R. GRau und R. HAM~: Uber die Proteolyse der Fleischproteine. II. 425

Uber die Proteolyse der Fleischproteine.

I I . M i t t e i l u n g .

Die Bestimmung des Bindegewebes in v, erarbeitetem Rohfleisch durch enzymatische t I yd ro ly se %

Von

R. G~AU nnd R. HAMM.

M i t t e i l u n g aus dem C h e m i s c h - P h y s i k a l i s c h e n I n s t i t u t tier B u n d c s f o r s c h u n g s a n s t a l t ffir F l e i s c h w i r t s c h a f t , Ku lmbach .

Mit 2 Textabbildungcn.

(Eingegangen am 5. Dezember J953.)

In der 1. Mit te i lung 1 wurde sine enzymat ische Methods zur Bes t immung des Bindegewebes in rohem Fleisch angegeben, welche mi t Pepsin-Salzs~ure unter nich~- op t imalen Bedingungen arbe i te t und da rauf beruht , dal~ Fleisch um so schwerer ve rdau t wird, je mehr Bindegewebe es enth~lt . Wghrend diese Methods ffir robes, unverarbe i te tes Fleisch exak t anwendbar ist, so war dies ftir verarbei te tes Rohfleisch, wie es vor allem in Rohwi i r s ten vorliegt , noch nicht nachgewiesen. Inzwischen haben wir uns mi t der Beeinflussung der Peps inverdauung eingehender befal~t; die Ergeb- nisse dieser Versuche sollen an anderer Stelle verSffent l icht werden.

Hier mag nur sovie] gssagt werden, dal~ der Pcpsinabbau des Fleisches in vitro yon einer ~eihe yon Faktoren abh~ngig ist, die uns zwangen, bei dcr Untersuchung yon Fleischwaren, insbesonderc Rohwurst, unser fiir frisches Fleisch guts Dienste leistcndes Verfahren auf verarbeitetes und be- handeltes Rohfleisch abzugndern. Die Art der Verarbeitung yon Rohwtirsten ist yon vornherein nicht bekannt. Es wird stets tin Probcmaterial wechselnder ZusUmmensetzung, wechselnden t~eifezustandes, wechselnder Zerkleinerung vorlicgen, die sine Pepsinverdauung zur Bestimmung des Bindegewebsanteil s erschweren oder gar unmSglich machcn. Schon in der 1. Mitteilung war auf die X%twendigkeit dcr Innehaltung genauer Versuchsbedingungen aufmerksam gemacht worden.

Es war daher in erster Linie notwendig, das Untersuchungsmaterial weitgehend einheitlich zu machen, um es in stets gleicher Beschaffenheit der Pepsinverdauung zu unterwerfen. Zu diesem Zweck innate das Fett entfernt werden. Als bcstes Extraktionsmittel ftir unsere Zwecke erwies sich Aceton, welches nicht nur das Fett extrahiert, sondern auch als polares LSsungsmittel fast das gesamte Wasser aus dem Fleisch entfernt. Man erhglt so sin stark denaturiertes Material, das sich im MSrser mfihelos zu cinem fcinen homogcnen hellgelben Pulver verreiben l~l]t. Da infolge der Acetonextraktion durch Wasserentzug der Stiekstoffgehalt des Flcisches um etwa das Vierfache zunimmt, setzten wir die Substratkonzentration derVerdauungsans~tze herab, und zwar yon 5,0 auf 2,5 % (1 g/40 ml Enzyml~isung). Der Gesamt-N ist dann doppelt so hoch, wie bei den frfihcren Versuchen an unbehandeltem Fleisch.

A r b e i t s w e i s e ( S t ~ n d a r d m e t h o d e ) .

