UJI ANTIPROLIFERASI PARTISI n-HEKSANA DAUN ASOKA

i

UJI ANTIPROLIFERASI PARTISI n-HEKSANA DAUN ASOKA (Ixora

coccinea L.) TERHADAP SEL KANKER T47D MELALUI PENGHAMBATAN

MMP-9 IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

I Made Bayu Kresna Yoga

NIM: 178114014

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2021

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

UJI ANTIPROLIFERASI PARTISI n-HEKSANA DAUN ASOKA (Ixora

coccinea L.) TERHADAP SEL KANKER T47D MELALUI PENGHAMBATAN

MMP-9 IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

I Made Bayu Kresna Yoga

NIM: 178114014

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2021


vi

ABSTRAK

Kanker payudara menempati peringkat kedua di Asia, dengan 911.014 kasus

baru dan 310.577 kematian pada tahun 2018. Matriks metaloproteinase-9 (MMP-9)

merupakan enzim yang berperan dalam mendegradasi matriks ekstraselular (ECM)

sehingga menyebabkan migrasi atau metastasis sel kanker payudara. Penelitian ini

bertujuan untuk mengetahui efek antiproliferasi partisi n-heksana daun asoka (Ixora

coccinea L.) terhadap sel kanker payudara T47D melalui penghambatan MMP-9 dan

juga keamanannya terhadap sel Vero. Partisi diuji secara in vitro aktivitas

penghambatannya terhadap enzim MMP-9 dengan metode FRET-based assay. Selain

itu, terhadap sel T47D dan sel Vero dilakukan MTT assay. Partisi kemudian

diidentifikasi kandungan kimianya dengan metode KG-SM. Secara in vitro diperoleh

aktivitas penghambatan partisi terhadap MMP-9 sebesar 97% dengan nilai EC50 dan

CC50 secara berturut-turut sebesar 1317,3 µg/mL dan 981,2 µg/mL (IK= 0,74).

Berdasarkan profil KG-SM, diperoleh 3 senyawa dengan puncak tertinggi dengan

waktu retensi 6,554; 15,574; dan 18,449 menit dengan rasio m/z berturut-turut sebesar

530; 550; dan 535. Menariknya, salah satu puncak tertinggi merupakan massa relatif

yang sesuai dengan salah satu marker dalam Ixora coccinea, yaitu ixorapeptida II (MR

535). Kesimpulannya, sampel partisi aktif menghambat MMP-9, namun kurang aktif

terhadap sel T47D yang mengindikasikan bahwa sampel partisi selektif terhadap

kanker tipe triple negatif.

Kata kunci: MMP-9, T47D, Ixora coccinea L., MTT assay


vii

ABSTRACT

Breast cancer ranked secondly in Asia, with 911.014 new cases and 310.577

deaths in 2018. Matrix metalloproteinase (MMP-9) is an enzyme which degrades

extracellular matrix (ECM) and causes breast cancer metastasis. This study aimed to

investigate the antiproliferative activity of Ixora coccinea L. n-hexane partition against

T47D cell line through MMP-9 inhibiton and its cytotoxicity activity against Vero cell

line. The inhibiton activity of partition was evaluated using FRET-based assay against

MMP-9 and MTT assay against T47D as well as Vero cell lines. Also, the chemical

substances in the partition were identified using Gas Chromatography-Mass

Spectrometry (GC-MS) method. Using MTT assay, the partition exhibited 97%

inhibition against MMP-9 with EC50 and CC50 values 1317,3 µg/mL and 981,2 µg/mL

respectively (SI = 0.74). The GC-MS profile reveals 10 peaks including 3 major

substances with retention time as follows 6,554; 15,547; and 18,449 minutes and the

ratio m/z 530; 550; and 535, respectively. Interestingly, one peak was indicated as

ixorapeptide II (MW 535) which is a marker compound in Ixora coccinea could be the

compound having a responsibility toward MMP-9 inhibittion. The partition active

inhibited MMP-9 but less active against T47D which concludes that the partition is

selective to the triple negative cancer type.

Key words: MMP-9, T47D, Ixora coccinea L., MTT assay


viii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... ii

PENGESAHAN SKRIPSI .................................................................................. iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................. v

ABSTRAK ......................................................................................................... vi

ABSTRACT ...................................................................................................... vii

DAFTAR ISI .................................................................................................... viii

DAFTAR TABEL .............................................................................................. ix

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... x

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xi

PENDAHULUAN ............................................................................................... 1

METODE PENELITAN ...................................................................................... 3

HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 10

KESIMPULAN ................................................................................................. 28

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 29

LAMPIRAN ...................................................................................................... 33

BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................... 57


ix

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Desain well-plate uji penghambatan MMP-9 ................................................ 5

Tabel II. Desain well-plate untuk MTT assay ............................................................ 8

Tabel III. Persentase aktivitas penghambatan enzim MMP-9 ................................... 13

Tabel IV. Nilai persen viabilitas sel T47D ............................................................... 20

Tabel V. Nilai persen viabilitas sel Vero ................................................................. 21

Tabel VI. Nilai EC50 terhadap sel T47D dan CC50 terhadap sel Vero ....................... 23

Tabel VII. Prediksi senyawa hits dari spektroskopi massa puncak 1, 4, dan 5 .......... 26


x

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Mekanisme hidrolisis substrat FRET oleh enzim MMP-9 ...................... 10

Gambar 2. Mekanisme proteolisis substrat peptida MMP-9 ..................................... 11

Gambar 3. NNGH yang berinteraksi dengan sisi aktif MMP-9 ................................ 12

Gambar 4. Morfologi sel sebelum diberi perlakuan ................................................. 14

Gambar 5. Pewarnaan sel menggunakan trypan blue ............................................... 16

Gambar 6. Kondisi sel T47D dan sel Vero setelah diberikan perlakuan ................... 18

Gambar 7. Kondisi sel T47D dan Vero setelah diberikan reagen MTT .................... 19

Gambar 8. Kurva nilai EC50 sampel dan kontrol positif terhadap sel T47D.............. 22

Gambar 9. Kurva CC50 sampel dan kontrol positif terhadap sel Vero ...................... 22

Gambar 10. Kromatogram partisi n-heksana daun asoka ......................................... 24

Gambar 11. Spektra massa puncak 1, 4, dan 5 partisi n-heksana daun asoka ............ 26


xi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tanaman asoka .................................. 33

Lampiran 2. Volume bahan pengujian in vitro .................................................... 34

Lampiran 3. Desain 96 well plate FRET-based assay ......................................... 35

Lampiran 4. Desain 96 well plate MTT assay sel T47D ..................................... 36

Lampiran 5. Desain 96 well plate MTT assay sel Vero ....................................... 37

Lampiran 6. Perhitungan sel T47D ..................................................................... 38

Lampiran 7. Perhitungan sel Vero ...................................................................... 39

Lampiran 8. Data absorbansi dan persentase viabilitas sel T47D ........................ 40

Lampiran 9. Data absorbansi dan persentase viabilitas sel Vero ......................... 41

Lampiran 10. Kurva nilai EC50 sampel terhadap sel T47D menggunakan

GraphPad Prism 9.0.0 .................................................................... 42

Lampiran 11. Kurva nilai CC50 sampel terhadap sel Vero menggunakan

GraphPad Prism 9.0.0 .................................................................... 45

Lampiran 12. Data hasil Uji T tidak berpasangan EC50 sel T47D ....................... 48

Lampiran 13. Data hasil Uji T tidak berpasangan CC50 sel Vero ......................... 49

Lampiran 14. Parameter Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM) ........ 50

Lampiran 15. Profil spektra massa partisi n-heksana daun asoka ........................ 51

Lampiran 16. Struktur prediksi senyawa-senyawa yang terkandung dalam partisi

n-heksana daun asoka berdasarkan library WILEY7.LIB ................................... 56



1

PENDAHULUAN

Penelitian terkait aktivitas penghambatan ekstrak metanol daun asoka (Ixora

coccinea L.) terhadap matriks metaloproteinase-9 (MMP-9) sebagai target terapi

kanker payudara telah dilakukan oleh Hariono et al. (2020). Dari hasil penelitian

tersebut, ekstrak metanol daun asoka menghambat aktivitas enzim MMP-9 secara in

vitro dengan nilai IC50 sebesar 81.55 g/mL. Selain itu, ekstrak metanol daun asoka

juga diuji secara in vitro terhadap sel kanker payudara 4T1 dan T47D dan dihasilkan

EC50 berturut-turut sebesar 270 g/mL dan 2200 g/mL. Hasil ini menunjukkan adanya

selektivitas ekstrak metanol daun asoka terhadap sel kanker yang metastatik.

Keamanan dari ekstrak tersebut juga diuji secara in vitro terhadap sel Vero dan didapat

nilai CC50 sebesar 653 g/mL dengan indeks keamanan (IK) terhadap sel kanker

payudara 4T1 dan T47D berturut-turut sebesar 2,42 dan 0,29. Hasil ini menunjukkan

bahwa ekstrak ini berada dalam rentang IK sempit namun hampir mendekati batas

aman (IK > 3 (Sutejo et al., 2016)) terhadap sel 4T1. IK ekstrak ini terhadap sel T47D

lebih rendah, walaupun begitu karena EC50 dalam kategori tidak aktif ( > 500 µg/mL

(Costa, et al. (2017)), maka dapat dikatakan IK-nya aman terhadap sel T47D. Lebih

dari itu, berdasarkan penelitian yang dilakukan Djohan (2020) diketahui bahwa salah

satu fraksi n-heksana-etil asetat daun asoka aktif terhadap enzim MMP-9 secara in vitro

dengan nilai IC50 116 µg/mL (Hariono et al., 2020; Djohan, 2020).

