UNDANG-UNDANG REPUBLIK INDONESIA NO 19 …pustaka.unpad.ac.id/wp-content/uploads/2016/08/07-Konstruksi-dan... · Isolasi Senyawa Steroid dari Umbi ... Analisis Zat Gizi Biskuit Difortifikasi

Prosiding Seminar Nasional MIPA 2014

i

UNDANG-UNDANG REPUBLIK INDONESIANO 19 TAHUN 2002 TENTANG HAK CIPTA

Pasal 72

KETENTUAN PIDANASANGSI PELANGGARAN

1. Barangsiapa dengan sengaja dan tanpa hak melakukan perbuatan sebagaimana dimaksuddalam Pasal 2 ayat (1) atau Pasal 49 ayat (1) dan ayat (2) dipidana dengan pidanapenjara masing-masing paling singkat 1 (satu) bulan dan/atau denda paling sedikit Rp1.000.000,00 (satu juta rupiah), atau pidana penjara paling lama 7 (tujuh) tahun dan/ataudenda paling banyak Rp 5.000.000.000,00 (lima miliar rupiah).

2. Barangsiapa dengan sengaja menyiarkan, memamerkan, mengedarkan, atau menjualkepada umum suatu Ciptaan atau barang hasil pelanggaran Hak Cipta atau Hak Terkaitsebagaimana dimaksud pada ayat (1) dipidana dengan pidana penjara paling lama 5(lima) tahun dan/atau denda paling banyak Rp 500.000.000,00 (lima ratus juta rupiah).


P R O S I D I N G

SEMINAR NASIONAL MIPA 2014FMIPA UNIVERSITAS PADJADJARAN

PERAN ILMU DASAR

DALAM PEMBANGUNAN BERWAWASAN LINGKUNGAN

DISUSUN OLEH:PANITIA SEMINAR NASIONAL BIDANG MIPA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS PADJADJARAN


iii

“PERAN ILMU DASAR DALAM PEMBANGUNAN BERWAWASAN LINGKUNGAN”

1 (satu) jilid; A4

Diterbikan oleh:FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS PADJADJARANJl. Raya Bandung-Sumedang KM. 21Jatinangor – Sumedang 45363Telp./Fax.: 022-7797712/7794545

ISBN : 978-602-72216-0-4ISSN : 9772442242DD3

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh isi buku ini dengan caraapapun, termasuk dengn penggunaan mesin fotocopy, tanpa izin sahdan tertulis dari penerbit

Hak Cipta Dilindungi Undang-undangIsi diluar tanggung jawab penerbit dan percetakan

Prosiding ini dicetak pada bulan Januari 2015


iv

SUSUNAN DEWAN REDAKSI PROSIDING SEMINAR NASIONAL BIDANG MIPAFMIPA UNPAD 2014

Penanggung Jawab : Dekan FMIPA UnpadKetua Dewan Redaksi : Ketua Seminar MIPA Unpad 2014Dewan Penelaah : Prof. Dr. Budi Nurani

Prof. Dr. Johan IskandarDr. Atje Setiawan ASeptiadi Padmadisastra, Ph.DDr. Setiawan Hadi, M.Sc.CsDr. Juli RejitoDr. Ruhyat Partasasmita, .M.SiDr. Euis Julaeha, M.SiDr. Tati Herlina, M.SiDr. Anni Anggraeni, M.SiDr. Ayi Bahtiar, M.SiDr. Iman Rahayu, M.SiDr. Teguh Husodo, M.SiDr. Lienda Noviyanti, M.SiDr. NurzamanDr. Dikdik Kurnia, M.ScDr. Sahrul HidayatDr. Diah Chaerani, M.SiDr. Lusi Safriani, M.SiAnnisa, M.Si., Ph.D

Editor Pelaksana : Dr. Dikdik Kurnia, M.Sc.Dr. Diah Chaerani, M.Si.Dr. Lusi Safriani, M.Si.

Desain Sampul : Eko NugrohoLayout : Iman Nugraha


v

Daftar Isi

Daftar Isi....................................................................................................................................................................... v

Sambutan Rektor Unpad............................................................................................................................................... xii

Sambutan Ketua Panitia Seminar Nasional MIPA 2014 .............................................................................................. xiv

Air Pollution and Perception-Based Averting Behavior The Case of The Jinchuan Mining Area, China ................... 1Henk Folmer

Pengembangan Model Prediksi SST Nino 3.4 Dan IOD Terkait Dengan Datangnya Kemarau Panjang ....................... 2Eddy Hermawan, Rizki Krisnanto dan Shailla Rustiana

Menjawab Tantangan: Peran Inovasi Sains Dalam Membangun Masa Depan Yang Berkelanjutan ........................... 3Abdul Haris

Recent Study on Biologically Active Natural Products From Some Indonesia Aglaia Plants ..................................... 4Unang Supratman, Mariam Ulfah, Asep Supriadin, Tri Mayanti, Desi Harneti, Nurlelasari, Khalijah Awang andHideo Hayashi

Perbandingan Metode Beda Hingga Pada Perhitungan Harga Opsi Asia..................................................................... 14Abdul Aziz dan Wahyudi

Menentukan Waktu Penggantian Optimum Salah Satu Komponen Mesin Pada Bus Penumpang Damri DenganModel Age Replacement .............................................................................................................................................. 19

Julita Nahar

Fungsi Mittag-Leffler Sebagai Alternatif Untuk Mencari Solusi Persamaan Diferensial Fraksional .......................... 24Endang Rusyaman, Kankan Parmikanti dan Ema Carnia

Pemecahan Persamaan Diferensial Non Homogen Tingkat Dua Dengan Koefisien Konstan Menggunakan FungsiGreen ............................................................................................................................................................................ 30

Eddy Djauhari

Model Optimisasi Perencanaan Produksi Rantai Pasok Loop Tertutup Dengan Tingkat Permintaan DanPengembalian Produk Yang Tidak Tentu Menggunakan Metode Wolfe ..................................................................... 34

Aris Prasetya, Diah Chaerani dan Eman Lesmana

Karakterisasi Fisiko Kimia Tepung Biji Nangka (Artocarpus heterophyllus) Dengan Penggilingan Basah DanKering Dalam Upaya Diversifikasi Pangan Fungsional ............................................................................................... 42

