UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Validasi Metode …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/36393/1/Rifa... · yang dilakukan adalah rentang linieritas, LOD, LOQ, akurasi,

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Validasi Metode Analisis Glukosamin Hidroklorida dengan

Derivatisasi Phenyl Isothiocyanate (PITC) dan Aplikasinya

pada Penetapan Glukosamin dalam Dispersi Nanopartikel

Kitosan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

SKRIPSI

RIFA ARIFAH RAHMAH

1112102000052

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

Oktober 2016

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Validasi Metode Analisis Glukosamin Hidroklorida dengan

Derivatisasi Phenyl Isothiocyanate (PITC) dan Aplikasinya

pada Penetapan Glukosamin dalam Dispersi Nanopartikel

Kitosan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

SKRIPSI

(Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi)

RIFA ARIFAH RAHMAH

1112102000052

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

Oktober 2016

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama :Rifa Arifah Rahmah

Program Studi :Farmasi

Judul :Validasi Metode Analisis Glukosamin Hidroklorida dengan

.Derivatisasi Phenyl Isothiocyanate (PITC) dan Aplikasinya pada

.Penetapan Glukosamin dalam Dispersi Nanopartikel Kitosan

.secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Glukosamin hidroklorida (Glukosamin HCl) yang telah banyak digunakan sebagai

obat untuk osteoartritis memiliki ketersediaan hayati yang rendah sehingga

dikembangkan glukosamin dalam dispersi nanopartikel kitosan. Penetapan

glukosamin dalam dispersi nanopartikel kitosan dapat dilakukan jika metode yang

digunakan telah tervalidasi. Pada penelitian ini akan dilakukan validasi metode

untuk menganalisis glukosamin HCl yang diderivatisasi menggunakan fenil

isotiosianat (PITC) secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan

detektor DAD, kolom ODS/C18 5 μm (4,6 x 250 mm), menggunakan fase gerak:

Metanol-aquabidest-asam asetat (10,00 : 89,96 : 0,04) dengan kecepatan alir 1,0

mL/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 245 nm. Hasil derivatisasi

glukosamin HCl terdeteksi pada waktu retensi 14,752 menit. Parameter validasi

yang dilakukan adalah rentang linieritas, LOD, LOQ, akurasi, presisi, dan

stabilitas. Respon detektor linier pada kisaran konsentrasi 4-20 ppm dengan

persamaan kurva kalibrasi y = 0,298 x + 0,016 (r = 0,999). Nilai LOD = 0,5419

ppm dan nilai LOQ = 1,8065 ppm. Uji presisi (%RSD) dan akurasi (%diff) intra

dan inter-day selama 2 hari yang tidak melampaui 2%. Nanopartikel kitosan

yang mengandung glukosamin HCl dapat dianalisis menggunakan metode analisis

tidak langsung dengan kondisi analisis yang telah tervalidasi. Data yang diperoleh

dapat digunakan untuk menghitung efisiensi penjerapan glukosamin HCl dalam

dispersi nanopartikel kitosan.

Kata Kunci : DAD, Efisiensi Penjerapan, Fenil Isotiosianat (PITC),

Glukosamin HCl, KCKT, Nanopartikel Kitosan,

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name :Rifa Arifah Rahmah

Program Study :Pharmacy

Tittle :Validation of Analytical Method for Glucosamine

.Hydrochloride with Derivatisation Phenyl Isothiocyanate

.(PITC) and Its Application to Determinted Glukosamin

.in the Dispersion of Chitosan Nanoparticles by High

.Performance Liquid Chromatography

Glucosamine hydrochloride (Glucosamine HCl) which has been widely used as a

drug for osteoarthritis have low bioavailability, therefore that was development in

glucosamine in the dispersion of chitosan nanoparticles. Determination of

glucosamine in the dispersion of chitosan nanoparticles can be done if the method

used has been validated. This research will be conducted validation methods for

analyzing glucosamine HCl which is being derivatized using phenyl

isothiocyanate (PITC) in High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with

DAD detector, an ODS/C18 5 μm (4.6 x 250 mm) column, using a mobile phase:

Methanol-aquabidest-acetic acid (10.00 : 89.96 : 0.04) with a flow rate 1.0

mL/min and detected at 245 nm. The results of glucosamine HCl derivatization

was detected at a retention time 14.752 minutes. Parameter validation that done in

this research are linearity, LOD, LOQ, accuracy, precision, and stability. Linear

detector response at a concentration range of 4-20 ppm calibration curve with the

equation y = 0.298 x + 0.016 (r = 0.999). Value LOD = 0.5419 ppm and value

LOQ = 1.8065 ppm. Test precision (%RSD) and accuracy (% diff) intra- and

inter-day for 2 days did not exceed 2%. Chitosan nanoparticles containing

glucosamine HCl can be analyzed using indirect analytical methods with the

analysis conditions that have been validated. The data obtained can be used to

calculate the entrapment efficiency of glucosamine HCl in chitosan nanoparticle

dispersion.

Key Word : Chitosan Nanoparticles, Diode Array Detector (DAD),

Entrapment Efficiency, Glucosamine HCl, HPLC, Phenyl Isothiocyanate (PITC),

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT Yang Maha

Mengetahui segalanya, yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya kepada

penulis sehingga dapat menyelesaikan skripsi yang diajukan sebagai salah satu

syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi dari Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Selama penulisan skripsi ini ada banyak hambatan yang penulis hadapi,

tetapi dengan adanya bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak maka hambatan-

hambatan tersebut dapat diatasi dengan baik. Oleh karena itu, penulis ingin

mengucapkan rasa terima kasih kepada:

1. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt. Selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Supandi, M.Si., Apt. selaku Pembimbing I dan Yuni Anggraeni, M. Farm.,

Apt.selaku Pembimbing II, yang telah menyediakan waktunya dan dengan

sabar serta tulus mengarahkan, memberikan nasehat, bantuan, semangat, dan

perhatian dari mulai penyusunan proposal, proses penelitian hingga

tersusunnya skripsi ini.

3. Prof. Dr. Atiek Soemiati selaku dosen penasehat akademik kelas Farmasi B

2012 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak dan Ibu dosen pengajar Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Rani Hestiningrum, A.Ma. selaku laboran di Laboratorium Farmakognosi dan

Fitokimia atas saran, bantuan, bimbingan, semangat, dan terlebih perhatian

yang diberikan kepada penulis selama penelitian.

6. Mamah, Bapa, Adan, Teh Ina, yang tidak putus memberikan dukungan moril

maupun materil, kekuatan, semangat, dan do’a untuk penulis selama penelitian

berlangsung sampai selesainya skripsi ini.

7. Teman-teman seperjuangan Farmasi Angkatan 2012, terutama teman-teman

Tulip atas waktu dan kesediaannya mendengarkan keluhan, memberikan

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

bantuan, saran dan menyemangati penulis dari masa perkuliahan sampai

penelitian berlangsung dan tersusunnya skripsi ini.

8. Pihak lain yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu, yang telah

membantu penulis selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

Akhir kata, penulis berharap semoga Allah SWT berkenan membalas

segala kebaikan dari semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini dapat

bermanfaat khususnya bagi penulis dan umumnya bagi pembaca dalam

menambah wawasan.

Ciputat, Oktober 2016

Penulis,

Rifa Arifah Rahmah

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ..................................................................................... i

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ........................................ ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iv

ABSTRAK ..................................................................................................... v

ABSTRACT ................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR ................................................................................... vii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH .............................. ix

DAFTAR ISI .................................................................................................. x

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xv

BAB 1 PENDAHULUAN ............................................................................. 1 1.1 LatarBelakang ............................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ......................................................................... 2

1.3 Tujuan Penelitian........................................................................... 2

1.4 Manfaat Penelitian......................................................................... 4

BAB 2 KAJIAN PUSTAKA ......................................................................... 5

2.1 Glukosamin HCl ............................................................................ 5

2.1.1 Monografi ............................................................................ 5

2.1.2 Farmakologi ........................................................................ 6

2.1.3 Farmakokinetik .................................................................... 6

2.2 Nanopartikel Kitosan..................................................................... 7

2.3 Pereaksi Fenil Isotiosianat (PITC) ................................................ 8

2.3.1 Monografi ............................................................................ 8

2.3.2 Reaksi Derivatisasi .............................................................. 8

2.4 Derivatisasi Zat ............................................................................. 9

2.5 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi................................................. 10

2.5.1 Instrumentasi ....................................................................... 11

2.5.2 Fase Gerak ........................................................................... 14

2.5.3 waktu Retensi ...................................................................... 14

2.5.4 Efisiensi Kolom ................................................................... 15

2.5.5 Analisis Kuantitatif ............................................................. 15

2.6 Validasi Metode Analisis .............................................................. 15

2.6.1 Akurasi ................................................................................ 16

2.6.2 Presisi .................................................................................. 16

2.6.3 Linieritas dan Kisaran ......................................................... 16

2.6.4 LOD dan LOQ ..................................................................... 17

2.6.5 Kesesuaian Sistem ............................................................... 17

2.7 Metode Analisis Glukosamin HCl ................................................ 17

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 3 METODE PENELITIAN ................................................................. 21

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ 21

3.2 Alat ................................................................................................. 21

3.3 Bahan .............................................................................................. 21

3.4 Pembuatan Bahan ........................................................................... 21

3.4.1 Pembuatan Larutan Induk Glukosamin HCl ....................... 21

3.4.2 Pembuatan Larutan Dapar Fosfat o,3 M pH 8,0 ................. 22

3.4.3 Pembutan Larutan Fenil Isotiosianat 1% ............................ 22

3.5 Optimasi Kondisi Analisis ............................................................. 22

3.5.1 Penentuan Panjang Gelombang Analisis ............................. 22

3.5.2 Pemilihan Laju Alir Fase Gerak untuk Analisis ................. 22

3.6 Uji Kesesuaian Sistem .................................................................... 23

3.7 Validasi Metode Analisis ............................................................... 23

3.7.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Linieritas ......................... 23