Matriks metaloproteinase (MMP) merupakan enzim yang berperan dalam

mendegradasi matriks ekstraselular (ECM) (Hariono et al., 2018). Enzim ini memiliki

peran penting dalam mengontrol migrasi sel dan erat kaitannya dengan metastasis sel

kanker (Putra et al., 2019). Berdasarkan spesifikasi substratnya, enzim ini dibedakan

menjadi lima subfamilia, yaitu gelatinase, kolagenase, matrilisin, stromelisin, dan

membrane-type. Salah satu anggotanya, yaitu MMP-9 termasuk dalam subfamilia

gelatinase dan banyak diekspresikan pada kanker payudara tahap metastasis. Oleh

sebab itu, penghambatan MMP-9 berpotensi sebagai target dalam terapi kanker

payudara (Adhipandito et al., 2019)


2

Kanker merupakan penyakit penyebab kematian terbanyak nomor dua di

dunia dengan 9,6 juta kematian pada tahun 2018. Satu dari enam kematian diperkirakan

terjadi akibat kanker (WHO, 2018). Di Asia, terdapat 8.750.932 kasus baru kanker pada

tahun 2018 dengan angka kematian sebesar 5.477.064. Di Indonesia sendiri pada tahun

2018, terdapat 348.809 kasus baru dan 207.210 kasus kematian akibat kanker

(Globocan, 2018). Kanker payudara menempati peringkat kedua di Asia, dengan

911.014 kasus baru dan 310.577 kematian pada tahun 2018. Kanker payudara di

Indonesia menempati peringkat pertama dengan 58.256 kasus dan 22.692 kematian

pada tahun 2018 (Globocan, 2018). Berdasarkan data American Society of Clinical

Oncology (ASCO), sekitar 75% wanita mengidap kanker payudara, mempunyai tipe

esterogen receptor-positive (ER+) (Burstein and Winer, 2014). Tamoxifen telah

digunakan dalam pengobatan kanker ER+ dan trastuzumab pada pengobatan kanker

payudara HER-2 positive (Zhang et al., 2016), sedangkan untuk kanker tipe triple

negative belum ada obat yang secara klinik aman bagi pasien.

Indonesia memiliki sumber daya alam yang potensial untuk dikembangkan

sebagai obat herbal dan fitofarmaka. Tanaman asoka (Ixora coccinea L.) merupakan

tanaman hias yang diketahui memiliki beberapa manfaat seperti mengobati penyakit

hati, infeksi mikroba, efek antioksidan, dan inflamasi (Dontha et al., 2015). Diketahui

bahwa daun asoka mengandung beberapa senyawa seperti flavonoid, senyawa fenol,

tannin, terpenoid, steroid, dan alkaloid yang bertanggungjawab terhadap aktivitas

farmakologinya (Kadirvelu and Damle, 2017).

Pada penelitian kali ini dilanjutkan untuk mengetahui potensi antiproliferasi

dari partisi n-heksana daun asoka terhadap sel kanker dengan melakukan uji aktivitas

penghambatan partisi n-heksana daun asoka terhadap MMP-9, diikuti dengan uji anti

proliferasinya terhadap sel kanker secara in vitro. Sel kanker yang digunakan dalam

penelitian ini adalah kultur sel kanker non-metastatik T47D. Untuk menentukan

keamanan sampel, uji sitotoksisitas terhadap sel normal (sel Vero) juga dilakukan.

Identifikasi senyawa yang terdapat dalam partisi n-heksana daun asoka dilakukan

dengan metode kromatografi gas-spektrometri massa (KG-SM).


3

METODE PENELITAN

Bahan

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini yaitu, partisi n-heksana

daun asoka. Partisi n-heksana daun asoka diperoleh dari penelitian yang dilakukan

Djohan (2020) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Partisi ini dibuat

pertama-tama dengan cara membuat ekstrak metanol daun asoka yang diperoleh dari

daerah Paingan, Yogyakarta dan sebelumnya telah dideterminasi di Fakultas Biologi

Universitas Gadjah Mada. Ekstrak kental yang didapat kemudian dipartisi

menggunakan pelarut n-heksana, etil asetat, n-butanol, dan air menggunakan corong

pisah sehingga didapatkan partisi dari masing-masing pelarut, salah satunya n-heksana.

Sedangkan bahan yang digunakan dalam uji penghambatan aktivitas enzim yaitu, kit

MMP-9 berasal dari Biovision yang terdiri dari enzim MMP-9 terliofilisasi, substrat

FRET-based peptide, buffer, NNGH (N-isobutil-N-(4-metoksifenilsulfonil) glisil

hidroksamat) sebagai kontrol positif, gliserol untuk mengencerkan enzim dan

dimetilsulfoksida (DMSO) sebagai pelarut sampel. Dalam kultur sel dan uji

penghambatan sel bahan-bahan yang digunakan antara lain, media padat Roswell Park

Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), aquabidest, natrium bikarbonat (NaHCO3),

asam klorida (HCl), natrium hidroksida (NaOH), air untuk injeksi, penisilin-

streptomisin, fetal bovine serum (FBS), kultur sel T47D, kultur sel Vero, trypan blue,

phosphate buffer saline (PBS), Tripsin-Ethylenediaminetetraacetic acid, reagen 3-

(4,5-dimetillthiazol-2-yl)-2,5-difenilltetrazolium bromida (MTT), dan Sodium Dodecyl

Sulfate (SDS).

Alat

Alat gelas pada umumnya, timbangan analitik ketelitian 0,1 mg (Ohaus),

otoklaf (Hirayama), Biosafety Cabinet class II (Esco Labculture®), kulkas, freezer -

80°C, tanki nitrogen, dan vortex, 96-well plate (Iwaki), micropipette P1000,

micropipette P200, micropipette P20 (Socorex), tips pipet, vortex, dan Synergy™ HTX

multi-mode microplate reader (BioTek), magnetic stirrer, pH meter (Worner Lab),


4

filter 0,2 mikron, botol duran 1000 mL, cryotube, conical tube, culture dish, sentrifuge,

mikrokop inverted (Magnus), hemasitometer, counter, inkubator CO2 (Thermo

science), dan ELISA reader (Tecan infinite 50), kromatografi gas-spektrometri massa

(Waters® Xevo®).

Tata Cara Penelitian

1. Uji aktivitas penghambatan MMP-9 in vitro

Enzim MMP-9 terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µL gliserol 30% dalam

air terdeionisasi. Kemudian, enzim tersebut diencerkan dengan 550 µL buffer dan siap

digunakan untuk pengujian. Sampel disiapkan dengan cara menimbang lebih kurang

100 mg partisi, kemudian dilarutkan dengan 1 mL DMSO hingga diperoleh konsentrasi

stok 100.000 µg/mL dalam mikrotube. Konsentrasi akhir DMSO dalam well sebesar

1% v/v. Blanko diberikan dengan memipet 100 µL buffer uji MMP-9 ke well. Sampel

partisi n-heksana diberikan dengan cara memipet 44 µL buffer uji MMP-9, 1 µL partisi

n-heksana daun asoka, dan 5 µL enzim MMP-9 ke dalam well. Kontrol negatif

diberikan dengan memipet 45 µL buffer uji MMP-9, 5 µL enzim MMP-9 ke dalam

well. Kontrol positif terdiri dari 43 µL buffer uji MMP-9, 2 µL NNGH, dan 5 µL enzim

MMP-9 juga dipipet ke dalam well. Selanjutnya blanko, sampel, kontrol negatif, dan

kontrol positif diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi, 1 µL

substrat FRET-based peptide MMP-9 dan 49 µL buffer ditambahkan pada sampel,

kontrol negatif, dan kontrol positif kemudian diinkubasi kembali selama 60 menit pada

suhu 37°C. Fluorosensi dibaca menggunakan Synergy™ HTX Multi-Mode Microplate

Reader dengan panjang gelombang 325/393 nm. Desain well-plate untuk uji

penghambatan MMP-9 disajikan pada Tabel I.


5

Tabel I. Desain well-plate uji penghambatan MMP-9

Keterangan:

BLK : blanko (100 µL buffer)

P : kontrol pelarut (44 µl buffer + 1 µl DMSO + 5 µl enzim + 1 µl substrat + 49 µl buffer)

K N : kontrol negatif (45 µL buffer + 5 µL enzim + 1 µL substrat + 49 µL buffer)

K P : kontrol positif (43 µL buffer + 2 µL NNGH + 5 µL enzim + 1 µL substrat + 49 µL buffer)

Smpl : sampel uji (44 µL buffer + 1 µL partisi n-heksana daun asoka + 5 µL enzim + 1 µL substrat

+ 49 µL buffer)

2. Uji proliferasi sel T47D dan sel Vero

a. Sterilisasi alat dan bahan. Alat-alat yang digunakan disterilkan terlebih

dahulu untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh mikroorganisme. Alat-alat

tersebut dicuci bersih dengan deterjen dan dikeringkan. Setelah kering, alat-alat

dibungkus dengan aluminium foil dan disterilkan dalam otoklaf selama 20 menit pada

suhu 121°C, tekanan 2 atm.

b. Sterilisasi BSC tipe II. BSC disterilisasi terlebih dahulu dengan

menyalakan lampu UV selama 30 menit. Kemudian dibuka penutup BSC dan

dinyalakan lampu biasa. Permukaan BSC disemprot dengan alkohol 70% dan

keringkan dengan tisu. Semua alat dan bahan yang akan digunakan disemprot dahulu

dengan alkohol 70% sebelum dimasukkan ke dalam BSC.

c. Pembuatan media. Media padat RPMI dilarutkan dengan 950 mL

akuabides steril dalam gelas beker 1000 mL dan ditambahkan 2,2 g NaHCO3.

Akuabides steril ditambahkan hingga volume 1000 mL kemudian diaduk dengan

magnetic stirrer. Setelah larut, dilakukan penyesuaian pH 0,2-0,3 di bawah pH yang

diinginkan dengan menambahkan NaOH 1 N atau HCl 1 N. Media difiltrasi dengan

filter 0,2 mikron, ditampung dalam Duran 1000 mL dan disimpan pada suhu 4°C.

d. Pembuatan media kultur lengkap. Dalam botol Duran 100 mL, dituang

1,5 mL penisilin-streptomisin, 10 mL FBS, 0,5 mL fungizone. Selanjutnya media cair

ditambahkan hingga volume 100 mL.