Ade Heri Mulyati dan Diana Widiastuti

Sifat Adsorpsi Daun Lidah Mertua (Sansevieria trifasciata) Terhadap Logam Kadmium Dan Kromium .................. 47Uji Pratomo, Anni Anggraeni, Diana Hendrati dan Rubianto Abd Lubis

Aktivitas Senyawa Dari Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.) Terhadap Enterococcus faecalis ATCC 29212 ... 51Harold Eka Atmaja, Dikdik Kurnia dan Dadan Sumiarsa

Pelarutan Monasit Dalam Sistem Tertutup Dengan Menggunakan Basa Serta Pemisahan Unsur Tanah Jarangnya ... 58Anni Anggraeni, Kokentyo Juniawan, Yuhelda Dahlan, Uji Pratomo, dan Husein H. Bahti

Terpenoid Dari Umbi Tumbuhan Sarang Semut (Myrmecodia pendans) Dan Uji Aktivitas AntibakteriEnterococcus Faecalis.................................................................................................................................................. 63

Boima Situmeang, Dadan Sumiarsa dan Dikdik Kurnia

Konstruksi Dan Optmasi Gen Pretrombin-2 Manusia Dalam Escherichia coli Untuk Produksi Trombin SebagaiKomponen Lem Fibrin ................................................................................................................................................. 68

Saronom Silaban, Iman Permana Maksum, Shabarni Gaffar, Sutarya Enus,Khomaini Hasan, Toto Subroto danSoetijoso Soemitro

Sintesis Hidrotalsit Mg/Fe/Al/Ce Dengan Metode Kopresipitasi-Hidrotermal: Leachabilitas Kebasaan DanDerajat Kristalisisasi..................................................................................................................................................... 73

Mochamad Zen, Dadan Sumiarsa1, Roekmi-ati Tjokronegoro dan Rustam E. Siregar


vi

Aplikasi Koagulan Cair Al-Fe Berbasis Lempung Alam Pada Pengolahan Air Gambut: Efek TemperaturKalsinasi Dan Pelindian ............................................................................................................................................... 77

Muhdarina, Amilia Linggawati, T.Ariful Amri, Reza Syahroni dan Hevi Sutrisno

Nisbah daya oksidasi elektrode Pt Vs Fe dalam proses MEO ...................................................................................... 82Rubianto Abd Lubis, Allyn Pramudya S., dan Uji Pratomo

Pengaruh Ekstrak Daun Medang Perawas (Litsea odorifera Val.) Terhadap Tukak Lambung Mus MusculusJantan............................................................................................................................................................................ 85

Dewi Handayani, Agus Sundaryono dan Raidatul Fannyda

Analisis Kimia Tanah Dengan Perangkat Uji Tanah Kering (PUTK) Untuk Rekomendasi Pemupukan TanamanKedelai (Glycine max, Linn) Untuk Kabupaten Bengkulu Selatan .............................................................................. 91

Nurmegawati, Yahumri dan Salastri Rohiat

Optimasi konsentrasi Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside pada ekspresi gen Pretrombin-2 manusia dalamEscherichia coli ............................................................................................................................................................ 95

Rizky Rhimadania Dwi Wahyuni, Saronom Silaban, Khomaini Hasan, Dian Siti Kamara, Sutarya Enus, ImanPermana Maksum, Toto Subroto dan Soetijoso Soemitro

Sintesis Silikalit-1 Menggunakan Bahan Dasar Silika Sekam Padi Dan Karakterisasinya .......................................... 101Solihudin

Penambahan Polianilin Untuk Meningkatkan Konduktivitas Baterai LiFePO4 ........................................................... 107Iman Rahayu, Sahrul Hidayat dan Lutfi Aryadi

Pembuatan Resin Berbasis Epoksi Termodif Ikasi Poliuretan Dengan Dan Tanpa Penambahan Katalis DibutiltinDilaurat......................................................................................................................................................................... 111

Herlan Herdiawan, Evi Triwulandari dan Muhammad Ghozali

Analisis Senyawa Metabolit Sekunder dan Uji Toksisitas Ekstrak Daun Bawang Laut (Proiphys amboinensis(L.) Herb.) .................................................................................................................................................................... 116

Meiske S. Sangi, Harry S.J. Koleangan dan Chendy C. Dapas

Studi Produksi Virgin Coconut Oil (VCO) Dengan Cara Fermentasi Menggunakan Campuran Rhizopusoligosporus, Saccharomyces cerevisiae Dan Neurospora sitophila ............................................................................. 122

Sadiah Djajasoepena, R. Ukun M S Soedjanaatmadja dan Yuni Lestari

Pengolahan Limbah Cantinamipa Dengan Proses Adsorpsi Menggunakan Batang Pisang Dan Ampas Teh .............. 127Putri Prasetyaningtyas, Christi L. Natanael dan Yati B. Yuliyati

Isolasi Senyawa Antioksidan Pada Alga Laut Eucheuma spinosum ............................................................................ 132Lena Damongilala, Eti Apriyanti dan Dikdik Kurnia

Isolasi Senyawa Antioksidan Pada Alga Laut (Laurencia tronoi) Dari Perairan Sulawesi Utara ................................ 135Verly Dotulong1, Eti Apriyanti dan Dikdik Kurnia

Penurunan Konsentrasi Tembaga dan Asam asetat dalam Limbah Laboratorium Kimia Universitas Padjadjarandengan Penggunaan Ampas Teh .................................................................................................................................. 139

Nina Andhini Pratiwi, Christi Liamita Natanael dan Yati B. Yuliyati

Sub-Kloning Gen -amilase Saccharomyces fibuligera (Sfamy) Dalam Inang Escherichia coli ................................ 146Shabarni Gaffar, Siti Rohanah, Toto Subroto dan Soetijoso Soemitro

Potential Energy Surfaces of Reaction of F+ with O3 ................................................................................................... 153Juliandri

Ekstraksi Silika Dari Sekam Padi Dengan Metode Presipitasi Dan Aplikasinya Sebagai Pelapis Hidrofobik............. 158Atiek Rostika Noviyanti, Solihudin, Yati B. Yuliyati dan Vivian Nur Shabrina

Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder Dari Daun Tumbuhan Gambir (Uncaria gambir Roxb.) ................................... 163Tiara Arindy Tikasari, Dikdik Kurnia dan Ika Wiani

Pengaruh Ph Dan Kecepatan Alir Pada Pemisahan Enansiomer Ofloksasin Melalui PembentukanDiastereoisomer Dengan L-Isoleusin Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ......................................................... 167

Diana Hendrati, Zenith Putri Dewianti dan Titin Sofyatin


vii

Terpenoid Dari Umbi Tumbuhan Sarang Semut (Myrmecodia pendans) Yang Beraktivitas Antikanker.................... 170Indah Permata Yuda, Dikdik Kurnia dan Dadan Sumiarsa

Isolasi Senyawa Steroid dari Umbi Sarang Semut (Myrmecodia pendans Merr. & L.M. Perry)................................. 176Hilmana Radhia Putera, Dikdik Kurnia dan Dadan Sumiarsa

Studi Interaksi Antara Kation Klor Dengan Molekul Ozon Menggunakan Metode Kimia Komputasi DFT............... 182Rustaman, Juliandri dan Alfredo Zefanya Sinurat

Analisis Zat Gizi Biskuit Difortifikasi Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia Mangostana.L)............................... 189Nenden Indrayati Anggraeni, M.Fahmi Fahrudin

Studi Penumbuhan Single Kristal Sistem Spin Ferromagnetik Satu Dimensi (1D) RbFeCl3....................................... 195R. Tasomara, T. Kawamata, Y. Matsuoka, Y. Koike dan Risdiana

Pengaruh Penambahan Bahan Manetik Fe Terhadap Nilai Reduksi Oksigen Dan Struktur Kristal BahanSuperkonduktor Eu1.85+yCe0.15-yCu1-yFeyO4+α-δ............................................................................................................. 200

S. Pratiwi, D. Suhendar, W. A. Somantri, N. Suhendi, T. Saragi dan Risdiana

Sintesis dan Karakterisasi Poli (3-Glisidiloksi propiltrimetoksisilan) untuk Bahan Proteksi Korosi Pipa BajaKarbon.......................................................................................................................................................................... 204

Tuti Susilawati, Fitrilawati dan Naely Zulfa

Rancang Bangun Solar Water Heater dan Pelat Absorber Untuk Pemanfaatan Panas Buangan Sel Surya ................. 208Marrisa Alrinkha Ega Putri, Came llia Panatarani dan I Made Joni

Desain dan Simulasi DC-DC Converter untuk Rumah DC Unpad .............................................................................. 214Mohammad Taufik, Taufik dan Bernard Y Tumbelaka

Identifikasi Gugus Fungsi Silicone Oil 5500 Cst Sebagai Cairan Tamponade Pada Bedah Vitreoretina .................... 217H. S. Nusa, W. Astuti, A. S. Kartasasmita, R. Virgana, N. Syakir, A. Bahtiar, L. Safriani dan Risdiana

Pengaruh Perlakuan Annealing Terhadap Kandungan Oksigen Dan Kualitas Bahan Superkonduktor DopingElektron Eu2-yCeyCuO4+α-δ ............................................................................................................................................ 221

Dadan Suhenda, Siska Pratiwi, Wahyu A. Somantri, Nendi Suhendi, Togar Saragi dan Risdiana

Pengaruh Capping Molekul Squaraine terhadap Sifat Optik Material Campuran Polimer Poli(3-Heksiltiofen):Zinc Oksida Nanopartikel (P3HT:ZnO-NP)........................................................................................... 225

Siti Halimah Tusaddiah, Wendy Paramandhita S.M dan Ayi Bahtiar

Interpretasi Data Geolistrik Untuk Penentuan Pola Sedimentasi Daerah Aliran Sungai Luk Ulo, Karang Sambung.. 229Marselina Sitinjak, Dini Fitriani dan Anggie Susilawati

Studi Keanekaan Jenis Dan Populasi Burung Di Kawasan Bandung Timur ................................................................ 233Johan Iskandar

Inokulan Cair Azotobacter Berbasis Molase Untuk Menekan Kerusakan Tanaman Sawi Akibat InfestasiRhizoctonia solani ........................................................................................................................................................ 238

Reginawanti Hindersah, A. Marthin Kalay, Wilhermina Rumahlewang, Abraham Talahaturuson dan Martha MariaMaskikit

Uji Fitokimia Pada Tumbuhan Obat Di Triangulasi-Sadengan Taman Nasional Alas Purwo ..................................... 244Rahayu Apriyanti, Asep Zainal M dan M. Nurzaman

Studi Komparatif Kekerabatan dan Keanekaragaman Jenis Tumbuhan Paku (Pteridophyta) di Sekitar Kawah diBeberapa Gunung di Jawa Barat ................................................................................................................................. 249

Suryana, Yayat Ruchiyat dan Budi Irawan

Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Dan Minyak Atsiri Buah Paprika (Capsicum annum var. grossum) TerhadapBakteri Streptococcus pyogenes dan Klebsiella pneumonia......................................................................................... 255

Ida Indrawati, Budi Irawan, Masagus dan Rizki Radiansyah

Optimisasi pH Medium Kultur Untuk Produksi Biosurfaktan Pada Bakteri Indigenous Oily Sludge ......................... 262Nia Rossiana, Asri Peni Wulandari dan Azka Manzilah

Struktur Komunitas Bivalvia Di Kawasan Mangrove Perairan Bontolebang Kabupaten Kepulauan SelayarSulawesi Selatan........................................................................................................................................................... 265

Magdalena Litaay, Darusalam dan Dody Priosambodo


viii

Mysida Mesopodopsis Sebagai Bahan Pembuat Terasi ............................................................................................... 272Rose O.S.E. Mantiri

Efektivitas Inokulan Mikroba Terpilih Berbasis Kompos Iradiasi Terhadap Degradasi TPH Di Dalam TanahTercemar Lumpur Minyak Bumi.................................................................................................................................. 275

Nana Mulyana, Tri Retno Dyah Larasati dan Dadang Sudrajat

Kloning Gen Pab Mycobacterium Tuberculosis Ke Vektor Ekspresi Pqe30 Sebagai Antigen Untuk KitDiagnostik Tuberkulosis Laten..................................................................................................................................... 283

