột, thỏ, khỉ, chồn...Tiêm hỗn dịch nghi là có virus vào động vật và quan sát bệnh cảnh lâm sàng. Hiện nay phương pháp này vẫn được dùng để phân lập một số virus.

IV. Ảnh hưởng của virus lên tế bào

Virus có thể tác động lên tế bào theo 4 cách sau:

• Gây chết tế bào. Kết quả của việc nhiễm virus là làm cho tế bào bị huỷ hoại, dẫn đến làm chết tế bào (CPE- Cytopathic effect).

56

• Chuyển dạng. Tế bào bị nhiễm virus nhưng không chết mà chuyển từ trạng thái bình thường sang trạng thái đặc biệt, thành các tế bào u hoặc ung thư.

• Nhiễm tiềm tàng. Virus tồn tại bên trong tế bào ở trạng thái hoạt động tiềm ẩn nhưng không ảnh hưởng rõ rệt đến chức năng của tế bào.

• Gây ngưng kết hồng cầu. Một số virus trên bề mặt vỏ ngoài có chứa protein gây ngưng kết hồng cầu (Haemaglutinin) gắn trên bề mặt các tế bào nhiễm. Khi thêm hồng cầu vào thì hồng cầu sẽ bị kết dính bởi các tế bào nhiễm.

V. Phân loại virus Virus được phân loại dựa theo đặc điểm hình thái, bản chất của

genome (DNA hay RNA), có hay không có vỏ ngoài, vị trí lắp ráp...

Uỷ ban quốc tế phân loại virus quy định: Họ virus có tiếp vị ngữ là -viridae, họ phụ – virinae và chi- virus. Sau đây là một số virus gây bệnh.

Bảng 3.1. Virus gây bệnh chứa genome DNA

Nhóm virus Tên virus Tên bệnh Pox Variola

Molluscum (u mềm) Đậu mùa u mềm lây

Herpes Herpes simplex Varicella zoster Cytomegalo EB ( Epstein- Barr), HH6

Herpes Thuỷ đậu zona (shingles) Nhiễm trong thoả hiệp miễn dịch Bệnh bạch cầu đơn nhân lây nhiễm Bệnh ngoại ban đột ngột

Adeno Virus adeno Viêm họng Viêm kết mạc

Hepadna Viêm gan B Viêm gan Papova Papiloma

Virus JC Mụn cóc Viêm chất trắng não nhiều ổ tiến

triển Parvo B19 Ban đỏ truyền nhiễm, cơn bất sản

57

Bảng 3.2. Virus gây bệnh chứa genome RNA Nhóm virus

Tên virus Tên bệnh

Orthomyxo Virus cúm Cúm Paramyxo Á cúm;Hợp bào hô hấp

Sởi Quai bị

Viêm nhiễm đường hô hấp Sởi Quai bị

Corona Virus corona Gây nhiễm đường hô hấp SARS

Rhabdo Virus dại Bệnh dại Picorna Entero

Rhino Viêm gan A

Viêm não, bại liệt Cảm lạnh Viêm gan

Calici SRSV (virus có cấu trúc dạng tròn nhỏ- small round structure virus)

Viêm dạ dày, ruột

Toga Alpha (virus arbo nhóm A) Rubi

Viêm não Sốt xuất huyết Rubeon (sởi Đức)

Flavi Flavi (virus arbo nhóm B) Viêm gan C

Viêm não Sốt xuất huyết Viêm gan

Bunya Một số virus arbo Viêm não Sốt xuất huyết Sốt, viêm thận

Reo Rota Bệnh đường tiêu hoá Arena Viêm màng não đám rối màng

mạch lympho bào Virus Machupo Virus Junin Virus lassa

Viêm màng não Sốt xuất huyết

Retro HTLV-I, II HIV- 1, 2

Ung thư tế bào T U lympho Liệt AIDS

Filo Virus Marburg Virus E bola

Sốt Marburg Sốt xuất huyết Ebola

VI. Ảnh hưởng của tác nhân vật lý, hoá học đến virus - Nhiệt độ cao: Đa số virus bị bất hoạt ở 560C trong vòng 30 phút,

hoặc ở 1000C trong vài giây.

58

- Nhịêt độ thấp: Đa số virus bền ở nhịêt độ lạnh nên có thể bảo quản lâu ở – 700C. Một số virus bị bất hoạt trong quá trình làm đông lạnh hoặc tan băng.

- Khô hạn: Khả năng chịu khô hạn của virus khác nhau tuỳ loài. Một số sống sót, một số bị bất hoạt nhanh ở điều kiện khô hạn

- Bức xạ tử ngoại: Virus bị bất hoạt bởi tia tử ngoại

- Chlorofoc, ete và các dung môi khác: Các virus có vỏ ngoài chứa lipid sẽ bị bất hoạt, còn không chứa lipid sẽ bền vững.

- Các chất oxi hóa và chất khử. Virus bị bất hoạt bởi dưới tác dụng của formaldehyt, clo, iot và H2O2.

β- propiolacton và formaldehyd là các hoá chất được dùng để bất hoạt virus trong sản xuất vaccine, song đa số virus không bị bất hoạt bởi phenol.

- Chất khử trùng virus: Tốt nhất là dùng dung dịch hypoclorua (một chất ăn mòn) và glutaraldehyt (là chất có thể gây mẫn cảm và kích thích gây khó chịu chảy nước mắt cho người dùng).

VII. Các bệnh do virus Virus là tác nhân gây bệnh quan trọng cho người, động vật, cây

trồng và vi sinh vật. Đa số các bệnh thường gặp ở người là do virus. Hầu hết chúng gây bệnh ở thể nhẹ, bệnh nhân tự bình phục sau một thời gian nhất định. Nhiều loại tồn tại thầm lặng trong cơ thể. Chúng nhân lên nhưng không gây bất kỳ triệu chứng nào. Tuy nhiên việc nhiễm virus thường ở thể nhẹ, nhưng đôi khi có thể gây bệnh trầm trọng ở những người mẫn cảm bất thường. Một số do virus gây bệnh rất nặng và thường có tỷ lệ tử vong cao.

VIII. Con đường lây nhiễm của virus vào cơ thể Virus vào cơ thể theo 4 con đường chính:

- Hít thở: Qua đường hô hấp

- Ăn uống: Qua đường tiêu hoá (dạ dày- ruột)

- Xâm nhập qua da, vết xước niêm mạc (qua quan hệ tình dục), truyền máu, tiêm chích, phẫu thuật cấy ghép hay do côn trùng hoặc động vật cắn.

- Bẩm sinh: Do mẹ truyền qua nhau thai sang con

59

IX. Sự xâm nhập Cơ chế gây bệnh chủ yếu của virus là sự xâm nhập. Bệnh sinh ra

do virus lan truyền trực tiếp tới các mô và cơ quan trong cơ thể. Sự sinh sản của virus trong tế bào sẽ giết chết tế bào (tuy nhiên có trường hợp không giết tế bào). Tác động gây huỷ hoại tế bào được gọi là CPE (cytopathic effect) sẽ dẫn đến tổn thương và huỷ hoại chức năng của các mô và cơ quan, rồi từ đó biểu hiện ra các dấu hiệu, triệu chứng.

X. Các quá trình nhân lên của virus Virus không có hoạt tính trao đổi chất mà sử dụng bộ máy trao đổi

chất của tế bào để tổng hợp các thành phần thiết yếu của mình, sau đó lắp ráp tạo ra các hạt virus con giống như nguyên bản. Vì vậy người ta thường sử dụng thuật ngữ nhân lên (nhân bản) của virus thay cho từ sinh sản.

Sự nhân lên của virus có thể làm tan tế bào gọi là chu trình sinh tan hoặc có thể gắn genome của mình vào nhiễm sắc thể của tế bào, tồn tại lâu dài dưới dạng tiềm ẩn mà không là chết tế bào gọi là chu trình tiềm tan.

Quá trình nhân lên của virus diễn ra theo 7 giai đoạn

1. Hấp phụ a. Gắn thụ thể đặc hiệu của mình lên thụ thể nằm trên màng sinh

chất của tế bào. Vì có tính đặc hiệu cao nên chỉ có virus nhất định mới gắn lên được các tế bào nhất định.

b. Sự hấp phụ được tăng cường khi có mặt của ion Mg2+ hoặc Ca2+

2. Xâm nhập a. Thông thường virus xâm nhập vào tế bào theo cơ chế ẩm bào.

- Virus không có vỏ ngoài : Màng tế bào lõm vào bao lấy virus tạo không bào tạm thời. Tiếp đó không bào dung hợp cùng với mạng lưới nội chất để giải phóng nucleocapsid.

- Virus có vỏ ngoài: Vỏ ngoài của virus dung hợp với màng sinh chất rồi đẩy nucleocapsid vào trong mà không tạo không bào. Vỏ ngoài virus hoà với màng sinh chất mà không chui vào tế bào chất .

- Màng tế bào lõm vào bao lấy virus cùng vỏ ngoài, tạo không bào. Sau đó màng không bào (có nguồn gốc từ màng tế bào) dung hợp với vỏ ngoài của virus rồi đẩy nucleocapsid vào tế bào chất.

60

Hình 3.3: Các phương thức xâm nhập của virus vào tế bào

1-Virus có vỏ ngoài: a) Dung hợp với màng sinh chất, đẩy nucleocapsid vào tế bào. Vỏ ngoài virus nằm trên màng sinh chất (ví dụ virus paramyxo, herpes). b) Xâm nhập theo lối ẩm bào, tạo không bào. Dung hợp với màng lưới nội chất hoặc endosom tiêu hóa rồi giải phóng nucleocapsid (ví dụ virus cúm, toga và rabdo) 2.Virus không có vỏ ngoài. Xâm nhập theo lối ẩm bào, tạo không bào, dung hợp với endosom tiêu hóa, tiến hành cởi vỏ và giải phúng acid nucleic (ví dụ virus polio, adeno và reo).

3. Cởi vỏ Enzyme tiêu hoá của tế bào từ lysosome tiến hành phân giải vỏ

protein cuả virus để giải phóng acid nucleic hoặc genome vào tế bào chất.

4. Phiên mã - Tạo thành mRNA của virus hoặc phân tử dạng sao chép của genome

(RF- replicative form)

- Thực hiện nhờ enzyme của tế bào hoặc của virus

- Diễn ra theo cơ chế điều khiển phức tạp:

• Kiểu phiên mã trước và sau khi sao chép acid nucleic hoàn toàn khác nhau.

61

• Nhiều genome virus chứa promoter và enhancer có tác dụng kích thích quá trình phiên mã.

• Bản phiên mã đầu tiên thường được cắt nối (splicing) để loại bỏ các đoạn intron nằm xen giữa các exon.

• Phiên mã đôi khi xảy ra theo cơ chế chồng lớp. Trong cùng một gen có nhiều điểm khởi đầu và nhiều điểm kết thúc, nhờ đó tạo ra nhiều protein từ cùng một đoạn acid nucleic

- Về cơ bản mRNA của virus có những đặc điểm sau đây (nhưng cũng có thể khác):

• Chứa trình tự khởi đầu

• Có gắn mũ ở đầu 5’

• Ở đầu 3’ có gắn đuôi polyA

5. Tổng hợp các thành phần của virus

5.1. Tổng hợp protein của virus

mRNA của virus được phiên mã trên ribosome của tế bào tạo ra 2 loại protein

- Protein cấu trúc là protein capsid, protein vỏ ngoài và protein trong lõi.

- Protein khôngcấu trúc là enzyme cần cho sao chép genome. Protein không cấu trúc tìm thấy trong hạt virus, trừ một số trường hợp đặc biệt ví dụ enzyme phiêm mã ngược có trong virus HIV hoặc virus viêm gan B chứa DNA polymerase, một số virus RNA chứa RNA polymerase

5.2.Tổng hợp acid nucleic của virus

- Genome của virus con được sao chép từ genome của virus mẹ. Trong trường hợp genome là mạch đơn thì khuôn là mạch bổ sung mới tạo thành của genome mẹ.

- Phần lớn quá trình sao chép được thực hiện nhờ polymerase (replicase) do virus mã hoá. Đối với một số virus DNA thì quá trình tổng hợp được thực hiện nhờ enzyme của tế bào.

6. Lắp ráp - Genome và protein mới được tạo thành lắp ráp với nhau tạo nên

hạt virus mới. Đa số trường hợp protein capsid lắp ráp tạo thành cấu trúc

62

rỗng gọi là tiền capsid (procapsid) sau đó do chuyển động Brao, acid nucleic chui vào cấu trúc này rồi hàn kín lại.

- Lắp ráp có thể xảy ra trong nhân tế bào, trong tế bào chất hoặc ngay sát màng sinh chất (đối với đa số virus có vỏ ngoài). Màng sinh chất bao lấy nucleocapsid tạo vỏ ngoài.

7. Giải phóng Virus có thể làm tan tế bào để chui ồ ạt ra ngoài hoặc đối với virus

có vỏ ngoài thì chui ra từ từ theo lối nảy chồi.

XI. Genome virus • Có thể là DNA hoặc RNA mà không bao giờ chứa cả hai.

• Có dạng chuỗi đơn hoặc chuỗi kép.

• Dạng thẳng hoặc khép kín (đóng vòng). Virus chứa genome DNA kép thường có kích thước lớn, virus chứa genome DNA đơn thường có kích thước nhỏ.

• Genome RNA kép tất cả đều phân đoạn (trong mỗi hạt virus có nhiều đoạn). Còn phần lớn genome RNA đơn không phân đoạn (trừ virus cúm và HIV).

• Genome RNA đơn có trình tự nucleotit giống trình tự của mRNA thì được quy ước là genome (+), còn ngược lại được gọi là genome (-).

• Genome của HepDNAaviridae (ví dụ virus viêm gan B) khi sao chép phải thông qua RNA trung gian (DNA – RNA- DNA).

Acid nucleic của virus có kích thước lớn.

• Có trọng lượng phân tử lớn.

• Mã hoá cho nhiều protein.

• Mã cho nhiều enzyme cần cho quá trình nhân lên.

Acid nucleic của virus có kích thước nhỏ.

• Có trọng lượng phân tử nhỏ.

• Do dó khả năng mã hoá tạo protein hạn chế.

• Nhiều trường hợp virus phải có gen chồng lớp.

• Để nhân lên phải dùng một số enzyme của tế bào.

63

Khả năng gây nhiễm.

• Đối với nhiều loại virus, acid nucleic chỉ có khả năng lây nhiễm khi đã được đưa vào trong tế bào. Ví dụ khi được giải phóng khỏi vỏ capsid, bản thân acid nucleic có thể tự thực hiện quá trình gây nhiễm tế bào, bắt đầu chu trình gây nhiễm hoàn chỉnh để nhân lên.

• Genome của các virus chứa RNA (-) không có khả năng gây nhiễm. Muốn nhân lên chúng phải phiên mã thành RNA (+).

XII. Protein của virus Tuỳ thuộc vào thời gian tạo thành mà protein của virus được chia

làm 3 loại

• Protein được tổng hợp ngay sau khi nhiễm được gọi là protein sớm tức protein không cấu trúc. Đây là enzyme cần cho sao chép acid nucleic .

• Protein được tổng hợp muộn hơn gọi là protein muộn, thường là protein cấu trúc tạo capsid, vỏ ngoài và protein lõi.

• Protein phân giải, thường là lyzozym giúp virus giải phóng ra khỏi tế bào.

Ba loại protein được điều hoà tổng hợp một cách hợp lý. Protein sớm là enzyme xúc tác nên chỉ cần một lượng nhỏ, còn protein cấu trúc thì phải tổng hợp một lượng lớn.

XIII. Các phương thức nhân lên của virus Quá trình nhân lên của virus trong tế bào hết sức phức tạp. Mỗi

nhóm virus có cách nhân lên riêng. Virus được chia làm 6 nhóm dựa vào genome và cách thức tổng hợp mRNA. Sau đây là vài nét đơn giản hoá quá trình nhân lên để nêu bật sự khác nhau giữa các nhóm.

Các virus có genome DNA

1. Nhóm 1. virus DNA kép Ví dụ virus vaccinia, herpes simplex, adeno, papiloma.

1.1. Dịch mã

Có 2 loại mRNA được tổng hợp .

• mRNA sớm: được tạo thành trước khi tổng hợp DNA virus, chủ yếu mã hoá cho các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp acid nucleic của virus,

64

• mRNA muộn: tạo thành sau khi tổng hợp DNA virus , chủ yếu mã hoá cho các protein cấu trúc như vỏ capsid, vỏ ngoài…

1.2. Tổng hợp DNA virus

- Các enzyme

Enzyme sao chép DNA chủ yếu là DNA polymerase phụ thuộc DNA.Các virus có kích thước lớn hơn (ví dụ vaccinia, herpes simplex) thì tự tổng hợp DNA polymerase riêng cho mình.Các virus có kích thước nhỏ (ví dụ adeno, papiloma) thì sử dụng DNA polymerase của tế bào

- Khuôn: DNA của virus con được tổng hợp trên khuôn genome DNA của virus mẹ.

- Vị trí tổng hợp: trong nhân tế bào (trừ virus pox).

- DNA mới tạo thành

• Dùng làm khuôn để tạo mRNA muộn cần cho tổng hợp protein muộn.

• Làm khuôn để tạo mạch tươngbù cần cho tổng hợp nhiều genome của virus mới.

1.3. Tổng hợp protein virus

Quá trình gồm 2 giai đoạn tuỳ thuộc vào sự tổng hợp mRNA.

- Tổng hợp protein sớm: Đây là các enzyme (DNA polymerase phụ thuộc DNA ) cần cho sao chép DNA.

- Tổng hợp protein muộn

• Diễn ra sau khi tổng hợp DNA

• Chủ yếu là các protein cấu trúc để tạo vỏ capsid và vỏ ngoài

• Vị trí tổng hợp : Protein được tổng hợp trên ribosome trong tế bào chất , sau đó được vận chuyển tới vị trí lắp ráp.

1.4. Lắp ráp

Quá trình lắp ráp genome với protein để tạo thành hạt virus mới xảy ra ở các vị trí khác nhau bên trong tế bào.

- Trong nhân tế bào: Ví dụ virus Herpes simplex, adeno, papiloma. Riêng virus herpes hình thành vỏ ngoài bằng cách nảy chồi qua màng nhân. Màng nhân trước đó đã được gắn glycoprotein do virus mã hoá tại

65

các vị trí đặc hiệu. Virus được bao bởi màng nhân khi ra khỏi nhân, sau đó kết hợp với mạng lưới nội chất sần hoặc bộ máy Golgi để ra khỏi tế bào.

- Trong tế bào chất: Ví dụ virus vaccinia nhân lên hoàn toàn trong tế bào chất tại các cụm ribosome.

1.5. Virus có genome DNA kép đặc biệt

Virus viêm gan B (HBV) có chu trình nhân lên đặc biệt và phức tạp. Genome gồm 2 mạch không bằng nhau. Mạch (-) dài, mạch (+) ngắn. Chứa enzyme DNA polymerase. Sau khi nhiễm, DNA được giải phóng vào nhân.

Phiên mã xảy ra trong nhân nhờ RNA polymerase của tế bào để tạo ra nhiều loại mRNA trong đó có RNA kích thước lớn được coi là tiền genome – một dạng trung gian để tạo genome. Các RNA đi ra tế bào chất để tổng hợp protein của virus như protein lõi và polymerase. Enzyme này có 3 hoạt tính ( DNA polymerase, enzyme phiên mã ngược và ribonuclease H). Tiếp đó RNA tiền genome liên kết với DNA polymerase và protein lõi để tạo ra hạt lõi (virus chưa hoàn chỉnh). Enzyme phiên mã ngược tiến hành chuyển RNA tiền genome thành mạch DNA (-), sau đó hầu hết RNA tiền genome bị phân huỷ nhờ ribonuclease H. Chỉ một đoạn RNA được giữ lại dùng làm mồi cho DNA polymerase tổng hợp mạch DNA (+) từ khuôn DNA (-) để tạo chuỗi DNA kép. Tiếp đó là hoàn thiện nucleocapsid.

2. Nhóm 2. Virus DNA đơn.

• Chỉ có một họ duy nhất là Parvoviridae.

• Các virus chứa DNA đơn thường có genome nhỏ.

• Tiến hành sao chép trong nhân nhờ DNA polymerase của tế bào để tạo DNA kép trung gian, gọi là dạng sao chép (RF-replicative form).

• RF vừa dùng làm khuôn tổng hợp DNA đơn genome vừa dùng để phiên mã tạo mRNA sau đó dịch mã tổng hợp protein .

• Một số virus có khiếm khuyết nên muốn nhân lên cần sự hỗ trợ của các virus khác.

Các virus có genome RNA.

Do vật liệu di truyền là RNA nên virus có cơ chế sao chép không giống với các cơ thể sống khác. Genome RNA của virus có các dạng phiên mã sau đây.

66

- RNA đơn, (+): Genome của virus chính là mRNA.

- RNA đơn, (-): mRNA được phiên mã từ genome của virus mẹ .

- RNA kép, phân đoạn: mRNA của virus được phiên mã riêng từ mỗi đoạn RNA genome của mẹ sử dụng transcriptase liên kết với mỗi đoạn.

Virus RNA có các đặc điểm sau:

• Do tế bào chủ không có RNA polymerase phụ thuộc RNA nên enzyme này bắt buộc phải được mã hoá bởi genome virus và thường có mặt trong hạt virus trưởng thành.

• Gen mã hoá cho RNA polymerase thường là gen lớn nhất trong genome và độc lập hoàn toàn với nhân tế bào chủ trong sao chép và phiên mã. Do vậy khác với virus DNA gây nhiễm ở eucaryota, rất nhiều virus tiến hành nhân lên hoàn toàn trong tế bào chất.

• Các enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA hoạt động không chính xác như polymerase phụ thuộc DNA và không có khả năng đọc sửa (proofreading), nên có tần số đột biến rất cao, khoảng 10-3- 10-4 base, qua mỗi chu kỳ sao chép xuất hiện một đột biến, gấp 3-4 lần so với virus DNA. Điều này dẫn đến 3 hệ quả:

Tần số đột biến ở virus rất cao nên nếu virus có chu kỳ nhân nhanh thì sự biến đổi kháng nguyên cũng diễn ra nhanh, vì thế tính độc cũng phát triển rất nhanh. Điều này có được là do virus RNA thích nghi rất nhanh với sự thay đổi của điều kiện môi trường hoặc tế bào chủ.

Một số virus RNA đột biến nhanh đến nỗi chúng tạo thành và tồn tại các quần thể chứa các genome khác nhau ngay trong một vật chủ. Việc xác định chúng ở mức độ phân tử chỉ có thể dựa vào các trình tự chiếm đa số hoặc trung bình.

Do nhiều đột biến có hại cho sự nhân lên của virus, nên tần số đột biến đặt ở giới hạn cao hơn kích thước genome RNA, vào khoảng 10 nucleotit.

Sau đây là một số ví dụ về quá trình nhân lên của virus RNA.

3. Nhóm 3. Virus RNA đơn, (+)

Ví dụ virus gây bệnh bại liệt polio. Lúc đầu không có quá trình phiên mã, vì RNA genome có trình tự nucleotid giống với trình tự của mRNA nên làm luôn chức năng của mRNA.

67

Có khả năng gây nhiễm vì genome mã hoá được cho tất cả các protein cần thiết của virus.

3.1. Dịch mã

Genome RNA (+), dùng làm mRNA để tổng hợp polypeptit tiền chất lớn sau đó nhờ protease phân cắt thành các phân tử nhỏ có chức năng khác nhau như:

• Protein cấu trúc tạo capsid.

• RNA polymerase phụ thuộc RNA cần cho quá trình sao chép (tế bào không có enzyme này)

• Protease phân cắt peptit lớn.

• Protein gắn vào đầu 5' của genome (thay cho mũ) gọi là protein VPg, cần cho khởi đầu sao chép.

3.2. Tổng hợp RNA của virus

• Sự tạo thành genome mới xảy ra trên khuôn RNA dạng sao chép (RF). Dạng này được tạo thành bằng cách tổng hợp RNA (-) bổ sung trên khuôn RNA (+) mẹ.

• Genome RNA (+) được tổng hợp trên khuôn RNA (-) của dạng sao chép RF

Hình 3.3: Chu trình đơn giản hoá quá trình nhân lên của virus RNA (-), đơn

68

• RNA polymerase phụ thuộc RNA tham gia tổng hợp cả RF và cả genome RNA (+) mới .

• RNA (+) mới được tổng hợp có những chức năng sau:

Làm khuôn để tổng hợp nhiều RF rồi từ đó tổng hợp nhiều RNA genome.

Dùng làm genome cho các virus mới

Dùng làm mRNA

3.3. Lắp ráp

Protein được tạo thành sau khi phân cắt polypeptit tiền chất sẽ lắp ráp với RNA genome mới trong tế bào chất để tạo ra virus mới

Với virus polio thì sự nhân lên hoàn toàn xảy ra trong tế bào chất

13.3.4. Giải phóng

Virus phá vỡ tế bào đột ngột để ồ ạt ra ngoài .

4. Nhóm 4. Virus RNA đơn, (-) Ví dụ virus cúm hoặc á cúm. Chu trình nhân lên được minh hoạ ở

hình 3.4

Hình 3.4: Chu trình đơn giản hoá quá trình nhân lên của virus RNA (+), đơn

Đặc điểm quá trình phiên mã có thể tóm tắt như sau:

69

• Virus RNA (-) luôn mang theo RNA polymerase phụ thuộc RNA vì tế bào không có enzyme này.

• mRNA được tổng hợp trong nhân tế bào từ genome RNA (-) của mẹ nhờ enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA có trong hạt virus .

• Virus cúm chứa genome nhiều đoạn do đó mỗi mRNA tạo thành được dùng để tổng hợp một loại protein.

4.1. Tổng hợp RNA genome.

Khác với phiên mã tạo mRNA, muốn tổng hợp genome RNA (-) trước hết phảI tổng hợp chuỗi RNA trung gian để làm khuôn. Quá trình này không cần mồi. Tiếp đó tổng hợp RNA (-) genome trên mạch khuôn trung gian.

4.2. Tổng hợp protein.

Protein của virus bao gồm:

Enzyme transcriptase (RNA polymerase phụ thuộc RNA ).

Protein vỏ ngoài gồm 2 loại đều được gắn glucozơ (glycosyl hoá). Một loại có hoạt tính haemaglutinin hoặc neuraminidase và một loại có hoạt tính dung hợp hoặc tan máu.

4.3. Lắp ráp

Nucleocapsid của virus được lắp ráp ở màng nhân tế bào và tạo vỏ ngoài khi nảy chồi qua màng sinh chất.

Virus cúm là virus RNA nhiều đoạn, đơn. Mỗi đoạn phiên mã cho một m RNA riêng để từ đó tổng hợp thành các phân tử protein có chức năng khác nhau. RNA mới của virus được tổng hợp trong nhân tế bào. Quá trình này cần có sự tham gia phiên mã cuả tế bào chủ. Protein virus được tổng hợp trong tế bào chất rồi di chuyển tới bề mặt tế bào. Tại đây glycoprotein vỏ ngoài cũng được gắn vào các vị trí nhất định. Genome RNA mới được vận chuyển đến bề mặt tế bào và lắp ráp với protein mới tổng hợp của virus. Hạt virus được bao vỏ ngoài khi nảy chồi qua màng sinh chất

5. Nhóm 5. Virus RNA kép

• Nhóm này bao gồm các virus Reo và Rota.

• Tất cả các virus RNA kép đều có genome nhiều đoạn.

• Mỗi đoạn phiên mã cho một mRNA để tổng hợp một protein riêng.

70

• Hạt virus chứa RNA polymerase phụ thuộc RNA .

• Phiên mã thực hiện theo cơ chế bảo thủ và không đối xứng, nghĩa là chỉ tạo thành mRNA. Mỗi mRNA lại được sao một lần để tạo chuỗi RNA kép, đó cũng chính là genome (sơ đồ nhân lên được minh hoạ ở hình sau ).

Hình 3.5: Chu trình đơn giản hoá quá trình nhân lên của virus Retro

(RT: Enzyme phiên mã ngược)

Hình 3.6: Chu trình đơn giản hoá quá trình nhân lên của virus RNA kép

(RdRp: Enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA)

71

6. Nhóm 6. Virus Retro chứa genome DNA đơn, (+) Rất nhiều nhưng không phải tất cả virus retro có khả năng tạo khối

u. Khi nhân lên không giết chết tế bào mà có thể chuyển dạng thành tế bào ung thư.

Genome là 2 phân tử RNA đơn, (+), gắn với nhau ở phía đầu (dạng dime).

Chứa 3 gen chính là gap (mã cho protein lõi), gen pol mã cho polymerase phiên mã ngược (RT) và gen env mã cho protein vỏ ngoài. Ngoài ra còn có một số gen điều hoà.

6.1.Quá trình nhân lên

Picorma và flavivirus

Genome RNA (+)

Đối genome RNA (-)

Tiền polyproteinEnzyme sao

chép

Protein cấu trúc

và không cấu

Virus mới

7

5

2 6

43

8

1

Hình 3.7. Sơ đồ nhân lên của virus RNA chuỗi dương, không tạo thành các mRNA genome. Sau khi xâm nhập và cởi vỏ (bước 1), RNA genome được sử dụng trực tiếp để tổng hợp các polyprotein kích thước lớn, các protein cấu trúc và không cấu trúc (bước 2 và 3). Protein không cấu trúc (enzyme) xúc tác để sao chép RNA thông qua sự tổng hợp RNA chuỗi âm (đối genome) (bước 5 và 6). Quá trình sao chép tạo ra nhiều genome RNA mới phục vụ cho tổng hợp các protein của virus (bước 6 và 7) và cho lắp ráp tạo virus mới (bước 8).

Mũi tên đậm thể hiện sự tổng hợp ở mức độ cao hơn.

72

Gồm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn đầu

• Phiên mã nhờ enzyme phiên mã ngược để tạo chuỗi lai RNA/ DNA.

• Chuyển chuỗi lai RNA/DNA thành chuỗi DNA kép. Enzyme RT có hoạt tính ribonuclease H phân giải mạch RNA. Còn mạch cDNA dùng làm khuôn tổng hợp mạch DNA bổ sung.

• Cài xen phân tử DNA kép mới tổng hợp vào nhiễm sắc thể của tế bào tạo ra provirus.

- Giai đoạn hai.

• RNA của virus phiên mã nhờ enzyme của tế bào.

• Bản sao RNA có 2 chức năng: vừa là m RNA để tổng hơpj protein virus, vừa là genome của virus mới.

6.2. Tổng hợp protein

mRNA được phiên mã từ DNA provirus tiến hành tổng hợp protein trên ribosome nằm trong tế bào chất, bao gồm: Enzyme phiên mã ngược, protein lõi, protein vỏ ngoài.

6.3. Lắp ráp

Nucleocapsid được lắp ráp từ genome RNA mới tạo thành với protein đã di trú ra bề mặt tế bào. Vỏ ngoài được hình thành khi virus nảy chồi qua màng sinh chất.

73

Atro, calici, toga, corona và arterivirus

Virus mới

Genome RNA (+)

Đối genome RNA (-)

Dưới genome mRNA

Tiền polyprotein không cấu trúc

Protein không cấu trúc

Enzyme sao chép

Protein cấu trúc và tiền polyprotein

5

92

4 3 10

6

1

Protein cấu trúc 11

7

8

Hình 3.8. Sơ đồ nhân lên của virus RNA dương, kèm theo tổng hợp RNA dưới genome. Sau khi xâm nhập và cởi vỏ (bước 1), RNA genome được dùng trực tiếp làm mRNA để tổng hợp protein không cấu trúc, trong đó có enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) ( bước 2 và 3). RdRp xúc tác để sao chép RNA, tổng hợp chuỗi RNA âm (đối genome) có kích thước đủ (tương đương RNA genome) ( bước 4 và 5). Từ chuỗi âm làm khuôn tiến hành sao chép để tạo ra nhiều chuỗi RNA genome mới (bước 5 và 6). mRNA dưới genome (có kích thước nhỏ hơn genome) tiến hành dịch mã để tạo protein cấu trúc ( bước 7 và 8). Genome mới tạo thành tiến hành dịch mã để tạo nhiều protein không cấu trúc (bước 9 và 10) và sau đó lắp ráp với protein cấu trúc để tạo virus mới ( bước 11).

Chú thích: Bước 7. Dịch mã của mRNA dưới genome; Bước 8. Phân cắt nhờ protease và xử lý sau dịch mã; Bước 10. Phân cắt nhờ protease

74

Phabdo, filo, borna, paramyxo, orthomyxo và một số bunya

Hình 3.9. Sơ đồ nhân lên của virus RNA chuỗi đơn, âm . Sau khi xâm nhập và cởi

vỏ một phần( bước 1), RNA tiến hành phiên mã nhờ RNA polymerase phụ thuộc RNA do virus mang theo để tạo mRNA (bước 2) cho tổng hợp protein cấu trúc và không cấu trúc (RdRp) ( bước 3). Enzyme RdRp tiến hành sao chép RNA thông qua bước trung gian là tạo RNA chuỗi dương (đối genome) (bước 4 và 5). Đối genome (chuỗi dương) được dùng làm khuôn để tổng hợp nhiều RNA genome (bước 5). Một phần RNA genome được dùng để tiến hành phiên mã mạnh, tạo ra mRNA cần cho tổng hợp protein (bước 7), một phần dùng để lắp ráp với protein để tạo virus mới (bước 8).

Virus mới

RNA genome ỗ

mRNA

Protein cấu trúc và không cấu trúc

Protein capsid và

1

RNA (+) đối genome 5

2 6

734

8

75

Virus Reo và Birna

Hình 3.10. Sơ đồ nhân lên của virus RNA chuỗi kép. Sau khi xâm nhập và cởi vỏ

từng phần (bước 1), các đoạn RNA chuỗi kép vẫn nằm trong lõi tiến hành phiên mã nhờ enzyme RdRp gắn ở lõi để tổng hợp mRNA (bước 2) rồi từ đó tổng hợp protein (bước 3). Các protein này lắp ráp quanh mRNA để tạo hạt dưới mức virus (bước 4). Sau đó mRNA trong các hạt này tiến hành sao chép để tạo RNA genome chuỗi âm tham gia tạo thành RNA genome chuỗi kép (bước 5). Các hạt dưới mức virus được tạo thành lại tiếp tục tham gia vào quá trình tổng hợp m RNA (bước 6), tổng hợp protein (bước 7), sao chép (bước 8 và 9), lắp ráp với protein cấu trúc để tạo thành virus mới (bước 10)

Chú thích:

Bước 1. Xâm nhập và cởi vỏ Bước 10. Lắp ráp tạo virus mới.

Bước 4. Lắp ráp tạo hạt dưới mức virus.

1

mRNA trong hạt dưới mức virus

Genome RNA kép trong hạt dưới mức virus 9

562

4mRNA virus

8

3 7

Protein cấu trúc và không cấu trúc

10

Virus mới

76

Virus Retro

1

Hình 3.11. Sơ đồ nhân lên của virus Retro. Sau khi xâm nhập và cởi vỏ từng phần (bước 1), RNA genome được phiên mã

thành cDNA (đối genome), sau đó thành DNA chuỗi kép nhờ enzyme phiên mã ngược (bước 2 và 3). Nhờ enzyme integrase, DNA của virus cài xen vào nhiễm sắc thể tế bào chủ (bước 4). Cả hai loại enzyme trên đều nằm trong lõi của virus. Nhờ RNA polymerase của tế bào, provirus phiên mã tạo RNA (bước 5) là tiền chất của mRNA (bước 6) để tổng hợp protein (bước 7) và lắp ráp tạo virus mới (bước 8).

Câu hỏi ôn tập chương 3 1.Hãy giải thích các thuật ngữ sau đây: capsome, capsid,

nucleocapsid, capsid có cấu trúc xoắn, khối đa diện, virus có cấu trúc phức tạp, vỏ ngoài.

2.Virus khác với plasmit và khác với tế bào ở điểm nào.

3.Virus có thể tác động lên tế bào như thế nào ?

4.Nêu các giai đoạn nhân lên của virus.

RNA genome cDNA (đối

genome) DNA kép

DNA cài xen (provirut)

RNA chưa chế biến

Các bản sao DNA kép của

virus

Protein cấu trúc, không cấu trúc và protein gây ung thư

Virut mới

RNA virus sau chế biến ế

3 2

56

77

8

4

9

77

5.Tại sao virus chỉ có thể nhân lên trong các tế bào nhất định ?

6.Trình bày các phương thức xâm nhập của virus vào tế bào chủ.

7.Hãy nêu các loại genome của virus, Thế nào là RNA(+), RNA(-

).Thế nào là genome chồng lớp.

8.Dạng sao chép (RF) khác với genome ở điểm nào ?

9.Tại sao các virus RNA(-) nhất định phải mang theo enzyme RNA polymerase.

10.Hãy tóm tắt quá trình nhân lên của các virus AND đơn, AND kép,RNA(+), RNA(-).

78

Chương 4 Dinh dưỡng, sinh trưởng

và phát triển của vi sinh vật

I. Dinh dưỡng Trong quá trình sống, tế bào vi sinh vật tiến hành trao đổi chất

không ngừng với môi trường chung quanh. Tế bào vi sinh vật tuy rất nhỏ, nhưng vì hấp thu các chất dinh dưỡng và thải ra các sản phẩm trao đổi chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cường độ trao đổi chất của chúng là rất lớn. Các chất dinh dưỡng vào tế bào qua màng và được chuyển hoá để tạo thành những chất riêng biệt cần thiết cho việc xây dựng tế bào. Nhờ quá trình đồng hoá các tế bào mới có thể sinh trưởng, phát triển tăng sinh khối, đồng thời tạo ra các sản phẩm trao đổi chất.

Sự biến đổi các chất dinh dưỡng bao gồm nhiều phản ứng hoá sinh khác nhau nhờ hệ enzyme theo con đường trao đổi chất, hoặc tạo ra những chất là thành phần của tế bào (quá trình đồng hoá) hoặc tạo ra năng lượng sinh học cần thiết cho hoạt động sống (quá trình dị hoá). Những chất dinh dưỡng là những hợp chất phân tử nhỏ có thể đi qua màng vào bên trong tế bào vi sinh vật và tham gia vào hai loại phản ứng sinh hoá:

- Biến đổi dị hoá làm xuất hiện những sản phẩm có cấu trúc đơn giản hơn. Những biến đổi dị hoá này cung cấp cho vi sinh vật năng lượng chuyển hoá ở dạng ATP hoặc những hợp chất giàu năng lượng khác. Một số những sản phẩm dị hoá được thải đi, một số khác làm vật liệu hoặc làm tiền chất cho các phản ứng đồng hoá.

- Biến đổi đồng hoá, đảm bảo sự tổng hợp của thành phần mới có cấu trúc phức tạp hơn và phân tử lượng cao hơn. Quá trình này thường được gọi là đồng hoá hoặc sinh tổng hợp.

Điều kiện chủ yếu để sinh tổng hợp các thành phần tế bào vi sinh vật là cung cấp một lượng thích hợp của những hợp chất có phân tử lượng nhỏ, như các acid hữu cơ hoặc amino acid, có thể làm nguyên liệu hay tiền chất cho các phản ứng đồng hoá hay phản ứng sinh tổng hợp. Khi trong môi trường có những hợp chất - vật liệu đó thì vi sinh vật sẽ trực tiếp sử dụng. Nhưng không phải bao giờ trong môi trường cũng có sẵn những hợp chất - vật liệu cần cho quá trình sinh tổng hợp. Muốn có tế bào vi sinh vật bắt buộc phải tự sản xuất lấy bằng cách tự biến đổi những thành phần của môi trường nuôi cấy. Ở những vi sinh vật dị dưỡng sống bằng chất hữu cơ,

79

một số tiền chất được hình thành trong các phản ứng dị hoá, nó sản sinh ra ATP cùng một số lớn các hợp chất khác nhau của carbon.

Các chất dinh dưỡng của vi sinh vật chủ yếu lấy ở môi trường xung quanh. Các môi trường dinh dưỡng nhân tạo cần cung cấp đầy đủ năng lượng, các vật liệu xây dựng tế bào và đảm bảo cho hiệu suất sinh tổng hợp cao. Thành phần môi trường gồm có các nguồn ăn carbon, nitơ, chất khoáng, các nguyên tố vi lượng và các chất kích thích sinh trưởng. Việc lựa chọn các nguồn dinh dưỡng và nồng độ của chúng trong môi trường phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng từng loài vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy chúng.

II. Môi trường dinh dưỡng và điều kiện sinh trưởng 1. Môi trường dinh dưỡng 1.1. Nguồn thức ăn carbon

Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn carbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO2, NaHCO3 , CaCO3... ) hoặc chất hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn carbon khác nhau phụ thuộc vào thành phần hóa học, tính chất sinh lí của nguồn thức ăn và đặc điểm sinh lí của từng loại vi sinh vật. Hầu như không có hợp chất carbon nào mà không bị hoặc nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải. Không ít vi sinh vật có thể đồng hóa được cả các hợp chất carbon rất bền vững như cao su, chất dẻo, dầu mỏ, parafin, khí tự nhiên.

Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết ra các enzyme thủy phân (amylase, cellulase, pectinase, protease, lipase...) để chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ hấp thụ (đường, amino acid, acid béo...).

Người ta thường sử dụng đường để làm nguồn thức ăn carbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường không giống nhau. Với vi khuẩn, xạ khuẩn thường dùng 0,2 - 0,5% đường còn đối với nấm men, nấm sợi thường dùng 3 - 10% đường.

Hầu hết vi sinh vật chỉ đồng hóa được các loại đường ở dạng đồng phân D. Nhưng phần lớn các đồng phân của đường đơn trong tự nhiên đều là thuộc loại D. Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (peptone, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu...) có thể sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh

80

vật. Với vi sinh vật dị dưỡng, nguồn thức ăn carbon làm cả hai chức năng, nguồn dinh dưỡng và năng lượng. 1.2. Nguồn dinh dưỡng nitơ (N)

Ý nghĩa chủ yếu của các chất dinh dưỡng chứa nitơ đối với vi sinh vật là cung cấp N để tạo thành các nhóm amin (-NH2) và nhóm imin (=NH) trong phân tử amino acid, các nucleotide, purine và pirimidine, trong nhiều vitamin...

Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NO3- và NH4

+. Muối nitrate là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nhiều loại nấm men và vi khuẩn. Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc NO3

- các ion kim loại còn lại (K+, Na+, Mg2+..) sẽ làm kiềm hóa môi trường. Để tránh hiện tượng này người ta thường sử dụng muối NH4NO3 để làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật. Tuy nhiên gốc NH4

+ thường được hấp thụ nhanh hơn gốc NO3-.

Vi sinh vật còn có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Các thức ăn này sẽ vừa là nguồn carbon vừa là nguồn nitơ cung cấp cho vi sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử. Rất nhiều vi sinh vật có khả năng sản sinh protease thủy phân protein thành các hợp chất phân tử thấp có khả năng xâm nhập vào tế bào vi sinh vật. Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là peptone (là chế phẩm thủy phân không triệt để của một nguồn protein nào đó) chúng khác nhau về lượng chứa các loại polypeptide và lượng chứa amino acid tự do.

Ngoài ra phân tử N2 tự do cũng được một nhóm nhỏ vi sinh vật sử dụng gọi là nhóm vi sinh vật cố định nitơ (nitrogen fixing microorrganisms). Chúng có hệ enzyme nitrogenase có thể bẻ gãy nối ba của nitơ phân tử ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường. 1.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng

Khi sử dụng các môi trường thiên nhiên để nuôi cấy vi sinh vật thường không cần thiết bổ sung các nguyên tố khoáng. Trong nguyên liệu dùng để pha chế các môi trường này (khoai tây, nước thịt, sữa, huyết thanh, peptone, giá đậu...) thường có chứa đủ các nguyên tố khoáng cần thiết đối với vi sinh vật. Ngược lại, khi làm các môi trường tổng hợp (dùng nguyên liệu là hóa chất) bắt buộc phải bổ sung đủ các nguyên tố khoáng cần thiết.

Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phải được cung cấp với liều lượng lớn được gọi là các nguyên tố đại lượng. Còn những

81

nguyên tố khoáng mà vi sinh vật chỉ đòi hỏi với những liều lượng rất nhỏ được gọi là các nguyên tố vi lượng.

Phosphorus (P) bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật (nhiều khi P chiếm đến 50% so với tổng số chất khoáng). P có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào (acid nucleic, phosphoprotein, phospholipid, ADP, ATP, UDP, UTP, CDP, CTP, NAD, NADP, flavin...; một số vitamin như thiamine, biotin...). Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng P người ta thường sử dụng các loại muối phosphate vô cơ. Việc bổ sung phosphate vào các môi trường dinh dưỡng ngoài tác dụng cung cấp P còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường.

Lưu huỳnh (S) cũng là một nguyên tố khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật. S có mặt trong một số amino acid (cysteine, cystine, methionine), một số vitamin (biotin, thiamine...) cysteine, cystine và một tripeptide là glutation không chỉ tham gia vào cấu trúc protein mà còn có vai trò quan trọng trong các quá trình ôxy hóa khử. Các hợp chất hữu cơ có chứa S ở dạng ôxy hóa thường có tác dụng độc đối với tế bào vi sinh vật. Trong khi đó các muối sulphate vô cơ với nguyên tử S ở trạng thái ôxy hóa lại được cơ thể vi sinh vật đồng hóa rất tốt. Một số vi sinh vật có thể dùng cả thiosulphate làm nguồn thức ăn S. Một số vi sinh vật khác lại đòi hỏi các thức ăn chứa S ở dạng khử (H2S, cystine, cysteine...).

Fe là nguyên tố rất cần thiết để giúp vi sinh vật có thể tổng hợp một số enzyme loại porphiryl chứa sắt (như cytochrome, cytochrome - oxydase, peroxydase, catalase...). Một số vi sinh vật tự dưỡng quang năng còn sử dụng Fe để tổng hợp ra các sắc tố quang hợp có cấu trúc porphiryl (chlorophyll, bacteriochlorophyll).

Mg là nguyên tố được vi sinh vật đòi hỏi cung cấp với lượng khá cao. Mg mang tính chất một cofactor, chúng tham gia nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến qúa trình phosphoryl hóa. Mg2+ có thể hoạt hóa các enzyme như hexokinase, ATP - ase, carboxylase, các enzyme trao đổi protein, các enzyme ôxy hóa khử của chu trình Krebs... Mg còn có vai trò quan trọng trong việc liên kết các tiểu phần ribosome với nhau.

Ca mặc dầu là nguyên tố ít tham gia vào việc xây dựng nên các chất hữu cơ nhưng nó có vai trò đáng kể trong việc xây dựng các cấu trúc tinh vi của tế bào. Ca đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng của tế bào sống (như giữa ADN và protein trong nhân, giữa các nucleotide với nhau, giữa ARN và protein trong ribosome). Ca rất cần thiết đối với việc hình thành các cấu trúc không gian ổn định của nhiều bào quan như ribosome, ti thể, nhân...

82

Zn cũng là một cofactor tham gia vào nhiều quá trình enzyme. Zn có tác dụng đáng kể trong việc hoạt hóa các enzyme như carbonanhydrase, enolase, pyrophosphatase, phosphatase kiềm ...

Cũng có một số nguyên tố hóa học chúng ta chưa hiểu rõ về vai trò sinh lí của chúng, trong số đó phải kể đến là K. K là nguyên tố chiếm tỉ lệ khá cao trong thành phần khoáng của tế bào vi sinh vật, nhưng cho đến nay người ta chưa tìm thấy K tham gia vào bất kì thành phần nào của nguyên sinh chất, cũng chưa tìm thấy bất kì enzyme nào có chứa K. K thường tồn tại ở dạng ion K+ ở mặt ngoài của cấu trúc tế bào. Một phần đáng kể K tồn tại ở trạng thái liên kết hóa lí không bền với protein và các thành phần khác của nguyên sinh chất. K làm tăng độ ngậm nước của các hệ thống keo do đó ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất, nhất là các quá trình sinh tổng hợp. K còn có thể tham gia vào quá trình tổng hợp một số vitamin và có ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của tế bào vi sinh vật.

Na và Cl cũng là những nguyên tố mà nhiều vi sinh vật đòi hỏi với một lượng không nhỏ, nhưng cho tới nay người ta vẫn còn biết rất ít vai trò sinh lí của chúng. Hàm lượng Na và Cl đặc biệt cao trong tế bào vi sinh vật ưa mặn sống trong nước biển, đất, vùng ven biển hoặc trên các loại thực phẩm ướp mặn. 1.4. Yếu tố sinh trưởng

Đối với vi sinh vật thì yếu tố sinh trưởng là một khái niệm rất linh động. Nó chỉ có ý nghĩa là những chất hữu cơ cần thiết đối với hoạt động sống mà một loại vi sinh vật nào đó không tự tổng hợp được từ các chất khác. Những chất được coi là yếu tố sinh trưởng của loài vi sinh vật này hoàn toàn có thể không phải là yếu tố sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật khác. Hầu như không có chất nào là yếu tố sinh trưởng chung đối với tất cả các loài vi sinh vật.

Đặc điểm của môi trường sống một mặt ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp yếu tố sinh trưởng của vi sinh vật, mặt khác ảnh hưởng đến đặc điểm trao đổi chất của chúng. Chính thông qua các ảnh hưởng này mà môi trường sống của từng loại vi sinh vật đã góp phần quyết định nhu cầu của chúng về yếu tố sinh trưởng. Khi sống lâu dài trong các môi trường thiếu yếu tố sinh trưởng, vi sinh vật sẽ dần dần tạo ra được khả năng tự tổng hợp yếu tố sinh trưởng mà chúng cần thiết.

Cùng một loài vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trong các điều kiện khác nhau cũng có thể có những nhu cầu khác nhau về yếu tố sinh trưởng. Chẳng hạn nấm mốc Mucor rouxii được chứng minh là chỉ cần biotin và

83

thiamine khi phát triển trong điều kiện kị khí. Khi nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí, chúng sẽ tự tổng hợp ra được yếu tố sinh trưởng này.

Sự có mặt của một số chất dinh dưỡng khác có khi cũng ảnh hưởng đến nhu cầu về yếu tố sinh trưởng của vi sinh vật. Chẳng hạn việc đòi hỏi acid pantotenic của một số vi sinh vật (ví dụ vi khuẩn bạch hầu Corynebacterium diphtheriae) có thể thỏa mãn khi chỉ cần cung cấp cho chúng β - alanine, chúng có thể tự tổng hợp được acid pantoic (acid pantotenic cấu tạo từ acid pantoic và β - alanine).

Thông thường các chất được coi là yếu tố sinh trưởng đối với một loài nào đó có thể thuộc về một trong các loại sau đây: các gốc kiềm purine, pirimidine và các dẫn xuất của chúng, các acid béo và thành phần của màng tế bào, các vitamin thông thường...

Mặt khác, nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin. Sinh khối vi sinh vật thường chứa hầu hết các loại vitamin chủ yếu với những hàm lượng khá cao. Người ta đã sử dụng thành công một số loài vi sinh vật để sản xuất ở quy mô công nghiệp một số loại vitamin tinh khiết dùng trong y học. Đáng chú ý nhất là acid ascorbic (vitamin C), riboflavin (vitamin B2), cyanocobalamin (vitamin B12). 2. Điều kiện sinh trưởng

Sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật liên quan chặt chẽ với các điều kiện của môi trường bên ngoài. Các điều kiện này bao gồm hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác động qua lại với nhau. Đa số các yếu tố đó đều có một đặc tính tác dụng chung biểu hiện ở ba điểm hoạt động là tối thiểu, tối thích và cực đại. 2.1. Cơ chế tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên vi sinh vật

Các yếu tố của môi trường bên ngoài tác dụng lên tế bào thuộc ba loại là yếu tố vật lí (độ ẩm, nhiệt độ, áp lực, tia bức xạ...), yếu tố hóa học (pH môi trường, thế ôxy hóa khử, các chất diệt khuẩn...) và yếu tố sinh học (chất kháng sinh, kháng thể). Dù là yếu tố nào nhưng khi đã tác dụng bất lợi lên tế bào thì thường trước hết gây tổn hại đến các cấu trúc quan trọng cho sự sống của tế bào. Những tổn hại đó dẫn đến phá hủy chức phận hoạt động của các cấu trúc và làm chết tế bào. Chừng nào tế bào vi sinh vật có thể sống sót chính là do chúng đã thích ứng với yếu tố đã cho bằng những thay đổi về sinh lí hoặc di truyền.

Tác dụng có hại của các yếu tố bên ngoài tế bào thể hiện chủ yếu ở những biến đổi sau đây:

1. Phá hủy thành tế bào: một số chất như enzyme lysozyme (chứa trong lá lách, bạch cầu, lòng trắng trứng, đuôi thực khuẩn thể...) có khả

84

năng phân huỷ thành tế bào vi khuẩn dẫn đến tạo thành các nguyên lạp chủ yếu ở vi khuẩn Gram dương và các cầu lạp ở vi khuẩn Gram âm.

2. Biến đổi tính thấm của màng tế bào chất: một số chất không nhất thiết phải xâm nhập tế bào, nhưng vẫn gây tác dụng kháng khuẩn. Do tác dụng lên một hoặc một chức phận sinh lí của màng tế bào, chất này sẽ làm vi khuẩn mất khả năng sinh sản. Rất có thể, trong trường hợp như vậy, hàng rào thẩm thấu tồn tại trong màng tế bào chất đã bị hư hại.

Tác dụng kháng khuẩn của các chất ôxy hóa và các chất khử (H2O2, các halogen ...) là do ảnh hưởng của chúng lên các thành phần của màng tế bào chất. Cũng có thể xếp vào nhóm các hợp chất này là rượu, phenol, các chất tẩy rửa tổng hợp, các muối mật và một số kháng sinh (polymyxin, thyroxydin, nistatin).

3.Thay đổi đặc tính keo của nguyên sinh chất: các yếu tố vật lí cũng như hóa học đều có thể gây nên tác dụng này. Chẳng hạn nhiệt độ cao làm biến tính protein và làm chúng đông tụ do khả năng khử nước.

4. Kìm hãm hoạt tính: một số chất tác động vào các hệ thống sinh năng lượng của tế bào, cyanite kìm hãm cytochrome - oxydase, fluoride ngăn cản quá trình đường phân, các hợp chất hoá trị ba của acsenic bao vây chu trình Krebs, dinitrophenol kìm hãm quá trình phosphoryl hoá ôxy hóa. Các chất ôxy hóa mạnh (H2O2, halogen) phá hủy các hệ thống tế bào làm tổn hại đến chức phận trao đổi chất. Các enzyme khác có thể bị bất hoạt khi liên kết với các yếu tố kim loại như thủy ngân.

5. Hủy hoại các quá trình tổng hợp: trong sự có mặt của một số chất tương tự về mặt cấu trúc với các chất trao đổi tự nhiên, gọi là các chất kháng chất trao đổi (antimetabolism), quá trình sinh tổng hợp có thể bị ức chế. Cơ chế tác dụng của các chất kháng chất trao đổi không giống nhau. Một số gắn với trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme mất hoạt tính phân hủy cơ chất; một số khác có thể tham gia vào phản ứng enzyme và được lắp vào sản phẩm của phản ứng nhưng sau đó không được sử dụng trong trao đổi chất với cùng mức độ như trong trường hợp của cơ chất thực. 2.2. Các nhân tố ảnh hưởng

* Các yếu tố vật lí - Độ ẩm: hầu hết các quá trình sống của vi sinh vật có liên quan đến

nước, do đó độ ẩm là một yếu tố quan trọng của môi trường. Đa số vi khuẩn thuộc các sinh vật ưa nước nghĩa là chúng cần nước ở dạng tự do, dễ hấp thụ. Chỉ một số xạ khuẩn có thể xếp vào bọn ưa khô. Nếu làm lạnh tế bào đồng thời làm khô trong chân không ta có thể bảo quản được sức

85

sống của tế bào trong một thời gian dài. Đây là nguyên tắc của phương pháp làm đông khô vi khuẩn.

Do vi khuẩn cần độ ẩm nhất định để sinh trưởng nên bằng cách phơi khô hoặc sấy khô ta có thể bảo quản được lâu dài nhiều loài sản phẩm (hoa quả khô, cá, ruốc thịt khô).

- Nhiệt độ: hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này thuộc phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào.

Như đã nói trên, hoạt động của vi sinh vật bị giới hạn trong môi trường chứa nước ở dạng có thể hấp thụ. Vùng này của nước nằm từ 2oC đến khoảng 100oC gọi là vùng sinh động học. Hầu hết tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật bị chết ở nhiệt độ cao do protein bị biến tính, một hoặc hàng loạt enzyme bị bất hoạt. Các enzyme hô hấp đặc biệt là các enzyme trong chu trình Krebs rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự chết của vi khuẩn ở nhiệt độ cao cũng có thể còn là hậu quả của sự bất hoạt hóa ARN và sự phá hoại màng tế bào chất (nói chung, các acid nucleic ít mẫn cảm với nhiệt độ so với các enzyme).

Nhiệt độ thấp (dưới vùng sinh động học) có thể làm bất hoạt quá trình vận chuyển các chất hòa tan qua màng tế bào chất do thay đổi cấu hình không gian của một số permease chứa trong màng hoặc ảnh hưởng đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ động các chất dinh dưỡng.

- Áp lực: áp suất thẩm thấu và áp suất thủy tĩnh có thể ảnh hưởng đến cấu trúc của tế bào vi khuẩn. Màng tế bào chất của tế bào vi khuẩn là bán thấm do đó các hiện tượng thẩm thấu và việc điều chỉnh thẩm áp qua các hệ thống permease đều có liên quan đến màng này. Trong môi trường ưu trương tế bào mất khả năng rút nước và các chất dinh dưỡng hòa tan bao quanh, tế bào chịu trạng thái khô sinh lí, bị co sinh chất và có thể bị chết nếu thời gian kéo dài. Trong thực tế người ta ứng dụng tác dụng co sinh chất của các nồng độ muối cao (10 - 15%) hoặc đường cao (50- 80%) để bảo quản thực phẩm (muối dưa, cà, ướp thịt cá), hoa quả (làm mứt) vì đa số vi sinh vật rất mẫn cảm với thẩm áp cao của môi trường. Ngược lại, khi vi khuẩn vào dung dịch nhược trương nước sẽ xâm nhập tế bào, áp lực bên trong sẽ tăng lên. Tuy nhiên, do có thành tế bào cứng ở vi khuẩn không xảy ra ra hiện tượng vỡ sinh chất như ở tế bào thưc vật.

Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường chứa ít hơn 2% muối, nồng độ muối cao hơn có hại cho tế bào. Nhưng cũng có một số vi khuẩn lại sinh trưởng tốt nhất trong môi trường chứa tới 30% muối, ta gọi

86

là các vi khuẩn ưa muối (halophilic). Nhiều vi khuẩn ở biển thuộc nhóm này, chúng không có khả năng phát triển ở những nồng độ đường cao.

- Các tia bức xạ: ánh sáng có thể gây ra những biến đổi và do đó có thể gây tổn thương sinh học nếu được tế bào hấp thụ. Mức độ gây hại tùy thuộc vào mức năng lượng trong lượng tử ánh sáng được hấp thụ. Các tia có thể gây những biến đổi hóa học là ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại, tia X, tia gamma và tia vũ trụ. Ánh sáng mặt trời có thể gián tiếp tác động lên tế bào do làm biến đổi môi trường. Tia tử ngoại có tác dụng mạnh nhất ở bước sóng 260nm, đây là vùng hấp thụ cực đại của acid nucleic và nucleoprotein gây dimer hóa thimine, dẫn đến ức chế sự nhân đôi của ADN. Nhưng sau khi chiếu tia tử ngoại, nếu đưa vi khuẩn ra ánh sáng ban ngày thì vi khuẩn có thể phục hồi khả năng sinh trưởng và phân chia. Hiện tượng này gọi là quang tái hoạt (photoreactivation).

- Âm thanh: sóng âm thanh, đặc biệt trong vùng siêu âm (trên 20 kHz) có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của vi khuẩn, các tế bào sinh dưỡng bị chết nhanh chóng.

* Các yếu tố hóa học - Ảnh hưởng của pH môi trường: pH của môi trường có ý nghĩa

quyết định đối với sinh trưởng của nhiều vi sinh vật. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có tác động mạnh mẽ. Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu và duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của tế bào là rất quan trọng.

Các giá trị pH (cực tiểu, tối thích, cực đại) cần cho sinh trưởng và sinh sản của vi khuẩn tương ứng với các giá trị pH trung bình cần cho hoạt động của nhiều enzyme. Giới hạn pH hoạt động đối với vi sinh vật ở trong khoảng 4 - 10. Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở pH trung tính (7,0) như nhiều vi khuẩn gây bệnh (môi trường tự nhiên là máu và bạch huyết của cơ thể động vật có pH khoảng 7,4). Các vi khuẩn nitrate hóa, vi khuẩn nốt sần, xạ khuẩn, vi khuẩn phân giải urea lại ưa môi trường hơi kiềm. Một số vi khuẩn chịu acid (vi khuẩn lactic, Acetobacter, Sarcina ventriculi), một số khác ưa acid như Acetobacter acidophilus, Thiobacillus thiooxydans (ôxy hóa lưu huỳnh thành H2SO4) có thể sinh trưởng ở pH <1. Nấm mốc và nấm men ưa pH acid (pH 4 - 6). pH môi trường không những ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng mà còn tác động sâu sắc đến các quá trình trao đổi chất.

- Ảnh hưởng của ôxy: ôxy có vai trò hết sức quan trọng trong hoạt động sống của vi sinh vật. Tuỳ thuộc vào nhu cầu đối với ôxy mà người ta

87

chia vi sinh vật thành các nhóm sau: + Hiếu khí bắt buộc: thuộc nhóm này là các vi sinh vật chỉ có thể

sinh trưởng được khi có mặt ôxy phân tử (O2), chúng có chuỗi hô hấp hoàn chỉnh, dùng O2 làm thể nhận hydro cuối cùng. Trong các tế bào có chứa enzyme SOD (superoxid dismutase), catalase và peroxidase có tác dụng chuyển hoá các gốc O2

2- và O2- để giải độc cho tế bào. Tuyệt đại đa

số vi nấm và số đông vi khuẩn thuộc nhóm này. + Hiếu khí không bắt buộc: thuộc nhóm này là các vi sinh vật có thể

sinh trưởng được cả trong điều kiện có ôxy lẫn không có ôxy. Trong tế bào có chứa SOD và peroxidase, khi có ôxy chúng sinh trưởng tốt hơn. Phần lớn nấm men và nhiều vi khuẩn thuộc nhóm này. Có thể kể đến các loài như Saccharomyces cerevisiae, E. coli, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris.

+ Vi hiếu khí: thuộc nhóm này là các vi sinh vật chỉ có thể sinh trưởng được ở điều kiện áp lực ôxy rất thấp. Chúng cũng thông qua chuỗi hô hấp và dùng ôxy làm thể nhận hydro cuối cùng. Có thể kể đến các loài như Vibrio cholerae, Hydrogenomonas spp, Zymononas spp, Bacteroides spp...