6

e. Thawing sel. Sebanyak 3 mL alikuot media kultur sel disiapkan dalam

conical tube. Cryo tube berisi sel diambil dari tangki nitrogen dan suspensi sel

dicairkan pada suhu kamar. Suspensi sel dipipet 1000 µL ke dalam media kultur. Sel

disentrifugasi pada 1000 rpm selama 2 menit kemudian supernatan dibuang. Sel

diresuspensi dengan media kultur baru sebanyak 4 mL hingga sel homogen. Sejumlah

sel dimasukkan ke dalam TCD 10 cm, lalu ditambahkan media kultur hingga total

media 7 mL. Sel diamati di bawah mikroskop dan diinkubasi pada suhu 37°C sambil

dialiri gas CO2 dengan konsentrasi 5%.

f. Panen sel. Jika sel telah mencapai 80% konfluen, media dibuang dengan

menggunakan mikropipet, kemudian sel dicuci dengan 3,5 mL PBS. Tripsin-EDTA

(0,25% tripsin) ditambahkan merata pada permukaan sel pada TCD, kemudian sel

diinkubasi kembali selama 1 menit pada suhu 37°C. Media kultur ditambahkan

sebanyak 3 mL dan kondisi sel diamati di bawah mikroskop inverted. Selanjutnya sel

yang telah lepas ditransfer sebanyak 1 mL ke dalam conical tube.

g. Perhitungan sel. Dari 1 mL suspensi sel hasil panen, dipipet sebanyak

10 µL ke hemasitometer. Sel dihitung di bawah mikroskop inverted dengan counter.

Perhitungan sel pada suspensi dilakukan dengan cara menghitung jumlah sel pada

empat kamar hemasitometer, lalu dilakuan perhitungan jumlah sel setiap mL dan

volume suspensi yang perlu ditransfer.

h. Preparasi sampel. Larutan stok sampel dibuat dengan melarutkan lebih

kurang 10 mg partisi n-heksana daun asoka dalam 100 µL DMSO. Setelah larut,

ditambahkan 950 µL air untuk injeksi hingga diperoleh stok dengan konsentrasi 10.000

µg/mL. Kemudian dibuat 6 seri konsentrasi dengan pengenceran menggunakan media

kultur, yaitu 1000 µg/mL; 500 µg/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62,5 µg/mL; 31,25

µg/mL.

i. Metode MTT. Sel yang telah dipanen dan dihitung, kemudian ditransfer

ke dalam masing-masing sumuran dengan volume 100 µL. Tiga kali replikasi

dilakukan untuk masing-masing seri konsentrasi dan kontrol media. Sel diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 37°C dan konsentrasi gas CO2 5% hingga sel attach kembali


7

dan 80% konfluen. Media sel dibuang dengan cara membalikan plate 180° di atas

tempat buangan dengan jarak 10 cm, kemudian plate ditekan secara perlahan di atas

tisu untuk meniriskan sisa cairan. Sebanyak 100 µL PBS ditambahkan ke dalam semua

sumuran yang terisi sel, kemudian PBS dibuang dengan cara membalik plate. Seri

konsentrasi partisi dan doxorubicin sebagai kontrol positif dimasukkan ke dalam plate

sesuai dengan desain plate (Tabel II). Sel diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C

sambil dialiri gas CO2 dengan konsentrasi 5%. Reagen MTT 0,5 mg/mL disiapkan

dengan cara memipet 1 mL stok MTT dalam PBS (5 mg/mL), kemudian diencerkan

dengan media kultur hingga 10 mL. Media sel dibuang, lalu sel dicuci dengan 100 µL

PBS. Sebanyak 100 µL ditambahkan reagen MTT ke setiap sumuran termasuk kontrol

media dan diinkubasi selama 4 jam dalam inkubator. Kondisi sel diperiksa kembali

dengan mikroskop. Jika kristal formazan telah jelas terbentuk, ditambahkan cairan

stopper 100 µL SDS 10% dalam 0,01 N HCl ke dalam masing-masing sumuran. Plate

dibungkus dengan aluminium foil dan diinkubasi di tempat gelap pada suhu kamar

selama 12 jam. Absorbansi setiap sumuran dibaca dengan ELISA reader pada λ 595

nm.


8

Tabel II. Desain well-plate untuk MTT assay

Keterangan:

Smp1 : kultur sel + 1000 µg/mL sampel Smp2 : kultur sel + 500 µg/mL sampel

Smp3 : kultur sel + 250 µg/mL sampel Smp4 : kultur sel + 125 µg/mL sampel

Smp5 : kultur sel + 62,5 µg/mL sampel Smp6 : kultur sel + 31,25 µg/mL sampel

KS : kontrol sel (kultur sel) KB : Kontrol blanko (Media kultur)

KP 1 : kultur sel + 40 µg doxorubicin KP 2 : kultur sel + 20 µg doxorubicin

KP 3 : kultur sel + 10 µg doxorubicin KP 4 : kultur sel + 5 µg doxorubicin

KP 5 : kultur sel + 2,5 µg doxorubicin

3. Pemeriksaan kromatografi gas-spektrometri massa (KG-SM)

Sebanyak lebih kurang 5 mg partisi dilarutkan dalam 1 mL pelarut yang telah

diorientasi, kemudian diambil sebanyak 1 µL untuk diinjeksikan ke dalam KG-SM.

Operasional KG-SM dikondisikan dengan menggunakan jenis kolom Rtx 5 MS

(difenildimetilpolisiloksan) dan suhu kolom 100°C selama 5 menit yang kemudian

dinaikkan sebesar 5°C per menit hingga mencapai 300°C. Parameter KG-SM yang

digunakan adalah by default. Panjang kolom yang digunakan yaitu 30 meter dengan

diameter 0,25 mm.

Analisis Hasil

1. Persentase penghambatan MMP-9

% hambatan = 1 − bacaan fluorosensi sampel−blanko

bacaan fluorosensi kontrol negatif−blanko× 100% (1)

2. Jumlah sel dan volume panenan sel yang ditransfer

Jumlah sel terhitung2 mL⁄ =

∑ sel pada keempat kamar

4× 104 × 2 (2)

Volume panenan sel yang ditransfer =jumlah sel yang diperlukan

jumlah sel terhitung/mL (3)


9

3. Persen viabilitas sel

% viabilitas = absorbansi perlakuan − absorbansi kontrol media

absorbansi kontrol sel−absorbansi kontrol media × 100% (4)

4. Perhitungan EC50 dan CC50

Grafik log konsentrasi vs persentase sel hidup dibuat dengan chart type scatter

dan chart subtype compare pairs of values. Persamaan regresi linier diperoleh dari

grafik tersebut dengan menampilkan odd trend line-regresi linier. Selanjutnya nilai y =

50% dimasukan pada persamaan regresi liner tersebut dan dihitung nilai x, kemudian

dihitung antilog dari nilai x tersebut hingga diperoleh nilai EC50 terhadap sel T47D atau

CC50 terhadap sel Vero.

5. Perhitungan indeks keamanan

IK =CC50 sel Vero

EC50 sel T47D (5)

6. Analisis statistik

Analisis statistik akan dilakukan dengan perhitungan SD dan Uji T tidak

berpasangan. Perhitungan SD digunakan untuk mengetahui reabilitas uji yang

dilakukan, sementara uji T tidak berpasangan digunakan untuk menganalisis hasil

rerata uji MMP-9 dan uji sel (T47D dan Vero) dari sampel uji yang dibandingkan

dengan kontrol positf.

7. Analisis profil KG-SM

Analisis profil KG-SM dilakukan dengan menyesuaikan profil spektrum massa

yang diperoleh dengan library NIST.


10

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengujian aktivitas penghambatan sampel terhadap enzim MMP-9 dilakukan

secara in vitro menggunakan kits enzim dari BIOVISION dengan metode FRET

(Fluorescence Resonance Energy Transfer). MMP-9 merupakan enzim protease,

sehingga dapat memotong ikatan peptida yang terdapat pada substratnya. Substrat yang

digunakan pada penelitian ini adalah peptida yang menyerupai substrat alami MMP-9

(protein ECM) pada cleavage site dan terikat dengan gugus fluorofor (Mca-Pro-Leu-

Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg). Intensitas FRET (antara molekul donor ke akseptor) akan

berkurang dan tingkat fluoresensi molekul donor akan meningkat seiring substrat

peptida terdegradasi (Ma, et al., 2014; Ganiga & Cyriac, 2015). Maka dari itu, ketika

substrat memotong ikatan peptida antar asam amino, fluorosensinya dapat terdeteksi

setelah dilakukan pengukuran pada panjang gelombang 325/393 nm. Fluorosensi yang

semakin tinggi mengindikasikan aktivitas enzim yang semakin tinggi juga (Nicolotti et

al., 2012). Mekanisme pemotongan substrat oleh enzim MMP-9 disajikan pada

Gambar 1.

Gambar 1. Mekanisme hidrolisis substrat FRET oleh enzim MMP-9 (Fundala et

al., 2011; Uniprot, 2011)


11

Aktivasi enzim MMP-9 terjadi karena proses pemutusan jembatan SH-Zn

(cysteine switch) untuk kemudian berinteraksi dengan substrat (Hariono et al., 2020).

Dalam kondisi aktif, ion Zn2+ yang terkoordinasi dengan suatu molekul air akan

berinteraksi dengan tiga asam amino histidin dan satu asam amino glutamat pada sisi

aktif MMP-9. Molekul air akan mendonasikan proton kepada residu glutamat sehingga

memungkinkan terjadinya serangan nukleofil oleh ion hidroksida terhadap gugus

karbonil pada substrat yang menghasilkan intermediet tetrahedral dan distabilkan oleh

ion Zn2+. Residu glutamat kemudian mentransfer proton ke atom nitrogen pada gugus

fungsi amida substrat sehingga menyebabkan terjadinya hidrolisis ikatan amida pada

substrat peptida. Selama terjadinya proses tersebut, gugus karbonil pada residu alanine

membantu menstabilkan muatan positif pada nitrogen substrat (Gambar 2) (Irit and

Gaffney, 2015).

Gambar 2. Mekanisme proteolisis substrat peptida MMP-9 (Irit and Gaffney,

2015)

Kelompok kontrol yang digunakan meliputi kontrol blanko, kontrol negatif,

kontrol positif, dan kontrol pelarut. Kontrol blanko yang digunakan berisi buffer,

berfungsi sebagai baseline atau patokan awal nilai fluorosensi tanpa aktivitas enzim.


