N~unyn-Schmiedeberg's Arch. PharmacoI. 272, 143--155 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

0ber die Hemmung der Phosphofructokinase im Rahmen der StSrungen des Glykogenstoffwechsels

im Fettgewebe durch 6-Aminonicotinamid

N. OI~OI~,I-NKA~NSAtt u n d F. v. BI~UCm~AusE~

Pharmakologisches Institut der Freien Universit~t Berlin

Eingegangen am 13. August 1971

The I m p a i r m e n t of Glycogen Metabolism in Adipose Tissue by 6-Aminonicot inamide

as Inf luenced by the Inh ib i t ion of Phosphofructokinase

Summary. 1. The incorporation of [U-l~C]-glucose into tissue glycogen was studied on isolated rat epididymal adipose tissue in the presence of 6-aminonicotin- amide with and without insulin, and compared with the 14CO~-output.

2. Although tissue glucose uptake is decreased incorporation of [t4C]-glueose into tissue glycogen increases in the presence of 6-aminonicotin~mide, the value reaching the 7 fold that of control assays on addition of insulin.

3. A 660/0 inhibition of adipose tissue phosphofructokinase is produced by the NAD-analogue of 6-aminonicotinamide, 6-ANAD (2 nd charge; 3• 10-aM). The in- hibition of the enzyme from rabbit muscle by 6-ANAD (1 st charge; 2• 10-aM or 10-4M) proves to be non-competitive using fructose-l,6-diphosphate and adenosine diphosphate as substrates. The inhibitor constant (Ki) of the enzyme for 6-ANAD with fructose 1,6-diphosphate as substrate is 1.57 • 10-4M. 6-ANADP (2 • 10-aM or 10-~M) is ineffective.

4. The effect of this inhibition on the glycogen metabolism together with other inhibitions caused by 6-aminonicotinamide-analogues on the 6-phosphogluconate dehydrogenase, glucose-6-phosphate-dehydrogen~se, and phosphorylase-b-kinase is discussed.

Key words: 6-Aminonicotinamide -- 6-Aminonieotim~mide Adenine Dinucleo- tide (Phosphate) -- Epididymal Adipose Tissue -- Glucose Incorporation into Tissue Glycogen -- Phosphofructokinase.

Einleitung I n v i t ro -Untersuchungen am Fet tgewebe haben gezeigt, dub in Gegen-

wart yon 6-Aminonicot inumid (6-AN) 1 a n d Insu l in der E i n b a u markier ter Glucose ins Fet tgewebsglykogen st~rk ansteigt. Gleichzeitig verminder t

1 Abkiirzungen. Siehe S. 144.

144 N. Ofori-Nkansah und P. v. Bruchhausen:

sieh die 14C02-Bildung aus 14C-Glucose. Dies wird als Folge einer ver- ringerten Glucoseaufnahme in die Fettze]le durch 6-ANAD gedeutet, ein Analoges des NAD, das dureh Austausch yon Nieotinamid durch 6-Amino- nicotinamid im Gewebe entsteht (v. Bruehhausen u. Herken, 1966). Der Befund 1/il?t daran denken, dab entweder der Abbau des Glykogens zu Glucose durch die Glykogenphosphorylase unter 6-AN verlangsamt wird oder aber sein Aufbau durch die Glykogensynthetase stimuliert wird oder beides.

Die f/Jr die Aktivierung der inaktiven Form der Muskelphosphorylase n6tige Phosphorylase-b-Kinase wird in vitro durch 3" 10-~M 6-ANAD zu 50~ gehemmt. Die aktive Form der Leberphosphorylase sinkt bei Gabe yon 6-AN (100 mg/kg t{attc) signifikant ab (v. Bruchhausen, 1964 b). 16 Std naeh der 6-AN-Gabe steigt die Glykogenmenge der Leber in der Hunger- phase wieder an (v. Bruchhausen, 1964b; v. Herrath, 1968) und wird durch eine gesteigerte Ausschiittung yon Glucoeorticoiden verursacht, die eine verst/irkte Glueoneogenese hervorrufen (v. Herrath, 1968). Zur Erkls des starken in vitro-Anstiegs des Fettgewebsglykogens er- seheinen diese Befunde nieht ausreichend.