Rosana Agus, Sjafaraenan, Helmy Widyastuti dan A. Arfan Sabran

Korelasi Kondisi Daun Terhadap Kadar Pb, dan Klorofil Daun Hibiscus tiliaceus dan Swietenia macrophyllaKing di Kampus Universitas Hasanuddin Makassar .................................................................................................... 287

Sri Suhadiyah, Roland A Barkey dan Elis Tambaru

Pencegahan Kebotakan Akibat Pemberian Etoposid dengan Menggunakan Berbagai Produk Olahan Kedelai(Glycine max (L.) Merr.) .............................................................................................................................................. 292

Madihah, Cucu Hadiansyah dan Yetty Yusri Gani

Potensi Antigenotoksik Dari Beberapa Kultivar Daun Mangga Pada Mencit (Mus musculus L.) Yang DiinduksiKadmium Klorida......................................................................................................................................................... 298

Nining Ratningsih, Annisa, Dhita A Ruspendi, Rini Hafzari dan Supartini Syarif

Aktivitas Ekstrak Etanol Dan Senyawa Spinasterol Daun Senggugu (Clerodendron serratum L.) DalamMenurunkan Kadar Kolesterol Total Serum Mencit (Mus musculus) Jantan ............................................................... 302

Desak Made Malini

Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Dari Tempe Bosok............................................................................. 306Muhammad Iqbal Perdana, Rifqi Nur H, Elisabeth Diani, Lia Pramusintia Daru M, Nur Fathurahman R dan Astuti

Jenis-Jenis Tumbuhan Pesisir Di Wilayah Oba Dan Oba Tengah Halmahera Maluku Utara ...................................... 312Budi Irawan

Struktur Komunitas Lamun Di Pantai Pancur Taman Nasional Alas Purwo, Banyuwangi, Jawa Timur..................... 315Alberta Widhi A. Putri dan Tri Dewi K. Pribadi

Peningkatan Populasi Bradyrhizobium Di Rizosfer Dan Pertumbuhan Vegetatif Kedelai Melalui AplikasiEksopolisakarida Azotobacter ...................................................................................................................................... 319

Dirga Sapta Sara, Reginawanti Hindersah dan Mieke R. Setiawati

Pengolahan Limbah Daun Kering Dan Kulit Ganyong Dengan Sedimen Selokan Sebagai Sumber Biogas ............... 324Wanda Irawan, Imela Sukma Tifana, Vanessa Catarina dan Irawan Sugoro

Efektivitas Ragi Tempe Berbahan Tepung Ganyong Terhadap Produksi Tempe ........................................................ 328Nurwinda Ekawati, Melvin Anggriawan, Afra Nadya R. dan Irawan Sugoro

Analisis Vegetasi Indikator Kondisi Ekosistem Hutan Alam....................................................................................... 332Wulandari Fitria Sartika, Teguh Husodo dan Prihadi Santoso

Pengaruh Faktor Lingkungan Terhadap Vegetasi Tumbuhan Bawah .......................................................................... 337Fithriya Karimah, Teguh Husodo dan Prihadi Santoso

Pengaruh Konsentrasi Pakan Hijauan Sorghum (Sorghum bicolor) Terhadap Fermentasi Cairan Rumen KerbauSecara In Vitro.............................................................................................................................................................. 345

Hilyati Melida Putri, Jumron Waris dan Irawan Sugoro

Identifikasi Spora Endomikoriza Indogenous Lahan Tercemar Mercuri Di Pongkor Bogor ....................................... 353Joko Kusmoro, Titin Supriatun, Nia Rossiana dan Bob Adyari

Pengembangan Perangkat Lunak Analisis Ketidakpastian Pada Perhitungan Struktur Material ................................. 356Entin Hartini, Roziq Himawan dan Nursinta Adiwahanani

Perbandingan Fungsi Respons Stokastik Hasil Kedelai Terhadap Pemupukan Kalium............................................... 361Mohammad Masjkur

A Comparison of Maximum Likelihood and Bayesian Estimator of Disease Risk by Means of Monte CarloSimulation .................................................................................................................................................................... 366

I Gede Nyoman Mindra Jaya, Henk Folmer, Budi Nurani Ruchjana, Sudartianto dan Soemartini


ix

Perhitungan Fungsi Dosis Radial Dan Fungsi Anisotropi Sumber Brakiterapi I-125 Tipe S01 MenggunakanSimulasi MCNPX........................................................................................................................................................ 375

Anik Purwaningsih dan Moch Subechi

Optimasi Query Cbir Database Citra Berukuran Besar Menggunakan Klaster Indeks K-Means................................. 380Juli Rejito dan Deni Setiana

Aplikasi Gelombang Otak Pada Lampu Led Menggunakan Mindflex......................................................................... 386Asep Sholahuddin, Setiawan Hadi dan M. Fayyadh

Pemanfaatan DeWa Framework untuk Deteksi Dini Kanker Kulit Pada Citra Biomedis ............................................ 389Setiawan Hadi, Bernard Y Tumbelaka, Budi Irawan dan Rudi Rosadi

Index Penulis ................................................................................................................................................................ 394Index Kata Kunci.......................................................................................................................................................... 397


xii

Sambutan Rektor Unpad

Seminar Nasional MIPA 2014“Peran Ilmu Dasar dalam Menunjang Pembangunan Berwawasan Lingkungan”

Bale Sawala, 18 Oktober 2014

Assalamu’alaikum wr. wb.

Puji dan syukur senantiasa kita panjatkan kehadirat Illahi Rabbi yang telah melimpahkan rahmat danhidyah-nya, ilmu, kesehatan, keselamatan, umur dan rezeki kepada kita semua.

Alhamdulillah pada hari yang berbahagia ini, kita dapat berkumpul bersama dalam acara SeminarNasional MIPA 2014 dengan tema “Peran Ilmu Dasar dalam Menunjang PembangunanBerwawasan Lingkungan”

Universitas Padjadjaran sebagai salah satu perguruan tingi besar yang ada di Indonesia, senantiasaberusaha meningkatkan kualitas pendidikan dan penelitian diberbagai bidang. Peningkatan kualitastersebut merupakan bagian dari proses kemajuan seiring dengan dinamika masyarakat yang bergeraksangat cepat.