12

Kontrol negatif berisi enzim, buffer, dan substrat bertujuan untuk mengetahui bacaan

fluorosensi aktivitas enzim MMP-9 tanpa adanya penghambatan atau sama dengan

100% aktivitas enzim. Kontrol pelarut yang digunakan terdiri dari enzim, buffer,

DMSO, dan substrat untuk mengetahui aktivitas penghambatan pelarut DMSO yang

digunakan pada sampel partisi terhadap enzim MMP-9. Hal ini perlu dilakukan

mengingat pada beberapa percobaan in vitro, DMSO bersifat melisiskan sel dan

diketahui sel tidak dapat hidup pada konsentrasi DMSO di atas 3% (Singh et al, 2017).

Kontrol positif yang digunakan terdiri dari NNGH, buffer, enzim, dan substrat

bertujuan untuk memastikan bahwa prosedur dan kits enzim sudah sesuai untuk

pengujian. Selain itu, kontrol positif juga digunakan sebagai pembanding

penghambatan MMP-9 terhadap sampel partisi n-heksana daun asoka. NNGH

merupakan senyawa derivat asam N-arilsulfonil α-amino hidroksamat. Senyawa ini

digunakan sebagai kontrol positif karena merupakan salah satu inhibitor MMP

spektrum luas dan memliki gugus fungsi hidroksamat yang dapat menghambat enzim

MMP pada sisi katalitiknya. Gugus hidroksamat akan membentuk kelat dengan ion

Zn2+ dan residu glutamat untuk menarik molekul air. Hal tersebut akan mencegah

proteolisis substrat peptida oleh enzim MMP-9 (Hariono et al., 2020).

Gambar 3. NNGH yang berinteraksi dengan sisi aktif MMP-9


13

Pada pengujian didapat nilai fluorosensi blanko sebesar 98, yang berarti nilai

ini menjadi patokan awal atau baseline terhadap nilai fluorosensi kelompok kontrol

lainnya dan kelompok perlakuan (sampel). Pada kontrol negatif didapat nilai

fluorosensi yang telah dikurangi baseline sebesar 114. Nilai ini menjadi patokan 100%

aktivitas dari enzim MMP-9 tanpa penghambatan. Data kontrol pelarut menunjukan

aktivitas penghambatan 5%, selanjutnya nilai ini digunakan sebagai pengurang nilai

persentase penghambatan enzim. Nilai penghambatan yang diperoleh pada kontrol

positif sebesar 100% yang mengindikasikan bahwa NNGH memiliki aktivitas yang

tinggi dalam menghambat aktivitas enzim MMP-9. Berdasarkan pengujian, partisi n-

heksana daun asoka memiliki nilai penghambatan sebesar 102%. Hasil ini kemudian

dikurangi dengan nilai penghambatan DMSO sebesar 5%, sehingga didapat nilai

penghambatan sampel terhadap enzim MMP-9 sebesar 97% pada konsentrasi 1000

µg/mL. Perhitungan persentase aktivitas enzim dan persentase penghambatan terhadap

enzim MMP-9 disajikan pada Tabel III.

Tabel III. Persentase aktivitas penghambatan enzim MMP-9

Pengukuran tahun 2019 (Djohan, 2020)

Bacaan

fluorosensi Rata-

rata Baseline

Aktivitas

enzim (%)

Inhibisi

enzim (%)

Baseline

pelarut

(%) 1 2 3

Kontrol

blanko 72 81 83 79 0 - - -

Kontrol

pelarut 184 186 194 188 109 95 5 0±4

Kontrol

positif 81 68 68 72 -6 -5 105 100±6

Pengukuran tahun 2020

Bacaan

Fluorosensi Rata-

rata Baseline

Aktivitas

enzim (%)

Inhibisi

enzim

(%)

Baseline

pelarut

(%) 1 2 3

Kontrol

Blanko 99 99 96 98 0 - - -

Kontrol

Negatif 224 190 222 212 114 100 0 -

Sampel 94 101 91 95 -3 -2 102 97±4


14

Untuk mendukung hasil uji in vitro molekuler terhadap enzim MMP-9, partisi

n-heksana daun asoka diuji secara in vitro seluler terhadap sel kanker non metastatik

T47D dan sel normal (sel Vero). Kultur sel T47D termasuk dalam tipe sel kanker ERα-

positive dengan morfologi sel epitelium dengan bentuk bulat (cobblestone-like

structure) (Xie et al., 2012). Sedangkan sel Vero merupakan sel kultur mamalia yang

representatif terhadap sel normal manusia dan memiliki morfologi seperti sel fibroblast

dengan bentuk yang relatif memanjang (Goncalves et al., 2006). Kedua morfologi

tersebut sesuai dengan bentuk sel yang teramati dalam penelitian (Gambar 4). Hal ini

menandakan sel yang digunakan pada penelitian ini masih representatif karena belum

terjadi perubahan morfologi. Uji antiproliferasi sel kanker bertujuan untuk mengetahui

potensi penghambatan sampel partisi terhadap sel kanker, terutama kultur sel T47D

melalui penurunan persentase viabilitas sel dan berdasarkan nilai EC50. Selain itu,

sampel juga diuji keamanannya terhadap sel Vero dengan melihat aktivitas sitotoksik

atau nilai CC50 dari sampel. Kemudian selektivitas sampel partisi juga diidentifikasi,

parameter yang digunakan dalam menentukan selektivitas sampel adalah nilai Indeks

Keamanan (IK). Kedua sel yang digunakan disiapkan dan diuji di Laboratorium Kultur

Sel In-Vitro Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. Tahapan pengujian

antiproliferasi dan sitotoksiksitas dimulai dari perhitungan sel, penanaman sel,

pembuatan seri konsentrasi sampel, perlakuan sel terhadap sampel, pemberian reagen

MTT dan stopper SDS, serta pembacaan absorbansi menggunakan elisa reader.

Gambar 4. Morfologi sel sebelum diberi perlakuan


15

Media yang digunakan dalam mengembiakkan sel T47D adalah RPMI 1640,

sedangkan sel Vero menggunakan media M199. Setelah dilarutkan dengan akuabides

steril, kemudian larutan media difiltrasi menggunakan filter 0,2 mikron agar bebas dari

cemaran mikroba. Media pertumbuhan sel harus mengandung faktor pertumbuhan

yang dapat menunjang fungsi pertumbuhan sel. Maka dari itu, Fetal Bovine Serum

(FBS) ditambahkan sebanyak 10% ke dalam media agar dapat menyediakan faktor

pertumbuhan bagi kultur sel. Selain itu media pertumbuhan sel rentan mengalami

kontaminasi bakteri, maka perlu ditambahkan pen-strep ke dalam media pertumbuhan

sel. Pen-strep merupakan antibiotik bersprektrum luas yang mampu membunuh bakteri

gram negatif dan gram positif, namun penggunaan pen-strep tidak disarankan berlebih

karena dapat menyebabkan kematian terhadap kultur sel, pada penelitian ini

konsentrasi pen-strep dalam media pertumbuhan yang digunakan adalah 1,5% (CCRC,

2017). Perlu adanya penambahan sistem buffer pada media pertumbuhan sel, pada

penelitian ini digunakan NaHCO3 dengan konsentrasi 0,22% b/v. Ketika dilakukan

inkubasi dalam inkubator, sel dialiri dengan gas CO2, maka dari itu perlu adanya sistem

buffer untuk mencegah perubahan pH drastis yang dapat menyebabkan kematian sel.

Pada penelitian ini dilakukan pengukuran absorbansi dari kontrol positif,

kontrol blanko, kontrol sel, dan sampel perlakuan. Kontrol positif adalah kultur sel

dengan perlakuan pemberian doxorubicin yang merupakan antibiotik spektrum luas

yang digunakan sebagai terapi kanker payudara (Fitrianingsih et al., 2020). Tujuan dari

penggunaan kontrol positif sendiri adalah untuk menjamin hasil positif dapat diperoleh

atau untuk menunjukkan parameter percobaan yang dilakukan berfungsi sebagaimana

mestinya (absah). Sedangkan kontrol negatif hanya terdiri dari kultur sel tanpa adanya

perlakuan. Hal ini berguna sebagai pembanding perlakuan yang diberikan benar-benar

memberikan efek terhadap sel uji. Kemudian kontrol blanko yang hanya terdiri dari

reagen MTT tanpa kultur sel dan sampel berfungsi sebagai baseline hasil absorbansi

seluruh pengujian.


16

Uji in vitro seluler dimulai dari penanaman sel T47D dan Vero. Sel yang telah

dipanen menggunakan tripsin-EDTA (tripsin 0,25%), kemudian dipipet ke

hemasitometer. Tripsin merupakan enzim protease yang dapat memutus ikatan protein

sehingga berguna dalam mendisosiasikan sel yang melekat pada culture disk (Trosan

et al., 2018). Trypan blue ditambahkan ke suspensi sel pada hemasitometer untuk

memberi warna sel yang telah mati, sehingga mempermudah dilakukannya perhitungan

sel di bawah mikroskop inverted (Gambar 5). Trypan blue dapat memberi warna pada

sel yang telah mati karena bermuatan negatif dan hanya dapat berinteraksi dengan

membrane sel yang mengalami kerusakan, maka dari itu hanya sel yang mati atau rusak

saja yang berwarna biru (Tran et al., 2011). Hasil perhitungan menunjukkan jumlah sel

T47D dan sel Vero dalam 2 mL media berturut-turut sebesar 5.995.000 sel dan 715.000

sel. Berdasarkan hasil perhitungan tersebut, suspensi sel T47D dan sel Vero yang

dipipet untuk 36 well yang kemudian ditambah media kultur. Kemudian plate

diinkubasi pada suhu 37°C dan konsentrasi gas CO2 sebesar 5%. Setelah dilakukannya

inkubasi selama 24 jam, dilakukan pengamatan dibawah mikroskop dan didapat sel

yang bebas dari kontaminasi bakteri dan jamur.

Gambar 5. Pewarnaan sel menggunakn trypan blue (tanda panah menunjukan

kematian sel)


17

Selanjutnya, sel dalam well plate yang telah diinkubasi selama 24 jam diberi

perlakuan. Sampel dipreparasi dengan cara membuat stock larutan partisi n-heksana

daun asoka dengan konsentrasi 10.000 µg/mL air untuk injeksi. Sebanyak 100 µL

DMSO sebelumnya ditambahkan untuk meningkatkan kelarutan dari sampel partisi.