Das AusmaB des Glykogenaufbaus ist nicht nur yon der Aktivit~t aufbauender Enzyme, sondern aueh yon der Konzentration der Ausgangs- substrate abh~ngig. Als wichtigstes Schliisselenzym ira Anfangsteil der Glykolyse, das im Fettgewebe die intraee]lnl/~re Konzentration yon Fructose-6-phosphat und Glucose-6-phosphat beeinfluBt, wird die Phosphofructokinase (ATP-D-Fructose-6-phosphat 1-phosphotransferase, EC 2.7.1.11) angesehen (Weber et al., 1960, 1965; Orevi et al., 1969). Es wird daher die Wirkung yon 6-Aminonicotinamid bzw. seinen NAD(P)- Analogen [6-ANAD(P)] auf die Aktivit/it dieses Enzyms untersucht, zu- real sieh aueh andere Phosphokinasen in vitro durch 6-ANAD hemmen lassen (v. Bruehhausen, 1964a, 1964b).

1 Ablsiirzungen. 6-AN 6-Aminonicotinamid; 6-ANAD(P) 2 6-Aminonicotin- amid-adenin-dinucleotid(phosphat); (I. und II. Wahl), I. Wahl: reines 6-Aminoni- cotinamid-adenin-dinucleotid, II. Wahl: enthglt geringe Verunreinigungen yon Nicotinamid und Nicotinamid-adenin-dinucleotid; 3-AP 3-Acetylpyridin; 3-APAD 3-Acetylpyridin-adenin-dinucleo~id; G-6-P Glucose-6-phosphat; F-6-P Fructose- 6-phosphat; FDP Fructose-l,6-diphosphat; ADP Adenosindiphosphat; PFK Phosphofructokinase (ATP-n-Fruegose-6-phosphat 1-phosphotransferase, EC 2.7.1.11); Glykogensynthetase UDPG u-l,4-gluean ~-4-Glucosyltransferase (EC 2.4.1.11); G-6-PDH Glucose-6-phosphat Dehydrogenase, n-Glucose-6-phospha~: NADP-Oxidoreduktase (EC 1.1.1.49) ; PGI Phosphoglucose-Isomerase, D-G]ucose- 6-phosphaf-Ketol-Isomerase (EC 5.3.1.9); TIM Triosephosph~t-Isomerase, l)-Gly- cerinaldehyd-3-phosphat-Ketol-Isomerase (EC 5.3.1.1) ; GPDH Glycerin-phosphat- Dehydrogenase, D-Glyeerin-l-phosphat: NAD-Oxidoreduktase (EC 1.1.1.8).

6-ANAD 2 wurde uns freundlicherweise yon Prof. Coper, Berlin, fiberlassen, 6-ANADP wurde in unserem Institut hergestellt.

Hemmung der Phosphofruetokinase dureh 6~ANAD 145

Material und Methoden

Verwendete Substanzen 6-Aminonicotinamid (Fluka, Buehs/Schweiz); 6-Aminonieotinamid-adenin-

dinucleotid(phosphat) ; Insulin Kristallsuspension (40 E/ml; Hoeehst, Frankfurt a. M.) ; [U-i~C]-Glueose spez. Akt. 2,8 mCi/mmol resp. 15,7 ~Ci/mg (R.adioehemieal Centre, Amersh~m) ; Glykogen (Merck, Darmstadt) ; Gtueose-6-phosphat, Frue- tose-6-phosph~t, Fructose- 1,6-diphosph~t, Glueose-6-phosph~t-Dehydrogenase (Hefe) 5 rag/rot, PhosphogIueose-Isomerase (Here) 2 mg/ml, Phosphofruetokinase (Kaninehenmuskel) 10 mg]ml, Triose-phosphat-Isomerase (Kaninehenmuskel) 10 mg/ml und Glyeerin-l-phosphat-Dehydrogenase (Kaninchenmuske]) 10 mg/ml waren yon Boehringer Mannheim Gmbg, Mannheim.

Gewinnung des Fettgewebes Als Versuchstiere dienten Wistar-Ratten (Zfichter: Tieffarm Hoffmann, Berlin)

yon 160--200 g KSrpergewieht, die Troekenfutter ,,Altromin 1~10" der Firm~ Alt- rogge, Lage/Lippe, und Leitungswasser ad libitnm erhieIten. Naeh der Dekapitation der Tiere wurde das epididymale Fettgewebe sehnell und sehonend entnommen und der Randsehleier jeder Seite auf 8 Ansgtze verteilt. Das mittlere Gewebsgewieht (Feuehtgewieht am Ende der Inkubation) betrug durchsehnittlieh 250 rag.

l~C02-Bildung und Incorporation yon [U-l~C]-Glucose in t'ettgewebsglys

Die so gewonnenen Fettgewebsst/iekchen wurden in 25 ml Erlenmeyer-Kolben /iberf/ihrt, die mit doppelt durchbohr~em Gumiuistopfen versehen w~ren (Voss, 1969). Das Inkubationsmedium naeh Krebs u. Henseleit (1932) wurde mit l~ Gelatine angereichert, um Insulinveduste durch Anhaften an den Inkubations- gefEBen zu vermeiden (Narahara, Tomizawa, Miller u. Williams, 1955; Ball, Martin u. Cooper, 1959). Nach den Zusitzen (5 #mol D-Glucose/Ansatz) und den zu unter- suehenden Substanzen wurde das Inkubationsmedium mit 950/0 O2 und 5~ CO 2 10 rain durehperlt. Danaeh hatte es einen jeweils kontrollierten pH yon 7,4. Eine 2stiindige PrEinkubation war erforderlich, um eine ausreichende Bildung yon 6-AN- Analogen im Gewebe zu gewEhrleisten.