3.7.2 Uji Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi ............... 24

3.7.3 Uji Presisi dan Uji Akurasi .................................................. 24

3.7.4 Uji Stabilitas Glukosamin Hasil Derivatisasi ...................... 24

3.8 Uji AnalisisGlukosamin dalam Kitosan Nanopaartikel ................ 25

3.8.1 Penyiapan Sampel Glukosamin dari Dispersi Nanopartikel 25

3.8.2 Analisis Glukosamin dari Dispersi Nanopartikel ................. 25

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 26

4.1 Optimasi Kondisi Analisis ............................................................ 26

4.2 Uji Kesesuaian Sistem .................................................................. 27

4.3 Validasi Metode Analisis .............................................................. 28

4.3.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Linieritas ......................... 28

4.3.2 Uji Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi ............... 29

4.3.3 Uji Presisi dan Uji Akurasi .................................................. 29

4.3.4 Uji Stabilitas Glukosamin Hasil Derivatisasi ...................... 30

4.4 Uji Analisis Glukosamin dalam Kitosan Nanopaartikel ................ 31

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 33

5.1 Kesimpulan ..................................................................................... 33

5.2 Saran .............................................................................................. 33

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 34

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Struktur Glukosamin HCl ........................................................... 5

Gambar 2.2 Struktur Kitosan .......................................................................... 7

Gambar 2.3 Struktur Fenil Isotiosianat (PITC) ............................................... 8

Gambar 2.4 Reaksi Derivatisasi Glukosamin HCl oleh PITC ........................ 9

Gambar 4.1 Kromatogram Glukosamin HCl laju alir (a) 1,0 mL/menit (b) 1,5

.mL/menit ...................................................................................... 27

Gambar 4.2 Kurva Kalibrasi glukosamin Hidroklorida ................................... 29

Gambar 4.3 Kromatogram Glukosamin HCl (a) 0 jam (b) 24 jam kering (c)

24.jam + fase gerak ...................................................................... 31

Gambar 4.4 Kromatogram Glukosamin HCl dari sampel cairan nanopartikel

.kitosan .......................................................................................... 32

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 4.1 Hubungan antara waktu retensi, jumlah lempeng teoritis,

efisiensi kolom, resolusi, dan faktor ikutan kromatogram PTC-

Glukosamin terhadap laju alir.......................................................... 27

Tabel 4.2 Data Uji Kesesuaian Sistem ............................................................. 28

Tabel 4.3 Data Kurva Kalibrasi ...................................................................... 29

Tabel 4.4 Data Akurasi dan Presisi ................................................................. 30

Tabel 4.5 Data Analisis Sampel Glukosamin dalam Nanopartikel Kitosan .... 31

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1 Kromatogram 3D Derivatisasi Glukosamin HCl ......................... 37

Lampiran 2 Data Uji Kesesuaian Sistem ........................................................ 38

Lampiran 3 Data Kurva Kalibrasi Glukosamin Hidroklorida ......................... 39

Lampiran 4 Perhitungan nilai LOD dan LOQ.................................................. 40

Lampiran 5 Perhitungan %RSD dan Perhitungan %diff .................................. 41

Lampiran 6 Data Uji Stabilitas ........................................................................ 42

Lampiran 7 Perhitungan Efisiensi Penjerapan ................................................. 43

1 UIN Syarif Hidayatullah jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Glukosamin (2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose) adalah suatu gula

amino dan termasuk ke dalam komponen glikosaminoglikan dan proteoglikan

dari matriks tulang rawan yang menutupi ujung tulang dan asam hialuronat

yang termasuk bagian dari cairan sinovial di dalam sendi (Fox dan Stephens,

2007). Seiring bertambahnya usia, produksi glukosamin berkurang sehingga

tidak memenuhi kebutuhan tubuh dan dapat menyebabkan penyakit

osteoarthritis (OA). Osteoarthritis merupakan hasil dari penurunan produksi

dan peningkatan degradasi matriks tulang rawan (Barclay, Tsourounis, dan

McCart, 1998). Bila hal itu terjadi, maka diperlukan tambahan glukosamin

dari luar (makanan atau suplemen).

Glukosamin dari luar dapat mempengaruhi jalur metabolik sintesis

glikosaminoglikan dan dapat menstimulasi prosuksi proteoglikan.

Glukosamin peroral diabsorpsi di saluran pencernaan kemudian mengalami

metabolisme lintas pertama yang signifikan dalam hati dan menghasilkan

bioavailabilitas (BA) 26% (Barclay, Tsourounis, dan McCart, 1998).

Rendahnya nilai BA dapat mengindikasikan juga rendahnya konsentrasi obat

pada sendi. Oleh karena itu, dilakukan pengembangan obat dengan sistem

penghantaran obat transdermal.

Glukosamin baik dalam bentuk garam sulfat atau hidroklorida bersifat

hidrofil yang menyebabkan kemampuan penetrasinya ke kulit cukup rendah.

Salah satu cara untuk meningkatkan penetrasi obat ke kulit dapat dilakukan

dengan memanfaatkan teknologi nanopartikel. Sistem penghantaran

nanopartikel membutuhkan suatu polimer, salah satu diantaranya adalah

kitosan yang sangat berpotensi menghasilkan penghantaran nanopartikel.

Nanopartikel kitosan dapat dibuat dengan metode gelasi ionik, di mana

larutan kitosan disambung silang dengan penyambung silang polianion

seperti natrium tripolifosfat (NaTPP).

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Salah satu evaluasi obat dengan teknologi nanopartikel adalah uji

efisiensi penjerapan zat aktif dalam nanopartikel, dalam hal ini untuk

mengetahui jumlah glukosamin yang terjerap dalam nanopartikel. Ada dua

macam metode untuk menganalisis zat aktif dalam sistem nanopartikel, yaitu

langsung (direct) dan tidak langsung (indirect). Metode analisis langsung

menganalisis dalam bentuk nanopartikelnya, sedangkan metode analisis tidak

langsung menganalisis zat aktif yang tidak berhasil terjerap oleh sistem

nanopartikel tersebut. Salah satu kelebihan dari metode analisis tidak

langsung terletak pada proses preparasi sampel yang akan dianalisis yang

prosesnya relatif lebih mudah dibandingkan metode analisis langsung. Pada

metode tidak langsung, preparasi sampel dilakukan dengan melakukan

sentrifugasi pada nanopartikel dan analisis dilakukan pada zat aktif yang

berada pada bagian supernatan. Pada metode langsung, preparasi sampel

dilakukan dengan memisahkan nanopartikel kemudian zat aktif diekstraksi

dari nanopartikelnya.

Dalam menganalisis nanopartikel kitosan yang mengandung

glukosamin perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu antara glukosamin dan

kitosannya. Analisis dapat dilakukan dengan menggunakan Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan detektor diode array (DAD). Cara ini

dipilih karena memiliki beberapa kelebihan, diantaranya: mampu

memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah

melaksanakannya, analisisnya cepat, dan memiliki kepekaan yang tinggi.

Glukosamin merupakan salah satu monomer dari kitosan. Tetapi, hal tersebut

tidak akan mengganggu analisis karena untuk memecah kitosan menjadi

monomernya dibutuhkan hidrolisis dengan larutan asam pada suhu tinggi

selama 6-10 jam atau dengan pemambahan α-amylase.

Glukosamin tidak memiliki gugus kromofor sehingga tidak menyerap

sinar pada daerah UV/Vis. Oleh karena itu, perlu dilakukan derivatisasi

sehingga menjadi senyawa berkromofor dan dapat dideteksi pada daerah UV.

Pereaksi yang dapat digunakan untuk derivatisasi glukosamin dengan

detektor UV, diantaranya: phenyl isothiocyanate (PITC) (Liang, Leslie,

Adebowale, Ashraf, dan Eddington, 1999), N-(9-fluorenyl-

3


methoxycarbonyloxy) succinimide (FMOC-Su) (Zhou, Waszkuc, and

Mohammed, 2005; Yan, Evenocheck, 2011); dan 1,2-naphthoquinone-4-

sulphonic acid sodium salt (NQS) (Hadad, Abdel-Salam, dan Emara, 2011).

Pereaksi FMOC-Su sudah tidak ada lagi di pasaran, sedangkan NQS memiliki

harga yang relatif lebih mahal daripada PITC, sehingga akan lebih efisien bila

penelitian ini menggunakan PITC.

Analisis dapat dilakukan jika metode yang digunakan telah divalidasi.

Validasi metode analisis dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis

akurat, spesifik, reproducible, dan tahan terhadap analit yang akan dianalisis

(Gandjar dan Rohman, 2007).

Berdasarkan latar belakang tersebut, akan dilakukan penelitian

mengenai validasi metode analisis glukosamin hidroklorida dengan

derivatisasi phenyl isothicyanate (PITC) dan aplikasinya pada dispersi

nanopartikel kitosan secara KCKT. Penelitian ini akan menggunakan metode

analisis nanopartikel tidak langsung dengan kondisi analisis mengikuti

metode penelitian optimasi proses derivatisasi glukosamin hidroklorida

dengan mengguanakan PITC yang dilakukan Tekko, I. A, dkk pada tahun

2006.

1.2 Rumusan Masalah

a. Bagaimana metode yang tervalidasi untuk analisis glukosamin

hidroklorida?

b. Apakah metode tersebut dapat diaplikasikan pada penentuan glukosamin

dalam dispersi nanopartikel kitosan secara kromatografi cair kinerja

tinggi?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk memperoleh metode yang tervalidasi

untuk analisis glukosamin hidroklorida dan aplikasinya pada penentuan

glukosamin dalam dispersi nanopartikel kitosan secara kromatografi cair

kinerja tinggi.

4


1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah untuk memberikan informasi mengenai

metode yang tervalidasi untuk analisis glukosamin hidroklorida dan

aplikasinya pada penentuan glukosamin dalam dispersi nanopartikel kitosan

secara kromatografi cair kinerja tinggi.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Glukosamin Hidroklorida (Glukosamin HCl)

Glukosamin adalah gula amino dan merupakan bagian dari struktur

polisakarida kitosan dan kitin, yang membentuk eksoskeleton Crustasea dan

arthropoda lainnya. Glukosamin dapat diproduksi secara komersial dengan

hidrolisis exoskeletons Crustacea atau dengan fermentasi jagung atau

gandum.