Oleh karena itu, saya melihat bahwa Seminar Nasional ini merupakan langkah nyata dalam upayameningkatkan kualitas para dosen dan peneliti kita untuk memberikan kontribusi kepada bangsa danmasyarakat. Bertemunya para ilmuwan yang berkecimpung dalam bidanga MIPA dari berbagaiperguruan tinggi dan institusi ilmiah di tanah air merupakan jembatan terjalinnya interaksi komunikasidan diseminasi ilmiah yg lebih baik.

Saya berharap, Seminar Nasional ini dapat menghasilkan pemikiran dan pemahaman rumusan nyatadalam pembangunan ilmu pengetahuan khususnya yang berkenaan dengan ilmu dasar MIPA.Disamping itu, dengan semangat kebersamaan antar para ilmuwan, kegiatan ini dapat menjadi saranauntuk menjalin kerjasama dalam upaya memberdayakan dan melestarikan potensi sumber daya alamIndonesia untuk pembangunan nasional berkelanjutan yang berwawsan lingkungan.

Saya ucapkan selamat melaksanakan Seminar Nasional ini kepada para peserta dari seluruh Indonesia.

Saya mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah mendukung suksesnya acara ini,

Terima Kasih,

Billahitaufik WalhidayyahWassalamu’alaikum wr. wr.

Rektor,Prof. Ganjar Kurnia


xiii


xiv

Sambutan Ketua Panitia Seminar Nasional MIPA 2014

Selamat Datang di SEMNAS MIPA 2014

Pada pagi yang cerah ini, izinkanlah saya mengucapkan selamat datang kepada semua peserta SeminarNasional MIPA 2014 di Gedung Rektorat Kampus Unpad Jatinangor. Dalam satu hari ini kita akanbersama-sama berbagi hasil-hasil penelitian di bidang MIPA yang terdiri atas Matematika, Kimia,Fisika, Biologi, Statistika, Geofisika dan Teknik informatika serta bidang ilmu terkait lainnya, denganharapan adanya komunikasi ilmiah antar peneliti dari berbagai universitas dan instansi ilmiah dapatmenigkatkan kualiatas dan kuantitas pendidikan dan dalam rangka pemanfaatan sumber daya alamuntk pembangunan berkelanjutan yang berwawasan lingkungan. Disamping itu, Seminar Nasioanl inidiharapkan juga dapat menjalin kerjasama antar peneliti bidang MIPA di seluruh Indonesia.

Seminar Nasional MIPA 2014 yang diselenggarakan oleh Fakultas MIPA Unpad sebagai rangkaianacara Dies MIPA Unpad ke 56 di kampus Unpad Jatinangor.

Kegiatan seminar ini diikuti oleh 154 pemakalah yang terdiri atas 4 pembicara tamu, 95 presentasi oraldan 55 presentasi poster yang berasal dari perguruan tinggi dan institusi penelitian di Indonesia. Selainitu, hari ini juga dilaksanakan hasil penelitian dan produk kreatifitas mahasiswa MIPA Unpad yanglolos pada kegiatan PIMNAS tahun 2014. Dalam kesempatan ini kami mengucapkan terima kasihkepada seluruh peserta dari seluruh Indonesia atas partisipasinya pada Seminar ini.

Ucapan terima kasih juga kami ucapkan kepada MIPAnet, Himpunan Matematika Indonesia,Himpunan Kimia Indonesia, Konsorsium Biologi Indonesia, Himpunan Fisika Indonesia, ForumPendidikan Tinggi Statistik Indonesia, dan juga kami sampaikan terima kasih kepada PURISKA yangtelah membantu kegiatan kami. Tentu saja kami sampaikan terima kasih yang tak terhingga kepadaseluruh rekan panitia Seminar Masioanl MIPA 2014 atas usaha kerja kerasnya dalam mensukseskanSeminar ini.

Terakhir, kami mengucapkan terima kasih kepada Rektor Universitas Padjadjaran atas fasilitas yangdiberikan serta berkenan untuk mendukung penuh Seminar Nasional ini.

Wassalamu’alaikum wr wbKetua Panitia Seminar Nasional MIPA 2014

Dr. Dikdik Kurnia, M.Sc


68

Konstruksi Dan Optmasi Gen Pretrombin-2 Manusia DalamEscherichia coli Untuk Produksi Trombin Sebagai Komponen

Lem Fibrin

Saronom Silaban1,2*, Iman Permana Maksum1, Shabarni Gaffar1, Sutarya Enus3,Khomaini Hasan4, Toto Subroto1 dan Soetijoso Soemitro1

Laboratorium Biokimia, Departemen Kimia, Universitas Padjadjaran, Bandung1

Jurusan Kimia, Universitas Negeri Medan, Medan 2

Pusat Mata Nasional, Rumah Sakit Mata Cicendo, Bandung 3

Pusat Penelitian Pangan, Kesehatan dan Obat, Institut Teknologi Bandung, Bandung4

*[email protected]

AbstrakLem fibrin merupakan biomaterial perekat yang menggunakan trombin, fibrinogen dan faktorXIII sebagai bahan utama. Bahan ini dapat diterapkan untuk mengganti teknik jahitan pascaoperasi. Dalam studi ini, kami mendesain dan mengkonstruksi gen prethrombin-2 (pt2) manusia,yang merupakan prekursor trombin. Gen pt2 difusikan dengan suatu tag pada posisi Nterminalnya, yang mengandung urutan pengode intein diikuti oleh domain pengikat kitin, yangbermanfaat untuk proses pemurnian. Proses pemotongan pt2 dari tag diinduksi melalui perubahanpH/ suhu. Kodon pt2 dirancang sesuai dengan kodon preferensi Escherichia coli. Gen pt2dirancang menggunakan software OPTIMIZER dengan penambahan dua sisi restriksi pada ujung5' dan 3' nya, yaitu berturut-turut BamHI dan XhoI, selanjutnya dikloning menggunakan vektorpMAT dalam E. coli. Selanjutnya fragmen pt2 diligasi ke vektor ekspresi pTWIN1 untuk E.coli.Hasil karakterisasi gen pt2 dalam pTWIN1 menggunakan metoda sequensing DNAmemperlihatkan bahwa gen pt2 hasil rancangan sudah berhasil dikloning. Dengan demikian, genpt2 hasil kloning ini dapat digunakan sebagai bahan awal untuk ekspresi PT2 dalam inang E. coli.