Etwa 30 g des rohen, zweimal durch den Wolfgcdrehten Materials wcrden im So xItLET-Apparat 4--8 Std. mit Aceton extrahiert. Man nimmt dann die Htilse heraus, zerkriimelt das nur teilwcise entw~sserte Material und extrahiert weitere 4--6 Std. Das extrahierte Fleisch l~Bt man auf einer Petrischale ausgebreitet an der Lnft stehen, bis das anhaftende Aeeton verdunstet ist. Das trok- kene Material wird im MSrser zu einem hellen Pulver zerrieben. Es kann in dieser Form ]ange aufbewahrt werden. In ciner Probe des Produktes bestimmt man naeh Verasehen mit Selen- Schwefels~Lure nach KJEL1)AIIL den Stickstoff; Gesamt-N der fettfreien Trockensubstanz.

1000 g des aeetonextrahierten F]eisches werden in einen Erlenmeyerweithalskolben (100 ml) eingewogen, in 20 ml Wasser suspendiert und 3 Std. im Brutschrank bei 30 ° C vorgequollen. ])ann werden 20 ml einer 0,2%igen L6sung yon Pepsin (Merck) in 0,05 n-HC1 zugesetzt. Man

* FrAulein Dr. A~ELI~,S BAV~&_~N danken wir ffir ihre wertvolle Mitarbeit. 1 GRAU, t~., u. t~. HAlUN: Diese Z. 911, 201 (1951).

426 R. GRAu und R. I - IA~:

l ~ t im Bratschrank bei 30 ° C das Enzym unter gelegentlichem Umschfitteln genau 4 Std. ein- wirken und filtriert dann durch troekene Faltenfilter in troekene KSlbchen.

Zur Bestimmung des insgesamt in LSsung gegangenen Stickstoffs (entsprechend dem in den Tabellen angegebenen A-Wert) werden 2 ml des Filtrates in Verasehungskolben yon 100 ml Inbalt pipettiert, rait 5 ml Selen-Sehwefels~ure veraseht und auf 25 ml aufgefiillt. 5 m] dieser LSsung dienen zur KJ~r~DA~L-Bestimmung. Das Filtrat kann zur Bestimmung des A-Wertes aueh sparer verarbeitet werden; zu diesem Zwecke kommt es naeh Zusatz yon 1 Tropfen Toluel in den Kfihlschrank.

2 ml des Filtrates werden sofort nach dem Filtrieren in dickwandige Reagenzgl~ser abpipettiert und in kr~ftigem Strahl 10 ml einer 15%igen Trichloressigsi~urel5sung zugesetzt. Die mit Gum- mistopfen versehenen Gl~ser werden (evtl. naeh Stehen im Kfihlschrank fiber Naeht) in der Zentrifuge zur Milchfettbestimmung 30 rain zentrifugiert. Die fiberstehende LSsung wird vor- sichtig abgegossen und verworfen. Der Rfickstand wird mit ca. 8 %iger Trichlors~uressigs~ure gewasehen und abermals ca. 20 min zentrifugiert. Die Wasehw~sser werden gleichfalls vor- sichtig abgegossen und verworfen. Der Zentrifugenriickstand wird dureh Nachwasehen mit Wasser und mit Hilfe eines Gummiwischers quantitativ in einen Veraschungskolben yon 100 ml Inhalt fibergeffihrt. Der Niederschlag wird dann mit 5 ml Selen-Sehwefels~ure veraseht und auf 25 ml aufgeffillt. 5 ml dieser LSsung dienen zur KJ~LDA~L-Bestimmung (Ermittlung des B-Wertes).

Verlangert man die Dauer der Acetonextraktion des l~leisches um das Doppelte, so tritt, wie einige Versuehe an Rind- nnd Kulbfleisch ergaben, eine geringe Abnahme der L5slichkeit in Pepsin-Salzsaure nnd damit auch eine Verminderung der B-Werte ein. Es ist daher zu empfehlen, die Gesamt-Extraktionsdauer nicht liinger als 15 Std. und nicht kfirzer als 10 Std. zu w~hlen. Die Substratkonzentration yon 2,5% zu iibersehreiten ist unzweekm~Big, da sonst die Triehlor- essigsauref~tllungen sehlecht zu zentrifugieren sind. - - Bei der Triehloressigs~urefiillung ist das Verh~ltnis des ~bpipettierten Filtratvolumens zu dem Volumen zugesetzter 15 % iger Trichlor- essigs~urel6sung innerhalb der untersuchten Grenzen yon 2:10 bis 4:10 ohne Einflul~ auf die HShe des ]3-Wertes.