+ Kỵ khí: với các vi sinh vật thuộc nhóm này sự có mặt của ôxy phân tử là có hại. Chúng không sinh trưởng được trên môi trường đặc hoặc bán đặc khi để trong không khí hay trong không khí có chứa khoảng 10% CO2. Chúng chỉ sinh trưởng được ở lớp thể dịch sâu, nơi không có ôxy, có các quá trình lên men, quá trình phosphoryl hoá quang hợp, quá trình methane hoá... Trong tế bào của các vi sinh vật này không có SOD, cytochrome-oxidase, phần lớn không có hydrogenperoxidase. Có thể kể đến rất nhiều loài trong các chi Clostridium, Fusobacterium, Butyrivibrio, Desulfovibrio, Veillonella...

- Các chất diệt khuẩn (sát trùng): thường sử dụng là phenol và các dẫn xuất của phenol, alkol, halogen, kim loại nặng, H2O, xà phòng, thuốc nhuộm và các chất tẩy rửa tổng hợp của các muối ammon bậc bốn.

* Các yếu tố sinh học Trong các yếu tố sinh học ảnh hưởng có hại lên các quá trình sống

của vi sinh vật cần kể đến kháng thể và kháng sinh. Chất kháng sinh có thể có từ nhiều nguồn gốc khác nhau như tổng hợp hoá học, chiếc xuất từ thực vật, động vật nhưng chủ yếu là được tổng hợp từ vi sinh vật. Đây là các chất đặc hiệu mà ở nồng độ thấp cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách chọn lọc.

88

Kháng thể là những chất có sẵn trong máu hoặc được xuất hiện khi có kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, có khả năng liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên để làm mất hoạt lực của kháng nguyên (xem thêm phần kháng sinh và miễn dịch ). III. Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật

Căn cứ vào dạng năng lượng sử dụng người ta có thể chia làm các loại vi sinh vật:

- Các cơ thể quang tự dưỡng (photoautotrophic) hay quang dưỡng vô cơ (photolithotrophic) có thể chuyển năng lượng ánh sáng thành năng lượng trao đổi chất (ATP) và chất có tính khử (NADPH2). CO2 là nguồn carbon chủ yếu, H2O hay H2S là chất cho điện tử.

Có thể gặp những vi khuẩn quang hợp thải ôxy giống như cây xanh, đại diện là các loài vi khuẩn lam (Spirulina, Anabaena, Nostoc…). Các tảo đơn bào quang hợp không thải ôxy như các vi khuẩn lục thuộc họ Chlorobacteriaceae (Chlorobium, Thiosulfatophilum...), đây là những vi khuẩn quang dưỡng vô cơ kị khí với H2S hoặc S2O3

2- làm chất cho điện tử. Các vi khuẩn lưu huỳnh màu tía thuộc bộ Thiorhodobacteriales như Chromatium, những vi khuẩn này có khả năng phát triển trên môi trường muối vô cơ như nhiều loại cây xanh, đây là những vi khuẩn kị khí quang dưỡng vô cơ khi có mặt trong môi trường S hoặc H2S.

- Các vi khuẩn quang dị dưỡng (photoheterotrophic) hay quang dưỡng hữu cơ (photoorganotrophic), sử dụng ánh sáng làm nguồn năng lượng và hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon, như các vi khuẩn màu tía không lưu huỳnh thuộc bộ Athiorhodobacteriales, họ Athiorhodaceae, các loài thuộc giống Rhodospirillum. Những vi khuẩn này thiên về vi hiếu khí, là những vi khuẩn quang dưỡng hữu cơ, không có khả năng phát triển với H2S là chất cho electron độc nhất, chất cho electron của chúng là acetate, succinate hay hydro.

- Các vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ (Chemolithotrophic) hay hóa tự dưỡng (Chemoautotrophic) sử dụng năng lượng được tạo thành từ các phản ứng hóa học và CO2 làm nguồn carbon.

Năng lượng có được là nhờ ôxy hóa các hợp chất vô cơ như NH4+,

NO2-, H2, H2S, S, S2O3

2-, Fe2+... Chúng hình thành một nhóm rất hạn chế tham gia vào các chu trình vật chất sống ở trong đất và nước như Hydrogenomonas ôxy hóa hydro, Nitrosomonas ôxy hóa NH3, Nitrobacter ôxy hóa nitrite, Thiobacillus ôxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh...

- Các cơ thể hóa dị dưỡng (Chemoheterotrophic) hay hóa dưỡng hữu cơ (Chemoorganotrophic) bao gồm các vi khuẩn, vi nấm, động vật nguyên

89

sinh, động vật, chúng sử dụng năng lượng hóa học và một cơ chất hữu cơ làm nguồn carbon chủ yếu. Một nhóm lớn các vi khuẩn hóa dưỡng hữu cơ là những vi sinh vật gây bệnh rất được chú ý trong Y học, các vi khuẩn tạp nhiễm vào thức ăn, các vi khuẩn được sử dụng trong công nghiệp để tổng hợp các chất kháng sinh, các loại vitamin, các amino acid... IV. Sinh lí học của sự sinh trưởng 1. Các phương pháp xác định số lượng và sinh khối vi khuẩn 1.1. Xác định sinh khối vi khuẩn

Việc chọn phương pháp để xác định sinh khối vi khuẩn tùy thuộc vào mục đính nghiên cứu. Chẳng hạn, muốn đánh giá sản lượng tế bào thì cần sinh khối tươi hoặc khô sau khi đã li tâm tế bào; muốn xác định cường độ trao đổi chất hay hoạt tính enzyme, người ta lại tính hàm lượng protein hoặc nitơ. Như vậy, trong thực tế có thế sử dụng các phương pháp trực tiếp hoặc gián tiếp.

Các phương pháp trực tiếp gồm có: 1. Xác định sinh khối tươi hoặc sinh khối khô (phương pháp này

kém chính xác). 2. Xác định hàm lượng nitơ tổng số (phương pháp Kjelhdal) hay

hàm lượng carbon tổng số (theo Vslike-Folch), các phương pháp này cho độ chính xác cao.

3. Trong thực tế người ta thường xác định hàm lượng protein của vi khuẩn. Có thế dùng phương pháp buire cải tiến hoặc phương pháp so màu khác. Các phương pháp vi lượng dựa vào việc đo số lượng các thành phần đặc trưng của protein như threonine, tryptophan (theo Lowry hoặc Folin-Ciocalteu) cũng cho kết quả tốt.

Có thể nói xác định hàm lượng protein trong sinh khối là phương pháp thích hợp nhất vì một mặt protein là thành phần chủ yếu của chất khô, mặt khác đó là những thành phần hoạt động trong sinh khối (hầu hết protein của tế bào là enzyme).

* Các phương pháp gián tiếp để đo sinh khối vi khuẩn: 1. Đo độ đục của dịch treo tế bào, đây là phương pháp rất thuận lợi.

Trong thực tế ta thường đo mật độ quang học của dịch treo, trong một số trường hợp người ta cũng xác định sự khuếch tán ánh sáng.

2. Đo các chỉ số cường độ trao đổi chất như hấp thụ O2, tạo thành CO2 hay acid, vì các chỉ số này liên quan trực tiếp với sinh trưởng. Dĩ nhiên ta chỉ dùng các phương pháp này trong trường hợp không sử dụng được các phương pháp khác, ví dụ khi mật độ sinh khối rất nhỏ.

90

1.2. Xác định số lượng tế bào Trong trường hợp xác định số lượng tế bào sống người ta thường

đếm số khuẩn lạc tạo thành bởi các vi khuẩn sống trong điều kiện sinh trưởng thuận lợi. Dịch treo vi khuẩn được pha loãng và một thể tích nhất định được đưa lên môi trường thạch trong hộp Petri. Sau khi nuôi cấy người ta đếm số khuẩn lạc mọc lên. Nếu giả dụ rằng mỗi tế bào tạo thành một khuẩn lạc thì đếm số khuẩn lạc ta sẽ đếm được số tế bào sống. Tất nhiên điều này không đúng đối với các vi khuẩn mọc thành chuỗi, thành đôi hay thành đám hoặc đối với các dịch treo vi khuẩn không đồng nhất.

Số khuẩn lạc cũng rất phụ thuộc vào thành phần môi trường. Tế bào mọc thành khuẩn lạc trên môi trường này không nhất thiết cũng cho xuất hiện khuẩn lạc trên môi trường khác.

Với một số loại vi khuẩn khó phát triển trên môi trường thạch người ta có thể kiểm tra số lượng bằng phương pháp pha loãng liên tiếp sau đó cấy từ mỗi độ pha loãng 1ml vào từng ống đựng môi trường chỉ thị (nếu có 1 vi khuẩn đưa vào cũng đủ cho phản ứng dương tính sau khi nuôi cấy). Phương pháp này gọi là phương pháp số lượng có khả năng nhất (MPN = Most Probable Number). Có thể cấy vào 5 ống và lấy số liệu ở 3 độ pha loãng cuối (có phản ứng dương tính) rồi tra bảng để tìm ra số lượng gần đúng mật độ vi khuẩn.

Hoặc có thể lọc mẫu qua màng lọc vi khuẩn rồi đặt màng lọc lên đĩa môi trường thạch để kiểm tra số khuẩn lạc mọc và suy ra mật độ vi sinh vật trong mẫu.

Nếu kích thước của tế bào khá lớn có thể đếm trực tiếp trên phòng đếm (thường hay dùng các loại phòng đếm Thomas hay Goriaev). 2. Sinh trưởng lũy thừa và thời gian thế hệ

Sinh trưởng và phát triển là thuộc tính cơ sở của vi sinh vật. Sinh trưởng là sự tăng kích thước và khối lượng tế bào, còn phát triển (sinh sản) là sự tăng số lượng tế bào. Điều cần chú ý là khi nói về sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn tức là đề cập đến sinh trưởng và phát triển của một số lượng lớn tế bào của cùng một loại. Bởi vì, việc nghiên cứu một cá thể tế bào vi khuẩn quá nhỏ là rất khó. Tuy nhiên sự tăng số lượng tế bào không phải bao giờ cũng diễn ra song song với sự tăng sinh khối. Chẳng hạn, khi chất dinh dưỡng trong môi trường đã cạn, vi khuẩn tuy còn phân chia 1 - 2 lần nhưng cho 2 - 4 tế bào nhỏ hơn tế bào bình thường; trong pha mở đầu, sinh khối vi khuẩn tăng lên, nhưng số tế bào không thay đổi, ngược lại, vào cuối pha logarid kích thước tế bào giảm đi nhưng số tế bào vẫn còn tăng.

91

Giả sử trong một bình kín chứa một lượng lớn môi trường dinh dưỡng, ta cấy vào đó một tế bào vi khuẩn. Nếu thành phần môi trường hoàn toàn phù hợp với nhu cầu của tế bào vi khuẩn sẽ sinh trưởng, tăng khối lượng và thể tích, tổng hợp các thành phần của tế bào (thành tế bào, màng tế bào chất, ADN, ARN, protein...) cho đến khi kích thước lớn gấp đôi và vi khuẩn sẽphân chia cho 2 tế bào. Hai tế bào này lại tiếp tục sinh trưởng và phân chia để cho 4, 8, 16 tế bào…

Nếu số tế bào ban đầu không phải là 1 mà là No thì sau n lần phân chia ta sẽ có số tế bào tổng cộng là N :

N = N0 . 2n (1) Các giá trị N và N0 có thể xác định nhờ phòng đếm hoặc tính số

khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc. Còn giá trị n (số thế hệ) có thể tính nhờ logarid thập phân:

logN = logN0 + n. log2

⇒ n = 2log

)log( NoN − (2)

Giả sử vi khuẩn phân chia n lần sau thời gian t, khoảng thời gian giữa 2 lần phân chia liên tiếp (hoặc thời gian cần cho việc phân đôi tế bào) gọi là thời gian thế hệ và được biểu thị bằng g:

g = nt =

0

1

loglog2log).(

NNtt−

− (3)

Ở đây t = t2 – t1 biểu thị sự sai khác giữa thời gian đầu (t1) và thời gian cuối (t2) tính bằng giờ. Giá trị đảo nghịch của thời gian thế hệ hay là số lần phân chia sau một đơn vị thời gian (tức sau 1 giờ) gọi là hằng số tốc độ phân chia C:

C = tn =

2log).(loglog

12

0

ttNN

−−

(4)

Rõ ràng thời gian thế hệ càng ngắn, vi khuẩn sinh trưởng và sinh sản càng nhanh. Từ công thức (4) ta có:

n = ct (5) Thay giá trị của n vào phương trình (1) ta có: N = N0.2ct (6) Hằng số tốc độ phân chia C phụ thuộc vào một số điều kiện: loài vi

khuẩn, nhiệt độ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy. 3. Sinh trưởng của vi khuẩn trong nuôi tĩnh

92

3.1 Quá trình sinh trưởng Nuôi cấy tĩnh là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian đó ta

không thêm vào chất dinh dưỡng cũng không loại bỏ đi các sản phẩm cuối cùng của trao đổi chất (quần thể tế bào bị giới hạn trong một khoảng không gian nhất định). Sự sinh trưởng trong một “hệ thống đóng” hay “hệ kín” như vậy tuân theo những quy luật bắt buộc không những đối với các cơ thể đơn bào mà cả đối với các cơ thể đa bào.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của logarid số lượng tế bào theo thời gian gọi là đường cong sinh trưởng (hình 4.1).

0 2 4 6 8

4

6

8

1 0

1 2

lo g N

t(h )

Hình 4.1 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn

Pha lag

Pha logarid

Pha ổn định

Pha tử vong

Quá trình sinh trưởng của tế bào vi sinh vật trong hệ kín trải qua các giai đoạn :

* Pha lag (pha mở đầu = pha tiềm tàng) Pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến khi vi khuẩn đạt được tốc

độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia (nghĩa là chưa có khả năng sinh sản) nhưng thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt do quá trình tổng hợp các chất, trước hết là các cao phân tử (protein, enzyme, acid nucleic...) diễn ra mạnh mẽ.

Độ dài của pha lag phụ thuộc trước hết vào tuổi của ống giống và thành phần môi trường. Thông thường tế bào càng già thì pha lag càng dài. Rõ ràng nguyên nhân của pha lag là sự khác biệt giữa các tế bào ở pha ổn định (hoặc bào tử) với các tế bào đang sinh trưởng logarid. Trong pha lag diễn ra việc xây dựng lại các tế bào nghỉ thành các tế bào sinh trưởng logarid (hoặc sinh trưởng theo lũy thừa).

93

Khi chuyển các tế bào đang sinh trưởng logarid vào môi trường mới khác với môi trường trước đó ta vẫn thấy có sự xuất hiện pha lag. Nguyên nhân của pha lag trong trường hợp này chính là sự thích ứng của vi khuẩn với điều kiện nuôi cấy mới; sự thích ứng đó có liên quan đến việc tổng hợp các enzyme mới mà trước đây tế bào chưa cần. Các enzyme mới này được tổng hợp nhờ sự cảm ứng của các cơ chất mới.

Ví dụ: Nếu chuyển các tế bào đang sinh trưởng logarid từ môi trường khoáng - glucose sang môi trường khoáng - maltose ta sẽ thấy xuất hiện pha lag, đây là thời gian cần cho việc hình thành enzyme maltase (α- glucozidase).

Đặc trưng của hiện tượng sinh trưởng kép là đường cong sinh trưởng gồm hai pha lag và hai pha log. Sau khi kết thúc pha log thứ nhất tế bào lại mở đầu pha lag thứ hai và tiếp tục pha log thứ hai (hình 4.2).

Hình 4.2 Đường cong sinh trưởng kép

E. coli trong môi trường hỗn hợp glucose - sorbitol (bên trái) Aerobacter aerogenes trong môi trường hỗn hợp muối ammon và

Hiện tượng sinh trưởng kép thường gặp khi nuôi cấy vi khuẩn trong

môi trường chứa nguồn carbon gồm một hỗn hợp của hai chất hữu cơ khác nhau. Khi sinh trưởng tế bào sẽ đồng hóa trước tiên nguồn carbon nào mà chúng “ưa thích” nhất. Đồng thời cơ chất thứ nhất này đã kìm hãm các enzyme cần cho việc đồng hóa cơ chất thứ hai. Chỉ sau khi nguồn carbon thứ nhất đã cạn thì nguồn carbon thứ hai mới có thể cảm ứng tổng hợp nên các enzyme cần trong việc chuyển hóa nó.

Hiện tượng sinh trưởng kép không chỉ hạn chế ở các nguồn carbon và năng lượng mà thấy ở các nguồn nitơ và phôtpho. Chẳng hạn Aerobacter aerogenes có thể sử dụng nguồn nitơ là amino acid, muối ammon và nitrate. Nếu khi cấy chuyển vi khuẩn từ môi trường nước thịt sang môi trường chứa muối ammon hoặc nitrate thì pha lag sẽ biểu hiện.

94

Nếu từ môi trường nước thịt sang môi trường chứa hỗn hợp cả hai loại muối sẽ thấy có hiện tượng sinh trưởng kép. Các ion NH4

+ được đồng hoá trước đồng thời kiềm chế việc tổng hợp cảm ứng enzyme nitrate - reductase. Chỉ sau khi hết muối ammon trong môi trường thì muối nitrate mới được sử dụng.

Sinh trưởng kép là hiện tượng phổ biến và có thể giải thích bằng cơ chế kiềm chế nói chung và đặc biệt bằng hiệu ứng glucose.

* Pha logarid (pha log) Trong pha này vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa,

nghĩa là sinh khối và số lượng tế bào tăng theo phương trình: N = No.2ct hay X= Xo.eut Kích thước của tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý... nói

chung không thay đổi theo thời gian. Tế bào ở trạng thái động học và được coi như là “những tế bào tiêu chuẩn”.

* Pha ổn định (pha cân bằng) Trong pha này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số

tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Kết quả là số tế bào sống không tăng cũng không giảm. Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Cho nên khi giảm nồng độ cơ chất (trước khi cơ chất bị cạn hoàn toàn) tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm. Do đó việc chuyển từ pha log sang pha ổn định diễn ra dần dần.

Nguyên nhân tồn tại của pha ổn định rõ ràng là do sự tích lũy sản phẩm độc của trao đổi cơ chất (các loại rượu, acid hữu cơ) và việc cạn chất dinh dưỡng (thường là chất dinh dưỡng có nồng độ thấp nhất). Nguyên nhân thứ nhất rất phức tạp và khó phân tích, nguyên nhân thứ hai đã được nghiên cứu kĩ hơn.

* Pha tử vong Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa

(mặc dù số lượng tế bào tổng cộng có thể không giảm). Đôi khi các tế bào bị tự phân nhờ các enzyme của bản thân. Ở các vi khuẩn sinh bào tử quá trình phức tạp hơn do sự hình thành bào tử.

Thực ra chưa có một qui luật chung cho pha tử vong. Sự chết của tế bào có thể nhanh hay chậm, có liên quan đến sự tự phân hay không tự phân. Do sức sống lớn bào tử bị chết chậm nhất (trong những điều kiện thích hợp như khô và nhiệt độ thấp bào tử có thể có khả năng sống vài trăm năm). Nguyên nhân của pha tử vong chưa thật rõ ràng, nhưng có liên

95

quan đến điều kiện bất lợi của môi trường. Trong trường hợp môi trường tích lũy các acid nguyên nhân của sự chết tế bào tương đối dễ hiểu. Nồng độ chất dinh dưỡng thấp dưới mức cần thiết cho hậu quả làm giảm hoạt tính trao đổi chất, phân hủy dần dần các chất dự trữ và cuối cùng dẫn đến sự chết của hàng loạt tế bào. Ngoài đặc tính của bản thân chủng vi khuẩn, tính chất của các sản phẩm trao đổi chất tích lũy lại cũng ảnh hưởng đến tiến trình của pha tử vong.

Một số enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác cực đại trong pha tử vong như deaminase, decarboxylase, các amylase và protease ngoại bào. Ngoài chức phận xúc tác một số quá trình tổng hợp những enzyme nói trên chủ yếu xúc tác cho quá trình phân giải.

Tốc độ tử vong của tế bào có liên quan trực tiếp đến thực tiễn vi sinh vật học và kĩ thuật, đó là vấn đề bảo quản các chủng vi sinh vật quan trọng về mặt lí thuyết (các chủng và các biến chủng đặc biệt) và kĩ thuật (các chủng sinh chất kháng sinh, amino acid, vitamin... với sản lượng cao). Ngoài khả năng sống ta còn cần bảo quản cả các đặc tính di truyền của vi khuẩn với nhiều phương pháp bảo quản khác nhau, nhưng tất cả đều nhằm làm giảm trao đổi chất đến tối thiểu chủ yếu bằng cách giảm nhiệt độ và độ ẩm 4. Các thông số của đường cong sinh trưởng

Sản lượng tế bào được tính bằng hiệu giữa khối lượng cực đại (Xmax) và khối lượng ban đầu (X0) khi nuôi cấy vi khuẩn (tính bằng gam):

X = Xmax - X0

Tỷ số giữa sản lượng tế bào (X) với lượng cơ chất đã được dùng (S) (tính bằng đơn vị trọng lượng) gọi là hệ số kinh tế (Y).

Y = SX

Nếu sản lượng tính bằng gam và cơ chất đã dùng tính bằng mol thì gọi là hệ số kinh tế mol (Ym).

Hệ số kinh tế mol (Ym) cho phép ta liên hệ sản lượng tế bào với số lượng ATP thu được do phân giải một lượng cơ chất nào đó. Ta có thể tính được sản lượng tế bào (tính bằng gam) cho 1 mol ATP đã tiêu thụ. Đại lượng này gọi là hệ số năng lượng (YATP). Hệ số năng lượng được tính dễ dàng nếu ta biết con đường phân giải của loại cơ chất và năng lượng ATP sinh ra do sự phân giải ấy.

Hằng số tốc độ sinh trưởng của tế bào vi sinh vật trong pha log được tính theo công thức:

96

μ = )(

lnln

0

0

ttXXt

−−

= )(lg

lglg

0

0

tteXXt

−−

Trong công thức: X0 và Xt là mật độ huyền phù tế bào tại các thời điểm t0 và t, và lge = 0.43429.

Thời gian của pha lag (T1). Đây là một thông số quan trọng để xem xét tính chất của vi khuẩn và

môi trường nuôi cấy có thích hợp hay không. Thông số này được xác định bằng hiệu giữa thời điểm tr (tại đây huyền phù tế bào có mật độ xác định nào đó xr) và ti (tại đây khối tế bào có thể đạt đến mật độ mà sau đó nếu đem nuôi cấy thì chúng bắt đầu pha log ngay).

T1 = tr – ti = tn - μ0lnln xxr −

Vì T1 chỉ thuận lợi để so sánh 2 giống với cùng tốc độ sinh trưởng log giống nhau, nên người ta thường biểu thị thời gian của pha lag không phải thời gian tuyệt đối, mà là thông qua thời gian sinh lý (thời gian của 1lứa g). Hiệu giữa sự sinh trưởng thực tế và lý thuyết là L = T1 x v.

Đại lượng L chỉ cho biết giống phát triển trong thực tế chậm hơn phát triển theo lý thuyết bao nhiêu thế hệ tại thời điểm cuối pha lag và chuyển vào đầu pha log. Thông số này thường dùng để so sánh các số liệu nói về ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng khác nhau, các chất ức chế sinh trưởng và điều kiện nuôi cấy. 5. Sinh trưởng của vi khuẩn trong nuôi liên tục

Trong phương pháp nuôi cấy tĩnh nói trên, các điều kiện môi trường luôn luôn thay đổi theo thời gian, mật độ vi khuẩn tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Vi khuẩn phải sinh trưởng và phát triển theo một số pha nhất định, sinh khối đạt được không cao. Tuy nhiên trong nhiều nghiên cứu và thực tiễn sản xuất ta cần cung cấp cho vi sinh vật những điều kiện ổn định để trong một thời gian dài chúng vẫn có thể sinh trưởng trong pha log. Dĩ nhiên trong một mức độ nào đó có thể cấy chuyền tế bào nhiều lần (qua những khoảng thời gian ngắn) vào môi trường dinh dưỡng mới. Nhưng đơn giản hơn, người ta đưa môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy vi khuẩn đồng thời loại khỏi bình một lượng tương ứng dịch vi khuẩn. Đây chính là cơ sở của phương pháp nuôi cấy liên tục trong chemostas và turbidostas.

Cơ sở của phương pháp nuôi liên tục: giả sử ta có một bình nuôi cấy trong đó vi khuẩn đang sinh trưởng phát triển. Cho chảy liên tục vào bình môi trường mới có thành phần không đổi. Thể tích bình nuôi cấy được giữ

97

không đổi, nghĩa là bình môi trường đi vào đã được bù bởi dòng môi trường đi ra với cùng một tốc độ.

Ta gọi thể tích bình là v (lít), tốc độ dòng đi vào là f (lít/giờ). Do đó tốc độ pha loãng (còn gọi là hệ số pha loãng) D = f/v (đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau một giờ).

Nếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi bình nuôi cấy với thể tích:

v- = - dtdX = D.X

Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình giảm, ta có công thức tính: X = X0. e-Dt

Tốc độ sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong bình biểu thị bởi phương trình:

v+ = dtdX = μ.X

Như vậy mật độ vi khuẩn trong bình tăng theo phương trình: X = X0. eμt

Tốc độ thay đổi cuối cùng (tăng hoặc giảm) mật độ vi khuẩn trong nuôi cấy liên tục là sự sai khác giữa độ tăng v+ và độ giảm v-:

v = v+ - v- = dtdX = (μ - D).X

Nếu μ > D => v > 0: mật độ vi khuẩn trong bình tăng. Nếu μ < D => v < 0: mật độ vi khuẩn trong bình giảm. Nếu μ = D => v = 0: mật độ tế bào không tăng không giảm theo thời

gian, quần thể vi khuẩn ở trong trạng thái cân bằng động học. Nếu bình thí nghiệm có thiết bị duy trì μ luôn luôn bằng D ta sẽ thu

được quần thể vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, thường xuyên ở một mật độ tế bào không đổi và không phụ thuộc và thời gian. Trong trường hợp như vậy không những kích thước trung bình của tế bào, trạng thái sinh lý của chúng mà cả môi trường nuôi cấy đều không đổi và không phụ thuộc vào thời gian. Điều này, một mặt tạo điều kiện cho việc nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý của tế bào vi khuẩn, mặt khác cải thiện quá trình sản xuất vi sinh vật ở qui mô công nghiệp.

Chemostas và turbidostas là hai thiết bị nuôi cấy trong đó ta có thể duy trì được điều kiện μ = D.

Nuôi cấy tĩnh được xem như hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng phải trải qua các pha mở đầu, logarid, ổn định và tử vong. Mỗi pha

98

sinh trưởng được đặc trưng bởi những điều kiện nhất định. Việc điều khiển tự động khó thực hiện.

Nuôi cấy liên tục, trái lại, là hệ thống mở có khuynh hướng dẫn đến việc thiết lập một cân bằng động học. Yếu tố thời gian ở đây trong phạm vi nhất định bị loại trừ. Tế bào được cung cấp những điều kiện môi trường không đổi, nhờ việc điều chỉnh tự động (hình 4.3).

TurbidostChemosta

Hình 4.3 Nuôi cấy liên tục trong chemostas (trái) và

turbidostas (phải) V. Sự kìm hãm sinh trưởng và sự diệt khuẩn 1. Các phương pháp khử trùng 1.1. Khử trùng bằng nhiệt

- Khử trùng bằng phương pháp Pasteur Cơ sở của phương pháp này là làm nóng vật liệu ở nhiệt độ dưới

1000C nhằm tiêu diệt tất cả các vi sinh vật trong các môi trường dễ bị hỏng khi đun sôi như sữa, bia, rượu vang... Khử trùng kiểu Pasteur có thể ở 600C trong 30 phút hoặc 750C trong 15 phút hay 800C trong 10 phút.

- Khử trùng bằng cách đun sôi Người ta dùng nồi Koch hay nồi Arnola để khử trùng. Nồi hấp được

cấu tạo bằng thùng hai vỏ kim loại. Nước ở thùng ngoài được đun sôi, hơi nước sẽ vào thùng trong. Nhiệt độ hơi nước sôi không vượt quá 1000C. Ở

99

nhiệt độ này tế bào sinh dưỡng bị tiêu diệt, nhưng bào tử vẫn còn khả năng nảy mầm. Ngoài phương pháp trên người ta còn có thể đun sôi trực tiếp các dụng cụ bằng kim loại, cao su, kim tiêm và xylanh trong thời gian khoảng 10 phút.

- Khử trùng bằng phương pháp hấp gián đoạn Các môi trường dinh dưỡng, các ống bằng cao su và một số dụng cụ

dễ bị hỏng khi khử trùng ở nhiệt độ cao. Vì vậy cần phải khử trùng bằng cách đun sôi lặp lại 3 lần trong 3 ngày kế tiếp nhau. Lần đun thứ nhất trong 30 - 45 phút làm cho các tế bào sinh dưỡng đều bị chết, nhưng bào tử vẫn còn sống. Sau đó để môi trường, dụng cụ đã khử trùng vào tủ ấm 28 - 300C. Ở nhiệt độ này trong môi trường thích hợp, các bào tử sẽ nảy mầm. Trong lần khử trùng thứ hai các tế bào vừa mới nảy mầm lại bị tiêu diệt. Để đảm bảo hoàn toàn vô trùng ta tiếp tục khử trùng lần thứ 3 trong ngày thứ 3 kế tiếp.

- Khử trùng bằng nồi hấp áp lực (Autoclave) Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm nóng môi trường bằng

hơi bão hòa ở áp suất cao hơn 1atm. Nồi hấp áp lực cao làm bằng kim loại, có hai vỏ và có khả năng giữ áp suất cao. Vỏ trong là thùng khử trùng, nơi để các dụng cụ, môi trường cần khử trùng. Thùng khử trùng có nắp van thoát khí, có áp kế để xác định áp suất hơi nước, có van bảo hiểm để xì hơi khi áp suất quá mức cần thiết và để nồi khỏi bị nổ. Khoảng trống giữ hai lớp vỏ là ngăn chứa hơi nước được nối với phểu. Nước trong nồi phải đủ đến mức quy định đã khắc trên ống đo nước, phía trên của thùng có lỗ để đưa hơi nước vào thùng trong. Nồi hấp được đậy kín bằng các khóa van xung quanh.

Chuẩn bị môi trường để khử trùng: các dụng cụ chứa môi trường chỉ được chứa đến 2/3 thể tích và nút kín bằng nút bông. Nút bông không được chặt quá để khỏi ngăn cản sự cung cấp ôxy cho vi sinh vật và không lỏng quá dễ bị vi sinh vật bên ngoài xâm nhập vào môi trường, đáy nút bông phải gọn tròn không dài quá hoặc ngắn quá. Khi phân phối môi trường tuyệt đối không để môi trường dính vào miệng ống nghiệm, bình hay nút bông. Dụng cụ xếp vào nồi khử trùng phải ngay ngắn, không xếp quá sít nhau, để cho hơi nước dễ đi qua. Khi khử trùng bằng nồi áp lực cao, áp suất trong nồi tăng lên làm cho nhiệt độ tăng theo.

Khi chọn chế độ khử trùng phải chú ý pH của môi trường, pH dưới 5,5 thạch bị thủy phân và khi nguội không có khả năng tạo gel. Nếu môi trường kiềm, khi khử trùng sẽ gây kết tủa sắt, caramen hóa đường. Để tránh các hiện tượng trên, trong khi khử trùng phải để môi trường có pH trung tính, sau khi khử trùng phải trung hòa lại môi trường đến mức pH

100

cần thiết. Môi trường sau khi khử trùng được giữ trong tủ ấm 300C trong 2-3 ngày để kiểm tra độ vô trùng.

- Khử trùng bằng sức nóng khô Cách khử trùng này tiến hành trong tủ sấy ở nhiệt độ 160 - 1700C

trong 2 - 3 giờ. Ở điều kiện này các tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi sinh vật đều bị tiêu diệt. Cách khử trùng này được sử dụng để khử trùng các dụng cụ thủy tinh. Ống nghiệm, bình tam giác trước khi khử trùng cần được nút kín bằng nút bông. Các pipette, hộp petri, que gạt phải được gói kín bằng giấy báo, trước khi sử dụng mới được mở ra.

- Khử trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa Cách khử trùng này dùng để khử trùng que cấy vi sinh vật, các dụng

cụ bằng sắt (kim, kẹp, gắp, dao, kéo...), một số dụng cụ thủy tinh (đũa thủy tinh, que gạt...). Muốn khử trùng ta đưa đi đưa lại nhiều lần dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, bằng cách này mọi vi sinh vật bám trên bề mặt dụng cụ đều bị tiêu diệt. 1.2. Khử trùng không bằng nhiệt

- Dùng nến lọc vi khuẩn Một số chất hữu cơ như huyết thanh, albumine trong môi trường dễ

bị biến tính khi khử trùng bằng nhiệt độ cao nên phải khử trùng bằng cách lọc qua các dụng cụ lọc vi khuẩn. Các lỗ của màng lọc nhỏ hơn kích thước của tế bào vi khuẩn. Loại dụng cụ thường dùng hiện nay là loại lọc seltz, loại này có 2 bộ phận. Một bộ phận hình viên trụ ở phía trên, dùng để chứa dịch lọc, một bộ phận hình phễu ở phía dưới. Hai bộ phận được gắn vào nhau và được cố định lại nhờ 3 đinh ốc. Mỗi lần lọc, người ta đặt vào giữa 2 bộ phận một màng lọc tròn bằng amian hay bằng nitrocellulose dày khoảng 3 - 5cm (màng lọc chỉ dùng một lần).

- Khử trùng bằng hóa chất Hóa chất được dùng để khử trùng bảo quản nguyên vật liệu và để

làm sạch phòng thí nghiệm, bệnh viện. Khi sử dụng hóa chất cần lưu ý tới nồng độ thích hợp, không gây độc đối với con người. Sàn nhà, bàn ghế trong phòng được lau bằng các dung dịch sát trùng như chloramine 0,5 - 3%, hoặc nước phenol 3 - 5%. Sử dụng cồn sát trùng để lau các dụng cụ thủy tinh như que gạt, phiến kính, lá kính, đũa thuỷ tinh...

- Khử trùng bằng tia tử ngoại, ánh sáng mặt trời Tia tử ngoại có bước sóng 13 - 400 nm đều có tác dụng diệt khuẩn.

Để khử trùng buồng nuôi cấy, phòng thí nghiệm, người ta chiếu tia tử ngoại trong khoảng 30 - 40 phút.

101

Tia sáng mặt trời có bước sóng 330 - 400 nm cũng có tác dụng diệt khuẩn. Vì thế trong một số trường hợp người ta có thể phơi nắng các dụng cụ của phòng thí nghiệm 2 - 3 giờ sau khi đã được rửa sạch. 2. Các phương pháp bảo quản

1. Cấy truyền thường xuyên trên thạch nghiêng hoặc trích sâu vào thạch. Sau khi đã sinh trưởng vi khuẩn được giữ trong tủ lạnh +40C. Phương pháp này đơn giản nhất và thường được dùng nhưng kém hiệu quả nhất.

2. Bảo quản dưới dầu vô trùng: dầu paraffin vừa ngăn cản môi trường khô vừa làm giảm trao đổi chất gây cản trở sự xâm nhập của ôxy.

3. Bảo quản trong cát hoặc đất sét vô trùng: do cấu trúc lí - hóa cát và đất sét đều là những vật chất tốt mang các tế bào vi sinh vật, chủ yếu là các bào tử. Sau khi làm khô không khí cát (hoặc đất sét) cùng với vi khuẩn có thể bảo quản tế bào rất lâu.

4. Đông khô: là phương pháp hoàn thiện và có hiệu quả nhất. Vi khuẩn được trộn với môi trường thích hợp (sữa, huyết thanh...) rồi làm lạnh và làm khô nhờ băng khô. Sau mấy năm bảo quản tế bào vẫn giữ được khả năng sống mà không bị biến đổi về di truyền.

5. Bảo quản trong glycerine (10%) và giữ trong tủ lạnh sâu (-600C hay - 800C): đây là phương pháp rất thích hợp nhưng cần mua được loại ống nhựa chịu nhiệt (khi khử trùng).

Câu hỏi ôn tập chương 4

1. Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật? 2. Các cơ chất dinh dưỡng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh

vật? 3. Cơ chế và tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên sinh trưởng và

phát triển của vi sinh vật? 4. Các pha sinh trưởng của vi sinh vật, điểm khác biệt của phương

pháp nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy liên tục? 5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đường cong sinh trưởng, hiện tượng

sinh trưởng kép?

102

Chương 5 Trao đổi chất ở vi sinh vật

I. Các con đường phân giải hexose 1. Con đường Embden - Meyerhof - Parnas (EMP hay đường phân)

1.1 Cơ chế (hình 5.1) Glucose (1) Glucose - 6 P

(2) Fructose - 6P ATP (3) ADP Fructose - 1,6 DP (5) (4) (AlPG) Glyceraldehyd - 3P Dioxy acetone – P (DAP) H3PO4 NAD (6)

NADH2

a. 1,3 diphosphoglyceric (a. 1,3DPG) ADP (7)

ATP a.3 P - Glyceric (A3PG)

(8) a.2P- Glyceric (A2PG) (9) Phosphoenolpyruvic (PEP) (10) ADP A TP

Trong điều kiện có hoặc không có O2, glucose đều được chuyển

thành pyruvate qua 10 phản ứng, trong đó 3 phản ứng 1, 3 và 10 là phản ứng một chiều, còn các phản ứng khác là phản ứng thuận nghịch. Trừ chất

a. Pyruvic

Hình 5.1: Con đường EMP

103

đầu và chất cuối, tất cả các chất trung gian trong chu trình đều ở dạng phosphoryl hóa. Gốc phosphoryl mang 3 chức năng là giúp cho chất trung gian mang điện tích âm cao không thể thoát ra ngoài, là vị trí gắn enzyme và là vị trí cung cấp liên kết cao năng.

Phương trình chung: Glucose 2 pyruvate + 2ATP + 2 NADH2

ATP được tạo thành từ 2 phản ứng 7 và 10. Sự tạo thành ATP ở 2 phản ứng trên gọi là phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất vì phosphate cao năng trước đó là một phần của phân tử chất trao đổi (1,3 di - P - glycerate và PEP), khi có mặt của ADP thì chất trao đổi sẽ chuyển gốc P cho ADP tạo thành ATP.

Có thể chia con đường EMP thành 4 giai đoạn: 1. Hoạt hóa glucose tạo fructose - 1,6 diphosphate (có thể xẩy ra ở

nhiều monosaccharide khác). 2. Bẻ đôi phân tử fructose - 1,6 diphosphate tạo AlPG và DAP. 3. Ôxy hóa AlPG thành A2PG. 4. Chuyển hóa A2PG tạo acid pyruvic (hình 5.1).

1.2. Ý nghĩa của con đường EMP - Quá trình đường phân cung cấp cho tế bào 6 trong số 12 tiền chất

dùng để tổng hợp các đơn vị kiến trúc: glucose - 6-P, fructose - 6-P, 3-P-glyceraldehyd, 3P - glycerate, PEP, pyruvate.

- Cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của tế bào tuy hiệu suất không cao (khoảng 10%), nhưng đây là con đường nguyên thủy nhất gặp ở hầu hết sinh vật. 2. Con đường pentosophosphate ôxy hoá (PP, HMP)

Do một đột biến nào đó (thiếu enzyme) mà một số vi sinh vật có thể chuyển hóa glucose thành pyruvate theo con đường PP (hình 5.2).

Từ glucose qua quá trình decarboxyl hóa tạo ribuloso - 5P và CO2. Các phản ứng tiếp theo là sự chuyển hóa giữa pentoso- 5P và hexoso - 6P.

Ý nghĩa của chu trình: Xét về mặt năng lượng, từ 1 phân tử glucose khi phân giải tạo 35 ATP nhưng qua con đường này tạo riboso - 5P tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid nucleic, tạo các loại đường C4, C7... tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid amin. Con đường này tạo NADPH2 cần thiết cho các phản ứng sinh tổng hợp trong tế bào. Đây là con đường phân giải đường thường gặp ở vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas.

104

Phương trình tổng quát: Glucose + 6O2 6CO2 + 6H2O + 35ATP

Glucose

Erytros

Glucose

Glucose

Fructos Frutose

Fructos Fructos

Erytrose

Ribulose

Xilulose

Xilulose

Xilulose

Xilulose

Ribose

Ribose

Hình 5.2 Con đường pentosophosphate

3. Con đường KDPG (2keto - 3deoxy - 6Pgluconate) Phương trình tổng quát như sau:

Glucose 2 Pyruvate + ATP + NADH2 + NADPH2 Con đường KDPG giúp cho nhiều vi khuẩn sử dụng gluconate và chỉ

gặp ở một số vi khuẩn. Ở E. coli và nhiều loài của Clostridium chuyển hóa glucose qua con đường EMP nhưng phân giải gluconate qua con đường KDPG. Qua các con đường phân giải glucose, pyruvate được tạo thành.

Nếu trong điều kiện hiếu khí các vi sinh vật sẽ ôxy hoá pyruvate tạo CO2 và nước. Nếu điều kiện kị khí các vi sinh vật sẽ tiến hành quá trình lên men hoặc hô hấp kị khí (hình 5.3).

105

Glucose

Glucose -6- h h

6 - phosphoglucono-18-lactose

6 - phosphogluconate

2-keto-3 deoxy-6-phosphogluconate

pyruvate Glyceraldehyd

1,3

3-phosphoglycerat 2-phosphoglycerate

Phosphoenol-pyruvate

Hình 5.3 Con đường KDPG

4. Ôxy hoá pyruvate Pyruvate chiếm vị trí trung tâm trong trao đổi chất trung gian và là

tiền chất của nhiều sản phẩm. Nhiều vi sinh vật ôxy hóa pyruvate thành acetyl - CoA chủ yếu qua 3 phản ứng sau (hình 5.4):

106

Pyruvate +CoA+NAD+ Acetyl - CoA + NADH2 + CO2 (1) Pyruvate + CoA + 2Fd Acetyl - CoA + 2FdH + CO2 (2) Pyruvate + CoA + NAD+ Acetyl - CoA + formate (3) (Formate - Fd - ferredoxin)

Hình 5.4 Quá trình ôxy hóa pyruvate

Pyruvate- carboxylase

Vòng tiasolium củ

a thiamin pyrophosphate

Acid acet

yl-lipoic

Dihydrolipoid- transacetylase

Acid dihydrolipoic

Enzyme

Acid lipoic

Dihydrolipoid-

dehydrogenas

Enzyme Enzyme

Enzyme

Pyruvate Phản ứng (1) do phức hệ pyruvate - dehydrogenase (PDH) xúc tác.

PDH gặp ở hầu hết vi sinh vật hiếu khí (không gặp ở vi khuẩn kị khí bắt buộc). PDH gồm 3 enzyme, ngoài CoA và NAD+ còn cần TPP (thiamine -pyrophosphate) và acid lipoic. Phản ứng (2) xúc tác bởi pyruvate - Fd - oxidoreductase, enzyme này gặp nhiều ở vi khuẩn kị khí như Clostridium. Phản ứng (3) do pyruvate - formate - liase xúc tác, enzyme này gặp nhiều ở vi khuẩn kị khí tiết acid formic (thuộc họ Enterobacteriaceae) và vi khuẩn quang năng.

107

II. Chu trình tricarboxylic (Krebs)

Trong quá trình ôxy hóa hoàn toàn, pyruvate sẽ được ôxy hoá triệt để thông qua chu trình Krebs (chu trình acid tricarboxylic = ATC).

Cơ chế được trình bày ở hình 5.5.

Hình 5.5 Chu trình Krebs (theo Lehninger)

Trong chuỗi phản ứng vòng của chu trình ATC, acid pyruvic bị phân huỷ triệt để tạo CO2, coezyme dạng khử và các hợp chất trung gian. Các coezyme thông qua chuỗi hô hấp vận chuyển H và electron đến cho O2 phân tử tạo nước đồng thời giải phóng năng lượng ATP.

108

Ý nghĩa của chu trình: Ngoài chức năng ôxy hóa tận cùng, chu trình ATC còn cung cấp cho tế bào 3 tiền chất là oxalacetate (tổng hợp aspactate), α - ketoglutarate và succinyl - CoA (tổng hợp nhân hem). Về năng lượng, chu trình cung cấp 1ATP ở mức độ phosphoryl hóa cơ chất nhưng sản sinh NADH2 để đi vào chuỗi vận chuyển electron tạo ATP.

Trong điều kiện kị khí chu trình TCA không có chức năng sinh năng lượng nhưng cũng phải cung cấp cho tế bào 3 tiền chất trên. Tế bào phải sử dụng phần lớn pyruvate để lên men thu năng lượng, còn phần nhỏ chuyển thành acetyl - CoA nhờ pyruvate - ferredoxin - oxidoreductase.

Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí ôxy hóa chất dinh dưỡng hữu cơ thành CO2 và H2O (vì carbon trong phân tử CO2 đạt mức độ ôxy hóa cao nhất nên người ta gọi là quá trình ôxy hóa hoàn toàn). Một số vi sinh vật có khả năng ôxy hóa cơ chất trong điều kiện hiếu khí nhưng lại sinh ra các sản phẩm chưa được ôxy hóa hoàn toàn (ketoacid, acid gluconic, acid malic, acid fumaric...). Nhiều quá trình ôxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men vì chúng sản sinh ra nhiều sản phẩm có giá trị. III. Chuỗi hô hấp (respiratory chain) và phosphororyl hóa ôxy hóa (oxidative phosphorylation)

Khác với vi khuẩn kị khí, vi khuẩn hiếu khí có thể tổng hợp ATP mạnh mẽ hơn nhiều nhờ có chuỗi hô hấp và ATP - synthetase. Hai hệ thống này nằm ở màng tế bào Prokaryota hoặc màng trong ti thể của tế bào Eukaryota. Năng lượng thoát ra được chuyển thành ATP, một phần nhỏ giải phóng ra ở dạng nhiệt. Các thành phần của chuỗi nằm trong lớp lipid kép, gồm nhiều enzyme vận chuyển electron và hydro, các coenzyme và nhóm thêm, các dehydrogenase và hệ thống vận chuyển. Các thành phần quan trọng nhất tham gia vào ôxy hóa hydro là :

- Flavoprotein là các enzyme chứa nhóm thêm là FMN hoặc FAD - vận chuyển hydro.

- Protein Fe-S vận chuyển electron, chứa nguyên tử Fe, vừa liên kết với S của cysteine vừa liên kết với S của H2S. Cysteine là một phần của chuỗi polypeptide, có thể coi trung tâm Fe - S là nhóm thêm của chuỗi polypeptide. Các protein Fe - S cũng tham gia vào sự cố định N, khử sulphite, khử nitrite, quang hợp...

- Quinol: nằm ở màng trong của ti thể, ở vi khuẩn G- là ubiquinol (CoQ), vi khuẩn G+ là naphtoquinol và ở lục lạp là plastoquinol. Quinol, đặc biệt là CoQ có đặc tính ưa lipid do đó lắp vào lớp lipid kép của màng, vận chuyển hydro hoặc enzyme.

109

- Cytochrome: vận chuyển electron, không vận chuyển hydrogen. Cytochrome nhận electron từ quinol, trong quá trình vận chuyển một số lượng H+ tương đương với số lượng electron bị tách vào môi trường (hình 5.6).

Cyt Cyt Cyt Cyt

Hình 5.6 Sơ đồ chuỗi hô hấp

Trong quá trình vận chuyển 2[H] từ NADH2 đến O2 có 3 bước

chuyền electron liên quan đến tạo thành ATP và được biểu thị bằng hệ số P/O (mol ATP/mol nguyên tử O). Hệ số P/O = 3 khi 2[H] được chuyền qua NAD+ và P/O = 2 khi 2[H] từ succinate qua FAD đến O2. Do đó 1mol glucose khi phân giải qua chu trình EMP và TCA với tất cả [H] tách ra được chuyển vào chuỗi hô hấp để tạo thành nước sẽ tạo 38 ATP. Sự tính toán trên đúng với ti thể và một số vi khuẩn. Tuy nhiên, ở một số vi khuẩn do chỉ có 2 vị trí phosphoryl hóa nên sự hô hấp hiếu khí glucose chỉ cho 26 ATP (như ở E. coli không có NAD, Proteus vulgaris không có cytochrome C).

Cơ chế phosphoryl hoá ôxy hoá (sự tạo thành ATP trong chuỗi hô hấp) được giải thích theo thuyết hoá thẩm thấu của Mitchell (1979). Theo thuyết này, màng tế bào vi khuẩn và màng trong ti thể không thấm các ion kể cả H+ và OH- và kém dẫn điện. Sự sắp xếp các protein của màng (các thành phần vận chuyển electron, permease, ATP - sinthetase...) khiến màng mang tính chất không đối xứng. Sự định hướng không gian của các phân tử enzyme dẫn đến trao đổi chất có đặc tính vectơ. Chuỗi hô hấp bao gồm một dãy các chất vận chuyển hidro và electron sắp xếp luân phiên trong màng. Do sự ôxy hoá cơ chất mà phía trong màng có sự tiêu thụ H+ và phía màng ngoài giải phóng H+. Trong sự ôxy hoá NADH2, 6H+ đã

110

được vận chuyển ra phía ngoài qua 3 núm. Việc vận chuyển proton do hô hấp làm xuất hiện một gradien điện hoá giữa 2 phía của màng. Thế proton này sẽ là động lực của sự phosphoryl hoá nghĩa là sự tạo thành ATP. Quá trình được xúc tác bởi ATP - sinthetase, enzyme này chuyển năng lượng phát ra từ dòng electron thành liên kết esterphosphate cao năng của ATP. ATP - sinthetase gặp ở các màng tham gia vào sự chuyển hoá năng lượng là màng ti thể, lục lạp và màng tế bào vi khuẩn. Có lẽ, dòng H+ từ ngoài đã đi qua rãnh của ATP - sinthetase trở vào bên trong ti thể hoặc vi khuẩn, năng lượng thoát ra được dùng cho phản ứng phosphoryl hoá tạo ATP. IV. Sự vận chuyển chất dinh dưỡng vào tế bào

Để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, tế bào vi sinh vật phải thường xuyên trao đổi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng nhận các chất dinh dưỡng cần thiết từ môi trường, mặt khác chúng thải ra các sản phẩm trao đổi chất. Giữa môi trường xung quanh và môi trường bên trong tế bào tồn tại một hàng rào thẩm thấu, hàng rào này chính là màng tế bào chất.

Tế bào nhận và thải các chất một cách chọn lọc. Sự xâm nhập của nước và các chất hòa tan qua màng tế bào là một quá trình động học; tế bào sống không bao giờ ở trạng thái cần bằng với các chất của môi trường chung quanh. Sự vận chuyển các chất qua màng tế bào vi sinh vật tuân theo một trong hai cơ chế: khuếch tán đơn giản (hay còn gọi là vận chuyển thụ động hay vận chuyển xuôi dòng) và vận chuyển chủ động (vận chuyển ngược dòng).

Theo cơ chế khuếch tán thụ động các phân tử đi qua màng nhờ sự chênh lệch nồng độ (trong trường hợp các chất không điện phân) hay chênh lệch điện thế (trong trường hợp các ion) ở hai phía của màng. Hàng loạt nghiên cứu đã khẳng định, trừ nước ra rất ít hợp chất có thể được vận chuyển qua màng theo cơ chế nói trên.

Trái lại, đa số các chất hòa tan qua màng do cơ chế vận chuyển đặc biệt. Những phân tử vận chuyển sắp xếp trong màng liên kết với các phân tử chất hòa tan và chuyển chúng vào bề mặt bên trong của màng, từ đây các phân tử chất hòa tan được chuyển vào tế bào chất. Kiểu khuếch tán này được gọi là khuếch tán xúc tiến. Các phân tử protein vận chuyển (carrier protein) nói trên gọi là protein thấm – permease.

Sự vận chuyển các chất nhờ permease có thể là thụ động (không cần năng lượng của tế bào) hoặc chủ động (cần năng lượng). Theo cơ chế vận chuyển thụ động, chất hòa tan liên kết thuận nghịch vào một vị trí đặc biệt trên phân tử permease nằm ở bên trong màng (có thể ở các lỗ của màng). Phức hợp “chất hòa tan - permease” được vận chuyển theo hai phía của

111

màng nhờ sự chênh lệch nồng độ ở một chất nào đó, nghĩa là sự vận chuyển diễn ra theo kiểu “xuôi dòng”. Sự vận chuyển thụ động nhờ permease đã được chứng minh ở một số vi sinh vật.

Tuy nhiên, vi sinh vật có khả năng tích lũy một số chất với nồng độ cao hơn nhiều so với nồng độ bên ngoài. Chẳng hạn, nồng độ K+ bên trong một số tế bào vi sinh vật có thể lớn hơn nồng độ bên ngoài hàng ngàn lần. Để đảm bảo độ trung hòa điện, tế bào cũng đồng thời thải ra bên ngoài các ion H+ hoặc Na+. Thêm vào đó, người ta đã phát hiện thấy ở các màng vi khuẩn có hoạt tính của ATP - ase là enzyme có liên quan đến việc vận chuyển các chất.

Rõ ràng, trong tế bào vi sinh vật ngoài cơ chế vận chuyển thụ động còn tồn tại cơ chế vận chuyển chủ động nhờ permease. Sự vận chuyển này được tiến hành ngược với gradien nồng độ nghĩa là theo kiểu “ngược dòng”, năng lượng tiêu thụ có thể do ATP cung cấp.

Cho tới nay người ta đã phân lập được hàng loạt protein vận chuyển trong các loài vi sinh vật. Giống như enzyme, chúng có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau. Một số có tính đặc hiệu gần như tuyệt đối. Chẳng hạn, permease của galactose ở E.coli chỉ vận chuyển galactose. Các permease của các đường và acid amin khác thể hiện tính đặc hiệu yếu hơn đối với các chất hòa tan.

Điều đáng chú ý là trong vi khuẩn sự vận chuyển chủ động của hầu hết các loại đường phụ thuộc vào quá trình phosphoryl hóa và hệ thống enzyme phosphotransferase. Hệ thống này bao gồm hai enzyme EI, EII và một protein vận chuyển bền nhiệt (Hpr: heat stable carried protein) có khối lượng phân tử thấp. Các thành phần protein của hệ thống này đã được thuần khiết và phản ứng diễn ra theo hai bước.

Trước hết EI chuyển phosphate từ phosphoenolpyruvate (PEP) đến Hpr:

Hpr + PEP Hpr - P + Pyruvate Sau đó EII chuyển phosphate từ Hpr - P đến C6 của đường đơn. EI là chung cho nhiều loại đường nhưng EII lại đặc trưng cho mỗi

loại đường. Nghĩa là một đột biến nào đó ảnh hưởng đến việc tổng hợp EI sẽ dẫn đến mất khả năng vận chuyển nhiều loại đường. Trái lại với đột biến như thế đối với EII chỉ ảnh hưởng đến sự vận chuyển của một loại đường (hình 5.7).

112

Glucose

Hình 5.7 Sơ đồ vận chuyển đường qua màng tế bào vi sinh vật

pyruvic

Trong Màng

EII glucose

EII Glucose- 6P

PEP

Hpr-P

Hpr

Ngoài

V. Trao đổi chất và năng lượng 1. Các nguồn năng lượng ở vi sinh vật

Tùy theo bản chất của nguồn năng lượng sơ cấp, có hai con đường cơ bản để cung cấp cho vi sinh vật: con đường quang dưỡng và hóa dưỡng. Trong cả hai trường hợp, sự thu nhận năng lượng của tế bào được liên hệ với sự vận chuyển electron qua màng, do đó tạo ra một gradient electron proton từ phần này đối với phần kia của màng tế bào chất. Chính gradien nồng độ ion là nguồn gốc của lực bơm proton (sự khác biệt điện tích) có thể được dùng vào những mục đích khác nhau như vận chuyển tích cực, sản xuất các chất giàu năng lượng, chuyển động v.v.. .

Trong thế giới vi sinh vật có sự khác biệt rất lớn về khả năng sử dụng các nguồn năng lượng. Một số vi khuẩn hiếu khí cũng giống như động vật có khả năng tổng hợp ATP cho mình từ đường bị phân giải theo con đường đường phân (glycolyse) và chu trình Krebs nhờ chuỗi hô hấp trên màng tế bào chất (tương tự như chuỗi hô hấp ở màng trong của ty thể).

Còn những vi sinh vật kị khí lại thu năng lượng cho hoạt động sống của mình nhờ quá trình lên men của các loại đường hoặc nhờ một loại chuỗi vận chuyển electron trong đó có sử dụng các hợp chất không phải là ôxy phân tử làm chất nhận electron cuối cùng trong chuỗi vận chuyển. Ở đây, chuỗi vận chuyển cũng khu trú trên màng tế bào chất tương tự như chuỗi vận chuyển nằm trong các ty thể. Đối với các cơ thể quang dưỡng thì lại khác, chúng có thể thu nhận năng lượng của ánh sáng.

113

Đứng về quan điểm năng lượng sinh học, thì ty thể, lục lạp và tế bào vi khuẩn có nhiều nét tương đồng. Tất cả các vi khuẩn có trên màng tế bào chất một hệ enzyme ATP - synthetase tương tự như ATP - synthetase của các ty thể và lục lạp. Phức hợp protein vận chuyển qua màng đảm bảo biến đổi dòng proton thành năng lượng trong mối liên kết phosphate ở dạng ATP. 1.1.Các cơ thể quang dưỡng (phototroph) và quang tổng hợp (photosynthesis)

Hình thái của cơ thể quang dưỡng và quang tổng hợp giữa vi khuẩn, tảo, thực vật có sự khác biệt rõ ràng. Mặt khác, cấu tạo các cơ quan quang hợp, sắc tố quang tổng hợp, cũng khác biệt (xem chương II). Đối với thực vật, chất cho electron là H2O và quá trình quang hợp giải phóng ôxy phân tử. Đối với vi khuẩn quang hợp không thải ôxy và chất cho electron là những hợp chất vô cơ (như H2S, S) hoặc hợp chất hữu cơ (isopropanol) (xem thêm chương VII). 1.2. Các cơ thể hóa dưỡng và ôxy hóa sinh học

Phần lớn vi khuẩn không có cơ quan và sắc tố quang hợp. Chúng lấy năng lượng hữu ích cho các quá trình tổng hợp của tế bào nhờ giải phóng năng lượng trong các phản ứng hóa học.

Sự trao đổi chất của các cơ thể hoá dưỡng nói chung bao gồm 3 giai đoạn:

- Phân cắt các đại phân tử ở ngoài tế bào. - Phân giải các phân tử bé để tạo ra các chất trao đổi trung gian

(pyruvate, acetyl - CoA) và tạo năng lượng hữu ích (ATP). - Phân giải triệt để các chất trao đổi trung gian thành CO2 và H2O

với việc tạo ra lượng lớn ATP. Đó là những phản ứng ôxy hóa cơ chất hữu cơ và vô cơ.

Quá trình ôxy hóa một cơ chất A có thể xem là một chuỗi phản ứng mà trong đó cơ chất A mất đi các eletron của mình. Cơ chất A gọi là chất cho electron sẽ biến thành một sản phẩm được ôxy hóa. Tương tự, một hợp chất B khác gọi là chất nhận electron sẽ biến thành sản phẩm khử.

Trong phần lớn trường hợp, một hợp chất A là một chất hữu cơ có thể xem là chất được hydro hóa, như vậy thì quá trình ôxy hóa về thực chất là một quá trình khử hydro (dehydrogenation), trong khi đó quá trình khử là quá trình hydro hóa (hydrogenation), tổ hợp hai quá trình này là quá trình ôxy hóa khử (oxidoreduction).

Quá trình ôxy hoá:

114

- 2H+ AH2 (chất cho hydro) A (sản phẩm ôxy hoá) + Năng lượng - 2e Quá trình khử: + 2H+ B (chất nhận hydro) BH2 (sản phẩm khử) + 2e Kết quả: AH2 + B A + BH2 + Năng lượng Trong chuỗi phản ứng, việc vận chuyển hydro hay electron từ cơ

chất sang chất nhận được thực hiện nhờ hàng loạt enzyme, các enzyme này tạo thành chuỗi vận chuyển điện tử.

Các chất xúc tác thích ứng cao với quá trình ôxy hoá cơ chất là những dehydrogenase. Những enzyme này đặc trưng cho một loại cơ chất và tổ hợp với các coenzyme mà nó đóng vai trò là chất nhận hydro từ cơ chất. Đó là các dẫn xuất của flavin (FMN, FAD) hoặc của pyridine (NAD, NADP) và nhiều hợp chất khác. Ở các cơ thể hiếu khí, sự vận chuyển các electron giữa coenzyme của dehydrogenase và ôxy phân tử được thực hiện nhờ các hợp chất trung gian của cytochrome. 2. Các kiểu hô hấp

Thông thường khi chất nhận electron cuối cùng là ôxy phân tử thì gọi là quá trình hô hấp hiếu khí và vi sinh vật thuộc dạng này gọi là vi sinh vật hiếu khí (aerobes). Khi chất nhận electron cuối cùng là một cơ chất khác không phải là ôxy tự do, thì người ta gọi là quá trình lên men hoặc có thể là quá trình hô hấp kị khí và vi sinh vật thực hiện các quá trình này gọi là các cơ thể kỵ khí (anaerobes).

Trong số các cơ thể kỵ khí, chất nhận electron có thể là chất hữu cơ hoặc chất vô cơ. Nếu chất nhận electron là chất hữu cơ người ta gọi là lên men, nếu chất nhận là electron là chất vô cơ người ta gọi là hô hấp kỵ khí (anaerobic respiration).

Hô hấp của một cơ thể hiếu khí là một quá trình vận chuyển electron và proton qua màng với ôxy phân tử làm chất nhận electron cuối cùng, còn “hô hấp kỵ khí” dùng để chỉ một quá trình vận chuyển qua màng của các electron và proton đến chất nhận electron cuối cùng là một chất khác ôxy phân tử, như nitrate trong trường hợp hô hấp nitrate (nitrate respiration), fumarate như hô hấp fumarate (fumarate respiration ) v.v...

115

Rất nhiều vi sinh vật có nhiều chuỗi vận chuyển electron có thể cùng hoạt động, hoặc được hoạt động trong những điều kiện nuôi cấy nhất định.

Ví dụ như ở E. coli, vi khuẩn đường ruột này có chuỗi vận chuyển electron với ôxy phân tử là chất nhận electron cuối cùng (chuỗi hoạt động như cơ thể hiếu khí ) và chuỗi “hô hấp nitrate” hoạt động kỵ khí trong môi trường nitrate, một chuỗi “hô hấp fumarate”, hoạt động kỵ khí trên môi trường chứa cơ chất hữu cơ mà vi khuẩn này có thể lên men.