Kata Kunci: pretrombin-2, trombin, lem fibrin, kodon preferensi, Escherichia coli

1. PendahuluanMetode untuk menutup luka pasca operasi

menggunakan teknik jahitan, merupakanstandar emas yang umum digunakan. Walaupunmerupakan standar emas, teknik ini menimbulkanbeberapa permasalahan, seperti waktupenyembuhan luka berlangsung lama, prosespembedahan yang lebih panjang, trauma tambahan(pemasangan dan pencabutan benang),meningkatnya inflamasi, serta kemungkinantimbulnya komplikasi yang berhubungan denganjahitan berupa infeksi (Enus et al., 2011).

Lem Fibrin (LF) pengganti teknik jahitanmemiliki kemampuan untuk merekatkan danmenutup luka. LF sebagai bahan bioadesif, tersusunatas trombin, fibrinogen, kalsium dan faktor XIII.Bahan ini dirancang untuk menyerupai tahap akhirkoagulasi dengan membentuk bekuan fibrin. LFdigunakan sebagai bahan hemostatis yangmenghentikan pendarahan dari celah insisi, matriksuntuk penyembuhan luka dan perekat jaringan.(Spotnitz & Prabhu, 2005).

Meskipun luas penggunaannya, LF yang didapat secara komersial relatif mahal, sehingga tidakekonomis. LF komersial ini mengandung proteinplasma yang dimurnikan dari sumber darah lain,yang beresiko terjadinya kontaminasi patogensecara bersamaan dengan perawatan. Untukmembuat LF diperlukan sumber bahan yang lebihberlimpah dan lebih aman. Saat ini, trombin padaLF komersial biasanya terbuat dari plasma bekusegar sapi (Kaufman et al., 2003). LF komersialsebagai pengganti jahitan memberikan banyakkeuntungan, yaitu operasi lebih nyaman, lebih cepatdan dapat terhindar kerugian akibat jahitan (Koranjiet al., 2004). Sampai saat ini LF komersial untukoperasi mata belum tersedia di Indonesia, sehinggaharus diimpor dengan harga yang sangat mahal danperlu penyimpanan secara khusus. Permasalahanlain yang muncul adalah belum adanya izin khususdari Food and Drug Administration untukpemakaian LF komersial pada operasi mata, terkaittransmisi penyakit karena terbuat dari plasma donor(Enus et al., 2009).


69

Penggunaan yang luas dari E. coli sebagaiinang dalam produksi protein rekombinandisebabkan oleh karena sifatnnya yang dapattumbuh cepat dengan siklus hidup pendek,informasi dan karakter genom yang sudah lengkapsehingga mudah dimanipulasi, biaya produksirelatif murah, tingkat ekspresi protein target tinggi,cepat, dan teknologinya sudah mapan (Cabrita etal., 2006). Namun, dibalik keuntungan yangdisebutkan di atas, inang ini juga memilikikelemahan, seperti fenomena bias kodon (Sorensen& Mortensen, 2005), dan potensi menghasilkanprotein agregat kompleks tidak aktif yang lazimdikenal sebagai badan inklusi (Freydell et al.,2007).

Strategi pertama yang perlu dilakukan untukmengatasi kelemahan yang disebutkan di atasadalah dengan melakukan optimasi kodon gentarget terhadap preferensi kodon inang (Gustafssonet al., 2004). Strategi ini bertujuan untuk mengatasirendahnya ekspresi protein dari gen target. Prosesoptimasi ini dilakukan dengan cara merubah kodonpengkode asam amino tertentu yang berasal darisumber lain menjadi kodon dengan frekuensi tinggidi inang ekspresi. Tingkat ekspresi gen yangmengandung kodon hasil optimasi lebih tinggidaripada gen yang mengandung kodon tidakteroptimasi (Wang et al., 2010). Hasil ekspresi genmeningkat setidaknya tiga kali lipat denganoptimasi kodon (Zhou et al., 2004). Strategi keduaadalah memanfaatkan teknologi gen sintetikberdasarkan kemampuan mengubah bias kodon darigen target menjadi cocok dengan kodon preferensiinang rekombinan (Graslund et al., 2008).Keuntungan lain dari teknologi ini adalahefektifitas dan efisiensi yang tinggi dibandingkandengan proses isolasi sendiri, serta terhindar daritransmisi penyakit dan reaksi alergi (Hughes et al.,2011).

2. MetodePenelitian ini menggunakan metode kualitatif,

bersifat eksperimen laboratorium.

2.1 Galur, vektor, bahan kimia, mediaE. coli TOP10F’ adalah galur inang untuk

kloning dan peremajaan plasmid. pMATmerupakan vektor kloning komersial. Galurditumbuhan dalam media Luria Bertani (LB)dengan komposisi (tripton 1%, yeast extract 0,5%,dan natrium klorida 1%) yang disuplemen denganantibiotik tetrasiklin (100 µg/mL), dan ampisilin(100 µg/mL). Untuk media padat, komponen mediaLB ditambahkan dengan 2% agar. Semua enzimrestriksi dan T4-DNA ligase diperoleh secarakomersial dari Fermentas (Canada). Vektorekspresi pTWIN1 diperoleh secara komersial dari

New England Biolabs, NEB. Gen pt2 sintetik(CBD-intein Ssp DnaB-pt2) disintesis oleh GeneArtAG (Jerman).

2.2 Desain dan optimasi kodon gen pt2Gen pt2 sintetik dirancang berdasarkan urutan

asam amino yang termuat dalam GenBank(Accession number: NM_000506.3). Kodonpreferensi E. coli yang digunakan termuat dalamCodon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/). Optimasi kodon dilakukan denganmenggunakan perangkat lunak Optimizer(http://gnomes.urv.es/OPTIMIZER) dan GraphicalCodon Usage Analyzer (GCUA) (http://gcua.schoedl.de/).