DMSO merupakan pelarut aprotik yang dapat meningkatkan kelarutan senyawa polar

dan non polar (Buncel and Stairs, 2015). Pengenceran kemudian dilakukan dengan

media kultur untuk mendapat seri konsentrasi sampel 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250

µg/mL, 125 µg/mL, dan 62,5 µg/mL, dan 31,25 µg/mL. Dengan dilakukannya

pengenceran tersebut, maka konsentrasi DMSO untuk masing-masing sumuran

menjadi 1%. Hal ini sesuai dengan batas aman konsentrasi DMSO terhadap

pertumbuhan sel, yaitu kurang dari 3 % (Singh et al, 2017). Kemudian sel kembali

diinkubasi selama 24 jam untuk memberikan waktu sel terpapar sampel perlakuan.

Berdasarkan Gambar 6, dapat teramati pada kontrol negatif pertumbuhan sel T47D dan

Vero terjadi secara normal yang berarti terjadi peningkatan jumlah sel hidup.

Peningkatan tersebut terjadi disebabkan tidak adanya perlakuan terhadap sel dan juga

mengindikasikan bahwa sel dapat berproliferasi secara normal. Sedangkan pada

perlakuan dengan 1000 µg/mL dan kontrol positif, menunjukan terjadinya kematian sel

T47D dan sel Vero yang dapat dilihat melalui perubahan morfologi sel. Namun

demikian, pada sel Vero sampel juga menunjukan adanya aktivitas sitotoksik. Maka

dari itu perlu untuk mengetahui selektivitas atau indeks keamanan dari sampel tersebut

agar aman digunakan dalam terapi.


18

Gambar 6. Kondisi sel T47D dan sel Vero setelah diberikan perlakuan (anak

panah menunjukan sel hidup)

Setelah diinkubasi dan dimati dibawah mikroskop inverted, sel dalam

sumuran diberi reagen MTT. Hasil pengamatan sel T47D dan sel Vero yang telah

diberikan reagen MTT di bawah mikroskop inverted menunjukkan terbentuknya kristal

formazan yang sedikit pada kelompok sampel perlakuan jika dibandingkan dengan

kontrol negatif. Sedangkan pada kontrol negatif, kristal formazan yang terbentuk jauh

lebih banyak. Hal ini mengindikasikan terjadi kematian sel pada sampel perlakuan,

namun tidak terjadi pada kontrol negatif (Gambar 7). Semakin tinggi jumlah formazan

yang terbentuk, maka semakin tinggi intensitas warna ungu yang dihasilkan,

menunjukan kematian sel yang terjadi semakin tinggi.


19

Gambar 7. Kondisi sel T47D dan Vero setelah diberikan reagen MTT (anak

panah menunjukan kristal formazan yang terbentuk)

Data hasil pembacaan absorbansi kemudian dikonversikan menjadi persen

viabilitas sel (persen sel hidup). Tabel IV menunjukkan persen viabilitas sel T47D yang

diberikan perlakuan pada konsentrasi 1000 µg/mL memiliki nilai terendah yaitu

67,34%, sedangkan pada konsentrasi terendah 31,25 µg/mL menunjukkan nilai persen

viabilitas sel yang tertinggi 99,76%. Berdasarkan hasil tersebut, diketahui terdapat

hubungan antara konsentrasi dengan proliferasi sel kanker T47D. Hal ini terbukti dari

nilai persen viabilitas yang menurun seiring dengan peningkatan dosis sampel partisi

yang mengindikasikan adanya aktivitas antiproliferasi sel kanker T47D pada sampel

partisi n-heksana daun asoka. Jika dibandingkan dengan hasil viabilitas sel T47D pada

kontrol positif, hasil menunjukan adanya aktivitas antiproliferasi serupa, yaitu

terjadinya penurunan viabilitas sel seiring peningkatan konsentrasi doxorubicin (dose

dependent).


20

Tabel IV. Nilai persen viabilitas sel T47D

Perlakuan Konsentrasi

(µg/mL)

% Viabilitas Sel T47D

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Rata-rata

Sampel partisi

n-heksana

daun asoka

1000 66,56 66,12 69,36 67,34±1,76

500 89,23 88,73 91,87 89,94±1,69

250 101,05 96,85 108,11 102,00±5,69

125 112,37 109,32 101,45 107,71±5,63

62,5 101,14 102,42 97,00 100,19±2,83

31,25 100,05 103,75 95,48 99,76±4,14

Kontrol positif

5 44.75 47.62 41.12 44.49±3,26

2,5 67.38 70.41 67.17 68.32±1,81

1,25 77.12 82.70 76.42 78.74±3,45

0,625 83.16 78.93 87.55 83.21±4,31

0,3125 88.11 92.06 87.91 89.36±2,34

0,15625 85,63 84,76 86,35 85,58±0,79

Persen viabilitas sel juga dihitung terhadap sel Vero, pada konsentrasi 1000

µg/mL menunjukan persentase viabilitas terkecil, yaitu 42,58% (Tabel V). Persentase

viabilitas juga teramati semakin meningkat seiring diturunkannya konsentrasi. Jika

dibandingkan dengan kelompok kontrol positif, hasil menunjukan aktivitas serupa,

yaitu sama-sama memiliki aktivitas antiproliferasi. Hal ini menunjukan bahwa partisi

n-heksana daun asoka dan doxorubicin memilki toksisitas dose dependent terhadap sel

normal.


21

Tabel V. Nilai persen viabilitas sel Vero

Perlakuan Konsentrasi

(µg/mL)

% Viabilitas Sel Vero

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Rata-rata

Sampel partisi

n-heksana

daun asoka

1000 47,34 35,62 44,78 42,58±6,16

500 84,42 76,30 95,88 85,53±9,84

250 68,43 79,69 88,83 78,98±10,22

125 90,02 85,83 93,22 89,69±3,17

62,5 99,51 92,38 93,85 95,25±3,67

31,25 97,54 101,22 94,89 97,88±3,18

Kontrol positif

400 7,29 7,67 7,67 7,54±0,22

200 30,63 28,33 29,29 29,41±1,15

100 51,48 52,82 51,09 51,79±0,90

50 66,78 66,78 63,91 65,82±1,66

25 67,16 65,06 69,07 67,10±2,01

12,5 67,54 67,93 68,69 68,05±0,58

Dari hasil perhitungan persentase viabilitas sel, kemudian dilakukan

perhitungan EC50 terhadap sel kanker T47D, dengan cara dibuat persamaan regresi non

linier log konsentrasi vs persentase viabilitas sel T47D pada masing-masing replikasi.

Dari persamaan tersebut, kemudian dihitung nilai EC50 sampel terhadap sel kanker

T47D pada masing-masing replikasi. Secara berturut-turut nilai EC50 sampel partisi

terhadap sel T47D sebesar 1312 µg/mL, 1337 µg/mL, dan 1303 µg/mL pada replikasi

satu, dua, dan tiga. Dari tiga nilai tersebut didapat nilai EC50 rata-rata sampel sebesar

1317,3 µg/mL. Menurut Costa, et al. (2017) suatu ekstrak memiliki aktivitas

antikanker yang tinggi apabila nilai EC50 < 500 µg/mL dan memiliki aktivitas yang

rendah apabila EC50 > 500 µg/mL. Maka dari itu, dilihat dari nilai EC50 yang diperoleh,

dapat dikatakan partisi n-heksana daun asoka memiliki aktivitas antiproliferasi yang

relatif rendah terhadap sel T47D. Jika dibandingkan dengan nilai EC50 kontrol positif

yaitu 5,127 µg/mL, sampel partisi memerlukan konsentrasi yang jauh lebih besar untuk

membunuh 50% populasi sel (Gambar 8). Hal ini berkaitan dengan doxorubicin yang

merupakan senyawa tunggal, sehingga memerlukan konsentrasi yang lebih kecil jika

dibandingkan dengan sampel partisi yang belum berupa senyawa tunggal. Maka dari


22

itu perlu dilakukannya penelitian lebih lanjut untuk mengisolasi senyawa pada sampel

partisi.

Gambar 8. Kurva nilai EC50 sampel dan kontrol positif terhadap sel T47D

Perhitungan CC50 sampel terhadap sel Vero juga dihitung dihitung dengan

membuat grafik regresi linear konsentrasi terhadap vibilitas sel Vero pada masing-

masing replikasi. Dari kurva tersebut kemudian didapat nilai CC50 sampel pada

replikasi satu, dua, dan tiga secara berturut-turut sebesar 1179 µg/mL, 809,3 µg/mL,

dan 955,3 µg/mL. Dari hasil tersebut kemudian didapat nilai CC50 rata-rata sebesar

981,2 µg/mL. Dapat dikatakan sampel partisi juga memiliki sifat sitotoksik yang

rendah, hal ini dapat dilihat dari nilai CC50 sampel yang berada diatas 500 µg/mL. Jika

dibandingkan dengan nilai CC50 pada kontrol positif yaitu 69,58 µg/mL, sampel partisi

memiliki aktivitas yang lebih baik karena bersifat kurang toksik (Gambar 9).

Gambar 9. Kurva CC50 sampel dan kontrol positif terhadap sel Vero


23

Tabel VI. Nilai EC50 terhadap sel T47D dan CC50 terhadap sel Vero

EC50 sel T47D (µg/mL)

Kelompok Replikasi

Rata-rata 1 2 3

Sampel 1303 1337 1312 1317,3

Kontrol positif 5,013 6,082 4,285 5,127

CC50 sel Vero (µg/mL)

Kelompok Replikasi

Rata-rata 1 2 3

Sampel 1179 809,3 955,3 981,2

Kontrol positif 70,51 68,81 69,41 69,58

Nilai EC50 dan CC50 yang diperoleh kemudian dianalisis secara statistik

dengan uji T tidak berpasangan. Hasil uji T pada nilai EC50 sel T47D antara kelompok

sampel dan kontrol positif adalah terdapat perbedaan yang bermakna yang dapat dilihat

dari perolehan nilai p < 0,05. Sama halnya pada sel Vero, hasil uji T antara CC50

kelompok sampel dan kontrol positif yang diperoleh adalah terdapat perbedaan yang

bermakna. Hal ini dapat dilihat dari nilai p yang diperoleh < 0,05. Dari dua hasil uji T

tersebut, diperoleh hasil yang berbeda bermakna antara kontrol positif, yang

menandakan terjadinya perbedaan aktivitas antara doxorubicin dan sampel terhadap sel

T47D dan sel Vero.