Hô hấp được đặc trưng trước hết là nơi khu trú của chuỗi vận chuyển electron ở màng tế bào chất đối với các cơ thể nhân sơ và ở màng trong của ty thể đối với các cơ thể nhân chuẩn. Hô hấp còn đặc trưng ở bản chất của chất nhận electron cuối cùng là ôxy phân tử. Sự ôxy hoá cơ chất và đồng thời sự khử của ôxy được thực hiện nhờ một chuỗi phản ứng enzyme, trong đó có sự tham gia của dehydrogenase và các coenzyme liên kết với nó.

Cơ chế thường thấy ở hô hấp là con đường của các cytochrome gián tiếp. Ngày nay người ta hoàn toàn biết rõ thành phần và cơ chế hoạt động của các cytochrome này trong tế bào nhân chuẩn và trong một số cơ thể nhân sơ.

Bên cạnh quá trình phosphoryl ôxy hoá cơ chất, còn tồn tại những con đường khác, đặc biệt là con đường ôxy hoá trực tiếp nhờ các enzyme vận chuyển các electron từ cơ chất đến ôxy với sự tạo thành H2O2 .

FADH2 + O2 FAD- oxydase FAD + H2O2

Hợp chất này rất độc và cần phải được phân giải nhờ catalase, peroxydase hoặc superoxyd dismutase tránh cho tế bào khỏi bị chết.

H2O2 catalase H2O + 1/2 O2

H2O2 + 2H+ + 2e- peroxydase 2H2O

Những con đường này tạo rất ít hoặc không tạo năng lượng hữu ích. Một vi khuẩn không có enzyme trên, nhưng con đường phân giải trên buộc chúng phải sống kỵ khí bắt buộc, bởi vì ôxy phân tử là tác nhân gây độc với chúng. Có một số vi khuẩn chịu được hiếu khí như Streptococcus, chúng không có catalase, nhưng có các enzyme flavin (NAD - oxydase và NAD - peroxydase) cho phép chúng thực hiện sự cân bằng trong hô hấp ở màng tế bào chất. Tuỳ thuộc vào số lượng và lượng các enzyme có thể phân giải H2O2 mà quyết định tính hiếu khí hay kỵ khí ở các vi khuẩn.

Lên men để chỉ sự có mặt của chuỗi vận chuyển electron nằm trong tế bào chất, không có sự tự động đi qua của dòng electron hoặc proton ở phần bên này và phần bên kia của màng tế bào (một dòng vận chuyển thứ

116

cấp được thiết lập nếu cần thiết, nhờ năng lượng của ATP). Về phương diện trao đổi năng lượng, đây cũng là một quá trình ôxy hóa khử, nhưng chất nhận electron cuối cùng là các hợp chất hữu cơ, chứ không phải là các phân tử ôxy. Quá trình này cũng giải phóng năng lượng nhưng ít hơn nhiều so với quá trình hô hấp. Các hợp chất cho electron (AH2) và chất nhận electron (B) đều là các hợp chất hữu cơ. Việc vận chuyển electron được thực hiện nhờ NAD. Ở đây có sự khác biệt rõ rệt so với hô hấp về bản chất của chất vận chuyển electron về sản phẩm cuối cùng...

Cơ chế vận chuyển electron trong quá trình lên men được tóm tắt như sau:

AH2 NAD+ BH2

A NADH2 B

3. Nghiên cứu sự trao đổi năng lượng Sự khác biệt về các phản ứng ôxy hóa khử ở các nhóm vi sinh vật

khác nhau là một tiêu chuẩn dùng để định loại chúng, một số nhà nghiên cứu đề xuất những phương pháp và môi trường có thể định loại nhanh chóng và đơn giản các nhóm vi sinh vật. 3.1 Nghiên cứu kiểu hô hấp

Để xác định kiểu hô hấp của một loại vi khuẩn, trong phòng thí nghiệm người ta sử dụng môi trường VF (nước thịt - gan) đã chế đặc và đưa vào ống nghiệm, rồi cấy giống vào sâu, dựa vào khả năng phát triển trong các ống nghiệm ta biết được đó là loại hô hấp gì. 3.2 Dùng phản ứng oxydase

Phản ứng này cho phép sự có mặt của chuỗi hô hấp đang hoạt động với cytochrome C ở màng nhờ TMPD (tetra - methyl - paraphenylene - diamine). Phản ứng này đặc biệt hiệu quả đối với vi khuẩn G-, phản ứng dương tính với các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc (trừ Pseudomonas maltophyla và Acinatobacter), phản ứng âm tính đối với các vi khuẩn kị khí không bắt buộc trừ các Vibrio và Aeromonas. Đặc biệt đối với các vi khuẩn đường ruột là có phản ứng âm tính mặc dù vi khuẩn này có chuỗi hô hấp với các cytochrome. 3.3 Thử catalase

Enzyme catalase thường có ở các vi khuẩn G-, trừ các giống Streptococcus và Lactobacilus. Khi có mặt H2O2, một vài giọt huyền phù vi khuẩn có catalase dương sẽ làm sủi bọt giải phóng ôxy phân tử. Nếu:

117

- Sủi nhiều bọt: đó là huyền phù vi khuẩn hiếu khí - Sủi ít bọt: vi khuẩn hiếu - kị khí - Không có bọt: vi khuẩn kị khí

3.4 Phản ứng nitrate reductase Sự khử nitrate có thể được nghiên cứu trên môi trường có nitrate

(môi trường lỏng hoặc đặc) để phát hiện sự có mặt của nitrite (nhờ thuốc thử Griess), có thể dẫn đến 2 kết quả theo 2 cơ chế khác nhau:

- Khử nitrate đồng hóa được xúc tác bởi nitrate reductase B tạo nitrite, chất này có thể được chuyển hóa tiếp thành muối ammon là nguồn nitơ dễ được cơ thể sử dụng.

- Khử nitrate dị hóa hay “hô hấp nitrate” dưới ảnh hưởng của nitrate reductase A và các enzyme khác, các nitrate sẽ được khử hoàn toàn thành N2O và N2 sẽ được giải phóng ngoài tế bào. Hô hấp nitrate là loại hô hấp kị khí. 3.5 Nghiên cứu kiểu trao đổi chất

Nghiên cứu này được thực hiện nhờ sử dụng glucose làm cơ chất, loại đường được dùng phổ biến nhất ở nhiều loại vi khuẩn. Thí nghiệm cần nuôi cấy ở 2 điều kiện hiếu khí và kị khí. Sau khi nuôi ở tủ ấm với nhiệt độ thích hợp, có thể có 4 trường hợp xảy ra:

- Vi khuẩn lên men khi có giống phát triển trong canh trường và làm acid hóa trong 2 ống nghiệm.

- Vi khuẩn ôxy hóa khi nó chỉ làm acid hóa trong ống nghiệm ở điều kiện hiếu khí.

- Vi khuẩn bất hoạt khi không thấy acid hóa trong cả 2 ống nghiệm. - Vi khuẩn kiềm hóa khi thấy môi trường bị kiềm hoá trong điều

kiện hiếu khí, điều này có thể thấy khi dùng peptone. 3.6 Khử các sản phẩm lưu huỳnh

Thí nghiệm khử các sản phẩm ôxy hóa của lưu huỳnh (sulfate, sulfite, thiosulfate v.v...) có thể thấy rõ nhờ tạo ra hydro được lưu huỳnh hóa (H2S...) phát hiện dưới dạng sulfua kim loại bị đen (sulfua sắt hay sulfua chì...). 3.7 Đo mức độ hô hấp

Hô hấp kế (Respirometre) Warburg là dụng cụ đầu tiên dùng để xác định mức độ sử dụng ôxy của tế bào sống. Nó bao gồm một bình cách thủy chịu nhiệt để mẫu cần nghiên cứu. Mẫu này được đặt trong một bình chứa nối với một áp kế, bình chứa mẫu và áp kế tạo thành một nhánh được

118

cố định chắc chắn trên ống có mức nước di động, sự di chuyển ở đây là do sự giao động của mẫu nghiên cứu gây nên.

Bình chứa mẫu được nối với một nhánh của bình cong của áp kế và được điều chỉnh để có một dung tích khí nhất định ở phần trên của mẫu nghiên cứu. Để loại bỏ ảnh hưởng của CO2 sinh ra trong quá trình hô hấp, người ta đặt một ống nhỏ giữa bình đựng mẫu nghiên cứu, trong đó, chứa KOH 10% để hấp thụ CO2 do quá trình hô hấp sinh ra. Sự thay đổi áp suất trong áp kế sẽ được tính chuyển nhờ dung tích ôxy tiêu thụ.

Với dụng cụ hô hấp kế này không những dùng để đo sự tiêu thụ ôxy phân tử mà còn có thể nghiên cứu các phản ứng enzyme khác nữa, trong đó sự thay đổi khí xuất hiện do khử carbonic, khử amin hóa. 4. Sự tích trữ và sử dụng năng lượng 4.1. Các mối liên kết giàu năng lượng

Tế bào sống tích trữ năng lượng vào các hợp chất và chúng có thể được giải phóng dễ dàng khi tế bào cần. Phản ứng hóa học phổ biến là thủy phân mối liên kết esterphosphate. Hợp chất được tế bào sử dụng thuận lợi và thường xuyên nhất là ATP. Ngoài ra còn có các hợp chất giàu năng lượng khác như các nucleotide UTP, GTP, CTP, TTP; các acylphosphate, ví dụ như 1-3 diphosphoglycerate; các enolphosphate như PEP; các acyl - thio - ester như CoA - SH.

CH2 R - C - O ∼ P Ví dụ: PEP (G = - 53,5 Kj.mole -1) + Các acyl - thioester: O R - C - S ∼ P Ví dụ: Coenzyme A

4.2. Nguồn gốc hợp chất cao năng ATP có thể được tổng hợp bằng hai cơ chế: - Quá trình phosphoryl hóa cơ chất xảy ra trong tế bào chất. - Quá trình phosphoryl hóa liên hệ với gradien electron và proton

xảy ra ở màng tế bào chất, ở đây người ta thấy có quá trình phosphoryl ôxy hóa và phosphoryl quang hóa (photophosphorylation).

Trong cả hai trường hợp quá trình tổng hợp ATP phụ thuộc vào lượng ADP và phosphate vô cơ.

119

+ Quá trình phosphoryl hóa cơ chất: trong quá trình này, một phosphate vô cơ được liên kết (nhờ xúc tác bởi enzyme) với các sản phẩm của sự phân giải. Hợp chất ôxy hóa là chất mang một mối liên kết phosphate giàu năng lượng và có thể được chuyển đến ADP. Kiểu hình thành ATP này thường thấy ở sự phân giải glucose theo con đường EMP (giai đoạn ôxy hóa 3 - phosphoglyceraldehyd thành acid 1,3- diphosphoglyceric và sự biến đổi hợp chất này thành acid pyruvic).

+ Quá trình phosphoryl hóa cũng liên hệ với gradien proton. Cả khi vận chuyển electron trong quá trình hô hấp (hiếu khí hoặc kị khí) cũng như trong quang hợp đã tạo ra một gradien proton quan trọng và nó là năng lượng dự trữ (có thể được so với một tụ điện được nạp sẵn), năng lượng dự trữ này có thể được thu hồi bằng cách để lại các proton một bên màng mà người ta thường so sánh như một động cơ sản sinh ATP. 5. Sự trao đổi carbohydrate 5.1. Sự phân giải carbohydrate

Carbohydrate nếu ở dạng hợp chất có trọng lượng phân tử lớn phải được thuỷ phân thành các dạng đường đơn để có thể đi vào các con đường phân giải đường để cung cấp năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể hoặc tạo ra các hợp chất trung gian cần cho sự chuyển hoá trao đổi chất. 5.2. Sự tổng hợp carbohydrate

Tương tự như các thực vật bậc cao, vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo - và polysaccharide. Lượng các oligo - và polysaccharide nội bào đạt tới 60% khối lượng khô của tế bào, còn polysaccharide ngoại bào có thể vượt nhiều lần khối lượng của vi sinh vật. Thành tế bào cũng chứa một lượng lớn polysaccharide.

Tất cả các oligo và polysaccharide được tổng hợp bằng cách kéo dài chuỗi saccharide có trước nhờ việc thêm đơn vị monosaccharide (X). Đơn vị monosaccharide này tham gia vào phản ứng ở dạng nucleotide - monosaccharide được hoạt hóa, thường là dẫn xuất của uridine - diphosphate (UDP.X) nhưng đôi khi cùng với các nucleotide purine và pirimidine khác. Sự tổng hợp diễn ra theo phản ứng chung như sau:

...X.X.X.X.X.X + UDP - X = ...X.X.X.X.X.X.X. + UDP (n - nhánh) (n + 1 - nhánh) Trong trường hợp polysaccharide bao gồm hai loại monosaccharide

liên tiếp (X và Y) phản ứng chung xảy ra qua hai bước: Bước 1: ...X.Y.X.Y.X.Y + UDP - X = ... X.Y.X.Y.X.Y.X. + UDP

120

Bước 2: ...X.Y.X.Y.X.Y.X + UDP - Y = ... X.Y.X.Y.X.Y.X.Y + UDP Con đường tổng hợp polysaccharide phân nhánh ta còn biết rất ít.

Trong dịch chiết tế bào của một số loài nấm sợi có chứa enzyme kitine - sinthetase xúc tác phản ứng chuyển các nhánh N - acetylglucosamine từ UDP - acetylglucosamine đến phân tử nhận. Một cách tương tự việc tổng hợp mannan của thành tế bào nấm men cũng bao gồm việc chuyển các nhánh mannose từ GDP - mannose đến chất nhận. Trong việc tổng hợp tinh bột ở Chlorella và glycogen ở Arthrobacter có sự tham gia của ADP - glucose.

- Tổng hợp glycogen: Khi có điều kiện ngoại cảnh hạn chế sự phát triển của vi khuẩn thì chúng có thể tích lũy glycogen nhờ hệ enzyme trùng hợp các glucose. Glycogen tích lũy dưới dạng các hạt trong chất ngyên sinh mà chúng ta có thể phát hiện bằng cách nhuộm màu với iode (hình 5.8).

Hình 5.8 Sơ đồ tổng hợp glycogen

- Tổng hợp levan và dextran: Các levan (poly β- 2,6-fructose) và các dextran (poly α-1,6 glucose) với sự phân nhánh α - 1,3 hoặc α -1,4 được tổng hợp từ saccharose theo phản ứng sau:

n saccharose n glucose + (fructose)n

n saccharose (glucose)n + n fructose Sự hình thành những hợp chất này chính là nguyên nhân của hiện

tượng nhầy nhớt khi nuôi cấy một số loại vi khuẩn trên môi trường giàu saccharose. Các hợp chất polysaccharide cùng với hợp chất nitơ sẽ hình thành nên glycopeptide của thành tế bào. 6. Sự trao đổi protein 6.1. Sự phân giải protein

Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Đây là một trong những thành phần quan trọng của xác bã động vật, thực vật và vi sinh vật. Sự phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ có ý nghĩa to lớn

121

đối với nông nghiệp và đối với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Người ta gọi quá trình phân giải này là quá trình ammon hóa (ammonification).

Muốn phân giải protein, cũng như các hợp chất cao phân tử khác, trước hết vi sinh vật phải tiết ra protease ngoại bào và chuyển hóa protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (polypeptide, olygopeptide). Các chất này tiếp tục được phân hủy thành acid amin nhờ các peptidase ngoại bào, hoặc được xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hóa thành acid amin. Một phần các acid amin này được vi sinh vật sử dụng trong tổng hợp protein, một phần khác được phân giải theo nhiều con đường khác nhau để tạo NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác. Những vi sinh vật không có khả năng sản sinh các enzyme phân giải protein ngoại bào sẽ không đồng hóa được các loại protein thiên nhiên. Chúng chỉ có thể sử dụng được các sản phẩm thủy phân của protein.

Rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau tham gia vào quá trình ammon hóa trong tự nhiên. Đáng chú ý là các vi sinh vật sau:

- Vi khuẩn: Bacillus mycoides, B. subtilis, Proteus vulgais, Pseudomonas aeruginosa, E. coli...

- Xạ khuẩn và nấm: Streptomyces griseus, S. fradiae, Aspergillus niger, A. awamori, Penicillium camemberti, Mucor spp., ...

Trong cơ thể vi sinh vật, các acid amin thường được chuyển hóa nhờ quá trình khử amin, quá trình khử carboxyl hoặc đồng thời vừa khử amin vừa khử carboxyl.

Khi phân giải các acid amin tùy theo từng loại phản ứng sẽ tạo các sản phẩm trung gian, đây là tiền chất cho các phản ứng sinh tổng hợp hoặc cần thiết cho một số quá trình trao đổi chất, như sự tạo thành acid fumaric từ acid aspactic:

HOOC- CH2- CH (NH2) - COOH HOOC-CH=CH-COOH+ NH3 hay tạo α - ketoglutaric từ acid glutamic, acid acetic từ glycine, acid succinic từ aspactic...). Trong quá trình khử amin thủy phân có sự liên kết với các ion H+ và OH- như sự tạo thành acid lactic từ alanine:

CH3-CH(NH2)-COOH + H2O CH3-CHOH-COOH + NH3

122

Enzyme phân giải Peptidase protein ngoại bào

Protein Polypeptide Amino acid Olygopeptide

Các Amino acid nội bào

Khử amin và Khử amin Chuyển amin và Trực tiếp dùng phân giải mạch carbon phân giải carbon trong quá

trình sinh tổng hợp protein

Nhiều sản phẩm sinh ra trong quá trình phân giải acid amin (rượu, acid hữu cơ ...) sẽ được lôi cuốn vào quá trình phân giải tạo năng lượng.

Nhiều loại amin do vi khuẩn sản sinh ra trong cơ thể người và động vật có tính độc, như sự tích lũy histamine có thể gây chứng co giật mạch máu, các hợp chất diamine như acmatine, putrecine gặp nhiều trong thịt cá ôi thiu đều có tính độc.

Một số vi khuẩn có khả năng chuyển hóa tryptophan thành 2 chất có mùi hôi là indol và skatol. Trong quá trình phân giải các acid amin chứa lưu huỳnh (methionine, cysteine, cystine) sẽ tạo ra H2S làm cho phân hoặc thịt cá có mùi hôi.

NH2

HOOC- CH- (NH2)-CH2-SH + 2H2O H2S + NH3 + CH3COOH + HCOOH (cysteine)

Khi quá trình thối rữa xảy ra trong điều kiện thoáng khí thì quá trình ôxy hóa được tiến hành đến cùng, khi đó hầu hết carbon được chuyển thành CO2. Nếu quá trình này diễn ra trong điều kiện kị khí thì có sự tích lũy nhiều sản phẩm trung gian nói trên.

Ngoài khả năng phân giải protein, vi sinh vật còn có khả năng phân giải một số chất đạm khác như urea, acid uric... Sự phân giải các chất này cùng tạo ra các sản phẩm trung gian như acid formic, acid acetic, CO2,

123

NH3..., các chất này có thể tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất và trao đổi năng lượng của tế bào.

Urea là chất hữu cơ chủ yếu trong nước tiểu của người và động. Trong urea có chứa 47% nitơ nhưng nếu không được vi sinh vật phân giải thành NH3 thì nguồn nitơ lớn lao này cũng trở thành vô ích đối với mọi thực vật.

Rất nhiều vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi sống trong đất có khả năng phân giải mạnh mẽ urea. Đáng chú ý là các loài như Planosarcina urea, Micrococcus urea, Bacillus pasteurii, Proteus vulgaris... Quá trình phân giải urea xẩy ra rất đơn giản với sự xúc tác của urease:

H2N- CO- NH2 + 2H2O (NH4)2CO3

(NH4)2 CO3 ít bền vững do đó dễ dàng phân giải tiếp: (NH4)2CO3 2NH3 + CO2 + H2O NH3 sinh ra do sự phân giải hợp chất hữu cơ thường được ôxy hóa

thành NO2- và tiếp tục ôxy hóa đến NO3

-. Phân đạm ((NH4)2SO4 hoặc NH4Cl) sau khi bón ruộng cũng nhanh chóng chuyển thành NO3

-. Quá trình chuyển hoá này gọi là quá trình nitrate hóa. Quá trình này bao gồm 2 giai đoạn:

- Quá trình nitrite hóa được biểu thị bằng phương trình phản ứng sau:

2NH3 + 3O2 2HNO2 + 2H2O + Q Năng lượng sinh ra trong phản ứng này cũng được vi khuẩn nitrite

sử dụng để đồng hóa CO2 của không khí. Thực ra quá trình này trải qua nhiều phản ứng trung gian và tạo nhiều sản phẩm trung gian, trong đó sản phẩm trung gian quan trọng nhất là hydroxilamin (NH2OH). Enzyme xúc tác cho việc chuyển hydro là các enzyme của quá trình hô hấp hiếu khí. Vi khuẩn nitrite là bọn tự dưỡng bắt buộc với các chi đại diện là Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira và Nitrosocystis.

- Quá trình nitrate hóa được biểu thị bằng phương trình sau: NO2

- + O2 NO3- + Q

Cũng như các vi khuẩn tự dưỡng hóa năng khác, năng lượng sinh

trong phản ứng ôxy hoá NO2- được sử dụng để đồng hóa CO2 không khí.

Vi khuẩn nitrate hóa điển hình là các loài thuộc giống Nitrobacter. Đây là những tế bào hình bầu dục, kích thước khoảng 0,8-1,0μm, thuộc loại G-, không tạo bào tử, khuẩn lạc nhỏ bé và trong suốt. Ngoài ra còn có một số giống khác như Nitrococcus, Nitrospira...

124

6.2. Sự tổng hợp protein Ba quá trình chủ yếu trong việc biến đổi và truyền đạt thông tin di

truyền ở trong cơ thể là: - Sự nhân đôi DNA tạo ra 2 phân DNA giống nhau và giống với

phân tử DNA “mẹ”. - Quá trình sao mã theo đó thông tin di truyền từ DNA được sao

sang RNA, sau đó được chuyển đến ribosome. - Quá trình dịch mã cho phép chuyển dịch thông tin di truyền thành

các axit amin cấu trúc nên protein. Công nghệ di truyền cho phép giải mã trật tự các nucleotide thành trật tự các axit amin đã được xác lập (h. 5.9).

Hình 5.9 Sơ đồ sinh tổng hợp axit amin (theo Lehninger)

125

Phần lớn các vi sinh vật có khả năng tổng hợp 20 loại axit amin. Con đường tổng hợp axit amin ở vi sinh vật đã được nghiên cứu khá tỉ mỉ. Nguyên liệu dùng cho quá trình tổng hợp đó là những sản phẩm trung gian như pyruvate, α - ketoglutarate, oxaloacetate, fumarate...

Trong phần lớn trường hợp, nhóm amin được đưa vào giai đoạn cuối cùng của sinh tổng hợp nhờ sự chuyển amin, một số acid amin được hình thành nhờ hàng loạt biến đổi của các acid amin khác, trong trường hợp đó không cần sự chuyển amin. Nhiều loại L - acid amin đã được sinh tổng hợp bằng con đường lên men nhờ vi sinh vật như lysine, glutamic, alanine, glycine...

Hiện nay nhiều loại acid amin “tự nhiên” là sản phẩm của công nghệ sinh học bằng cách thủy phân protein, tổng hợp hóa học hoặc sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật. Trong nhiều trường hợp người ta phối hợp giữa tổng hợp hóa học và sinh tổng hợp, phương pháp này có nhiều ưu điểm là cho các dạng L - acid amin là dạng thường gặp trong cơ thể. 7. Sự trao đổi lipid 7.1. Sự phân giải lipid

Lipid (ester phức tạp của glycerine và acid béo) và các chất sáp (ester phức tạp của acid béo và rượu bậc một) được nhiều vi sinh vật dùng làm nguồn thức ăn và năng lượng. So với các cơ chất khác thì đây là loại cơ chất được đồng hóa với tốc độ chậm, quá trình này được thực hiện bởi nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm

Bước đầu tiên của quá trình đồng hóa lipid là sự phân giải thành glycerine (hoặc rượu đơn nguyên tử) và các acid béo. Quá trình này được xúc tác nhờ lipase nội bào hoặc ngoại bào.

Sau khi được phosphoryl hóa, glycerine sẽ được chuyển hóa theo con đường EMP, còn các acid béo đi vào chu trình β - ôxy hóa (hình 5.10).

Như vậy, cứ qua một vòng ôxy hóa hòan toàn chuỗi carbon của phân tử acid béo lại mất đi 2C. Cứ tiếp tục như vậy thì toàn bộ chuỗi carbon sẽ được chuyển hóa thành acetyl - CoA, chất này được chuyển hóa nhờ chu trình TCA hoặc chu trình acid glyoxilic. Một số nấm mốc thuộc các chi như Penicillium và Aspergillus có thể ôxy hóa acid béo một cách không triệt để và tích lũy lại trong môi trường metylketone tạo mùi khó chịu (gặp trong dầu mỡ bị nhiễm mốc).

126

Hình 5.10: Chu trình β- ôxy hóa axit béo

Câu hỏi ôn tập của chương 5 1. Các hình thức vận chuyển các chất qua màng? 2. Cơ chế của quá trình sinh năng lượng của hô hấp hiếu khí và kị

khí? 3. Các kiểu hô hấp ở vi sinh vật? 4. Các con đường phân giải hexose? 5. Các kiểu trao đổi chất ở vi sinh vật? 6. Cơ chế và ý nghĩa của chu trình acid tricarboxylic (ATC)? 7. Sự phân giải các hợp chất protein? 8. Vai trò của vi sinh vật trong vòng tuần hoàn nitơ? 9. Vai trò của vi sinh vật trong tuần hoàn carbon?

127

Chương 6 Hô hấp kị khí

I.Khái niệm chung

Nhiều vi khuẩn hiếu khí có thể sinh trưởng được trong điều kiện không có oxy, lúc đó chúng dùng nitrate (hoặc sulfate) làm chất nhận điện tử cuối cùng, vì vậy gọi là hô hấp nitrate (hoặc hô hấp sulfate).

Khả năng chuyển điện tử cho nitrate và sulfate, giúp cho vi khuẩn thực hiện tương đối đầy đủ quá trình oxy hóa hoàn toàn cơ chất, mà không cần có sự tham gia của oxy phân tử, nhờ đó vi sinh vật thu được nhiều năng lượng hơn so với quá trình lên enzyme (hình 6.1)

Ngoài ra, có một số ít vi khuẩn (Clostridium aceticum) lại có thể dùng CO2 làm chất nhận hydro trong hô hấp kị khí.

Hình 6.1: Sơ đồ quá trình hô hấp hiếu khí, kị khí và lên enzyme

II. Hô hấp nitrate, ammonium hóa nitrate và khử nitrogen Hô hấp nitrate hay là khử dị hoá nitrate khác với quá trình khử đồng hoá nitrate ở chỗ, các sản phẩm khử trong trường hợp này không được tế bào sử dụng tiếp, mà thường được tiết ra ngoài môi trường.

128

Rất nhiều vi khuẩn hiếu khí khi sống trong điều kiện kị khí có khả năng dùng nitrate làm chất nhận hydro cuối cùng, ví dụ một số loài thuộc các chi Bacillus, Aerobacter và E. coli khử nitrate thành amoniac (quá trình amon hoá nitrate), trong khi đó một số khác lại khử nitrate để giải phóng nitơ phân tử (N2) hoặc (N2O), người ta cho rằng quá trình amon hoá nitrate và phản nitrate hoá có chung giai đoạn đầu (hình 6.2)

Hình 6.2: Sơ đồ quá trình hô hấp nitrate

Vi khuẩn nitrate hóa thuộc chi Nitrobacter dùng nitrite làm nguồn

năng lượng. Có thể biểu thị chuỗi hô hấp của vi khuẩn nitrate như sau:

Hình 6.3: Chuỗi hô hấp của vi khuẩn nitrate hóa

Nhiều loại vi sinh vật có khả năng dùng nitrate làm nguồn thức ăn nitơ, khử đồng hoá nitrate qua nitrit thành amoniac, hợp chất này sẽ tham gia tổng hợp trong tế bào của chúng:

NO → NO → x → NH−3

−2 2OH → NH +

4

Khi ammonium hoá nitrate ta có:

129

8[H] + H+ + NO −3 → NH + OH+

4- + 2H2O

Còn khi khử nitrate hoá: 10[H] + 2H+ + NO −

3 → N2 + 6H2O

Khi hô hấp nitrate, đặc biệt là khi phản nitrate hoá, cơ chất hữu cơ được oxy hoá hoàn toàn đến CO2 và H2O. Năng lượng sinh ra với nitrate là chất nhận hydro chỉ thấp hơn trong trường hợp chất nhận là oxy phân tử khoảng 10%. ATP cũng được tạo ra nhờ kết quả của quá trình phosphoryl hóa trong chuỗi hô hấp, vì vậy quá trình phản nitrate hóa đảm bảo hoạt tính sinh trưởng của vi sinh vật ở mức độ cao. Ở nhiều loại vi sinh vật có khả năng hô hấp nitrate như E.coli thì chuỗi vận chuyển điện tử tương tự như trong trường hợp hiếu khí, chỉ có citocromo-oxydase được thay bằng nitratereductase.

Giai đoạn đầu của quá trình khử nitrate được xúc tác nhờ nitratereductase. Nhiều vi khuẩn phản nitrate hóa có khả năng dùng không những nitrate mà cả nitrite làm chất nhận hydrogen, M. denitrificans còn khử được cả N2O. Tùy theo loài vi khuẩn mà sản phẩm của khử nitrate dị hóa và nitrite dị hóa là N2, N2O hay NO.

Do vi khuẩn phản nitrate hóa có khả năng dùng nitrate chủ yếu làm chất nhận điện tử, mà không có khả năng khử nó thành NH , cho nên muốn nuôi cấy chúng phải cần bổ sung thêm nguồn đạm vào môi trường (pepton hoặc NH ). Vi khuẩn phản nitrate hóa phân bố rất rộng trong tự nhiên, những loài thường gặp như: P. denitrificans, P. aeruginosa, P. fluorescens, Micrococcus denitrificans, Hydrogenomonas agilis...

+4

+4

Vi khuẩn phản nitrate hóa là tác nhân sinh học làm nghèo nitrogen của đất (còn phản nitrate hóa học xảy ra mạnh khi đất quá nhiều acid) quá trình này xảy ra mạnh khi đất bị kỵ khí (đất ngập nước, không tơi...)hoặc khi dùng phân đạm (nitrate) cùng với phân chuồng trên những ruộng lúa ngập nước, ở đây phân nitrate dùng bón cho lúa đạt hiệu quả rất ít, vì nitrate có thể mất hết rất nhanh, chỉ khoảng mười giờ sau khi bón. Khi đất thoáng khí quá trình phản nitrate bị ức chế, vì oxy phân tử đã ức chế tế bào vi khuẩn tổng hợp enzyme nitratereductase và nitritereductase.

III. Hô hấp sulfate Phần lớn vi sinh vật và thực vật có thể dùng sulfate làm nguồn dinh dưỡng lưu huỳnh để tổng hợp cáchợp chất của cơ thể chứa S (acid amin chứa S, enzyme...). Đó là quá trình khử đồng hóa sulfate. Chỉ có một

130

số ít vi sinh vật thuộc 2 chi Desulfovibrio và Desulfotomaculum lại dùng sulfate làm chất nhận hydro cuối cùng trong hô hấp kị khí. Quá trình hô hấp sulfate cũng tương tự như quá trình hô hấp nitrate, nhưng các vi sinh vật thực hiện quá trình này đều thuộc loại kị khí bắt buộc, chúng chỉ có thể dùng sulfate làm chất nhận hydro cuối cùng trong quá trình oxy hóa cơ chất. H2S là sản phẩm của quá trình được sinh ra theo khử ứng:

8[H] + SO → H−24 2S + 2H2O + 2OH-

Vi khuẩn thực hiện quá trình hô hấp sulfate trước khi bị khử thành H2S phải trải qua nhiều giai đoạn trung gian mà có những giai đoạn cho đến nay người ta chưa biết được một cách chắc chắn:

SO → APS → SO → → → S−24

−23

2-

(Adenosin-5-phosphosulfate) Năng lượng sinh ra trong quá trình hô hấp sulfate được vi sinh vật sử dụng để đồng hóa các hợp chất hữu cơ (acid hữu cơ, amino acid) một số vi khuẩn khử sulfate hóa có khả năng tự dưỡng cacbon, chúng dùng hydro phân tử để khử sulfate và sử dụng năng lượng sinh ra trong quá trình hô hấp sulfate để đồng hóa CO2 trong không khí. 4H2 + H2SO4 → H2S + 2H2O + Q Vi khuẩn khử sulfate hóa có thể phân giải pyruvate để hình thành H2S: 4CH3COCOOH + H2SO4 → CH3COOH +4CO2 +H2S Vi khuẩn khử sulfate hóa thường gặp ở những vùng bùn lầy có khí H2S, tức là những nơi có quá trình phân giải kỵ khí các hợp chất hữu cơ. Trong 1ml nước bẩn chứa 104 – 106 vi khuẩn khử sulfate, còn trong bùn có H2S số lượng của chúng lên tới 107 tế bào. Hàng triệu năm nay, chúng tham gia tích cực vào quá trình hình thành quặng lưu huỳnh, mỏ dầu hỏa. Desulfotomaculum ruminis tham gia tích cực vào quá trình khử sulfate và tạo thành H2S trong những dạ dày cỏ của động vạt nhai lại (trâu, bò...). Bằng cách khử sulfate những vi sinh vật của nhóm này đã tham gia tích cực vào chu trình chuyển hóa chuyển hóa lưu huỳnh trong tự nhiên. Mặt khác, do sinh ra H2S có thể làm cá chết hàng loạt, H2S làm ăn mòn các bộ phận kim loại của các công trình chôn sâu dưới đất hoặc dưới nước.

131

Thiobacillus denitrificans Thiobacil lus thiooxidans

Hình 6.4: Một số loài vi khuẩn lưu huỳnh IV. Hô hấp carbonate tạo thành methane Những vi sinh vật này có khả năng hình thành methane từ carbonate e. Chúng lấy năng lượng cho hoạt động sống của mình từ quá trình oxy hóa kỵ khí các hợp chất khoáng hay các hợp chất hữu cơ đơn giản như acid formic hay một số acid béo bậc cao. Những vi sinh vật sinh methane bao gồm 4 nhóm phụ khác nhau về hình thái: -Các vi sinh vật sinh methane không sinh bào tử (Methanobacterium)

-Các vi sinh vật sinh methane sinh bào tử (Methaneobacillus) -Các vi sinh vật hình cầu sinh methane (Methanococcus) -Các 8 cầu khuẩn sinh methane (Methanosarcina)

Hình 6.5: Khuẩn lạc Methanosarcina acetivorans.

132

Methanobacterium formocicum Methanospirillum sp.strain TM20-1 Hình 6.6: Hình dạng một số loài vi khuẩn methane Người ta thường gặp những vi sinh vật sinh methane ở đáy những

ao hồ, đầm và đáy biển, nơi mà điều kiện kỵ khí rất thuận lợi cho chúng phát triển.

Methaneobacterium barkeri. Có khả năng chuyển hoá CO thành CH4. Sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hoá là CO2 và H2.

4CO + 4H2O → 4 CO2 + 4H CO2 + 4H2 → CH4 + H2O

4CO + 2H2O → CH4 + 3CO2 Vi khuẩn sinh methane được chứng minh là loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh vitamin B12. Sơ đồ giả thuyết về sự hình thành CH4 từ CO2 hoặc acetate ở vi khuẩn sinh methane có thể được trình bày như sau:

133

Hình 6.7: Sơ đồ giả thiết sinh tổng hợp VTM B12 ở vi khuẩn sinh methane V. Hô hấp carbonate tạo thành acetate Quá trình hô hấp carbonate tạo thành acetate mới được phát hiện gần đây ở vi khuẩn methane, khử sulfate.

Hình 6.8: Hình dạng Vi khuẩn Methanobacterium thermoautotrophicum

Kết quả nghiên cứu ở vi khuẩn Methanobacterium thermoautotrophicum cho thấy như sau: Theo con đường này, 1phân tử CO2 bị [H] có năng lực khử thành CH3-X, 1phân tử CO2 khác bị CO dehydrogenase khử thành CO. Qua quá trình cacbocyl hóa CH3X sẽ sinh ra Acetyl-X, sau đó thành Acetyl-CoA. Dưới sự xúc tác của piruvate siterase, Acetyl-CoA sẽ tiếp thu 3 phân tử CO2 để cacbocyl hóa thành acid pyruvic. Acid pyruvic thông qua các con đường trao đổi chất quen thuộc để tổng hợp ra các chất hữu cơ cần thết cho tế bào.

134

Câu hỏi ôn tập chương 6

1. So sánh những điểm khác nhau giữa hô hấp hiếu khí và hô hấp kỵ khí ? 2. Những điểm giống nhau và khác nhau giữa hô hấp nitrate và hô hấp sulfate. 3. Vị trí vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nấm men trong các hệ thống phân loại hiện nay ? 4. Vai trò của vi khuẩn methane trong thiên nhiên và trong đời sống con người ?

144

Chương 8

Các quá trình lên men I. Con đường Embden-Meyerhof (EM) : Bước chuyển hóa chung cho các quá trình lên men

Lên men là một quá trình oxi hóa-khử cân bằng nội sinh, trong đó một số nguyên tử của nguồn năng lượng (chất cho điện tử) trở nên có tính khử hơn, trong khi một số nguyên tử khác trở nên oxi hóa hơn, còn năng lượng thì được sinh ra nhờ sự phosphorin hóa cơ chất. Con đường trao đồi chất chung đối với sự lên men glucose là con đường đường phân, cũng còn được gọi là con đường Embden-Meyerhof. Đường phân được chia thành ba bước chính, mỗi bước gồm một số phản ứng riêng biệt do enzyme xúc tác. Bước một gồm các phản ứng chuẩn bị, không có các phản ứng oxi hóa và cũng không giải phóng năng lượng, song lại dẫn đến việc tạo ra hai phân tử trung gian quan trọng, glixeraldehit-3-phosphate (GAP). Trong bước hai, sự oxi hóa-khử xảy ra, năng lượng được dự trữ dưới dạng ATP và hai phân tử piruvat được tạo thành. Trong bước ba, một phản ứng oxi hóa-khử thứ hai xảy ra và các sản phẩm lên men (chẳng hạn ethanol và CO2, hoặc acid lactic), sẽ được tạo thành. Trong sự tạo thành hai phân tử acid 1,3 điphosphoglixeric có hai phân tử NAD+ bị khử thành NADH. Tuy nhiên, một tế bào chỉ chứa một lượng nhỏ NAD+, và nếu như toàn bộ NAD+ bị chuyển thành NADH thì phản ứng oxi hóa glucose sẽ bị đình chỉ; sự oxi hóa tiếp tục chỉ có thể xảy ra khi một phân tử NAD+ có mặt để tiếp nhận các điện tử vừa được giải phóng ra. Sự "tắc đường" này có thể được khắc phục trong lên men bằng cách oxi hóa NADH trở lại thành NAD+ nhờ các phản ứng khử piruvat thành một trong hàng loạt các sản phẳm lên men khác nhau. Trong trường hợp của nấm men, piruvat bị khử thành ethanol với sự giải phóng CO2. ở các vi khuẩn lactic, piruvat bị khử thành acid lactic.

Nhiều con đường khử piruvat cũng gặp ở các vi sinh vật nhân sơ khác, song kết quả thật sự đều giống nhau, tức là NADH phải được hồi phục lại thành dạng oxi hóa, NAD+, để cho các phản ứng thu nhận năng lượng của lên men có thể tiếp tục. Là một coenzyme dễ khuếch tán, NADH có thể tách khỏi GAP-dedihydrogenase, gắn vào một enzyme khác, (chẳng hạn lactat-dedihydrogenase, enzyme khử piruvat thành acid lactic), rồi lại lập tức khuếch tán trở lại sau khi NADH đã được oxi hóa thành NAD+ để lặp lại chu trình một lần nữa.

145

Trong bất kỳ một phản ứng thu năng lượng nào, sự oxi hóa bao giờ cũng phải được cân bằng với sự khử và phải có một chất nhận nào đó đứng chờ sẵn để nhận một điện tử vừa được tách ra. Trong trường hợp này, sự khử NAD+ tại một bước trong con đường đường phân sẽ được cân bằng bởi sự oxi hóa nó tại một bước khác. (Các) sản phẫm cuối cùng cũng phải nằm trong trạng thái cân bằng oxi hóa-khử với cơ chất ban đầu, tức là glucose. Bảng 6.1: Các quá trình lên men phổ biến ở vi sinh vật

Kiểu lên men

Phản ứng tổng thể Vi sinh vật thực hiện

Lên men rượu Hexose → 2 Ethanol + 2 CO2 Nấm men Zymomonas

Lên men lactic đồng hình

Hexose → 2 Lactat + 2 H+ Streptococcus Một số Lactobacillus

Lên men lactic dị hình

Hexose → Lactat + Ethanol + CO2 + H+

Leuconostoc Một số Lactobacillus

Acid propionic Lactat → Propionat + Acetate + CO2

Propionibacterium Clostridium propionicum

Acid hỗn hợp Hexose → Ethanol + 2,3-Butandiol + Xucxinat + Lactat + Acetate + Focmat + H2 + CO2

Các vi khuẩn đường ruột Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter

Acid butiric Hexose → Butirat + Acetate + H2 + CO2

Clostridium butyricum

Butanol Hexose → Butanol + Acetate + Aceton + Ethanol + H2 + CO2

Clostridium acetobutylicum

Caproat Ethanol + Acetate + CO2 → Caproat + Butirat + H2

Clostridium kluyveri

Homoacetic Fructose → 3 Acetate + 3 H+

4 H2+ 2 CO2 + H+ → Acetate + 2 H2O

Clostridium aceticum Acetobacterium

Sinh methane Acetate + H2O → CH4 + HCO −3

Methanothrix Methanosarcina

II. Tính đa dạng của lên men Bảng 6.1 trình bày một số kiểu lên men chính được phân loại dựa

trên các sản phẩm được tạo thành. Đó là các quá trình lên men rượu, acid lactic, acid propionic, acid hỗn hợp, acid butiric và acid homoacetic. Có

146

nhiều quá trình lên men được phân loại dựa trên cơ chất được lên men thay vì các sản phẩm. Chẳng hạn, nhiều vi khuẩn kị khí tạo thành bào tử (chi Clostridium) lên men các amino acidvới sự sản sinh acetate, amoniac và H2. Các loài Clostridium khác, như C. acidiurici và C. purinolyticum lên men các purin như xantin hoặc ađenin với sự tạo thành acetate, focmat, CO2, và amoniac. Còn những bọn kị khí khác thì lên men các hợp chất thơm. Chẳng hạn, vi khuẩn Pelobacter acidigallici lên men hợp chất thơm phloroglucinol (1,3,5-benzenetriol, C6H6O3) theo con đường sau :

Phloroglucinol (C6H6O3) +3 H2O → 3 acetate- + 3H+, ΔGo' = -142,5 kJ/phản ứng

Nhiều quá trình lên men không thông thường chỉ được thực hiện bởi một nhóm rất hạn chế các vi khuẩn kị khí, và trong một sồ trường hợp chỉ bởi một vi khuẩn duy nhất. Một số ví dụ được nêu trên bảng 6.2. Nhiều trong số các vi khuẩn này có thể được xem như các chuyên gia về trao đổi chất vì chúng có khả năng phân giải một hoặc nhiều cơ chất mà các vi khuẩn khác không phân giải được.

Bảng 6. 2: Một số quá trình lên men không thông thường

Kiểu lên men

Phản ứng cân bằng tổng thể

Vi sinh vật thực hiện

Acetylen 2 C2H2 + 3 H2O → Ethanol + Acetate + H+

Pelobacter acetylenicus

Glycerin 4 Glycerin + 2 HCO → −3

7 Acetate + 5 H+ + 4 H2O

Acetobacterium spp.

Resocxinol (một hợp chất thơm)

2 C6H4(OH)2 + 6 H2O → 4 Acetate + Butirat + 5 H+

Clostridium spp.

Xinamat (một hợp chất thơm)

2C9H7O2 + 2 H2O → C9H9O2 + Benseat + Acetate + H+

Acetovibrio multivorans

Phlorogluxinol (một hợp chất thơm)

C6H6O3 + 3 H2O → 3 Acetate + 3 H+

Pelobacter masiliensis Pelobacter acidigallici

Putresxin 10 C4H12N2 + 26 H2O → 6 Acetate + 7 Butirat + 20 NH4

+ + 16 H2 + 13 H+

Các vi khuẩn kị khí gram dương không sinh bào tử, chưa phân loại

Xitrat Xitrat + 2 H2O → Focmat + 2 Acetate + HCO + H−

3+

Bacteroides sp.

Aconitat Aconitat + H++ 2 H2O → 2 CO2 + 2 Acetate + H2

Acidaminococcus fermentans

147

Glioxilat 4 Glioxilat +3 H+ + 3 H2O → 6 CO2 + 5 H2 + Glicolat

Vi khuẩn gram âm chưa phân loại

Xucxinat Xucxinat + H2O → Propionat + HCO −3

Propionigenium modestum

Oxalat Oxalat + H2O → Focmat + HCO −3

Oxalobacter formigenes

Malonat Malonat + H2O → Acetate + HCO −3

Malonomonas rubra Sporomusa malonica

III. Lên men không có sự phosphorin hóa cơ chất Với một số cơ chất, năng lượng sinh ra không đủ để ghép đôi với sự tổng hợp ATP trực tiếp nhờ phosphorin hóa cơ chất, tuy nhiên các hợp chất này vẫn trợ giúp sinh trưởng lên men của một cơ thể nào đó. Trong những trường hợp này sự phân giải cơ chất được gắn liền với những bơm ion được dùng để tạo nên một građien proton hoặc natri qua màng. Ví dụ về kiểu này có các quá trình lên men của Propionigenium modestum hoặc Oxalobacter formigenes, cả hai đều gắn sự lên men các acid đicacboxilic với các bơm ion sinh năng lượng liên kết với màng. Propionigenium modestum thực hiện phản ứng sau đây :

Xucxinat2- + H2O → Propionat- + HCO3- , ΔGo' = -20,5 kJ/phản ứng

Phương trình tổng thể này thu không đủ năng lượng tự do để ghép đôi với sự tổng hợp ATP trực tiếp nhờ phosphorin hóa cơ chất, tuy nhiên nó lại được dùng làm phản ứng thu năng lượng duy nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn. Sở dĩ như vậy là vì sự loại CO2 khỏi xucxinat

148

Hình 6.1: Lên men liên kết với bơm ion ở vi khuẩn

(năng lượng thu được không qua phosphorin hóa cơ chất) (qua metilmalonil-CoA và đecacboxilase liên kết với màng bởi Propionigenium modestum đã được ghép đôi với sự xuất Na+ qua màng tế bào chất. Một ATPse chuyển vị Na+ nằm trên màng của P. modestum sử dụng građien này để hoạt hóa sự tổng hợp ATP.

Oxalobacter formigenes thực hiện sự lên men oxalat :

Oxalat2- + H2O → Focmat- + HCO3- , ΔGo' = -26,7 kJ/phản ứng

ở pH trung tính, oxalat tồn tại dưới dạng ion hóa oxalat-, và sự loại cacboxil thành focmat- tiêu thụ một proton. Sau đó sự xuất focmat- khỏi tế bào sẽ tạo nên một động lực nhờ proton (proton motive force = PMF) có khả năng ghép đôi với sự tổng hợp ATP nhờ một ATPase chuyển vị proton nằm trên màng.

149

Điều thú vị và độc đáo trong trao đỗi chất của cả Propionigenium modestum lẫn Oxalobacter formigenes nằm ở chỗ sự tổng hợp ATP xảy ra không cần cả phosphoril hóa cơ chất lẫn chuỗi vận chuyển điện tử; tuy nhiên, sự tạo thành ATP theo cơ chế hóa thẩm vẫn xảy ra dựa vào một bơm Na+/H+ kết hợp với sự loại CO2 khỏi các acid hữu cơ. Điều cần rút ra từ những sự lên men này là : các phản ứng, dù chỉ thu được dưới 31,8 kJ, con số cần thiết để tạo thành một ATP, hoặc không có khả năng ghép đôi với sự phosphorin hóa cơ chất, cũng không thể lập tức bị coi là không có khả năng trợ giúp sinh trưởng cho một vi khuẩn. Nếu như phản ứng có thể ghép đôi được với một građien ion thì sự sản sinh ATP vẫn có khả năng xảy ra và do vậy vẫn có sinh trưởng (Hình 6.1).

IV. Hiện tượng cộng dưỡng (syntrophy) Trong vi sinh vật học có nhiều ví dụ về hiện tượng cộng dưỡng, một hiện tượng mà hai sinh vật khác nhau có thể cùng nhau phân giải một chất nào đó - và bảo toàn năng lượng của quá trình phân giải đến mức không cơ thể nào trong hai cơ thể đó một mình có thể làm được.

Trong đa số trường hợp, bản chất của một phản ứng cộng dưỡng có liên quan tới khí dihydro (H2) sinh ra bởi một trong hai đối tác và được tiêu thụ bởi đối tác kia.

Do vậy, cho đến nay, cộng dưỡng cũng còn được gọi là sự chuyển H2 liên loài. Kẻ tiêu thụ H2 có thể là bất kỳ một cơ thể nào trong số các vi khuẩn khử sunfat, lên men homoacetate, và vi khuẩn sinh methane. Hãy xem xét trường hợp cộng dưỡng liên quan tới quá trình lên men ethanol thành acetate và sự sản sinh methane sau đó. Như có thể thấy trên hình 2, bọn lên men ethanol thực hiện một phản ứng không thuận lợi về mặt năng lượng tự do (ΔGo' dương). Tuy nhiên, H2 được sinh ra bởi đối tác lên men rượu lại là một chất cho điện tử đầy giá trị đối với quá trình hình thành methane do một vi khuẩn sinh methane thực hiện. Và khi cộng hai phản ứng lại thì phản ứng tổng thể sẽ là một phản ứng toả nhiệt và có thể trợ giúp sinh trưởng của cả hai đối tác trong hỗn hợp cộng dưỡng. Lên men ethanol 2CH3CH2OH + 2H2O → 4H2 + 2CH3COO- +2H+ +19,4 kJ /phản ứng Sinh methane 4H2+ CO2 → CH4 + 2H2O - 130,7 kJ/phản ứng Phản ứng cộng dưỡng 2CH3CH2OH + CO2 → CH4 + 2CH3COO- - 111,3 kJ/phản ứng

150

Một ví dụ khác của hiện tượng cộng dưỡng là sự oxi hóa butirat thành acetate cộng với H2 bởi vi khuẩn cộng dưỡng oxi hóa acid béo Syntrophomonas:

Butirat- + 2H2O → 2acetate- + H+ + 2H2 , ΔGo' = +48,2 kJ/phản ứng

Sự biến đổi năng lượng tự do của phản ứng này rất không thuận lợi và trong ống giống thuần khiết, Syntrophomonas không thể mọc được trên butirat. Song nếu H2 vừa sinh ra trong phản ứng được tiêu thụ ngay bởi một cơ thể đối tác (như một vi khuẩn sinh methane) thì Syntrophomonas lại sinh trưởng rất tốt trong ống giống cấy chung với bọn tiêu thụ H2.

V. Lên men rượu nhờ nấm men và vi khuẩn Ethanol là một trong số các sản phẩm lên men phổ biến nhất gặp ở vi sinh vật. Bản thân thực vật và nhiều loài nấm cũng tích lũy ethanol dưới các điều kiện kị khí. Vi sinh vật sản sinh ethanol chủ yếu là nấm men, đặc biệt là các chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae. Giống như đa số nấm, nấm men là những cơ thể hô hấp hiếu khí, nhưng khi vắng mặt không khí chúng sẽ lên men hiđrat cacbon thành ethanol và CO2. Nhiều vi khuẩn kị khí và hiếu khí cũng tạo thành ethanol như các sản phẩm chính hoặc sản phẩm phụ khi lên men các hexose hoặc pentose.

1. Sự tạo thành ethanol nhờ nấm men

Sự lên men glucose thành ethanol và CO2 nhờ Saccharomyces cerevisiae diễn ra theo con đường Embden-Meyerhof. Sự chuyển hóa piruvat thành ethanol gồm hai bước. Trong bước một, piruvat được loại CO2 thành acetaldehit nhờ piruvat-đecacboxilase với sự tham gia của tiaminpirophosphate. Trong bước sau, acetaldehit bị khử thành ethanol nhờ alcohol-đedihydrogenase chứa NADH.

2CO2

2NAD 2NADH

2 Piruvat

2 Acetaldehyt

Glucose

2Ethanol

151

Bằng sự chuyền H này, dihydro tách ra do triosephosphate-dehydrogenase xúc tác sẽ được tiêu thụ, nhờ vậy trạng thái oxi hóa-khử sẽ được cân bằng.

2. Các dạng phương trình Neuberg

Các phương pháp và phát hiện của Carl Neuberg về lên men rượu không chỉ có ý nghĩa lịch sử. Ông đã khám phá ra rằng, không chỉ glucose mà cả piruvat cũng được nấm men lên men và acetaldehit xuất hiện như một sản phẩm trung gian có thể bị bắt giữ bởi dihydrosulfit. Dihydrosulfit vốn không độc đối với nấm men. Nếu bổ sung dihydrosulfit vào một môi trường chứa glucose đang được nấm men lên men thì acetaldehit sẽ bị kết tủa do tạo thành phức chất :

CH3-CHO + NaHSO3 → CH3- CHOH -SO3Na

Lúc đó glycerin sẽ xuất hiện như một sản phẩm lên men mới, đồng thời hiệu suất ethanol và CO2 sẽ giảm xuống.

Lên men với sự có mặt của dihydrosulfit đã được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất glycerin. Nguyên lý của nó là, acetaldehit bị bắt giữ, và do vậy không thể hoạt động như một chất nhận điện tử được nữa. Lúc này, thay cho acetaldehit, dihydroxiacetonphosphate được sử dụng làm chất nhận điện tử và bị khử thành glycerin-3-phosphate rồi tiếp tục bị loại phosphate để trở thành glycerin. Phương trình phản ứng diễn ra như sau :

Glucose + Dihydrosulfit → Glycerin + Acetaldehit-sulfit + CO2

Phương trình lên men cải biến này được gọi là dạng lên men Neuberg 2.

Khi bổ sung các chất kiềm (NaHCO3, Na2HPO4) thì glycerin cũng được tạo thành vì acetaldehit bị chuyển thành ethanol và acetate qua phản ứng hóa hai, và do vậy không còn hoàn thành được chức năng của một chất nhận điện tử. Phương trình lên men có tên là dạng lên men Neuberg 3 và được viết như sau :

Glucose + 2H2O → Ethanol + Acetate + 2Glycerin + 2CO2

Dạng lên men thông thường được Neuberg gọi là dạng lên men 1.

152

3. Hiệu ứng Pasteur Hiệu ứng Pasteur là sự ức chế lên men rượu (hay quá trình đường phân) bởi oxi (tức là bởi hô hấp hiếu khí). Sự chuyển sang hô hấp không những làm giảm sự tạo thành ethanol và CO2 mà còn làm giảm sự hấp thụ đường. Có hai cơ chế chịu trách nhiệm đối với hiện tượng này.

Một mặt, đó là sự cạnh tranh ADP và phosphate vô cơ giữa hai quá trình phosphorin chuỗi hô hấp và phosphorin hóa cơ chất. Sự loại dihydro xảy ra trong phản ứng oxi hóa glyceraldehyt-3-phosphate cần ADP và phosphate vô cơ (Pvc) :

Glyceraldehyt-3-phosphate + NAD + Pvc → 3-phosphoglicerate + NADH + ATP

Do vậy, sự chuyển hóa cơ chất (glucose) qua con đường EM phụ thuộc vào sự có mặt của ADP và phosphate. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sự phosphorin hóa chuỗi hô hấp cũng cạnh tranh ADP và phosphate để phát sinh ATP. Lúc đó nồng độ nội bào của ADP và phosphate giảm, và hậu quả là, sự chuyển hóa glucose và do vậy, sự tạo thành ethanol cũng sẽ giảm. Khi dùng đinitrophenol (DNP) để làm bất hoạt phosphorin hóa chuỗi hô hấp, ADP và phosphate lại trở nên có sẵn đối với phản ứng loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate, bởi vậy người ta thấy ngay trong điều kiện thóang khí, sự tiêu thụ glucose (cho lên men) vẫn tăng.

Cơ chế thứ hai chịu trách nhiệm đối với hiệu ứng Pasteur là cơ chế điều hoà bằng enzyme dị lập thể. Hình 3 tóm tắt những quan hệ điều hòa chủ chốt trong hiệu ứng này. Trong điều kiện thoáng khí, sự lên men rượu chỉ tạo thành một vài ATP tính trên mỗi phân tử glucose. Để duy trì sự cung cấp năng lượng, tế bào phải sử dụng nhiều glucose. Tỉ lệ của ATP/AMP trong trường hợp này rất thấp. Trái lại, khi oxi xâm nhập vào môi trường, ATP được tạo thêm rất nhiều nhờ sự quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp.

Enzyme chìa khóa dị lập thể điều hòa sự sử dụng glucose trong nấm men lên men rượu là phosphofructokinase. Đó là enzyme không thuận nghịch đầu tiên của con đường EM. Nó xúc tác cho sự phosphorin hóa fructose-6-phosphate thành fructose-1,6-điphophat nhờ ATP và bị kìm hãm dị lập thể bởi ATP. Sự kìm hãm theo cơ chế liên kết ngược này làm tăng nồng độ glucose-6-phosphate trong tế bào do tính thuận nghịch của phản ứng enzyme trước đó. Glucose-6-phosphate kìm hãm dị lập thể hexokinase, kìm hãm cả sự hấp thu glucose, do đó làm giảm sự tiêu thụ đường này.

153

Trong khi ATP kìm hãm dị lập thể phosphofructokinase thì AMP lại hoạt hóa nó. Bởi vậy một tỉ lệ ATP/AMP thấp như trong lên men lại kích thích sự hấp thu và sự trao đổi glucose.

Hoạt tính của phosphofructokinase cũng bị kìm hãm bởi xitrat. Nhờ chất hiệu ứng âm tính thứ hai này mà tác dụng kìm hãm của ATP được tăng cường, trái lại các ion amôn lại kích thích enzyme này.

Sự điều hòa mô tả ở trên có thể được chứng minh dễ dàng khi người ta đo nồng độ nội bào của glucose, glucose-6-phosphate, fructose-6-phosphate, fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate trước và sau khi chuyển từ điều kiện nuôi kị khí sang điều kiện nuôi hiếu khí. Ngay sau khi được thông khí, nồng độ glucose-6-phosphate và fructose-6-P của tế bào tăng nhanh, còn nồng độ của fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate lại giảm mạnh. ở đây, phosphofructosekinase hoạt động như một cái van được điều chỉnh bởi các ađenilat cũng như các chất trao đỗi trung gian khác. Nếu van bị đóng, các chất trao đổi nằm phía trên van sẽ bị ứ đọng, còn các chất nằm bên dưới van được tiếp tục chuyển hóa và do vậy, nồng độ giảm đi.

Hiệu ứng Pasteur cũng gặp ở vi khuẩn (chẳng hạn, ở E. coli) và ở mô động vật. Nguyên tắc điều hòa là giống nhau, chỉ có những khác biệt về loại chất hiệu ứng. Chẳng hạn, ở E. coli, không phải AMP mà ADP mới là chất hiệu ứng dương. Những cơ chế cơ bản của trao đỗi chất thì rất giống nhau, còn các cơ chế điều hòa thì thường có tính đặc hiệu loài và đặc hiệu chủng.

4.Kỹ thuật sản xuất ethanol nhờ nấm men

Các loài nấm men dùng trong sản xuất ethanol là các nấm đơn bào mang nhiều đặc điểm phong phú về sinh trưởng và phát triển. Các loài được quan tâm trước hết

trong sản xuất công nghiệp là Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum (carslbergensis), Schizosaccharomyces pombe và Kluyveromyces sp. Ngoài ra, nhiều biến chủng bắt nguồn từ các nấm men này đã được tạo ra nhờ kỹ thuật di truyền.

Các tính chất mong muốn của một quá trình sản xuất ethanol công nghiệp phụ thuộc nhiều vào việc lựa chọn chủng vi sinh vật dùng trong lên men. Các chủng này phải có một năng suất sản phẩm cao trên một đơn vị cơ chất được sử dụng, một tốc độ lên men cao, tính chịu cồn cần thiết, khả năng sống sót ở nhiệt độ cao, tính bền trong các điều kiện lên men và tính chịu pH thấp.

154

Khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau phụ thuộc vào loài. Nói chung, các cơ thể này có khả năng sinh trưởng và lên men ethanol có hiệu quả ở các giá trị pH giữa 3,5-6,0 và nhiệt độ từ 28-35oC. Hiện nay người ta quan tâm nhiều đến việc tạo ra các thể đột biến khuyết hô hấp từ nấm men nhờ việc sử dụng các tác nhân hóa học như các thuốc nhuộm hoặc các hợp chất làm biến tính protein. Các biến chủng này chứa ADN ti thể đã bị biến đổi theo hướng ức chế sự tạo ra các enzyme cần thiết cho sự trao đổi chất hiếu khí và do vậy thích hợp với sự tổng hợp rượu.

5. Hiệu suất lên men

Nấm men, dưới điều kiện kị khí chuyển hoá glucose thành ethanol trước hết bằng con đường Embden-Meyerhof. Phản ứng thật sứ bao gồm sự tạo thành 2 mol ethanol, 2 mol CO2 và 2 mol ATP trên mỗi mol glucose được lên men. Do vậy, về mặt trọng lượng mỗi gam glucose về lý thuyết có thể tạo ra 0,51 g rượu. Tuy nhiên sản lượng đạt được trong lên men thực tế thường không vượt quá 90-95% con số lý thuyết. Sở dĩ như vậy là vì một phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để tổng hợp sinh khối mới và cho các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế bào. Cũng còn có các phản ứng phụ xảy ra (thường dẫn tới Glycerin và sucxinat) tiêu thụ tới 4-5% cơ chất tổng số. Nếu loại trừ được các phản ứng này thì sản lượng ethanol có thể tăng thêm được 2,7%.

Một nồng độ nhỏ oxi cần phải được cung cấp cho nấm men lên men vì đây là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất béo chưa bão hòa và các lipit. Thông thường oxi được giữ trong dịch lên men ở nồng độ 0,05-0,1 mm Hg tính theo áp suất oxi. Bất cứ nồng độ nào nằm trên giới hạn đó đều sẽ kích thích sinh trưởng, vi phạm đến sự tạo thành ethanol (hiệu ứng Pasteur).