Es erwies sieh, wie weitere Einzelversuehe zeigten, als notwendig, sofort nach dem Ffltrieren der Ans~tze die Trichloressigs~uref~llung vorzunehmen, da der Abbau der vom Pepsin gelSsten Polypeptide beim Stehen der Filtrate im Kiihlschrank langsam fortschreitet und so eine Abnahme der B-Werte mit sich bringt.

B e s t i m m u n g d e s B i n d e g e w e b s g e h a l t e s i n a c e t o n e x t r a h i e r t e m F l e i s e h .

Aus einer Reihe hier n ich t angeff ihr ter Versuche geh t hervor , dal3 m a n durch A c e t o n e x t r a k t i o n des F]eisches ein nahezu wasserfreies homogenes Pu lve r erh~lt , dessen Verdau l ichke i t durch Peps in-Salzs~ure unbeeinflul~t yon A r t und T e m p e r a t u r der Zerkle inerung und yon der Menge des vor der E x t r a k t i o n beigemischten F e t t e s ist. D a das Mate r ia l ungeach te t des v o r der E x t r a k t i o n vor l iegenden F e t t - und Wassergeha l tes n a c h A c e t o n e x t r a k t i o n s te ts e twa den gleichen St ieks tof fgehal t aufweist , kSnnen Ver~nderungen der Verdau l ichke i t au f Grund untersehiedl icher K o n z e n t r a t i o n e n des S u b s t r a t - N n ich t e int re ten. Es is t zu erwar ten , dal~ Unter - sehiede im Quel lungszustand, welche das Fle iseh v o r der E x t r a k t i o n aufweis t (je nach Aus t rocknungsgrad , Rei fungszus tand , Kochsa lzgeha l t u s w . ) , i n dem dureh E x t r a k t i o n entw~tsserten, s t a rk dena tu r i e r t en P r o d u k t fiir die Verdaul iehke i t keine Rolle mehr spielen. Die Differenzen zwischen d~en B - W e r t e n des ex t r ah i e r t en Flei- sehes und denen des ex t r ah i e r t en Bindegewebes s ind grSger als die en t sprechenden Unte rsch iede be im rohen, n ich t ex t r ah i e r t en Gewebe. Alle diese Vorte i le veran- lal~ten uns, nachzuprfifen, ob sich ace tonex t rah ie r t e s Fle iseh als S u b s t r a t ffir die B indegewebsbes t immung eignet.

a) A n w e n d u n g d e r S t a n d a r d m e t h o d e a u f M u s k e l g e w e b e .

U m die Beziehung zwischen dem Bindegewebsgeha l t und dem P e p s i n a b b a u des a ee tonex t r ah i e r t en Fleisches zu untersuchen, wurde zuni~chst in j edem un te r such ten Fle isch der Bindegewebsgeha l t m i t der in der 1. Mit te i lung ~ angegebenen Methode

G~Av, R., u. R. HAM~: Zit. S. 425, Anm. 1

Uber die Proteolyse der Fleischproteine. II. 427

du rch Verdauung des rohen Fleisches ermit tel t . D a n n wurde das Fleisch gemi~B der i n der vorl iegenden Arbei t angegebenen S tandardmethode mit Aeeton ex tmhier t u n d durch Pepsin-Salzsi~ure verdau t (Tab. 1).

Tabelle i. Ve rdauung yon e x t r a h i e r t e m Rind-, Kalb- und Schweinef le iseh b e k a n n t e n Sehnengeha l t e s dureh Pepsin-Salzs/~ure.