2.1.1 Monografi (Menurut Purwadi dalam Andriani, 2012)

Gambar 2.1 Struktur glukosamin hidroklorida

[Sumber: Han. In Hee., et al. Arch Pharm Res Vol 33, No 2, 293-299, 2010]

Glukosamin HCl memiliki rumus kimia C16H14NClO5, dengan

nama kimia 2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose hidrocloride. Nama

lain dari glukosamin HCl adalah chitosamine hydrochloride;

glucosamine, chlorhydrate de; glucosamini hydrochloridum;

glukozaminy hchlorowodorek; hidrocloruro de glucosamina.

Glukosamin berbentuk serbuk kristal putih dengan rasa agak manis dan

bau tidak spesifik dengan berat molekul 215,62. Memiliki kelarutan 1

bagian dalam 10 bagian air dengan pH 3,0 – 5,0 (dalam air).

Glukosamin harus disimpan dalam wadah kedap udara dan terlindung

dari cahaya.

6


2.1.2 Farmakologi

Glukosamin banyak digunakan baik di Eropa maupun di Amerika

Serikat (AS) dalam upaya untuk meringankan rasa sakit dan kecacatan

akibat osteoarthritis (OA). Selain itu, glukosamin juga merupakan

komponen dari sejumlah besar suplemen makanan di AS (Block,

Oegema, Sandy, dan Plaas, 2010). Ketertarikan pada glukosamin

berawal dari laporan mengenai manfaatnya pada hewan dan manusia,

dan fakta bahwa glukosamin dapat merangsang sintesis proteoglikan

dari artikular kartilago secara invitro dan memiliki profil keamanan

yang sangat baik (dipiro ed. 6, 2005). Terbukti pada penelitian preklinis

pada hewan percobaan bahwa glukosamin memiliki efek antiinflamasi

melalui pengurangan faktor nuklear kappa beta yang diinduksi oleh

Interleukin-1 (IL-1). Beberapa penelitian pada manusia juga telah

menunjukkan bahwa glukosamin HCl mengurangi produksi IL-1 yang

merangsang enzim katabolik dan penanda inflamasi seperti

prostaglandin E2 dengan sel kondrosit dan sinovial dari pasien dengan

OA (Fox dan Stephens, 2007).

2.1.3 Farmakokinetika

Sekitar 87% dari dosis oral glukosamin diserap pada saluran

pencernaan. Glukosamin mengalami metabolisme lintas pertama dalam

hati dan menghasilkan bioavailabilitas oral pada manusia 26%

sedangkan bioavailabilitas intramuskularnya adalah sekitar 96%.

Glukosamin didistribusikan ke banyak jaringan dengan konsentrasi

tertinggi ditemukan di hati, ginjal, dan tulang rawan artikular.

Glukosamin diekskresi terutama dalam urin dan diekskresi pada feses

pada persentasi kecil (pada pemberian intravena dan intramuskular).

Glukosamin juga dimetabolisme menjadi karbon dioksida dan

diekskresikan melalui paru-paru.

7


2.2 Nanopartikel Kitosan

Nanopartikel polimer (PNPs) adalah struktur dengan diameter mulai

dari 10-100 nm. PNPs dapat diperoleh dari polimer sintetis, seperti poli--

caprolactone, poliakrilamida dan poliakrilat, atau dari polimer alami,

misalnya, albumin, DNA, kitosan, dan gelatin. Berdasarkan sifat invivonya,

PNPs dapat diklasifikasikan sebagai biodegradable, seperti poli-(L-laktida)

(PLA), poliglikolida (PGA), dan non-biodegradable, misalnya, poliuretan

(Wilczewska, Niemirowicz, Markiewicz,dan Car, 2012).

Gambar 2.2 Struktur kitosan

[Sumber: Rodrigues, Susana et al. J. Funct. Biomater 3, 615-641, 2012]

Kitosan adalah derivat N-deasetilasi kitin, bersifat biodegradable,

berupa polimer kationik yang terdiri dari unit -(1-4)-D-glucosamine (unit

deasetilasi) dan N-acetyl-glucosamine (unit terasetilasi) yang terdistribusi

sercara acak. Kitosan telah banyak digunakan dalam bidang biomedik,

pengembangan sistem penghantaran obat, dan dapat diaplikasikan dalam

berbagai sediaan, diantaranya: gel, film, microsphare, tablet, dan lapisan

untuk liposom. Kitosan berbentuk serbuk atau serpihan, tidak berbau,

berwarna krem-putih dengan densitas 1,35-1,40 g/cm3. Memiliki kelarutan

yang sedikit larut dalam air, praktis tidak larut dalam etanol (95%), pelarut

organik lainnya dan larutan netral atau alkali dengan pH diatas 6,5. Kitosan

larut dengan cepat dalam asam organik seperti asam formiat, asam sitrat dan

asam asetat. Serbuk kitosan merupakan bahan yang stabil dalam suhu ruang

dan dapat disimpan dalam wadah tertutup baik ditempat yang kering dan

sejuk. Kitosan memiliki nilai pH 4.0-6.0 (pada 1% w/v larutan air). Pada pH

fisiologis,gugus amina primer kitosan terprotonasi, dan bermuatan positif

8


sehingga dapat membentuk nanopartikel dalam larutan melalui cross-linking

dengan polianion.

2.3 Fenil isotiosianat (Phenyl Isothiocyanate, PITC)

2.3.1 Monografi

Gambar 2.3 Struktur fenil isotiosianat (PITC)

[Sumber: www.biosynth.com/en/products/organic-synthesis/basic-

intermediates/products/J-802269.html, 2016]

Fenil isotiosianat memiliki rumus kimia C7H5NS, dengan nama

lain benzene, isothiocyanato-; benzene-1-isothiocyanate;

fenylisothiokyanat; iso thiocyanatobenaene; isothiocyanatobenzen;

isothiocyanatobenzene; isothiocyanato benzene; phenyl thiocyanate.

PITC berbentuk cairan tidak berwana sampai berwarna kuning pucat

dengan bau menusuk dengan berat molekul 135,19 dan berat jenis

1,132 g/mL pada 20˚C. Tidak larut dalam air dengan kemurnial 98%,

titik leleh -21˚C dan titik didih 218˚C. PITC merupakan senyawa yang

stabil, mudah terbakar, inkompatibel dengan agen pengoksidasi kuat

dan asam kuat. Sebaiknya PITC disimpan pada suhu 2-8˚C.

2.3.2 Reaksi

Fenil isotiosianat digunakan sebagai pereaksi derivatisasi untuk

amina primer dan sekunder. Reaksi PITC dengan gula amino alkohol

(seperti glukosamin) menghasilkan senyawa yang dapat dideteksi oleh

spektrofotomrter UV/Vis pada panjang gelombang 245 nm dengan hasil

derivatisasi berupa phenylthiocarbamyl (PTC)-gula amino alkohol

(PITC-Glukosamin) yang stabil pada keadaan kering namun menjadi

kurang stabil pada keadaan asam.

http://www.biosynth.com/en/products/organic-synthesis/basic-intermediates/products/J-802269.html

http://www.biosynth.com/en/products/organic-synthesis/basic-intermediates/products/J-802269.html

9


Gambar 2.4 Reaksi derivatisasi glukosamin oleh PITC

[Sumber: Anumula dan Taylor, 1991, Telah diolah kembali]

2.4 Derivatisasi Zat (Gandjar dan Rohman, 2007; Nollet dan Toldrá, 2012)

Derivatisasi zat dilakukan untuk menghasilkan senyawa yang tadinya

tidak bisa dideteksi menjadi bisa dideteksi pada daerah UV atau

meningkatkan daya deteksinya sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.

Beberapa syarat dari suatu reaksi derivatisasi yang baik, diantaranya: produk

yang dihasilkan harus mampu menyerap sinar ultraviolet atau sinar tampak

atau dapat membentuk senyawa berfluorosensi sehingga dapat dideteksi

dengan spektrofluorometri, proses derivatisasi cepat dan menghasilkan

persentase produk sebesar mungkin, produk hasil derivatisasi stabil selama

proses derivatisasi dan deteksi, dan sisa pereaski tidak mengganggu

pemisahan kromatografi. Derivatisasi pada KCKT dapat dilakukan sebelum

zat masuk ke dalam kolom (pre-column derivatization), atau setelah kolom

(post-column derivatization).

Pada derivatisasi sebelum kolom, analit diderivatisasi lebih dulu

sebelum diinjeksikan kedalam kromatografi. Pereaksi derivatisasi yang umum

digunakan untuk deteksi dengan spektrofotometri UV-Vis diantaranya phenyl

isothiocyanate (PITC), butylisothiocyanate (BITC), dan diethyl

ethoxymethylenemalonate.

Pada derivatisasi setelah kolom, analit diinjeksikan dahulu ke dalam

kolom lalu diderivatisasi setelah keluar dari kolom (sebelum mencapai

detektor). Keuntungan dari pendekatan ini adalah sifat kromatografis zat

10


dapat digunakan untuk pemisahan dan menghindari adanya gangguan dari zat

penderivat, sedangkan kerugian utamanya adalah terjadinya sejumlah

pelebaran pita, dan kemungkinan zat dirusak oleh proses oksidasi, reduksi,

dan lain-lain. Untuk melakukan derivatisasi setelah kolom, sistem KCKT

harus dimodifikasi dengan penambahan sistem penghantaran cairan sekunder.

Sistem reaksi derivatisasi setelah kolom adalah dengan mencampur aliran

eluen dari kolom KCKT dengan aliran larutan pereaksi kemudian campuran

mengalir melalui reaktor selama waktu tertentu untuk reaksi kimia. Reaktor

dapat dipanaskan, jika diperlukan, untuk mempercepat reaksi derivatisasi.