Indeks keamanan (IK) merupakan parameter suatu sampel dapat dikatakan

selektif membunuh sel kanker dan tidak toksik terhadap sel normal. Hal ini berguna

untuk menghindari efek samping antikanker terhadap sel normal (Sutejo et al., 2016).

Nilai IK dapat diperoleh dengan menghitung rasio antara CC50 terhadap sel Vero

dengan EC50 terhadap sel kanker T47D. Suatu ekstrak dinyatakan mempunyai

selektivitas yang tinggi apabila memiliki nilai IK ≥ 3, dan dinyatakan kurang selektif

apabila memiliki nilai IK < 3 (Sutejo et al., 2016). Berdasarkan nilai CC50 dan EC50

yang didapat pada penelitian ini, nilai IK yang diperoleh adalah sebesar 0,74. Meskipun

IK-nya rendah, namun berdasarkan kategorinya, EC50 sampel berada pada rentang

“tidak aktif” sehingga nilai IK tetap dianggap aman. Aktivitas partisi n-heksana daun

asoka terhadap T47D tidak sekuat aktivitasnya terhadap MMP9. Hal ini menunjukkan

bahwa partisi n-heksana daun asoka lebih selektif menghambat MMP9 yang


24

merupakan ciri khas kanker payudara triple negative daripada estrogen-α yang

merupakan ciri khas kanker luminal A yang terdapat pada model sel kanker T47D.

Metode Kromatografi Gas Spektrometri Massa (KG-SM) digunakan

bertujuan memprediksi senyawa-senyawa yang terkandung dalam partisi n-heksana

daun asoka berdasarkan bobot molekulnya. Senyawa-senyawa di dalam sampel

dipisahkan terlebih dahulu berdasarkan waktu retensinya dengan menggunakan

Kromatografi Gas (KG) yang memiliki prinsip pemisahan senyawa didasarkan

perbedaan distribusi antara fase diam dan fase gerak berupa gas inert yang akan

mengalir melalui sistem kromatografi (Enndler, 2004). Pengujian ini dilakukan dengan

menggunakan parameter yang telah ditetapkan dan didapatkan hasil kromatogram yang

menunjukkan adanya 10 puncak termasuk 3 puncak tertinggi, yaitu puncak 1, 4, dan 5

(Gambar 10).

Gambar 10. Kromatogram partisi n-heksana daun asoka

Waktu retensi yang diperoleh setiap puncak berbeda-beda. Hal ini terjadi

karena adanya perbedaan titik didih setiap senyawa yang terdapat pada sampel.

Semakin rendah waktu retensi yang diperoleh, mengindikasikan bahwa titik didih


25

senyawa tersebut semakin rendah (Pavia et al., 2015). Selain itu, jenis kolom yang

digunakan merupakan faktor penting lainnya yang berperan dalam menentukan waktu

retensi suatu senyawa. Kolom yang digunakan adalah RTX 5 MS

(difenildimetilsiloksan) yang bersifat non-polar. Semakin non-polar suatu senyawa

maka waktu retensinya juga akan semakin besar yang disebabkan karena afinitasnya

yang besar terhadap kolom yang digunakan (Hübschmann, 2015).

Puncak 1 dengan waktu retensi sebesar 6,554 menit memiliki mass peak

sebanyak 409 dan base peak pada 83 dengan Mr 530 (Gambar 11). Spektra massa

puncak 1 kemudian dicocokkan dengan library dan diprediksi sebanyak dua senyawa

hits yang disajikan pada Tabel VII dengan fragmen 152 dan 168. Puncak 4 dengan

waktu retensi sebesar 15,547 menit memiliki mass peak sebanyak 346 dan base peak

pada 138 dengan Mr 550 (Gambar 11). Spektra massa puncak 4 kemudian dicocokkan

dengan library dan diprediksi sebanyak dua senyawa hits yang disajikan pada Tabel

VII dengan fragmen 222 dan 222. Puncak 5 dengan waktu retensi sebesar 18,449 menit

memiliki mass peak sebanyak 319 dan base peak pada 68 dengan Mr 535 (Gambar 11).

Spektra massa puncak 5 kemudian dicocokkan dengan library dan diprediksi sebanyak

tiga senyawa hits yang disajikan pada Tabel VII dengan fragmen 222, 137, dan 250.


26

Gambar 11. Spektra massa puncak 1, 4, dan 5 partisi n-heksana daun asoka

Tabel VII. Prediksi senyawa hits dari spektroskopi massa puncak 1, 4, dan 5

Puncak Retention

time

%

Area Mr Fragmen Prediksi

Similarity

Index

1 6,554 23,04 530

152 1,1-Dichloro-2,2,2-

trifluoroethane 72

168 1,1-Difluoro-1,2,2-

trichloroethane 72

4 15,547 22,94 550

222 Patchouli alcohol 95

222 5.beta.,7.beta.H,10.alpha.-

Eudesm-11-en-1.alpha.-ol 85

5 18,449 34,29 535

222 Hexadecane, 1,2-epoxy- 88

137 1-Octadecyne 88

250 9-Octadecen-1-ol 87

Dari profil KG-SM diatas sampel partisi tidak secara pasti menunjukkan

adanya senyawa ixorapeptide I (MR 500,6 g/mol), akan tetapi rasio m/z yang

dihasilkan berada pada rentang 527-550 yang diprediksi sebagai keberadaan senyawa

ixorapeptide dengan struktur yang termodifikasi. Hal tersebut diperkuat dengan adanya

senyawa yang memiliki MR sama dengan ixorapeptide II (Mr 535 g/mol). Hasil ini

memperkuat kemungkinan adanya derivat senyawa ixorapeptide, terutama


27

ixorapeptide II yang menyebabkan partisi n-heksana daun asoka aktif terhadap MMP-

9. Selain itu pada puncak ke 4, diprediksi terdapat senyawa patchouli alcohol yang

memiliki aktivitas penghambatan terhadap beberapa sel kanker, salah satunya sel

kanker payudara MCF7 yang merupakan tipe sel kanker luminal seperti T47D (Jeong

et al, 2013).


28

KESIMPULAN

1. Partisi n-heksana daun asoka aktif menghambat MMP-9.

2. Partisi n-heksana daun asoka kurang aktif menghambat sel T47D yang merupakan

tipe sel kanker luminal A. Hal ini menunjukkan selektivitasnya terhadap kanker

tipe triple negatif yang mengekspresikan MMP-9 secara berlebih.

3. Nilai indeks keamanan yang diperoleh rendah, namun dapat masuk dalam kategori

aman karena berada pada rentang tidak aktif terhadap sel kanker T47D.

4. Senyawa kimia yang terdeteksi oleh KG-SM salah satunya adalah ixorapeptide II

yang diprediksi merupakan salah satu senyawa yang berperan dalam

penghambatan MMP-9. Untuk itu, penelitian lebih lanjut perlu dilakukan isolasi

ixorapeptide II dan dibuktikan aktivitasnya secara in vitro terhadap MMP9.


29

DAFTAR PUSTAKA

Adhipandito, C.F., Ludji, D.P.K.S., Aprilianto, E., Jenie, R.I., Al-Najjar, B., and

Hariono, M., 2019. Matrix metalloproteinase9 as the protein target in anti-

breast cancer drug discovery: an approach by targeting hemopexin domain.

Future Journal of Pharmaceutical Sciences, 5 (1), 1–15.

Buncel, E., and Stairs, R.A., 2015. Solvent Effects in Chemistry, 2nd Edition. John

Wiley & Sons, Inc., United States, p. 140-154.

Burstein, H.J. and Winer, E.P., 2014. Adjuvant Endocrine Therapy for Women with

Hormone Receptor – Positive Breast Cancer: American Society of Clinical

Oncology Clinical Practice Guideline Focused Update. Journal of Clinical

Oncology, 32 (21), 2255–2270.

CCRC, 2017. Protokol In Vitro. Indonesian Society for Cancer Chemoprevention,

Yogyakarta.

Costa, E. V. S., Brigido, H. P. C., Silva, J. V. S., Ferreira, M. R. C., 2017.

Antileishmanial Activity of Handroanthus serratifolius (Vahl) S. Grose

(Bignoniaceae). Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2,

1-6.

Djohan, M.A., 2020. UjiAktivitasFraksi n-Heksana-EtilAsetat DaunAsoka

(Ixoracoccinea L.) Terhadap Penghambatan Matrix Metalloproteinase-9

(MMP-9). Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta,

Indonesia.

Dontha, S., Kamurthy, H., and Mantripragada, B., 2015. Phytochemical and

Pharmacological Profile of Ixora: A Review. International Journal of

Pharmaceutical Sicencesand Research, 6 (2), 567-584.

Enndler, E.R.K., 2004. Introduction to Chromatography 1–25.

Fitrianingsih, F., Maharini, I., dan Utami, D, T., 2020. Development of Ethanolic

Extract of Pinang (Areca Catechu L.) as A Modulator of Doxorubicin

Cytotoxic Effect in Breast Cancer Therapy. Pharmaceutical Sciences and

Research, 7 (1), 1-14.

Fundala, R., et al., 2011. Fluorescence Detection of MMP-9. I. MMP-9 Selectively

Cleaves Lys-Gly-Pro-Arg-Ser-Leu-Ser-Gly-Lys Peptide. Current

Pharmaceutical Biotechnology. 12(5), 834–838.

Ganiga, M., and Cyriac, J., 2015. Detection of PETN and RDX using a FRET-based

fluorescence sensor system. Royal Society of Chemistry (Analytical Methods).

7(13), 5412-5418.

Globocan, 2018. International Agency for Research Centre. Asia, 29, 1–2.


30

Goncalves, E.A., Ventura, C.A., Yano, T., Macedo M.L.R., Genari, S.C., 2006.

Morphological and growth alterations in Vero cells transformed by cisplatin.