Các nhu cầu tương đối của các chất dinh dưỡng được dùng trong sự tổng hợp ethanol tỉ lệ thuận với các thành phần chính của tế bào nấm men. Chúng bao gồm C, O, N, và H. Thấp hơn một chút là P, S, K và Mg dùng để tổng hợp các thành phần thứ yếu. Các muối vô cơ (như Mn, Co, Cu, Zn) và các nhân tố sinh trưởng hữu cơ (acid amin, acid nucleic, và các vitamin) được yêu cấu dưới dạng vết.

Nhiều loại nguyên liệu dùng để sản xuất rượu ở quy mô lớn (như rỉ đường mía hay actiso Jerusalem) ngoài hiđrat C còn cung cấp toàn bộ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng của nấm men. Trong một số trường hợp, người ta cũng đưa thêm vào một số chất dinh dưỡng bổ sung như các muối amôn, phosphate K hay nguồn cao ngô rẻ tiền.

155

Hình 6.3: Hiệu ứng Pasteur

Cơ chế điều hòa nhờ enzyme dị lập thể Phosphofructosekinase

Nấm men rất mẫn cảm với sự ức chế bởi ethanol. Nồng độ 1-2% (w/v) đã đủ để làm chậm sinh trưởng của vi sinh vật và ở nồng độ cồn 10% (w/v) tốc độ sinh trưởng của nấm men gần như ngừng hẳn. Bản chất của hiện tượng kìm hãm này là rất phức tạp. Việc thêm cồn vào pha log làm giảm nhanh tốc độ sinh trưởng của nấm men (có lẽ do tác động lên sự tổng hợp protein), giảm khả năng sống sót của tế bào (qua sự biến tính không thuận nghịch của các enzyme), và ở một mức độ thấp hơn nhiều,

156

ethanol làm giảm tóc độ tổng hợp bản thân nó. Các dẫn liệu về mức độ chịu cồn của một số chủng nấm men phụ thuộc rất nhiều vào thành phần acid béo trong màng tế bào chất cho thấy rằng thành phần acid béo kích thích hoặc kìm hãm sự tiết ethanol khỏi bào tương. Các kết quả khác cung chứng minh được rằng ethanol được tạo ra trong lên men (ethanol tự sinh) ức chế lên sinh trưởng của tế bào mạnh hơn là ethanol được đưa vào một cách nhân tạo từ bên ngoài.

6. Sự tạo thành ethanol nhờ vi khuẩn

Trong số vi khuẩn, kiểu lên men rượu phổ biến ở nấm men (EM, piruvat-đecacboxilase) chỉ gặp ở Sarcina ventriculi. Đây là loài vi khuẩn chịu khí yếu, dễ dàng phân lập được từ đất, nhưng cũng gặp cả trong dịch tiêu hóa của những người mắc bệnh dạ dày. Các vi khuẩn này được coi là không bình thường vì có kích thước rất lớn (đường kính 4 μm), tạo nên các dạng hộp bao gói (chứa trên 64 tế bào mỗi hộp , được liên kết với nhau nhờ xenlulose), chịu pH (sinh trưởng được ở pH từ 0,9 đến 9,8) và tạo thành nội bào tử.

Từ dịch ép lên men của cây dứa dại (Agave americana) ở vùng Mexico người ta đã phân lập được một loài vi khuẩn hình que, di động, có lông roi ở hai cực, có khả năng tạo thành ethanol. Vi khuẩn này có tên là Zymomonas mobilis, phân giải glucose theo con đường 2-keto-3deoxi-6-phosphogluconat (KDPG) cắt piruvat thành acetaldehit và đioxit cacbon. Acetaldehit được khử thành ethanol. Ethanol, đioxit cacbon và một lượng nhỏ acid lactic là những sản phẩm lên men duy nhất. Người ta để ý rằng trong rượu mạnh chế từ dứa dại, các nguyên tử cacbon số 2 và số 3 cũng như số 5 và số 6 đã thay thế các nguyên tử cacbon số 1 và số 2 cũng như số 5 và số 6 trong rượu chế từ nấm men.

157

Trong quá trình lên men của một số Enterobacteriaceae và Clostridium, ethanol xuất hiện như một sản phẩm phụ. Tuy nhiên, tiền chất của ethanol, acetaldehit, không được giải phóng trực tiếp từ piruvat nhờ piruvatđecacboxilase mà được tạo thành nhờ sự khử acetil-CoA.

Các vi khuẩn lên men lactic dị hình (ví dụ Leuconostoc mesenteroides) tạo ra alcohol theo một con đường hoàn toàn khác. Qua các bước đầu tiên của con đường pentosephosphate (PP), glucose được phân giải thành pentosephosphate. Phosphoketolase tấn công vào xilulose -5- phosphate :

Xilulose-5-phosphate+Pvc→ Acetilphosphate + glyceraldehyt-3-phosphate

Acetilphosphate vừa tạo thành nhờ acetaldehit-đedihydrogenase và alcohol-đedihydrogenase sẽ được khử thành ethanol. Sản phẩm phân giải còn lại là glyceraldehyt-3-phosphate, sẽ được khử thành lactat qua piruvat.

VI. Lên men lactic và họ Lactobacteriaceae Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc dù nhóm này không có sự giống nhau về hình thái và, bao gồm cả vi khuẩn hình que dài, hình que ngắn lẫn các vi khuẩn hình cầu, song về mặt sinh lý chúng có chung các đặc điểm khá đặc trưng. Tất cả các đại diện đều là các vi khuẩn gram dương, không tạo thành bào tử (trừ Sporolactobacillus) và không di động. Để thu năng lượng chúng hoàn toàn phụ thuộc vào các hiđrat cacbon và tiết ra acid lactic (lactat).

Đối lập với các Enterobacteriaceae là bọn cũng sản sinh acid lactic, chúng thuộc bọn lên men bắt buộc. Chúng khác chứa các hemin (xitocrom, catalase). Mặc dù vậy, các vi khuẩn thuộc họ Lactobacteriaceae có khả năng sinh trưởng khi có mặt oxi không khí, chúng thuộc bọn kị khí song đồng thời cũng là bọn chịu khí. Một vi khuẩn sinh trưởng hiếu khí mà không chứa catalase thì gần như chắc chắn đó là một vi khuẩn lactic (trừ ngoại lệ Acetobacter peroxydans và Shigella dysenteriae).

1. Nhu cầu về các chất bổ sung và nhân tố sinh trưởng

Một đặc điểm nữa của các vi khuẩn lactic là có nhu cầu về các chất bổ sung. Không có đại diện nào có thể mọc được trên môi trường vô cơ thuần khiết chứa glucose và các muối amôn. Đa số trong chúng cần hàng loạt các vitamin (lactoflavin, tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin), và các acid amin, các bazơ purin và pirimiđin. Vì vậy người ta thường nuôi chúng trên các môi trường dinh dưỡng phức tạp chứa

158

những số lượng khá lớn cao nấm men, dịch cà chua, dịch đường sữa hoặc thậm chí cả máu nữa.

Điều ngạc nhiên là một số vi khuẩn lactic (và cả các vi khuẩn lên men khác) khi sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng chứa máu có thể tạo thành các xitocrom và thậm chí có thể tiến hành quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp. Vì vi khuẩn lactic thiếu năng lực tổng hợp các pocphirin nên khi các pocphirin được bổ sung vào môi trường thì một số vi khuẩn lactic có thể tạo thành các sắc tố hem tương ứng.

Vi khuẩn lactic được coi như những kẻ què quặt về trao đỗi chất. Có thể rằng do hậu quả của sự chuyên hóa sinh trưởng trong sữa hoặc trên những môi trường giàu chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng, chúng đã mất đi khả năng tổng hợp nhiều chất trao đỗi. Trong khi đó chúng lại có khả năng mà đa số các vi khuẩn khác không có, đó là khả năng sử dụng lactose.

Khả năng này nhiều vi khuẩn đường ruột (ví dụ Escherichia coli) cũng có. Lactose không có mặt trong giới thực vật, nó được các động vật có vú tạo thành và tiết ra cùng với sữa hoặc được hấp thu vào cùng với sữa. Việc sử dụng được lactose cũng có thể được xem như một sự thích nghi với các điều kiện tồn tại trong đường ruột của động vật có vú. Lactose là một đisaccarit, trước khi đi vào các con đường phân giải hexose nó phải được phân cắt :

Lactose + H2O D-glucose + D-galactose β- Galactozidase

Sau khi được phosphorin hóa galactose được chuyển thành glucosephosphate.

Do có sự sản sinh một lượng lớn lactat nên môi trường dinh dưỡng cần phải được trung hòa. Thường người ta dùng cacbonat canxi. Trên một môi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung cacbonat canxi có thể nhận ra sự tạo thành acid qua các vòng trong suốt bao quanh các khuẩn lạc.

Nơi sống chủ yếu của các vi khuẩn lactic là sữa và những nơi sản xuất và chế biến sữa, thực vật nguyên vẹn hoặc đang tự phân hủy, cũng như đường ruột và niêm mạc của người và động vật. Do tạo thành một lượng lớn lactat và do tính chịu chua mà dưới các điều kiện môi trường thích hợp các vi khuẩn lactic phát triển nhanh, vì vậy có thể dễ dàng phân lập các vi khuẩn lactic trên các môi trường dinh dưỡng chọn lọc.

159

2. Lên men lactic đồng hình Vi khuẩn lactic lên men đồng hình tạo thành toàn bộ hoặc gần như toàn bộ là lactat. Chúng phân giải glucose qua con đường EM, chứa các enzyme cần thiết, kể cả alđolase và chuyển dihydro tách ra trong quá trình loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate sang piruvat :

Glucose

2 NADH

Việc xuất hiện D-, L+ hay DL- lactat là phụ thuộc vào tính chuyên hóa không gian của enzyme vận chuyển lactat-đedihydrogenase và vào sự có mặt của một lactat-racemase.

Chỉ một phần nhỏ piruvat được loại cacboxil và chuyển thành acetate, ethanol, CO2 và acetoin. Việc tạo thành các sản phẩm phụ phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của oxi.

3. Lên men lactic dị hình

Vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con đường EM là alđolase và triosephosphate-isemerase. Đoạn phân giải glucose đầu tiên chỉ xảy ra qua con đường pentosephosphate, tức là qua glucose-6-phosphate, 6-phosphogluconat và ribulose-5-phosphate (hình). Chất này nhờ một epimerase được chuyển thành xilulose-5-phosphate và nhờ phosphoketolase được phân giải trong một phản ứng phụ thuộc taminpirophosphate làm xuất hiện glyceraldehyt-3-phosphate và acetilphosphate.

Các tế bào Leuconostoc mesenteroides không sinh trưởng và được rửa sạch đã lên men glucose thành lactat, ethanol và CO2 theo một tỉ lệ gần như tương đương:

C6H12O6 → CH3 - CHOH - COOH + CH3 - CH2 - OH + CO2

ở các cơ thể này acetilphosphate bị khử qua acetil-CoA và acetaldehit thành ethanol. Các vi khuẩn lên men dị hình khác chuyển một phần hoặc

2 Lactat

2 Piruvat 2 NAD

160

toàn bộ acetilphosphate thành acetate, trong đó liên kết phosphate giàu năng lượng được chuyển sang ADP và được sử dụng dưới dạng ATP.

Dihydro thừa trong trường hợp này được truyền cho glucose làm xuất hiện manit. Glyceraldehyt-3-phosphate được chuyển qua piruvat thành lactat. Ribose được L. mesenteroides lên men thành lactat và acetate.

*Lên men lactic dị hình ở Bifidobacterium

Vi khuẩn lactic dị hình Bifidobacterium bifidum có dạng chữ V hay chữ Y (bifidus tiếng Hi Lạp có nghĩa là bị chia đôi, bị phân cắt), là thành viên trong khu hệ đường ruột của trẻ sơ sinh, trước hết là các trẻ nuôi bằng sữa mẹ. Vi khuẩn này cần N-acetilglucosemin chỉ có trong sữa người mà không có trong sữa bò. Các đại diện thuộc chi Bifidobacterium là những vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt, không chịu khí và cần một khí quyển chứa CO2 (10% CO2) để sinh trưởng. Bifidobacterium chuyển hóa glucose theo phương trình :

2 C6H12O6 → 2 CH3 - CHOH - COOH + 3 CH3 - COOH

Bifidobacterium lên men glucose qua con đường phụ phosphoketolase, không chứa aldolase cũng như glucose-6-phosphat-dehydrogenase, song lại chứa các phosphoketolase hoạt động, phân giải fructose-6-phosphat và xilulose-6-phosphat thành acetilphosphate và eritro-4-phosphate hoặc glixeraldehyt-3-phosphate. Hexose được chuyển hóa theo con đường sau đây :

161

Hình 6.4: Lên men lactic dị hình :1. Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 2. Phosphogluconat-dedihydrogenase 3. Epimerase ; 4. Phosphoketolase

4. ứng dụng của lên men lactic

Nếu để dung dịch đường không khử trùng chứa cả các nguồn nitơ phức tạp và các chất sinh trưởng một cách tự nhiên trong trong điều kiện kị khí hoặc dưới dạng lớp cao thì các vi khuẩn lactic sẽ nhanh chóng phát triển ở phía bên trong. Chúng làm giảm pH xuống dưới 5 và qua đó ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn kị khí khác là bọn không có khả năng sinh trưởng ở độ chua này. Trong các môi trường làm giàu này nhóm vi khuẩn nào phát triển được là tuỳ thuộc vào các điều kiện đặc biệt. Nhờ đặc tính bảo quản và khử trùng dựa trên nguyên tắc acid hóa mà các vi khuẩn lactic

162

được sử dụng, trong nông nghiệp, trong nội trợ, trong ngành sản xuất và chế biến sữa.

4.1.Thức ăn ủ chua.

Vi khuẩn lactic phân bố trên các nguyên liệu thực vật giữ một vai trò to lớn trong việc bảo quản thức ăn gia súc. Để tạo điều kiện cho lên men lactic xảy ra, lá các loại cây lấy củ hoặc cỏ ... được nén chặt trong các hầm ủ, thêm rỉ đường để nâng cao tỉ lệ C/N và tạo độ chua ban đầu bằng cách thêm acid formic hay acid vô cơ.

4.2.Dưa là một sản phẩm của quá trình lên men lactic. Bắp cải được cắt nhỏ, trộn và bóp với muối ăn 2-3%. Trong điều kiện yếm khí, lên men lactic sẽ xảy ra một cách tự nhiên, lúc đầu bởi Leuconostoc - với sự tạo thành CO2, và về sau có sự tham gia của Lactobacillus plantarum.

4.3.Các sản phẩm sữa. Sữa có một thành phần dinh dưỡng cao, chứa nhiều nước và giàu các muối khoáng, protein (chủ yếu là cazein), mỡ bơ, đường (đặc biệt là lactose) và các vitamin. Ở trong bầu vú của động vật thì nó là vô trùng, nhưng khi đi ra khỏi núm vú thì sữa bị nhiễm bởi khu hệ bình thường của động vật, sau đó được bổ sung thêm bởi các vi sinh vật khác từ người vắt sữa, máy hoặc bình chứa.

Là một môi trường gần như hoàn hảo nên sữa rất mẫn cảm với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Khi để sữa ở trong phòng nhiều loại vi khuẩn sẽ lên men lactose tạo thành acid và làm thay đổi tính chất và kiến trúc của sữa. Quá trình này có thể xảy ra tự nhiên hoặc được con người bắt chước như trong qnầ trình sản xuất phomat hoặc iagua.

Trong các giai đoạn sớm của lên men sữa lactose bị tấn công nhanh bởi Streptococcus lactis và Lactobacillus spp. Sự tiết acid lactic và sự giảm pH làm protein của sữa bị đông lại thành cục vón (curd). Sự đông cũng làm tách riêng phần dịch đường sữa (whey) ở trên bề mặt. Cục vón cũng có thể được tạo nên nhờ tác dụng của vi sinh vật hoặc nhờ một enzyme (rennin) lấy từ dạ dày bê.

Một lít sữa nặng 1032g bao gồm 902g nước và 130g chất khô trong đó chứa 49g lactose; 39g chất béo (là những giọt mỡ đường kính 1-8 μm gồm glixerit và các chất tan trong lipit, như colesterol và các vitamin A, D, E, K; 32,7g protein mà chủ yếu là cazein; 9g chất khoáng (gồm phosphate, xitrat, KCl, NaCl và MgCl2).

*Sữa chua (sữa bơ). Sữa chua là sản phẩm của sự lên men sữa lỏng bằng sự để chua ngẫu nhiên dưới tác động của nhiều vi khuẩn sinh acid

163

lactic khác nhau (như Streptococcus lactis hay S. cremoris), hoặc của một số lượng ít hơn nhiều các vi khuẩn gây thơm (như Streptococcus diacetylacis, Betacoccus citrovorus) hoặc bằng việc cấy vào sữa đã đun nóng các giống vi khuẩn thuần khiết. Khi lên men diễn ra, lactose được chuyển hoá thành acid lactic, acid này sẽ ngưng kết cazein ở pH 4-5. Sữa đông, đặc, có vị chua, tùy theo vùng có tên gọi khác nhau. Sữa chua được làm từ sữa đầy đủ (chứa ít nhất 3% mỡ của sữa) thường được trộn với bột sữa đã vớt váng nhằm làm tăng hàm lượng chất rắn toàn phần và cải thiện cấu trúc gel protein. ở một số nước, sữa chua cũng được sản xuất từ sữa cừu, sữa trâu, sữa tuần lộc hoặc sữa ngựa. Kem chua được sản xuất bởi một quá trình rất giống quy trình dùng để sản xuất sữa chua chỉ trừ việc kem cà phê đã được sử dụng làm nguyên liệu thô.

*Iagua. Iagua được làm từ các loại sữa chứa các hàm lượng mỡ khác nhau bằng cách lên men nhờ các giống đặc biệt. Nó có một độ đông đặc mịn giống như gel, một độ chua rõ rệt và hương vị dễ chịu, khác biệt rõ ràng với loại sữa chua bình thường. Iagua được sản xuất bằng cách cấy vào sữa đã khử trùng Pasteur đồng nhất khoảng 1,5-3% các vi khuẩn lactic ưa nhiệt (giống hỗn hợp của một hoặc nhiều chủng như Streptococcus thermophilus hay Lactobacillus bulgaricus) và sau đó giữ ở 42-45oC trong khoảng 3 giờ. Độ quánh mịn được hình thành trong thời gian này. Sản phẩm cuối cùng có vị chua (độ chua 40-60oSH). Phần quan trọng trong hương thơm đặc biệt của iagua là các hợp chất cacbonyl với đixetyl và acetaldehit chiếm ưu thế. Một loại igua đặc biệt có tên là sữa aciđophilus được sản xuất nhờ Lactobacillus acidophilú. Việc thêm đường và hoa quả vào iagua (iagua hoa quả) làm tăng đáng kể sức tiêu thụ sản phẩm này.

*Kefia và Kumis. Kefia và Kumis là các loại đồ uống chứa rượu giàu CO2, nhiều bọt. Khu hệ vi sinh vật bao gồm nấm men Torula (chịu trách nhiệm đối với quá trình lên men rượu) và các vi khuẩn Streptococcus lactis và Lactobacillus caucaticus (chịu trách nhiệm đối với lên men lactic). Các hạt kefia dùng để sản xuất kefia chứa các cục sữa đông cộng với các vi khuẩn kefia. Kumis được làm từ sữa ngựa hay sữa dê do các giống kumis thuần khiết (Thermobacterrium bulgaricus và nấm men Candida) . Cả hai đồ uống làm từ sữa này đều là các sản phẩm địa phương của vùng Caucasus và các vùng thảo nguyên Turkestan. Kefia chứa acid lactic (0,5- 1%), một số lượng rượu đáng kể (0,5-2%), CO2 và một số sản phẩm phân giải cazein sinh ra từ hoạt động phân giải protein của nấm men.

*Phomat. Phomat là sản phẩm thu được từ sữa đông bằng cách loại bỏ dịch đường sữa và bằng cách làm chín cục vón khi có mặt một khu hệ

164

vi sinh vật đặc biệt. Có nhiều loại phomat với hình dạng và kích thước khác nhau. được xếp thành nhóm dựa vào loại sữa sử dụng (bò, dê, cừu), sự tạo thành cục vón (dùng acid, dùng rennin hay dùng cả hai), kiến trúc hay độ đặc, và hàm lượng chất béo. Trong từng nhóm, các loại phomat riêng biệt được đặc trưng bởi hương thơm. Sự sản xuất phomat về cơ bản bao gồm hai công đoạn : sự tạo thành cục vón và quá trình làm chín.

*Sự tạo thành cục vón

Hàm lượng chất béo của sữa được điều chỉnh tới mức độ mong mnốn, và khi cần, hàm lượng protein cũng được điều chỉnh. Các chất phụ gia bao gồm muối canxi nhằm cải thiện sự ngưng kết protein và kiến trúc của phomat, nitrat để kìm hãm khu hệ vi khuẩn kị khí hình thành bào tử và các sắc tố tạo màu. Sữa thô hoặc sữa đã khử trùng được trộn trong một bể ở nhiệt độ 15-59oC với một loại giống khởi động (vi khuẩn lactic hay vi khuẩn propionic, nấm sợi, như Penicillium camemberti, P. candidum, P. roqueforti , các vi khuẩn mang sắc tố màu vàng hoặc màu đỏ như Bacterium linens, cùng các cầu khuẩn và nấm men) và sữa sẽ đông lại thành một khối bán lỏng mềm, cụcvón, sau lên men lactic, được nối tiếp bằng sự bổ sung rennin hoặc một tổ hợp nào đó mà thông thường nhất là tổ hợp giữa acid và rennin. Gel protein này sẽ được cắt thành các hình khối nhỏ trong lúc đang được đun nóng rồi sau đó được khuấy nhẹ. Dịch đường sữa được loại bỏ còn phần cục vón chứa mỡ thì được chuyển sang quá trình làm rắn. Khi độ rắn mong muốn đã đạt được, cục vón được chuyển sang quá trình làm chín.

*Làm chín

Quá trình làm chín phụ thuộc vào thành phần khối phomat, đặc biệt là hàm lượng nước, khu hệ vi sinh vật và các điều kiện bên ngoài như nhiệt độ và độ ẩm của các phòng làm chín. Sự chín của phomat mềm xảy ra từ ngoài vào trong, vì thế trong giai đoạn đầu sẽ có một phần vỏ chín và một phần lõi chưa chín. Sự chín không đồng đều xảy ra là do có sự chênh lệch về pH. ở bên trong khối phomat, pH thấp vì có mặt acid lactic. ở ngoài vỏ, các loài nấm sợi đặc trưng phát triển thích hợp hơn ở các pH cao đã nâng pH lên nhờ phản ứng loại CO2 từ các amino acid.

Sự chín ở phomat cứng xảy ra đồng đều trên toàn bộ khối phomat. Sự tạo thành vỏ chỉ là kết quả của sự khô bề mặt, điều này có thể tránh được nhờ việc bao gói khối phomat trong các màng plastic thích hợp trước khi quá trình làm chín bắt đầu. Thời gian làm chín thay đổi tùy trường hợp, kéo dài từ vài ngày đối với phomat mềm tới vài tháng thậm chí vài

165

năm đối với các loại phomat cứng. Sản lượng trên 100 kg sữa nước là 8 kg phomat cứng và tới 12 kg phomat mềm.

Mọi thành phần của phomat đều chịu sự biến đổi về mặt sinh hoá học ở các mức độ khác nhau trong quá trình làm chín. Lactose được phân giải thành acid lactic nhờ lên men lactic đồng hình. Trong loại phomat cheđa chẳng hạn, pH giảm từ 6,55 xuống 5,15 tính từ lúc bổ sung giống khởi động cho tới khi đúc thành khuôn. Khi có mặt vi khuẩn propionic (như trong trường hợp của phomat Emmental), acid lactic được chuyển hóa tiếp tục thành acid propionic, acid acetic, và CO2 theo phản ứng :

3 CH3CHOHCOOH → 2 CH3CH2COOH + CH3COOH + CO2 + H2O

Tỉ lệ giữa acid propionic và acid acetic bị ảnh hưởng bởi thế oxi hóa khử của phomat và tỉ lệ này sẽ thấp khi có mặt muối nitrat chăng hạn. Phương thức và mức độ phân giải mỡ của sữa phụ thuộc vào khu hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình làm chín phomat. Sự giải phóng các acid béo, đặc biệt là các acid ảnh hương đến hương thơm của phomat phụ thuộc vào tính đặc hiệu của các lipase.

Ngoài các acid béo tự do, 2-alkanon và 2-alkanol cũng được tạo thành như các sản phẩm phụ của sự β-oxi hoá các acid béo. Nấm sợi, đặc biệt là Penicillium roqueorti, sử dụng β-ketoaxyl-CoA đeaxylase (tiodihydroase) và β-ketoacid đecacboxylase để cung cấp các hợp chất điển hình cho hương thơm của các phomat bán mềm.

Sự phân giải protein thành các amino acid xảy ra qua các peptit như ìà các sản phẩm trung gian. Tùy thuộc vào loại sữa mà 20-40% cazein được chuyển hoá thành các dẫn xuất protein hòa tan trong đó 5-15% là các acid amin. Phạm vi pH 3-6 là tối ưu đối với hoạt tính proteinase của Penicillium roqueorti. Sự phân giải protein bị ảnh hưởng mạnh bởi hàm lượng muối chứa trong phomat. Hàm lượng amino acid là 2,6-9% phần chất rắn của phomat và là phần quan trọng trong hương thơm của phomat. Những lỗi trong quá trình làm chín có thể tạo nên những peptit có vị đắng.

Các amino acid được chuyển hóa tiếp tục. Trong giai đoạn sớm của sự làm chín, với pH thấp, chúng bị loại CO2 thành các amino. Trong giai đoạn muộn, với pH cao, các phản ứng oxi hoá chiếm ưu thế. Sự phân giải protein không chỉ đóng góp vào sự tạo thành hương thơm, nó còn ảnh hưởng đến kiến trúc của phomat. Khi phomat mềm bị làm chín quá mức, sự phân giải protein có thể dẫn đến việc dịch hóa gần như toàn bộ khối phomat.

166

Câu hỏi ôn tập chương 8 1. Trong tế bào, quá trình đường phân diễn ra ở đâu ? Phản ứng này

khác nhau như thế nào khi không có mặt oxy và khi có mặt oxy ?

2. Phân tử nào mở đầu con đường đường phân ? Khi đường phân hoàn thành, phân tử nào còn lại. Bao nhiêu ATP được tạo thành ở mức độ phosphoril hóa cơ chất ? Con số ATP được tạo thành là bao nhiêu, và vì sao con số này lại khác với tổng số ATP được tạo thành ? Bao nhiêu ATP sẽ được tạo thành bổ sung nếu oxy có mặt ?

3. Khi nguông glucose là không hạn chế thì cái gì sẽ là nhân tố giới hạn trong phản ứng đường phân ?

4. Hai cơ chế tái tạo NAD+ là những cơ chế nào ? Chúng khác nhau ở chỗ nào ? Đâu là một quá trình hiếu khí và đâu là một quá trình kị khí ?

5. Lên men khác hô hấp oxy hóa chỗ nào khi xét về phương diện các chất nhận điện tử và sự sản sinh năng lượng ?

6. Sự trao đổi điện tử để tạo nên ATP khác nhau như thế nào trong các trường hợp NADH được tạo thành trong đường phân, NADH được tạo thành trong chu trình acid citric, và FADH2 được tạo thành trong chu trình acid citric ?

7. Hiệu quả của việc phân giải hiếu khí hoàn toàn một phân tử glucose ở vi khuẩn là bao nhiêu ? So sánh với hiệu quả của một mình đường phân?

8. Hiệu ứng Pasteur có gặp ở các vi khuẩn lên men lactic đồng hình không ? Vì sao ?

9. Giải thích tại sao ở một số nấm men, như Rhodotorula hay Geotrichum, khi thừa nguồn C, đồng thời thiếu N và P thì lipit lại được tích lũy ?

10. Cho ví dụ về những trường hợp lên men ở vi khuẩn trong đó có sự tạo thành nhiều hơn 2 mol ATP trên một mol glucose bị phân hủy.

144

Chương 8

Các quá trình lên men I. Con đường Embden-Meyerhof (EM) : Bước chuyển hóa chung cho các quá trình lên men

Lên men là một quá trình oxi hóa-khử cân bằng nội sinh, trong đó một số nguyên tử của nguồn năng lượng (chất cho điện tử) trở nên có tính khử hơn, trong khi một số nguyên tử khác trở nên oxi hóa hơn, còn năng lượng thì được sinh ra nhờ sự phosphorin hóa cơ chất. Con đường trao đồi chất chung đối với sự lên men glucose là con đường đường phân, cũng còn được gọi là con đường Embden-Meyerhof. Đường phân được chia thành ba bước chính, mỗi bước gồm một số phản ứng riêng biệt do enzyme xúc tác. Bước một gồm các phản ứng chuẩn bị, không có các phản ứng oxi hóa và cũng không giải phóng năng lượng, song lại dẫn đến việc tạo ra hai phân tử trung gian quan trọng, glixeraldehit-3-phosphate (GAP). Trong bước hai, sự oxi hóa-khử xảy ra, năng lượng được dự trữ dưới dạng ATP và hai phân tử piruvat được tạo thành. Trong bước ba, một phản ứng oxi hóa-khử thứ hai xảy ra và các sản phẩm lên men (chẳng hạn ethanol và CO2, hoặc acid lactic), sẽ được tạo thành. Trong sự tạo thành hai phân tử acid 1,3 điphosphoglixeric có hai phân tử NAD+ bị khử thành NADH. Tuy nhiên, một tế bào chỉ chứa một lượng nhỏ NAD+, và nếu như toàn bộ NAD+ bị chuyển thành NADH thì phản ứng oxi hóa glucose sẽ bị đình chỉ; sự oxi hóa tiếp tục chỉ có thể xảy ra khi một phân tử NAD+ có mặt để tiếp nhận các điện tử vừa được giải phóng ra. Sự "tắc đường" này có thể được khắc phục trong lên men bằng cách oxi hóa NADH trở lại thành NAD+ nhờ các phản ứng khử piruvat thành một trong hàng loạt các sản phẳm lên men khác nhau. Trong trường hợp của nấm men, piruvat bị khử thành ethanol với sự giải phóng CO2. ở các vi khuẩn lactic, piruvat bị khử thành acid lactic.

Nhiều con đường khử piruvat cũng gặp ở các vi sinh vật nhân sơ khác, song kết quả thật sự đều giống nhau, tức là NADH phải được hồi phục lại thành dạng oxi hóa, NAD+, để cho các phản ứng thu nhận năng lượng của lên men có thể tiếp tục. Là một coenzyme dễ khuếch tán, NADH có thể tách khỏi GAP-dedihydrogenase, gắn vào một enzyme khác, (chẳng hạn lactat-dedihydrogenase, enzyme khử piruvat thành acid lactic), rồi lại lập tức khuếch tán trở lại sau khi NADH đã được oxi hóa thành NAD+ để lặp lại chu trình một lần nữa.

145

Trong bất kỳ một phản ứng thu năng lượng nào, sự oxi hóa bao giờ cũng phải được cân bằng với sự khử và phải có một chất nhận nào đó đứng chờ sẵn để nhận một điện tử vừa được tách ra. Trong trường hợp này, sự khử NAD+ tại một bước trong con đường đường phân sẽ được cân bằng bởi sự oxi hóa nó tại một bước khác. (Các) sản phẫm cuối cùng cũng phải nằm trong trạng thái cân bằng oxi hóa-khử với cơ chất ban đầu, tức là glucose. Bảng 6.1: Các quá trình lên men phổ biến ở vi sinh vật

Kiểu lên men

Phản ứng tổng thể Vi sinh vật thực hiện

Lên men rượu Hexose → 2 Ethanol + 2 CO2 Nấm men Zymomonas

Lên men lactic đồng hình

Hexose → 2 Lactat + 2 H+ Streptococcus Một số Lactobacillus

Lên men lactic dị hình

Hexose → Lactat + Ethanol + CO2 + H+

Leuconostoc Một số Lactobacillus

Acid propionic Lactat → Propionat + Acetate + CO2

Propionibacterium Clostridium propionicum

Acid hỗn hợp Hexose → Ethanol + 2,3-Butandiol + Xucxinat + Lactat + Acetate + Focmat + H2 + CO2

Các vi khuẩn đường ruột Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter

Acid butiric Hexose → Butirat + Acetate + H2 + CO2

Clostridium butyricum

Butanol Hexose → Butanol + Acetate + Aceton + Ethanol + H2 + CO2

Clostridium acetobutylicum

Caproat Ethanol + Acetate + CO2 → Caproat + Butirat + H2

Clostridium kluyveri

Homoacetic Fructose → 3 Acetate + 3 H+

4 H2+ 2 CO2 + H+ → Acetate + 2 H2O

Clostridium aceticum Acetobacterium

Sinh methane Acetate + H2O → CH4 + HCO −

3

Methanothrix Methanosarcina

II. Tính đa dạng của lên men Bảng 6.1 trình bày một số kiểu lên men chính được phân loại dựa

trên các sản phẩm được tạo thành. Đó là các quá trình lên men rượu, acid lactic, acid propionic, acid hỗn hợp, acid butiric và acid homoacetic. Có nhiều quá trình lên men được phân loại dựa trên cơ chất được lên men

146

thay vì các sản phẩm. Chẳng hạn, nhiều vi khuẩn kị khí tạo thành bào tử (chi Clostridium) lên men các amino acidvới sự sản sinh acetate, amoniac và H2. Các loài Clostridium khác, như C. acidiurici và C. purinolyticum lên men các purin như xantin hoặc ađenin với sự tạo thành acetate, focmat, CO2, và amoniac. Còn những bọn kị khí khác thì lên men các hợp chất thơm. Chẳng hạn, vi khuẩn Pelobacter acidigallici lên men hợp chất thơm phloroglucinol (1,3,5-benzenetriol, C6H6O3) theo con đường sau :

Phloroglucinol (C6H6O3) +3 H2O → 3 acetate- + 3H+, ΔGo' = -142,5 kJ/phản ứng

Nhiều quá trình lên men không thông thường chỉ được thực hiện bởi một nhóm rất hạn chế các vi khuẩn kị khí, và trong một sồ trường hợp chỉ bởi một vi khuẩn duy nhất. Một số ví dụ được nêu trên bảng 6.2. Nhiều trong số các vi khuẩn này có thể được xem như các chuyên gia về trao đổi chất vì chúng có khả năng phân giải một hoặc nhiều cơ chất mà các vi khuẩn khác không phân giải được.

Bảng 6. 2: Một số quá trình lên men không thông thường

Kiểu lên men

Phản ứng cân bằng tổng thể

Vi sinh vật thực hiện

Acetylen 2 C2H2 + 3 H2O → Ethanol + Acetate + H+

Pelobacter acetylenicus

Glycerin 4 Glycerin + 2 HCO → −3

7 Acetate + 5 H+ + 4 H2O

Acetobacterium spp.

Resocxinol (một hợp chất thơm)

2 C6H4(OH)2 + 6 H2O → 4 Acetate + Butirat + 5 H+

Clostridium spp.

Xinamat (một hợp chất thơm)

2C9H7O2 + 2 H2O → C9H9O2 + Benseat + Acetate + H+

Acetovibrio multivorans

Phlorogluxinol (một hợp chất thơm)

C6H6O3 + 3 H2O → 3 Acetate + 3 H+

Pelobacter masiliensis Pelobacter acidigallici

Putresxin 10 C4H12N2 + 26 H2O → 6 Acetate + 7 Butirat + 20 NH4

+ + 16 H2 + 13 H+

Các vi khuẩn kị khí gram dương không sinh bào tử, chưa phân loại

Xitrat Xitrat + 2 H2O → Focmat + 2 Acetate + HCO + H−

3+

Bacteroides sp.

Aconitat Aconitat + H++ 2 H2O → 2 CO2 + 2 Acetate + H2

Acidaminococcus fermentans

Glioxilat 4 Glioxilat +3 H+ + 3 H2O → 6 Vi khuẩn gram âm chưa

147

CO2 + 5 H2 + Glicolat phân loại Xucxinat Xucxinat + H2O → Propionat +

HCO −3

Propionigenium modestum

Oxalat Oxalat + H2O → Focmat + HCO −

3

Oxalobacter formigenes

Malonat Malonat + H2O → Acetate + HCO −

3

Malonomonas rubra Sporomusa malonica

III. Lên men không có sự phosphorin hóa cơ chất Với một số cơ chất, năng lượng sinh ra không đủ để ghép đôi với sự tổng hợp ATP trực tiếp nhờ phosphorin hóa cơ chất, tuy nhiên các hợp chất này vẫn trợ giúp sinh trưởng lên men của một cơ thể nào đó. Trong những trường hợp này sự phân giải cơ chất được gắn liền với những bơm ion được dùng để tạo nên một građien proton hoặc natri qua màng. Ví dụ về kiểu này có các quá trình lên men của Propionigenium modestum hoặc Oxalobacter formigenes, cả hai đều gắn sự lên men các acid đicacboxilic với các bơm ion sinh năng lượng liên kết với màng. Propionigenium modestum thực hiện phản ứng sau đây :

Xucxinat2- + H2O → Propionat- + HCO3- , ΔGo' = -20,5 kJ/phản ứng

Phương trình tổng thể này thu không đủ năng lượng tự do để ghép đôi với sự tổng hợp ATP trực tiếp nhờ phosphorin hóa cơ chất, tuy nhiên nó lại được dùng làm phản ứng thu năng lượng duy nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn. Sở dĩ như vậy là vì sự loại CO2 khỏi xucxinat

148

Hình 6.1: Lên men liên kết với bơm ion ở vi khuẩn

(năng lượng thu được không qua phosphorin hóa cơ chất) (qua metilmalonil-CoA và đecacboxilase liên kết với màng bởi Propionigenium modestum đã được ghép đôi với sự xuất Na+ qua màng tế bào chất. Một ATPse chuyển vị Na+ nằm trên màng của P. modestum sử dụng građien này để hoạt hóa sự tổng hợp ATP.

Oxalobacter formigenes thực hiện sự lên men oxalat :

Oxalat2- + H2O → Focmat- + HCO3- , ΔGo' = -26,7 kJ/phản ứng

ở pH trung tính, oxalat tồn tại dưới dạng ion hóa oxalat-, và sự loại cacboxil thành focmat- tiêu thụ một proton. Sau đó sự xuất focmat- khỏi tế bào sẽ tạo nên một động lực nhờ proton (proton motive force = PMF) có khả năng ghép đôi với sự tổng hợp ATP nhờ một ATPase chuyển vị proton nằm trên màng.

149

Điều thú vị và độc đáo trong trao đỗi chất của cả Propionigenium modestum lẫn Oxalobacter formigenes nằm ở chỗ sự tổng hợp ATP xảy ra không cần cả phosphoril hóa cơ chất lẫn chuỗi vận chuyển điện tử; tuy nhiên, sự tạo thành ATP theo cơ chế hóa thẩm vẫn xảy ra dựa vào một bơm Na+/H+ kết hợp với sự loại CO2 khỏi các acid hữu cơ. Điều cần rút ra từ những sự lên men này là : các phản ứng, dù chỉ thu được dưới 31,8 kJ, con số cần thiết để tạo thành một ATP, hoặc không có khả năng ghép đôi với sự phosphorin hóa cơ chất, cũng không thể lập tức bị coi là không có khả năng trợ giúp sinh trưởng cho một vi khuẩn. Nếu như phản ứng có thể ghép đôi được với một građien ion thì sự sản sinh ATP vẫn có khả năng xảy ra và do vậy vẫn có sinh trưởng (Hình 6.1).

IV. Hiện tượng cộng dưỡng (syntrophy) Trong vi sinh vật học có nhiều ví dụ về hiện tượng cộng dưỡng, một hiện tượng mà hai sinh vật khác nhau có thể cùng nhau phân giải một chất nào đó - và bảo toàn năng lượng của quá trình phân giải đến mức không cơ thể nào trong hai cơ thể đó một mình có thể làm được.

Trong đa số trường hợp, bản chất của một phản ứng cộng dưỡng có liên quan tới khí dihydro (H2) sinh ra bởi một trong hai đối tác và được tiêu thụ bởi đối tác kia.

Do vậy, cho đến nay, cộng dưỡng cũng còn được gọi là sự chuyển H2 liên loài. Kẻ tiêu thụ H2 có thể là bất kỳ một cơ thể nào trong số các vi khuẩn khử sunfat, lên men homoacetate, và vi khuẩn sinh methane. Hãy xem xét trường hợp cộng dưỡng liên quan tới quá trình lên men ethanol thành acetate và sự sản sinh methane sau đó. Như có thể thấy trên hình 2, bọn lên men ethanol thực hiện một phản ứng không thuận lợi về mặt năng lượng tự do (ΔGo' dương). Tuy nhiên, H2 được sinh ra bởi đối tác lên men rượu lại là một chất cho điện tử đầy giá trị đối với quá trình hình thành methane do một vi khuẩn sinh methane thực hiện. Và khi cộng hai phản ứng lại thì phản ứng tổng thể sẽ là một phản ứng toả nhiệt và có thể trợ giúp sinh trưởng của cả hai đối tác trong hỗn hợp cộng dưỡng. Lên men ethanol 2CH3CH2OH + 2H2O → 4H2 + 2CH3COO- +2H+ +19,4 kJ /phản ứng Sinh methane 4H2+ CO2 → CH4 + 2H2O - 130,7 kJ/phản ứng Phản ứng cộng dưỡng 2CH3CH2OH + CO2 → CH4 + 2CH3COO- - 111,3 kJ/phản ứng

150

Một ví dụ khác của hiện tượng cộng dưỡng là sự oxi hóa butirat thành acetate cộng với H2 bởi vi khuẩn cộng dưỡng oxi hóa acid béo Syntrophomonas:

Butirat- + 2H2O → 2acetate- + H+ + 2H2 , ΔGo' = +48,2 kJ/phản ứng

Sự biến đổi năng lượng tự do của phản ứng này rất không thuận lợi và trong ống giống thuần khiết, Syntrophomonas không thể mọc được trên butirat. Song nếu H2 vừa sinh ra trong phản ứng được tiêu thụ ngay bởi một cơ thể đối tác (như một vi khuẩn sinh methane) thì Syntrophomonas lại sinh trưởng rất tốt trong ống giống cấy chung với bọn tiêu thụ H2.

V. Lên men rượu nhờ nấm men và vi khuẩn Ethanol là một trong số các sản phẩm lên men phổ biến nhất gặp ở vi sinh vật. Bản thân thực vật và nhiều loài nấm cũng tích lũy ethanol dưới các điều kiện kị khí. Vi sinh vật sản sinh ethanol chủ yếu là nấm men, đặc biệt là các chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae. Giống như đa số nấm, nấm men là những cơ thể hô hấp hiếu khí, nhưng khi vắng mặt không khí chúng sẽ lên men hiđrat cacbon thành ethanol và CO2. Nhiều vi khuẩn kị khí và hiếu khí cũng tạo thành ethanol như các sản phẩm chính hoặc sản phẩm phụ khi lên men các hexose hoặc pentose.

1. Sự tạo thành ethanol nhờ nấm men

Sự lên men glucose thành ethanol và CO2 nhờ Saccharomyces cerevisiae diễn ra theo con đường Embden-Meyerhof. Sự chuyển hóa piruvat thành ethanol gồm hai bước. Trong bước một, piruvat được loại CO2 thành acetaldehit nhờ piruvat-đecacboxilase với sự tham gia của tiaminpirophosphate. Trong bước sau, acetaldehit bị khử thành ethanol nhờ alcohol-đedihydrogenase chứa NADH.

2CO2

2NAD 2NADH

2 Piruvat

2 Acetaldehyt

Glucose

2Ethanol

151

Bằng sự chuyền H này, dihydro tách ra do triosephosphate-dehydrogenase xúc tác sẽ được tiêu thụ, nhờ vậy trạng thái oxi hóa-khử sẽ được cân bằng.

2. Các dạng phương trình Neuberg

Các phương pháp và phát hiện của Carl Neuberg về lên men rượu không chỉ có ý nghĩa lịch sử. Ông đã khám phá ra rằng, không chỉ glucose mà cả piruvat cũng được nấm men lên men và acetaldehit xuất hiện như một sản phẩm trung gian có thể bị bắt giữ bởi dihydrosulfit. Dihydrosulfit vốn không độc đối với nấm men. Nếu bổ sung dihydrosulfit vào một môi trường chứa glucose đang được nấm men lên men thì acetaldehit sẽ bị kết tủa do tạo thành phức chất :

CH3-CHO + NaHSO3 → CH3- CHOH -SO3Na

Lúc đó glycerin sẽ xuất hiện như một sản phẩm lên men mới, đồng thời hiệu suất ethanol và CO2 sẽ giảm xuống.

Lên men với sự có mặt của dihydrosulfit đã được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất glycerin. Nguyên lý của nó là, acetaldehit bị bắt giữ, và do vậy không thể hoạt động như một chất nhận điện tử được nữa. Lúc này, thay cho acetaldehit, dihydroxiacetonphosphate được sử dụng làm chất nhận điện tử và bị khử thành glycerin-3-phosphate rồi tiếp tục bị loại phosphate để trở thành glycerin. Phương trình phản ứng diễn ra như sau :

Glucose + Dihydrosulfit → Glycerin + Acetaldehit-sulfit + CO2

Phương trình lên men cải biến này được gọi là dạng lên men Neuberg 2.

Khi bổ sung các chất kiềm (NaHCO3, Na2HPO4) thì glycerin cũng được tạo thành vì acetaldehit bị chuyển thành ethanol và acetate qua phản ứng hóa hai, và do vậy không còn hoàn thành được chức năng của một chất nhận điện tử. Phương trình lên men có tên là dạng lên men Neuberg 3 và được viết như sau :

Glucose + 2H2O → Ethanol + Acetate + 2Glycerin + 2CO2

Dạng lên men thông thường được Neuberg gọi là dạng lên men 1.

152

3. Hiệu ứng Pasteur Hiệu ứng Pasteur là sự ức chế lên men rượu (hay quá trình đường phân) bởi oxi (tức là bởi hô hấp hiếu khí). Sự chuyển sang hô hấp không những làm giảm sự tạo thành ethanol và CO2 mà còn làm giảm sự hấp thụ đường. Có hai cơ chế chịu trách nhiệm đối với hiện tượng này.

Một mặt, đó là sự cạnh tranh ADP và phosphate vô cơ giữa hai quá trình phosphorin chuỗi hô hấp và phosphorin hóa cơ chất. Sự loại dihydro xảy ra trong phản ứng oxi hóa glyceraldehyt-3-phosphate cần ADP và phosphate vô cơ (Pvc) :

Glyceraldehyt-3-phosphate + NAD + Pvc → 3-phosphoglicerate + NADH + ATP

Do vậy, sự chuyển hóa cơ chất (glucose) qua con đường EM phụ thuộc vào sự có mặt của ADP và phosphate. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sự phosphorin hóa chuỗi hô hấp cũng cạnh tranh ADP và phosphate để phát sinh ATP. Lúc đó nồng độ nội bào của ADP và phosphate giảm, và hậu quả là, sự chuyển hóa glucose và do vậy, sự tạo thành ethanol cũng sẽ giảm. Khi dùng đinitrophenol (DNP) để làm bất hoạt phosphorin hóa chuỗi hô hấp, ADP và phosphate lại trở nên có sẵn đối với phản ứng loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate, bởi vậy người ta thấy ngay trong điều kiện thóang khí, sự tiêu thụ glucose (cho lên men) vẫn tăng.

Cơ chế thứ hai chịu trách nhiệm đối với hiệu ứng Pasteur là cơ chế điều hoà bằng enzyme dị lập thể. Hình 3 tóm tắt những quan hệ điều hòa chủ chốt trong hiệu ứng này. Trong điều kiện thoáng khí, sự lên men rượu chỉ tạo thành một vài ATP tính trên mỗi phân tử glucose. Để duy trì sự cung cấp năng lượng, tế bào phải sử dụng nhiều glucose. Tỉ lệ của ATP/AMP trong trường hợp này rất thấp. Trái lại, khi oxi xâm nhập vào môi trường, ATP được tạo thêm rất nhiều nhờ sự quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp.

Enzyme chìa khóa dị lập thể điều hòa sự sử dụng glucose trong nấm men lên men rượu là phosphofructokinase. Đó là enzyme không thuận nghịch đầu tiên của con đường EM. Nó xúc tác cho sự phosphorin hóa fructose-6-phosphate thành fructose-1,6-điphophat nhờ ATP và bị kìm hãm dị lập thể bởi ATP. Sự kìm hãm theo cơ chế liên kết ngược này làm tăng nồng độ glucose-6-phosphate trong tế bào do tính thuận nghịch của phản ứng enzyme trước đó. Glucose-6-phosphate kìm hãm dị lập thể hexokinase, kìm hãm cả sự hấp thu glucose, do đó làm giảm sự tiêu thụ đường này.

153

Trong khi ATP kìm hãm dị lập thể phosphofructokinase thì AMP lại hoạt hóa nó. Bởi vậy một tỉ lệ ATP/AMP thấp như trong lên men lại kích thích sự hấp thu và sự trao đổi glucose.

Hoạt tính của phosphofructokinase cũng bị kìm hãm bởi xitrat. Nhờ chất hiệu ứng âm tính thứ hai này mà tác dụng kìm hãm của ATP được tăng cường, trái lại các ion amôn lại kích thích enzyme này.

Sự điều hòa mô tả ở trên có thể được chứng minh dễ dàng khi người ta đo nồng độ nội bào của glucose, glucose-6-phosphate, fructose-6-phosphate, fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate trước và sau khi chuyển từ điều kiện nuôi kị khí sang điều kiện nuôi hiếu khí. Ngay sau khi được thông khí, nồng độ glucose-6-phosphate và fructose-6-P của tế bào tăng nhanh, còn nồng độ của fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate lại giảm mạnh. ở đây, phosphofructosekinase hoạt động như một cái van được điều chỉnh bởi các ađenilat cũng như các chất trao đỗi trung gian khác. Nếu van bị đóng, các chất trao đổi nằm phía trên van sẽ bị ứ đọng, còn các chất nằm bên dưới van được tiếp tục chuyển hóa và do vậy, nồng độ giảm đi.

Hiệu ứng Pasteur cũng gặp ở vi khuẩn (chẳng hạn, ở E. coli) và ở mô động vật. Nguyên tắc điều hòa là giống nhau, chỉ có những khác biệt về loại chất hiệu ứng. Chẳng hạn, ở E. coli, không phải AMP mà ADP mới là chất hiệu ứng dương. Những cơ chế cơ bản của trao đỗi chất thì rất giống nhau, còn các cơ chế điều hòa thì thường có tính đặc hiệu loài và đặc hiệu chủng.

4.Kỹ thuật sản xuất ethanol nhờ nấm men

Các loài nấm men dùng trong sản xuất ethanol là các nấm đơn bào mang nhiều đặc điểm phong phú về sinh trưởng và phát triển. Các loài được quan tâm trước hết

trong sản xuất công nghiệp là Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum (carslbergensis), Schizosaccharomyces pombe và Kluyveromyces sp. Ngoài ra, nhiều biến chủng bắt nguồn từ các nấm men này đã được tạo ra nhờ kỹ thuật di truyền.

Các tính chất mong muốn của một quá trình sản xuất ethanol công nghiệp phụ thuộc nhiều vào việc lựa chọn chủng vi sinh vật dùng trong lên men. Các chủng này phải có một năng suất sản phẩm cao trên một đơn vị cơ chất được sử dụng, một tốc độ lên men cao, tính chịu cồn cần thiết, khả năng sống sót ở nhiệt độ cao, tính bền trong các điều kiện lên men và tính chịu pH thấp.

154

Khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau phụ thuộc vào loài. Nói chung, các cơ thể này có khả năng sinh trưởng và lên men ethanol có hiệu quả ở các giá trị pH giữa 3,5-6,0 và nhiệt độ từ 28-35oC. Hiện nay người ta quan tâm nhiều đến việc tạo ra các thể đột biến khuyết hô hấp từ nấm men nhờ việc sử dụng các tác nhân hóa học như các thuốc nhuộm hoặc các hợp chất làm biến tính protein. Các biến chủng này chứa ADN ti thể đã bị biến đổi theo hướng ức chế sự tạo ra các enzyme cần thiết cho sự trao đổi chất hiếu khí và do vậy thích hợp với sự tổng hợp rượu.

5. Hiệu suất lên men

Nấm men, dưới điều kiện kị khí chuyển hoá glucose thành ethanol trước hết bằng con đường Embden-Meyerhof. Phản ứng thật sứ bao gồm sự tạo thành 2 mol ethanol, 2 mol CO2 và 2 mol ATP trên mỗi mol glucose được lên men. Do vậy, về mặt trọng lượng mỗi gam glucose về lý thuyết có thể tạo ra 0,51 g rượu. Tuy nhiên sản lượng đạt được trong lên men thực tế thường không vượt quá 90-95% con số lý thuyết. Sở dĩ như vậy là vì một phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để tổng hợp sinh khối mới và cho các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế bào. Cũng còn có các phản ứng phụ xảy ra (thường dẫn tới Glycerin và sucxinat) tiêu thụ tới 4-5% cơ chất tổng số. Nếu loại trừ được các phản ứng này thì sản lượng ethanol có thể tăng thêm được 2,7%.

Một nồng độ nhỏ oxi cần phải được cung cấp cho nấm men lên men vì đây là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất béo chưa bão hòa và các lipit. Thông thường oxi được giữ trong dịch lên men ở nồng độ 0,05-0,1 mm Hg tính theo áp suất oxi. Bất cứ nồng độ nào nằm trên giới hạn đó đều sẽ kích thích sinh trưởng, vi phạm đến sự tạo thành ethanol (hiệu ứng Pasteur).

Các nhu cầu tương đối của các chất dinh dưỡng được dùng trong sự tổng hợp ethanol tỉ lệ thuận với các thành phần chính của tế bào nấm men. Chúng bao gồm C, O, N, và H. Thấp hơn một chút là P, S, K và Mg dùng để tổng hợp các thành phần thứ yếu. Các muối vô cơ (như Mn, Co, Cu, Zn) và các nhân tố sinh trưởng hữu cơ (acid amin, acid nucleic, và các vitamin) được yêu cấu dưới dạng vết.

Nhiều loại nguyên liệu dùng để sản xuất rượu ở quy mô lớn (như rỉ đường mía hay actiso Jerusalem) ngoài hiđrat C còn cung cấp toàn bộ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng của nấm men. Trong một số trường hợp, người ta cũng đưa thêm vào một số chất dinh dưỡng bổ sung như các muối amôn, phosphate K hay nguồn cao ngô rẻ tiền.

155

Hình 6.3: Hiệu ứng Pasteur

Cơ chế điều hòa nhờ enzyme dị lập thể Phosphofructosekinase

Nấm men rất mẫn cảm với sự ức chế bởi ethanol. Nồng độ 1-2% (w/v) đã đủ để làm chậm sinh trưởng của vi sinh vật và ở nồng độ cồn 10% (w/v) tốc độ sinh trưởng của nấm men gần như ngừng hẳn. Bản chất của hiện tượng kìm hãm này là rất phức tạp. Việc thêm cồn vào pha log làm giảm nhanh tốc độ sinh trưởng của nấm men (có lẽ do tác động lên sự tổng hợp protein), giảm khả năng sống sót của tế bào (qua sự biến tính không thuận nghịch của các enzyme), và ở một mức độ thấp hơn nhiều,

156

ethanol làm giảm tóc độ tổng hợp bản thân nó. Các dẫn liệu về mức độ chịu cồn của một số chủng nấm men phụ thuộc rất nhiều vào thành phần acid béo trong màng tế bào chất cho thấy rằng thành phần acid béo kích thích hoặc kìm hãm sự tiết ethanol khỏi bào tương. Các kết quả khác cung chứng minh được rằng ethanol được tạo ra trong lên men (ethanol tự sinh) ức chế lên sinh trưởng của tế bào mạnh hơn là ethanol được đưa vào một cách nhân tạo từ bên ngoài.

6. Sự tạo thành ethanol nhờ vi khuẩn

Trong số vi khuẩn, kiểu lên men rượu phổ biến ở nấm men (EM, piruvat-đecacboxilase) chỉ gặp ở Sarcina ventriculi. Đây là loài vi khuẩn chịu khí yếu, dễ dàng phân lập được từ đất, nhưng cũng gặp cả trong dịch tiêu hóa của những người mắc bệnh dạ dày. Các vi khuẩn này được coi là không bình thường vì có kích thước rất lớn (đường kính 4 μm), tạo nên các dạng hộp bao gói (chứa trên 64 tế bào mỗi hộp , được liên kết với nhau nhờ xenlulose), chịu pH (sinh trưởng được ở pH từ 0,9 đến 9,8) và tạo thành nội bào tử.

Từ dịch ép lên men của cây dứa dại (Agave americana) ở vùng Mexico người ta đã phân lập được một loài vi khuẩn hình que, di động, có lông roi ở hai cực, có khả năng tạo thành ethanol. Vi khuẩn này có tên là Zymomonas mobilis, phân giải glucose theo con đường 2-keto-3deoxi-6-phosphogluconat (KDPG) cắt piruvat thành acetaldehit và đioxit cacbon. Acetaldehit được khử thành ethanol. Ethanol, đioxit cacbon và một lượng nhỏ acid lactic là những sản phẩm lên men duy nhất. Người ta để ý rằng trong rượu mạnh chế từ dứa dại, các nguyên tử cacbon số 2 và số 3 cũng như số 5 và số 6 đã thay thế các nguyên tử cacbon số 1 và số 2 cũng như số 5 và số 6 trong rượu chế từ nấm men.

157

Trong quá trình lên men của một số Enterobacteriaceae và Clostridium, ethanol xuất hiện như một sản phẩm phụ. Tuy nhiên, tiền chất của ethanol, acetaldehit, không được giải phóng trực tiếp từ piruvat nhờ piruvatđecacboxilase mà được tạo thành nhờ sự khử acetil-CoA.

Các vi khuẩn lên men lactic dị hình (ví dụ Leuconostoc mesenteroides) tạo ra alcohol theo một con đường hoàn toàn khác. Qua các bước đầu tiên của con đường pentosephosphate (PP), glucose được phân giải thành pentosephosphate. Phosphoketolase tấn công vào xilulose -5- phosphate :

Xilulose-5-phosphate+Pvc→ Acetilphosphate + glyceraldehyt-3-phosphate

Acetilphosphate vừa tạo thành nhờ acetaldehit-đedihydrogenase và alcohol-đedihydrogenase sẽ được khử thành ethanol. Sản phẩm phân giải còn lại là glyceraldehyt-3-phosphate, sẽ được khử thành lactat qua piruvat.

VI. Lên men lactic và họ Lactobacteriaceae Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc dù nhóm này không có sự giống nhau về hình thái và, bao gồm cả vi khuẩn hình que dài, hình que ngắn lẫn các vi khuẩn hình cầu, song về mặt sinh lý chúng có chung các đặc điểm khá đặc trưng. Tất cả các đại diện đều là các vi khuẩn gram dương, không tạo thành bào tử (trừ Sporolactobacillus) và không di động. Để thu năng lượng chúng hoàn toàn phụ thuộc vào các hiđrat cacbon và tiết ra acid lactic (lactat).

Đối lập với các Enterobacteriaceae là bọn cũng sản sinh acid lactic, chúng thuộc bọn lên men bắt buộc. Chúng khác chứa các hemin (xitocrom, catalase). Mặc dù vậy, các vi khuẩn thuộc họ Lactobacteriaceae có khả năng sinh trưởng khi có mặt oxi không khí, chúng thuộc bọn kị khí song đồng thời cũng là bọn chịu khí. Một vi khuẩn sinh trưởng hiếu khí mà không chứa catalase thì gần như chắc chắn đó là một vi khuẩn lactic (trừ ngoại lệ Acetobacter peroxydans và Shigella dysenteriae).

1. Nhu cầu về các chất bổ sung và nhân tố sinh trưởng

Một đặc điểm nữa của các vi khuẩn lactic là có nhu cầu về các chất bổ sung. Không có đại diện nào có thể mọc được trên môi trường vô cơ thuần khiết chứa glucose và các muối amôn. Đa số trong chúng cần hàng loạt các vitamin (lactoflavin, tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin), và các acid amin, các bazơ purin và pirimiđin. Vì vậy người ta thường nuôi chúng trên các môi trường dinh dưỡng phức tạp chứa

158

những số lượng khá lớn cao nấm men, dịch cà chua, dịch đường sữa hoặc thậm chí cả máu nữa.

Điều ngạc nhiên là một số vi khuẩn lactic (và cả các vi khuẩn lên men khác) khi sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng chứa máu có thể tạo thành các xitocrom và thậm chí có thể tiến hành quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp. Vì vi khuẩn lactic thiếu năng lực tổng hợp các pocphirin nên khi các pocphirin được bổ sung vào môi trường thì một số vi khuẩn lactic có thể tạo thành các sắc tố hem tương ứng.

Vi khuẩn lactic được coi như những kẻ què quặt về trao đỗi chất. Có thể rằng do hậu quả của sự chuyên hóa sinh trưởng trong sữa hoặc trên những môi trường giàu chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng, chúng đã mất đi khả năng tổng hợp nhiều chất trao đỗi. Trong khi đó chúng lại có khả năng mà đa số các vi khuẩn khác không có, đó là khả năng sử dụng lactose.

Khả năng này nhiều vi khuẩn đường ruột (ví dụ Escherichia coli) cũng có. Lactose không có mặt trong giới thực vật, nó được các động vật có vú tạo thành và tiết ra cùng với sữa hoặc được hấp thu vào cùng với sữa. Việc sử dụng được lactose cũng có thể được xem như một sự thích nghi với các điều kiện tồn tại trong đường ruột của động vật có vú. Lactose là một đisaccarit, trước khi đi vào các con đường phân giải hexose nó phải được phân cắt :

Lactose + H2O D-glucose + D-galactose β- Galactozidase

Sau khi được phosphorin hóa galactose được chuyển thành glucosephosphate.

Do có sự sản sinh một lượng lớn lactat nên môi trường dinh dưỡng cần phải được trung hòa. Thường người ta dùng cacbonat canxi. Trên một môi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung cacbonat canxi có thể nhận ra sự tạo thành acid qua các vòng trong suốt bao quanh các khuẩn lạc.

Nơi sống chủ yếu của các vi khuẩn lactic là sữa và những nơi sản xuất và chế biến sữa, thực vật nguyên vẹn hoặc đang tự phân hủy, cũng như đường ruột và niêm mạc của người và động vật. Do tạo thành một lượng lớn lactat và do tính chịu chua mà dưới các điều kiện môi trường thích hợp các vi khuẩn lactic phát triển nhanh, vì vậy có thể dễ dàng phân lập các vi khuẩn lactic trên các môi trường dinh dưỡng chọn lọc.