Die 4 stfindige Inkubation bei 37~ im Seh~ttel-Wasserbid erfolgte unter Vor- lage yon 1 ~Ci [U-l~C]-Glueose. Das entstandene i~CO2 wurde in einem dem Erlen- meyer-Kolben seitlieh eingehgngten Gliisehen aufgefangen, in das am Ende der Inkubation 0,4 ml Hyamin (p-Diisobutyleresoxy&thoxy~thyl-dimethylbenzyl- ammoniumhydroxyd, Fa. Packard Instruments) dureh die Versehlugkappe ein- gespritzt wurde. Zur Freisetzung yon Kohlendioxyd aus dem Ansatz wurde 0,25 ml 10~ H2SO 4 in d~s Medium eingespritzt. Die Hyaminproben wurden in Zg~hlgefs mi~ 10 ml Szintillatortoluol iibertragen und die ~adioaktivit~t im Triearb-Szin- tillationsspektrometer Mod.314 Ex3375 (Fa. Packard Instruments) unter Be- riieksiehtigung yon Leerwert und Quenehfaktor bestimmt.

Zur Aufbereitung der Glykogenfraktion wurden die Fettgewebsstiiekehen naeh der Hyamin-Einspritzung entnommen, die Kolben wieder versehlossen und behandelt wie oben. Die Fettgewebsstfickehen wurden 3mM mit Medium gewaschen, aufFiltrier- papier getroeknet, das Gewicht auf einer Torsionswaage ermittelt und in 10 ml Zentrifugengl~ser eingebraeht, die i0 mg Glykogen und 2 ml 30~/0ige KMilauge ent- hielten. Weitere Aufbereitung wurde naeh der Methode yon Good, Kramer u. So- mogyi (1933) ausgefiihrt und dureh 4maliges Wasehen mit J~thanol (Zentrifugieren

146 N. Ofori-Nkansah und F. v. Bruchhausen:

bei 3000 Rpm 15 min l~ng in Laborzentrifuge) yon begleitender gadioaktivitgt be- freit. Die so erhaltene Glykogenfraktion wurde mit 5 ml 1 N H~SO 4 3 Std im ko- chenden Wasserbad hydrolysiert und mit 2 N KOH neutralisiert. Zur Impuls- ausziihlung im Tricarb-Szintillationsspektrometer diente 0,2 ml des Neutralisations- produktes in einem Oemiseh yon 4 ml Athanol und 8 ml Szintillatortoluol.

Enzymatische Bestimmungen Die Gewinnung des Fettgewebes erfolgte wie eingangs beschrieben. Als Ex-

traktionsmedium diente ein 50 mM Trisacetat-Puffer pH 7,4 (Pogson u. Denton, 1967), der ~uBerdem 50 mM MgS04 und 2 mM EDTA statt ~thylenglycol-bis- (2-aminogthyl)-tetraessigs~ure (EGTA) enthielt. Die gewonnenen Fettgewebs- schleier wurdcn kurz in Extraktionspuffer gewasehen, auf Filtrierpapier abgetupft, gewogen und mit 3 Vol/g Fettgewebe Tris~cetat Puffer pit 7,4 im Potter-Homo- genisator bci 4~ homogenisiert. Das Homogenat wurde 2ma] bei 2800 g 20 rain lang bei 2~ in einer Phywe-Zentrifuge Mod.220 V3~50 HZ (Phywe AG., GSttingen) zentrifugiert. Der gelbe L~berstand wurde dekantiert und entweder sofort zur enzy- matischen Bestimmung verwendet oder im Kfihlschrank bei 4~ aufbewahrt.