Campuran aliran selanjutnya dilewatkan melalui detektor. Pereaksi yang biasa

digunakan untuk derivatisasi post-column diantaranya ninhidrin,

fluorescamine, dan o-phthalaldehyde (OPA).

2.5 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Harmita; Gandjar dan Rohman, 2007)

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan pada

perbedaan distribusi dari komponen penyusun campuran tersebut diantara

fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase).

Berdasarkan polaritas fase diam dan fase geraknya, kromatografi

dibedakan menjadi: fase normal (kolom atau fase diam bersifat polar, seperti

silika dan fase gerak bersifat nonpolar, seperti heksan) dan fase terbalik

(kolom atau fase diam bersifat nonpolar, seperti rantai karbon panjang C8 atau

C18 dan fase gerak bersifat polar, seperti air dan alkohol). Berdasarkan pada

mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi: kromatografi

absorpsi, kromatografi partisi, kromatografi pasangan ion, kromatografi

penukar ion, kromatografi eksklusi ukuran, dan kromatografi afinitas.

Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dibedakan atas

kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi cair kinerja tinggi

(KCKT), dan kromatografi gas.

KCKT merupakan metode yang tidak destruktif, dapat memisahkan

komponen-komponen tidak mudah menguap, dan dapat digunakan untuk

analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT banyak digunakan untuk

menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam amino, asam

11


nukleat, dan protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa aktif

obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk degradasi dalam

sediaan farmasi; memonitor sampel yang berasal dari lingkungan;

memurnikan senyawa dalam suatu campuran; memisahkan polimer dan

menentukan distribusi berat molekulnya dalam campuran; kontrol kualitas;

dan mengikuti jalannya reaksi sintesis.

Kekurangan dari metode KCKT ada pada kemampuannya dalam

identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer

massa dan jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit

diperoleh. Sedangkan keuntungan dari metode KCKT diantaranya: waktu

analisis cepat, memiliki daya pisah yang baik, pemilihan kolom dan eluen

sangat bervariasi, kolom dapat digunakan kembali, dan dapat digunakan

untuk molekul besar maupun kecil.

2.5.1 Instrumentasi

a. Wadah fase gerak

Dapat digunakan wadah pelarut kosong atau labu laboratorium

dengan kondisi wadah yang bersih dan lembam (inert).

b. Pompa

Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses

penghantaran fase gerak berlangsung secara cepat, reproducible,

konstan, dan bebas dari gangguan. Pompa yang digunakan harus

inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa

adalah gelas, baja tahan karat, teflon, atau batu nilam. Ada dua jenis

pompa, yaitu pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan

aliran fase gerak yang konstan. Pompa yang digunakan sebaiknya

mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu

mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 mL/menit.

c. Injektor

Injektor berfungsi untuk memasukkan sampel ke dalam kolom.

12


d. Kolom

Kolom adalah bagian paling penting dalam kromatografi karena di

sinilah proses pemisahan berlangsung. Berhasil atau gagalnya suatu

analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan

yang digunakan. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu

kolom analitik (diameter dalam 2-6 mm dengan panjang kolom

tergantung pada jenis material pengisi kolom) dan kolom preparatif

(umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih dan panjang kolom

25-100 cm). Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan

biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, atau temperatur yang

lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan

kromatografi eksklusi. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan

fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu

memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran rendah, sedang,

maupun tinggi.

e. Detektor

Detektor digunakan untuk mendeteksi analit yang telah dipisahkan.

Detektor dikelompokan dalam dua kelompok, yaitu: detektor

universal (mendeteksi analit secara umum, tidak spesifik, tidak

selektif) dan detektor spesifik (mendeteksi senyawa secara spesifik

dan selektif). Karakteristik detektor yang ideal adalah mempunyai

respon terhadap solut yang cepat dan reproducible, mempunyai

sensitifitas yang tinggi, stabil dalam pengoperasian, mempunyai sel

volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita,

sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut

pada kisaran yang luas, dan tidak peka terhadap perubahan suhu dan

kecepatan alir fase gerak. Beberapa detektor yang sering digunakan

pada KCKT:

1) Detektor Spektrofotometri UV/Vis

Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi UV (190-

380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) oleh analit yang yang

memiliki struktur atau gugus kromoforik. Detektor

13


spektrofotometri UV/Vis dapat berupa detektor dengan panjang

gelombang tetap dan detektor dengan panjang gelombang

bervariasi.

2) Detektor Photodiode-Artay (PDA)

Detektor PDA merupakan detektor UV/Vis dengan beberapa

keistimewaan. Detektor ini mampu memberikan kumpulan

kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang

berbeda dalam sekali proses (single run). Spektrum dan

kromatogram yang dihasilkan dapat ditampilkan sebagai plot 3

dimensi absorbansi, panjang gelombang, dan waktu kemudian

dibandingkan dengan data 3 dimensi dari perpustakaan data yang

ada di komputer sehingga bisa digunakan untuk tujuan identifiksi.

3) Detektor Fluoresensi

Fluoresensi merupakan fenomena luminisensi yang terjadi ketika

suatu senyawa menyerap sinar UV atau visible lalu

mengemisikannya pada panjang gelombang yang lebih besar.

Kelemahan detektor ini adalah rentang linieritasnya yang sempit

sedangkan keunggulannya adalah memiliki sensitifitas dan

selektifitas yang tinggi.

4) Detektor Indeks Bias

Detektor Indeks Bias termasuk dalam detektor universal yang

mampu memberikan respon (signal) pada setiap zat terlarut.

Indeks bias pada kedua sel (sampel dan pembanding) harus sama

persis agar didapat garis dasar yang stabil, sehingga tidak

dianjurkan untuk elusi bergradien.

5) Detektor Elektrokimia

Banyak senyawa organik (termasuk obat) dapat dioksidasi atau

direduksi secara elektrokimia pada elektroda yang cocok.

Kepekaan detektor elektrokimia umumnya tinggi. Fase gerak

yang digunakan ketika menggunakan detektor ini harus

menggunakan elektrolit pendukung sehingga fase geraknya harus

yang bersifat polar.

14


f. Komputer, Integrator, atau Rekorder

Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, atau rekorder

dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal

elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya

menjadi suatu kromatogram yang selanjutnya dievaluasi.

2.5.2 Fase Gerak

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang

dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam elusi dan

resolusi yang ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas

fase diam, dan sifat komponen analit. Untuk fase normal, kemampuan

elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut, sedangkan

untuk fase terbalik, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya

polaritas pelarut.

Sebelum digunakan fase gerak harus dilakukan degassing

(penghilangan gas) sebab adanya gas dapat mengacaukan analisis. Perlu

digunakan pelarut, dapar, dan reagen dengan kemurnian tinggi (atau

HPLC grade). Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan

gangguan pada sistem kromatografi. Adanya partikel kecil dapat

terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehinga dapat

mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak

tetap selama elusi) atau dengan cara gradien (komposisi fase gerak

berubah-ubah selama elusi). Elusi dengan gradien terutama digunakan

untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika

sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.

2.5.3 Waktu Retensi

Waktu retensi (tR) merupakan lamanya waktu yang dibutuhkan

solut untuk melewati kolom menuju detektor sedangkan waktu mati (t0

atau tM) merupakan waktu yang dibutuhkan oleh solut yang tidak

15


tertahan oleh kolom dan bermigrasi dengan kecepatan yang sama

dengan fase gerak (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.4 Efisiensi Kolom

Parameter efisiensi kolom pada kromatografi yang biasanya

digunakan adalah jumlah lempeng atau plate number teoritis (N) dan

tinggi setara pelat teori atau height equivalent theorotical plate (HETP).

HETP adalah panjang kolom kromatografi (mm) yang diperlukan

sampai terjadinya keseimbangan molekul solut dalam fase gerak dan

fase diam. Kolom yang memberikan jumlah lempeng (N) yang besar

dan nilai HETP yang kecil akan mampu memisahkan komponen-

komponen dalam dalam suatu campuaran dengan baik yang berarti

bahwa efisiensi kolom besar (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.5 Analisis Kuantitatif

Dasar perhitungan kuantitatif untuk suatu komponen zat yang

dianalisis adalah dengan mengukur luas area atau tinggi area yang akan

berbanding langsung dengan banyaknya solut yang dikromatografi jika

dilakukan pada detektor yang linier. Tinggi puncak diukur sebagai jarak

dari garis dasar ke puncak maksimum sedangkan luas area diukur

sebagai hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi.

Integrator akan mengukur luas area dan mengubahnya dalam bentuk

angka (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.6 Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.

Beberapa parameter dalam validasi metode analisis:

16


2.6.1 Akurasi (accuracy) (Harmita, 2004)

Kecermatan merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan

antara hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan

dapat dinyatakan sebagai persen differential (%diff). Persen differential

dinyatakan sebagai perbandingan antara hasil yang diperoleh dengan

hasil yang sebenarnya. Rentang %diff yang diijinkan adalah 2%.

2.5.1 Presisi (precision) (Harmita, 2004)

Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat

kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil

individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada

sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen.

Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability)

atau ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah keseksamaan

metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi

sama dan dalam interval waktu yang pendek. Ketertiruan adalah

keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda.

Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang

berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang

berbeda pula. Presisi mencakup: SD (standar deviasi) dan %RSD

(persen standar deviasi relatif). Semakin kecil nilai SD dan %RSD dari

serangkaian pengukuran, maka metode yang diguanakan semakin tepat.

Percobaan keseksamaan dilakukan terhadap paling sedikit enam

sampel yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang

homogen. Secara umum, kriteria seksama dapat diberikan jika metode

memberikan %RSD atau KV 2% atau kurang.

2.5.2 Linieritas dan Kisaran (range) (Harmita, 2004)

Linearitas adalah kemampuan metode analisis untuk memperoleh

hasil uji yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi

matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam

sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi

17


analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan,

keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima. Digunakan satu seri

larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50–150% kadar analit

dalam sampel. Jumlah sampel yang dianalisis sekurang-kurangnya

delapan buah sampel blanko.

Koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linier Y = a + bX

digunakan sebagai parameter adanya hubungan linier. Hubungan linier

yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau –1, sedangkan nilai a

menunjukkan kepekaan analisis.

2.5.3 Batas deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ) (Harmita,

2004)

Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang

dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan

dibandingkan dengan blangko namun tidak selalu diukur, sedangkan

batas kuantitasi diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel

yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.

2.5.4 Kesesuaian Sistem (Gandjar dan Rohman, 2007)

Kesesuaian sistem didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk

menjamin bahwa metode tersebut dapat menghasilkan data yang dapat

diterima. Dari validasi metode yang dilakukan dapat diketahui apakah

suatu metode analisis (dalam hal ini kromatografi) dapat dipakai pada

suatu kondisi tertentu.

2.7 Metode Analisi Glukosamin HCl

Beberapa studi yang berkaitan dengan metode analisis derivatisasi

glukosamin HCl yang telah dipublikasikan:

a. Optimasi kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik untuk mengevaluasi

penyerapan glukosamin hidroklorida perkutan (Tekko, Ismaiel A, Michael

C. Bonner, Adrian C. Williams, 2006)

Kondisi:

18


Metode KCKT berdasarkan reaksi dari phenylisothiocyanate (PITC)

dengan glukosamin (GL) dalam media basa untuk menentukan glukosamin

hidroklorida yang berpenetrasi melalui kulit manusia secara in vitro.Reaksi

menghasilkan feniltiokarbamil-glukosamin (PTC-GL) yang dipisahkan

pada kolom fase-balik (RP) 5μm ODS (C18) menggunakan detektor diode

array (DAD) pada 245 nm. Fase geraknya adalah metanol-air- asam asetat

glasial (10,00 : 89,96 : 0,04 v/v/v, pH 3,5) pada laju alir 1 ml/min dan suhu

kolom pada 30°C. Reaksi derivatisasi terjadi pada kondisi suhu 80˚C, 30

min dan 1% v/v. Galactosamine hidroklorida (Gal-HCl) digunakan sebagai

standar internal. PTC-Gal dan GL terelusi pada 8,9 dan 9,7 menit. Respon

detektor linier pada kisaran konsentrasi 0-1000 ug/ml. Pengujian

robustness dengan presisi intra dan inter-day (% standar relatif deviasi,%

R.S.D.) <12. Akurasi intra dan inter-day (% kesalahan relatif,% RE)

adalah ≤-5.60 dan ≤-8,00.

b. Penetapan kadar glukosamin hidroklorida dalam bahan baku, bentuk

sediaan, dan plasma menggunakan derivatisasi pra-kolom secara KCKT

dengan detektor ultraviolet (Liang, Zhongming, James Leslie, Abimbola

Adebowale, Ashraf Mohammed, Eddington, Natalie D. 1999)

Kondisi:

Analisis sampel dengan KCKT detektor UV/Vis pada panjang gelombang

254 nm, menggunakan kolom C18, dan fase gerak metanol:air:asam asetat

(10,00 : 89,96 : 0,04 v/v/v) dengan kecepatan alir 1,2 mL/menit dan

diderivatisasi dengan fenilisotiosianat (PITC). Didapatkan rentang

linieritas pada kurva kalibrasi sebesar 0,99 dengan konsentrasi 6,65-16,63

μg/mL, presisi 5% pada semua konsentrasi, dan akurasi intra-day dan

inter-day 2,54-2,70%.

c. Penentuan glukosamin sulfat dan kitosan dalam bahan mentah dan bentuk

sediaan dengan KCKT ( El-Saharty, Yasser dan Bary, Ahmed Abdel,

2002)

Kondisi:

Analisis glukosamin dan (-1-4)-polymeric dari kitosan dengan KCKT

detektor indeks refraktif, menggunakan kolom aminophase, dan fase gerak

19


asetonitril:air:asam asam asetat (50 : 50 : 0,02) pH 4,0 dengan volume

injeksi 20 μL. Didapatkan rentang linieritas pada kurva kalibrasi sebesar

0,99 dengan konsentrasi 20-1000 μg/mL, presisi pada sampel bentuk

sediaan tidak kurang dari 3% pada semua konsentrasi.

d. Penentuan glukosamin pada bahan mentah dan suplement makanan

mengandung glukosamin sulfat dan/atau glukosamin hidroklorida secara

KCKT dengan derivatisasi FMOC-Su: sebuah studi kolaboratif (Zhou,

Joseph Ziqi, Ted Waszkuc dan Felicia Mohammed, 2005)

Kondisi:


265 nm, menggunakan kolom ODS (C18), dan fase gerak bergradien

selama 15 menit dengan fase gerak A =0,05% TFA (0,5 mL TFA dan 1L

air) dan fase gerak B = asetonitril 100%, kecepatan alir 0,8 mL/menit dan

diderivatisasi dengan N-(9-fluorenyl-methoxycarbonyloxy) succinimide

(FMOC-Su). Didapatkan perolehan kembali pada puncak spike 100%

adalah 99,0% dengan %RSD 2,1% dan puncak spike 150% adalah 101%

dengan %RSD 2,3%. Hasil tes antar laboratorium menunjukan nilai

ketertiruan (reproducible) 4,0% dan keterulangan (repeatable) 0,7%.

e. Analisis kitosan menggunakan hidrolisis asam dan KCKT/UV (Yan, Xun

dan Heidii M. Evenocheck, 2012)

Kondisi:


265 nm, menggunakan kolom ODS (C18), dan fase gerak bergradien

dengan fase gerak A =70% dari 0,05% TFA dalam air dan fase gerak B =

30% asetonitril dimana setelah 6 menit diganti menjadi 100% asetonitril,

dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit, volume injeksi 10 μL, dan

diderivatisasi dengan N-(9-fluorenyl-methoxycarbonyloxy) succinimide

(FMOC-Su). Kitosan dapat dihidrolisis dengan asam secara kuatitatif

menjadi glukosamin dengan 10 M HCl pada suhu 105˚C atau 12 M HCl

pada suhu 90˚C selama 6 jam. Metode selanjutnya divalidasi untuk

linieritas, presisi, dan akurasi pada kitosan dan formulasi suplement yang

mengandung kitosan.

20


f. Penentuan glukosamin dan carisoprodol pada sediaan farmasi secara

kromatografi cair dengan derivatisasi sebelum kolom dan deteksi

ultraviolet (Hadad, Ghada M., Randa A. Abdel Salam dan Samy Emara,

2012)

Kondisi:

Analisis glukosamin dengan atau tanpa kombinasi carisoprodol dengan

KCKT detektor UV/Vis pada panjang gelombang 280 nm, menggunakan

kolom ODS (C18), dan fase gerak asetonitril:air (10 : 90) pH 7,3 yang

disesuaikan oleh NaOH 0,1 M, kecepatan alir 1,0 mL/menit dan

diderivatisasi dengan 1,2-naphtoquinone-4-sulphonic acid sodium (NQS)

dan dapar borat dan volume injeksi 20 μL. Derivatisasi dilakukan dalam

kondisi optimum NQS 100 ppm, dapar borat 0,1 M, pH 8,5 selama 20

menit pada suhu 70˚C .


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia

FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, selama tiga bulan dimulai dari bulan

Juni samapi dengan September 2016.

3.2 Alat

Kromatografi cair kinerja tinggi (JBIC Loan IP – 530 OGAWA SEIKI

DIONEX), kolom ODS/C18 5 μm (4,6 x 250 mm), dan pengolah data pada

komputer, syringe, sonikator (Elmasonic), pH meter, timbangan analitik,

sentrifugator, tabung sentrifugasi, vortex, magnetic stirer, buret, pipet mikro,

mikrotip kuning dan biru, pipet tetes, alat alat gelas, turbo evaporator

(TurboVap® LV), lemari pendingin (Sanyo Medicool), dan oven (Memmert).

4.3 Bahan

Glukosamin hidroklorida, phenyl isotiosianat (PITC) (Sigma-Aldrich),

aquabidest (Otsuka), metanol pro HPLC (Merck), natrium dihidrogen fosfat

(Na2HPO4) (Merck), asam fosfat 85%, asam asetat glasial (Merck), kitosan,

natrium tripolifosfat (Na-TPP), dan aquadest.

4.4 Pembuatan Bahan

4.4.1 Pembuatan Larutan Induk Glukosamin HCl

Ditimbang secara seksama 25,5 mg glukosamin HCl, dilarutkan

dengan aquabidest, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25,0 mL,

dan ditambahkan sampai tanda batas sehingga diperoleh larutan

glukosamin HCl dengan konsentrasi 1,02 mg/mL (1020 ppm).

Dilakukan pengenceran untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi

tertentu.

22


4.4.2 Pembuatan Larutan Dapar Fosfat 0,3 M pH 8,0

Ditimbang 2,1293 gram dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4),

kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, dilarutkan dengan

aquabidest, dan ditambahkan aquabidest sampai tanda batas. Periksa pH

larutan, kemudian disesuaikan hingga mencapai pH 8,0 dengan asam

fosfat 85%.

4.4.3 Pembuatan Larutan PITC 1%

Diambil 50 μL PITC, dilarutkan dengan metanol, kemudian

dimasukkan ke dalam labu ukur 5,0 mL, dan ditambahkan sampai tanda

batas.

4.5 Optimasi Kondisi Analisis

4.5.1 Penentuan Panjang Gelombang Analisis

Larutan standar glukosamin HCl diderivatisasi dengan cara

konsentrasi 204 ppm diambil sebanyak 400 μL dimasukkan ke dalam

tabung reaksi, kemudian ditambahkan 250 μL 0,3 M dapar fosfat pH

8,0 dan 200 μL metanol. Campuran tersebut dikocok dan dibiarkan

selama 15 menit, kemudian ditambahkan 250 μL larutan PITC 1%.

Sampel divortex selama 15 detik, kemudian ditempatkan di oven pada

suhu 80˚C selama 30 menit. Sampel kemudian dievaporasi dalam alat

turbo evaporator sampai kering pada suhu 50˚C di bawah gas nitrogen.