159

2. Lên men lactic đồng hình Vi khuẩn lactic lên men đồng hình tạo thành toàn bộ hoặc gần như toàn bộ là lactat. Chúng phân giải glucose qua con đường EM, chứa các enzyme cần thiết, kể cả alđolase và chuyển dihydro tách ra trong quá trình loại dihydro của glyceraldehyt-3-phosphate sang piruvat :

Glucose

2 NADH

Việc xuất hiện D-, L+ hay DL- lactat là phụ thuộc vào tính chuyên hóa không gian của enzyme vận chuyển lactat-đedihydrogenase và vào sự có mặt của một lactat-racemase.

Chỉ một phần nhỏ piruvat được loại cacboxil và chuyển thành acetate, ethanol, CO2 và acetoin. Việc tạo thành các sản phẩm phụ phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của oxi.

3. Lên men lactic dị hình

Vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con đường EM là alđolase và triosephosphate-isemerase. Đoạn phân giải glucose đầu tiên chỉ xảy ra qua con đường pentosephosphate, tức là qua glucose-6-phosphate, 6-phosphogluconat và ribulose-5-phosphate (hình). Chất này nhờ một epimerase được chuyển thành xilulose-5-phosphate và nhờ phosphoketolase được phân giải trong một phản ứng phụ thuộc taminpirophosphate làm xuất hiện glyceraldehyt-3-phosphate và acetilphosphate.

Các tế bào Leuconostoc mesenteroides không sinh trưởng và được rửa sạch đã lên men glucose thành lactat, ethanol và CO2 theo một tỉ lệ gần như tương đương:

C6H12O6 → CH3 - CHOH - COOH + CH3 - CH2 - OH + CO2

ở các cơ thể này acetilphosphate bị khử qua acetil-CoA và acetaldehit thành ethanol. Các vi khuẩn lên men dị hình khác chuyển một phần hoặc

2 Lactat

2 Piruvat 2 NAD

160

toàn bộ acetilphosphate thành acetate, trong đó liên kết phosphate giàu năng lượng được chuyển sang ADP và được sử dụng dưới dạng ATP.

Dihydro thừa trong trường hợp này được truyền cho glucose làm xuất hiện manit. Glyceraldehyt-3-phosphate được chuyển qua piruvat thành lactat. Ribose được L. mesenteroides lên men thành lactat và acetate.

*Lên men lactic dị hình ở Bifidobacterium

Vi khuẩn lactic dị hình Bifidobacterium bifidum có dạng chữ V hay chữ Y (bifidus tiếng Hi Lạp có nghĩa là bị chia đôi, bị phân cắt), là thành viên trong khu hệ đường ruột của trẻ sơ sinh, trước hết là các trẻ nuôi bằng sữa mẹ. Vi khuẩn này cần N-acetilglucosemin chỉ có trong sữa người mà không có trong sữa bò. Các đại diện thuộc chi Bifidobacterium là những vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt, không chịu khí và cần một khí quyển chứa CO2 (10% CO2) để sinh trưởng. Bifidobacterium chuyển hóa glucose theo phương trình :

2 C6H12O6 → 2 CH3 - CHOH - COOH + 3 CH3 - COOH

Bifidobacterium lên men glucose qua con đường phụ phosphoketolase, không chứa aldolase cũng như glucose-6-phosphat-dehydrogenase, song lại chứa các phosphoketolase hoạt động, phân giải fructose-6-phosphat và xilulose-6-phosphat thành acetilphosphate và eritro-4-phosphate hoặc glixeraldehyt-3-phosphate. Hexose được chuyển hóa theo con đường sau đây :

161

Hình 6.4: Lên men lactic dị hình :1. Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 2. Phosphogluconat-dedihydrogenase 3. Epimerase ; 4. Phosphoketolase

4. ứng dụng của lên men lactic

Nếu để dung dịch đường không khử trùng chứa cả các nguồn nitơ phức tạp và các chất sinh trưởng một cách tự nhiên trong trong điều kiện kị khí hoặc dưới dạng lớp cao thì các vi khuẩn lactic sẽ nhanh chóng phát triển ở phía bên trong. Chúng làm giảm pH xuống dưới 5 và qua đó ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn kị khí khác là bọn không có khả năng sinh trưởng ở độ chua này. Trong các môi trường làm giàu này nhóm vi khuẩn nào phát triển được là tuỳ thuộc vào các điều kiện đặc biệt. Nhờ đặc tính bảo quản và khử trùng dựa trên nguyên tắc acid hóa mà các vi khuẩn lactic

162

được sử dụng, trong nông nghiệp, trong nội trợ, trong ngành sản xuất và chế biến sữa.

4.1.Thức ăn ủ chua.

Vi khuẩn lactic phân bố trên các nguyên liệu thực vật giữ một vai trò to lớn trong việc bảo quản thức ăn gia súc. Để tạo điều kiện cho lên men lactic xảy ra, lá các loại cây lấy củ hoặc cỏ ... được nén chặt trong các hầm ủ, thêm rỉ đường để nâng cao tỉ lệ C/N và tạo độ chua ban đầu bằng cách thêm acid formic hay acid vô cơ.

4.2.Dưa là một sản phẩm của quá trình lên men lactic. Bắp cải được cắt nhỏ, trộn và bóp với muối ăn 2-3%. Trong điều kiện yếm khí, lên men lactic sẽ xảy ra một cách tự nhiên, lúc đầu bởi Leuconostoc - với sự tạo thành CO2, và về sau có sự tham gia của Lactobacillus plantarum.

4.3.Các sản phẩm sữa. Sữa có một thành phần dinh dưỡng cao, chứa nhiều nước và giàu các muối khoáng, protein (chủ yếu là cazein), mỡ bơ, đường (đặc biệt là lactose) và các vitamin. Ở trong bầu vú của động vật thì nó là vô trùng, nhưng khi đi ra khỏi núm vú thì sữa bị nhiễm bởi khu hệ bình thường của động vật, sau đó được bổ sung thêm bởi các vi sinh vật khác từ người vắt sữa, máy hoặc bình chứa.

Là một môi trường gần như hoàn hảo nên sữa rất mẫn cảm với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Khi để sữa ở trong phòng nhiều loại vi khuẩn sẽ lên men lactose tạo thành acid và làm thay đổi tính chất và kiến trúc của sữa. Quá trình này có thể xảy ra tự nhiên hoặc được con người bắt chước như trong qnầ trình sản xuất phomat hoặc iagua.

Trong các giai đoạn sớm của lên men sữa lactose bị tấn công nhanh bởi Streptococcus lactis và Lactobacillus spp. Sự tiết acid lactic và sự giảm pH làm protein của sữa bị đông lại thành cục vón (curd). Sự đông cũng làm tách riêng phần dịch đường sữa (whey) ở trên bề mặt. Cục vón cũng có thể được tạo nên nhờ tác dụng của vi sinh vật hoặc nhờ một enzyme (rennin) lấy từ dạ dày bê.

Một lít sữa nặng 1032g bao gồm 902g nước và 130g chất khô trong đó chứa 49g lactose; 39g chất béo (là những giọt mỡ đường kính 1-8 μm gồm glixerit và các chất tan trong lipit, như colesterol và các vitamin A, D, E, K; 32,7g protein mà chủ yếu là cazein; 9g chất khoáng (gồm phosphate, xitrat, KCl, NaCl và MgCl2).

*Sữa chua (sữa bơ). Sữa chua là sản phẩm của sự lên men sữa lỏng bằng sự để chua ngẫu nhiên dưới tác động của nhiều vi khuẩn sinh acid

163

lactic khác nhau (như Streptococcus lactis hay S. cremoris), hoặc của một số lượng ít hơn nhiều các vi khuẩn gây thơm (như Streptococcus diacetylacis, Betacoccus citrovorus) hoặc bằng việc cấy vào sữa đã đun nóng các giống vi khuẩn thuần khiết. Khi lên men diễn ra, lactose được chuyển hoá thành acid lactic, acid này sẽ ngưng kết cazein ở pH 4-5. Sữa đông, đặc, có vị chua, tùy theo vùng có tên gọi khác nhau. Sữa chua được làm từ sữa đầy đủ (chứa ít nhất 3% mỡ của sữa) thường được trộn với bột sữa đã vớt váng nhằm làm tăng hàm lượng chất rắn toàn phần và cải thiện cấu trúc gel protein. ở một số nước, sữa chua cũng được sản xuất từ sữa cừu, sữa trâu, sữa tuần lộc hoặc sữa ngựa. Kem chua được sản xuất bởi một quá trình rất giống quy trình dùng để sản xuất sữa chua chỉ trừ việc kem cà phê đã được sử dụng làm nguyên liệu thô.

*Iagua. Iagua được làm từ các loại sữa chứa các hàm lượng mỡ khác nhau bằng cách lên men nhờ các giống đặc biệt. Nó có một độ đông đặc mịn giống như gel, một độ chua rõ rệt và hương vị dễ chịu, khác biệt rõ ràng với loại sữa chua bình thường. Iagua được sản xuất bằng cách cấy vào sữa đã khử trùng Pasteur đồng nhất khoảng 1,5-3% các vi khuẩn lactic ưa nhiệt (giống hỗn hợp của một hoặc nhiều chủng như Streptococcus thermophilus hay Lactobacillus bulgaricus) và sau đó giữ ở 42-45oC trong khoảng 3 giờ. Độ quánh mịn được hình thành trong thời gian này. Sản phẩm cuối cùng có vị chua (độ chua 40-60oSH). Phần quan trọng trong hương thơm đặc biệt của iagua là các hợp chất cacbonyl với đixetyl và acetaldehit chiếm ưu thế. Một loại igua đặc biệt có tên là sữa aciđophilus được sản xuất nhờ Lactobacillus acidophilú. Việc thêm đường và hoa quả vào iagua (iagua hoa quả) làm tăng đáng kể sức tiêu thụ sản phẩm này.

*Kefia và Kumis. Kefia và Kumis là các loại đồ uống chứa rượu giàu CO2, nhiều bọt. Khu hệ vi sinh vật bao gồm nấm men Torula (chịu trách nhiệm đối với quá trình lên men rượu) và các vi khuẩn Streptococcus lactis và Lactobacillus caucaticus (chịu trách nhiệm đối với lên men lactic). Các hạt kefia dùng để sản xuất kefia chứa các cục sữa đông cộng với các vi khuẩn kefia. Kumis được làm từ sữa ngựa hay sữa dê do các giống kumis thuần khiết (Thermobacterrium bulgaricus và nấm men Candida) . Cả hai đồ uống làm từ sữa này đều là các sản phẩm địa phương của vùng Caucasus và các vùng thảo nguyên Turkestan. Kefia chứa acid lactic (0,5- 1%), một số lượng rượu đáng kể (0,5-2%), CO2 và một số sản phẩm phân giải cazein sinh ra từ hoạt động phân giải protein của nấm men.

*Phomat. Phomat là sản phẩm thu được từ sữa đông bằng cách loại bỏ dịch đường sữa và bằng cách làm chín cục vón khi có mặt một khu hệ

164

vi sinh vật đặc biệt. Có nhiều loại phomat với hình dạng và kích thước khác nhau. được xếp thành nhóm dựa vào loại sữa sử dụng (bò, dê, cừu), sự tạo thành cục vón (dùng acid, dùng rennin hay dùng cả hai), kiến trúc hay độ đặc, và hàm lượng chất béo. Trong từng nhóm, các loại phomat riêng biệt được đặc trưng bởi hương thơm. Sự sản xuất phomat về cơ bản bao gồm hai công đoạn : sự tạo thành cục vón và quá trình làm chín.

*Sự tạo thành cục vón

Hàm lượng chất béo của sữa được điều chỉnh tới mức độ mong mnốn, và khi cần, hàm lượng protein cũng được điều chỉnh. Các chất phụ gia bao gồm muối canxi nhằm cải thiện sự ngưng kết protein và kiến trúc của phomat, nitrat để kìm hãm khu hệ vi khuẩn kị khí hình thành bào tử và các sắc tố tạo màu. Sữa thô hoặc sữa đã khử trùng được trộn trong một bể ở nhiệt độ 15-59oC với một loại giống khởi động (vi khuẩn lactic hay vi khuẩn propionic, nấm sợi, như Penicillium camemberti, P. candidum, P. roqueforti , các vi khuẩn mang sắc tố màu vàng hoặc màu đỏ như Bacterium linens, cùng các cầu khuẩn và nấm men) và sữa sẽ đông lại thành một khối bán lỏng mềm, cụcvón, sau lên men lactic, được nối tiếp bằng sự bổ sung rennin hoặc một tổ hợp nào đó mà thông thường nhất là tổ hợp giữa acid và rennin. Gel protein này sẽ được cắt thành các hình khối nhỏ trong lúc đang được đun nóng rồi sau đó được khuấy nhẹ. Dịch đường sữa được loại bỏ còn phần cục vón chứa mỡ thì được chuyển sang quá trình làm rắn. Khi độ rắn mong muốn đã đạt được, cục vón được chuyển sang quá trình làm chín.

*Làm chín

Quá trình làm chín phụ thuộc vào thành phần khối phomat, đặc biệt là hàm lượng nước, khu hệ vi sinh vật và các điều kiện bên ngoài như nhiệt độ và độ ẩm của các phòng làm chín. Sự chín của phomat mềm xảy ra từ ngoài vào trong, vì thế trong giai đoạn đầu sẽ có một phần vỏ chín và một phần lõi chưa chín. Sự chín không đồng đều xảy ra là do có sự chênh lệch về pH. ở bên trong khối phomat, pH thấp vì có mặt acid lactic. ở ngoài vỏ, các loài nấm sợi đặc trưng phát triển thích hợp hơn ở các pH cao đã nâng pH lên nhờ phản ứng loại CO2 từ các amino acid.

Sự chín ở phomat cứng xảy ra đồng đều trên toàn bộ khối phomat. Sự tạo thành vỏ chỉ là kết quả của sự khô bề mặt, điều này có thể tránh được nhờ việc bao gói khối phomat trong các màng plastic thích hợp trước khi quá trình làm chín bắt đầu. Thời gian làm chín thay đổi tùy trường hợp, kéo dài từ vài ngày đối với phomat mềm tới vài tháng thậm chí vài

165

năm đối với các loại phomat cứng. Sản lượng trên 100 kg sữa nước là 8 kg phomat cứng và tới 12 kg phomat mềm.

Mọi thành phần của phomat đều chịu sự biến đổi về mặt sinh hoá học ở các mức độ khác nhau trong quá trình làm chín. Lactose được phân giải thành acid lactic nhờ lên men lactic đồng hình. Trong loại phomat cheđa chẳng hạn, pH giảm từ 6,55 xuống 5,15 tính từ lúc bổ sung giống khởi động cho tới khi đúc thành khuôn. Khi có mặt vi khuẩn propionic (như trong trường hợp của phomat Emmental), acid lactic được chuyển hóa tiếp tục thành acid propionic, acid acetic, và CO2 theo phản ứng :

3 CH3CHOHCOOH → 2 CH3CH2COOH + CH3COOH + CO2 + H2O

Tỉ lệ giữa acid propionic và acid acetic bị ảnh hưởng bởi thế oxi hóa khử của phomat và tỉ lệ này sẽ thấp khi có mặt muối nitrat chăng hạn. Phương thức và mức độ phân giải mỡ của sữa phụ thuộc vào khu hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình làm chín phomat. Sự giải phóng các acid béo, đặc biệt là các acid ảnh hương đến hương thơm của phomat phụ thuộc vào tính đặc hiệu của các lipase.

Ngoài các acid béo tự do, 2-alkanon và 2-alkanol cũng được tạo thành như các sản phẩm phụ của sự β-oxi hoá các acid béo. Nấm sợi, đặc biệt là Penicillium roqueorti, sử dụng β-ketoaxyl-CoA đeaxylase (tiodihydroase) và β-ketoacid đecacboxylase để cung cấp các hợp chất điển hình cho hương thơm của các phomat bán mềm.

Sự phân giải protein thành các amino acid xảy ra qua các peptit như ìà các sản phẩm trung gian. Tùy thuộc vào loại sữa mà 20-40% cazein được chuyển hoá thành các dẫn xuất protein hòa tan trong đó 5-15% là các acid amin. Phạm vi pH 3-6 là tối ưu đối với hoạt tính proteinase của Penicillium roqueorti. Sự phân giải protein bị ảnh hưởng mạnh bởi hàm lượng muối chứa trong phomat. Hàm lượng amino acid là 2,6-9% phần chất rắn của phomat và là phần quan trọng trong hương thơm của phomat. Những lỗi trong quá trình làm chín có thể tạo nên những peptit có vị đắng.

Các amino acid được chuyển hóa tiếp tục. Trong giai đoạn sớm của sự làm chín, với pH thấp, chúng bị loại CO2 thành các amino. Trong giai đoạn muộn, với pH cao, các phản ứng oxi hoá chiếm ưu thế. Sự phân giải protein không chỉ đóng góp vào sự tạo thành hương thơm, nó còn ảnh hưởng đến kiến trúc của phomat. Khi phomat mềm bị làm chín quá mức, sự phân giải protein có thể dẫn đến việc dịch hóa gần như toàn bộ khối phomat.

166

Câu hỏi ôn tập chương 8 1. Trong tế bào, quá trình đường phân diễn ra ở đâu ? Phản ứng này

khác nhau như thế nào khi không có mặt oxy và khi có mặt oxy ?

2. Phân tử nào mở đầu con đường đường phân ? Khi đường phân hoàn thành, phân tử nào còn lại. Bao nhiêu ATP được tạo thành ở mức độ phosphoril hóa cơ chất ? Con số ATP được tạo thành là bao nhiêu, và vì sao con số này lại khác với tổng số ATP được tạo thành ? Bao nhiêu ATP sẽ được tạo thành bổ sung nếu oxy có mặt ?

3. Khi nguông glucose là không hạn chế thì cái gì sẽ là nhân tố giới hạn trong phản ứng đường phân ?

4. Hai cơ chế tái tạo NAD+ là những cơ chế nào ? Chúng khác nhau ở chỗ nào ? Đâu là một quá trình hiếu khí và đâu là một quá trình kị khí ?

5. Lên men khác hô hấp oxy hóa chỗ nào khi xét về phương diện các chất nhận điện tử và sự sản sinh năng lượng ?

6. Sự trao đổi điện tử để tạo nên ATP khác nhau như thế nào trong các trường hợp NADH được tạo thành trong đường phân, NADH được tạo thành trong chu trình acid citric, và FADH2 được tạo thành trong chu trình acid citric ?

7. Hiệu quả của việc phân giải hiếu khí hoàn toàn một phân tử glucose ở vi khuẩn là bao nhiêu ? So sánh với hiệu quả của một mình đường phân?

8. Hiệu ứng Pasteur có gặp ở các vi khuẩn lên men lactic đồng hình không ? Vì sao ?

9. Giải thích tại sao ở một số nấm men, như Rhodotorula hay Geotrichum, khi thừa nguồn C, đồng thời thiếu N và P thì lipit lại được tích lũy ?

10. Cho ví dụ về những trường hợp lên men ở vi khuẩn trong đó có sự tạo thành nhiều hơn 2 mol ATP trên một mol glucose bị phân hủy.

167

Chương 9 Vi khuẩn quang hợp và cố định đạm

I.Vi sinh vật quang hợp 1.Các vi khuẩn quang quang hợp (Phototrophic bacteria)

1.Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (Purple sulfur bacteria): a-HọChromatiaceae: b-HọEctothiorhodospiraceae: 2-Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Nonsulfure purple bacteria) 3.Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Green sulfure bacteria) 4.Vi khuẩn không lưu huỳnh màu lục (Green nonsulfur bacteria) 5-Vi khuẩnlam(Ngành Cyanobacteria) a- Nhóm I (có tác giả gọi là bộ Chroococcales): b- Nhóm II (có tác giả gọi là bộ Pleurocapsales): c- Nhóm III (có tác giả gọi là bộ Oscillatorriales): d- Nhóm IV (có tác giả gọi là bộ Nostocales) : e- Nhóm V (có tác giả gọi là bộ Stigonematales) 1.1.Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (Purple sulfur bacteria)

Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a hoặc b , hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H2, H2S hay S . Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, có loài chu mao, tỷ lệ G+C là 45-70%.

a- Họ Chromatiaceae: 1.1.Chi Thiospirium 1.2. Chi Chromatium 1.3. Chi Thiocapsa 1.4. Chi Thiocystis 1.5. Chi Thiospirillum 1.6. Chi Thiorhodovibrio 1.7. Chi Amoebobacter 1.8. Chi Lamprobacter 1.9. Chi Lamprocystis 1.10.Chi Thiodyction

168

1.11.Chi Thiopedia 1.12. Chi Rhabdochromatium 1.13. Chi Thiorhodococcus

Chromatium Thiocapsa

Thiocystis Thiospirillum

Lamprocystis Thiopedia

Hình 9.1: Một số đại diện vi khuẩn lưu huỳnh màu tía thuộc Họ Chromatiaceae

169

b- Họ Ectothiorhodospiraceae: 1.1- Chi Ectothiorhodospirace 1.2- Chi Halorhodospira

1.2-Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Nonsulfure purple bacteria) Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi khuẩn quang dị

dưỡng hữu cơ (photoorganoheterotrophs) thường kỵ khí bắt buộc, một số loài là quang tự dưỡng vô cơ không bắt buộc (trong tối là hoá dị dưỡng hữu cơ- chemoorganoheterotrophs). Tế bào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng chất hữu cơ, đôi khi sử dụng hợp chất lưu huỳnh dạng khử hoặc H2. Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, hoặc không di động, một số loài có túi khí (gas vesicles), tỷ lệ G+C là 61-72%.

2.1- Chi Blastochloris 2.2- Chi Phaeospirillum 2.3- Chi Rhodobacter 2.4- Chi Rhodobium 2.5- Chi Rhodocista 2.6- Chi Rhodocyclus 2.7- Chi Rhooferax 2.8- Chi Rhodomicrobium 2.9- Chi Rhodoplanes 2.10-Chi Rhodopila 2.11- Chi Rhodopseudomonas 2.12- Chi Rhodospira 2.13- Chi Rhodospirillum

2.14- Chi Rhodothalassium 2.15- Chi Rhodovibrio 2.16-Chi Rhodovulum 2.17- Chi Rosespira 2.18- Chi Rubiviva

170

Rhodospirillum Rhodospirillum dưới KHV điện tử

Rhodopseudomonas Rhodopseudomonas dưới KHV điện tử

Rhodobacter Rhodopila

Rhodocyclus purpureus Rhomicrobium Hình 9.2: Một số đại diện vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía

171

1.3.Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Green sulfure bacteria) Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng quang

tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a cùng với b , c hoặc e, chứa caroten nhóm 5, hệ thống quang hợp liên quan đến các lục thể (chlorosom) và độc lập đối với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H2, H2S hay S . Hạt lưu huỳnh tích luỹ bên ngoài tế bào Không có khả năng di động , một số loài có túi khí; tỷ lệ G+C là 48-58%.

3.1- Chi Chlorobium 3.2- Chi Prosthecochloris 3.3- Chi Pelodictyon 3.4- Chi Ancalichliris 3.5- Chi Chloroherpeton

Chlorobium Pelodictyon Prosthecochloris

Hình 9.3: Một số đại diện vi khuẩn lưu huỳnh màu lục

1.4.Vi khuẩn không lưu huỳnh màu lục (Green nonsulfur bacteria) Thuộc nhóm này là các vi khuẩn đa bào, dạng sợi,thường kỵ khí

không bắt buộc ,thường là quang dị dưỡng (photoheterotroph), có loài quang tự dưỡng hoặc hoá dị dưỡng. Tế bào có chứa chlorophyll a và c, trong điều kiện kỵ khí thấy có chlorosom. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang dị dưỡng là glucose, axit amin, axit hữu cơ; trong quang tự dưỡng là H2, H2S. Di động bằng phương thức trườn (gliding) , tỷ lệ G+C là 53-55%. Chi điển hình là Chloroflexus., Chloronema

172

Chloronema Chloroflexus

Hình 9.4: Một số đại diện vi khuẩn không lưu huỳnh màu lục

1.5- Vi khuẩn lam (Ngành Cyanobacteria)

Theo NCBT (2005) thì Vi khuẩn lam bao gồm những bộ sau đây:

• -Chlorococcales • -Gloeobacteria • -Nostocales • -Oscillatoriales • -Pleurocapsales • -Prochlorales

Trước đây thường nhầm lẫn là Tảo lam (Cyanophyta). Thực ra đây là những cơ thể nhân nguyên thuỷ, không liên quan gì đến tảo , ngoài khả năng quang hợp hiếu khí (quang tự dưỡng vô cơ) và dùng H2O làm chất cho điện tử trong quá trình quang hợp. Vi khuẩn lam chứa chlorophyll a và phycocyanin- phycobiliprotein. Một số loài có sắc tố đỏ phycoerythrin. Chúng phối hợp với sắc tố lục tạo nên màu nâu. Màng liên kết với phycobilisom. Đơn bào hoặc đa bào dạng sơi. Không di động hoặc di động bằng cách trườn (gliding), một số loài có túi khí (gas vesicles).Nhiều loại có dị tế bào (heterocysts) và có khả năng cố định nitơ. Vi khuẩn lam có mặt ở khắp mọi nơi, trong đất, trên đá, trong suối nước nóng, trong nước ngọt và nước mặn. Chúng có năng lực chống chịu cao hơn so với thực vật đối với các điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp. Một số loài có khả năng sống cộng sinh với các cơ thể khác như Rêu, Dương xỉ, Tuế...Nhiều loài cộng sinh với nấm để tạo ra Địa y (Lichen). Vi khuẩn lam có thể là sinh vật xuất hiện sớm nhất trên Trái đất

173

Vi khuẩn lam được chia thành 5 nhóm (subsection) như sau: a- Nhóm I (có tác giả gọi là bộ Chroococcales): Hình que hoặc hình cầu đơn bào, không có dạng sợi hay dạng kết

khối (aggregate); phân đôi hoặc nẩy chồi; không có dị tế bào (heterocytes). Hầu hết không di động. Tỷ lệ G+C là 31-71% . Các chi tiêu biểu là:

-Chamaesiphon -Chroococcus -Gloeothece -Gleocapsa -Prochloron

Chamaesiphon Chroococcus

Glooeothece Gleocapsa Prochloron Hình 9.5: Một số đại diện vi khuẩn lam thuộc bộ Chroococcales b-Nhóm II (có tác giả gọi là bộ Pleurocapsales): Hình que hoặc hình cầu đơn bào. có thể tạo dạng kết khối

(aggregate); phân cắt nhiều lần tạo ra các baeocytes; không có dị tế bào.Chỉ có các baeocytes là có di động. Tỷ lệ G+C là 40-46% . Các chi tiêu biểu là:

• -Pleurocapsa • -Dermocapsa • -Chroococcidiopsis

174

Pleurocapsa Dermocapsa Chroococcidiopsis

Hình 9.6: Một số đại diện vi khuẩn lam thuộc bộ Pleurocapsales c-Nhóm III (có tác giả gọi là bộ Oscillatorriales): Dạng sợi (filamentous) ; dạng lông (trichome) không phân nhánh chỉ

có ở các tế bào dinh dưỡng; phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn (fragmentation); không có dị tế bào; thường di động. Tỷ lệ G+C là 34-67%. Các chi tiêu biểu là:

• -Lyngbya • -Osscillatoria • -Prochlorothrix • -Spirulina • -Pseudanabaena

Lyngbya Oscillatoria Prochlorothrix

Spirulina Pseudanabaena

Hình 9.7: Một số đại diện vi khuẩn lam thuộc bộ Oscillatorriales

175

d-Nhóm IV (có tác giả gọi là bộ Nostocales) Dạng sợi ; dạng lông (trichome) không phân nhánh có thể chứa các

tế bào biệt hoá (specialized cell) ; phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn tạo thành đoạn sinh sản (hormogonia) ; có tế bào dị hình ; thường di động có thể sản sinh bào tử màng dày (akinetes). Tỷ lệ G+C là 38-47%. Các chi tiêu biểu là :

• -Anabaena • -Cylindrospermum • -Aphanizomenon • -Nostoc • -Scytonema • -Calothrix

Anabaena Anabaena trong Bèo hoa dâu

Cylindrospermum Calothrix

176

Nostoc Scytonema

Hình 9.8: Một số đại diện vi khuẩn lam thuộc bộ Nostocales e-Nhóm V (có tác giả gọi là bộ Stigonematales) : Lông (trichome) dạng sợi, phân nhánh hoặc do các tế bào nhiều hơn

một chuỗi tạo thành ; phân đôi theo nhiều mặt phẳng, hình thành đoạn sinh sản (hormogonia) ; có tế bào dị hình ; có thể sản sinh bào tử màng dày ( alkinetes), có hình thái phức tạp và biệt hóa (differentiation). Tỷ lệ G+C là 42-44%. Các chi tiêu biểu là :

-Fischerella -Stigonema -Geitlerinema

Stigonema Fischerella Geitlerinema

Hình 9.9: Một số đại diện vi khuẩn lam thuộc bộ Stigonematales 2.Trao đổi chất ở các vi sinh vật quang dưỡng

Tất cả các vi khuẩn quang hợp đều chứa sắc tố quang hợp. Sắc tố quang hợp ở vi khuẩn được gọi là bacteriochlorophyll. Chlorophyll và bacteriochlorophyll còn được gọi là chất diệp lục và chất khuẩn lục. Chất diệp lục, chất khuẩn lục và huyết sắc tố có cấu trúc tương tự như nhau. Đó là một vòng pocphiril do 4 nhân pirol liên kết với nhau. Lõi của chất diệp lục và chất khuẩn lục là Mg, còn lõi của huyết sắc tố là Fe, chất diệp lục a

177

khác với chất khuẩn lục a,b,c,d,e ở 7 gốc R (từ R1 đến R7) có thể thấy rõ sự khác nhau này trong bảng sau đây:

Bảng 9.1: Sự sai khác giữa chất diệp lục a và các loại chất khuẩn lục

Chú thích: a→ giữa C3 và C4 không có nối đôi, không thêm H

b→ giữa C3 và C4 không có nối đôi, có thêm H Có thể thấy rõ hơn sự phân biệt của hai loại chlorophyll,

bacteriochlorophyll và hem...bằng cách quan sát hình sau đây:

178

H. 9.10: Cấu trúc hóa học của một số sắc tố quang hợp

179

Ngoài các loại chlorophyll vi khuẩn tự dưỡng quang năng còn có chứa một số các sắc tố thuộc loại carotenoit. Carotenoit ở vi khuẩn không giống với carotenoit ở tảo hoặc thực vật. Dưới đây là vài ví dụ:

H. 9.11: Cấu trúc hóa học các loại carotenoit

Ở vi khuẩn tự dưỡng quang năng có hai loại phosphoryl hóa quang hợp: phosphoryl hóa quang hợp tuần hoàn và phosphoryl hóa quang hợp không tuần hoàn. Chú thích

Bchl*: trạng thái kích phát của bacteriochlorophyll Ru-5-P: Ribulose-5-phosphate H2A: Chất vô cơ cho hydrogen

H.9.12:Phosphoryl hóa quang hợp kiểu tuần hoàn Trong điều kiện kỵ khí một số vi khuẩn quang hợp có thể sử dụng

năng lượng của ánh sáng để thực hiện phản ứng phosphoryl hóa sản sinh ra ATP. Electron từ bacteriochlorophyll được tách ra dưới tác dộng của ánh sáng, sau đó tham gia vào chuỗi hô hấp tuần hoàn và quay trở lại Bchl. Trên đường đi đã sản sinh ra ATP. Việc sinh ra ATP được thực hiện riêng rẽ với việc sinh ra [H] có năng lực khử. [H] có năng lực khử được sinh ra từ các chất vô cơ cho hydrogen (như H2S...).Quá trình quang hợp này không sản sinh ra oxi.

180

H.9.12: Phosphoryl hóa quang hợp kiểu không tuần hoàn

Chú thích: Chlb* và Chla* là ở trạng thái kích phát.

Đây là kiểu phản ứng phosphoryl hóa quang hợp gặp ở vi khuẩn lam và cũng tương tự như ở tảo và cây xanh. Ở đây chuỗi vận chuyển electron là không tuần hoàn vì vậy còn gọi là dòng chảy electron không tuần hoàn. Quang hợp xảy ra trong điều kiện có oxi và có 2 hệ thống quang.

Hệ thống quang I có chứa Chl a (chất diệp lục a) và có thể sử dụng được tia đỏ có bước sóng dài.

Hệ thống quang II có chứa Chl.b và có thể sử dụng được tia sáng lam (bước sóng ngắn). Quá trình quang hợp này có sản sinh oxi và xảy ra đồng thời việc sinh ATP(ở hệ thống quang hợp II) và việc sinh [H] có năng lực khử (trong NAD PH2) là H+ và e-, được sinh ra sau sự quang giải nước.

Sau quang giải nước sản sinh ra ½ O2 +2H+ + 2e, electron sẽ liên tiếp đi qua chuỗi electron (I và II), sau cùng đem electron đến cho NADP+ để sản sinh ra 2 phản ứng phophoryl hóa để sinh ATP. Ở hệ thống I có sinh NADPH2 và ATP, còn ở hệ thống II có sinh oxi và ATP.

Một số vi khuẩn ưa mặn tự dưỡng quang năng có quá trình quang hợp khá dặc biệt. Đại diện cho nhóm này là các vi khuẩn hay gặp trên các hải sản ướp muối (như vi khuẩn Halobacterium halobium, H.eutirubrum...)

Màng chất té bào của chúng phân thành 2 phần: phần màu đỏ và phần màu tía. Phần màu đỏ có chứa cytocrom, flavoprotein.. của chuỗi hô hấp dùng để oxi hóa phosphoryl hóa. Phần màu tía rất kì lạ. Trên màng hiện lên các vết khoang (đường kính khoảng 0,5μm), phân bố độc lập với

181

nhau, chiếm tới một nửa tổng diện tích của màng tế bào vi khuẩn. Màng này có khả năng thực hiện một quá trình quang hợp độc đáo. Có một loại protein gọi là bacteriorodopsin, rất giống với rodopsin, loại protein có trong tế bào hình trụ ở trên võng mạc của mắt. Bacteriorodopsin chiếm tới 75% màng màu tía.

Những vi khuẩn này có thể sinh trưởng được trong tối hoặc ngoài sáng nếu có mặt oxi, khi không có mặt oxi chúng chỉ sinh trưởng được ngoài sáng. Chúng có 2 con đường thu nhận năng lượng: một đường oxi hóa phosphoryl hóa khi có oxi và một đường oxi hóa phosphoryl hóa khi được chiếu sáng (quang hợp). Tốc độ tạo ra ATP là cao nhất khi được chiếu sáng bằng bước sóng 550-600nm.

H.9.13: Sơ đồ minh họa 2 hệ thống quang

3. Cơ chế quang hợp 3.1. Pha sáng quang hợp Pha sáng là giai đoạn đầu của quang hợp, giai đoạn này ánh sáng là nhân tố trực tiếp tham gia vào quang hợp nên gọi là pha sáng. Pha sáng xảy ra qua 2 giai đoạn: giai đoạn quang lý và giai đoạn quang hoá. * Giai đoạn quang lý: Nhờ tính chất quang hoá của ánh sáng và khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng của phân tử chlorophyll mà năng lượng của ánh sáng được chuyển sang năng lượng của điện tử trong các phân tử chlorophyll. Năng lượng này lại chuyển đến 2 tâm quang hợp là λ700 và λ680 để thực hiện giai đoạn quang hoá tiếp. * Giai đoạn quang hoá: quang hoá là giai đoạn chuyển hoá năng lượng của các điện tử trong 2 tâm quang hợp đã được làm giàu bởi năng lượng ánh sáng thành năng lượng chứa đựng trong các hợp chất giàu năng lượng là ATP và NADPH2.

Giai đoạn quang hoá xảy ra tại 2 tâm quang hợp bởi 2 phản ứng

182

quang hoá mà phần chính là quang phân ly nước và phosphoryl hoá. - Quang phân ly nước: Nhờ năng lượng ánh sáng với sự tham gia

của sắc tố và hệ thống các chất oxi hoá trong lục lạp mà nước bị phân huỷ. 2H2O ( 4H+ + 4è + O2

) - Phosphoryl hoá : đây là quá trình tổng hợp ATP nhờ năng lượng

của quá trình oxi hoá xảy ra trong chuỗi vận chuyển è quang hợp. ADP + H3PO4 → ATP + H2O

Có 3 hình thức Phosphoryl hoá xảy ra: + Phosphoryl hoá vòng. + Phosphoryl hoá không vòng. + Phosphoryl hoá hoá vòng giả.

Kết quả chung của pha sáng là: 12H2O +18ADP +18H3PO4+12NADP+ →18ATP + 12NADPH+H+ + 6O2

+ 18H2O Pha sáng đã tạo ra ATP và NADPH+H+ cung cấp cho pha tối quang hợp. 3.2. Pha tối quang hợp

Sau khi pha sáng tạo ATP và NADPH+H+, giai đoạn tiếp theo của quang hợp là sử dụng ATP và NADPH+H+ để khử CO2 tạo sản phẩm sơ cấp của quang hợp là C6H12O6. Quá trình này không cần ánh sáng nên gọi là pha tối. Pha tối diễn ra nhiều con đường khác nhau, mỗi con đường đặc trưng cho một nhóm thực vật. Có 3 con đường đồng hoá CO2 trong quang hợp: chu trình Calvin, chu trình Hatch-Slack và chu trình CAM.

* Chu trình Calvin (chu trình C3) - Đây là con đường đồng hoá CO2 phổ biến nhất do Calvin tìm ra.

Chu trình xảy ra qua 3 giai đoạn chính: + Tiếp nhận CO2 : Ribulozo 1,5dP tiếp nhận CO2 sau đó biến đổi

thành 2 phân tử APG. APG là sản phẩm đầu tiên nên chu trình còn được gọi là chu trình C3.

+ APG bị khử thành AlPG nhờ ATP và NADPH+H+ của pha sáng. + AlPG sẽ tái tạo lại Ribulozo 1,5dP đồng thời tạo nên sản phẩm của chu

trình là C6H12O6. Tóm tắt chu trình Calvin:

183

C5 + CO2 + ATP + NADPH ---> C6H12O6

H. 9.14: Chu trình Calvin www.starsandseas.com/. ../cellcalvin.htm

II.Cố đinh nitrogen phân tử Trong không khí có rất nhiều N phân tử, nhưng tuyệt đại đa số sinh vật không sử dụng được nguồn N này. Chỉ có một số VSV là có thể hấp thụ được N. Qua hoạt động sống của chúng N sẽ được chuyển thành N hợp chất (protein và các sản phẩm thủy phân protein). Hoạt động này được gọi là sự cố định N phân tử. Quá trình cố định N có tác dụng rất lớn đến đời sống các sinh vật trên trái đất. Trên cơ bản trong nham thạch không chứa hợp chất N. Cho nên nguồn N trong đất hầu như hoàn toàn do tác dụng cố định N của VSV mà hình thành. Hàng năm cây trồng lại lấy đi một lượng N đáng kể. Hợp chất N được hình thành trong quá trình cố định này lại chính là nguồn N chủ yếu bổ sung cho đất. Các loại VSV cố định N không nhiều lắm, có thể chia làm hai loại lớn như sau: 1.Vi sinh vật cố định N sống tự do (không cộng sinh): bao gồm một số vi khuẩn, xạ khuẩn. Trong số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azotobacter và loài Clostridium Pasteurianum. 1. Azotobacter 1.1.Sơ lược về Azotobacter

Azotobacter là vi khuẩn cố định N sống tự do trong đất, hiếu khí, không có bào tử. Chúng đã được phân lập và nuôi cấy thuần khiết từ năm

184

1901 do nhà VSV Hà Lan Beijerinck. Đại diện điển hình của chi này là Azotobacter chroococcum. Do điều kiện nuôi cấy và lứa tuổi khác nhau mà Azotobacter có hình thái thay đổi. Lúc còn non Azotobacter là những trực khuẩn mập hình que, có tiên mao, có khả năng di động, khi già thì trở thành tế bào hình cầu có giáp mạc xung quanh. Azotobacter có thể sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn thức ăn C. Chúng cũng cần nhiều nguyên tố khoáng, đặc biệt là 2 nguyên tố vi lượng bor (B) và molipbden (Mo)(Mo cần cho tác dụng cố định N). Khi sống trong điều kiện không có N hợp chất Azotobacter sẽ dùng N của không khí để biến thành hợp chất N của cơ thể sống. Khi sống trong môi trường đủ thức ăn N hữu cơ hoặc vô cơ thì tác dụng cố định N sẽ rất thấp hoặc không có. Azotobacter thích hợp với điều kiện hiếu khí vừa phải và pH trung tính hoặc hơi kiềm. Trong điều kiện thích hợp cứ mỗi khi tiêu thụ 1gam hydratcarbon Azotobacter có thể cố định được 10- 15mg N. Vì Azotobacter có khả năng cố định N mạnh mẽ như vậy nên từ cuối thế kỷ 18 đã có nhiều nước nghiên cứu sử dụng chúng làm phân vi khuẩn (gọi là phân Azotobacterin). Việc sử dụng Azotobacterin cũng đang phát triển mạnh ở nhiều nước và thu được kết quả. Tuy nhiên sử dụng Azotobacterin không phải là vấn đề tiếp giống đơn giản, mà còn phải tạo điều kiện để chúng phát triển mạnh cố định được nhiều N, nghĩa là sử dụng kỹ thuật liên hoàn. Để chế tạo Azotobacterin trước hết ta nuôi thật nhiều Azotobacter trên môi trường đặc hoặc lỏng có bơm không khí. Sau đó đem trộn chúng với than bùn hoặc các chất nuôi dưỡng khác để chế thành bột Azotobacterin. 1.2. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Azotobacter a. Hình thái khuẩn lạc

Khi nuôi trong môi trường thạch,vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc tan, lúc đầu không màu, sau biền thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen nhưng không làm nhuộm màu môi trường khuẩn lạc. Ngoài ra một số loài Azotobacter có dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng .

Vỏ nhầy của vi khuẩn Azotobacter chứa khoảng 75% là chất hiđrit của acid uronic và chứa khoảng 0.023% N.

185

H. 9.15: Hình dạng tế bào Azotobacter sp. (a) dưới kính hiển vi điện tử (b) tiêu bản âm

(www-micro.msb.le.ac.uk/ video/Azotobacter.html)

b. Hình thái tế bào vi khuẩn Azotobacter Azotobacter là loại vi khuẩn Gram âm không sinh bào tử. Khi còn non tế bào có dạng que đầu tròn đứng riêng lẻ hay xếp thành từng đôi chồng chất, chất tế bào nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động nhờ tiên mao, kích thước khoảng :2,0- 7,0× 10- 2,5 mμ . Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng hình cầu. Sinh chất xuất hiện nhiều hạt lổn nhổn. Đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ…

Lượng ADN trong tế bào Azotobacter thường thấp hơn so với nhiều loại vi khuẩn khác (0,70- 0,81%).

Tóm lại hình dạng tế bào Azotobacter và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc vào tuổi của ống giống và điều kiện phát triển. 1.3. Các đặc tính sinh lí, sinh hoá.

a. Đặc điểm nuôi cấy : Vi khuẩn Azotobacter thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, sống theo

phương thức dị dưỡng. Chúng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau: disacarit, dextrin, tinh bột, acid hữu cơ, hợp chất thơm, … tuy vậy, nhiều tác giả cho biết có không ít các chủng Azotobacter không có khả năng đồng hoá lactose, manitol hoặc natribenzoat.

b. Khả năng sử dụng nguồn N: Trên các môi trường không chứa N khuẩn lạc Azotobacter có dạng

nhầy, lồi, đôi khi nhăn nheo. Chứng tỏ vi khuẩn Azotobacter có khả năng sinh trưởng trên môi trường không có N. Sở dĩ chúng tồn tại được là vì có khả năng đồng hoá muối amonium, urê. Một số chủng Azotobacter có khả

186

năng sử dụng nitrit, nitrat. Hai loại acid thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dưỡng của Azotobacter là acid glutamic và axtit asparaginic. 1.4. Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Azotobacter

Theo Becking (1974) thì vi khuẩn cố định đạm thuộc chi Azotobacter có 4 loài: A. chroococcum; A. beijerinckii; A. vinelandii; A. agilis . 1.5. Ảnh hưởng các nhân tố sinh thái đến sự sinh trưởng và phát triển của các vi khuẩn Azotobacter

Vi khuẩn Azotobacter hiếu khí, sự phát triển và khả năng cố định N của chúng trong đất chịu ảnh hưởng của các điều kiện sau: a. Độ ẩm của đất

Azotobacter đòi hỏi độ ẩm rất cao của đất. Nhu cầu về độ ẩm của chúng cao hơn so với các vi khuẩn khác, tương đương với nhu cầu của cây trồng. Vì vậy ít gặp chúng ở vùng khô hạn, sự khô hạn của đất chỉ có bào xác của chúng mới chịu đựng được. Ẩm độ thích hợp:75- 80%. b. Độ thoáng khí .

Độ thoáng khí của đất có liên quan đến quá trình cố định N của Azotobacter. Tuy vậy vi khuẩn thuộc loại hiếu khí nhưng có thể phát triển được trong điều kiện vi hiếu khí. Quá trình cố định N của Azotobacter bị giảm khi thể ôxi hoá khử của môi trường cao quá +200 mv hoặc thấp quá (–) 200 mv. Như vậy, không khí quá mạnh cũng ức chế quá trình cố định N phân tử, khi nồng độ ôxi trong không khí là 4% quá trình cố định N vượt quá ba lần so với khi ôxi là 10- 20%. c . Nhiệt độ.

Nhiệt độ ảnh hưởng đến Azotobacter không giống nhau ở các vùng địa lí khác nhau. Ở vùng nhiệt đới Azotobacter thích hợp với nhiệt độ 35- 400C. Ở nhiệt độ 70C Azotobacter có hoạt động cố định N thấp hơn 5 lần so với 450C. Tế bào sinh dưỡng của Azotobacter không sống được khi xử lí 500C trong 30 phút, ở nhiệt độ 800C sẽ chết rất nhanh. Nhiệt độ thích hợp đối với sự phát triển của Azotobacter vào khoảng 20-300C. d. pH của đất.

pH của đất ảnh hưởng không giống nhau đến sự phát triển và khả năng cố định N của Azotobacter. Azotobacter thích hợp nhất với pH = 7,2- 8,2, song có thể phát triển được ở pH = 4,5- 9,0. Các loài Azotobacter khác nhau mẫn cảm một cách khác nhau đối với pH của môi trường. Chẳng hạn: pH thấp nhất của môi trường đối với Azotobacter

187

chroococcum và A. beijerinck khoảng 5,5; đối với A. marocytoges là khoảng 4,6.

Phần lớn Azotobacter chỉ phát triển ở pH lớn hơn 6, vì vậy ít gặp chúng ở đất chua. Cũng có thể phân lập được một số chủng từ đất chua nhưng các chủng này thường đã mất khả năng cố định N phân tử. e. Phân đạm

Trong đất Azotobacter có khả năng đồng hoá các chất dinh dưỡng từ môi trường. Nguồn N đối với Azotobacter không phải chỉ là N phân tử mà còn là muối amon, nitrat, amino acid. Tuỳ thuộc vào nồng độ của các hợp chất chứa N có trong môi trường mà quá trình cố định N sẽ bị ức chế nhiều hay ít . g. Phân lân.

Phốt pho rất cần cho quá trình cố định N của Azotobacter chỉ bắt đầu xảy ra khi nồng độ PO4

3- đạt đến 4 mg trong 100 ml môi trường. Ngược lại khi nồng độ PO4

3- đạt tới 800 mg trong 100 ml quá trình cố định N sẽ bắt đầu ngừng lại. Sự mẩn cảm mạnh mẽ của Azotobacter với phốt pho cho phép người ta sử dụng chúng như loại vi khuẩn chỉ thị để xác định nhu cầu về phospho của đất.

h. Phân kali. Sự phát triển của Azotobacter rất cần đến kali, nhưng với lượng

nhỏ. Nếu đưa vào môi trường một lượng muối kali quá dư thừa chúng sẽ làm ức chế sự phát triển của Azotobacter, có thể tác hại này là do gốc anion của muối này gây ra. i. Canxi.

Canxi ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của Azotobacter. Khi thiếu canxi tế bào Azotobacter sẽ tạo thành nhiều không bào ảnh hưởng xấu đối với việc tổng hợp ATP và sự tạo thành các polyphotphat. Những điều tra ở Việt Nam cho thấy trong đất có lượng chứa CaO cao hơn 0,4% luôn có mặt một số lượng lớn các tế bào Azotobacter. Hầu như không phát triển trong mẫu đất có có lượng chứa CaO dưới 0,25% (Nguyễn Lân Dũng 1965) Riêng đối với A.chroococcum nồng độ CaCl2 ,thích hợp nhất là 0,01% ,nếu cao hơn sẽ ảnh hưởng không tốt đối với hoạt động cố định N của chúng. Có tác giả đã dùng A. chroococum như là loài vi khuẩn chỉ thị để xác định nhu cầu về vôi của đất, nguyên tố Mg được Azotobacter đòi hỏi với số lượng cao hơn sắt khoảng 10 lần .

188

Cùng với nguyên tố đại lượng, các nguyên tố vi lượng cũng cần thiết đối với Azotobacter, đáng chú ý hơn cả là molybden, bo(Bo), mangan(Mn) k. Các nhân tố sinh học Sự phát triển và cố định N của Azotobacter trong đất còn chịu ảnh hưởng mật thiết của khu hệ các sinh vật đất. Bên cạnh các nhóm vi sinh vật có ảnh hưởng tốt còn có nhiều nhóm có khả năng ức chế sự phát triển của Azotobacter . Đã có nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến mối quan hệ gữa Azotobacter với cây trồng với số lượng cao hơn nhiều so với ngoài vùng rễ . Một số chủng A.chroococum có khả năng sinh ra một số chất chống nấm có tác dụng khá rộng (ức chế Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria …) 1.6. Tình hình nghiên cứu ứng dụng Azotobacter. Trong nhiều năm, ở nhiều nước khác nhau ,người ta đã sản xuất ở quy mô công nghiệp hoặc thủ công nghiệp những chế phẩm Azotobacter và gọi là azotobacterin. Đó là những dịch nuôi cấy Azotobacter được hấp thụ vào than bùn hoặc các loại đất giàu chất hữu cơ đã trung hoà và bổ sung thêm một ít phân phospho, kali… Khác với nitragin, azotobacterin khi dùng để bón cho cây trồng thường đưa đến những hiệu quả không lớn và không ổn định (nếu có làm tăng sản lượng thường cũng không tăng quá 10% so với đối chứng ). Đa số các tác giả cho rằng hiệu quả của việc sử dụng azotobacterin chỉ tương đối với các đất giàu chất hữu cơ hoặc trong trường hợp được bón thêm nhiều phân khoáng. Có lẽ tác dụng chủ yếu của chúng không phải ở khía cạnh cố định N mà là ở khía cạnh tổng hợp các chất hoạt động sinh học có tác dụng kích thích sinh trưởng của cây trồng . Ở Việt Nam, việc sản xuất và sử dụng chế phẩm azotobacterin chỉ đặt ra trong những điều kiện thâm canh có khả năng dồi dào về phân bón, cần bón vôi và bón phân lân để làm tăng số lượng Azotobacter trong đất. Azotobacterin chỉ có tác dụng tương đối rõ đối với các loại đất giàu chất hữu cơ hoặc trong trường hợp được bón thêm nhiều chất khóang.Có lẽ tác dụng chủ yếu của chúng không phải ở khía cạnh cố định N mà là ở khía cạnh tổng hợp các chất hoạt động sinh học có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của cây trồng . a. Các phương pháp tạo chế phẩm Azotobacter

189

* Dạng môi trường thạch nghiêng Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng Thành phần môi trường (g/l):Glucose-20; K2HPO4.3H2O -0,2; MgSO4 .7H2O -0,2; NaCl- 0,2; K2SO4 -0,1; CaCO3 -5,0; H20 -1 lít ;Thạch -20 pH: 6,5-7. Chuẩn bị giống Azotobacter :Các ống giống đã được phân lập và tuyển chọn từ trước. Tạo chế phẩm: Cấy truyền giống vi khuẩn Azotobacter từ giống gốc vào những ống nghiệm thạch nghiêng. Ủ ấm ở nhiệt độ: 28-30 C trong thời gian 2-6 ngày, loại bỏ những ống bị nhiễm vi sinh vật khác ta thu được chủng Azotobacter thuần khiết.

0

* Dạng dịch thể Chuẩn bị môi trường dịch thể Thành phần môi trường (g/l): Glucose 20 K2HPO4.3H2O 0,2 MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,2 K2SO4 0,1 CaCO3 5,0 H2O 1 lít pH 6,5-7 Chuẩn bị giống vi khuẩn Azotobacter : Lấy 5-10 ml môi trường dịch thể (Có thành phần như trên không có thạch) đã khử trùng cho vào mỗi ống nghiệmφ 14 5ml Dùng que cấy gạt nhẹ, đưa dịch vi khuẩn vào bình nón (250-500ml) đựng 150ml môi trường và nuôi chúng trên máy lắc(220 dao động/phút) . Khi khi dịch nuôi đạt mật độ 109 tế bào/ml thì có thể đem sử dụng * Dạng bột Nuôi cấy giống vi khuẩn Nhân giống Hâp thụ giống vào chất mang vi khuẩn

Điểm quan trọng cua phương pháp này là lựa chọn chất mang vi khuẩn, chất mang vi khuẩn phải đạt yêu cầu thích hợp vớ sự tồn tại của Azotobacter trong quá trình bảo quản và độ sống sót trên hạt giống khi được tẩm vào, chất mang vi khuẩn có thể là than bùn, đất bột giàu chất hữu cơ, có nơi sử dụng cả trấu, bã bia làm chất mang vi khuẩn

190

Ngày nay chất mang vi khuẩn được sử dụng bởi than bùn thích hơp trong việc sử dụng chế phẩm vi khuẩn nói chung và chế phẩm Azotobacter nói riêng. Ngoài đặc tính của than bùn là không độc, có tính hấp thụ cao, giữ nước tốt , nó còn là nguyên liệu rẻ tiền sẳn có ở nhiều nơi. 1.2. Clostridium pasteurianum và một số VSV cố định N khác C.pasteurianum là trực khuẩn kị khí bắt buộc, có bào tử, bào tử nằm ở giữa làm tế bào phình lên như hình thoi.

C. pasteurianum là một loại vi khuẩn butyric, chúng có thể sử dụng các hydratcarbon thông thường và làm lên men suinh ra acid butyric, acetic, CO2 và H2. Chúng có thể sử dụng hợp chất N vô cơ và hữu cơ làm nguồn thức ăn N, khi những hợp chất này đầy đủ thì tác dụng cố định N của chúng hạ thấp hoặc hoàn toàn không có.

Tác dụng cố định N của C. pasteurianum thấp hơn Azotobacter. Cứ mỗi khi tiêu thụ 1g hydratcarbon thì chúng cố định được 2-3 mg N. Tuy nhiên C.Pasteurianum rất nhiều và phân bố rộng rãi hơn Azotobacter nên nguồn N mà chúng cố định cho đất là rất quan trọng. Chúng lại phát triển được ở ruộng ngập nước, yêu cầu pH không gắt gao nên thích hợp cho các loại ruộng của ta.

Ngoài hai loài trên, trong các VSV cố định N còn có một số vi khuẩn thuộc chi Clostridium, Bacillus và Azotomonas. Tuy nhiên, vì những loài này phân bố không nhiều và hiệu lực cố định N cũng thấp nên tác dụng thực tế không lớn lắm. 2. Vi khuẩn cố định N cộng sinh. Phần lớn các cây thuộc họ đậu không cần thức ăn hợp chất, chúng có thể sử dụng được N không khí. Nhưng khả năng này không phải bản thân cây họ đậu có mà do những vi khuẩn nốt rễ cộng sinh với cây họ đậu mang lại. 2.1. Vi khuẩn nốt rễ

Người đầu tiên chứng minh rằng các cây bộ đậu có thể sinh trưởng trong đất không chứa N là H. Hellrigel và H. Wilfarth (1886).

Năm 1886 M.W.Beijerinck đã phân lập được vi khuẩn từ nốt rễ một số cây đậu.

Giống (chi) Rhizobium (Franck, 1889) là loại vi khuẩn đơn bào ở đất, rất dễ nhầm với Pseudomonas, trực khuẩn tự do có kích thước 1,2(m x 0,5 chuyển động nhờ nhung mao và tiên mao ở cực, hiếu khí. Khi hình thành nốt sần thì trực khuẩn biến dạng (có hiện tượng đa hình thái), nó thay đổi hình dạng tùy theo lứa tuổi và điều kiện sống. Khi còn non chúng là trực khuẩn nhỏ bé, không có bào tử, di động nhờ tiên mao. Trong quá trình phát triển, chúng sẽ chuyển thành hình cầu và những dạng phân nhánh hình chữ Y, chữ V gọi là giả khuẩn thể (Bacteroids).

191

Năm 1963, Manil đã chia các vi khuẩn nốt sần thành 3 nhóm: -Rhizobium leguminosa (đậu Hà Lan), R. trifolii (cỏ ba lá), R. phaseoli (đậu cô ve, đậu xanh). -Rhizobium lupini (mục túc, linh lăng), gộp nhóm 1 và 2 thành Rhizobium mọc nhanh. - Rhizobium lupini (đậu đũa, lupin), R. Japonicum (đậu nành) với nhiều loài phụ. Nhóm này hiện nay được định loại là Bradyrhizobium (gồm tất cả các chủng mọc chậm. Hiện nay, người ta xếp vi khuẩn nốt rễ vào một chi chung là Rhizobium.Chúng có thể sử dụng nhiều hydratcarbon khác nhau làm nguồn C. Khi sống riêng lẻ trong đất hoặc trong môi trường nuôi cấy chúng không có khả năng cố định N. Về hô hấp, chúng là loại vi hiếu khí. Rhizobium có nhiều loài và có tính chất chuyên tính, nghĩa là mỗi loài chỉ có thể xâm nhập và tạo thành nốt rễ trong một số cây họ đậu nhất định. Vi khuẩn nốt rễ khi gặp cây họ đậu thích hợp sẽ xâm nhập vào tế bào rễ, kích thích rễ tạo thành những nốt rễ. Nốt rễ thường thường bằng hạt gạo, nốt rễ to bằng hạt đậu nhỏ, trong nốt rễ chứa đầy vi khuẩn. Sau khi hình thành nốt rễ giữa vi khuẩn và cây họ đậu làm thành một thể cộng sinh có lợi cho cả hai bên. Ngoài các cây họ đậu, một số rễ cây khác cũng có thể cộng sinh với vi khuẩn cố định N. Gần đây người ta còn thấy nốt sần ở lá một vài loài cây nhiệt đới. Trong nốt sần đó cũng chứa vi khuẩn cố định N gần giống ở rễ. 2.2.Phân bón nốt rễ (nitragin) Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và được đặt tên là nitragin: Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như ở Mỹ (1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914).

Nitragin là loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizobium do Beijerink phân lập năm 1888 và được Fred đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho các loại cây thích hợp của họ đậu. Từ đó cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh cố định nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật có ích khác như một số xạ khuẩn cố định nitơ sống tự do Frankia spp, Azotobacter spp, các vi khuẩn cố định N sống tự do Clostridium pasteurianum, Beijerinkia indica, các xạ khuẩn có khả năng giải cellulose, hoặc một số chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các

192

nguồn dự trữ phospho và kali ở dạng khó hoà tan với số lượng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong các quặng apatit, phosphorid v.v... chuyển chúng thành dạng dễ hoà tan, cây trồng có thể hấp thụ được.

Trong các loại vi sinh vật kể trên, vi khuẩn nốt rễ có ý nghĩa hết sức to lớn trong nông nghiệp. Cường độ cố định N cộng sinh lớn hơn nhiều so với cường độ cố định N không cộng sinh. Sau khi trồng các cây họ đậu đất giàu thêm N rất nhiều. Chính vì vậy, từ đầu thế kỷ XX người ta nghiên cứu sử dụng phân bón nốt rễ với mục đích là để tiếp giống nhân tạo, làm cho đất không chứa vi khuẩn nốt rễ thích ứng sẽ có vi khuẩn thích ứng, làm cho cây họ đậu không sinh nốt rễ sẽ có thể sinh nốt rễ và những cây có thể sinh nốt rễ thì càng sinh nhiều hơn, cố định N càng mạnh mẽ hơn. Cách sử dụng phân bón vi khuẩn nốt rễ là đem trộn phân với hạt giống, rồi để khô, sau đó đem gieo. Cũng có thể dùng nốt rễ tốt, nghiền nát để trộn với hạt giống. Khi sử dụng có thể tăng sản lượng cây họ đậu lên 15- 20%. Ngoài hai nhóm vi khuẩn cố định N sống cộng sinh với thực vật và sống tự do trong đất như đã nói ở trên, còn một số vi khuẩn có khả năng cố định N sống trên bề mặt rễ và ăn sâu vào vào lớp tổ chức bề mặt rễ của một số cây hòa thảo như lúa, ngô, mía,... Đó là một loài vi khuẩn có dạng xoắn được phát hiện từ năm 1974 thuộc chi Azospirillum. Ngoài các nhóm vi khuẩn cố định N nói trên ra, còn có một số loài vi tảo đơn bào cũng có khả năng cố định N. Ví dụ như vi khuẩn lam sống tự do và sống cộng sinh trong bèo hoa dâu. Các loài này cũng đóng góp không nhỏ vào quá trình cố định N không khí.

Câu hỏi ôn tập chương 9

1.Hãy nêu tổng quát chu trình chuyển hóa N trong thiên nhiên và vai trò của vi sinh vật trong chu trình đó ? 2.Các nhóm vi sinh vật cố định N ? ý nghĩa thực tế của việc nghiên cứu vi sinh vật cố định đạm. 3.Nêu một số thành tựu hiện nay về nghiên cứu vi sinh vật cố định đạm. 4. Naza là gì ? Cơ chế hiện biết của quá trình cố định N phân tử. 5.Các loại phân bón vi sinh vật ? cơ sở khoa học của việc sản xuất và sử dụng các loại phân bón vi sinh vật? 6. Trình bày các bước chủ yếu điều chế Azotobacterin và Nitragin. Trong điều kiện hiện nay ở Việt Nam có thể sản xuất 2 chế phẩm này được không ? Tại sao ?

193

Chương 10

Di truyền học vi sinh vật Di truyền là đặc tính chung của mọi sinh vật giữ lại những và

truyền cho con cháu những đặc điểm về cấu tạo và phát triển của tổ tiên, hay nói cách khác, là hiện tượng các cá thể trong một gia đình có những thuộc tính cấu tạo và phát triển giống tổ tiên, với cha mẹ hoặc giữa con cái với nhau.

Biến dị là đặc tính chung của mọi sinh vật có thể mang những sự khác biệt về nhiều chi tiết tính trạng so với bố mẹ của chúng và với các cá thể khác cùng loài.

Đối tượng nghiên cứu của di truyền học không chỉ là hiện tượng di truyền mà cả hiện tượng biến dị. Tính biến dị có vẻ như độc lập với tính di truyền nhưng thực ra sự khác biệt giữa các cá thể trong một loài trong nhiều trường hợp liên quan đến sự biến đổi hoặc trong trường hợp khác đến sự phản ứng của vật chất di truyền của sinh vật.