Zur Bestimmung der Aktivitgt der Phosphofructokinase in den Fcttgewebs- homogen~ten diente die Umwandlungsreaktion von Fructose-6-phosphat fiber Fructose-l,6-diphosphat in Glycerin-l-phosphat. Als Hilfsenzyme dienten Aldo]ase, Triosephosphat-Isomerase und Glycerin-l-phosphat-Dehydrogenase. Die Bestim- mungen erfolgten ~n 50 mM Trisacetat-Puffer pH 7,4 (Pogson u. Denton, 1967) bei 340 m~ in Beckman DK 2 Spektrophotometer bei Zimmertemperatur. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Fruetose-6-phospha~ in Gang gesetzt und die Kinetik mit und ohne die zu testenden Subs~anzen gesehrieben. Die fibrigen Komponenten riefen keine Extblktions~nderungen hervor. Die gleiche 1V[ethode diente zur Bestimmung der Aktivit~t des Enzyms aus dcm Kaninehenmuskel unter dem EinfluB yon 6-ANADP. Die Bestimmungen erfolgten be[ 340 m~ in 0,1 M Tris-ItC1-Puffer pH 7,4 in Carl Zeiss-Spektralphotometer DMR 21 be[ Zimmertemperatur.

Unter Verzicht auf NAD-abh~ngige Reaktionssehritte wurcle an relativ reinem Enzym aus Kaninehenmuskel (Boehringer) die Messung in entgegengesetzter Rich- tung durchgefiihrt. Ausgehend vom Fructose-l,6-diphosphat wurde die im Gleieh- gewieht nicht begfinstigte Rfiekreaktion - - nEmlich die Bfldung yon Fructose-6- phosphat erzwungen. Das entstandene Fructose-6-phosphat wurde mit Hilfe von Phosphog]ucose-Isomerase in Glucose-6-phosphat fiberffihrt. Die Umwandlung des Glucose-6-phosphats in 6-Phosphog]ueonat unter der Einwirkung yon Glucose-6- phosphat-Dehydrogenase wurdc durch Messung der Extinktion bei der Reduktion yon NADP in NADPH 2 in 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,5 bei 340 m~ in Beck- man DK 2 Spektrophotometer bci Zimmertemperatur bis zum HSchstwert verfolgt.

In beiden Bestimmungsverfahren wurde bei der Berechnung des gebildeten NAD bzw. NADPH 2 ein Extinktionskoeffizient von 6,22 cm~/mol (Umbreit, Burris u. Stauffer, 1959) zugrunde gelegt.

Ergebnisse Wir k6nnen best~tigen, dab 6-Aminonicot inamid im Fettgewebe die

durch Insu l in stark angeregte 14CO2-Bfldung aufhebt . Dennoch erweist sich die Markierung des Fettgewebsglykogens aus [U-laC]-Glucose bei der gleichzeitigen Anwesenheit yon Insu l in und 6-Aminonicot inamid um mehr als das 6faehe erhSht (p < 0,0002). Aueh ohne Insu l in erhSht 6-Amino- n icot inamid (10-aM) die Markierung des Fettgewebsglykogens um ca.

Itemmung der Phosphofructokinase durch 6-ANAD 147

150~ (p = 0,02) und i iber t r i f f t somit die Erh6hung der Mark ie rung des Fe t tgewebsg lykogens durch Insul in, d ie ca. 70~ be t r~gt (Abb. 1).

Tab. 1 zeigt die W i r k u n g des 6 -Aminonico t inamids bzw. seines NAD- Analogen (6-ANAD) auf die A k t i v i t g t der Phosphof ruc tok inase des F e t t -

14C02-Bildung in nCi/ 10C -4h/100mg Fett- r

gewebe [

p- 0,008 ]

L

5C ~ } p 1 0,i

(~' Ko i-AN

10-3M

[

t p= 8 0,002

6

2

6-AN 0 10-3M ,

]nsu[in 1 mE/m[

Glykogenmarkierung in nCi/4h/ 100 mg Fettgewebe

p-r

I t

Ko 6-AN 10 -3 M ~ _ _

~•215215

6-AN 10-3M ,

Insulin I mElml Abb. 1. Wirkung yon 6-Aminonicotinamid auf den [U-14C]-Glucosestoffwechsel. Ans~tz (5 ml Endvolumen) enthielt 5 ~molD-Glucose, i 1 BCi [UJ4C]-Glucose, 2 h

Pr~inkubation + 4 h Inkubation

Tabelle 1. Hemmung der Aktivit~it der Phospho/ructokinase im Fettgeweb.~homogenat dutch 6-ANAD

NADH-Oxy- gemmung dation in Mol 10-9/min/g Fettgewebe ~

Ko I 77,3 -]= 0,7 6-ANAD (1,5 - 10-4M) 54,6 6-ANAD (3 �9 10 -a M) 26,5 6-ANAD (1,2 - 10 -3 M) 0,0

Ko I I 45,5 • 4,4 6-AN (10 -3 M) 46,2 3-AP (10 -~ M) 42

Ko I I I 66,0 3-APAD (10 -a M) 69,0 3-APAD (5, i0 -a M) 59,5 3-APAD (10 -3 M) 64,5

29,4 65,8

109

Der Ansatz yon 3 ml Endvolumen enthielt 10 ~mol F-6-P, 4 ~mol ATP, 7,5~mol MgS04, 0,6Fmol NADH, 20~zg Glycerin-l-phospha~-Dehydrogenase, 20 ~zg Triosephosphat-Isomerase, 60 ~zg Aldolase und Fettgewebshomogenat als Phosphofructokinase-Zusatz.