Setelah kering, residu dilarutkan dalam 4 mL fase gerak KCKT

sehingga konsentrasi akhir yang dihasilakan adalah 20,4 ppm. Larutan

diambil sebanyak 20 μL kemudian disuntikkan ke dalam KCKT dengan

komposisi fase gerak: metanol-aquabidest-asam asetat (10,00 : 89,96 :

0,04) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit dengan metode 3D. Dicatat

panjang gelombang analisisnya dari kromatogram 3D.

4.5.2 Pemilihan Laju Alir Fase Gerak untuk Analisis

Larutan standar glukosamin HCl konsentrasi 204 ppm

diderivatisasi dengan cara yang sama seperti poin sebelumnya. Setelah

23


kering, residu dilarutkan dalam 4 mL fase gerak KCKT sehingga

konsentrasi akhir yang dihasilkan adalah 20,4 ppm. Larutan diambil

sebanyak 20 μL kemudian disuntikkan ke dalam KCKT dengan

komposisi fase gerak: metanol-aquabidest-asam asetat (10,00 : 89,96 :

0,04) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit dan 1,5 mL/menit. Kemudian

dicatat waktu retensi (tR), dihitung faktor ikutan (Tf), jumlah lempeng

teoritis (N), HETP, dan %RSD.

4.6 Uji Kesesuaian Sistem

Larutan standar glukosamin HCl konsentrasi 204 ppm diderivatisasi

dengan cara yang sama seperti poin sebelumnya. Setelah kering, residu

dilarutkan dalam 4 mL fase gerak KCKT sehingga konsentrasi akhir yang

dihasilkan adalah 20,4 ppm. Larutan diambil sebanyak 20 μL kemudian

disuntikkan ke dalam KCKT dengan kondisi analisis terpilih. Prosedur ini

diulang sebanyak lima kali. Kemudian dicatat waktu retensi (tR), dihitung

faktor ikutan (Tf), jumlah lempeng teoritis (N), HETP, dan %RSD.

4.7 Validasi Metode Glukosamin HCl

4.7.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas

Larutan standar glukosamin HCl dengan konsentrasi 40,8; 81,6;

122,4; 163,2; dan 204 ppm diderivatisasi dengan cara yang sama seperti

poin sebelumnya. Setelah kering, residu dilarutkan dalam 4 mL fase

gerak KCKT sehingga konsentrasi akhir yang dihasilakan adalah 4,08;

8,16; 12,24; 16,32; dan 20,4 ppm. Larutan diambil sebanyak 20 μL

kemudian disuntikkan ke dalam KCKT dengan kondisi analisis terpilih.

Dari data pengukuran dibuat kurva kalibrasi dengan menggunakan

persamaan garis regresi linear (y=a+bx), dimana x adalah konsentrasi

glukosamin HCl dan y adalah luas area glukosamin HCl. Dari

persamaan garis regresi linear kemudian diperoleh koefisien korelasi (r)

yang menunjukan linieritasnya.

24


4.7.2 Uji Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) dihitung secara

statistik pada garis linier dari kurva kalibrasi.

4.7.3 Uji Presisi dan Uji Akurasi

Larutan standar glukosamin HCl dengan tiga konsentrasi (3 kali

nilai LOQ, 50% dan 90% dari konsentrasi tertinggi kurva kalibrasi)


kering, residu dilarutkan dalam 4 mL fase gerak KCKT. Larutan

diambil sebanyak 20 μL kemudian disuntikkan ke dalam KCKT dengan

kondisi analisis terpilih. Prosedur diulang sebanyak tiga kali pada

masing-masing konsentrasi untuk menilai presisi secara intra-day dan

prosedur diulang pada dua hari berturut-turut untuk menilai presisi

secara inter-day. Dari data yang diperoleh, dihitung nilai %RSD pada

masing-masing konsentrasi untuk uji presisi dan %diff untuk uji

akurasi.

4.7.4 Uji Stabilitas Hasil Derivatisasi

Larutan standar glukosamin HCl konsentrasi 204 ppm


kering, residu dilarutkan dalam 4 mL fase gerak KCKT sehingga

konsentrasi akhir yang dihasilakan adalah 20,4 ppm. Sampel pertama

langsung dilarutkan dalam fase gerak (konsentrasi akhir yang

dihasilakan adalah 20,4 ppm) dan langsung disuntikkan. Sampel kedua

disimpan selama rentang waktu 24 jam, kemudian sampel dilarutkan

dalam fase gerak (konsentrasi akhir yang dihasilakan adalah 20,4 ppm)

dan disuntikkan ke KCKT dengan kondisi kromatografi terpilih.

Sampel ketiga disimpan dengan fase gerak selama 24 jam dan

disuntikkan ke KCKT dengan kondisi kromatografi terpilih. Gejala

ketidakstabilan zat dapat diamati dengan mengamati luas area

kromatogram dan bentuk kromatogram.

25


4.8 Uji Analisis pada Sampel Glukosamin dalam Kitosan Nanopartikel

4.8.1 Penyiapan Sampel Glukosamin dari Dispersi Nanopartikel

Nanopartikel Kitosan yang mengandung glukosamin HCl dibuat

dengan cara melarutkan 1 gram glukosamin HCl ke dalam 40 ml larutan

kitosan 1% dalam asam asetat 1%. Sebanyak 10 ml larutan Na-TPP

0,2%, ditambahkan ke dalam larutan kitosan untuk dilakukan sambung

silang sambil diaduk menggunakan bantuan pengaduk magnetik hingga

terbentuk dispersi nanopartikel. Konsentrasi akhir glukosamin HCl

dalam cairan nanopartikel adalah 1 gram/50 mL atau 20000 ppm.

4.8.2 Analisis Glukosamin dari Dispersi Nanopartikel

Dispersi nanopartikel diambil, dimasukkan ke dalam tube

sentrifuge berukuran 2 mL dan disentrifugasi pada 13000 rpm selama

20 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk diambil untuk

diderivatisasi dan dianalisis pada kondisi kromatografi terpilih dengan

pengenceran 600 kali.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Optimasi Kondisi Analisis

4.1.1 Penentuan Panjang Gelombang Analisis

Metode analisis yang digunakan pada penelitian ini mengikuti

metode penelitian yang dilakukan Tekko, dkk (2006) mengenai

optimasi proses derivatisasi glukosamin HCl dengan menggunakan

fenil isotiosianat (PITC). Berdasarkan metode tersebut, panjang

gelombang yang digunakan adalah 245 nm. Pada penelitian ini, untuk

membuktikan bahwa hasil derivatisasi glukosamin dengan PITC

dianalisis pada panjang gelombang tersebut maka dilakukan dengan

menganalisis standar glukosamin yang telah diderivatisasi dan dibuat

kromatogram 3D-nya pada kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)

dengan menggunakan detektor dioda array (DAD). Dari hasil

kromatogram 3D tersebut, dapat disimpulkan bahwa hasil derivatisasi

glukosamin dan PITC dianalisis pada panjang gelombang 245 nm.

4.1.2 Pemilihan Laju Alir Fase Gerak untuk Analisis

Pada tahap pemilihan komposisi fase gerak digunakan larutan

glukosamin standar. Kondisi awal analisis adalah metanol-air-asam

asetat glasial (10,00 : 89,96 : 0,04) dengan laju alir 1,0 mL/menit. Pada

kondisi ini glukosamin terpisah dengan waktu retensi 14,752 menit.

Pada kondisi fase gerak tersebut waktu retensi yang dihasilkan terlalu

lama. Oleh karena itu, dilakukan percobaan dengan menggunakan laju

alir 1,5 mL/menit dengan komposisi fase gerak yang sama. Pada laju

alir 1,5 mL/menit, puncak yang dihasilkan menjadi dua dengan waktu

retensi 11,007 menit tetapi memiliki jumlah lempeng teoritis (N),

HETP, faktor ikutan (Tf) dan resolusi yang lebih buruk, sehingga laju

alir yang digunakan adalah 1,0 mL/menit.

27


a. b.

Gambar 4.1 Kromatogram glukosamin HCl dengan (a) laju alir 1,0 mL/menit (b)

laju alir 1,5 mL/menit

Tabel 4.1. Hubungan antara waktu retensi, jumlah lempeng teoritis, resolusi,

dan faktor ikutan kromatogram glukosamin terhadap laju alir

Laju alir

(mL/menit)

Waktu

retensi

(menit)

Jumlah

lempeng

teoritis.(N)

HETP Faktor ikutan

(asimetrisitas)

Resolusi

1,0 14,752 6819 0,036 1,70 2,03

1,5 11,007 1590 0,157 1,08 n.a

Persyaratan > 2500 Semakin

kecil,

maka

efisiensi

kolom

semakin

baik

< 2 ≥ 1,5

4.2 Uji Kesesuaian Sistem

Secara normal terdapat variasi dalam peralatan dan teknik analisis

sehingga uji kesesuaian sistem perlu dilakukan. Uji kesesuaiaan sistem perlu

dilakukan sebelum metode analisis terpilih dilaksanakan untuk memastikan

sistem operasional akhir adalah efektif dan memberikan jaminan bahwa

sistem kromatografi yang digunakan akan bekerja dengan baik selama

analisis berlangsung. Dari hasil 5 kali penyuntikan, dihitung %RSD luas area

dan waktu retensi, jumlah lempeng teoritis (N), HETP, faktor ikutan

(asimetrisitas) dan resolusi. Dari data tersebut dapat terlihat persyaratan untuk

uji kesesuaian sistem telah terpenuhi.