Ở vi sinh vật biến dị thể hiện ở mức độ lớn hơn ở vi sinh vật bậc cao nhờ số cá thể trong một quần thể lớn, đơn allele, sinh sản đồng loạt, giai đoạn sinh dưỡng ngắn, tần số đột biến và tái tổ hợp cao và có khả năng trao đổi di truyền ngoài loài. Dù cơ chế xuất hiện khác nhau nhưng ở phần lớn các trường hợp biến dị đều tạo ra những dòng hay tập đoàn có sự thích ứng tốt nhất với điều kiện ngoại cảnh vốn luôn biến động.

I. Cơ sở vật chất di truyền ở vi sinh vật

1. Vật chất di truyền ở vi khuẩn

Acid nucleic là cơ sở vật chất di truyền của tất cả các dạng sinh vật. Ở tất cả các sinh vật nhân sơ (prokaryote, còn gọi là sinh vật nhân sơ sơ, bao gồm các vi khuẩn) hay nhân chuẩn (eukaryote, còn gọi là sinh vật nhân chuẩn, bao gồm nấm, tức chân khuẩn, nguyên sinh động vật, tảo, thực vật và động vật bậc cao), trừ virus và các yếu tố sinh học đơn giản hơn như viroid và prion, tính trạng được mã hóa và tồn trữ dưới dạng mã hóa là trình tự thẳng của các nucleotide trong thành phần acid deoxyribonucleic (DNA). Vật chất di truyền này được thể hiện thành tính trạng của cá thể thông qua quá trình tổng hợp từ khuôn DNA thành phân tử RNA thông tin (quá trình phiên mã) và sau đó RNA thông tin này lại làm khuôn để tổng hợp protein (cấu trúc, enzyme, thụ thể, kích thích, kìm hãm,...) trong quá trình gọi là dịch mã (transcription) dẫn đến biểu hiện tính trạng. Vật chất di truyền được truyền từ thế hệ tế bào này sang thế hệ tế bào khác (và từ thế hệ này sang thế hệ khác) nhờ quá trình tự sao

194

(replication) của phân tử DNA. Quy tắc này được gọi là quy tắc trung tâm biểu hiện di truyền.

Ở vi khuẩn DNA có thể gặp ở hai dạng: DNA nhiễm sắc thể và DNA plasmid. Nhân (thể nhân) vi khuẩn là một nhiễm sắc thể vi khuẩn cấu tạo từ một phân tử DNA duy nhất xoắn kép (gồm hai mạch xoắn), khép kín (không có đầu tự do), phân bố trong tế bào chất. Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ có một nhân (thể nhân) duy nhất, mặc dù trước khi phân bào số lượng nhân (nhiễm sắc thể) thường thấy là 2, 4 hoặc nhiều hơn do quá trình phân bào diễn ra chậm hơn quá trình phân nhân. Vì vậy, thông thường nhiễm sắc thể được mô hình hóa trong tế bào vi khuẩn dưới dạng một vòng tròn.

Hình 10.1: Mô hình cấu trúc một đoạn phân tử DNA: một dẫn xuất purine liên kết qua cầu nối hyđrô với một dẫn xuất pyrimidine nên khoảng cách giữa hai sườn đường ribose - Acid phosphoric của hai chuỗi là không đổi, guanine

luôn kết hợp với cytosine, adenine kết hợp với thymine của chuỗi song đối nên trình tự hai chuỗi không bao giờ giống nhau nhưng trình tự một chuỗi quy định trình tự của chuỗi kia, hơn nữa các sườn có nhiều nhóm ái thủy nên DNA tan tốt

trong nước.

195

Hai mạch xoắn của phân tử DNA thực chất là hai chuỗi polymer và có mối quan hệ chặt chẽ với nhau về thành phần hóa học cũng như trình tự sắp xếp của các monomer được gọi là một nucleotide. Mỗi chuỗi polymer được cấu tạo từ bốn loại monomer có cấu trúc tổng quát gồm ba thành phần: bazơ nitơ dị vòng (dẫn xuất purine hoặc pyrimidine), đường deoxyribose (C5) và Acid phosphoric. Ở DNA, có bốn loại nucleotide: adenine (A), thymine (T), guanine (G) và cytosine (C) (hay xitôzin). Các nucleotide khác nhau bởi gốc bazơ khác nhau. Chuỗi polymer của mỗi mạch (sợi) DNA được hình thành nhờ liên kết phosphoester giữa Acid phosphoric và đường deoxyribose tạo nên bộ "sườn" của phân tử ((-P-C5-)n). Còn các gốc bazơ nitơ gắn vào nguyên tử C 1' của phân tử đường deoxyribose. Phân tử Acid phosphoric trong một nucleotide gắn vào vị trí C 5' của phân tử đường deoxyribose, trong khi đó nguyên tử C 3' gắn với Acid phosphoric của nucleotide kế tiếp. Do trình tự hoạt động của các enzyme tổng hợp DNA từ đầu C 5' đến đầu C 3' của mỗi mạch DNA nên người ta quy ước mô tả mạch theo hướng C 5'→C 3'. Ví dụ, nếu không có chú giải khác thì mạch ATT CGC GCA TCA GCT cũng có nghĩa là 5'-ATT CGC GCA TCA GCT-3' hay 5'-ATT CGC GCA TCA GCT. Hai chuỗi của một phân tử DNA gắn kết với nhau nhờ các mối liên kết hyđrô giữa các gốc bazơ, một gốc purine được gắn kết với một gốc pyrimidine theo nguyên tắc "tương bù": adenine gắn với thymine bằng hai mối liên kết hyđrô, còn guanine gắn với cytosine bằng ba mối liên kết hyđrô. Hai chuỗi như vậy không đối xứng mà chạy ngược hướng (đối nghịch song song, hay song đối) từ 5'→3' hoặc ngược lại. Do một gốc purine của một chuỗi liên kết với một gốc pyrimidine của chuỗi kia nên khoảng cách giữa hai sườn (-P-C5-)n của phân tử DNA ở mọi điểm không đổi. Và nhờ vậy mà sườn này hướng ra phía ngoài và xoắn quanh trục tưởng tượng xuyên qua các lớp gốc bazơ nitơ vòng, nên với tính ái thủy của Acid phosphoric và đường deoxyribose, DNA là chất tan tốt trong nước và khá bền vững trong dung môi này. Do số lượng mối liên kết hyđrô giữa guanine (G) và cytosine (C) cao hơn nên DNA có nhiều G+C thường có mức nhiệt biến tính hay "nhiệt nóng chảy" (melting point) cao hơn hay bền vững hơn. Hơn nữa, bên cạnh cấu trúc xoắn phải (B-DNA) nêu trên, ở những vùng hàm lượng G+C cao DNA còn có cấu trúc xoắn trái (Z-DNA) là nơi DNA có sự gấp khúc mạnh và xuất hiện đoạn DNA xoắn chuỗi ba. Có thể những Z-DNA đóng vai trò quan trọng trong tái tổ hợp gen cũng như điều hòa hoạt động của gen.

Một đoạn DNA mã hóa một RNA (như RNA ribosome, RNA vận chuyển) hay mã hóa một protein (qua RNA thông tin) được gọi là một gen. Gen mã hóa phân tử protein được gọi là gen cấu trúc. Ở vi khuẩn toàn bộ trình tự nucleotide gen cấu trúc được phiên mã thành RNA thông tin và sau đó dịch toàn bộ thành trình tự Acid amin trong phân tử protein.

196

Mặc dù được cấu tạo bởi hai chuỗi nhưng ở vi khuẩn (cũng như ở sinh vật nhân chuẩn) gen chỉ có một mạch "hiệu lực", tức chỉ một mạch làm khuôn tổng hợp nên RNA thông tin. Hiệp hội sinh hóa quốc tế quy ước chuỗi làm khuôn để tổng hợp nên RNA thông tin (hay tổng hợp RNA hoạt động, như RNA ribosome,...) là chuỗi âm. Như vậy, chuỗi dương của một gen là chuỗi có trình tự nucleotide tương đương với trình tự nucleotide của RNA thông tin. Ngoài ra, do một polypeptide được khởi đầu tổng hợp với Acid amin methionine (mã AUG trên RNA thông tin), kết thúc bởi một trong những "mã dừng" (UAA, UAG và UGA) và chỉ có thể có thuộc tính protein nếu đủ lớn (dài hơn 50 Acid amin), đồng thời, thông tin di truyền được giải đọc từng "khung" bộ ba nucleotide (tức ba nucleotide liền kề nhau mã hóa cho một Acid amin trong sản phẩm protein) nên chỉ có những đoạn DNA bắt đầu từ bộ ba ATG (theo cả ba cách đọc của mỗi chuỗi DNA) đến một mã dừng (TAA, TAG, TGA) đủ dài (hơn 150 nucleotide) mới có thể là (nhưng không nhất thiết phải là) một gen cấu trúc. Đoạn DNA này được gọi là một "khung khả phiên" (hay một "khung đọc mở" - open reading frame).

Ngoài ra, không phải tất cả các đoạn DNA đều mang gen cấu trúc, chức năng của nhiều đoạn còn chưa biết, đồng thời còn có các đoạn DNA đặc biệt tham gia vào điều hòa hoạt động của các gen cấu trúc. Nhờ vậy, các tính trạng quy định trong genome chỉ biểu hiện trong điều kiện môi trường nhất định, đồng thời quá trình tổng hợp các cơ chất nguyên liệu cho quá trình tổng hợp các thành phần tế bào cũng diễn ra và đình chỉ một cách hiệu quả và tiết kiệm. Ở sinh vật nhân sơ các gen cấu trúc (các cistron) được gắn liền nhau thành tập hợp và cùng chịu sự kiểm soát của các gen điều hòa gồm gen (hay vùng) khởi động (promotor - P), gen (hay vùng) điều hành (operator - O, còn gọi là gen chỉ huy) và gen điều hòa (regulator - R). Gen điều hòa (R) nằm ở vị trí nào đó trong nhiễm sắc thể xa với các gen cấu trúc và điều khiển việc tổng hợp một protein đặc biệt có tác động (phong tỏa hoặc giải tỏa) trực tiếp hoặc gián tiếp lên các vùng P hoặc O. Cả tập hợp bao gồm các vùng khởi động, vùng điều hành và các gen cấu trúc tạo thành một đơn vị hoạt động gọi là operon.

RNA gồm ba loại khác nhau: RNA ribosome là thành phần chủ yếu cấu tạo nên ribosome, có chức năng hoạt động như một enzyme tức xúc tác quá trình sinh tổng hợp protein. (Những RNA xúc tác phản ứng sinh học thường được gọi là ribozyme). RNA thông tin được sao chép từ chuỗi âm của gen có vai trò sao mã di truyền từ nhiễm sắc thể cho RNA ribosome giải mã thành phân tử protein có mạch polypeptide có thành phần và trình tự Acid amin xác định. Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein còn có nhóm các RNA vận chuyển. Đây là những phân tử RNA tương đối ngắn có tác dụng hoạt hóa Acid amin nguyên liệu và vận

197

chuyển Acid amin này đến RNA thông tin cũng đã được hoạt hóa nhờ gắn kết với ribosome. Trình tự RNA thông tin quyết định trình tự Acid amin trong thành phần polypeptide, nhưng quá trình nhận biết trình tự Acid amin mã hóa trong RNA thông tin là nhờ RNA vận chuyển. Mỗi Acid amin được mã hóa bởi một bộ ba nucleotide trên RNA thông tin, và bộ ba này tương bù với trình tự bộ ba nucleotide nhận biết của RNA vận chuyển. Nhờ mỗi Acid amin có loại RNA vận chuyển riêng nên trình tự mã bộ ba được dịch một cách chính xác.

Bảng 10.1 : Mã di truyền trên nhiễm sắc thể (biểu hiện trên mRNA, chiều 5' đến 3') Chữ thứ hai của mã

Đầu 5'

U C A G

UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys U UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys C UUA Leu UCA Ser UAA Stop UGA Stop A U

UUG Leu UCG Ser UAG Stop UGG Trp G CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg A C

CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg G AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg A A

AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly C GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly A

Chữ

thứ

nhất

của

mã

(đầu

5')

G

GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G C

hữ thứ

ba của

mã

(đầu

3')

Khác với DNA, các RNA đều cấu tạo chỉ từ một chuỗi nucleotide. Ngoài ra, trong thành phần của các RNA còn có những điểm khác biệt khác: uracine thay thế thymine, đường deoxyribose được thay thế bởi ribose trong sườn của mạch polymer cũng như sự có mặt một số bazơ dẫn xuất khác của purine và pyrimidine. Chính vì có thêm một gốc -OH ở vị trí C 2' (của đường ribose) mà cầu nối phosphoester giữa nguyên tử C 3' và Acid phosphoric của nucleotide tiếp theo thường yếu hơn so với cầu nối C 3' với Acid phosphoric trong DNA. RNA, vì vậy, cũng kém bền vững hơn DNA.

Tuy cấu tạo từ chỉ một chuỗi nucleotide nhưng cấu trúc không gian của các loại RNA lại ổn định nên chức năng của chúng cũng ổn định. Tính ổn định của cấu trúc có được nhờ các mối liên kết hyđrô xuất hiện giữa hai đoạn trình tự tương bù ngược hướng của cùng chuỗi nucleotide. Hai đoạn có trình tự tương bù ngược hướng tạo thành một đoạn xoắn kép,

198

trong khi đoạn nucleotide nằm giữa chúng hình thành một "thòng lọng" mạch đơn. Vì vậy, chẳng hạn, các phân tử RNA vận chuyển có dạng "lá ba chẽ" với chức năng đặc hiệu.

Bên cạnh DNA nhiễm sắc thể ở vi khuẩn còn có thể gặp cơ sở vật chất di truyền ngoài nhiễm sắc thể gọi là plasmid. Về bản chất hóa học, plasmid cũng là một phân tử DNA xoắn kép, khép kín, nhưng có phân tử lượng thấp hơn nhiều (khoảng 106 - 108 Dalton, hay khoảng 1/100 đến 1/200 lần nhiễm sắc thể vi khuẩn). Một vi khuẩn có thể không mang, hoặc mang một hoặc một số plasmid. Plasmid có thể phân bố trong tế bào chất ở trạng thái tự do và có thể sao chép một cách độc lập với nhiễm sắc thể hoặc nằm trong nhiễm sắc thể (tái tổ hợp), khi đó plasmid được gọi là episome. Ở trạng thái tái tổ hợp trong nhiễm sắc thể (hay episome) plasmid thường được sao chép đồng thời với nhiễm sắc thể và được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác của vi khuẩn. Tuy vậy, trong nhiều trường hợp (như chủng Hfr) plasmid tái tổ hợp lại có thể điều khiển sao chép độc lập, làm cho bản thân plasmid hoặc một đoạn plasmid kèm theo một đoạn DNA nhiễm sắc thể được tổng hợp đồng loạt với tần suất cao. Có loại plasmid có số phiên bản cao (high-copy plasmid), trong khi đó có loại plasmid có số phiên bản thấp (low-copy plasmid).

Hình 10.2: Bản đồ enzyme hạn chế của plasmid pBR322, là một plasmid

được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Plasmid cải biến nhân tạo này mang hai gen kháng thuốc (tetR đề kháng tetracycline và ampR đề kháng

ampicillin) và một loạt vị trí cắt của enzyme hạn chế trong đó mỗi enzyme này chỉ có một vị trí phân cắt, nhờ vậy plasmid vector này áp dụng được với nhiều

DNA khác nhau.

199

Thêm hoặc mất một plasmid thường dẫn đến mất hoặc bớt một hoặc một số tính trạng, mặc dù nhiều plasmid không thể hiện tính trạng (plasmid "câm"). Tính trạng mà các plasmid điều khiển đa dạng nhưng nhìn chung plasmid không phải là yếu tố thiết yếu đối với sự sống còn của vi khuẩn. Dựa vào sự tương hợp của các sản phẩm của plasmid mà người ta chia các plasmid thành một số nhóm: plasmid giới tính, plasmid đề kháng, plasmid điều khiển sinh tổng hợp (nhóm chất nào đó),... và thường liên quan đến tính gây bệnh của các vi khuẩn. Ví dụ, đã xác định được rằng một số loài (hoặc còn được coi là dạng huyết thanh học) vi khuẩn Salmonella có được độc tính nhờ mang plasmid.

Bảng10.2 : Plasmid độc tính đặc hiệu một số loài (dạng huyết thanh)

Salmonella Salmonella Độ lớn (kb) Biểu hiện tính gây bệnh chủ yếu

S. typhimurium 90 Độc tính gây chết, giảm thiểu tính thẩm thấu của các chất kỵ thủy

S. dublin 75 Độc tính gây chết, tính đề kháng huyết thanh, năng lực tăng trưởng trong tế bào hệ lưới nội bì

S. naestved 75 Giống như plasmid ở S. dublin ( hay serovar Dublin)

S. enteritidis 54 Độc tính gây chết S. choleraesuis 50 Độc tính gây chết, gây chứng máu nhiễm

khuẩn ở chuột S. gallinarum-pullorum 85 Độc tính gây chết

Plasmid giới tính còn gọi là yếu tố sinh dục hay yếu tố F (fertility factor), là plasmid điều khiển sự hình thành các pili giới tính (nhung mao giới tính), sự tiếp hợp và sự vận chuyển thông tin di truyền (gen plasmid hay gen nhiễm sắc thể) một chiều từ tế bào cho sang tế bào nhận. Trong trường hợp này tế bào mang plasmid F là tế bào cho thường được gọi là tế bào đực hay tế bào F+, còn tế bào nhận được gọi là tế bào cái hay tế bào F-. Yếu tố F có thể nằm ở trạng thái tự do trong tế bào chất hay ở trạng thái liên kết với nhiễm sắc thể hay trạng thái episome. Trong trường hợp sau quá trình vận chuyển thông tin di truyền thường diễn ra với tốc độ và tần suất cao nên những chủng vi khuẩn này thường được gọi là chủng Hfr (bắt nguồn từ tiếng Anh: high frequency of recombination).

Yếu tố đề kháng, hay yếu tố kháng thuốc, hay plasmid R (resistance factor), là plasmid điều khiển sự đề kháng của vi khuẩn đối với các chất kháng sinh và thuốc chống vi khuẩn khác. Cơ chế đề kháng này là sự điều khiển việc tổng hợp các enzyme (như penicillinase,...) phân

200

hủy thuốc kháng sinh thành các sản phẩm vô hoạt hoặc ức chế sự xâm nhập của thuốc kháng sinh vào tế bào (như chặn các lỗ khổng trên màng tế bào chất đối với tetracycline hoặc thuốc kháng sinh họ macrolide,...). Yếu tố R lan truyền được (transmissible R factor) là yếu tố F kháng thuốc, gồm hai miền gen. Một miền gen điều khiển sự đề kháng. Số lượng yếu tố bị đề kháng có thể là 1 đến 10 hoặc nhiều hơn nữa, trường hợp sau thường gọi là plasmid đề kháng đồng loạt. Miền gen thứ hai (miền RTF) là gen điều khiển sự vận chuyển các plasmid vào tế bào khác. Thông thường sự vận chuyển các plasmid này có tốc độ cao, nhưng yếu tố vận chuyển cũng có thể tự ức chế hoặc bị ức chế bởi yếu tố khác. Yếu tố R không lan truyền được (non-transmissible R factor) chỉ mang miền gen điều khiển tính đề kháng. Các plasmid này không tự vận chuyển sang tế bào khác mà chỉ làm cho tế bào mang chúng có tính đề kháng thuốc kháng sinh. Chúng có thể tồn tại và phổ biến trong quần thể vi khuẩn nhờ quá trình sinh sản của vi khuẩn hoặc nhờ các quá trình vận chuyển vật chất di truyền qua dịch thể tức quá trình biến nạp (transformation) hoặc sự vận chuyển của virus của vi khuẩn (phage, hay thực khuẩn thể) tức nhờ quá trình tải nạp (transduction).

2. Vật chất di truyền ở virus

Khác với các sinh vật khác, virus chỉ mang một trong hai loại Acid nucleic (hoặc DNA hoặc RNA), có loại virus mang genome dưới dạng DNA (tương tự genome của vi khuẩn, động vật và thực vật) nhưng có loại lại mang genome dưới dạng RNA. Hầu hết các virus thực vật có genome RNA, còn hầu hết virus của vi khuẩn có genome DNA, trong khi các virus động vật có genome hoặc loại này hay loại khác. Cũng như bản chất hóa học, cấu trúc genome của virus rất đa dạng, có loại virus mang DNA một sợi (chuỗi) âm hoặc dương, có loại DNA hai sợi, có loại mang RNA một sợi âm hoặc dương hoặc lưỡng nghĩa (ambisense RNA: có đoạn âm có đoạn dương, hay đồng thời với khung khả phiên một gen cấu trúc còn mang khuôn của một khung khả phiên một gen khác ngược hướng). Genome nhiều virus là một sợi acid nucleic duy nhất nhưng cũng có loại virus genome bao gồm một số đoạn. Thông tin di truyền trên genome của virus cũng có sự khác biệt khác so với genome vi khuẩn. Đó là hiện tượng gen chồng lặp (overlapping genes): có thể có hai RNA thông tin khác nhau được sao chép từ một đoạn genome. Dưới đây trình bày ngắn gọn về cấu trúc genome một số virus.

Genome các virus thuộc chi Parvovirus là virus chứa DNA một sợi âm nhưng cũng thấy khoảng 1 - 50% số virion chứa DNA một sợi dương. Ở các chi Dependovirus và Densovirus thì số lượng virion chứa

201

DNA chuỗi âm và virion chứa DNA chuỗi dương tương bù về căn bản tương đương nhau.

Genome của các Adenovirus (họ Adenoviridae) là một phân tử DNA 2 sợi chuỗi thẳng.

Genome các virus họ Papillomaviridae là một phân tử DNA hai sợi chuỗi vòng khép kín, phân tử lượng khoảng 5 kbp .

Genome của các baculovirus (họ Baculoviridae) rất lớn, tương đương genome của các tế bào côn trùng, là một phân tử DNA duy nhất hai sợi, trong đó có chứa một gen cho tiểu đơn vị lớn của enzyme ribonucleotide reductase (RR1).

Genome của các hepadnavirus (họ Hepadnaviridae) là một phân tử DNA mạch vòng, có vùng gồm 2 sợi, có vùng chỉ một sợi. Sợi DNA âm là sợi đầy đủ, có chiều dài toàn bộ là 3,0 - 3,2 kb có khấc (nick) đặc hiệu ở một số chỗ. Còn sợi DNA dương thì có độ dài không hoàn toàn và không ổn định, thường từ 1,7 đến 2,8 kb.

Genome của các orthomyxovirus (họ Orthomyxoviridae) là RNA một sợi gồm 8 phân đoạn (riêng virus cúm C có 7 phân đoạn).

Các bunyavirus (họ Bunyaviridae) có genome gồm 3 phân tử RNA một sợi âm có kích thước khác nhau (gọi là các RNA L, M và S). Riêng RNA S của chi Phlebovirus có một đoạn có cơ năng của sợi dương, nên thường gọi "RNA lưỡng nghĩa (ambisense RNA").

Genome các arenavirus (họ Arenaviridae) có 2 phân tử RNA một sợi. Ngoài ra, bên trong virion còn có các RNA 28 S, 18 S, 4 - 6 S có nguồn gốc từ tế bào ký chủ. Các RNA 4 - 6 S chứa RNA thông tin dưới genome (subgenomic mRNA) mã hóa protein Z có thể là nhân tố điều tiết sao chép. RNA genome cũng lưỡng nghĩa (ambisense).

Genome picornavirus (họ Picornaviridae) cấu tạo từ 1 phân tử RNA một sợi dương chuỗi thẳng, phân tử lượng 2,4 - 2,7 x 106 (khoảng 7,5 - 8,5 kb), có chuỗi poly-A ở đầu 3', còn đầu 5' kết hợp cộng hóa trị với phân tử protein VPg có phân tử lượng khoảng 2.400 Da.

Genome của các birnavirus (họ Birnaviridae) là phân tử RNA hai sợi, gồm hai đoạn (đoạn A có kích thước 3,1 kbp và đoạn B 2,9 kbp).

3. Vật chất di truyền ở vi sinh vật nhân chuẩn

Ở vi sinh vật nhân chuẩn (eukaryote) vật chất di truyền cũng có bản chất hóa học là acid nucleic DNA, RNA. Chức năng hai loại acid này tương tự ở tế bào nhân sơ. DNA mang mật mã thông tin di truyền trong khi RNA tham gia chuyển hóa mật mã này thành protein mà thể

202

hiện tính trạng. Quá trình tự sao chép DNA cũng là cơ sở di truyền từ thế hệ tế bào này sang thế hệ tế bào khác hay thế hệ này sang thế hệ khác. Điểm khác biệt lớn giữa sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân sơ là nhân chuẩn có màng nhân và genome thường gồm hai bộ (lưỡng bội) hoặc đôi khi nhiều hơn nhiễm sắc thể (ở thực vật: tam bội, tứ bội, đa bội) cũng cấu tạo từ DNA xoắn kép nhưng không khép kín (có đầu tự do). Tuy nhiên ở nhiều nấm và thực vật còn tồn tại chu trình đơn bội, khi đó trong tế bào nhân chỉ chứa một bộ nhiễm sắc thể. Thể đơn bội này ở nhiều nấm tồn tại song song với thể lưỡng bội và dạng tế bào song nhân có hai nhân đơn bội riêng rẽ. Ở các nấm chuyển hình hoàn toàn (holomorphous fungi) thể lưỡng bội thường là điểm khởi đầu của sự hình thành cơ quan sinh bào tử hữu tính từ đó sản sinh các bào tử đơn bội. Còn ở các nấm chuyển hình không hoàn toàn (imperfect fungi) không có giai đoạn lưỡng bội. Điểm khác biệt nữa là, DNA nhiễm sắc thể nhân chuẩn còn quấn quanh các phân tử protein histone.

Tổ chức gen sinh vật nhân chuẩn còn có sự khác biệt khác so với sinh vật nhân sơ. Gen cấu trúc bao gồm nhiều đoạn và chỉ một số đoạn mã hóa cấu trúc protein. Trong quá trình phiên mã, gen trên nhiễm sắc thể được sao chép thành RNA thông tin sơ cấp trong nhân tế bào nhưng để trở thành RNA thông tin thành thục đặc hiệu thì RNA phải trải qua quá trình biến đổi. Một số đoạn của RNA thông tin sơ cấp bị cắt bỏ khỏi đoạn RNA thông tin (trong quá trình gọi là splicing - "cắt xén", hay "tách ghép"), đồng thời đầu 5' được methyl hóa, còn đầu 3' được bổ sung đoạn dài adenine (poly-A). Methyl hóa đầu 5' làm cho RNA thông tin có thể nhận biết đối với ribosome, còn quá trình poly-A hóa RNA thông tin góp phần đẩy RNA này ra khỏi lỗ khổng màng nhân mà đi vào tế bào chất. Phần gen tương ứng phần còn lại của RNA thông tin thành thục là phần được biểu hiện thành tính trạng nên được gọi là exon, phần bị cắt bỏ gọi là intron. Đoạn DNA mã hóa RNA thông tin sơ cấp được gọi là một đơn vị gen. Cấu trúc gen không liên tục này đóng vai trò quan trọng đối với sự biệt hóa tổ chức trong quá trình sinh trưởng của cá thể. Ngoại lệ có thể gặp là gen histone và interferon không có intron. (Ngoài ra, genome nhiễm sắc thể ở động vật bậc cao còn có trình tự lặp giàu G+C ở đầu nhiễm sắc thể, gọi là telomer, thường bị ngắn dần sau mỗi lần phân bào do đoạn RNA mồi không được tổng hợp bù đắp bằng DNA, có thể liên quan đến quá trình lão hóa của cơ thể).

Bên cạnh genome nhiễm sắc thể (ở trong nhân), ở các eukaryote còn có hệ thống tín hiệu di truyền khác là DNA trong các ty thể và lạp thể. Bộ gen này điều khiển sự tổng hợp một số protein của các cơ quan này và có bản chất tương tự bộ gen ở sinh vật nhân sơ (DNA cũng có cấu tạo mạch xoắn kép, khép kín) nhưng được cắt bớt đi nhiều. Ở sinh vật

203

sinh sản hữu tính (hợp tử hình thành từ giao tử đực và giao tử cái) bộ gen này ở mọi cá thể đều có nguồn gốc từ mẹ do trong quá trình thụ tinh giao tử đực không truyền được các ty thể (và lạp thể ở thực vật) vào giao tử cái. Genome của các tiểu cơ quan (ty thể và lạp thể) được phiên mã thành RNA thông tin tương ứng với quá trình diễn ra tương tự ở tế bào nhân sơ.

Gen nhảy (transposon) là đoạn DNA đặc biệt gặp cả ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn, không có vị trí ổn định trong nhiễm sắc thể. Đoạn này có thể tách rời khỏi vị trí vốn có của nó và di chuyển đến một vị trí khác của cùng nhiễm sắc thể hoặc sang nhiễm sắc thể khác. Tuy không phải là gen cấu trúc nhưng transposon ảnh hưởng rất lớn đến quá trình biểu hiện tính trạng. Nó có thể khống chế hoặc giải phóng một gen cấu trúc nào đó dẫn đến việc mất tính trạng hoặc xuất hiện tính trạng quy định bởi gen đó. Quá trình khống chế có thể diễn ra khi một gen nhảy chèn vào khoảng giữa gen khởi động (promoter) và gen cấu trúc cũng như chèn vào giữa gen cấu trúc làm cho quá trình phiên mã không thể khởi động hoặc bị gián đoạn.

II. Di truyền và biểu hiện tính trạng

1. Tự sao hay tái tạo DNA (replication)

Quá trình tổng hợp DNA trong nhân tế bào gắn chặt chẽ với quá trình bão toàn và truyền đạt thông tin di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Nguyên lý bổ sung các bazơ trong chuỗi xoắn kép DNA đáp ứng quá trình nhân đôi và tái bản chính xác trình tự các bazơ trong phân tử gốc hay DNA khuôn. Trong quá trình tái tạo DNA, phân tử này được tách đôi thành hai mạch đơn. Mỗi mạch đơn của DNA gốc được dùng để làm khuôn tổng hợp một mạch mới có các nucleotide liên kết hyđrô tương bù với các nucleotide của chuỗi gốc. Phân tử DNA, như vậy, có một chuỗi là chuỗi gốc còn chuỗi thứ hai hoàn toàn được tổng hợp mới. Do đó, cơ chế tự sao DNA là cơ chế bán bão toàn. Đây là quá trình phức tạp có sự tham gia của nhiều enzyme và protein khác nhau. Đặc biệt ở DNA sinh vật nhân sơ, do DNA xoắn kép, khép kín nên hai sợi phải xoắn bện và lồng vào nhau không thể tách rời nên quá trình tự sao DNA lại càng phức tạp và có sự tham gia của nhiều yếu tố. Vị trí bắt đầu quá trình tái bản DNA được gọi là điểm khởi đầu tái bản, vùng có mạch gốc được tách đôi gọi là chạc tái bản. Sự phát sinh một chạc tái bản từ điểm khởi đầu được gọi là sự khởi đầu tái bản. Khi khởi đầu tái bản enzyme topoizomerase (tức gyrase) có chức năng cắt đứt một sợi của chuỗi DNA và khôi phục sợi này lại nhanh chóng làm cho DNA xoắn kép có thể tách đôi được mà vẫn giữ nguyên cấu trúc. Quá trình tháo duỗi xoắn của chuỗi đôi thành chuỗi đơn có sự tham gia của enzyme helicase. Đoạn mạch đơn duy trì được độ

204

căng của nó là nhờ các enzyme đặc biệt gọi là các protein liên kết DNA mạch đơn (ssDNA binding protein). Trong tế bào các nucleotide nguyên liệu được tổng hợp sẵn dưới dạng các phân tử cao năng nucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP và dCTP). Các nucleotide này không thể tự liên kết vào chuỗi DNA một sợi dù thỏa mãn tính tương bù mà phải còn cần có một oligonucleotide (tức một đoạn Acid nucleic mạch đơn) gọi là mồi (primer) gắn kết một cách tương bù với đoạn DNA một sợi đã được duỗi sẵn. Đoạn oligonucleotide mồi này thường là một đoạn RNA ngắn được enzyme primase xúc tác tổng hợp trực tiếp trên khuôn DNA và sau đó cung cấp đầu 3'-OH cho một nucleotide nguyên liệu lắp ráp vào. Nhờ đó, mạch của chạc tái bản luôn duy trì được đầu 3'-OH để từ đó một nucleotide mới khác lắp ráp vào. Quá trình lắp ráp tiếp diễn dưới sự xúc tác của enzyme DNA-polymerase III. Mồi RNA sau đó được phân hủy khỏi DNA khuôn và chỗ trống này được lấp đầy nhờ enzyme DNA-polymerase I. Quá trình tổng hợp DNA từ chạc tái bản, như vậy, tiếp diễn nhờ nối dài đầu 3'-OH của mỗi mạch mới theo hướng 3'→5'của sợi khuôn. Chính vì vậy, quá trình tổng hợp DNA trên một sợi khuôn là liên tục, còn trên sợi kia (sợi đối nghịch song song với sợi trước) quá trình tổng hợp lại diễn ra gián đoạn, trong khi chạc tái bản chuyển động liên tục về một hướng. Mạch có sự lắp ráp liên tục gọi là mạch tiến còn trên mạch kia sự tổng hợp lại diễn ra theo hướng ngược với chiều chuyển động của chạc tái bản gọi là mạch lùi hay mạch gián đoạn. Một khi đoạn khuôn mới được mở ra thì trên mạch lùi này lại diễn ra sự tổng hợp một mồi mới nhờ enzyme primase, rồi từ mồi này quá trình lắp ráp các nucleotide tương bù với trình tự của mạch khuôn lại diễn ra. Sau đó nhờ tác dụng endonuclease của enzyme DNA-polymerase I mà mồi bị loại bỏ, và cũng dưới sự xúc tác của enzyme này chỗ trống được lấp bởi sự lắp ráp các deoxyribonucleotide. Những đoạn mạch này được gọi là đoạn Okazaki (gọi theo tên người phát hiện). Mối liên kết giữa các đoạn Okazaki được kết nối sau đó nhờ enzyme ligase. Các protein trong tập hợp các protein tham gia quá trình tái bản DNA gọi là replisome. Nhờ hệ thống này mà quá trình tái bản DNA diễn ra với tốc độ cao (ở E. coli khoảng 30000 - 50000 đôi nucleotide trong một giây).

Ở sinh vật nhân chuẩn quá trình tự sao DNA diễn ra theo quá trình tương tự nhưng cơ chế có thể phức tạp hơn và còn nhiều điểm chưa rõ. DNA nhiễm sắc thể tế bào nhân chuẩn rất dài và sự khởi đầu tái bản có thể đồng thời từ nhiều điểm khởi đầu tái bản và thường diễn ra theo cả hai chiều. Đoạn DNA giữa hai điểm khởi đầu tái bản được gọi là đơn vị tái bản. Trung bình độ dài một đơn vị tái bản đến 40000 bp. Khi bắt đầu tái bản từ điểm khởi đầu tái bản, enzyme topoisomerase cắt DNA ở một sợi và nhanh chóng khôi phục khía đứt để chuỗi siêu xoắn kép được tháo xoắn và duỗi thẳng. Enzyme DNA-helicase tham gia vào tháo duỗi xoắn

205

của chuỗi kép để tạo mạch đơn. Bên cạnh các DNA-polymerase, topoisomerase, helicase và primase, trong tổ hợp replisome của tế bào nhân chuẩn còn có các protein khác gọi là các yếu tố tái bản A, B, và C,... (RFA, RFB, RFC,...) cũng như kháng nguyên hoạt hóa nhân tế bào (PCNA). Cũng đã phát hiện được bốn loại DNA-polymerase khác nhau, ký hiệu theo độ lớn của phân tử lượng là α, β, γ, và δ. DNA-polymerase α, β và δ phát hiện thấy trong nhân tế bào còn DNA-polymerase γ thì chỉ phát hiện trong các ty thể và lạp thể. Quá trình tái bản DNA nhân chuẩn trên chạc tái bản diễn ra tương tự ở tế bào vi khuẩn. DNA-polymerase δ hoạt động tương đương DNA-polymerase III ở vi khuẩn: xúc tác kéo dài quá trình lắp ráp. Sự khởi đầu mỗi đoạn tái bản cũng do enzyme primase đảm nhận, nó tổng hợp một đoạn RNA trên khuôn DNA chuỗi đơn và nhờ đó cung cấp đoạn chuỗi đôi cho DNA-polymerase nhận biết và đầu 3'-OH cần thiết cho quá trình lắp ráp. Enzyme này xúc tác quá trình lắp ráp trên cả mạch tiến (mạch liên tục) lẫn mạch lùi (mạch gián đoạn). Tương tự DNA-polymerase I ở vi khuẩn, ở mạch lùi quá trình khử bỏ các RNA mồi và lấp chỗ trống của mồi bởi deoxyribonucleotide do DNA-polymerase α đảm nhận. (Vai trò của hai DNA-polymerase khác còn chưa rõ). Cuối cùng vết khấc giữa các đoạn Okazaki cũng được kết nối nhờ sự xúc tác của enzyme ligase. Tốc độ tái bản DNA phụ thuộc vào tốc độ làm việc của các hệ thống tái bản trên mạch lùi vì quá trình tái bản trên mạch này thường chậm trễ so với mạch tiến.

Bên cạnh cơ chế tái bản phụ thuộc primase tạo mồi (ở sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn) nêu trên còn có cơ chế tái bản DNA khác gọi là cơ chế tái bản theo vòng lăn thường thấy ở plasmid và có thể diễn ra ở nhiễm sắc thể vi khuẩn cũng như nhiễm sắc thể sinh vật nhân chuẩn. Ở plasmid hoặc vi khuẩn, chẳng hạn, từ một điểm cắt bởi enzyme endonuclease trên một sợi hình thành đầu 3'-OH và đầu 5'-P. Đầu 5'-P tách dần ra khỏi vòng và được tổng hợp gián đoạn (có sự tham gia của primase), còn đầu 3'-OH được DNA-polymerase nhận biết và xúc tác quá trình lắp ráp không cần mồi RNA. Ở sinh vật nhân chuẩn tái bản kiểu vòng lăn diễn ra trong trường hợp khuyếch đại gen. Khi đó một mạch đơn của đoạn gen này bị cắt tại một điểm, tách ra rồi vòng lại, đầu 3'-OH hoạt động như một mồi cho DNA-polymerase tổng hợp liên tục nhiều vòng đoạn nhiễm sắc thể này. Kết quả là sau lần tái bản DNA tiếp theo số phiên bản của gen tăng cao trong thành phần của nhiễm sắc thể.

Ở các virus RNA, quá trình tự sao genome có cơ chế đa dạng tùy thuộc loại virus DNA một sợi hay hai sợi, virus RNA một sợi hay hai sợi, hay virus có quá trình phiên ngược (hepadnavirus và retrovirus). Còn các virus DNA hai sợi, nhìn chung, có quá trình sao chép tương tự ở prokaryote và eukaryote. Ở virus DNA có genome chuỗi thẳng có cấu

206

trúc kẹp tóc (hair pin) ở đầu quá trình tái bản DNA có thể theo cơ chế tái bản theo vòng lăn. Các virus RNA hai sợi cũng có quá trình tương tự ở DNA hai sợi nhưng diễn ra trong tế bào chất tế bào ký chủ với sự xúc tác của enzyme RNA-polymerase phụ thuộc RNA và sự sao chép RNA không cần đến đoạn mồi oligonucleotide. Ở các virus một sợi (DNA hoặc RNA), quá trình tái bản genome đều thông qua dạng tái tạo (replicative form) là dạng Acid nucleic (NA) hai sợi gồm một sợi NA virus và một sợi NA tương bù được tổng hợp trong tế bào ký chủ (nhưng không có trong thành phần virion). Sợi tương bù tiếp tục làm khuôn để tổng hợp đồng loạt các sợi NA virus. Trường hợp cá biệt xảy ra với các virus thuộc họ Hepadnaviridae và họ Retroviridae. Genome hepadnavirus gồm DNA hai sợi mạch vòng, sợi âm có cấu trúc khá đầy đủ nhưng có một điểm khuyết thiếu (khấc) đặc hiệu chi, còn sợi dương có độ dài không hoàn toàn và không ổn định. Nhờ DNA-polymerase sẵn có trong virion, sợi dương không hoàn toàn được tổng hợp thành sợi dương hoàn toàn (để tổng hợp RNA thông tin). Còn sợi âm làm khuôn tổng hợp sợi RNA dương. Sau đó, nhờ sự xúc tác của enzyme RT (enzyme phiên ngược - reverse transcriptase), hàng loạt sợi DNA âm của virus được tổng hợp từ khuôn là sợi RNA dương. Những sợi DNA âm này lại làm khuôn để tổng hợp DNA dương nhưng quá trình này chưa kịp hoàn thiện thì DNA hai sợi này bị nhồi vào vỏ capsid cũng đồng thời hình thành.

Ở các retrovirus, genome là phân tử RNA gồm hai đoạn có đầu 5' giống nhau. Dưới tác dụng của enzyme RT và mồi là RNA vận chuyển chuỗi DNA âm tương bù được tổng hợp. Sau khi chuỗi RNA bị phân giải sợi DNA âm được dùng làm khuôn để tổng hợp sợi DNA dương tương bù. Cấu trúc DNA hai sợi này có các đoạn dài trình tự lặp ở đầu cực (LTR - long terminal repeat). Nhờ LTR này mà sau khi di nhập vào nhân DNA retrovirus tái tổ hợp vào DNA nhiễm sắc thể tế bào ký chủ (trở thành tiền virus - provirus). Provirus nhờ tín hiệu sao chép trong LTR dưới tác dụng của RNA-polymerase của ký chủ mà tổng hợp RNA genome virus (đồng thời với việc tổng hợp các RNA thông tin có kích thước khác nhau).

2. Phiên mã (Transcription)

Phiên mã là quá trình sao chép trình tự nucleotide trên DNA gen cấu trúc thành trình tự nucleotide trên RNA thông tin (mRNA). Thông tin di truyền trên DNA như vậy được truyền đạt sang hệ thống tổng hợp các yếu tố hình thành tính trạng. Quá trình này thường diễn ra trên chạc tái bản DNA nên khi hoàn thành quá trình tự sao DNA thì tế bào cũng đã chuẩn bị sẵn lượng lớn RNA thông tin cần thiết. Đồng thời, trên một khuôn DNA có nhiều RNA thông tin được tổng hợp. Về nguyên lý tổng

207

hợp RNA thông tin cũng theo nguyên tắc tương bù nucleotide. Một adenyl ribonucleoside triphosphate sẽ tìm đến lắp ráp tương bù với thymine trên khuôn DNA. Các ribonucleoside triphosphate khác cũng hoạt động tương tự: A bù T, C bù G, G bù C nhưng uracyl ribonucleoside triphosphate thay thế thymyl ribonucleoside triphosphate gắn kết tương bù với adenine trên khuôn DNA. Quá trình phiên mã được xúc tác bởi enzyme RNA-polymerase và không cần có sự tham gia của mồi.

Quá trình phiên mã diễn ra trong bốn giai đoạn: sự nhận biết đoạn khởi đầu, mở đầu sự hình thành chuỗi, kéo dài chuỗi và kết thúc. RNA-polymerase ở vi khuẩn gồm bốn tiểu phần: hai tiểu phần giống nhau α và hai tiểu phần khác β và β1. Enzyme nhận biết được điểm khởi đầu khi có yếu tố σ. Đoạn khởi đầu có trật tự nucleotide giàu A và T nên thường gọi là trình tự ATAT (hay miền ATAT) là một vùng của miền khởi động (promoter) trong cấu trúc operon (gồm các đoạn gen cấu trúc với các gen điều hòa (R) và gen điều hành (O) phân bố trước chúng). Gắn vào điểm khởi đầu phiên mã, RNA-polymerase định hướng tới đúng chỗ bắt đầu tổng hợp RNA. Ở điểm bắt đầu quá trình lắp ráp một ribonucleoside triphosphate tương bù được lắp vào. Sau đó RNA-polymerase tiếp tục trượt dọc theo khuôn (chuỗi đơn) DNA, nhờ đó các ribonucleoside triphosphate tương bù tiếp theo cũng được lắp vào chuỗi RNA. Hướng kéo dài của mạch luôn là 5'→3'. Khi chạy đến vùng kết thúc, RNA-polymerase được tác động với yếu tố ρ, và xảy ra quá trình kết thúc phiên mã: cả RNA-polymerase lẫn chuỗi RNA được tách khỏi chuỗi DNA khuôn. Trong nhiều trường hợp vùng kết thúc phiên mã có cấu trúc đặc biệt và thường là vùng có cấu trúc lặp ngược hướng (palindrome) tạo nên cấu trúc thòng lọng hay cấu trúc uốn palindrome.

Ở vi khuẩn có một loại RNA-polymerase. Enzyme này xúc tác tổng hợp cả ba loại RNA: RNA thông tin, RNA ribosome và RNA vận chuyển. Thông tin di truyền thường kết chuỗi thành một đơn vị phiên mã (operon): một số gen cấu trúc (cistron) được phân bố liên tiếp sau một đoạn gen khởi đầu phiên mã (tổ hợp R và O) và phiên mã cùng nhau thành một RNA thông tin đa cistron gồm một số RNA thông tin phân cách nhau bởi một đoạn trật tự nêm không mã hóa Acid amin gồm khoảng vài chục nucleotide. Ở sinh vật nhân chuẩn có ba loại RNA-polymerase I, II và III, theo trình tự tổng hợp RNA ribosome (I), RNA thông tin (II), các RNA vận chuyển và các RNA ribosome có phân tử lượng nhỏ (III). Các RNA thông tin ở sinh vật nhân sơ được sử dụng trực tiếp ngay trong quá trình phiên mã để tổng hợp protein trên bề mặt cấu trúc màng (màng tế bào chất, rất có thể là vùng mesosome), nhưng ở sinh vật nhân chuẩn thì RNA thông tin được tổng hợp trong nhân phải trải qua quá trình thành thục hóa (processing) gồm methyl hóa đầu 5' và poly-A

208

hóa đầu 3'-OH và cắt xén hay tách ghép (splicing: vùng intron của gen cấu trúc bị cắt khỏi RNA thông tin chỉ còn lại phần exon) để trở thành RNA thông tin thành thục hay RNA thông tin dịch mã.

Sinh vật có cơ chế điều hòa quá trình phiên mã cũng như dịch mã, bảo đảm cho quá trình sử dụng thức ăn cũng như tổng hợp các hợp chất nguyên liệu đồng hóa một cách tiết kiệm. Ở vi khuẩn gen điều hòa I, chẳng hạn, tổng hợp protein điều hòa có mặt trong tế bào với liều lượng thấp có tác động bao vây vùng điều hành (O) gây ức chế sao mã các gen cấu trúc (điều hòa âm tính). Khi có mặt trong môi trường, yếu tố cảm ứng (như lactose đối với Lac operon) làm cho protein điều hòa thay đổi cấu trúc không gian, mất hoạt tính bao vây vùng O. Vùng O được giải tỏa cho phép RNA-polymerase nhận biết và xúc tác quá trình tổng hợp các RNA thông tin. Các gen cấu trúc trong tập hợp operon được phiên mã cùng nhau thành một RNA thông tin đa cistron, sau đó quá trình dịch mã thành các protein trên ribosome tiến hành theo từng đoạn ứng với các gen cấu trúc. Bên cạnh cơ chế điều hòa âm tính nêu trên, trong tế bào còn có cơ chế điều hòa dương tính. Khi đó chất giữ vai trò trọng yếu là adenosyl monophosphate vòng (cyclic AMP - cAMP) tác dụng gián tiếp qua protein đặc biệt có tên là CAP (catabolic gene activator protein) kết hợp với vị trí khởi động làm tăng ái lực của RNA-polymerase dẫn đến tăng cường quá trình phiên mã. Bên cạnh hai cơ chế cảm ứng đã nêu còn có cơ chế điều hòa khác: cơ chế kìm hãm. Cơ chất nguyên liệu được tổng hợp ra một cách dư thừa (ví dụ các Acid amin) tham gia vào tổ hợp kìm hãm vùng operator làm dừng quá trình phiên mã.

3. Dịch mã (translation)

Dịch mã là quá trình tổng hợp mạch polypeptide ở ribosome trên cơ sở khuôn RNA thông tin. Trình tự đọc bộ ba nucleotide (hay khung đọc bộ ba - triplet reading frame) quyết định trình tự các Acid amin trong mạch polypeptide. Tham gia vào quá trình dịch mã là một hệ thống phức tạp: RNA thông tin (mRNA), ribosome và các Acid amin đã được hoạt hóa bởi RNA vận chuyển (tRNA) thành dạng aminoacyl-tRNA dưới sự xúc tác của enzyme aminoacyl-tRNA-synthetase, một loạt các protein khác và đặc biệt là còn có sự tham gia của cấu trúc màng. Ở vi khuẩn cấu trúc màng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein là màng tế bào chất mà có thể là vùng mesosome. Trong khi đó cấu trúc màng có chức năng tương ứng ở sinh vật nhân chuẩn là mạng lưới nội chất (endoplasmic reticulum). Mạng lưới nội chất không có ribosome bám lên gọi là mạng lưới nội chất nhẵn còn mạng lưới nội chất có ribosome bám lên gọi là mạng lưới nội chất có hạt. Ribosome chỉ hoạt động khi bám lên cấu trúc màng. Nhờ vậy (và còn nhờ các chất tạo khuôn gọi là chaperon) các

209

protein được tổng hợp ra có được cấu trúc không gian xác định, phân bố trong cấu trúc màng theo hướng xác định (đầu NH3

+ hướng ra ngoài màng tế bào chất và hướng vào phía trong của màng mạng lưới nội chất) và, nhờ đó, có chức năng xác định.

Ribosome cấu tạo từ hai tiểu thể có hằng số lắng khác nhau: 30S và 50S ở vi khuẩn và trong ty thể hay lạp thể, còn trong nhiễm sắc thể tế bào nhân chuẩn ribosome lớn hơn và cấu tạo từ tiểu thể 40S và 60S. Các ribosome đều có hai vị trí gắn tRNA: vị trí A gắn aminoacyl-tRNA và vị trí P gắn peptidyl-tRNA. RNA vận chuyển (tRNA) chỉ gồm 70 - 90 nucleotide, chứa nhiều bazơ nitơ cải biến (dihydroutidine, pseudoutidine, thioutidine, inosine, ribothymidine,...), có dạng lá ba chẽ với cuống và ba thùy. Đầu 5' của cuống là vị trí gắn Acid amin, còn thùy giữa là đối mã (anticodon).

Quá trình dịch mã bao gtờ cũng bắt đầu từ một methionine. Ở vi khuẩn tRNA vận chuyển methionine đầu chuỗi cũng khác với tRNA vận chuyển methionine vào giữa chuỗi. Sau khi gắn với tRNA methionine đầu chuỗi thường phải formyl hóa (nhờ nhận gốc formyl từ Acid N10-tetrahydrofolic) thành formyl-methionine-tRNA. Vì vậy, RNA vận chuyển methionine vào đầu chuỗi và giữa chuỗi được ký hiệu lần lượt là RNAf

met và RNAmmet. Trước hết nhờ sự kích thích của protein IF-3,

mRNA liên kết với ribosome 30S. Tiếp đến tổ hợp fMet-RNAfmet

ở dạng phức hợp cao năng (fMet-RNAf

met-IF-2-GTP) được chuyển vào vị trí P trên hạt 30S ứng với codon mở đầu UAG của methionine. Tín hiệu UAG của methionine trên mRNA là của methionine mở đầu chỉ khi nó nằm gần trình tự Shine-Dalgarno (3 - 9 nucleotide chứa trình tự trung tâm GAG) ở trước đó. Nhờ tín hiệu này codon AUG mở đầu được chuyển chính xác vào vị trí mở đầu trên ribosome thay thế vị trí của IF-3 trên hạt 30S của ribosome. Sau đó hạt này liên kết tiếp với hạt 50S thành thể ribosome 70S. Đồng thời, IF-2 (trong tổ hợp hoạt hóa với IF-1) bị đẩy ra ngoài nhờ năng lượng thủy phân GTP. Kết quả là phức hợp mở đầu (70S-mRNA-fMet-RNAf

met) được hình thành.

Quá trình kéo dài cần các yếu tố kéo dài: EF-T và EF-G. Yếu tố EF-T gồm hai protein: Tu và Ts. Tu và GTP hoạt hóa tất cả các Acid amin tham gia kéo dài chuỗi polypeptide. Tổ hợp Acid amin hoạt hóa có dạng chung là aan-tRNA-Tu-GTP. Trước hết tổ hợp này gắn vào vị trí A với codon tương ứng, rồi ở đó GTP bị thủy phân bởi Tu và cùng bị đẩy ra ngoài. Tổ hợp Tu-GTP năng lượng cao được phục hồi nhờ yếu tố Ts. Liên kết peptide thứ nhất được tạo thành nhờ hoạt tính peptidyl-transferase của ribozyme 23S trong thành phần hạt ribosome 50S. Nhóm -COOH của fMet và -NH2 của Acid amin tiếp theo (aa2) tham gia phản ứng trùng ngưng giải phóng một phân tử nước, nhận điện tử (năng lượng) từ tổ hợp

210

tRNA-Tu-GTP. Để dịch mã được tiếp tục fMet-aa2-tRNA được dịch chuyển từ vị trí A sang vị trí P của ribosome, còn tRNAf

Met bị tách khỏi cả hai liên kết: liên kết với codon mRNA và liên kết với methionine mà trở nên tự do. Sự chuyển chỗ này cần yếu tố EF-G và GTP: EF-G thủy phân GTP cung cấp năng lượng cho sự chuyển chỗ đồng thời đẩy EF-G ra ngoài.

Ở sinh vật nhân chuẩn Acid amin mở đầu sự dịch mã cũng là methionine nhưng không cần formyl hóa.

Các chuỗi polypeptide được tổng hợp nhờ ribosome phải diễn ra trên cấu trúc màng. Ở vi khuẩn cơ cấu này chủ yếu là màng tế bào chất tạo thành nếp cuộn của mesosome, còn sinh vật nhân chuẩn đó chính là mạng lưới nội chất. Về thực chất hai cơ cấu màng này đều là sản phẩm của quá trình tổng hợp màng vốn diễn ra liên tục trong tế bào và cung cấp phần diện tích màng mới bao bọc thể tích của tế bào đang tăng trưởng. Màng được hình thành chủ yếu nhờ quá trình chuyển hóa lipid trung tính dự trữ thành lipid phân cực (chủ yếu là phospholipid) tạo nên cơ cấu màng đơn vị (hay màng điển hình) hai lớp có các đuôi Acid béo hướng vào nhau nhờ lực kị thủy. Màng đơn vị được bổ sung các phân tử protein đang được tổng hợp trên ribosome bám dính trên màng này mà trở thành cấu trúc màng sinh học đặc trưng: các phân tử protein khác nhau hoặc thẩm nhập suốt độ dày của màng, thẩm nhập chỉ phía trong hoặc phía ngoài của màng, hoặc nằm giữa hai lớp màng đơn vị phụ thuộc vào tính phân cực và lực kị thủy của toàn bộ hay một phần cấu trúc phân tử của chúng. Cơ cấu màng sinh học từ trạng thái mạng lưới nội chất chuyển dần ra ngoài rồi dung hợp với màng tế bào chất làm diện tích màng tế bào chất càng rộng. Mặt khác, các protein tiết xuất cũng được tổng hợp trên cơ cấu màng và nhờ quá trình dung hợp màng tiểu bào (thể Golgi phình rộng) với màng tế bào chất mà được tiết xuất ra ngoài tế bào. Chính nhờ những cơ cấu này mà cơ thể có những tính trạng đặc trưng. Ở vi khuẩn, quá trình hình thành màng bắt đầu từ mesosome và quá trình tổng hợp protein cũng diễn ra đồng thời. Các phân tử protein được tổng hợp trôi dạt dần trong cấu trúc linh động của màng. Ở các tế bào động vật hay thực vật bị cảm nhiễm virus, các quá trình tổng hợp protein virus và hình thành màng của tế bào cũng diễn ra đồng thời theo phương thức tương tự. Vì vậy, nếu phát triển virus luôn lộ xuất các kháng nguyên của mình trên bề mặt tế bào ký chủ trước khi giải phóng ra khỏi tế bào.

III. Sửa chữa DNA Tế bào có cơ cấu sao chép thông tin di truyền hoàn thiện nhờ cơ chế

sao chép bán bảo toàn và lắp ráp nucleotide tương bù vào khuôn mạch đơn. Tuy vậy, cơ chế này còn được bổ sung thêm cơ cấu sửa chữa DNA.

211

Có thể gặp ba cơ chế sửa chữa DNA là sửa chữa trực tiếp, sửa chữa cắt bazơ và sửa chữa ghép đôi sai.

Sửa chữa trực tiếp thường gặp khi trên DNA hình thành dimer thymine, là kết quả của sự chiếu xạ tử ngoại vào lứa cấy tế bào. Trong cơ thể có một loại enzyme gọi là photolyase đảm trách việc sửa sai này. Trong thành phần có FADH2 và 5,10-dimethyl tetrahydrofolate, photolyase được hoạt hóa bởi ánh sáng nhìn thấy. Khi đó nó có thể nhận biết cấu trúc dimer thymine, phân giải dimer rồi tách khỏi DNA.

Ví dụ khác về sửa chữa trực tiếp là sửa chữa phục hồi guanine đã bị methyl hóa trên nguyên tử O6. O6-methyl guanine (O6MG) hình thành khi tế bào phát triển trong môi trường có yếu tố ankyl hóa. Khi sao mã, O6MG có khuynh hướng ghép đôi với T hơn là với C, vì vậy gây đột biến GC thành AT. Enzyme DNA-methyl transferase xúc tác loại bỏ nhóm methyl khỏi O6MG làm phục hồi guanine bình thường trong chuỗi DNA. (Do nhóm methyl liên kết chặt với Acid amin cystine của trung tâm hoạt động của enzyme nên enzyme bị vô hoạt sau phản ứng sửa chữa DNA).

Sửa chữa trực tiếp còn nhờ các exonuclease là những enzyme cắt DNA từ hai đầu.

Sửa chữa cắt bazơ được thực hiện nhờ enzyme DNA-glycosylase. Enzyme này nhận biết những chỗ hư hỏng phổ biến trên DNA như adenine và cytosine khuyết thiếu amin hoặc guanine và adenine methyl hóa. Các enzyme này cắt bỏ nucleotide sai bằng cách cắt bỏ mối liên kết glycosyl giữa bazơ nitơ và nguyên tử C 1' của deoxyribose. Kết quả là tạo nên những điểm khuyết thiếu purine hoặc pyrimidine, ký hiệu là AP (apurinic/apyrimidineic site). Sau khi AP xuất hiện các enzyme AP-endonuclease cắt bỏ deoxyriboso-5'-phosphate sót lại, sau đó DNA-polymerase I tổng hợp DNA bổ sung và ligase hàn chỗ trống trong mạch.

Bên cạnh sửa chữa điểm nêu trên còn có quá trình sửa chữa ghép đôi sai. Hệ thống sửa chữa này ở E. coli, chẳng hạn, có ít nhất 9 protein. Sự phân biệt sợi dựa vào tác dụng của enzyme dam-methylase methyl hóa DNA ở các vị trí N6 của tất cả các adenine (*A) gặp trong trình tự 5'-GATC hay enzyme dcm-methylase methyl hóa cytosine (*C) nằm kề adenine hoặc kề thymine trong trình tự CCATGG hay CCTAGG, hay ở động vật bậc cao một số cytosine trong trình tự CG. Sau thời điểm sao chép chỉ sợi khuôn được methyl hóa còn sợi mới còn chưa methyl hóa. Nhờ đó tế bào phân biệt được sợi cũ và sợi mới. Trong sửa chữa DNA, các protein MutS, MutH và MutL đóng vai trò quan trọng. MutS liên kết các cặp bazơ ghép đôi sai, MutH liên kết với trình tự GATC, còn MutL kết hợp với cả hai protein đã kết hợp DNA nói trên thành một phức hợp làm cho phân tử DNA uốn cong trong khoảng độ dài 1000 bp phía đầu 5'

212

của trình tự GATC. Khi đó, nếu một trong hai mạch không được methyl hóa MutH sẽ tác dụng như một endonuclease phân giải sợi không được methyl hóa ở phía 5' của guanine thuộc GATC. Sợi không methyl hóa sẽ được tiếp tục bị cởi xoắn và bị phân giải theo hướng 3'→5' từ vị trí đánh dấu đến vị trí ghép sai rồi được thay thế bằng sợi DNA mới với sự xúc tác của hệ thống replisome gồm helicase II, protein SSB, exonuclease I, polymerase III và ligase.

IV. Cơ chế chống sự xâm nhập của gen lạ (hạn chế và cải biến) Tế bào có cơ chế tự sao chép và sửa sai bảo đảm cho vật chất di

truyền ổn định. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp tế bào chịu sự xâm nhập của gen lạ, như các phage xâm nhập vào tế bào vi khuẩn. Khi đó tế bào còn có cơ chế khác chống lại sự xâm nhập của DNA từ ngoài vào. Sự hạn chế (restriction) này là nhờ các tế bào ký chủ có hệ thống enzyme nhận biết và cắt các DNA lạ (gọi là các enzyme hạn chế - restriction enzyme) trong khi các DNA tế bào chủ không bị cắt là nhờ sự cải biến (modification). Hạn chế và cải biến phổ biến ở vi sinh vật và được nghiên cứu kỹ ở vi khuẩn. Một mặt chúng có tác dụng đánh dấu DNA tế bào, mặt khác phân hủy DNA lạ. Hệ thống gồm hai hoạt tính enzyme trên cùng một phân tử protein hay trên hai protein riêng rẽ: hoạt tính endonuclease và methyltransferase. Các endonuclease này nhận biết một trình tự đặc hiệu dài ngắn khác nhau tùy loại enzyme và phân cắt DNA này tại vị trí hoặc cách xa điểm nhận biết đó. Do DNA của mình được methyl hóa tại các điểm adenine (tại N-6) và cytosine (tại N-5 và N-4) bởi hoạt tính methyltransferase tác dụng phân cắt của hoạt tính endonuclease bị trở ngại.