148 N. Ofori-Nkansah und F. v. Bruchhausen:

gewebshomogenats. Daraus geht hervor, dab 6-Aminonicotinamid keinen Einflug auf das Best immungssystem hat, w/ihrend 6-ANAD (1,5 �9 10-aM, I I . Wahl) das System zu 29~ hemmt. H6here Konzentra t ionen an 6-ANAD (1,2 �9 10-aM) hemmen das System v611ig.

Auch das E n z y m aus dem Kaninchenmuskel wird durch 6-ANAD ge- hemmt. ~Terden alle clrei der hier angewendeten Enzymsehri t te , ngmlieh die Phosphofruetokinase-geakt ion, die Phosphoglueose-Isomerase-Re- aktion und die Glueose-6-phosphat-Dehydrogenase-Reaktion kinetiseh gemeinsam verfolgt, so zeigt sieh ein deutlieher Hemmeffekt dutch 6-ANAD (2 �9 10-4M, I. Wahl) yon rund 60~ Der Zusatz yon 6-Amino- nieotinamid (10-aM) ruff keine nennenswerten Ver/~nderungen an diesem System hervor. Die enzymatisehen Hflfsreaktionen werden dureh 6-ANAD nieht beeinflugt, wenn sie mit limitierenden Substratmengen, aber Enzym- Konzentrat ionen, die etwas fiber der Limitierung liegen, getestet werden (Tab. 2).

I m Gegensatz zum 6-ANAD ha t 6 -ANADP (2 �9 10-4M bzw. 10-4M) keinen Einflug auf die Akt iv i ta t dieses Enzyms (Tab. 3).

Tabelle 2. HemmeJ/elct yon 6-ANAD au/ die Aktivitdt der Phospho/ructokinase (aus Kaninehenmuslcel)

Substra~ t~eduktion yon NADP (in Mol �9 10-9/rain) durch

Glucose-6- phosphat- dehydro- genase

Phospho- Phospho- glucose- frueto- isomerase kinase

G-6-P (5 ~mol/3 ml) 11.9 �9 G-6-P (5 ~xraol/3 ml) d- 6-ANAD (2.10 -t M) 11.8 a

F-6-P (5 ~mol/3 ml) F-6-P (5 ~mol/3 ml) d- 6-ANAD (2.10 -4 M)

FDP (10 ~zmol/3 ml) FDP (10 ~mol/3 ml ) d- 6-ANAD (2- 10 4 M) FDP (10 ~mol/3 ml) d- 3-AP (10 -2 M) FDP (10 ~mol/3 ml) d- 3-APAD (10 -3 M) FDP (10 tLmol/3 ml) d- 6-AN (10 .3 M)

7.]b 7.0 b

3.0 e 1.2e (600/0 unter 3.1 c Kontrolle) 3.3 c 2.9r

Ansatz (3 ml Endvolumen) enthielt: 5 tzmol G-6-P, 0,6 ~mol NADP, 2,5 ~zg G-6-PDH, in 0,1 M Tris-HC1 pH 7,5.

b Ansatz (3 ml Endvolumen) enthielt: 5 tzmol F-6-P, 0,6 ~mol NADP, 2,0 [zg PGI, 25 ~g G-6-PDH, alles in 0,1 M Tris-HC1 pH 7,5.

c Ansatz (3 ml Endvolumen) enthielt: I0 ~mol FDP, 0,6 ~mol NADP, 12 ~mol ADP, 10 ~mol MgS04, 25 ~g G-6-PDH, 20 ~g PGI, 100 ~g PFK, alles in 0,1 M Tris-HC1 pH 7,5.