2.3 Konstruksi fusi pt2 dan vektor pTWIN1Ekspresi PT2 dalam E. coli dan pemurniannya

menggunakan sistem IMPACT-TWIN.

Perancangan gen pt2 sintetik ini dilengkapi dengansisi restriksi BamHI dan XhoI pada intein denganperubahan pH/suhu. Untuk menggabungkan pt2sintetik dengan vektor ekspresi pTWIN1, makapMAT-pt2 terlebih dahulu dipotong menggunakanenzim restriksi BamHI dan XhoI. Secara paralel,dilakukan juga pemotongan pTWIN1 dengan enzimrestriksi yang sama. Selanjutnya fragmen pt2disambungkan ke pTWIN1 menggunakan T4 DNAligase hingga menghasilkan plasmid pTWIN1-pt2.

2.4 Transformasi pTWIN1-pt2 ke dalam selkompeten E. coli TOP10F’Transformasi pTWIN1-pt2 ke sel kompeten E.

coli TOP10F’ dengan menggunakan metodekejutan panas (heat shock) (Sambrook et al., 1989).Koloni transforman E. coli diseleksi melalui mediaagar yang mengandung antibiotik tetrasiklin danampisilin untuk transforman yang mengandungpTWIN1-pt2. Plasmid rekombinan, pTWIN1-pt2diisolasi dari koloni transforman E. coli TOP10F’menggunakan QIAgen Spin Plasmid Miniprep TestKit sesuai dengan protokol dari Qiagen. Plasmidrekombinan hasil pemurnian, dianalisis denganelektroforesis gel agarosa 1%. Selanjutnya plasmidtersebut digunakan untuk analisis restriksi danditentukan urutan nukleotidanya menggunakanmetode sekuensing DNA. Hasil sekuensingdisejajarkan menggunakan Seqman pada programBioedit.

3. Hasil dan Pembahasan3.1 Optimasi Kodon Gen pretrombin-2

Perancangan gen pt2 manusia sintetik telahdilakukan melalui perangkat lunak. pt2 sintetikdirancang berdasarkan urutan asam amino yangtermuat dalam GenBank (Accession number:NM_000506.3) dan penggunaan kodon preferensi


70

E. coli yang termuat dalam Codon UsageDatabase. Berdasarkan data GenBank, bahwa genpt2 manusia terdiri dari 307 asam amino.

Hasil analisis urutan kodon pt2 manusia padaE. coli menunjukkan, adanya kodon yang tidaksesuai kodon preferensi E. coli. Beberapa kodonpt2 manusia pengkode asam amino yang memilikikesesuaian kurang dari 50% dengan preferensikodon E. coli antara lain: (1) S: agt, tcg, tcc, tca, (2)E: gag, (3) T: act, aca, (4) G: gga, ggg, (5) R: agg,aga, cga, cgg, (6) P: cct, ccc, (7) K: aag, (8) L: ctc,ctt, ttg, (9) V: gtc, (10) Q: caa. Sedangkan kodonpt2 manusia yang memiliki kesesuaian relatif lebihdari 50% hingga mendekati 100% terdiri dari: (1)A: gcc, gca, gct, (2) Y: tac, (3) F: ttc, (4) N: aat, (5)D: gac, (6) C: tgt, (7) I: atc, ata, (8) H: cac, (9) V:gtt, (10) T: acg, dan (11) G: ggt. Kodon-kodon pt2manusia yang belum mencapai kesesuaian relatif100% dengan preferensi kodon E. coli dioptimasihingga mencapai 100%.

Penggunaan gen sintetik dapat mem-permudahdan mempercepat perolehan gen yang diinginkankarena tidak terbatas pada sumber biologis alami(Gustafsson et al., 2004). Selain itu, data dariGenBank juga dapat diakses dengan mudah sebagaidasar penentuan urutan gen yang akan disintesis.Optimasi kodon dilakukan karena banyak gentarget memiliki potensi kodon preferensi yangberbeda dengan genom inang. Walaupun, beberapagen target memiliki kesesuaian yang cukup dengangenom inang, sehingga tidak perlu dilakukanoptimasi kodon. Dalam penelitian ini, gen pt2manusia yang akan diekspresikan dalam inang E.coli, pilihan kodon pt2 manusia memiliki kodonpreferensi yang rendah dengan E. coli (Welch etal., 2009). Penelitian sebelumnya menunjukkanbahwa gen pt2 manusia yang diekspresikan dalamE. coli akan menghasilkan badan inklusi (Soejimaet al., 2001). Oleh sebab itu, optimasi kodonorganisme asal terhadap preferensi kodon inangdiperlukan.

3.2 Konstruksi Plasmid RekombinanStruktur pTWIN1-pt2 terdapat pada Gambar 1.

pTWIN1 memiliki gen pengode domain pengikatkitin yang dapat berikatan dengan kitin padamatriks pemurnian (Chong et al., 1998). Dalampenelitian ini pt2 manusia dikonstruksi dalambentuk fusi pada bagian N-terminal (CBD-inteinSsp DnaB-pt2. Pada ujung keduanya disisipkan sisipemotongan BamHI (GGATCC) pada ujung 5’ danXhoI (CTCGAG) pada ujung 3’ agar gen pt2 dapatdigabung dengan pTWIN1. Rancangan keseluruhangen pt2 sintetik untuk CBD-intein-pt2pH sebagaiberikut.

Penyisipan gen pt2 manusia sintetik padapTWIN1 dilakukan pada bagian intein Ssp DnaB.Untuk memungkinkan proses ekspresi protein, padaujung 3’ pt2 ditambahkan stop codon (TAA)sebelum sisi restriksi BamHI agar intein Mxe GyrAtidak ikut terekspresi karena akan menambahukuran protein yang dihasilkan. Start codon tidakditambahkan sebab sudah tercakup dalam CBD-intein SspDnaB dalam pTWIN1.