Các endonuclease đều cắt DNA sợi đôi và có thể chia thành hai loại. Loại I nhận biết trình tự DNA đặc biệt và cắt DNA này ở xa vị trí nhận biết. Endonuclease của phage P1 thuộc loại này. Loại II nhận biết và phân cắt DNA trong trình tự nhận biết là một vùng có trình tự đối xứng quay kép (trình tự đối xứng đảo vị hay trình tự lặp ngược hướng - palindrome). Do phân cắt tại những điểm đặc hiệu tạo ra những mảnh DNA xác định nên enzyme hạn chế loại II được sử dụng trong kỹ thuật tái tổ hợp và tạo dòng gen. Bảng dưới đây giới thiệu một số enzyme hạn chế. Chú ý một số enzyme hạn chế (Eco RI, Hha I) cắt DNA hai sợi tạo ra đầu gồm một số nucleotide một sợi (đầu dính - cohesive), trong khi đó một số enzyme hạn chế khác (Ba II, Hae III) cắt DNA hai sợi tạo ra đầu bằng (đầu tầy).

213

Bảng 10.3: Một số enzyme hạn chế, dạng vết cắt và nguồn gốc của chúng

Enzyme Trình tự điểm nhận biết Nguồn gốc Eco RI 5'-G↓AA*TTC Escherichia coli RY 13 Hha I 5'-GC*G↓C Haemophilus haemolyticus Ba II 5'-TGG↓C*CA Brevibacterium albidum Hae III 5'-GG*↓CC Haemophilus aegypticus Bam HI 5'-G↓GATCC Bacilus amyloliquefaciens H Hind III 5'-A↓AGCTT Hemophilus influenzae Rd Kpn I 5'-GGTAC↓C Klebsiella pneumoniae Mbo I 5'-↓GATC Moraxella bovis

Hình 10.3 : Hai dạng đầu cắt của enzyme hạn chế loại II:

a) cắt hình thành đầu tầy và b) cắt hình thành đầu dính.

V. Biến dị

1. Biến dị kiểu hình

Biến dị kiểu hình còn gọi là thường biến, là hiện tượng có sự khác biệt về cấu trúc cũng như đặc điểm phát triển giữa thế hệ con cái so với thế hệ bố mẹ cũng như giữa chúng với nhau dưới tác động của môi trường và không liên quan đến sự thay đổi vật chất di truyền. Đây là những biến dị tạm thời, thuận nghịch và không ổn định của toàn bộ quần thể sinh vật. Những biến dị này xuất hiện chậm và mất đi khi các yếu tố làm xuất hiện chúng mất đi.

Bản chất của biến dị kiểu hình là hiện tượng trội - lặn của gen sẵn có trong tế bào dưới tác động cảm ứng của môi trường. Khi môi trường mất đi yếu tố cảm ứng thì tính trạng đã từng hình thành cũng trở nên không biểu hiện nữa (gen trở nên lặn).

Biến dị kiểu hình, như vậy, có những tính chất sau: tính tạm thời (không ổn định), tính thuận nghịch và tính toàn bộ.

Ở vi khuẩn, biến dị kiểu hình có thể biểu hiện dưới một số hình thức. Biến dị hình thái trong quá trình sinh sản thường xảy ra biến dị về kích thước của tế bào. Tế bào vi khuẩn E. coli nuôi cấy được 5 - 6 giờ trong môi trường và điều kiện thích hợp sẽ dài ra trước khi phân bào. Trái

214

lại chúng sẽ trở nên nhỏ hơn khi vào trong giai đoạn phát triển tối đa, và có kích thước tối thiểu khi mất khả năng sinh sản. Hoặc biến dị hình thái dưới ảnh hưởng của ngoại cảnh như cấu trúc hóa học của môi trường làm cho vi khuẩn có những hình thái khác nhau, vi khuẩn trở nên mập hơn nếu được nuôi cấy trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, trái lại hình thành những dạng tế bào mảnh hoặc dạng cầu bất thường khi nuôi cấy trong môi trường nghèo chất dinh dưỡng. Sức căng bề mặt của môi trường cũng như độ Acid (pH) môi trường tăng làm hình thành những vi khuẩn mập hơn, ngắn hơn. Ở nhiệt độ 37 °C Brucella, chẳng hạn, có dạng rất ngắn, hình thoi hoặc dạng cầu khuẩn nhỏ trong khi nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn tế bào thường dài, mảnh. Những chất ức chế ở nồng độ thấp có khả năng biến đổi hình thái của vi khuẩn. Tương tự, nhiều nấm gây bệnh thường biểu hiện hai dạng hình thái khác nhau, thường gọi là nấm nhị hình. Chúng có dạng hình cầu (dạng nấm men) khi ở trong nội quan động vật mắc bệnh nhưng có dạng sợi khi nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy nhân tạo hay ở môi trường ngoài, ví dụ, Aspergillus fumigatus, Coccidoides immitis, Histoplasma farsimosa,...

Biến đổi hình thái do thường biến còn biểu hiện ở dạng khuẩn lạc. Những vi khuẩn cùng loài khi phát triển trên môi trường đặc có thể hình thành khuẩn lạc láng (dạng S) hoặc nhám (dạng R) hoặc những dạng trung gian.

Biến dị kiểu hình còn thể hiện ở hiện tượng dung nạp thuốc và khả năng hình thành enzyme để sử dụng các yếu tố môi trường. Tiếp xúc lâu ngày với nồng độ thấp chất kháng sinh có thể dẫn đến việc hình thành những chủng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh do gen lặn được cảm ứng trở nên trội (mặc dù trong đa số trường hợp sự xuất hiện tính đề kháng với thuốc kháng sinh là do đột biến hoặc vận chuyển và tái tổ hợp thông tin di truyền). Trong trường hợp thường biến kháng thuốc các gen tổng hợp yếu tố đề kháng (thường là enzyme phân giải thuốc kháng sinh hoặc các hợp chất làm thay đổi các lỗ khổng trên màng tế bào chất) từ trạng thái bị ức chế được cảm ứng mà chuyển thành dạng hoạt động tức trở thành khuôn tổng hợp các protein tương ứng.

2. Biến dị kiểu gen

Khái niệm biến dị kiểu gen ở sinh vật đa bào thường được coi là đồng nhất với khái niệm đột biến (mutation). Tuy vậy, ở vi sinh vật, thường là đơn bào, thì khái niệm biến dị kiểu gen phải được hiểu rộng hơn và như là sự hình thành các biến chủng có thể là kết quả của đột biến (biến đổi cấu trúc genome sẵn có) hoặc của quá trình tiếp nhận vật chất di truyền từ bên ngoài (thường tiếp theo sau là quá trình tái tổ hợp thông tin di truyền vào genome nhiễm sắc thể).

215

2.1. Đột biến

Đột biến là sự hình thành các cá thể có những chi tiết (cấu trúc, phát triển) khác biệt so với thế hệ cha mẹ liên quan đến sự biến đổi vật chất di truyền. Biến dị này là những biến đổi đột ngột, xuất hiện một cách ngẫu nhiên, không dự tính trước được và không liên tục ở một số cá thể hiếm hoi (tần suất xuất hiện ở vi khuẩn: 10-8 - 10-6) của một quần thể vi sinh vật. Chúng tương đối độc lập với môi trường chung quanh, có tính cố định, tính bền vững và tính di truyền.

Tính gián đoạn của đột biến là sự thay đổi xảy ra một cách hoàn chỉnh trong một thời hạn, thường là một lần phân bào.

Tính hiếm của đột biến là hiện tượng tất cả các đột biến đều xảy ra với tần suất hết sức thấp và xảy ra không đều. Trong những điều kiện nhất định xác suất xuất hiện đột biến nào đó được biểu diễn như là tỷ số tế bào hình thành đột biến trong tập đoàn vi khuẩn giữa hai lần phân chia tế bào. Tần suất này ở vi khuẩn khoảng 10-7 (10-8- 10-5).

Tính vững bền của đột biến là sự xuất hiện một biến chủng nếu tồn tại được trong điều kiện ngoại cảnh xác định thì tính trạng mới được duy trì và truyền sang thế hệ tiếp theo. Mặc dù vậy, trong nhiều trường hợp có thể xuất hiện những đột biến biến đảo (conversion). Biến đảo không nhất thiết có cùng tần suất xuất hiện của đột biến ban đầu nhưng chúng cũng hiếm, gián đoạn và di truyền.

Tính ngẫu nhiên của đột biến có nghĩa là sự hình thành biến chủng đột biến trước khi có những yếu tố chọn lọc tác động đến, mặc dù cũng có những đột biến do cảm ứng với các yếu tố chọn lọc. Trong nghiên cứu vi khuẩn, để kiểm tra sự hình thành một biến chủng nào đó người ta phải sử dụng yếu tố chọn lọc để tuyển chọn những dòng vi khuẩn có thuộc tính khác biệt nhờ kìm hãm những vi khuẩn không có thuộc tính đề kháng chất chọn lọc. Thí nghiệm của Lederberg (1952) với một chủng E. coli pha loãng phân nhỏ ra ống nghiệm và pha loãng mà không phân nhỏ (vẫn để trong bình lớn) để nuôi cấy chuẩn bị trước khi cấy lên đĩa thạch môi trường có chất cảm ứng chọn lọc (streptomycin) chứng minh rằng đột biến xảy ra ngay cả khi không tiếp xúc với yếu tố chọn lọc (chất kháng sinh).

Tính đặc hiệu của đột biến còn hiểu là tính độc lập của đột biến. Một tính trạng mới xuất hiện thường không ảnh hưởng đến sự hình thành tính trạng đột biến khác. Tần suất xuất hiện một đột biến kép (ví dụ, đột biến đề kháng cả penicillin và streptomycin) là tích số các tần suất tương ứng. Ví dụ, tần suất xuất hiện biến chủng đề kháng một chất kháng sinh là 10-7 và tần suất xuất hiện biến chủng đề kháng chất kháng sinh khác là 10-

216

8 thì tần suất xuất hiện một biến chủng đề kháng cả hai thuốc trên là 10-15. Như vậy, phối hợp hai thuốc trên có thể làm giảm khả năng chọn lọc những biến chủng kháng thuốc hơn là sử dụng các thuốc kháng sinh riêng rẽ.

Nguyên nhân đột biến có thể là do các yếu tố hóa học và vật lý ion hóa hoặc gắn kết hóa trị với cầu nối giữa hai chuỗi monomer của DNA xoắn kép (tia tử ngoại tạo dimer thymine, actinomycin D, ethidium bromide, bromouracine, 2-aminopurine, ethyl- hoặc methyl- metasulfonate, dimethyl- hoặc diethylmetasulfonate, N-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine, ethyleneimine, acid nitrơ,...). Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp khó có thể phát hiện và kiểm soát được các nguyên nhân gây nên nhiều đột biến. Người ta gọi chúng là đột biến do ngẫu nhiên.

Bản chất của đột biến: Bộ nucleotide của DNA thuộc một gen là một mật mã thông tin, nó tương ứng với cấu trúc một protein đặc hiệu. Mọi thay đổi của bộ này dẫn đến sự thay đổi cấu trúc và chức năng của protein đó, hình thành một tính trạng đột biến. Đột biến là những thay đổi ở tầm phân tử.

Mọi đột biến dù là ngẫu nhiên hay do cảm ứng thì sự thay đổi của bộ nucleotide có thể xảy ra hai kiểu: thêm, bớt hoặc thay thế một đôi bazơ bằng một đôi bazơ khác (đột biến điểm) hoặc thêm, bớt hoặc thay thế một đoạn DNA bằng một đoạn DNA khác (đột biến đoạn). Mặc dù đột biến đoạn thường khá gặp, như hiện tượng khuyếch đại gen, nhưng do tính phổ biến của đột biến điểm nên người ta thường đồng nhất khái niệm đột biến điểm với đột biến. Đột biến này thường không biến đảo. Đột biến điểm tuy nhỏ nhưng thường góp phần quan trọng trong quá trình tiến hóa. Khi một bazơ bị mất hoặc được chèn thêm vào trình tự của gen cấu trúc sẽ xuất hiện sự thay đổi mạnh mẽ trong cấu trúc protein do thay đổi toàn bộ trình tự Acid amin trong thành phần chuỗi polypeptide kể từ vị trí thêm điểm hay mất điểm (đọc theo hướng 5'→3' của RNA thông tin). Biến đổi này được gọi là sự chuyển dịch khung (frame shift). Trong đa số trường hợp, đặc biệt đột biến điểm ở vị trí đầu 5' của sợi dương của gen cấu trúc, cũng là đầu 5' của RNA thông tin, những biến chủng này thường mất khả năng sống nếu biến dị xảy ra trên gen thiết yếu (house-keeping genes) của sinh vật do cấu trúc (hóa học cũng như không gian) protein thay đổi dẫn đến mất chức năng vốn có (cấu trúc, enzyme, kích thích, thụ thể,...) của nó. Đột biến thế điểm (GC→AT và ngược lại) ngược lại là đột biến thường gặp nhưng ít biểu hiện ra bên ngoài và thường khó phát hiện. Khi DNA gen được phiên thành RNA thông tin, điểm đột biến thế điểm không làm thay đổi khung đọc của phần lớn chiều dài của chuỗi RNA thông tin. Vì vậy thành phần của chuỗi polypeptide chỉ thay đổi tại một vị trí tương ứng với điểm đột biến trên gen. Khi đó, nếu Acid amin mới đó khác nhiều

217

so với Acid amin nguyên thủy về thuộc tính phân cực, tính ái thủy và tính phản ứng thì tính chất nguyên thủy của protein bị thay đổi dẫn đến chức năng cũ của protein bị mất. Hiện tượng này biểu hiện trầm trọng nếu acid amin thay thế nằm ở trung tâm hoạt động của một enzyme thiết yếu, kết quả có thể là biến chủng không thể tồn tại. Trong trường hợp Acid amin thay thế không có sự khác biệt nhiều so với acid amin nguyên thủy hoặc đột biến tạo mật mã thoái hóa (nhiều mã bộ ba nucleotide cho một acid amin) thì đột biến không biểu hiện tính trạng và tích lũy lặn trong quần thể. Đây thường là nguyên nhân của sự hình thành loài mới trong quá trình tiến hóa.

Chủng loại đột biến thường gặp khá phong phú. Có thể gặp đột biến hình thái như đột biến dạng khuẩn lạc, thay đổi khả năng sinh sắc tố hoặc khả năng hình thành nha bào. Đặc biệt có thể gặp các đột biến khuyết dưỡng hay tự dưỡng (auxotrophic mutants): các chủng đột biến này mất khả năng phát dục nếu trong môi trường thiếu một yếu tố nào đó. Ngược lại, một số đột biến dẫn đến việc tăng khả năng tổng hợp các yếu tố sinh trưởng hay các hợp chất khác như Acid amin,... (đồng nghĩa với việc mất khả năng điều tiết sản xuất thừa). Các đột biến khác cũng thường gặp ở vi khuẩn là đột biến thay đổi khả năng lên men, khả năng sử dụng các đường, đột biến gây vững bền đối với các nhân tố ức chế dẫn đến thay đổi độc lực, thay đổi tính kháng nguyên hoặc sự mẫn cảm đối với kháng sinh hoặc tia tử ngoại, v.v...

2.2. Sự vận chuyển và tái tổ hợp thông tin di truyền

Có ba cơ chế vận chuyển di truyền khác nhau ở vi khuẩn: Biến nạp (còn gọi là chuyển thể - transformation), tải nạp (transduction, còn gọi là chuyển nạp) và tiếp hợp (conjugation, còn gọi là tiếp nạp hay giao phối). Những cơ chế đều có đặc điểm là vận chuyển di truyền theo một chiều từ tế bào này sang tế bào khác mà không có chiều ngược lại, và tế bào cho (donor) chỉ vận chuyển một phần di truyền, trừ một vài ngoại lệ ít gặp trong những trường hợp vận chuyển nhiễm sắc thể do sự tiếp hợp.

Mỗi cơ chế vận chuyển này đều có đặc tính riêng quyết định sự truyền những yếu tố di truyền từ tế bào cho sang tế bào nhận. Trong quá trình biến nạp chất liệu di truyền là những mảnh DNA tự do. Hiện tượng chuyển nạp là do các phage đưa mảnh nhiễm sắc thể từ một tế bào phage đã ký sinh và dung giải trước đây cho một tế bào khác. Khác với sự vận chuyển di truyền trong biến nạp và tải nạp, hiện tượng giao phối là sự phối hợp giữa hai vi khuẩn có giới tính khác nhau, hay là sự vận chuyển từ vi khuẩn đực sang vi khuẩn cái.

2.2.1. Biến nạp (Transformation)

218

Biến nạp (hay chuyển thể) là sự vận chuyển thông tin di truyền nhờ sự xâm nhập của các phân tử DNA tự do (có nguồn gốc từ tế bào cho đã phân giải) vào tế bào nhận làm cho genome của tế bào nhận thay đổi. Kết quả của biến nạp phụ thuộc vào mức độ tương đồng trong cấu trúc phân tử DNA của tế bào cho và tế bào nhận. Vì vậy sự biến nạp thường có kết quả hơn trong giới hạn một loài có các cá thể có những tính trạng khác nhau.

Điều kiện biến nạp: Quá trình biến nạp chỉ xảy ra trong khi các vi khuẩn nhận ở một tình trạng sinh lý đặc biệt (ở khoảng 1 - 15% tế bào ở quần thể, thông thường ở giai đoạn phát triển giảm). Tình trạng này đã làm thay đổi các tính chất bề mặt tế bào nhận có các yếu tố cảm ứng enzyme đặc biệt trên đó các đoạn phân tử DNA có thể xâm nhập được. Trên bề mặt tế bào nhận có các yếu tố cảm ứng để cho đoạn DNA có thể cố định. Có chừng 30 - 70 vùng cảm ứng như thế. Đoạn DNA đã nhập vào tế bào được tách đôi, và một mạch đơn được ghép vào nhiễm sắc thể của tế bào nhận. Quá trình này được gọi là sự tái tổ hợp (recombination). Tần suất tái tổ hợp phụ thuộc vào đặc tính các đoạn nhiễm sắc thể khác nhau, vào sự tương đồng các phân tử DNA. Biến nạp tự nhiên thường diễn ra ở họ Enterobacteriaceae. Trong điều kiện thí nghiệm tần suất biến nạp tăng cao nhờ tế bào được xử lý làm thay đổi màng tế bào chất (như xử lý polyethylene glycol) và gây sốc nhiệt (chuyển tế bào từ nhiệt độ 0°C sang nhiệt độ 40 - 50°C trong vòng 50 - 60 giây).

Griffith là người đầu tiên đã phát hiện sự biến nạp ở phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae, tên cũ là Diplococcus pneumoniae hay pneumococcus) vào năm 1928. Vi khuẩn này có hai dạng khác nhau. Dạng gây bệnh cho động vật hình thành khuẩn lạc láng ký hiệu là S. Dạng không gây bệnh hình thành khuẩn lạc nhám ký hiệu R. Nếu tiêm vi khuẩn sống chủng S thì làm chuột nhắt chết, tiêm S chết do qua xử lý nhiệt (hơ nóng) thì chuột vẫn sống, còn tiêm vi khuẩn chủng R sống cho chuột thì chuột vẫn sống, nhưng tiêm R sống đồng thời với tiêm S chết lại làm chuột chết và sau đó trong máu chuột chết phân lập được chủng S đặc trưng. Các thí nghiệm sau đó (Avery, MacLeod và McCarty, 1944) cho thấy nếu xử lý dịch S chết được tinh chế vẫn có năng lực biến nạp in vitro và nếu xử lý bằng DNase thì làm mất hoạt tính biến nạp của dịch này trong khi xử lý bằng protease vẫn giữ nguyên tính biến nạp. Điều đó chứng minh rằng DNA, chứ không phải protein, là vật chất mang thông tin di truyền.

Cho đến nay, những tính trạng được biến nạp được biết là khả năng tổng hợp yếu tố sinh trưởng, khả năng sử dụng đường để sinh trưởng, khả năng kháng thuốc, khả năng sinh độc tính,... Hiện tượng này được vận dụng rộng rãi trong kỹ thuật di truyền.

219

2.2.2. Sự tải nạp (chuyển nạp - transduction)

Tải nạp là sự vận chuyển vật chất di truyền nhờ phage (bacteriophage hay thực khuẩn thể) là các virus ký sinh vi khuẩn. Có hai loại phage. Các phage độc làm tan vi khuẩn ký chủ đặc hiệu trong khi các phage ôn hòa không làm tan vi khuẩn. Tuy vậy, các phage ôn hòa có hai giai đoạn thay thế nhau trong chu trình phát triển, chúng có thể trở thành phage độc khi môi trường có tác nhân (hóa, lý) gây đột biến.

Khi phage hấp bám lên màng tế bào vi khuẩn đặc hiệu bằng thụ thể ở lông đuôi, ATP-ase ống đuôi của phage được hoạt hóa phân giải ATP giải phóng năng lượng làm co rút vỏ đuôi, kết quả là ống đuôi chọc thủng màng tế bào chất vi khuẩn và làm DNA phage theo ống đuôi này xâm nhập vào tế bào chất vi khuẩn. Sau khi xâm nhập DNA, phage độc tồn tại độc lập trong tế bào chất, điều khiển quá trình tổng hợp protein phage, DNA phage và làm phân hủy DNA của vi khuẩn. Trong quá trình lắp ráp vỏ protein phage thường bao bọc DNA phage nhưng trong nhiều trường hợp vỏ protein phage lại chứa mảnh DNA vi khuẩn (và tạo thành phage khuyết tổn hay phage thui: abortive phage). Khi giải phóng ra ngoài cùng các phage khác do dung giải tế bào, phage khuyết tổn này lại tiếp tục hấp bám lên tế bào mới và đưa đoạn DNA của tế bào cũ vào tế bào mới.

Ở một số phage được gọi là phage ôn hòa, sau khi xâm nhập vào tế bào chất vi khuẩn, DNA ấn nhập vào cấu trúc phân tử DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn ở dạng tiền phage (prophage). Ở trạng thái episome này bộ gen của phage ôn hòa được truyền cho các thế hệ sau của vi khuẩn tương tự các gen khác của nhiễm sắc thể. Các vi khuẩn mang prophage được gọi là vi khuẩn dung nguyên (lysogenic bacteria) do những vi khuẩn này mang mầm mống của quá trình dung khuẩn sau này, khi chuyển sang trạng thái độc. Vi khuẩn dung nguyên tiếp tục sinh trưởng bình thường, tuy nhiên khi gặp điều kiện môi trường có các yếu tố gây đột biến thì phage chuyển sang trạng thái độc làm vi khuẩn dung giải. Khi đó prophage tự sao chép thành những phiên bản ở trạng thái độc lập trong tế bào chất và bắt đầu chu trình dung giải vi khuẩn. Trong quá trình sao chép đó các phage mới hình thành có thể mang theo DNA của phage và đoạn DNA (nằm kề bên) của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Khi xâm nhập vào tế bào mới, các phage mang gen nhiễm sắc thể thực hiện chức năng vật mang chất di truyền từ tế bào cho (ký chủ trước) sang tế bào nhận (ký chủ sau). Sự tải nạp phổ biến rộng rãi và được nghiên cứu kỹ ở vi khuẩn họ Enterobacteriaceae. Ở E. coli đó là các phage T và P-1, ở Shigella P-1, ở Salmonella typhimurum P-22. Các phage tải nạp ở Staphylococcus, Pseudomonas và Proteus cũng biết đến. Quá trình tải nạp có thể vận chuyển một hoặc một số gen bất kỳ như nêu trên được gọi là tải nạp

220

chung hay tải nạp không đặc hiệu (như tải nạp do phage P-1 và P-22 ở E. coli, Shigella và Salmonella.

Nhiều phage chỉ có thể tái tổ hợp vào một vị trí (locus) nhất định trong genome ký chủ. Chính vì vậy chúng chỉ có thể vận chuyển những gen phân bố gần locus này mà thôi. Hiện tượng này gọi là tải nạp đặc hiệu. Phage lambda (λ) ở E. coli, ví dụ, chỉ vận chuyển những gen nằm kề locus galactosidase (Gal) là vị trí phage này tái tổ hợp vào genome ký chủ. Tương tự, phage Φ-80 cũng ở E. coli có thể tái tổ hợp vào gần locus điều khiển tổng hợp tryptophan và sau đó tải nạp yếu tố này một cách đặc hiệu.

Khi nghiên cứu sự tải nạp ở Salmonella người ta còn phát hiện được sự tải nạp khuyết (abortive transduction). Chẳng hạn, trường hợp một đoạn nhiễm sắc thể điều khiển tổng hợp các purine được phage tải nạp sang tế bào nhận không tái tổ hợp với nhiễm sắc thể mà tồn tại tự do trong tế bào chất ở dạng gen ngoài (extragene) và không tự sao chép. Khi đó vi khuẩn trở nên có khả năng phát triển trên môi trường không có hợp chất này và thể hiện kiểu hình là các khuẩn lạc nhỏ mọc trên môi trường tổng hợp không chứa purine. Lý do của quá trình này là gen tổng hợp purine không sao chép được trong mỗi lần vi khuẩn phân bào nên chỉ một tế bào vi khuẩn duy nhất mang tính trạng tổng hợp purine trong quần thể (để phát triển và có thể hỗ trợ tế bào bên cạnh). Một số phage ôn hòa khi làm dung nguyên hóa vi khuẩn có khả năng làm thay đổi các kháng nguyên vi khuẩn nhận. Khi tải nạp, một đoạn nhiễm sắc thể điều khiển tổng hợp kháng nguyên thân được truyền theo điều khiển tổng hợp kháng nguyên thân ở tế bào nhận, sau khi được ấn nhập vào tế bào nhận (vốn không có kháng nguyên này). Hiện tượng tải nạp đoạn gen điều khiển độc tố được phát hiện ở Corynebacterium diphtheriae. Ở loài vi khuẩn này chỉ có những tế bào dung nguyên có khả năng tổng hợp ngoại độc tố biểu hiện độc tính: gây sốt và các hiện tượng bệnh lý khác ở người (bệnh bạch hầu).

Nói chung, ở vi khuẩn chuyển nạp đóng vai trò trong lan truyền độc tính, lan truyền kháng nguyên thân (gây phản ứng chéo miễn dịch) và nâng cao khả năng tổng hợp các chất yếu tố sinh trưởng.

2.2.3. Tiếp hợp (hay tải nạp, giao phối - conjugation)

Tiếp hợp là quá trình vận chuyển thông tin di truyền bằng cách tiếp xúc trực tiếp các tế bào cho và nhận nguyên vẹn về mặt sinh lý. Quá trình truyền vật chất di truyền chỉ diễn ra một chiều từ tế bào đực (F+) sang tế bào cái (F-). Điều này được Lederberg và Tatum chứng minh lần đầu tiên vào năm 1964 trên các biến chủng E. coli K-12. Khả năng cho của tế bào đực quyết định bởi sự có mặt của yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể là

221

F (fertility factor, sex-factor, yếu tố giới tính). Các thuật ngữ "tế bào đực" và "tế bào cái" được dùng theo hệ thống định danh hiện đại từ năm 1976.

Trên bề mặt của tế bào F+ có các nhung mao đặc biệt - pili giới tính, có thể hấp thụ các phage đặc biệt. Số lượng pili giới tính rất ít (khoảng 2 - 3). Đường kính trong khoảng 25Åcó thể cho phép sợi DNA của tế bào đi qua khi nó tiếp xúc với tế bào nhận.

Yếu tố ngoài nhiễm sắc thể điều khiển quá trình tiếp hợp gọi là các plasmid tiếp hợp (conjugative plasmid). Những plasmid này có thể điều khiển sự vận chuyển DNA của chính nó hoặc định hướng vận chuyển nhiễm sắc thể khi nó nằm ở trạng thái liên kết với nhiễm sắc thể đó.

Ngoài yếu tố giới tính F còn có các plasmid tiếp hợp khác như plasmid điều khiển sự đề kháng của vi khuẩn đối với một số thuốc (plasmid R). Plasmid điều khiển tổng hợp colicin (col j, col v2, colv 3), plasmid điều khiển tổng hợp enterotoxin ở E. coli, plasmid Hly điều khiển sự tổng hợp hemolysin, hemotoxin, có plasmid độc tố vir, cũng như plasmid điều khiển tổng hợp kháng nguyên K-88 (tức F4), K-99 (tức F5) và một vài plasmid khác.

Quá trình tiếp hợp của plasmid F tái tổ hợp trong DNA mạch vòng của nhiễm sắc thể bắt đầu từ khi hai tế bào đực và cái tiếp xúc nhau. Khi đó, một mạch của đoạn nhiễm sắc thể ở kề bên yếu tố F bị cắt và duỗi ra mà trở nên có cấu trúc thẳng. Đầu nhiễm sắc thể tự do này tách ra và tự sao thành hai sợi, hướng về phía pili giới tính và được chuyển theo pili này sang tế bào F-. Bởi vì plasmid F nằm ở cuối chuỗi thẳng nhiễm sắc thể nên nó không được truyền qua tế bào F- vì trong quá trình tiếp hợp ngắn ngủi DNA nhiễm sắc thể thường bị đứt đoạn, và nhờ đó chỉ một phần nhiễm sắc thể của tế bào F+ được chuyển sang tế bào F-. Những chủng có tần suất biến nạp gen nhiễm sắc thể cao được gọi là chủng Hfr (chủng có tần suất biến nạp cao). Trong trường hợp pili giới tính tự do trong tế bào chất, hai hiện tượng có thể gặp là biến nạp một phần genome plasmid F hoặc biến nạp toàn bộ genome plasmid. Trong trường hợp đầu chỉ một số gen của plasmid F được chuyển sang và có thể tái tổ hợp vào nhiễm sắc thể tế bào nhận. Trong trường sau, tế bào nhận trở thành tế bào F+. Hiện tượng này được gọi là sự hùng hóa ("đực hóa") tế bào cái.

2.3. Tương tác các virus

Tương tác các virus là hiện tượng thường gặp và góp phần thay đổi tính trạng cũng như khả năng phát triển của virus khi trong một tế bào đồng thời cảm nhiễm một số virus. Hiện tượng này có thể liên quan đến kiểu gen nhưng trong nhiều trường hợp ở các virus chỉ xảy ra liên quan đến kiểu hình. Tương tác kiểu gen có thể là: 1) tái tổ hợp, hoạt hóa đồng

222

loạt, dị hợp hóa, chuyển vỏ và tái hoạt hóa chéo. Tương tác kiểu hình có thể là pha trộn kiểu hình, tái hoạt hóa phi kiểu gen, tương bổ, kích thích và cản nhiễm (hay can thiệp cảm nhiễm).

Tái tổ hợp là sự trao đổi vật chất di truyền giữa các thể virus khác biệt nhau về một số tính trạng cùng phát triển trong một tế bào. Kết quả là hình thành những thể lai mang một phần tính trạng của chủng gốc này và một phần tính trạng của chủng gốc khác. Ở virus động vật xương sống hiện tượng tái tổ hợp chỉ diễn ra khi các chủng virus gần gũi cùng cảm nhiễm một tế bào và tần suất xuất hiện phụ thuộc vào chủng loại hệ thống tế bào ký chủ. Tái tổ hợp là đặc tính chung của mọi virus nhưng việc phát hiện được thể lai là khó khăn và phụ thuộc vào nhiều điều kiện. Tần suất lai cao diễn ra ở một số virus RNA (orthomyxovirus, reovirus, oncornavirus) và ở tất cả các virus DNA hai sợi. Tái tổ hợp có thể truyền hàng loạt tính trạng: hoạt tính ngưng kết hồng cầu, tính đề kháng nhiệt và chất ức chế, độc tính đối với động vật, hoạt tính sinh sản trong phôi gà, hoạt tính enzyme và miễn dịch. Có thể xảy ra, chẳng hạn quá trình tái tổ hợp giữa các virus động vật và người trong thí nghiệm in vitro cũng như in vivo, điều này giải thích sự xuất hiện dịch cúm ở người cũng như khả năng người mắc bệnh cúm động vật do cúm động vật có thể tiếp nhận một số tính trạng (như mang thụ thể đối với tế bào người) bảo đảm tiếp tục xâm nhập và phát triển trong tế bào người. Bản chất của quá trình tái tổ hợp gen virus có thể là sự trao đổi từng đoạn và trao đổi trong đoạn kết quả là thể lai mang thông tin di truyền của cả hai chủng gốc.

Hoạt hóa đồng loạt là quá trình thường diễn ra trong một tế bào cảm nhiễm đồng thời nhiều thể virus đã bị vô hoạt bởi bức xạ tử ngoại. Do tử ngoại chỉ gây đột biến một số phần của genome virus nên, trong một tế bào, các phần gen còn nguyên vẹn của các genome có thể trao đổi (tái tổ hợp) dẫn đến hình thành thể có đầy đủ những gen nguyên vẹn.

Dị hợp hóa là hiện tượng khi một số thể virus có tính trạng khác nhau tái sản đồng thời trong một tế bào có thể hình thành những virion mang toàn bộ genome của một virus và một phần hoặc toàn bộ genome của virus thứ hai. Mặc dù sự kết hợp genome trên không di truyền nhưng nó cho phép các virus sản sinh thế hệ mới, trong đó một số virion mang tính trạng của một virus khởi nguyên loại này còn một số khác mang tính trạng của virus khởi nguyên loại khác. Những virus trên được gọi là dị hợp thể và khác với các virus đồng thể ở chỗ các virion thế hệ con không đồng nhất. Hiện tượng dị hợp hóa có thể quan sát trong các thí nghiệm với virus cúm và virus bệnh Newcastle. Thí nghiệm cũng đã chỉ ra rằng có thể đun nóng làm biến tính DNA virus làm mạch đôi chuyển thành mạch đơn và khi để nguội thì mạch đôi lại tự phục hồi. Nếu trong dung

223

dịch tồn tại hai loại virus thì có thể hình thành những thể dị hợp mang genome hỗn hợp của hai virus khởi đầu.

Chuyển vỏ (transcapsidation) là hiện tượng genome của một virus được ấn nhập vào vỏ của virus khác có khả năng bảo tồn ở trạng thái ổn định trong tế bào mẫn cảm với virus khởi nguồn. Hiện tượng này có thể gặp khi nuôi cấy vào tế bào đồng thời adenovirus và virus SV-40 của khỉ.

Hoạt hóa chéo là hiện tượng genome tương tự tái tổ hợp nhưng một trong hai virus tham gia ở dạng nguyên vẹn còn virus kia đã bị vô hoạt do hư tổn một phần genome (đun nóng hoặc chiếu tử ngoại). Trong trường hợp này phần genome của virus bị vô hoạt có thể tham gia tái tổ hợp với genome virus bình thường. Kết quả là hình thành những virion có tính trạng hỗn hợp của hai virus khởi nguyên. Dạng tái tổ hợp thường dễ hình thành hơn trong trường hợp hoạt hóa chéo so với việc kết hợp hai virus nguyên vẹn. Hoạt hóa chéo thường diễn ra trong tế bào nếu tiêm virus vô hoạt (bằng nhiệt hoặc tia tử ngoại) vào hệ thống mẫn cảm khoảng 24 - 48 giờ trước khi tiêm virus có hoạt tính. Có đến 70% genome virus cúm gia cầm vô hoạt A1 được hoạt hóa nhờ virus cúm A2. Virus đậu thỏ cũng đã được chứng minh có hoạt hóa chéo.

Pha trộn kiểu hình là hiện tượng hai virus khác nhau khi tái sản đồng thời trong một tế bào làm xuất hiện những virion mang genome của chỉ một virus khởi nguyên nhưng lại mang kháng nguyên của cả hai virus khởi nguyên đó. Trong trường hợp này không diễn ra quá trình tương tác kiểu gen mà các virion chỉ thừa hưởng chung các protein cấu trúc đã được tổng hợp đồng thời trong một tế bào. Hiện tượng pha trộn kiểu hình thường gặp ở phage T2 và T4 và cũng như ở một số virus người và động vật (như virus cúm, virus bệnh Newcastle, bại liệt, và các "arbovirus" typ A).

Tái hoạt hóa phi kiểu gen là hiện tượng một virus bị vô hoạt protein cấu trúc nhưng có thể phát triển nhờ hoạt tính của protein-enzyme có nguồn gốc từ virus khác, ví dụ nhờ enzyme "cởi vỏ" của virus đậu. Hiện tượng tái hoạt hóa phi kiểu gen có thể diễn ra nhờ một virus đậu nguyên vẹn nhưng cũng có thể nhờ một virus đậu genome khuyết tổn.

Tương bổ là hiện tượng khi nhiễm đồng thời hai virus có genome tổn thương do biến dị ở hai miền gen khác nhau và đều mất khả năng tái sản, thì chúng cùng sử dụng chung sản phẩm (các protein) của hai genome mà cùng có khả năng thực hiện chu trình tái sản. Chẳng hạn, gen khuyết tổn do biến dị ở một virus có thể là protein dịch sớm (RNA-polymerase) còn virus khác khuyết tổn ở gen protein cấu trúc. Khi tách biệt hai virus này đều không thể tái sản nhưng nếu cảm nhiễm hỗn hợp thì

224

quá trình tái sản của cả hai đều xảy ra. Do không có sự tái tổ hợp di truyền nên các virion thế hệ con cháu cũng có genome khuyết tổn.

Kích thích là hiện tượng một virus nguyên vẹn khi cảm nhiễm đồng thời với virus khuyết tổn thì cung cấp một hoặc một số nguyên liệu cần thiết cho virus khuyết tổn thực hiện chu trình tái sản. Ví dụ virus u thịt Raus không thể cảm ứng tổng hợp protein cấu trúc, mà sử dụng protein của virus bạch cầu gà trong thành phần áo ngoài. Khi trong môi trường có mặt của virus bạch cầu gà, từ các tế bào gà biến nạp (có gen đã tái tổ hợp) virus u thịt Raus xuất hiện các virion virus u thịt Raus. Virus bạch cầu gà trong trường hợp này gọi là virus trợ giúp. Virus á cúm typ 3 có thể là virus trợ giúp đối với virus Newcastle trong lứa cấy tế bào thận khỉ, virus Sendai đối với virus bại liệt trong lứa cấy tế bào sơ phôi chuột vàng, adenovirus đối với các virus tùy thuộc adeno (hay AAV, hay adenosatelite).

Cản nhiễm (hay can thiệp cảm nhiễm, can nhiễm - interfering) là hiện tượng một tế bào đã bị cảm nhiễm một loại (typ) virus có khả năng đề kháng lại sự xâm nhập sau đó của virus khác. Hiện tượng này liên quan đến sự hình thành protein đặc biệt gọi là interferon do genome tế bào động vật chi phối, giúp tế bào bị nhiễm cũng như các tế bào bên cạnh trở nên đề kháng tái cảm nhiễm virus. Phụ thuộc vào chủng loại virus bị cản nhiễm mà chia thành ba loại cản nhiễm: tự cản nhiễm, cản nhiễm đồng loại, cản nhiễm dị loại. Điểm đặc biệt của interferon là chỉ bảo vệ được các tế bào cùng loài với tế bào đã tổng hợp nên nó (tính đặc hiệu ký chủ) và chống lại sự xâm nhập của các loại virus khác nhau (tính không đặc hiệu vật ký sinh). Do khả năng hình thành nhanh chóng (khoảng 24 - 48 giờ) và tạo sự đề kháng đối với nhiều loại virus một cách nhanh chóng nên interferon được coi chú ý ứng dụng. Tác dụng của các vaccine virus nhược độc (attenuated vaccine) trong giai đoạn sớm là do hiện tượng cản nhiễm. Ngày nay, hợp chất này đã được sản xuất bằng công nghệ di truyền và áp dụng trong điều trị bệnh nhiễm virus ở người.

VI. Kỹ thuật di truyền Kỹ thuật di truyền bắt đầu như một khoa học từ 7/1972 khi nhóm nghiên cứu của Paul Berg (Viện hàn lâm khoa học quốc gia Mỹ) hoàn thành việc chế tạo bộ gen lai giữa virus SV40 của khỉ với phage lambda. Lần đầu tiên kết nối hai virus khác nhau hoàn toàn về mặt di truyền thành một chỉnh thể và được nhân lên dưới dạng plasmid trong tế bào vi khuẩn. Phân tử DNA lai chứa các thông tin di truyền của virus SV40, thông tin điều khiển quá trình tự sao của DNA phage lambda cũng như toàn bộ chức năng của operon galactosidase của vi khuẩn E. coli. Ban đầu khái niệm kỹ thuật di truyền chỉ các kỹ thuật tái tổ hợp DNA nhưng

225

dần dần nội dung của thuật ngữ này mở rộng tới các kỹ thuật liên quan như PCR với các biến tướng PCR, kỹ thuật lai phân tử (Northern hybridization, Southern hybridization, microarray,...

Nguyên tắc chung của công nghệ DNA tái tổ hợp gồm một số bước. Trước hết DNA genome mục tiêu và DNA chuyển tải (vector) được tinh chế và cắt thành đoạn nhờ một loại enzyme hạn chế. Trong nhiều trường hợp (đặc biệt đối với sinh vật bậc cao) DNA genome mục tiêu được thay thế bằng DNA tương bù (cDNA) của RNA thông tin thành thục. DNA này được tổng hợp từ khuôn RNA thông tin nhờ sự xúc tác của enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA-polymerase). DNA vector có thể là của một plasmid hoặc phage (nếu vật mang, dòng hóa gen là vi khuẩn), plasmid Ti của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (nếu vật mang dòng hóa gen là tế bào thực vật), là virus (retrovirus hoặc adenovirus không gây bệnh, nếu vật mang dòng hóa gen mục tiêu trong tế bào động vật). Bước thứ hai là chuyển vận DNA tái tổ hợp vào cơ thể vật mang, dòng hóa và bước tiếp sau đó là sau đó nuôi cấy vật mang, sản xuất (chiết xuất và tinh chế) sản phẩm mục tiêu.

Nhờ được cắt cùng một loại enzyme hạn chế (thường là enzyme đầu dính) các đoạn DNA mục tiêu và các DNA vector (chỉ cắt tại một điểm của mạch vòng xoắn kép) có thể ngẫu nhiên hình thành mối liên kết hyđrô tương bù ở các đầu dính, rồi được enzyme ligase hàn gắn các đầu khấc. Kết quả là trong hỗn hợp hình thành thể tái tổ hợp vector với một hoặc một số mảnh DNA của genome mục tiêu (bên cạnh các sản phẩm không mong muốn như vector tự khép vòng, các vector tự tái tổ hợp với nhau và các mảnh DNA không tái tổ hợp hoặc tự tái tổ hợp). Tất cả các sản phẩm trong hỗn hợp đều được trộn với các vật mang tạo dòng, sau đó các vật mang được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có chứa yếu tố chọn lọc (chất kháng sinh đối với vi khuẩn, hóa chất gây chết đối với tế bào động vật và thực vật). Trong điều kiện đó, chỉ các tế bào vật mang mang vector sống sót. Hơn nữa, do plasmid bị enzyme hạn chế cắt tháo vòng tại một vị trí xác định trong một gen điều khiển một thuộc tính nhận biết khác, những plasmid đã tái tổ hợp mất khả năng tạo tính trạng đó ở vật mang (chẳng hạn, mất khả năng tổng hợp beta-galactosidase), nên chỉ những vật mang sống sót và không biểu hiện tính trạng đó được chọn nuôi cấy tạo dòng. Bước tiếp theo là chọn những dòng biểu hiện tính trạng của gen mục tiêu hoặc những dòng mang gen mục tiêu (nhờ lai phân tử: các phương pháp thử nghiệm miễn dịch như ELISA, Western blot analysis hoặc với các dò DNA hoặc RNA - Southern blot analysis, Northern blot analysis), hoặc PCR. Nuôi cấy tạo dòng những cá thể vật

226

mang thỏa mãn các bước thử nghiệm trên giúp tạo ra dòng thuần các sinh vật mang có thể sản xuất các sản phẩm mục tiêu.

Cho đến nay, kỹ thuật di truyền đã đạt được những bước tiến vượt bậc. Nhiều sản phẩm có ích đã được sản xuất từ các sinh vật tái tổ hợp hay sinh vật biến đổi gen (genetically modified organisms - GMO) như giống ngũ cốc, đậu tương, hạt có dầu, bông,... mang gen chống sâu bệnh hoặc kháng thuốc chống cỏ dại hoặc có chất lượng sản phẩm nâng cao như khoai tây chứa nhiều protein, lúa giàu vitamin A và sắt,... tạo ra được những vaccine tái tổ hợp có thể dễ sản xuất (dễ nuôi cấy trên lứa cấy tế bào hay phôi gà) và dễ sử dụng (cho ăn, cho uống), hoặc các động vật tái tổ hợp sản sinh những sản phẩm hữu ích như thuốc chữa bệnh, thậm chí tạo ra những đàn lợn mang kháng nguyên người hy vọng có thể là vật cho tim hoặc nội quan khác để điều trị những trường hợp người bệnh cần phải thay thế nội quan,... Tuy nhiên, kỹ thuật di truyền cũng đặt loài người vào tình trạng có thể phải đương đầu với những đe dọa mới liên quan đến sức khỏe của người và sinh thái - môi trường. Chưa thể chứng minh được tính vô hại của GMO thực phẩm đối với con người, cũng như chưa thể phủ nhận khả năng lan truyền gen kháng thuốc (của plasmid vector) trong tập đoàn các vi khuẩn tự nhiên của cơ thể (ví dụ, trong đường ruột) người và động vật. Chăm sóc những loại cây trồng đề kháng thuốc diệt cỏ và thuốc diệt sâu bệnh có thể dẫn đến lạm dụng nông dược và nếu thoái hóa trở thành cỏ dại thì thực vật kháng thuốc và kháng sâu bệnh sẽ là một nguy cơ mới đối với nông nghiệp. Tương tự, nguy cơ những sinh vật GMO lấn át sinh vật tự nhiên là rất cao và có thể dẫn đến sự tuyệt diệt của nhiều loài sinh vật hiện có, ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái,...

PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp: polymerase chain reaction) là một kỹ thuật riêng biệt được sáng tạo để khuyếch đại DNA in vitro dựa trên cơ sở phản ứng tự sao của DNA nhờ DNA-polymerase từ các deoxyribonucleoside triphosphate luôn cần mồi (primer) là đoạn oligonucleotide (trong tế bào là đoạn RNA do primase xúc tác tổng hợp) gắn kết sẵn một cách tương bù trên khuôn sợi đơn của phân tử DNA. Hiện thực hóa nguyên lý trên để áp dụng trong ống nghiệm được xúc tiến nhờ những tiến bộ trong kỹ thuật như: tổng hợp được các mạch oligonucleotide có trình tự đặc hiệu biết trước từ các deoxyribonucleoside triphosphate, thành công trong việc chế tạo máy chu kỳ nhiệt hay máy luân nhiệt (thermocycler) và tinh chế được enzyme DNA-polymerase chịu nhiệt (từ vi khuẩn ưu nóng Thermus aquaticus - Taq polymerase, sau đó từ E. coli tái tổ hợp gen này của Thermus aquaticus - rTaq polymerase). Trong máy luân nhiệt, hỗn hợp gồm DNA, dNTP, DNA-polymerase, cặp oligonucleotide mồi và dung dịch đệm được gia nhiệt (94 - 96 °C), khi đó các DNA mạch đôi biến tính thành chuỗi đơn, sau đó khi máy hạ nhiệt

227

xuống khoảng 40 - 60 °C thì các oligonucleotide mồi sẽ gắn vào các vị trí đặc hiệu (có trình tự nucleotide tương bù) và cung cấp đầu 3'-OH cho DNA polimerase gắn vào, khi gia nhiệt lên khoảng 60 - 75 °C polymerase hoạt động gắn kết các dNTP tương bù kéo dài sợi mới theo hướng 5'→3' làm cho sợi đơn trở thành sợi đôi bắt đầu từ điểm gắn mồi. Tiếp tục các chu kỳ gia nhiệt gây biến tính (denaturation), hạ nhiệt gây gắn mồi (annealling) rồi nâng nhiệt gây kéo dài (elongation) ta có thể tổng hợp được lượng lớn sợi đơn mới. Do hai mồi trong hỗn hợp được thiết kế có thể gắn đặc hiệu với hai sợi đơn khác nhau sao cho mạch mới tổng hợp của mồi này cung cấp chỗ gắn cho mồi kia nên sau một số khá lớn (25 - 40) chu kỳ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp với số lượng lớn áp đảo. Nếu cho sản phẩm phản ứng di động trong gel nhờ dòng điện một chiều bên cạnh các đoạn DNA có phân tử lượng (DNA molecular weight marker) biết trước và nhuộm ethidium bromide rồi soi dưới tia tử ngoại, ta có thể nhận ra các băng DNA và xác định được phân tử lượng của sản phẩm (cũng như sự thuần khiết của sản phẩm). Do hai mồi được thiết kế một cách đặc hiệu với trình tự DNA biết trước hay do mỗi sinh vật có trình tự DNA đặc hiệu nên sản phẩm được PCR tổng hợp có phân tử lượng đặc hiệu (do tính đặc hiệu của trình tự nucleotide). Nhờ đó có thể dùng phản ứng này để nhận biết sự hiện diện của một đoạn gen cho trước hoặc để chẩn đoán bệnh (đồng định: nhận biết sự hiện diện của mầm bệnh) hoặc nhận diện (đồng định) cá thể. Để tăng hiệu quả của PCR, mở rộng phạm vi sử dụng của nó hoặc áp dụng để nhân DNA từ khuôn RNA, hàng loạt biến tướng của kỹ thuật này được thiết lập (nested PCR, LA PCR, hot start PCR, RAGE, panhandle PCR, inverse PCR,...).

Ngoài kỹ thuật PCR thông thường (conventional PCR) nêu trên còn có PCR thực thời (real-time PCR) được phát triển trên cơ sở phản ứng PCR thông thường với cặp mồi đặc hiệu và một dò chỉ hấp thụ và phát xạ (bức xạ bước sóng đặc hiệu) khi gắn với DNA đoạn giữa hai mồi tổ hợp với thiết bị đặc biệt trắc định cường độ phát xạ của dò ngay trong quá trình phản ứng.

PCR còn được sử dụng trong việc xác định trình tự nucleotide (sequencing) của DNA. Khi đó, có thể sử dụng trực tiếp sản phẩm khuếch đại nhờ PCR hoặc các đoạn DNA đã được dòng hóa. Nguyên tắc chung là khuyếch đại một đoạn DNA nhờ một mồi với hỗn hợp gồm DNA khuôn, một mồi duy nhất bắt cặp với đầu 5' của đoạn DNA cần đọc trình tự, Taq DNA-polymerase, các dNTP cùng với một trong bốn loại ddNTP (dideoxyribonucleotide) đã được đánh dấu huỳnh quang (hoặc phóng xạ,...) trong mỗi lọ trong bốn lọ phản ứng (hoặc bốn loại đánh dấu khác nhau trong một lọ phản ứng chung). Phản ứng xảy nối dài bắt đầu từ mồi và kết thúc khi gắn kết với một ddNTP đánh dấu (do ddNTP thiếu gốc 3'-

228

OH cần thiết cho phản ứng tiếp tục). Do việc gắn kết với các phân tử ddNTP là tương bù đặc hiệu và ngẫu nhiên giữa một ddNTP với dNTP cùng loại nên sau khi biến tính kết quả phản ứng (bằng nhiệt, có thêm formamide) ta có hỗn hợp chứa các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau. Khi điện di (trong polyacrylamide gel bão hòa urea) trong bốn làn (lane) cạnh nhau (với trường hợp đánh dấu cùng loại) hoặc trong một làn (với trường hợp đánh dấu khác loại) các đoạn dài ngắn khác nhau sẽ di động với tốc độ khác nhau. Kết quả là ta có các băng (band) phân bố liên tiếp (lần lượt, đọc từ băng di động nhanh nhất) phụ thuộc vào độ dài của mạch đơn nucleotide tức phụ thuộc vào vị trí gắn kết của một loại ddNTP. Trình tự đọc được chính là trình tự nucleotide của đoạn DNA bắt đầu từ mồi.

Lai phân tử (hybridization) có thể giúp nhận biết sự hiện diện của một phân tử đặc hiệu nào đó, gồm lai Southern (phân tích DNA) hoặc Northern (phân tích RNA) và các kỹ thuật miễn dịch học như Western blot analysis và ELISA. Một trình tự mạch đơn (DNA hoặc RNA) biết trước gọi là dò (probe) được đánh dấu (bằng chất phóng xạ) được chuẩn bị sẵn và cho tiếp xúc với sản phẩm RNA hoặc DNA sợi đơn đã cố định trên giá thể (màng nylon hoặc màng nitrocellulose), nếu có trình tự tương bù dò sẽ gắn kết một cách đặc hiệu. Sau khi rửa kỹ màng giá thể, nếu phát hiện được dò (nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ký) trên màng chứng tỏ trong sản phẩm có chứa trình tự nucleotide tương bù. Western blot analysis là phương pháp lai kháng thể gắn kết với một enzyme có khả năng chuyển màu cơ chất thích hợp (đánh dấu bằng peroxidase hoặc phosphotase kiềm) với sản phẩm đã cố định trên màng, trong khi ELISA là phương pháp lai kháng thể đánh dấu với sản phẩm đã cố định trên bề mặt lỗ khay. Nếu trong sản phẩm có kháng nguyên đặc hiệu thì kháng thể đánh dấu sẽ kết hợp đặc hiệu và không bị rửa trôi. Kết quả là nếu phát hiện được yếu tố đánh dấu (nhờ kỹ thuật chuyển màu cơ chất enzyme) thì chứng tỏ trong sản phẩm có kháng nguyên hay protein đặc hiệu.

Câu hỏi ôn tập chương 10

1. Vật chất di truyền ở sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus? 2. Sự tự sao DNA? 3. Quá trình phiên mã? 4. Quá trình dịch mã? 5. Sự điều tiết phiên mã và điều tiết dịch mã? 6. Cải biến và hạn chế? 7. Biến dị kiểu hình? 8. Đột biến? 9. Biến nạp (chuyển thể) ở vi khuẩn?

229

10. Tải nạp ở vi khuẩn? 11. Tiếp hợp ở vi khuẩn? 12. Tương tác di truyền ở virus" 13. Kỹ thuật di truyền và công nghệ DNA tái tổ hợp? 14. PCR cần những yếu tố hóa học gì, những điều kiện phản ứng như thế

nào? 15. Các kỹ thuật lai phân tử dựa trên tính chất cơ bản gì của các yếu tố tham

gia phản ứng?

230

Chương 11 MIỄN DỊCH

Miễn dịch (MD-immunity) là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể

chống lại các tác nhân gây bệnh (vi sinh vật và các độc tố của chúng, các phân tử lạ...) khi chúng xâm nhập vào cơ thể.

Sự bảo vệ cơ thể do rất nhiều các phân tử và tế bào nằm rải rác khắp cơ thể tham gia theo cơ chế bảo vệ không đặc hiệu và bảo vệ đặc hiệu. MD không đặc hiệu được hình thành từ khi mới lọt lòng và trước khi có sự xuất hiện của kháng nguyên. MD đặc hiệu bao gồm MD thể dịch do hình thành kháng thể trong thể dịch của cơ thể và MD tế bào (tạo Protein độc tiêu diệt các tế bào mang kháng nguyên lạ) I.Cơ chế bảo vệ không đặc hiệu

Là miễn dịch tự nhiên mang tính chất bẩm sinh, bao gồm các tuyến phòng thủ từ ngoài vào trong để ngăn chặn không cho vi sinh vật (VSV) xâm nhập vào cơ thể.

- Hàng rào vật lý: Da và niêm mạc ngăn cách nội môi của cơ thể với ngoại môi xung quanh. Trên mặt biểu bì chứa keratin không tan trong nước, không bị VSV phân giải, do đó không cho VSV thấm qua. Phía ngoài, biểu bì chủ yếu gồm tế bào chết nên virus không nhân lên được.

Niêm mạc bao phủ bề mặt trong cơ thể như đường hô hấp, tiêu hoá và sinh dục. Chất nhầy của niêm mạc là cái bẫy bắt giữ VSV, hệ thống nhu mao chuyển động hất VSV ra bên ngoài qua đường mũi hoặc miệng. Lông mũi, phản xạ ho, hắt hơi, nôn cũng giúp ngăn chặn VSV xâm nhập vào cơ thể.

* Dịch cơ thể như nước mắt, nước bọt, nước tiểu...cũng giúp rửa trôi VSV khi chúng bám trên bề mặt các mô, y hệt như ta tắm rửa để làm trôi bụi bặm.

- Hàng rào VSV bao gồm các vi khuẩn bao phủ bề mặt hoặc khu trú bên trong cơ thể, tạo nên khu hệ VSV bình thường. Đây là một khu hệ VSV phức tạp, có số lượng gấp 9 lần tổng số tế bào của cơ thể. Chúng chiếm trước các vị trí mà VSV gây bệnh đã đến, cạnh tranh thức ăn và tiết ra chất hoá học tiêu diệt VSV gây bệnh. Ngoài ra nhiều vi khuẩn sống trong đường tiêu hoá còn tiết ra biotin, riboflavin và các vitamin khác cung cấp cho cơ thể. Khi phá vỡ sự cân bằng trong khu hệ, một số sẽ có thể trở thành VSV gây bệnh cơ hội.

231

- Hàng rào hoá học: trong dịch tiết của các mô trong máu, trong dịch lympho đều chứa các nhân tố ức chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh.

* pH acid ức chế sự sinh trưởng của VSV. VSV phân giải lipid thành acid béo làm tăng độ acid của da. Vi khuẩn lactic lên men glycogen tạo acid lactic trong âm đạo. Dịch vị do tuyến trong dạ dày tiết ra chứa acid clohydric có pH 1-2. Sản phẩm lên men của các vi khuẩn thường trú trong đường tiêu hoá là acid lactic và axetic. Ngoài ra VSV còn tiết ra bacterioxin là chất diệt khuẩn mạnh.

* Lysozym là enzyme có trong nước mắt, nước mũi, nước bọt, dáy tai, mồ hôi, sữa, dịch âm đạo...v.v.., có khả năng diệt vi khuẩn Gram dương nhờ cơ chế phân giải thành tế bào, do đó được coi là một loại chất kháng sinh.

Protein liên kết với sắt như lactoferrin có trong tinh dịch, nước mắt, sữa mẹ, mật, nước mũi, dịch nhầy ruột...v.v.., transferrin có trong gian bao các mô, trong huyết thanh làm giảm trọng lượng sắt tự do gây tình trạng thiếu sắt cần thiết cho VSV sinh trưởng, do đó ngăn cản được nhiễm trùng.

Inteferon (IFN) là glycoprotein do các tế bào mô đã nhiễm virus hoặc vi khuẩn (IFN-α và IFN-β) hoặc do các tế bào lympho T sinh ra (IFN-γ). IFN ức chế sự nhân lên của virus trong tế bào bằng cách hình thành protein cảm ứng ngăn cản quá trình dịch mã và phân huỷ RNA thông tin của virus. Ngoài vai trò bảo vệ, IFN còn làm nhiệm vụ điều hoà mạng lưới bảo vệ chống nhiễm trùng và sự nhân lên của các tế bào ung thư.

Bổ thể (Complement) là glycoprotein có khả năng làm tan tế bào và tăng cường hiện tượng thực bào.

- Hiện tượng thực bào: Các bạch cầu tham gia vào cơ chế bảo vệ không đặc hiệu bao gồm: Bạch cầu trung tính chứa các hạt không bắt màu thuốc nhuộm, có tính hoá ứng động bắt giữ và tiêu diệt các vật lạ, kể cả VSV và các mảnh tế bào phân huỷ, do vậy đóng vai trò quan trọng trong chống nhiễm trùng.

Bạch cầu ưa kiềm chứa các hạt bắt màu xanh methylen, chứa các hoạt chất nhu histamin, heparin, serotonin.

Bạch cầu ưa acid chứa các hạt bắt màu eosin, chứa enzyme phân giải histamin và heparin, do vậy điều hoà hoạt động của bạch cầu kiềm. Bạch cầu này có khả năng gây độc các ấu trùng giun.

Đại thực bào đóng vai trò quan trọng trong chống nhiễm trùng, nhất là virus. Đại thực bào thâu tóm VSV nhờ giả túc, tạo không bào

232

(phagosom). Các không bào dung hợp với lysosom tạo phagolysosom. Các VSV trong phagolysosom bị tiêu diệt do nhiều nguyên nhân.

- Các enzyme phụ thuộc oxy chuyển hoá oxy phân tử thành peoxit gây độc cho VSV.

- Sự thay đổi kiểu hô hấp, tạo acid lactic làm giảm pH, pH thấp làm tăng hoạt tính nhiều enzyme trong lysosom.

- Cơ chế thực bào không phụ thuộc oxy bao gồm hoạt động của các enzyme phân giải của lysosom như lyzozim, photpholipase, ribonuclease, deoxyribonuclease..v.v..

Sốt là cơ chế bảo vệ tự nhiên, làm tăng phản ứng enzyme phân huỷ VSV, làm tăng hoạt động của IFN và làm giảm nồng độ sắt tự do trong máu, do đó góp phần tiêu diệt VSV.

Viêm không đặc hiệu có tác dụng khu trú VSV vào một nơi không cho chúng lan rộng thêm, 4 tính chất của viêm là: đỏ, đau, sưng, nóng là do giãn mạch, tăng dòng máu, làm thoát bradykinin và prostaglandin, bạch cầu trung tính, đại thực bào vào ổ viêm. II.Chất sinh miễn dịch và kháng nguyên

1. Chất sinh miễn dịch (immunogen) là những chất khi đưa vào cơ thể ở điều kiện thích hợp có khả năng gây một đáp ứng miễn dịch (ĐUMD), còn kháng nguyên (KN-antigen) là những chất có khả năng liên kết với kháng thể hoặc thụ thể đặc hiệu của tế bào limpho T (TCR). Tất cả các chất sinh miễn dịch đều là kháng nguyên, nhưng không phải tất cả kháng nguyên đều là chất sinh miễn dịch. Ví dụ: Hapten là kháng nguyên không trọn vẹn, có thể gắn với kháng thể những không kích thích tạo kháng thể.

Ba điều kiện cần của một chất sinh miễn dịch là: - Tính lạ: Cơ thể không đáp ứng bảo vệ với kháng nguyên bản

thân, do vậy chất càng lạ với cơ thể, khả năng gây đáp ứng miễn dịch càng cao.

- Trọng lượng phân tử đủ lớn: Kháng nguyên thường có trọng lượng phân tử trên 10.000 dalton. Nếu thấp hơn, khả năng sinh miễn dịch yếu hoặc không có vì khó bị đại thực bào bắt giữ và xử lý.

- Cấu trúc phân tử phức tạp: nhiều chất có trọng lượng phân tử lớn như polylisin, polisaccharid không gây hoặc gây đáp ứng miễn dịch yếu vì cấu trúc đơn giản do lặp đi lặp lại, trong khi hapten có trọng lượng phân tử thấp nhưng gắn với protein thì lại trở thành chất gây đáp ứng miễn dịch.