Hemmung der Phosphofructokinase dureh 6-ANAD 149

Tabelle 3. Wirlcung yon 6-ANADP au] die Aktivit~it der Phospho/ructolcinase ( Kaninchenmuslcel)

NADH-Oxydation (in Mo110-9/min)

Ko 133,3 • 0,55 (n - 4)

6-ANADP (2.10 -4 M) 138,0 -k 0,21 (,~ = 2)

6-ANADP (10 -4 ~) 134,6 • 0,47 (~ = 4)

Der Ansatz (3 ml Endvolumen) enthielt 10 -4 M Fructose-6-phosphat, 5 �9 10 -4 M ATP, 1,8 �9 10 -4 M NADH, 4,5 - 10 -4 M EDTA, 1,67 �9 10 3 M 3/IgSO 4, 20 ~xg Phospho- fructokinase, 20 ~g Aldolase, 10 Bg Triose-phosphat-Isomerase und 10 Fg Glycerin-1 - phosphat -Dehydrogenase.

n = Zahl der Bestimmungen.

m/zmol/min 7,5

2,5

0 go 6-ANAD 5-ANAD 6-ANAD 6-ANAD 8.10-4M 5.10-4M 2.10-z, M 10-4M

Abb.2. Wirkung yon verschiedenen 6-Aminonicotins~ureamidadenindinucleotid- Konzentrationen auf die Aktivitat der Phosphofructokinase Bus Kaninchenmuskel.

(Aktivitiit gemessen els Umsatz von NADP in mBmol/min )

Abb .2 zeigt die H e m m w i r k n n g des 6-ANAD (I. Wahl) auf die Aktl- v i tg t der Phosphofructokinase in Abhgngigkei t yon tier 6-ANAD-Kon- zentra t ion. Dutch Endkonzen t r a t i onen yon mehr als 10-4M wird die Enzymakt ivi t i~t sehr s tark eingesehr/~nkt (420/0 bei 10-~M) und bei h6herer K o n z e n t r s t i o n prakt iseh aufgehoben (93~ bei 8 .10 -4M) . Es erreehnet sieh eine Inh ib i to rkons tan te (Ki) yon 1,57 �9 10-4M flit 6-ANAD.

Abb. 3 zeigt die kinetisehe Darstel lung (Lineweaver-Burk-Diagramm) ffir Frue tose- l ,6 -d iphosphat als variables, die Reaktionsgesehwindigkeit l imitierendes Substrat . Aus dem Diagramm ist eine offenbar nieht kom- petive H e m m u n g dureh 6-ANAD zu entnehmen. Bei einer Miehaelis-

150 N. OforilNkansah und F. v. Bruchhausen:

.10 2 1~ / 1 | 6"ANAD (2'10"~ M)

I / ~%-"~-

z ~ ~ , a 2 ,, ,~ ........... / ] . ~ " ~ ' ~ - Km Ko "L 1.;4"

_o,o o o,o o.: o.1

Abb. 3. Lineweaver-Burk-Diagramm fiir Phosphofructokinase aus Kaninchenmuske]. Fructose-l,6-diphosphat als Substrat. Ansatz (3 ml Endvol.) enthielt 12 ~mol ADP, 100 9g Phosphofructokinase, 20 ~zg Phosphoglucose-Isomerase, 25 ~g Glucose-6-

Phosphat-Dehydrogenase, 10 ~mo] MgSO 4, 0,6 ~mol NADP

1 2 1OF

- i f - - o 2, Ko~ 1 I I I i _......o-- km Ko ]

) ' " ~ km 6-ANADJ 2'I0"4M I.~-25~ ~ - ~ f i i T i i

-0,5 -0.25 0 0,25 0,5 0,75 1,0 1.25 1,5

Abb.4. Adenosindiphosphat als Substrat. Ansatz (3 ml Endvol.) enthielt 10 ~.mol FDP, Enzyme, MgSO 4 und NADP wie oben

K o n s t a n t e (Kin) yon 1,54 �9 10-SM betri~gt die maximale Geschwindigkeit (Vmax) 1 ,0 .10-SMol /min ffir Kontrol lans~tze und 4 , 8 . 1 0 - g M o l / m i n bei Anwesenheit yon 6-ANAD (2 �9 10-4M).

Abb. 4 stellt ein entsprechendes Diagramm fiir A D P dar. Es liegt hier ebenfalls eine nicht kompeti t ive H e m m u n g vor, wenn m a n hohe ADP- Konzen t ra t ionen unberficksichtigt ] ~ t . Bei einem Km ffir A D P yon 2 �9 10-aM ergeben sich Vmax yon 6,7 �9 10-gMol/min fiir Kontrol lansi i tze und 2,2 �9 10-gMol/min bei Anwesenheit Yon 6-ANAD (10-aM). Die durch

Hemmung der Phosphofructokinase durch 6-ANAD 151

Tabelle 4. Der Hemme]/elct yon 6-ANAD au] die Alctivitiit der Phospho[ructokinase mit ADP als Substrat

ADP- NADP-Reduktion in Mo110-9/min Hemmung Konzentration ohne 6-ANAD mit 6-ANAD

(10 -~ M) 9/9

6,67 3,33 6,67 3,33 1,67 6,67

10 -a M 6,3 3,6 42,8 1O -a M 6,1 2,8 54,1 10 -4 M 4,6 1,7 63,0 10 -4 M 4,1 1,3 65,8 10 -~ M 3,3 1,0 69,7 10 -5 M 2,2 0,6 72,9

6-ANAD hervorgerufene Hemmung der Phosphofruetokinaseaktivitgt wird bei zunehmenden ADP-Konzentrat ionen unverh/~ltnism/tI~ig geringer (Tab.4). Die Unstetigkeit im Kurvenverlauf kann mit Aktivierung des Enzyms durch h6here ADP-Konzentrat ionen (bis zu 1 raM) erkl/~rt wer- den (Denton u. Randle, 1966).