Einwaage: 1,000 g; Substragkonz. : 2,5% ; Pepsinkonz. : 0,1% ; S/iurekonz. : 0,05 n-HC1; Temperatur: 30 ° C; Vorquelldauer: 3 Std. ; Dauer der Verdauung: 4 Std.

Nr.

574 628 646 676 700 725 702 678

750 768 761

Herkunft des

Fleisches

Rind

Kalb Schwein

Rind Rind Schwein

Ges.-N

mg

122,6 134,6 134,6 137,9 133,9 131,3 134,4 140,5

135,5 134,0 137,9

15sL N, bez. a. Ges.-~ r

(A-Weft)

%

88,9 94,5 90,0 84,5 89,3 94,9 87,4 87,7

94,3 96,3 93,9

N v. Tri- chloress.-

F~llg. (B-Wert)

%

69,9 72,6 76,4 68,1 73,6 80,9 71,9 71,8

79,2 83,2 80,1

N v. Bindegewebe bez. a. Ges.-N bei

rohem extrah. Fleisch Fleisch

(E~-Wert) ~ (E~-Wert) ~ % %

28,7 26,1 23,2 23,1 20,9 18,9 26,1 28,3 20,1 22,0 16,5 13,9 22,0 23,8 21,1 24,0

17,4 15,8 8,3 10,9

15,8 14,8

]~I--E2

%

+2,6 +o,1 +2,0 --2,2 --1,9 +2,6 --1,8 --2,9

+1,6 --2,6 +1,o

Ffir die Ansgtze 750, 761 und 768 wurden aus dem rohen Fleisch mSglichst bindegewebsfreie Muskelfasern herausprgpariert. Diese Fasern wurden bei Rindfleisch einmal durch den Wolf gedreht, wghrend sie beim Sehweinefleisch bereits naehdeichtem Zerreiben als breiige Masse vor- lagen und ein weiteres Zerkleinern iiberflfissig war.

b) A n w e n d u n g d e r S t a n d a r d m e t h o d e a u f B i n d e g e w e b e .

Von den verschiedenen Bindegeweben seien als char~kteristische Vertreter Sehnen u n d lockeres Bindegewebe angefiihrt. Aeetonextrahier te Schwarte, Nacken- b a n d u n d sogenanntes ,s t raffes Bindegewebe" ergeben ~hnliche, auf keinen Fal l hShere B-Werte (Tab. 2).

Tabelle2. V e r d a u u n g yon a e e t o n e x t r a h i e r t e m Bindegewebe d u t c h Peps in- Salzs~ure.

Einwaage : 1,000 g; Substratkonz. : 2,5 % ; Pepsinkonz. : 0,1% ; S~ure- konz.: 0,05n-HC1; Temperatur: 30 ° C; Dauer des Vorquellens. 3 Std.; Dauer der Verdauung : 4 Std.

~Iaterial

extrahierte Sehnen . . . . extrahierte Sehnen . . . . lock. extrah. Bindegewebe .

Nr.

514 735 772

Ges.-N mg

134,8 142,8 136,5

A-Weft B-Wert % %

6,5 3,1 3,2 1,2 7,0 2,7

Aehillessehne des Rindes wurde yon Fett und Fleisch meehaniseh befreit und einmal dureh den Fleisehwolf gedreht.

1 Ermittelt hash der in der 1. Mitt. angegebenen Methode. Berechnet n. d. Gleichung ftir Kurve aus den B-Werten der Abb. 1.

428 g. GRAU und g. H4M~:

Die dfinnen, teilweise sehleimigen H~iute des lockeren ]~indegewebes vom Rind wurden mechanisch yon Fett und Fleisch befreit und mit dem Messer rein zerschnitten. Das Material wurde ebenso, wie unter a) fiir Fleisch angegeben, mit Aceton extrahiert. Ein Zerreiben des extrahierten Bindegewebes im M6rser war nicht mSglich.