233

2. Tính đặc hiệu của kháng nguyên (KN) Không phải toàn bộ kháng nguyên tham gia vào kích thích hệ

thống miễn dịch mà chỉ có một phần nhất định của kháng nguyên gọi là quyết định kháng nguyên hay epitop, mới liên kết với kháng thể hoặc tế bào lympho. Phần tương ứng với quyết định kháng nguyên nằm trên mỗi kháng thể gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop còn phần tương ứng nằm trên mặt tế bào lympho là thụ thể, ví dụ thể tế bào T (TCR T-cellreceptor). Sự liên kết giữa epitop với paratop mang tính đặc hiệu cao, tương ứng như giữa enzyme và cơ chất hay giữa khoá với chìa. III. Các cơ quan và tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch

Nhiều cơ quan và tế bào nằm rải rác khắp cơ thể hợp tác với nhau để nhận diện và phản ứng với kháng nguyên theo nhiều cách dẫn đến đáp ứng miễn dịch cuối cùng. 1. các cơ quan lympho: là nơi huấn luyện và tàng trữ các tế bào lympho, bao gồm cơ quan lympho trung tâm và cơ quan lympho ngoại vi. 1.1. Cơ quan lympho trung tâm gồm tuyến ức và túi fabricius Các tế bào gốc hay còn gọi là tế bào nguồn đi từ tuỷ xương vào tuyến ức. Tại phần vỏ của tuyến ức, tiền tế bào T được phân chia nhiều lần và biệt hoá thành tế bào T chín với các thụ thể khác nhau trên bề mặt. Các gen kiểm tra sự hình thành các thụ thể này xuất hiện do tái tổ hợp DNAcủa tế bào T non khi còn ở tuyến ức. Phần lớn các tế bào T có thụ thể nhận diện được kháng nguyên bản thân sẽ bị loại trừ và chết. Các tế bào còn lại di cư vào phần tuỷ của tuyến ức để tiếp tục biệt hoá tạo các dòng tế bào T phân lớp, sau đó các tế bào này theo máu rời tuyến ức để vào cơ quan lympho ngoại vi.

Túi Fabricus là cơ quan lympho trung tâm chỉ có ở gia cầm, nằm gần hậu môn và là nơi biệt hoá tế bào B. Động vật có vú không có túi Fabricus nên sự biệt hoá tế bào B xẩy ra ngay trong tuỷ xương và các cơ quan tương đương, như cơ quan lympho của hệ tiêu hoá. Các tế bào B chín rời túi đến cơ quan lympho ngoại vi. Khi tiếp xúc với kháng nguyên sẽ được kích thích, biệt hoá để trở thành tế bào plasma (tương bào) sản xuất kháng thể. Vì thế tế bào plasma được coi là nhà máy sản xuất kháng thể. 1.2. Các cơ quan lympho ngoại vi

Lách là cơ quan lympho ngoại vi lớn nhất, là nơi bẫy kháng nguyên vào bằng đường tĩnh mạch và là cơ quan chính tạo kháng thể. Trong lách có vùng chứa tế bào T và vùng chứa tế bào B. Trung tâm mầm

234

nằm trong nang lympho ở vùng tế bào B. Trong trung tâm mầm chứa đầy tế bào B và tế bào plasma, một số đại thực bào và tế bào tua.

Hạch lympho nằm rải rác khắp cơ thể và hoạt động như một hệ thống lọc. Kháng nguyên di chuyển chậm theo các mạch hẹp và gấp khúc để tăng sự tiếp xúc với đại thực bào và tế bào lympho.

Phần vỏ gồm vùng vỏ nông có nhiều nang chứa tế bào B. Khi có kháng nguyên kích thích, nang sẽ nới rộng ra tạo trung tâm mầm, chứa chủ yếu tế bào B chuẩn bị phân chia. Vùng vỏ sâu chứa chủ yếu là tế bào T và một số đại thực bào. Phần tủy có nhiều xoang chứa dịch lympho. Các tế bào plasma đi từ vùng vỏ sang vùng tuỷ. Khi có kháng nguyên xâm nhập, đại thực bào bắt giữ, xử lý, hợp tác với các tế bào B và T để sản xuất kháng thể. 2. Các tế bào tham gia và đáp ứng miễn dịch: từ nguồn gốc chung là tế bào tuỷ xương sẽ được biệt hoá để tạo thành các dòng tế bào khác nhau: (Hình 11.1)

235

- Dòng tạo máu biệt hoá thành các tế bào dòng tuỷ bao gồm tế bào mono (tiền thân của đại thực bào) và các tế bào đa nhân (bạch cầu trung tính, bạch cầu kiềm và bạch cầu acid). Dòng hồng cầu tạo tế bào hồng cầu và dòng tế bào khổng lồ tạo tiểu cầu.

- Dòng lympho đi vào các cơ quan trung tâm. Nếu vào túi Fabricius, sẽ biệt hoá thành tế bào B (từ chữ Bursa Fabricius) khi được kháng nguyên kích thích tế bào B sẽ biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất kháng thể và tế bào B nhớ để đáp ứng với kháng nguyên vào lần hai.

Nếu tế bào nguồn đi vào tuyến ức sẽ được biệt hoá thành các tế bào lympho T (từ chữ Thymus-tuyến ức). Các tế bào T được phân biệt bởi các thụ thể bề mặt thành các dòng tế bào T4 và T8.

Dòng tế bào T4 bao gồm: - Lympho T hỗ trợ (TH) có nhiệm vụ kích thích tế bào B biệt hoá

thành tế bào plasma sản xuất kháng thể. - Lympho T cảm ứng (Ti) tiết ra intơlơkin-2 kích thích sự biệt hoá

và hoạt động của các tế bào T khác. - Lympho T gây quá mẫm muộn (TDTH) tiết lymphokin hoạt hoá

đại thực bào và các bạch cầu khác gây quá mẫm muộn. - Lympho T điều hoà ngược (TFR) có tác dụng hoạt hoá lympho T

ức chế. Dòng tế bào T8 bao gồm: - Lympho T độc (TC) tấn công trực tiếp các tế bào có kháng

nguyên lạ (tế bào ung thư, tế bào nhiễm virus). - Lympho T ức chế (TS) điều hoà đáp ứng miễn dịch bằng cách ức

chế sự hoạt động của các loại lympho bào khác. Đại thực bào đóng vai trò như là tế bào khơi mào cho một đáp ứng

miễn dịch. Trước hết chúng làm nhiệm vụ chế biến kháng nguyên bằng cách bắt giữ, nuốt và tiết enzyme phân giải để bộc lộ quyết định kháng nguyên, sau đó đẩy kháng nguyên ra bề mặt để tiếp cận với tế bào B và tế bào T. Nhờ động tác này mà đại thực bào được gọi là tế bào trình diện kháng nguyên (APC-antigen presenting cell).

Đại thực bào còn chứa các thụ thể dành cho phần Fc của IgG và bổ thể C3, do đó làm tăng khả năng thực bào.

236

IV. Kháng thể Kháng thể (KT-antibody) là các gamma globulin Ig) có trong huyết

thanh của động vật có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó.

Ở đây ta chỉ xét các kháng thể miễn dịch (KTMD) 1. Cấu trúc của kháng thể miễn dịch: Tất cả các kháng thể đều có cấu trúc giống nhau gồm 4 chuỗi polypeptit. Hai chuỗi nhẹ ký là L và 2 chuỗi nặng ký hiệu là H, gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S).

Hình 11.2: Cấu tạo của kháng thể

237

Các amino acid nằm xa nhau trên cùng một chuỗi có thể gắn với nhau nhờ cầu nối S-S để tạo vùng gấp (domain)

Chuỗi nhẹ: Trật tự amino acid của hai chuỗi nhẹ giống hệt nhau và được chia làm hai vùng. Vùng có trật tự amino acid thay đổi gọi là vùng biến đổi (ký hiệu VL), nằm phía đầu amin (-NH2) của phân tử. Vùng có trật tự amino acid không thay đổi gọi là vùng cố định (ký hiệu CL), nằm ở phía đầu cacboxyl (-COOH). Trật tự amino acid vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớp kháng thể, hoặc theo trật tự λ (lamda) hoặc theo trật κ (kappa). Ngược lại trật tự ở vùng biến đổi luôn khác nhau, kể cả ở các kháng thể do cùng một tế bào sinh ra.

Chuỗi nặng: Mỗi chuỗi nặng có 4 vùng amino acid: một vùng biến đổi và 3 vùng cố định. Vùng biến đổi (ký hiệu là VH) nằm phía đầu amin đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ, tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên (paratop). Vùng cố định nằm phía đầu cacboxyl, chai làm 3 vùng nhỏ (ký hiệu là CH1,CH2,CH3). Giữa vùng CH1 và CH2 là vùng khớp nối, có tác dụng như bản lề làm cho phân tử có hình chữ Y và có thể điều chỉnh cho hai paratop gắn với hai epitop của kháng nguyên.

Dưới tác dụng của papain (protease ở nhựa quả đu đủ), phân tử kháng thể bị phân giải tại vùng bản lề thành 3 mảnh: hai mảnh nhỏ chứa toàn bộ chuỗi nhẹ và một nửa chuỗi nặng có đầu amin. Đây là nơi gắn với kháng nguyên và được gọi là mảnh Fab (Fragment of antigen binding). Mảnh còn lại của chuỗi nặng phía đầu cacboxyl có thể kết tinh được gọi là mảnh Fc (Fragment crystalizable). Mảnh này có thể liên kết với thụ thể đặc hiệu nằm trên đại thực bào, tế bào B và bổ thể.

Dưới tác dụng của pepsin thu được hai mảnh: mảnh lớn gần như một kháng thể trọn vẹn với hai paratop và mảnh nhỏ Fc. 2. Các lớp kháng thể Có 5 lớp kháng thể mang tên chuỗi nặng là IgG, IgM, IgA, IgD và IgE.

- IgG chiếm 80% tổng Ig trong huyết thanh người bình thường, cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ κ (kappa) hoặc λ (lamda) và hai chuỗi nặng γ (gama). Ở người Việt Nam nồng độ IgG trong máu là 1400 mg/100ml. IgG là kháng thể duy nhất được truyền từ mẹ sang thai qua nhau thai. IgG giữ vai trò chính bảo vệ cơ thể chống tác nhân gây bệnh, đảm nhiệm các chức năng opsonin hoá (giúp đại thực bào bắt giữ kháng snguyên), hoạt hoá bổ thể, gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể (giúp tế bào K diệt tế bào đích) trung hoà ngoại độc tố (độc tố uốn ván, độc tố do

238

Clostridium botulinum gây ngộ độc thức ăn, nọc rắn, nọc côn trùng... gây ngưng kết vi khuẩn và trung hoà virus.

IgM Chiếm từ 5-10% trong huyết thanh của người bình thường. Có cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ κ (kappa) hoặc λ (lamda) và hai chuỗi nặng μ (muy). Năm globulin chụm lại với nhau thành phân tử lớn hình sao nhờ cầu nối disulfua và chuỗi protein J do vậy có tới 10 paratop. IgM xuất hiện sớm nhất thực hiện các chức năng như hoạt hoá bổ thể, ngưng kết hồng cầu cùng loài trong trường hợp nhóm máu AB, ngưng kết vi khuẩn.

- IgA có cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ κ (kappa) hoặc λ (lamda) và hai chuỗi nặng α (anfa). Có hai loại: IgA trong huyết thanh chủ yếu ở dạng monome và IgA tiết (SIgA), luôn có dạng dime, có trong dịch tiết của cơ thể như sữa, nước bọt, nước mắt, trong dịch nhầy đường tiêu hoá, sinh dục, hô hấp. IgA monome làm nhiệm vụ hoạt hoá bổ thể theo con đường nhánh. IgA tiết chống vi khuẩn trên bề mặt niêm mạc gây nhiễm trùng đường hô hấp, tiêu hoá, đồng thời chống kháng nguyên nhóm máu AB.

- IgD có nồng độ trong máu rất thấp và cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ κ (kappa) hoặc λ (lamda) và hai chuỗi nặng δ (delta).

Hoạt tính sinh học IgD còn chưa rõ nhưng nó có mặt trên tế bào B làm thụ thể cho kháng nguyên.

- IgE có nồng độ trong huyết thanh rất thấp và có cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ κ (kappa) hoặc λ (lamda) và hai chuỗi nặng ε (epsilon). IgE tham gia vào quá mẫn tức thì (hay dị ứng) bằng cách gắn phần Fc với tế bào Mast (dưỡng bào) và phần Fab với kháng nguyên. Tế bào Mast được hoạt hoá sẽ giải phóng các chất hoạt mạch như histamin leukotrien, serotonin gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch. V. Thụ thể tế bào T

Tế bào T có khả năng nhận diện kháng nguyên thông qua thụ thể bề mặt, viết tắt là TCR (T-cell receptor). Sự nhận diện này mang tính đặc hiệu cao. Chẳng hạn tế bào Tc có thể phân biệt được mỗi loại virus khi chúng xâm nhập vào cơ thể.

TCR có cấu tạo gần giống kháng thể, gồm hai chuỗi peptit α và β gắn với nhau bởi cầu nối disulfua. TCR cũng có hai vùng: vùng biến đổi nằm ở phía đầu amin của mỗi chuỗi tạo nên vị trí kết hợp kháng nguyên. Vùng cố định nằm phía đầu cacboxyl và cắm sâu vào màng sinh chất của tế bào T.

239

VI. Kháng nguyên phù hợp tổ chức (MHC) Thụ thể tế bào T chỉ có thể nhận diện kháng nguyên quen, đó là

kháng nguyên "của mình" hoặc cùng loại với mình, gọi là kháng nguyên hay phức hợp phù hợp tổ chức chính, viết tắt là MHC (major histocompatibility complex). Kháng nguyên ày nằm trên bè mặt tế bào bình thường và được mã hoá bởi vùng gen riêng, vùng gen MHC. MHC hoạt động như là phân tử trình diện kháng nguyên vì nó tương tác đặc hiệu với cả kháng nguyên lạ lẫn TCR và đóng vai trò quan trọng trong toàn bộ đáp ứng miễn dịch. Có hai loại MHC: MHC-1và MHC-2. MHC-1 có trên bề mặt tất cả các tế bào có nhân ở động vật có xương sống, còn MHC-2 chỉ có mặt trên tế bào lympho B và đại thực bào. Ở người kháng nguyên phù hợp tổ chức (MHC) được gọi là hệ thống HLA tức kháng nguyên bạch cầu người (human leucocyte antigen). Có nhiều gen mã cho MHC-1, còn chỉ có các gen phụ mã cho MHC-2 (Hình 11.3).

Hình 11.3: Cấu trúc của protein phù hợp tổ chức chính a) Lớp I; b) Lớp II. (Cần nhớ rằng các phân tử lớp I nằm trên bề mặt tất cả các tế

bào có nhân, còn các phân tử lớp II chỉ có trên bề mặt các tế bào trình diện kháng nguyên đã biệt hoá, chẳng hạn đại thực bào và tế bào B).

240

Protein MHC-1 có cấu tạo gồm hai chuỗi polypeptit. Một chuỗi được mã hoá bởi gen nằm trong vùng gen MHC, gọi là chuỗi α và được cắm sâu vào màng sinh chất còn chuỗi kia nhỏ hơn được mã bởi gen nằm ngoài vùng gen MHC, gọi là chuỗi microglobulin β-2 (viết tắt là β2m).

Protein MHC-2 cũng có cấu tạo từ hai chuỗi polypeptit α và β cả hai đều cắm sâu vào màng sinh chất và nhô ra ngoài mặt tế bào.

Cấu trúc MHC ở các cá thể khác nhau trong cùng loài cũng khác nhau, do vậy khi ghép cơ quan giữa hai cá thể có MHC không tương đồng thì sẽ dễ bị thải loại.

Chức năng của MHC: MHC làm nhiệm vụ trình diện hay nói đúng hơn là trung chuyển kháng nguyên cho tế bào T. Với mỗi loại MHC có một cơ chế trình diện riêng.

- Với MHC-1: kháng nguyên sau khi được tế bào ký chủ chế biến nhờ enzyme tiêu hoá, sẽ được gắn với MHC-1 trong lưới nội chất. Ví dụ tế bào nhiễm virus phân giải protein virus thành các peptit rồi gắn với MHC-1. Phức hệ MHC-1 kháng nguyên sẽ xuyên qua màng sinh chất và nằm trên mặt tế bào, ở đây tế bào Tc thông qua TCR đặc hiệu kháng nguyên sẽ liên kết với phức hệ trên, đồng thời thụ thể CD8 trên mặt tế bào Tc cũng gắn với MHC-1, làm cho phức hệ mạnh hơn. Sau khi được kháng nguyên kích thích, tế bào T tăng sinh và sản ra lymphokin để làm tan tế bào nhiễm. Rõ ràng tế bào T phải rà soát để nhận diện kháng nguyên phù hợp với TCR của mình và TCR ấy phải tương tác cả với epitop của kháng nguyên lẫn MHC.(Hình 11.4)

Hình 11.4: Nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC lớp 1 Protein lớp I được tạo thành và tích luỹ trong lưới nội chất, cùng với các protein

khác (như kháng nguyên virus và ung thư). Một số protein này bị tiêu hoá và được đưa

241

vào trong lưới nội chất tạo thành peptit. Các peptit này gắn với protein lớp I rồi chuyển ra mặt tế bào. Ở đây chúng tương tác với TCR trên mặt tế bào Tc đồng thụ thể CD8 trên mặt tế bào Tc cũng đồng thời gắn với MHC lớp I tạo nên phức hệ mạnh hơn, sau đó tế bào Tc sản ra lymphokin là các protein diệt tế bào đích. Bất kì tế bào có nhân nào cũng có thể hoạt động như một tế bào trình diện kháng nguyên (APC) cho phân tử lớp I.

MHC-2 được hình thành trong lưới nội chất cùng với các protein khác. Một chuỗi protein không đổi gọi là chuỗi I gắn trước với MHC-2 để cản ngăn không cho MHC-2 gắn với các peptit khác. MHC-2 cùng chuỗi I được chuyển vào endosom.

Hình 11.5: Sự nhận diện kháng nguyên nhờ phân tử MHC-2 MHC-II được tạo thành và tích luỹ trong lưới nội chất cùng với protein bao vây

(blocking protein) Ii . Chuỗi này ngăn không cho lớp II gắn với các peptit khác cũng được tạo thành trong lưới nội chất. Sau đó lớp II đi qua thể Golgi vào endosom. Tại đây protein Ii và protein lạ từ bên ngopài vào sẽ bị phân giải nhờ enzymee protein lớp II lại được gắn với peptit lạ đã phân giải tạo phức hợp đưa ra mặt tế bào. Phức hợp này tương tác với TCR và đồng thụ thể CD4 của tế bào TH. Tế bào này sản ra lymphokin kích thích tế bào B tạo kháng thể. Tế bào APC là đại thực bào hoặc tế bào B.

Kháng nguyên lạ bị tế bào APC (đại thực bào, tế bào B), thâu tóm rồi chuyển vào endosom. Ở đây nhờ proteinase, chúng được phân giải cùng với protein I. Các peptit lạ được giải phóng ra sẽ thế chỗ cho protein I để gắn vào MHC-2 tạo phức hệ chui qua màng sinh chất đặng trình diện cho tế bào TH thông qua TCR. Thụ thể CD4 trên mặt tế bào TH cùng gắn vào MHC-2. Khi được kháng nguyên lạ kích thích, tế bào TH hoạt hoá và tiết intơlơkin để biệt hoá tế bào B thành tế bào plasma sản xuất kháng thể.

242

Hình 11.6: Cấu tạo chi tiết vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ.

Đây là một nửa phân tử Ig, CH và CL là vùng cố định của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. VII. Cơ chế hình thành kháng thể miễn dịch

Việc hình thành kháng thể là một quá trình rất phức tạp đòi hỏi có sự tham gia của nhiều loại tế bào: Tế bào T, tế bào B và tế bào trình diện kháng nguyên (APC) và phải có mối tương tác giữa các phân tử bề mặt (TCR, MHC, kháng thể bề mặt tế bào B).

Khi kháng nguyên vào cơ thể sẽ theo dòng máu và bạch huyết vào hạch lympho, lách và gan. Kháng nguyên sẽ được tạo thành ở lách và hạch lympho.

Trước hết kháng nguyên phải được APC trình diện. APC là đại thực bào hoặc cũng có thể là tế bào B.

- APC là tế bào B thông qua thụ thể là kháng thể bề mặt sẽ nhận diện kháng nguyên. Kháng nguyên vào tế bào rồi tiêu hoá trong endosom, các peptit được tạo thành sẽ kết hợp với phân tử MHC-2 đi ra bề mặt tế bào để tương tác với TCR.

- APC là đại thực bào cũng hoạt động như vậy nhưng không có thụ thể dành cho kháng nguyên. Đại thực bào thâu tóm kháng nguyên (theo kiểu amip bắt mồi), tiêu hoá và giải phóng peptit. Peptit cũng được gắn với MHC-2 để đưa ra bề mặt trình diện tế bào TH như trường hợp với APC là tế bào B.

243

Hình 11.7: Mô hình thuyết chọn lọc dòng

244

Phức hệ MHC-2 KN sẽ được trình diện cho tế bào TH thông qua TCR. Phân tử MHC cũng tương tác với thụ thể CD4 trên bề mặt tế bào TH. được kích thích bởi kháng nguyên, tế bào TH hoạt hoá và tăng sinh sản ra interlơkin để kích thích tế bào B tăng sinh và biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất kháng thể và dòng tế bào B nhớ. Tế bào plasma chỉ sống được khoảng một tuần nhưng lại sản xuất một lượng lớn kháng thể. Tế bào B nhờ có đời sống dài và tồn tại cả khi kháng nguyên đã mất. Khi được kích thích bởi kháng nguyên vào lần 2, chúng sẽ biến thành tế bào plasma để sản xuất kháng thể nhiều và nhanh chóng hơn. Đó chính là đáp ứng miễn dịch lần 2 và là cơ sở của việc tiêm chủng vaccin.

Một số kháng nguyên có thể kích thích tạo thành kháng thể ở mức độ thấp mà không cần có sự tham gia của tế bào T, được gọi là kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức. Các kháng nguyên này thường có cấu tạo đơn giản, lặp đi lặp lại, như polysaccharit. Kháng thể được tạo thành thường thuộc lớp IgM, có ái lực thấp. tế bào B đáp ứng kháng nguyên này không có trí nhớ miễn dịch 1.Thuyết chọn lọc dòng của Burnette

Theo Burnette thì thông tin để hình thành kháng thể đã có sẵn trong tế bào B từ trước khi có kháng nguyên xâm nhập. Bằng con đường đột biến, hàng loạt tế bào B được tạo thành. Mỗi loại có khả năng đáp ứng với một loại kháng nguyên có sẵn. Trong thời kỳ bào thai, loại tế bào nào chống lại kháng nguyên bản thân sẽ bị ức chế. Khi ra đời, cơ thể chỉ còn lại các tế bào phản ứng lại kháng nguyên lạ. Khi có kháng nguyên xâm nhập, chúng sẽ chọn lọc tế bào nào phù hợp (có thụ thể phù hợp với quyết định kháng nguyên) để kích thích, phân chia theo con đường gián phân tạo thành dòng. Các tế bào không phù hợp với kháng nguyên thì không được kích thích để tạo dòng.(Hình 11.7)

Thuyết chọn lọc dòng được công nhận vì nó giải thích được nhiều hiện tượng miễn dịch như dung nạp miễn dịch (không tạo kháng thể chống kháng nguyên bản thân) và trí nhớ miễn dịch. 2.Kháng thể đơn dòng

Trong tự nhiên, kháng nguyên có nhiều nhóm quyết định (kháng nguyên đa giá), do đó sẽ kích thích cơ thể tạo thành không phải một mà là một phức hợp kháng thể. Muốn nhận một loại kháng thể trong phức hợp ấy thì phải tiến hành tách tinh khiết.

Năm 1975 Milstein và Kohler đã tiến hành lai bằng con đường dung hợp tế bào ung thư tuỷ và tế bào lympho B. Tế bào ung thư có khả năng phân chia nhanh nhưng không tạo thành kháng thể, ngược lại tế bào B có

245

khả năng hình thành kháng thể nhưng không có khả năng phân chia vì chúng là tế bào tận cùng của quá trình biệt hoá.

Tế bào lai có được ưu điểm của cá hai tế bào trên: vừa phân chia rất nhanh vừa có khả năng tổng hợp kháng thể.

Tiến hành pha loãng liên tục trong giếng của phiến nhựa vi lượng cho đến khi mỗi giếng chỉ có một tế bào. Từ một tế bào đơn chỉ sản xuất một dòng kháng thể thuần khiết. Do vậy kháng thể đơn dòng là kháng thể do một dòng tế bào B sinh ra để chống lại một quyết định kháng nguyên.

Kỹ thuật kháng thể đơn dòng đã được áp dụng rộng rãi để thay thế dần một số phương pháp huyết thanh thông thường như xác định hocmon trong đánh giá chức năng nội tiết, xác định protein chấn đoán ung thư, xác định nồng độ thuốc trong máu với độ nhạy cao gấp nhiều lần so với các biện pháp thông thường. Có thể đưa thuốc đến tận mục tiêu cần tiêu diệt như là tên lửa đạo đạn. Thuốc sẽ được phóng thích liên tục để diệt các tế bào ung thư. Kỹ thuật đơn dòng cũng được dùng để xác địng doping trong thể thao. VIII. Cơ sở di truyền của sự tạo thành kháng thể

Một vấn đề đặt ra là làm sao cho cơ thể có khả năng sản ra một lượng lớn và đa dạng các loại kháng thể đến như vậy để đáp ứng với các loại kháng nguyên muôn hình muôn vẻ. Nếu mỗi protein cần một gen mã hoá thì cơ thể phải cần đến hàng tỷ gen để sản xuất kháng thể. Điều đó vượt quá tiềm năng gen có sẵn của cơ thể. Muốn hiểu rõ cơ chế di truyền của sự tổng hợp kháng thể, chúng ta cần nghiên cứu chi tiết hơn cấu trúc kháng thể và sự sắp xếp lại gen.

Cấu trúc kháng thể: Các kháng thể khác nhau có trật tự sắp xếp các amino acid khác nhau ở vùng biến đổi. Trong vùng biến đổi lại có những vùng nhỏ có trật tự amino acid thay đổi rất mạnh, gọi là vùng siêu biến. Đó chính là vị trí kết hợp với kháng nguyên.

Vùng biến đổi của chuỗi nhẹ cũng như chuỗi nặng có 3 vùng siêu biến, được mã hoá bởi các gen vùng biến đổi (gen V) nằm trên DNA của tế bào B trong quá trình chín ở tuỷ xương. Tại vùng siêu biến thứ 3 của chuỗi nặng còn có một vùng được mã hoá bởi riêng gọi là gen D (từ chữ diversity-đa dạng) và một vùng nối giữa vùng đa dạng (D) và vùng cố định (CH) gọi là vùng nối (J) được mã hoá bởi gen J, ở chuỗi nhẹ không có vùng D. Vùng J nối giữa vùng V với vùng CL, cuối cùng là vùng cố định được mã hoá bởi các gen C.

246

Hình 11.8: Sự sắp xếp lại gen Ig trong tế bào lympho chưa chín và

cơ chế hình thành gen hoạt tính (a) chuỗi năng (b). Chuỗi nhẹ kapa. Chuỗi nhẹ lamda được mã hoá trong phức hệ gen tách biệt hoàn toàn (c). Sự hình thành một nửa phân tử Ig.

Sự sắp xếp lại gen: các gen kiểm tra tính đa dạng của các phân tử của hệ thống miễn dịch như kháng thể, TCR và MHC đều có sẵn trong các tế bào lympho. Để kiểm tra sự tao thành chuỗi nhẹ của kháng thể, trong tế bào B chưa chín có 150 gen vùng biến đổi (VL), 5 đoạn gen liên kết J, 2 gen vùng cố định (CL). Đối với chuỗi nặng có ~200VH, 4 gen J, 50 gen D và 5 gen CH gen xen giữa các gen V, J, D là các gen intron, không làm nhiệm vụ mã hoá. Tế bào B trong quá trình biệt hoá xẩy ra tái tổ hợp di truyền. Sự tái cấu trúc này dẫn đến tạo thành các gen hoạt tính chuỗi nặng và các gen hoạt tính chuỗi nhẹ. Đoạn DNA chứa các gen này được sao lại theo cơ chế bổ sung để tạo ra RNA sơ cấp rồi từ RNA sơ cấp các gen hoạt tính chắp nối lại với nhau, loại bỏ intron để tạo ra mRNA dùng để dịch mã tạo ra protein chuỗi nặng hay chuỗi nhẹ, tuỳ thuộc từng vùng gen, tách biệt dành cho mỗi loại chuỗi. Nếu sự chắp nối sai bao gồm các gen không phù hợp xen vào giữa thì các gen sai sẽ được enzyme phân giải. Sự ghép

247

nối các gen hoạt tính theo nguyên tắc tổ hợp, do vậy số lượng các loại kháng thể được tạo thành sẽ là rất lớn.

Ví dụ chuỗi nhẹ được tạo thành bởi các tổ hợp 150 gen VL, 5 gen JL, 2 gen CL sẽ cho ra 150 x 5 = 1.500 chuỗi khác nhau. Cũng như vậy ta sẽ có 200 x 4 x 50 x 5 = 20000 chuỗi nặng khác nhau. Hai chuỗi nhẹ lại liên kết với 2 chuỗi nặng nên ta có 20000 x 1500 x 2 = 6. 107 phân tử kháng thể khác nhau. Sự đa dạng của các loại kháng thể này đủ thoả mãn với các loại kháng nguyên. Có thể có trong tự nhiên.

Tính đa dạng của thụ thể tế bào T. TCR nhận diện kháng nguyên do tế bào APC trình diện thông qua MHC. Như vậy TCR vừa phải gắn được với các vùng của MHC vừa phải gắn đặc hiệu với epitop của kháng nguyên. Vì thế sự tạo thành TCR của kháng nguyên cũng phải rất đa dạng. Tính đa dạng này có được là do sự sắp xếp lại gen của DNA trong tế bào T chưa chin khi đang biệt hoá trong tuyến ức. Trong TCR cũng chứa các vùng VDJ, sự tái tổ hợp giữa các gen V, D, J cũng sẽ tạo ra các TCR khác nhau giống như ở kháng thể vậy.

Cơ chế tạo thành kháng thể. Theo thuyết chọn lọc dòng (clon) của Burnett thì trong cơ thể đã có sẵn nhiều loại tế bào lympho có khả năng sản xuất kháng thể, mỗi loại thì nhận diện và phản ứng với một loại kháng nguyên. Khi còn ở giai đoạn bào thai nếu tế bào lympho nào phản ứng với kháng nguyên bản thân sẽ bị ức chế. Khi có kháng nguyên lạ xâm nhập, chúng sẽ lựa chọn tế bào lympho tương ứng, kích thích tăng sinh để tạo thành dòng tế bào sản xuất kháng thể. Những tế bào không phù hợp với kháng nguyên lạ sẽ không được tạo thành dòng.

Sự tạo thành kháng thể là một tập hợp các phản ứng do kháng nguyên kích thích. Kháng nguyên được tế bào APC xử lý và trình diện cho tế bào TH. Về phần mình, tế bào TH tiết ra interleukin để hoạt hoá tế bào B. Tế bào này biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất kháng thể (gọi là đáp ứng nguyên phát hay lần 1) và tế bào B nhớ. Tế bào B nhớ có đời sống dài, chúng còn hoạt động nhiều năm khi kháng nguyên đã hết. Khi kháng nguyên vào lần sau, cơ thể sẽ đáp ứng nhanh và mạnh hơn đó là do tế bào B nhớ biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất kháng thể (gọi là đáp ứng thứ phát hay lần 2). IX. Miễn dịch qua trung gian tế bào

Miễn dịch qua trung gian tế bào gọi tắt là CMI ( cell mediated immulity) có tầm quan trọng chống lại virus, Ricketsia, vi khuẩn (đặc biệt là vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis) sống bên trong tế bào và trong miễn dịch ung thư cũng như trong thải bỏ mô ghép.

248

Đảm nhiệm vai trò trong CMI là các tế bào T, trước hết là tế bào TC. Tế bào này nhận mặt kháng nguyên khi chúng gắn với MHC. Bất kể tế bào nào mang kháng nguyên lạ. chẳng hạn tế bào mô ghép không tương đồng, tế bào nhiễm virus, đều bị tế bào TC tiết ra perforin-chất độc từ bọng nằm trong tương bào chui qua màng sinh chất của tế bào đích để tiêu diệt tế bào đích.

Lympho TDTH gây quá mẫn muộn, chúng chủ yếu đóng vai trò trong dị ứng và viêm mãn tính. Sự tăng đột ngột lymphokin do tế bào này tiết ra gây triệu chứng viêm da do tiếp xúc.

Tế bào giết tự nhiên gọi tắt là tế bào NK (Natural killer cells) là các tế bào nhiều hạt lớn trong tế bào chất. Chúng không phải là tế bào T hay B, nhưng có khả năng giết tế bào ung thư và tế bào nhiễm virus như tế bào TC, chỉ khác ở chỗ không cần có sự kích thích của kháng nguyên đặc hiệu. Tuy nhiên cũng giống như tế bào TC, trước tiên tế bào NK phải tiếp xúc với tế bào chứa kháng nguyên lạ sau đó mới tiết độc tố để giết tế bào. Cho đến nay người ta vẫn chưa thấy thụ thể của tế bào NK cần cho việc làm tan tế bào đích.

Các tế bào T cũng tiết ra các chất điều biến (modulator) như các interleukin, interferon tham gia vào sự điều hoà miễn dịch kích thích tế bào B sản xuất kháng thể.

Các lymphokin khác như yếu tố hoá ứng động hấp dẫn đại thực bào nơi có kháng nguyên, yếu tố ức chế di tản ngăn cản đại thực bào ra khỏi vùng chứa kháng nguyên. Yếu tố hoạt hoá đại thực bào, kích thích tế bào này làm nhiệm vụ hiệu quả hơn v.v.... X. Bổ thể

Bổ thể (complement) là một nhóm protein huyết thanh có đặc điểm hoá học và miễn dịch học khác nhau, có khả năng phản ứng với nhau, với kháng thể và với màng sinh chất của tế bào. Hệ thống bổ thể bao gồm 9 protein được ký hiệu là C (từ C1 đến C9), các yếu tố B, D và propecdin. Các bổ thể muốn hoạt động phải được hoạt hoá. Sự hoạt hoá này theo kiểu phản ứng dây chuyền. Một bổ thể sau khi được hoạt hoá sẽ kích thích để hoạt hoá bổ thể tiếp theo.

Có hai cách hoạt hoá bổ thể. Cách thứ nhất phát hiện sớm hơn gọi là hoạt hoá theo con đường cổ điển. Cách thứ hai phát hiện sau gọi là hoạt hoá theo con đường nhánh hay con đường propecdin. Hai con đường này chỉ khác nhau giai đoạn đầu, ở phần chót lại giống nhau.

Hoạt hoá theo con đường cổ điển cần có sự tham gia của các bổ thể C1, C4, C2 và kháng thể. Có thể chia ra làm sáu bước:

249

1. Tạo phức hệ kháng nguyên- kháng thể để hoạt hoá C1.C1 gồm 3 protein hợp thành: C1q, C1r và C1s. Khi C1 gắn vào phần của FC của 2IgG (thuộc loại IgG1, IgG2, IgG3 thuộc IgM) nằm kề nhau, thì C1q được hoạt hoá. Tiểu phần này sau khi được hoạt hoá sẽ kích thích C1r, C1r được hoạt hoá sẽ kích thích C1S, C1S đã hoạt hoá sẽ tham gia hoạt hoá C4 và C2.

2. C1S đã hoạt hoá sẽ xức tác để tách đôi C4 thành C4a và C4b. Mảnh C4b sẽ gắn vào màng nguyên sinh chất của tế bào và vào C2 tạo thành C4bC2, C1S đã hoạt hoá, tiếp tục tách đôi C2 thành C2a và C2b. C4b kết hợp với C2a thành C4b2a, đó chính là convertase C3 (enzyme bổ C3).

3. Dưới tác dụng của C4b2a, C3 bị tách thành 2 mảnh là C3a và C3b. C3b gắn với C4b2a thành C4b2a3b đó chính là convertase C5 (enzyme bổ C5).

4. Dưới tác dụng của C4b2a3b, C5 bị tách thành 2 mảnh là C5a và C5b.

5. C5b gắn vào tế bào đích và vào C6 để tạo phức hợp C5b6 sau đó gắn với C7 để tạo thành C5b67. Phức hợp này bám vào lớp lipid kép của màng sinh chất.

6. C5b67 bám vào C8 sau đó bám tiếp vào C9 tạo thành phức hợp tấn công màng C5b6789 khoan lỗ thủng, làm thoát nội chất và giết chết tế bào.

Hoạt hoá theo con đường nhánh không cần có sự tham gia của kháng thể, nhưng cần đến yếu tố B, D và propecdin thay cho các bổ thể C1, C2, C4 để dẫn đến tạo thành enzyme hoạt hoá C3.

Yếu tố B gắn với C3b tạo phức hợp C3bB. Khi gắn với C3b, yếu tố B để lộ vị trí chịu sự tác động của yếu tố D và bị tách ra thành Ba và Bb. Mảnh Bb được giữ lại tạo thành phức hợp C3bBb, đó chính là convertase C3 dùng để bổ C3. C3bBb gắn thêm C3b tạo thành C3bBb3b chính là convertase C5. Từ đây sự hoạt hoá bổ thể sẽ diễn ra giống như ở con đường cổ điển.

Sự hoạt hoá bổ thể được điều hoà bởi các chất ức chế. Chất bất hoạt C1 là C1-INH, còn chất bất hoạt C3b là yếu tố I, yếu tố H cạnh tranh với yếu tố B để gắn với C3b ngăn cản sự tạo thành C3bBb.

Sự hoạt hoá bổ thể dẫn đến nhiều hậu quả sinh học, trước hết là làm tan tế bào nhờ phức hệ tấn công màng (C5b6789). C3b vừa gắn với thụ thể của vi khuẩn, virus vừa gắn với đại thực bào, do đó làm tăng khả năng thực bào. C3b bao phủ quanh tế bào đích sẽ làm tăng khả năng tiêu diệt tế

250

bào đích của tế bào K trong hiệu ứng ADCC (gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể).

Hình 11.9a: Hoạt hoá và điều hoà theo con đường cổ điển Cả hai con đường đều tạo thành convertase C3: C4b2a( con đường cổ điển) và

C3bBb (con đường nhánh). Các enzyme này gắn với C3b để tạo thành covertase C5: C4b2a3b (con đường cổ điển) C3bBb3b (con đường nhánh).

Hình 11.9b: Sự hình thành phức hệ tấn công màng

(Phần Fab của kháng thể đặc hiệu bám vào tế bào đích, còn phần FC

bám vào tế bào K, giúp cho tế bào K diệt tế bào đích). C3a và C5a là độc tố gây phản vệ, chúng tham gia vào sự giải phóng

histamin khỏi tế bào Mast. C3a và C5a cũng là chất hoá ứng động, chúng lôi kéo bạch cầu trung tính vào nơi tập trung kháng nguyên lạ để làm nhiệm vụ thực bào.

251

XI. Miễn dịch bệnh lý 1. Quá mẫn là những tổn thương bệnh lý xẩy ra do một đáp ứng miễn dịch quá mức và không hợp lý, gây huỷ hoại mô. Quá mẫn không biểu hiện ngay sau khi tiếp xức với kháng nguyên lần đầu, mà chỉ ở những lần tiếp xúc sau. Gell và Combs đã chia quá mẫn ra là 4 loại.

* Quá mẫn tip I hay quá mẫn tức thì được đặc trưng bởi các phản ứng dị ứng, xẩy ra nhanh (<30phút) ngay sau khi tiếp xúc với kháng nguyên vào lần hai, nguyên do là IgE được hình thành gắn vào thụ thể FC của tế bào mast, phần Fab của hai IgE nằm kề nhau gắn chéo với kháng nguyên, dẫn đến làm thay đổi cấu trúc không gian của thụ thể, gây biến đổi tại chỗ màng, làm thoát các bọng rồi từ bọng giải phóng các chất trung gian hoạt mạch như histamin (gây co thắt cơ trơn), serotonin (tăng tính thấm thành mạch), heparin (kìm hãm động mạch, ECF-A-yếu tố hoá hướng động bạch cầu trung tính).

Sự hoạt hoá tế bào Mast cũng dẫn đến việc tổng hợp các chất mới như phản ứng chậm (SRS-A làm tăng tính thấm thành mạch) và yếu tố hoạt hoá tiểu cầu (PAF, gây ngưng kết tiểu cầu và giải phóng histamin).

Quá mẫn típ I có thể biểu hiện toàn thân như sốc phản vệ, sốc do dị ứng với thuốc, sốc do dùng huyết thanh điều trị hoặc bệnh chết trong nôi (kháng thể chống protein có trong sữa bò). Quá mẫn loại này cũng có thể biểu hiện cục bộ như hen phế quản và viêm mũi dị ứng).

* Quá mẫn típ II hay quá mẫn gây độc tế bào xẩy ra khi kháng thể gắn trực tiếp với kháng nguyên trên bề mặt tế bào cùng với sự tham gia của bổ thể và các tế bào hiệu ứng (tế bào K, tiểu cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân hay đại thực bào) dẫn tới làm tan tế bào đích, chẳng hạn tế bào đích gắn với kháng thể đặc hiệu, hoạt hoá bổ thể tạo phức hợp C5b-9 tấn công màng tế bào đích, đồng thời mảnh C3b có thể bám quanh tế bào đích và bám vào đại thực bào thực hiện opsonin hoá, giúp đại thực bào diệt tế bào đích.

Quá mẫn típ II thể hiện rất rõ trong các trường hợp sau: Khi truyền máu không phù hợp, chằng hạn truyền máu nhóm A cho

người có nhóm máu B thì sẽ làm tan máu của kháng thể (IgM) của nhóm A sẽ kháng lại kháng nguyên B người nhận.

Phản ứng kháng nguyên-kháng thể sẽ hoạt hoá bổ thể gây hiện tượng tan hồng cầu của người nhận máu, gây tổn thương thận do tắc nghẽn bởi một lượng lớn màng hồng cầu và gây độc do giải phóng phức hợp hem (C34H23O4N4Fe).

252

Bảng 11.1: Sơ đồ nhóm máu

Nhóm Kháng nguyên Kháng thể Nhóm có thể thận

AB A&B Không có kháng thể AB, O, A, B (nhận toàn năng)

A A Kháng thể kháng B A, O

B B Kháng thể kháng A B, O

O Không có Kháng thể kháng A, kháng B

O (cho toàn năng)

O Nhóm máu Rh: khi bố mang máu Rh+ và mẹ mang máu Rh- thì 50%

đứa trẻ chào đời mang Rh+. Nếu thai nhi mang Rh+ thì hồng cầu có thể truyền sang mẹ, kích thích tạo kháng thể kháng Rh. Kháng thể này có thể truyền cho con qua nhau thai gây tan hồng cầu của thai nhi. để tránh tai hoạ cho lần có thai sau, người ta phải tiêm cho mẹ kháng thể kháng Rh (RhoGAM) để loại bỏ kháng nguyên Rh ở cơ thể mẹ.

Bệnh ban xuất huyết xảy ra khi phần tử thuốc (hapten) gắn xung quanh tiểu cầu, lúc đó chúng trở thành kháng nguyên mạnh. Kháng thể chống phức hợp này gây huỷ tiểu cầu khi có mặt bổ thể. Vì tiểu cầu cần cho sự đông máu nên nếu thiếu sẽ gây xuất huyết trên da.

* Quá mẫn típ III hay phức hợp miễn dịch khác với quán mẫu típ II ở chỗ kháng thể chống lại với kháng nguyên hoà tan phân bố rộng rãi trong máu.

Khi tiêm kháng nguyên vào cơ thể sẽ kết hợp với kháng thể kết tủa có sẵn tạo thành phức hợp kháng nguyên- kháng thể rồi lắng đọng vào giữa các tế bào nội mô và màng đáy mao mạch. Hiện tượng này kéo theo sự hoạt hoá dòng bổ thể tạo C3a và C5a (các chất gây phản vệ) làm tăng tính thấm thành mạch (gay phù nề). Các thành phần khác là các chất hoá

253

ứng động, thu hút bạch cầu trung tính. Cùng với tiểu cầu, các tế bào này tập trung gây ghẽn mao mạch. Bạch cầu trung tính hoạt hoá sẽ tiết enzyme protease, colagenase và các chất hoạt mạch gây viêm loét. Kết quả là mao mạch đứt, xuất huyết dẫn đến hoại tử cục bộ. Hiện tượng này gọi là phản ứng Arthus.

Bệnh viêm cầu thận là một ví dụ của quá mẫn típ III. Phức hợp kháng nguyên-kháng thể đọng lại trong gian bào nội mô và màng đáy vách mao mạch gây viêm. Kháng nguyên có thể là vi khuẩn (sau nhiễm liên cầu), ký sinh (viên thận sau sốt rét ác tính ) protein lạ (viêm thận trong bệnh huyết thanh).

Bệnh huyết thanh: việc sử dụng kháng huyết thanh trong điều trị mang lại kết quả lớn (ví như virrut dại), song ở một số trường hợp có thể gây tai biến. Nguyên nhân là do phức hợp miễn dịch lắng đọng trong thành mạch máu.

Bệnh phức hợp miễn dịch liên quan đến nhiễm trùng (Rheumatic fever): khi bị viêm họng do Streptococcus gây ra, kháng nguyên thành tế bào chứa protein M kích thích tạo kháng thể. Tại màng tim, thận, khớp cũng có protein này, do vậy kháng thể kháng vi khuẩn gây phản ứng chéo với các thành phần của cơ thể gây viêm (màng tim, thận, khớp). Ví dụ: viêm cầu thận

* Quá mẫn típ IV hay quá mẫn muộn là tổn thương do sự tương tác giữa kháng nguyên với các lympho T đã mẫn cảm với các kháng nguyên đó gây ra. Phản ứng xẩy ra muộn, sau 24 giờ hoặc hơn. Các thương tổn có thể do tế bào TC phá huỷ tế bào đích đã có các kháng nguyên đặc hiệu bám trên bề mặt hoặc do tác động của lymphokin do lympho T tiết ra, có tác dụng làm cho đại thực bào tập hợp quá nhiều, nhập lại thành tế bào khổng lồ (u hạt).

Quá mẫn do tiếp xúc là một ví dụ. Một số chất như niken, cromat, các hoá chất trong cao su, đồ hoạ, mỹ phẩm...có trong lượng phân tử (<1kDa) nên là hapten. Khi thấm qua biểu bì, gặp protein sẽ trở thành chất công hợp hapten protein thải (kháng nguyên) kích thích lympho T, đặc biệt là TC. Mối tương tác giữa lympho T này với hapten bám trên da đã gây phản ứng viêm da. 2. Bệnh tự miễn

Bình thường cơ thể không sinh đáp ứng miễn dịch chống lại kháng nguyên bản thân. Khi tính tự dung nạp bị mất và cơ thể không còn khả năng phân biệt kháng nguyên bản thân với kháng nguyên lạ thì sẽ gây đáp ứng miễn dịch chống lại kháng nguyên bản thân và dẫn đến bệnh tự miễn.

254

Bệnh tự miễn có thể thuộc quá mẫn típ II, III hoặc IV. Sau đây là một số ví dụ:

+ Bệnh Grave (Típ II) là do kháng thể gắn vào thụ thể của tế bào tuyến giáp dành cho hocmon kích thích tuyến giáp. Hocmon này do tuyến yên sinh ra. Kết quả là tuyến giáp bị kích thích sản ra một lượng ngày càng lớn hocmon tuyến giáp dẫn đến bướu cổ do tuyến giáp phìng to.

+ Bệnh nhược cơ (Típ II) làm cho cơ thể suy yếu. Ấy là do kháng thể gắn vào thụ thể dành cho axetylcholin tại điểm nối xung thần kinh cơ. Do không tiếp nhận xung thần kinh do phân tử axetylcholin, cơ sẽ bị yếu, hô hấp dừng, dẫn đến tử vong.

+ Luput ban đỏ hệ thống (SLE) (típ III) là bệnh tạo trên vùng ban đỏ hình bướm hay mặt sói. Nguyên nhân do tạo thành kháng thể chống DNA dạng xoắn kép hoặc sợi đơn (gọi chung là kháng thể kháng nhân). Phức hợp miễn dịch lắng đọng ở cầu thận, hoạt hoá bổ thể, thu hút bạch cầu hạt gây viêm cầu thận.

+ Bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin (Típ IV) do kháng thể đặc hiệu tiêu diệt tế bào tuyến tuỵ sản sinh insulin. Việc thiếu insulin làm cho lượng đường trong máu tăng dẫn đến mù loà và hoại thư.

Suy giảm miễn dịch: Suy giảm miễn dịch là sự đáp ứng miễn dịch không đầy đủ. Nguyên nhân có thể do sự khiếm khuyết hệ thống miễn dịch mang tính bẩm sinh, do sai sót hoặc thiếu các gen của hệ thống miễn dịch mang tính bẩm sinh, do sai sót hoặc thiếu các gen của hệ thống miễn dịch nhận từ cha mẹ hoặc có thể mắc sau khi dùng thuốc, bị ung thư hoặc sau khi nhiễm trùng.

Ví dụ: bệnh Hodgkin (ung thư) làm giảm đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào hoặc nhiều loại virus giết các tế bào của hệ thống miễn dịch (HIV).

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) Virus HIV là virus Retro mang genom RNA một sợi và enzyme

phiên mã ngược. Bao bọc capsit là vỏ ngoài liporotein. Trên mặt vỏ ngoài chứa các gai glycoprotein với trọng lượng phân tử 120 kDa nên gọi tắt là gp 120. Các gai này gắn vào thụ thể CD4 nằm trên mặt tế bào TCD4 và đại thực bào là tế bào đích chính của HIV.

Sau khi xâm nhập vào tế bào, virus cởi bỏ ỏ ngoài nhờ enzyme tiêu hoá của tế bào sau đó sợi RNA virus được sao thành DNA đơn nhờ enzyme sao mã ngược. Sợi DNA mới tổng hợp được dùng làm khuôn để tổng hợp sợi DNAmới theo cơ chế bổ sung. Hai sợi xoắn vào nhau tạo sợi DNAxoắn kép.

255

DNA kép này gắn xen vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ nhờ enzyme integrase và nằm ở đó dưới dạng porvirus. Một bản sao DNA có thể nằm im trong tế bào vài tháng đến vài năm. Gen HIV được biểu hiện khi có sự kích thích của yếu tố phiên mã của tế bào chủ gắn vào 2 đầu lặp lại dài của provirus. Sự kích thích này dẫn đến tạo thành các RNA khác nhau, một số là RNA genom của virus, một số là RNA thông tin dùng để tổng hợp protein vỏ capsid. Vỏ capsid kết hợp với RNA genom tạo thành hạt virus (virion) chui ra ngoài để lặp lại vòng đời mới ở tế bào CD4 khác.

Chỉ một thời gian ngắn sau khi nhiễm đã có 1-100 tế bào chứa HIV. Lúc đầu cơ chế bảo vệ của cơ thể làm giảm tốc độ nhân lên của virus nhưng sau chung vượt qua và nhiễm ngày càng nhiều vào các tế bào T. Dựa vào số lượng tế bào T trong máu để xác định mức độ nhiễm. Nếu lượng tế bào T4 trong máu xuống dưới 600/μ, bệnh nhân bắt đầu mất đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và dẫn đến nhiễm bệnh cơ hội. Khi mới bắt đầu nhiễm nhiều dòng tế bào B được hình thành và trong huyết thanh chứa một lượng lớn IgG, IgM và IgA nhưng ở giai đoạn sau của AIDS, lượng kháng thể giảm đột ngột và các kháng thể kháng gp 120 cũng giảm theo.

Liệu pháp thành công nhất để chống HIV là dùng Dideoxynucleozit, chủ yếu là azidotimidin hoặc zidovudin. Các chất này ức chế enzyme phiên mà ngược của HIV và do đó cản trở sự tổng hợp DNA của virus. Cho đến nay mọi loại thuốc cũng chỉ làm giảm sự tiến triển thành AIDS. Cách tốt nhất vẫn là phòng chống, ngăn sự lây lan theo các con đường quan hệ tình dục, tiêm chích ma tuý và truyền máu đã nhiễm. XII Các phản ứng huyết thanh

Kháng thể tồn tại trong huyết thanh miễn dịch, do đó các phản ứng miễn dịch dùng kháng huyết thanh gọi là phản ứng huyết thanh học. Phản ửng huyết thanh dùng đề chẩn đoán kháng nguyên hoặc kháng thể khi đã biết một trong hai thành phần, gọi là phương pháp chẩn đoán huyết thanh học.

Sự kết hợp giữa kháng nguyên-kháng thể hay đúng hơn là giữa epitop và paratop dựa trên ba lực liên kết: lực Vander-wals, lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức và lực liên kết giữa các liên kết hydro.

Phản ứng xảy ra theo hai pha, pha đầu gọi là pha đặc hiệu hay pha không nhìn thấy xẩy ra nhanh, đặc trưng bởi sự hấp phụ kháng nguyên.

Pha sau xẩy ra chậm, biểu hiện ra ngoài có thể nhìn tháy được như kết tủa hoặc ngưng kết. Phản ứng kháng nguyên-kháng thể phụ thuộc vào điều kiện pH, nhiệt độ, chất điện giải , các ion Na+, Cl-, Mg++.

256

Nhiều phản ứng xảy ra khó nhận biết do đó cần các chất chỉ thị như hồng cầu, thuốc nhuộm huỳnh quang, chất phóng xạ.

Sau đây là các phản ứng chính: + Phản ứng kết tủa: Khi cho kháng thể phản ứng với kháng

nguyên hoà tan ở nồng độ chuẩn sẽ xuất hiện kết tủa. Phản ứng bị ức chế khi quá thừa một trong hai thành phần trên. Phản ứng dùng để xác định kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc xác định kháng thể khi đã có sẵn kháng nguyên hoà tan đặc hiệu. Có thể thực hiện phản ứng kết tủa trong thạch, kháng nguyên và kháng thể khuếch tán trong thạch, nơi gặp nhau tạo thành vòng cung kết tủa.

+ Phản ứng ngưng kết tương tự như phản ứng kết tủa, nhưng đòi hỏi kháng nguyên hữu hình có kích thước lớn như hồng cầu, tế bào vi sinh vật. Kháng nguyên liên kết chéo với kháng thể kết dính với nhau tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy bằng mắt thường.

Cho kháng nguyên vào dãy ống nghiệm chứa kháng nguyên huyết thanh với độ pha loãng tăng dần. Hiệu giá kháng thể (titer) là ở độ pha loãng cao nhất mà vẫn xẩy ra ngưng kết.

Ví dụ với độ pha loãng 1/20, 1/40, 1/80.... 1/640 đều ngưng kết thì 1/640 là hiệu giá kháng thể.

+ Phản ứng trung hoà xẩy ra khi kháng thể bao vậy trung hoà ngoại độc tố vi khuẩn hoặc bao vây virus.

Ví dụ kháng thể bao quanh virus gây ngưng kết hồng cầu do đó hồng cầu không bị virus làm ngưng kết.

+ Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang dựa trên nguyên tắc là thuốc nhuộm khi bị kích thích bởi bức xạ có bước sóng đặc biệt sẽ phát sáng chẳng hạn fluorescein phát huỳnh quang màu vàng lục còn rodamin phát huỳnh quang màu da cam. Một trong hai thành phần (kháng nguyên hoặc kháng thể) được gắn với thuốc nhuộm. Sau khi phản ứng kháng nguyên-kháng thể xẩy ra, rửa phần không tham gia phản ứng, rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.

+ Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ dựa trên sự cạnh tranh giữa kháng nguyên đánh dấu động vi phóng xạ (ví dụ 125I) (đã biết) với kháng nguyên không đánh dấu (cần biết) gắn vào kháng thể đặc hiệu chuẩn.

Bước 1: Trộn kháng nguyên đánh dấu phóng xạ với kháng thể chuẩn, sau đó ủ, rửa kháng nguyên thừa (không tham gia phản ứng). Đo độ phóng xạ (A).

Bước 2: Trộn kháng nguyên đánh dấu và kháng nguyên không đánh dấu với kháng thể. Sau đó ủ và rửa kháng nguyên thừa không gắn với

257

kháng thể. Đo độ phóng xạ (B). So sánh độ phóng xạ ở A và B có thể suy ra lượng kháng nguyên cần xác định.

Kỹ thuật ELISA (kỹ thuật chất hấp phụ miễn dịch gắn enzyme-enzyme-Linked Inmunosorbent Assay) nguyên tắc của kỹ thuật này giống như miễn dịch huỳnh quang nhưng khác ở chỗ thay vì gắn kháng thể với thuốc nhuộm huỳnh quang thì người ta gắn kháng thể với một enzyme. Sau đó phản ứng kháng nguyên-kháng thể, người ta cho thêm cơ chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ phản ứng đặc hiệu kháng nguyên với kháng thể. Đo cường độ màu là biết được nồng độ kháng nguyên cần phát hiện.

Câu hỏi ôn tập chương 11 1.Hãy phân biệt miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu (khả năng đề

kháng). Miễn dịch đặc hiệu gồm những loại miễn dịch nào ? 2.Hãy phân biệt chất sinh miễn dịch, kháng nguyên và hapten. Hãy

nêu tính chất cơ bản của kháng nguyên. Quyết định kháng nguyên (epitop) là gì ?

3.Vẽ sơ đồ cấu tạo kháng thể. Vùng nào của kháng thể giữ vai trò gắn kháng nguyên. Các lớp kháng thể có chức năng gì ?

4.Kể tên các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch. Nêu sự khác nhau cơ bản giữa tế bào T và B.

5.Nêu sự khác nhau cơ bản giữa tế bào TH và TC. Chúng đảm nhiệm chức năng gì trong đáp ứng miễn dịch.

6.TRC là gì ? Nó tham gia vào hoạt hoá tế bào T như thế nào ? 7.Thế nào là thụ thể tế bào B, chúng tham gia vào hoạt hoá tế bào B

như thế nào ? 8.Thế nào là tế bào trình diện kháng nguyên (APC). Hãy mô tả quá

trình chế biến kháng nguyên. 9.Phân tử MHC là gì ? chúng có chức năng gì trong trình diện kháng

nguyên ? 10. Hãy trình bày quá trình trình diện kháng nguyên với sự tham gia

của MHC-I và MHC-II. 11.Hãy trình bày quá trình hình thành kháng thể. Tại sao cơ thể có

tiềm năng to lớn trong việc hình thành kháng thể để chống lại mọi kháng nguyên có thể có trong tự nhiên.

12.Bổ thể được hoạt hoá như thế nào và đóng vai trò gì trong đáp ứng miễn dịch.

258

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. T ÀI LI ỆU TI ẾNG VI ỆT 1.Vũ Triệu An, Homberg,J.C. (1998). Miễn dịch học. Nhà xuất bản

Y học Hà Nội. 2.Nguyễn Thị Chính, Ngô Tiến Hiển, 2001. Virus học, Nxb 3.Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. 1977. Vi

sinh vật học. NXB Giáo dục. Hà Nội 4.Nguyễn Thành Đạt. 1999. Cơ sở sinh học vi sinh vật. NXB Giáo

dục. Hà Nội

5.Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo dục, Hà Nội.

6.Phạm Bá Kim, 2004. Vi sinh vật đất. Trường Đại học Cần Thơ.

7.Võ Thị Thương Lan. 2002. Sinh học phân tử. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

8.Nguyễn Bá Lộc. 1997. Hoá sinh. NXB Giáo dục. Hà Nội.

9.Phạm Hồng Sơn, Phan Văn Chinh, Nguyễn Thị Thanh & Phạm Quang Trung. 2002. Vi sinh vật học thú y. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

10.Trần Thị Thanh. 2001. Công nghệ vi sinh. NXB Giáo dục, Hà Nội.

11.Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Đường, Nguyễn Khắc Tuấn & Nguyễn Bá Hiên. 2004. Vi sinh vật học đại cương. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

12.Lê Đức Trình. 2001. Sinh học phân tử của tế bào. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

13.Lê Xuân Phương. 2001. Vi sinh vật công nghiệp. NXB Xây dựng. Hà Nội.

II. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14.Cann A. J. 2001. Principle of molecular virology. Academic

Press, San Diego. 15.Collier L. H. & Timbury M. C. (ed.) 1990. Topley & Wilson's

Principles of bacteriology, virology and immunology (8th ed.), vol. 4, Edward Arnold, London.

259

16.Fenner F. J., Bachmann P. A., Gibbs E. P. J. et al. 1993. Veterinary virology (2nd ed.) Academic Press, Orland.

17.Johnson L. G. 1983. Biology. Wm. B. Co. Publisher, Dubuque, Iowa.

18.Karp G. 2002. Cell and molecular biology, Concepts and experriments, 3rd edition. John Wilson & Sons, Inc., New York.

19.Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. 1993. Principles of Biochemistry. Second Edition. Worth Publishers. New York.

20.Linton A. H. & Dick H. M. (ed.) 1990. Topley & Wilson's Principles of Bacteriology, Virology and Immunology (8th ed.), vol. 1, Edward Arnold, London.

21.Mikami T. (ed.) 1995. Juui biseibutsu gaku [Vi sinh vật học thú y] (Tiếng Nhật), Buneidou shuppan, Tokyo.

22.Prescot Harley Klein, 2002. Microbiology. W. C. Brown publisher, USA.

23.Pham H.-S., Kiuchi A. & Tabuchi K. 1999. Methods for rapid cloning and detection for sequencing of cloned inverse PCR-generated DNA fragments adjacent to known sequences in bacterial chromosome. Microbiol. Immunol. 43: 928-836.

24.Ronald M. 1995. Principles of Microbiology University of Louisville. Kentucky. Mosby.

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ADP Adenosine diphosphate AMP Adenosine monophosphate APG Acid 3-phosphoglyceric A-1,3-DPG Acid 1,3 diphosphoglyceric ATP Adenosine triphosphate A-6PA Acid 6-penicillanic CoA Coenzyme A CKS Chất kháng sinh DNA Deoxiribonucleic acid R-1,5-DP Ribulose-1,5-diphosphate R-5-P Ribulose-5-diphosphate RNA Ribonucleic acid VSV Vi sinh vật F-6-P Fructose-6-phosphate FAD Flavin adenine dinucleotide G-6-P Glucose-6-phosphate GAP Glyceraldehyde phosphate KDPG 2-Keto-3-deoxi-6-phosphogluconate N Nitrogen NAD Nicotinamid adenine dinucleotide dạng oxi hóa NADH Nicotinamid adenine dinucleotide dạng khử NADP Nicotinamid adenine dinucleotide phosphat dạng oxi hóa NADPH Nicotinamid adenine dinucleotide phosphat dạng khử PP Pentose phosphate X-5-P Xylulose-5-phosphate

Người biên soạn

Biên soạn các chương

1. PGS.TS. Kiều Hữu Ảnh 8 2. TS. Biền Văn Minh (Chủ biên) 1, 6, 7, và 9 3. TS. Phạm Ngọc Lan 4, 5 4. ThS. Nguyễn Thị Thu Thủy 2 5. TS. Phạm Hồng Sơn 10 6. PGS.TS. Phạm Văn Ty 3 và 11