28


Tabel 4.2. Data uji kesesuaian sistem

Waktu

retensi

(menit)

Luas area

(mAU)

Jumlah

lempeng

teoritis (N)

HETP Faktor ikutan

(asimetrisitas) Resolusi

Rata-rata

14,752

Rata-rata

6,033

Rata-rata

4138,4

Rata-rata

0,06411 Rata-rata 1,524

Rata-

rata

3,212

%RSD =

0,278 %

Persyaratan

2,0 %

%RSD =

1,255 %

Persyaratan

2,0 %

Persyaratan

2500

Semakin

kecil,

maka

efisiensi

kolom

semakin

baik

Persyaratan 2

Per-

syaratan

≥1,5

4.3 Validasi Metode Analisis

4.3.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Linieritas

Kurva kalibrasi dibuat pada rentang konsentrasi 4,08-20,4 ppm,

yaitu 4,08; 8,16; 12,24; 16,32; dan 20,4 ppm. Berdasarkan metode

dalam jurnal Tekko, dkk (2006) hasil derivatisasi glukosamin HCl

dilarutkan dalam 400 μL fase gerak dari sistem kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT). Volume tersebut tidak mencukupi untuk

dilakukan penyaringan, sehingga derivatisasi dilakukan pada

konsentrasi 10 kalinya. Konsentrasi glukosamin HCl yang dibutuhkan

untuk mencapai konsentrasi akhir 20,4 ppm digunakan konsentrasi

glukosamin HCl 204 ppm, kemudian dilarutkan dalam 4000 μL (4mL)

fase gerak sistem KCKT.

Berdasarkan hasil perhitungan statistik regresi linier diperoleh

garis kurva kalibrasi y = 0,298 x + 0,016, dimana x adalah konsentrasi

dan y adalah Luas area dari hasil derivatisasi glukosamin dengan PITC.

Koefisien korelasi yang didapat adalah r = 0,999 dan telah memenuhi

kriteria uji linieritas untuk suatu metode analisis yang valid.

29


Tabel 4.3. Data kurva kalibrasi

Konsentrasi (ppm) Luas area (mAU)* RSD (%)

4,08 1,215 1,185

8,16 2,411 1,252

12,24 3,718 1,712

16,32 4,900 0,534

20,40 6,037 0,596 Keterangan : * Rata-rata dari 3 kali ulangan

Gambar 4.2 Kurva kalibrasi glukosamin hidroklorida

4.3.2 Uji Batas Deteksi dan Uji Batas Kuantifikasi

Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) dihitung secara

statistik pada garis linier dari kurva kalibrasi. Nilai LOD yang didapat

adalah 0,5419 ppm dan nilai LOQ yang didapat adalah 1,805 ppm.

Perhitungan nilai LOD dan LOQ dapat dilihat pada Lampiran 4.

4.3.3 Uji Presisi dan Uji Akurasi

Data uji presisi menunjukkan derajat kesesuaian atau kedekatan

antara hasil pengujian yang satu dengan yang lainnya. Pada penelitian

ini, uji presisi dilakukan sebanyak 3 kali pengukuran yang dilakukan

selama sehari (intraday) dan selama 2 hari (interday). Digunakan 3

konsentrasi yang digunakan pada uji presisi, yaitu konsentrasi rendah,

sedang, dan tinggi. Konsentrasi rendah merupakan tiga kali dari nilai

LOQ. Konsentrasi sedang merupakan 50% dari konsentrasi analit

30


tertinggi pada kurva kalibrasi. Konsentrasi tinggi merupakan 90% dari

konsentrasi analit tertinggi pada kurva kalibrasi. Maka didapat

konsentrasi rendah 6,12 ppm, konsentrasi sedang 10,2 ppm, dan

konsentrasi tinggi 18,36 ppm.

Uji presisi menggunakan data %RSD untuk menunjukan

tervalidasi suatu metode. Data %RSD semua konsentrasi pada hari ke-1

dan ke-2 dapat dilihat pada Tabel 5.4. Dari hasil percobaan uji presisi

yang telah dilakukan, semua data sudah memenuhi kriteria yang

dipersyaratkan. Persyaratan yang ditetapkan untuk uji presisi adalah

<2%. Perhitungan %RSD uji presisi dapat dilihat pada Lampiran 5.

Uji akurasi menggunakan data %diff untuk menunjukan

tervalidasi suatu metode. Data %diff semua konsentrasi pada hari ke-1

dan ke-2 dapat dilihat pada Tabel 5.4. Dari hasil percobaan uji akurasi

yang telah dilakukan, semua data sudah memenuhi kriteria yang

dipersyaratkan. Persyaratan yang ditetapkan untuk uji presisi adalah

<2%. Perhitungan %diff uji presisi dapat dilihat pada Lampiran 5.

Tabel 4.4. Data uji presisi dan uji akurasi

Konsentrasi

(ppm)

Hari ke-1 Hari ke-2

6,12 10,2 18,36 6,12 10,2 18,36

Luas area

(mAU)

1,8873 3,0461 5,509 1,893 3,0216 5,5063

1,8549 3,0867 5,4549 1,7667 3,0748 5,3093

1,8438 3,1031 5,4907 1,8183 3,0579 5,4527

%RSD 1,2139 0,9531 0,5017 1,0455 0,2669 1,8783

% diff 1,2195 0,7578 -0,0441 -0,7545 -0,1371 -1,1791

4.3.5 Uji Stabilitas Hasil Derivatisasi Glukosamin HCl

Sampel yang disimpan selama 24 jam tidak menunjukan

perubahan yang signifikan pada kromatogram dibandingkan dengan

sampel yang disiapkan sesaat sebelum disuntikkan, sedangkan sampel

yang telah dilarutkan dengan 4 mL fase gerak dan disimpan selama 24

jam dianalisis, hasilnya menunjukan adanya perubahan pada bentuk

kromatogram dan luas area yang dihasilkan. Luas area pada sampel jam

31


ke-0 adalah 5,956 mAU, sampel 24 jam kering adalah 6,158 mAU, dan

sampel 24 jam dan fase gerak adalah 3,332 mAU. Terdapat perbedaan

yang cukup besar pada luas area antara sampel yang disimpan 24 jam

dengan fase gerak dengan sampel jam ke-0. Dianjurkan untuk

melarutkan hasil derivatisasi dengan fase gerak sesaat sebelum

dianalisis.

a. b. c.

Gambar 4.3 Kromatogram glukosamin HCl (a) 0 jam

(b) 24 jam kering (c) 24 jam + fase gerak

4.4 Uji Analisis pada Sampel Kitosan Nanopartikel

Efisiensi penjerapan sampel yang dianalisis menggunakan metode

analisis tidak langsung dilakukan dengan perhitungan dengan rumus:

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑧𝑎𝑡 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑓 −𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑧𝑎𝑡 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑓 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑠𝑢𝑝𝑒𝑟𝑛𝑎𝑡𝑎𝑛

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑧𝑎𝑡 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑓 x 100%

Data yang diperoleh dari percobaan ini dapat dilihat pada Tabel 4.5.

Perhitungan efisiensi penjerapan dapat dilihat pada Lampiran 7.

Tabel 4.5. Data uji analisis glukosamin pada dispersi nanopartikel kitosan

Pengulangan Luas Area

(mAU)

Konsentrasi setelah

dikali faktor

pengenceran

% Efisiensi

penjerapan

1 2,478 4957,05 75,21

2 2,490 4981,21 75,09

3 2,489 4980,40 75,10

% RSD 0,274

32


Gambar 4.4 Kromatogram glukosamin HCl dari sampel dispersi nanopartikel

kitosan


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

a. Metode analisis glukosamin HCl telah tervalidasi dengan menggunakan

KCKT dengan detektor DAD, kolom ODS/C18 (250 mm), menggunakan

fase gerak: metanol-aquabidest-asam asetat (10,00 : 89,96 : 0,04) dengan

kecepatan alir 1,0 mL/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 245

nm. Hasil derivatisasi glukosamin HCl terdeteksi pada waktu retensi

14,752 menit. Respon detektor linier pada kisaran konsentrasi 4-20 ppm

dengan persamaan kurva kalibrasi y = 0,298 x + 0,016 (r = 0,999). Nilai

LOD = 0,5419 ppm dan nilai LOQ = 1,8065 ppm. Uji presisi (%RSD) dan

akurasi (%diff) intra dan inter-day selama 2 hari yang tidak melampaui

2%.

b. Nanopartikel kitosan yang mengandung glukosamin HCl dapat dianalisis

mengguanakan metode analisis tidak langsung dan kondisi analisis yang

telah divalidasi. Data yang diperoleh dapat digunakan untuk menghitung

efisiensi penjerapan glukosamin HCl dalam dispersi nanopartikel kitosan.

5.2 Saran

a. Untuk penelitian selanjutnya, dapat dilakukan validasi metode untuk

menganalisis nanopartikel kitosan yang mengandung glukosamin HCl

dengan mengguanakan metode analisis langsung.


DAFTAR PUSTAKA

Allen, L. V. 2009. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Sixth Edition. Rowe

R. C., Sheskey, P. J., Queen, M. E., (Editor). London. Pharmaceutical

Press and American Pharmacists Assosiation, pp. 159-160.

Andriani, Shintia. 2012. Skripsi: Optimasi Derivatisasi Glukosamin HCl dengan

9-Fluorenilmetoksikarbonil Klorida (FMOC-Cl) secara KCKT-

Fluorescensi. Universitas Indonesia.

Anumula, Kaylan rao dan paul B. Taylor. 1991. Quantitative Determination of

Phenyl Isothiocyanate-derivatized Amino Sugars and Amino Sugar

Alcohols by High-Performance Liquid Chromatography. Analytical

Biochemistry 197, 113-120.

Barclay, T.S., Tsourounis, C., McCart, G.M., 1998. Glucosamine. Ann

Pharmacotherapy 32, 574–579.

Biosynth. 2016. Phenyl isothiocyanate. Diakses dari

www.biosynth.com/en/products/organic-synthesis/basic-

intermediates/products/J-802269.html pada tanggal 27-09-2016 pada jam

19.30 WIB

Block, J. A., T. R. Oegema, J. D. Sandy and A. Plaas. 2010. Review the effects of

oral glucosamine on joint health: is a change in research approach

needed?. Osteoarthritis Research Society International. 18. 8. 5-11.

doi:10.1016/j.joca.2009.07.005.

Brigger, Irene, Catherine Dubernet, Patrick Couvreur. 2002. Nanoparticles in

cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews 54

(2002): 631-651.