Wie Tab. 2 zeigt, wird das ex t rah ie r t e Bindegewebe ~ihnlich wie das rohe nach v iers t i indiger Peps ine inwi rkung nur geringffigig abgebau t . Die B -We r t e s ind e twas n iedr iger als diejenigen des unvo rbehande l t en Gewebes. Dies t r i f f t vor al lem fiir das lockere Bindegewebe zu. Es sei erw~hnt , dal~ g e k o c h t e Schwar te sowohl vor als auch nach A c e t o n e x t r a k t i o n durch Peps in-Salzs~ure fas t ebenso gu t v e r d a u t wird wie Fle isch; unser Verfahren ist zur Unte r suchung gekochten l~leisches n ich t geeignet .

c) A n w e n d u n g d e r S t a n d a r d m e t h o d e a u f G e m i s c h e y o n S e h n e n u n d M u s k e l g e w e b e .

F i i r die Aufs te l lung einer zur B indegewebsbes t immung d ienenden ,,Eichkurve" war es notwendig , auch den Bereich yon 15- -100% Bindegewebe-N (in % des Gesamt-N) zu erfassen (Tab. 3).

Tabelle 3. V e r d a u u n g yon Gemischen aus e x t r a h i e r t e m R i n d f l e i s c h und e x ~ r a h i e r t e n Sehnen du rch P e p s i n - S a l z s g u r e .

Einwaage: 1,000 g; Substratkonzentration: 2,5 % ; Pepsinkonzentration : 0,1% ; Sgurekonzen- tration: 0,05 n HC1; Temperatur: 30 ° C; Vorquelldauer: 3 Std. ; D~uer der Verd~uung: 4 Std.

Nr.

725 727 733 729 730 732 735

I I Sehnen- I Anteil

0 10 20 30 50 70

100

N-Gehalt der Sehnen zugesetz~ an der insgesamt

MuskeI (S-Wert)

mg , mg mg %

0 14,3 28,6 42,8 71,4

100,0 142,8

21,6 19,4 17,3 15,1 10,8 6,5 0

21,6 16,5 33,7 25,4 45,9 34,3 57,9 43,0 82,2 59,9

]06,5 76,4 142,8 100,0

Ges.-N

mg

131,3 132,5 133,7 134,7 137,1 139,4 142,8

A-Weft

%

94,9 85,0 75,9 69,5 52,6 35,1

3,2

B-Weft

%

80,9 68,9 63,9 55,7 40,5 24,1

1,2

E~-Wert

%

13,9 27,2 32,8 41,9 58,7 77,0

103,0

S-E2

%

-~2,6 --1,8 ÷1,5 -4-1,1 -4-1,2 --0,6. --0,3

d) B e r e c h n u n g d e s B i n d e g e w e b s a ' n t e i l s .

I n Abb. 1 is t die Beziehung zwischen den durch P e p s i n a b b a u des extrahier te~l Fle isches e rmi t t e l t en B - W e r t e n (Tabellen) und dem Sehnengehal t des F le i sches graphisch dargeste]l t . Die W e r t e l iegen - - innerha lb der bei e inem biologischen Mate r ia l zu e rwar t enden Schwankungen - - auf einer Geraden.

Die Gleichung der Geraden ist B

E~ = ]03,7 0,901 '

wenn E 2 den Gehal t des ex t r ah i e r t en Mater ia ls an Sehnen in % des Gesamt -N und B den durch Ana lyse gefundenen W e r t bedeuten . Die aus den gefundenen B - W e r t e n berechneten E2-Werte s ind in die Tab. 1 und 3 .eingetragen.

Die mittlere Abweiehung der naeh dieser Gleichung erreehneten E~-Werte yon der mittels der in der 1. Mitteilnng angegebenen Methode an rohem Fleiseh ermittelten Sehnengehalten Ez bzw. den Sehnengehalten S der Mischungen betrgg.t. 1,6%, wobei die hSehstenAbweichungen -4- 2,6% bzw. - - 2,9 % betragen. Es ist dies eine gute Ubereinstimmung. Man mul~ bei dieser Methode im allgemeinen mit einer Fehlerbreite yon hSchstens 3,0% Gesamt-Bindegewebe-N (in Prozent des Gesamt-N) rechnen, bzw. mit einer Fehlerbreite der B-Werte yon maximal 3,0%.