Diskussion

Glykogenmarlcierung

Die beschriebenen Ergebnisse zeigen, dab ein starker in-vitro-Anstieg der Glykogenmarkierung des Fettgcwebes unter 6-AN mit und ohne In- sulin eintritt, obwohl die Glucoseaufnahme gleichzeitig herabgesetzt ist (v. Bruchhausen u. IIerken, 1966; Ofori-Nkansah, 1970). Da Insulin vor- nehmlich den Transport von Glucose in die Fettgewebszelle stimuliert (Crofford u. Renold, 1965a, b), ist in diesem Falle ein Angriff yon 6-AN bzw. seines Stoffwechselproduktes an der Zellmembran anzunehmen. Der gleichzeitig starke Anstieg der Glykogenmarkierung kann nicht durch gluconeogenetische Vorg~nge zustande gekommen sein, da im Fettgewebe durch Mangel an Glucose-6-phosphatase und Fructose-l,6-diphosphatase (Weber et al., 1960, 1965) sowie an Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (Weber et al., 1965) die Glueoneogenese nicht ablaufen kann. Aueh finder mit markiertem Pyruva t keine nennenswerte Markiernng des Fett- gewebsglykogens start (Christophe et al., 1961; White et al., 1968; Ofori- Nkansah, 1970). Die eingangs erw~hnte verzSgerte Glueoneogenese dureh Aussehfittung yon Glucocortieoiden kommt ftir das isolierte Gewebe nieht in Betraeht. Es mug daher angenommen wcrden, dab die in die Zelle ge- langte Glucose durch rcgulierende Schritte im Bereieh der Glykolyse bzw. des Pentose-Phosphat-Weges oder im Glykogenumsatz starker zur Gly- kogenbildung herangezogen wird.

152 N. Ofori-Nkansah und F. v. Bruchhausen:

Hemmung der Phosphofructokinase Die Phosphofructokinase wird im Fettgcwebe a]s eines der Schlfissel-

enzyme der Glyko]yse angesehen (Weber eta]. , 1960, 1965; Orevi et al., 1969), dessen Aktivit~t sieh nicht nur auf den Flul~ der Glucose in der Glykolyse auswirkt, sondern aueh auf den Durchsatz in Richtung Gly- kogen und Pentose-Phosphat-Weg. Im Skelet- und Herzmuskel (Mansour, 1963; Mansour et al., 1965), in der Here (Vinuela et al., 1963), in Fasciola hepatica (Stone u. Mansour, 1967a, b) sowie im Fettgewebe (Denton u. l%andle, 1966) existiert dieses allosterisehe Enzym interkonvertierbar in aktiver and inaktiver Form. In der aktiven Form bestimmt es die Gr56e der Glykolyserate; es kommt zur Abnahme der Konzentrationcn an Glucose-6-phosphat, Fructosc-6-phosphat und ATP und zur Zunahme an Fructose-l,6-diphosphat und anderen Zwischenprodukten der Glykolyse (Mansour, 1963).

In vitro liel3 sich die Aktivit~tt dieses Enzyms aus Kaninchenmuskel sowie aus Fettgewebe wohl durch 6-ANAD, aber nicht durch 6-ANADP hemmen. Der Hemmtyp verhs sich, wcnn man sehr hohe ADP-Kon- zentrationen unberfieksichtigt li~l~t, dem ADP und dem Fruetose-l,6- diphosphat gegenfiber nicht kompetitiv. Die Unstetigkeit im Kurven- verlauf h i t ADP als Substrat k5nnte folgendermal~en gedeutet werden: Wegen des allosterischen Charakters des Enzyms kSnnte ADP einmal als Substrat, zum anderen Mal als Aktivator der Phosphofructokinase dienen. Die Aktivierung ist ebenfalls ffir 3',5'-AMP, 5'-AMP, AMP, anorganisches Phosphat und Sulfationen (Passonneau u. Lowry, 1962) sowie Serotonin (Mansour u. Mansour, 1962) bekannt, wi~hrend ATP (Mansour u. Mansour, 1962), Citrat (Passonneau u. Lowry, 1963 ; Parmeggiani u. Bowman, 1963 ; Denton u. Randle, 1966) sowie aerobe Bedingungen (Aisenberg u. Potter, 1957 ; Passonneau u. Lowry, 1962) als Inhibitoren dienen. Als Aktivator wfirde ADP mit dem Inhibitor (6-ANAD) konkurrieren und ihn v o n d e r Bindungsstelle verdri~ngen. Der zugrunde liegende Meehanismus w~tre dann kompetitiv und wi~re, wie aus den Ergebnissen hervorgeht, erst mit hohen ADP-Konzentrationen (fiber 6,67 �9 10-4M) zu erreichen. Weshalb das NAD-, nicht aber das NADP-Ana]oge des 6-AN auf die Aktivit~t der Phosphofructokinase hemmend wirkt, muB noch gekl/~rt werden.