Cell Biology International, 30, 485-494.

Hariono, M., Rollando, R., Karamoy, J., Hariyono, P., Atmono, M., Djohan., M.,

Wiwy, W., Nuwarda, R., Kurniawan, C., Salin, N., and Wahab, H., 2020.

Bioguided Fractionation of Local Plants against Matrix Metalloproteinase9

and Its Cytotoxicity against Breast Cancer Cell Models: In Silico and In Vitro

Study. Molecules, 25 (20), 1-17.

Hariono, M., Yuliani, S.H., Istyastono, E.P., Riswanto, F.D. and Adhipandito, C.F.,

2018. Matrix metalloproteinase 9 (MMP9) in wound healing of diabetic foot

ulcer: Molecular target and structure-based drug design. Wound Medicine, 22,

pp.1-13.

Hariono, M., Nuwarda, R.F., Yusuf, M., Rollando, R., Jenie, R.I., Al-najjar, B., Putra,

K.C., Nugroho, E.S., Wisnumurti, Y.K., Dewa, S.P., Jati, B.W., Tiara, R.,

Ramadani, R.D., Qodria, L., 2019. Arylamide as Potential Selective Inhibitor

for Matrix Metalloproteinase 9 (MMP9): Design, Synthesis, Biological

Evaluation, and Molecular Modeling 9. Journal of Chemical Information and

Modeling, 60 (1), 349 – 359.

Huang, H., 2018. Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) as a Cancer Biomarker and

MMP-9 Biosensors: Recent Advances. Sensors, 18 (3249), 1-19.

Hutapea, J.R. (1994). Inventaris Tanaman Obat Indonesia III, Badan Penelitian dan

Pengembangan Kesehatan, Jakarta.

Hübschmann, H.-J., 2015. Handbook of GC-MS, Third Ed. ed, Handbook of GCMS.

Wiley-VCH, Singapore.

Irit, S., and Gaffney, J., 2015. Matrix Metalloproteinase Biology. Willey-Blackwell,

New Jersey. pp. 4, 45-47.

Jeong, J. B., Choi, J., Lou, Z., Jiang, X., Lee, S.H., 2013. Patchouli alcohol, an essential

oil of Pogostemon cablin, exhibits anti-tumorigenic activity in human

colorectal cancer cells. International Immunopharmacology, 16 (2), 184-190.

Kadirvelu, S. and Damle, S., 2017. Phytochemical Studies of Ixora Coccinealinn-An

Ethnobotanical. International Journal of Biology, Pharmacy and Allied

Sciences, 6 (7), 1403–1415.

Kuete, V., 2017. Medicinal Spices and Vegetables from Africa. Elsevier Inc., United

States, 272-273.


31

Lee, C.L., Liao, Y.C., Hwang, T.S., Wu, C.C., Chang, F.R., Wu, Y.C., 2010.

Ixorapeptide I and ixorapeptide II, bioactive peptides isolated from Ixora

coccinea. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 20, 7354-7357.

Ma, L., et al., 2014. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein

studies. Journal of Molecular Structure. 1077(1), 87-100.

Munira, Maisarah, R., Nasir, M., 2016. Potensi Antibakteri Ekstrak Bunga Soka (Ixora

coccinea L) Terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Aceh

Nutrition Journal, 1 (2), 130-134.

Naoki, O., Arihiro, K., Toshiyuki, Y., Noriko, H., Fumio, K., Suyoshi, S., Makoto, K.,

Kentaro, H., Hattori, M., 2014. The genome landscape of the African Green

Monkey kidney-derived Vero cell line. DNA Research, 21(6), 673–683.

Nicolotti, O., Catto, M., Giangreco, I., Barletta, M., Leonetti, F., Stefanachi, A., Pisani,

L., Cellamare, S., Tortorella, P., Loiodice, F., Carotti, A., 2012. European

Journal of Medicinal Chemistry Design, synthesis and biological evaluation

of 5-hydroxy, 5-substituted- pyrimidine-2, 4, 6-triones as potent inhibitors of

gelatinases MMP-2 and MMP-9. European Journal of Medicinal Chemistry,

58, 368–376.

Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S., Vyvyan, J.R., 2015. Introduction to

Spectroscopy.

Pusztai, L., 2009. Short communication Gene expression profiling of breast cancer.

Breat Cancer Research, 11 (3), 1–3.

Putra, K.C., Nugroho, E.S., Wisnumurti, Y.K., Dewa, S.P., Jati, B.W.P., Tiara, R.,

Setyaningsih, D. and Hariono, M., 2019. In Silico Study of Thioguanine

Derivatives as Hemopexin Matrix Metalloproteinase9 (PEX-9)

Inhibitors. Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and

Technology, 1(2), pp.17-24.

Saha, M. R., Alam, Md. A., Akter, R., Jahangir, R., 2008. In Vitro Free Radical

Scavenging Activity of Ixora coccinea L. Bangladesh Journal of

Pharmacology, 3, 90-96.

Singh, M., McKenzie, K., and Ma, X., 2017. Effect of Dimethyl Sulfoxide on In Vitro

Proliferation of Skin Fibroblast Cells. Journal of Biotech Research, 8, 78 –

82.

Sutejo, I. K., Putri, H., dan Meiyanto, E., 2016. Selektivitas Ekstrak Etanolik Buah

Makasar (Brucea javanica) pada Kanker Payudara Metastasis secara In Vitro.

Journal of Agromedicine and Medical Sciences, 2 (1), 1-5.


32

Tran, S., Puhar, A., Ngo-Camus, M., Ramarao, N., 2011. Trypan Blue Dye Enters

Viable Cells Incubated with the Pore-Forming Toxin HlyII of Bacillus cereus.

Plos One, 6 (9), 1-5.

Trosan, P., Smeringaiova, I., Brejchova, K., Bednar, J., Benada, O., Kofronova, O.,

Jirsova, K., 2018. The enzymatic de-epithelialization technique determines

denuded amniotic membrane integrity and viability of harvested epithelial

cells. Plos one, 13 (3), 1-16.

Uniprot, 2020. UniProtKB - P14780 (MMP9_HUMAN).

https://www.uniprot.org/uniprot/P14780. Diakses pada tanggal 23 Oktober

2020.

United States Department of Agriculture, 2020. Classification,

https://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=I

XORA, diakses tanggal 20 Februari 2020.

Wallrabe, H., Periasamy, A., 2005. Imaging protein molecules using FRET and FLIM

microscopy. Current Opinion in Biotechnology, 16(1), 19–27.

WHO, 2018. Cancer, https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer,

diakses tanggal 4 Maret 2020.

Xie, G., Yao, Q., Liu, Y., Du, S., Liu, A., Guo, Z., Sun, A., Ruan, J., Chen, L., Ye, C.,

and Yuan, Y., 2012. IL-6-Induced epithelial-mesenchymal transition

promotes the generation of breast cancer stem-lie cells analogous to

mammosphere cultures. International Journal of Oncology, 40, 1171-1179.

Yu, S., Kim, T., Hyun, K., Kang, K., 2017. Biochemical and Biophysical Research

Communications the T47D cell line is an ideal experimental model to

elucidate the progesterone-speci fi c effects of a luminal A subtype of breast

cancer. Biochemical and Biophysical Research Communications, 486 (3),

752–758.

Zhang, C., Wang, L., Wang, L., and Cui, S., 2016. A Retrospective Study on the

Efficacy of Trastuzumab in HER2Positive and Tamoxifen-Refractory Breast

Cancer with Brain Metastasis. BioDrugs, 30 (1),


33

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tanaman asoka


34

Lampiran 2. Volume bahan pengujian in vitro

No. Bahan Volume (µL)

BLK KN P KP Smpl

1 Buffer uji 100 45 44 43 44

2 Enzim MMP-9 - 5 5 5 5

3 Sampel - - - - 1

4 NNGH - - - 2 -

5 DMSO - - 1 - -

Inkubasi pada 37°C selama 30 menit

6 Buffer uji - 49 49 49 49

7 Substrat MMP-9 - 1 1 1 1

Total 100 100 100 100 100

Inkubasi pada 37°C selama 60 menit

BLK: Blanko; KN: Kontrol negatif; P: Kontrol pelarut; KP: Kontrol positif;

Smpl: Sampel partisi


35

Lampiran 3. Desain 96 well plate FRET-based assay


36

Lampiran 4. Desain 96 well plate MTT assay sel T47D

Keterangan:

Smp1: kultur sel + 1000 µg/mL sampel KP1: kultur sel + 5 µg/mL doxorubicin Smp2: kultur sel + 500 µg/mL sampel KP2: kultur sel + 2,5 µg/mL doxorubicin

Smp3: kultur sel + 250 µg/mL sampel KP3: kultur sel + 1,25 µg/mL doxorubicin

Smp4: kultur sel + 125 µg/mL sampel KP4: kultur sel + 0,625 µg/mL doxorubicin

Smp5: kultur sel + 62,5 µg/mL sampel KP5: kultur sel + 0,3125 µg/mL doxorubicin


KB: Kontrol blanko (Media kultur)

KS: Kontrol sel (kultur sel)


37

Lampiran 5. Desain 96 well plate MTT assay sel Vero

Keterangan:

Smp1: kultur sel + 1000 µg/mL sampel KP1: kultur sel + 400 µg/mL doxorubicin Smp2: kultur sel + 500 µg/mL sampel KP2: kultur sel + 200 µg/mL doxorubicin

Smp3: kultur sel + 250 µg/mL sampel KP3: kultur sel + 100 µg/mL doxorubicin

Smp4: kultur sel + 125 µg/mL sampel KP4: kultur sel + 50 µg/mL doxorubicin

Smp5: kultur sel + 62,5 µg/mL sampel KP5: kultur sel + 25 µg/mL doxorubicin


KB: Kontrol blanko (Media kultur)

KS: Kontrol sel (kultur sel)


38

Lampiran 6. Perhitungan sel T47D

a. Dilakukan penanaman 10.000 selwell⁄

b. Jumlah sel yang diperlukan = 36 well × 10.000 sel = 360.000 sel

c. Perhitungan hemasitometer:

o Jumlah sel kamar A: 276 sel

o Jumlah sel kamar B: 296 sel

o Jumlah sel kamar C: 340 sel

o Jumlah sel kamar D: 279 sel

d. Perhitungan jumlah sel:

e. Jumlah sel yang diperlukan:

f. Suspensi sel yang dipipet:

g. Volume total yang diperlukan:

Σ sel yang dihitung2 mL⁄ =

Σ kamar A + Σ kamar B + Σ kamar C + Σ kamar D

4× 104


1191

4× 104 × 2

Σ sel yang dihitung2 mL⁄ = 5.955.000 sel

2 mL⁄

Jumlah sel yang diperlukan = 36 well × 10.000 sel

well⁄

Jumlah sel yang diperlukan = 360.000 sel ≈ 400.000 sel

Volume total = 100 μL

well⁄ × (36 well + 4 well)

Volume total = 4000 μL (134 μL suspensi sel + 3866 μL media kultur RPMI)

jumlah sel terhitung × V1 = jumlah sel yang diperlukan × V2

5.955.000 sel × V1 = 400.000 sel × 2 mL

V1 = 0,134 mL ≈ 134 μL suspensi sel


39

Lampiran 7. Perhitungan sel Vero

a. Dilakukan penanaman 10.000 selwell⁄

b. Jumlah sel yang diperlukan = 36 well × 10.000 sel = 360.000 sel

c. Perhitungan hemasitometer:

o Jumlah sel kamar A: 35 sel

o Jumlah sel kamar B: 33 sel

o Jumlah sel kamar C: 39 sel

o Jumlah sel kamar D: 36 sel

d. Perhitungan jumlah sel:

e. Jumlah sel yang diperlukan

f. Suspensi sel yang dipipet:

g. Volume total yang diperlukan:


Σ kamar A + Σ kamar B + Σ kamar C + Σ kamar D

4× 104


143

4× 104 × 2

Σ sel yang dihitung2 mL⁄ = 715.000 sel

2 mL⁄

jumlah sel terhitung × V1 = jumlah sel yang diperlukan × V2

715.000 sel × V1 = 400.000 sel × 2 mL

V1 = 1,119 mL ≈ 1119 μL suspensi sel

Jumlah sel yang diperlukan = 36 well × 10.000 selwell⁄

Jumlah sel yang diperlukan = 360.000 sel ≈ 400.000 sel

Volume total = 100 μL

well⁄ × (36 well + 4 well)

Volume total = 4000 μL (1119 μL suspensi sel + 2881 μL media kultur M119)


40

Lampiran 8. Data absorbansi dan persentase viabilitas sel T47D

konsentrasi

(mcg)

Absorbansi % Viabiltias Sel

Kelompok 1 2 3

rata-

rata 1 2 3 Rata-rata

Sampel

1000 0.2567 0.2553 0.2657 0.259 66,56 66,12 96,36 67,34±1,76

500 0.3296 0.328 0.3381 0.332 89,23 88,73 91,87 89,94±1,69

250 0.3676 0.3541 0.3903 0.371 101,05 96,85 108,11 102,00±5,69

125 0.404 0.3942 0.3689 0.389 112,37 109,32 101,45 107,71±5,63

62.5 0.3679 0.372 0.3546 0.365 101,14 102,42 197,00 100,19±2,83

31,25 0,3644 0,3763 0,3497 0,363 100,05 103,75 95,48 99,76±4,14

Kontrol positif

5 0.4151 0.4373 0.3871 0.413 44,75 47,62 41,12 44,49±3,26

2.5 0.5897 0.6131 0.5881 0.597 67,38 70,41 67,17 68,32±1,81

1.25 0.6648 0.708 0.6594 0.677 77,12 82,70 76,42 78,74±3,45

0.625 0.7114 0.6788 0.7453 0.712 83,16 78,93 87,55 83,21±4,31

0.3125 0.7496 0.7801 0.7481 0.759 88,11 92,06 87,91 89,36±2,34

0,15625 0,7305 0,7238 0,736 0,730 85,63 84,76 86,35 85,58±0,79


41

Lampiran 9. Data absorbansi dan persentase viabilitas sel Vero

konsentrasi

(mcg)

Absorbansi % viabilitas sel

Kelompook 1 2 3

rata-

rata 1 2 3 Rata-rata

Sampel

1000 0,299 0,2355 0,2847 0,273 47.34 35.62 44.78 42.58±6,10

500 0,4977 0,4541 0,5593 0,504 84.42 76.30 95.88 85.53±9,48

250 0,4118 0,472 0,5214 0,469 68.43 79.69 88.83 78.98±10,22

125 0,5278 0,5053 0,545 0,526 90.02 85.83 93.22 89.69±3,71

62.5 0,5788 0,5405 0,5484 0,556 99.51 92.38 93.85 95.25±3,76

31,25 0,5367 0,5268 0,489 0,518 91,67 89,83 82,80 88,10±4,68

Kontrol

positif

400 0,076 0,078 0,078 0,077 7,92 7,67 7,67 7,54±0,22

200 0.198 0.186 0.191 0.192 30,63 28,33 29,29 29,41±1,15

100 0.307 0.314 0.305 0.309 51,48 52,82 51,09 51,79±0,90

50 0.387 0.387 0.372 0.382 66,78 66,78 63,91 65,82±1,66

25 0.389 0.378 0.399 0.389 67,16 65,06 69,07 67,10±2,01

12,5 0.391 0.393 0.397 0.394 67,54 67,93 68,69 68,05±0,58


42

Lampiran 10. Kurva nilai EC50 sampel terhadap sel T47D menggunakan GraphPad

Prism 9.0.0


43


44


45

Lampiran 11. Kurva nilai CC50 sampel terhadap sel Vero menggunakan GraphPad

Prism 9.0.0


46


47


48

Lampiran 12. Data hasil Uji T tidak berpasangan EC50 sel T47D

Table Analyzed Uji T EC50 sel T47D

Column B Kontrol positif

vs. vs.

Column A Sampel partisi

Unpaired t test with Welch's correction

P value <0.0001

P value summary ****

Significantly different (P < 0.05)? Yes

One- or two-tailed P value? Two-tailed

Welch-corrected t, df t=128.8, df=2.011

How big is the difference?

Mean of column A 1317

Mean of column B 5.127

Difference between means (B - A) ± SEM -1312 ± 10.18

95% confidence interval -1356 to -1269

R squared (eta squared) 0.9999

F test to compare variances

F, DFn, Dfd 379.8, 2, 2

P value 0.0053

P value summary **


Data analyzed

Sample size, column A 3

Sample size, column B 3


49

Lampiran 13. Data hasil Uji T tidak berpasangan CC50 sel Vero

Table Analyzed Uji T CC50 sel Vero

Column B Kontrol positif

vs. vs.

Column A Sampel partisi

Unpaired t test with Welch's correction

P value 0.0136

P value summary *


One- or two-tailed P value? Two-tailed

Welch-corrected t, df t=8.480, df=2.000

How big is the difference?

Mean of column A 981.2

Mean of column B 69.58

Difference between means (B - A) ± SEM -911.6 ± 107.5

95% confidence interval -1374 to -449.1

R squared (eta squared) 0.9729

F test to compare variances

F, DFn, Dfd 46645, 2, 2

P value <0.0001

P value summary ****


Data analyzed

Sample size, column A 3

Sample size, column B 3


50

Lampiran 14. Parameter Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)


51

Lampiran 15. Profil spektra massa partisi n-heksana daun asoka


52


53


54


55


56

Lampiran 16. Struktur prediksi senyawa-senyawa yang terkandung dalam partisi n-

heksana daun asoka berdasarkan library WILEY7.LIB

Senyawa Struktur

1,1-Dichloro-2,2,2-trifluoroethane

1,1,7-Trimethyl-4-methylenedecahydro-1H

Azulene, 1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-1,4-

dimethyl-7-(1-methylethenyl)

1,6-Methanonaphthalen-1(2H)-ol, octahydro-

4,8a,9,9-tetramethyl-

Hexadecane, 1,2-epoxy-

1,2-Epoxyoctadecane

1-Octadecyne

1H-Indene, 2-butyl-5-hexyloctahydro-

1-Docosanol, acetate

Octane, 2-chloro-


57

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Uji Antiproliferasi Partisi n-

Heksana Daun Asoka (Ixora coccinea L.) Terhadap Sel

Kanker T47D Melalui Penghambatan MMP-9 In Vitro”

memiliki nama lengkap I Made Bayu Kresna Yoga. Penulis

lahir di Kabupaten Tabanan pada tanggal 4 Juli 1998 sebagai

anak kedua dari tiga bersaudara dari pasangan I Ketut Wina

dan Ni Made Perami Antari. Pendidikan formal penulis

diawali di TK Saraswati Tabanan (2004-2005), SD Saraswati

Tabanan (2005-2011), SMPN 1 Tabanan (2011-2014), dan

SMAN 1 Tabanan (2014-2017). Penulis kemudian

melanjutkan Pendidikan Sarjana 1 di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2017.

Selama menempuh perkuliahan, penulis terlibat dalam

beberapa kegiatan organisasi dan kepanitiaan, antara lain

anggota divisi P3K kegiatan Pharmacy Performance tahun 2017 dan 2018, anggota

divisi perlengkapan kegiatan Pelepasan Wisuda I dan II tahun 2018, ketua umum

kegiatan Pharmacy Performance tahun 2019, dan ketua Drug Discovery Student Club

(DDSC) periode 2019-2020. Selain itu, penulis pernah memperoleh prestasi berupa

juara II dalam Kompetisi Basket Putra USD Talent tahun 2019, juara II dalam

Kompetisi Basket Putra HIMFA CUP 2019, dan finalis Penelitian Paling Berpotensi

sekaligus Peneliti Muda Paling Berpotensi dalam kegiatan Bursa Hilirisasi Inovasi

Herbal Indonesia yang diadakan Badan POM RI tahun 2020. Penulis juga berperan

aktif sebagai asisten praktikum mata kuliah Kimia Organik (2019), Biologi Sel dan

Molekuler (2019-2020). Selain itu penulis juga pernah menjadi pengajar dalam

program Tutor Sebaya untuk mata kuliah Kimia Organik (2019) dan Kimia Medisinal

(2020).


Documents

UJI ANTIPROLIFERASI PARTISI n-HEKSANA DAUN ASOKA