Uber die Proteolyse der FIeischproteine. II. 429

Die Werte fiir den insgesamt in LSsung gehenden Stiekstoff in Prozent des Gesamt-Stiekstoffs, aufgetragen in Abh~ngigkeit vom gesamten Bindegewebe-N (Abb. 2), zeigen hier keine so starke Streuung wie die entspreehenden Werte bei rohem, nieht extrahiertem Fleiseh ~. Sie streuen aber etwas starker, als die Werte des F~llungs-N. Wie beim rohen Fleiseh, so liegen aueh beim extrahierten die

% do

70

dO

' ¢0

30

ZO

70

0 0

"kA. %

q5

' I r I i i o

70 20 30 ¢0 80 00 70 80 ~°0100% 81n(fg~CwgD,s -Ill

i I

ZO ~0 #0 80 % 100 B/zdegewe& -#

Abb. i+ Abb. 2.

Abb. 1. Abh~tngigkeit der B-Wer te (N-Wer te der Trichloressigs~ure-Fiil lung) v o m Bindegewebe-N in % des Ges~mt-N. O = l~indfleisch, × -- Kalbfleisch, A = Schweinefleisch. (E inwaage : 1,000 g; Subs t ra tkonz . : 2 ,5%; Peps inkonz . :

0 ,1%; S~urekonz. : 0,05 n-HCI; T e m p e r a t u r : 30 ° C; Vorquel ldauer : 3 Std., Dauer der V e r da uung : 4 Std.).

Abb. 2. Abh~ngigke i t des insgesam~ in LSsung gehenden N yore BJndegewebe-N, beides bezogen a u f den Gesamt -N in %. (Versuchsbedingungen wie bei Abb. 1.)

A-Werte nicht, wie die B-Werte, auf einer Geraden, sondern auf einer leicht gekrtimm- ten Kurve. Es ist also auch beim acetonextrahierten Gewebe der f~llbare Stickstoff fiir die Bestimmung des Bindegewebes geeigneter als der insgesamt in LSsung gehende Stickstoff. Da auBer dem Gesamt-N des Untersuehungsmateria]s nur diese GrS8e ermittelt werden muB, so kommt man mit zwei Stickstoffbestimmungen pro Ansatz aus.

Z u s a m m e n f a s s u n g . Die in der 1. Mitteilung angegebene Methode zur Bestimmung yon Bindegewebe

dutch enzymatisehe Hydrolyse des Fleisehes ist nur for die Analyse unbehandelten Rohfleisches, nicht abet yon verarbeitetem Fleisch giiltig, da Zerkleinerungsart und Fettbeimischung die Verdaulichkeit dureh Pepsin-Salzs~ure beeinflussen.

Durch Extraktion des Untersuehungsmaterials mit Aeeton gelingt es, homogene, pulverfeine und haltbare Pr~tparate zu erhMten, deren Verdau]ichkeit durch Pepsin nur yon ihrem Bindegewebegeha]t, nieht aber yon den Faktoren der vorausgegan- genen Verarbeitung, yore Quellungsgrad u. dgl. abhg~ngt.

Die Naehpriifung yon extrahiertem Fleisch, dessen Sehnengehalt mittels der in der 1. Mitteilung angegebenen Methode ermittelt war, und yon Mischungen aus extrahiertem Muskelfleisch und extrahierten Sehnen ergibt eine einfaehe Beziehung zwischen den Stiekstoffwerten der Trichloressigs~ure-:F~Jlung und des Bindegewebes.

Die Feh]ergrenze des Verfahrens betr£gt ~= 3 %.

1 Zit. S. 425, Ann]. 1.