Chemical book. 2016. Phenyl isothiocyanate (103-72-0). Diakses dari

http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB5733806_

EN.htm pada tanggal 03-02-2016 pada jam 15.24 WIB.

El-Saharty, Yasser S. dan Ahmed Abdel Bary. 2002. High-performance liquid

chromatographic determination of neutraceuticals, glucosamine sulphate

and chitosan, in raw materials and dosage forms. Analytica Chimica Acta

462 125–131.

Fox, Beth Anne dan Mary M Stephens. 2007. Review: Glucosamine hydroclorida

for the treatment of osteoarthritis symptoms. Clinical Interventions in

Aging 2007:2(4) 599–604.

http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB5733806_EN.htm%20pada%20tanggal%2003-02-2016

http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB5733806_EN.htm%20pada%20tanggal%2003-02-2016

35


Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis.

Yogyakarta: Pustaka Pelajar.

Habashi, Ali Aghazadeh, Saeed Sattari, Franco Pasutto and Fakhreddin Jamali.

2002. High Performance Liquid Chromatographic Determination of

Glucosamine in Rat Plasma. J Pharm Pharmaceut Sci

(www.ualberta.ca/~csps) 5(2):176-180.

Hadad, Ghada M., Randa A. Abdel-Salam, and Samy Emara. 2011.

Determination of Glucosamine and Carisoprodol in Pharmaceutical

Formulations by LC with Pre-Column Derivatization and UV Detection.

Journal of Chromatographic Science 2012;50:307–315

doi:10.1093/chromsci/bms008.

Han, In Hee., et al. 2010. Identification and Assessment of Permeability

Enhancing Vehicles for Transdermal Delivery of Glucosamine

Hydrochloride. Arch. Pharm. Res. Vol 33, No 2, 293-299, 2010. DOI

10.1007/s12272-010-0215-4.

Hansen, Karen E., Elliott, Mary Elizabeth. 2005. Osteoarthritis, dalam Dipiro,

Joseph T., Talbert, Robert L. ., Yee, Gary C., Matzke, Gary R., Wells,

Barbara G. Posey, L. Michael. (Eds), Pharmacotherapy: A

Pathophysiologic Approach, Sixth Edition. The McGraw-Hill

Companies, Inc. United States of America, pp. 1685,1698.

Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya.

Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No. 3, 117-135.

Kealey, D dan Haines P.J. 2002. Instant Notes: Analytical Chemistry. New York,

BIOS Scientific Publisher Limited.

Liang, Zhongming, James Leslie, Abimbola Adebowale, Mohammed Ashraf, dan

Natalie D. Eddington. 1999. Determination of the nutraceutical,

glucosamine hydrochloride, in raw materials, dosage forms and plasma

using pre-column derivatization with ultraviolet HPLC. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 20 (1999) 807–814.

Nollet, Leo M.L. dan Fidel Toldrá. 2012. Food Analysis by HPLC third edition.

New York, Taylor & Francis Group, LLC. pp 40-44.

Rangari, Amol T. dan Padmini Ravikumar. 2015. Polymeric Nanoparticles Based

Topical Drug Delivery: An Overview. Asian Journal of Biomedical and

Pharmaceutical Sciences. doi: 10.15272/ajbps.v5i47.718

Rodrigues, Susana., et al. 2012. Biocompatibility of Chitosan Carriers with

Application in drug Delivery. J. Funct. Biomater 3, 615-641. doi:

10.3390/jfb3030615.

36


Tekko, Ismaiel A, Michael c. Bonner, dan Adrian C. Williams. 2006. An

optimized reverse-phase high performance liquid chromatographic

method for evaluating percutaneous absorption of glucosamine

hydroclorida. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41

(2006) 385-392. doi: 10.1016/j.jpba.2005.11.044.

Wilczewska, Agnieszka Z., Katarzyna Niemirowicz, Karolina H. Markiewicz,

Halina Car. 2012. Review: Nanoparticles as drug delivery systems.

Pharmacological Reports. 64, 1020-1-37. ISSN 1734-1140.

Yan, Xun, Heidi M. Evenocheck. 2012. Chitosan analysis using acid hydrolysis

and HPLC/UV. Elsevier Carbohydrate Polymers 87 (2012) 1774–1778

doi:10.1016/j.carbpol.2011.09.091.

Zhou, Joseph Ziqi, Ted Waszkuc, and Felicia Mohammed.2005. Determination

of Glucosamine in Raw Materials and Dietary Supplements Containing

Glucosamine Sulfate and/or Glucosamine Hydrochloride by High-

Performance Liquid Chromatography with FMOC-Su Derivatization:

Collaborative Study. Journal of AOAC International Vol. 88, No. 4.

37


Lampiran 1. Kromatogram 3D Derivatisasi Glukosamin HCl

38

UIN Syarif Hidayatullah Jakrta

Lampiran 2. Data Uji Kesesuaian Sistem

Waktu

Retensi

(menit)

Luas Area

(mAU)

Jumlah

Lempeng

Teoritis (N)

HETP Resolusi Faktor Ikutan

(asimetrisita)

14,793 5,9480 3953 0,0632 4,07 1,63

14,717 6,0919 3783 0,0661 1,51 1,27

14,700 6,1066 2966 0,0843 1,38 1,40

14,770 6,0621 3171 0,0788 3,57 1,62

14,780 5,9558 6819 0,0367 5,53 1,70

Rata-rata

14,752

%RSD

0,2778

Rata-rata

6,0329

%RSD

1,2546

Rata-rata

4138,4

Rata-rata

0,0658

Rata-rata

3,212 Rata-rata 1,524

Persyaratan

2,0 %

Persyaratan

2,0 %

Persyaratan

2500

Semakin

kecil,

maka

efisiensi

kolom

semakin

baik

Persyaratan

2

Persyaratan

≥1,5

39


Lampiran 3. Data Kurva Kalibrasi

Pengulangan Konsentrasi (ppm)

20,40 16,32 12,24 8,16 4,08

1 6,0919 4,844 3,6654 2,4192 1,2084

2 5,9558 4,9668 3,789 2,401 1,2227

3 6,0621 4,9076 3,7008 2,4115 1,2136

Rata-rata 6,0366 4,906133 3,7184 2,410567 1,2149

%RSD 1,185164 1,251762 1,711807919 0,533872 0,595777

40


Lampiran 4. Perhitungan nilai LOD dan LOQ

Rumus:

Keterangan :

Yi = luas area hasil pengukuran

Ῡ = luas area hasil perhitungan

Sy/x = simpangan baku residual

b = slope

LOQ = batas kuantifikasi (limit of quantification)

LOD = batas deteksi (limit of detection)

xi yi Ῡ Ῡ-yi^2

4,08 1,215 1,23184 0,000283586

8,16 2,411 2,44768 0,001345422

12,24 3,718 3,66352 0,00296807

16,32 4,906 4,87936 0,00070969

20,4 6,037 6,0952 0,00338724

Jumlah 0,008694008

Sy/x 0,0538331

LOD = 3 x 𝑠𝑦/𝑥

𝑏 = 3 x

0,0538

0,298 = 0,5419

LOQ = 10 x 𝑠𝑦/𝑥

𝑏 = 10 x

0,0538

0,298 = 1,8065

41


Lampiran 5. Perhitungan %RSD dan Perhitungan %diff

Rumus perhitungan %RSD :

SD = √(∑(𝑥−𝑥′)2)

𝑛−1 RSD =

𝑆𝐷

𝑥′ x 100% %diff =

𝐵−𝐴

𝐴 𝑥 100%

Keterangan:

SD = Standart Deviation

x = konsentrasi dari perhitungan

x’ = konsentrasi rata-rata (mean)

n = jumlah data

RSD = Relative Standart Deviation

A = Konsentrasi sesungguhnya

B = Konsentrasi terukur rata-rata

Contoh perhitungan untuk presisis dan akurasi konsentrasi 6,12 ppm hari pertama

y x

1,8873 6,2795

1,8549 6,1708

1,8438 6,1336

Rata – rata (x’) atau (B) 6,1946

a. Presisi (%RSD)

SD = √∑(𝑥−𝑥′)2

𝑛−1 = √

(6,2795−6,1946)2+ (6,1708−6,1946)2+ (6,1336−6,1946)2

2 = 0,0758

RSD = 0,0758

6,1946 𝑥 100% = 1,2236 %

b. Akurasi (%diff)

%diff = 6,1946−6,12

6,12 𝑥 100% = 1,219 %

42


Lampiran 6. Data Uji Stabilitas

Parameter 0 jam 24 jam kering 24 jam + fase gerak

Waktu retensi

(menit) 14,793 15,067 15,267

Jumlah Lempeng

(N) 6819 7642 2580

HETP 0,044 0,039 0,116

Faktor ikutan

(asimetrisitas) 1,70 1,36 n.a

Resolusi (R) 5,53 4,34 2,40

Luas Area

(mAU) 5,956 6,158 3,332

43


Lampiran 7. Perhitungan Efisiensi Penjerapan

Rumus perhitungan efisiensi penjerapan :

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑧𝑎𝑡 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑓 −𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑧𝑎𝑡 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑓 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑠𝑢𝑝𝑒𝑟𝑛𝑎𝑡𝑎𝑛

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑧𝑎𝑡 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑓 x 100%

Konsentrasi akhir glukosamin HCl dalam cairan nanopartikel adalah 1 gr/50 mL

atau 20000 ppm.

Luas Area (mAU) Konsentrasi setelah dikali faktor

pengenceran (ppm) % efisien

2,4780 4957,04698 75,21477

2,4900 4981,20805 75,09396

2,4896 4980,40269 75,09799

Pengulangan 1

Konsentrasi setelah dikali faktor pengenceran = 4957,05 ppm

% Efisiensi penjerapan = 20000−4957,05

20000 x 100% = 75,21%

Pengulangan 2



20000 x 100% = 75,09%

Pengulangan 3



20000 x 100% = 75,10%

Documents

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Validasi Metode …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/36393/1/Rifa... · yang dilakukan adalah rentang linieritas, LOD, LOQ, akurasi,