Folgen fi~r Kohlenhydratstoffwechsel Als Folge der Hemmung der Aktivit/it der Phosphofructosekinasc wi~re

ein Anstieg der Intermedi~rprodukte -- Fruetose-6-phosphat und Glu- eose-6-phosphat -- zu erwarten. Im ttomogenat des mit 6-AN pr~inku- bierten Fettgewebes liel~ sich dies allerdings nieht best~tigen (v. Bruch- hausen u. Ofori-Nkansah, 1969), wohl abet im Fettgewebshomogenat mit 6-AN behandeltcr Ratten, wenn das Gewebe zus~tzlich mit Glucose

Itemmung der Phosphofructokinase durch 6-ANAD 153

inkubiert wurde (v. Bruehhausen). Ebenso lies sich ein sehr starker An- stieg yon 6-Phosphogluconat und in geringem MaSe yon Glueose-6-phos- phat im Gehirn (Herken u. Lange, 1969 ; tIerken et al,, 1969; Lange et al., 1970) und in der Niere (Lange u. Proft, 1970) 6-AN behandelter Rat ten sowie in u der Maus feststellen, wenn die tumortragenden Tiere mit 6-AN vorbehandelt waren (Ofori-iNkansah u. v. Bruchhausen). Die Anreieherung dieser Zuekerphosphate kann auf die t{emmnng der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase bzw. Glucose-6- phosphat-Dehydrogenase dutch entstandenes 6-ANADP zurfiekgeffihrt werden. Durch t{emmung der beiden Enzyme wird der Flus durch die Glykolyse sowie den Pentose-Phosphat-Weg eingeschr~nkt. Die dureh 6-ANAD bewirkte Hemmung der Phosphofructokinase kSnnte zu weiterer Anreicherung yon Glueose-6-phosphat fiihren, das zum Glykogenaufbau verwendet werden kann und wie Insulin (Villar-Palasi u. Larner, 1961) eine Aktivierung der UDPG ~-l,4-gluean ~-4-glncosy]transferase (EC 2.4.1.11) ~ Glykogensyn~hetase bewirken kann (Leloir et al., 1959; Leloir u. Goldemberg, 1960 ; Vil]ar-Palasiu. Lamer, 1960). MSglicherweise tr/~gt auch eine Hemmung der Phosphorylase b-Kinase durch 6-ANAD in Analogie zum Musket (vgl. Einleitung) zur st&rkeren Markierung des G]ykogens bei.

Ffir die genannten enzymatisehen Hemmungen im Bereich des Kohlenhydratstoffwechsels mfissen ausreichende Konzentrationen der Analogen hn Gewebe vorliegen. ])as flit die Bfldung dieser Analogen wich- tige Enzym Nueleosidase NAD(P)-glyeohydrolase (EC 3.2.2.6) ist im Fett- gewebe in ausreiehender Konzentration enthalten (pers. M/tteflung Coper). Ffir das Fettgewebe liegen bisher keine n/~heren Angaben fiber 6-ANAD noch fiber 6-ANADP vor. Allerdings konnte Neuhoff (pers. Mitteilung) 6-AN-Analoge im Fettgewebe naehweisen. Ein Teil des radioaktiv an- gebotenen 6-Aminonicotinamids konnte naeh 6 Std Inkubation auch als markiertes 6-ANAD(P) im Fettgewebe gefunden werden (v. Bruchhausen, 1967). Eine Interpretation, welche der genannten St5rungen zur starken Markierung des Fettgewebes bei Angebot markierter Glucose unter 6-Aminonieotinamid Zusatz am st~rksten beitrigt, ist erst unter Kenntnis der Analogenkonzentration L-n Gewebe mSglieh.

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N. Ofori-IN-kansall F. yon Bruehhausen Pharmakologisches Institut der Freien Universitat D-1000 Berlin 33, ThielMlee 69/73 Deutschland

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