Gambar 1.Konstruksi pTWIN1-pt2 dengan sisi pemotongannya

3.3 Kloning Gen Pretrombin-2ManusiaUntuk mendapatkan fragmen pt2, plasmid

pMAT-pt2 dipotong menggunakan dan BamHIXhoI sesuai rancangan gen sintetik sebelumnya.Hasil pemotongan pMAT-pt2 dikarakterisasimenggunakan elektroforesis gel agarose 1%. Hasilanalisis menunjukkan bahwa fragmen pt2 berhasildilepaskan dari vektor pMAT. Pita pertamamenunjukkan fragmen pt2 dengan bobot molekul939 pb, dan pita vektor pMAT dengan bobotmolekul 2374 pb (Gambar 2).

Gambar 2. Elektroforesis hasil restriksi plasmid pMAT-pt2(3313 pb) dengan enzim BamHI dan XhoI. M: Marker 1 kbDNA, pMAT dengan berat molekul 2374 pb, pt2 dengan beratmolekul 939 pb.

Dengan menggunakan enzim restriksi yangsama, pTWIN1 dipotong dan kemudian diisolasiuntuk proses ligasi pt2. Gambar 3 menunjukkan


71

bahwa vektor ekspresi pTWIN1 berhasil dipotong.Terdapat dua pita dengan bobot molekul 6536 pbsebagai vektor pTWIN1, dan pita dengan bobotmolekul 839 pb sebagai fragmen Multi Cloning Site(MCS) yang terlepas dari vektor pTWIN1 (Gambar3).

Gambar 3. Elektroforesis hasil restriksi vektor pTWIN1 (7375pb) dengan enzim BamHI dan XhoI. M: Marker 1 kb DNA,pTWIN1 setelah dipotong dengan berat molekul 6536 pb,Fragmen MCS dengan berat molekul 839 pb.

Fragmen pt2 diligasikan terhadap vektorekspresi pTWIN1 menggunakan T4 DNA ligase(Fermentas), selanjutnya, hasil ligasi diisolasi dandimurnikan dengan kit isolasi DNA (Roche). Hasilpemurnian dikarakterisasi dengan elektroforesis gelagarosa 1%. Seperti yang terlihat pada Gambar 4,Hasil elektroforesis gel agarosa menunjukkanbahwa fragmen pt2 (939 pb) dan vektor pTWIN1

(6536 pb) berhasil diisolasi dan dimurnikan darigel.

Gambar 4. Elektroforesis hasil pemurnian pTWIN1-pt2 (7475pb) dari gel yang direstriksi dengan dua enzim BamHI dan XhoI.M: Marker 1 kb DNA, pTWIN1 dengan berat molekul 6536 pb,pt2 dengan berat molekul 939 pb.

3.4 Karakterisasi hasil kloning dengan DNAsequensingUntuk mengkonfirmasi keberhasilan hasil

ligasi, dan memastikan kesesuaian urutannukleotida gen pt2 hasil ligasi dengan hasilrancangan optimasi, sebanyak 10 µL plasmidpTWIN1-pt2 dengan konsentrasi 100 ng/µLditentukan urutan nukleotidanya dengan DNAsequencer oleh MacroGene (Korea). Perbandinganurutan nukleotida pt2 hasil optimasi dengan pt2hasil kloning disajikan dalam Gambar 5.

Gambar 5. Hasil sekuencing. Perbandingan urutan DNA gen pt2 hasil rancangan ( ) dengan hasil kloning ( ).

4. KesimpulanOptimasi kodon gen pt2 sesuai kodon

preferensi E. coli dapat meminimalkan efek biaskodon, yang selanjuntnya berpengaruh padaekspresi protein. Penggunaan gen sintetik lebihefisien dan efektif dibanding proses isolasi darisumber alami.

Ucapan Terima KasihPenulis mengucapkan terimakasih kepada

DP2M dikti (atas nama: Iman Permana Maksum)atas bantuan dana penelitian melalui programPenelitian Unggulan Strategis Nasional (PUSNAS).Ucapan yang sama juga disampaikan kepadaDirektorat Jenderal Pendidikan Tinggi,

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

---------CTCGAGACCGCGACCAGCGAATATCAGACCTTTTTTAACCCGCGCACCTTTGGCAGCGGCGAAGCGGATTGCGGCCTGCGCCCGCTGTTTG 91

CGCGAATTCCTCGAGACCGCGACCAGCGAATATCAGACCTTTTTTAACCCGCGCACCTTTGGCAGCGGCGAAGCGGATTGCGGCCTGCGCCCGCTGTTTG 200

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

AAAAAAAAAGCCTGGAAGATAAAACCGAACGCGAACTGCTGGAAAGCTATATTGATGGCCGCATTGTGGAAGGCAGCGATGCGGAAATTGGCATGAGCCC 191

AAAAAAAAAGCCTGGAAGATAAAACCGAACGCGAACTGCTGGAAAGCTATATTGATGGCCGCATTGTGGAAGGCAGCGATGCGGAAATTGGCATGAGCCC 300

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

GTGGCAGGTGATGCTGTTTCGCAAAAGCCCGCAGGAACTGCTGTGCGGCGCGAGCCTGATTAGCGATCGCTGGGTGCTGACCGCGGCGCATTGCCTGCTG 291

GTGGCAGGTGATGCTGTTTCGCAAAAGCCCGCAGGAACTGCTGTGCGGCGCGAGCCTGATTAGCGATCGCTGGGTGCTGACCGCGGCGCATTGCCTGCTG 400410 420 430 440 450 460 470 480 490 500

. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

TATCCGCCGTGGGATAAAAACTTTACCGAAAACGATCTGCTGGTGCGCATTGGCAAACATAGCCGCACCCGCTATGAACGCAACATTGAAAAAATTAGCA 391

TATCCGCCGTGGGATAAAAACTTTACCGAAAACGATCTGCTGGTGCGCATTGGCAAACATAGCCGCACCCGCTATGAACGCAACATTGAAAAAATTAGCA 500

510 520 530 540 550 560 570 580 590 600. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

TGCTGGAAAAAATTTATATTCATCCGCGCTATAACTGGCGCGAAAACCTGGATCGCGATATTGCGCTGATGAAACTGAAAAAACCGGTGGCGTTTAGCGA 491

TGCTGGAAAAAATTTATATTCATCCGCGCTATAACTGGCGCGAAAACCTGGATCGCGATATTGCGCTGATGAAACTGAAAAAACCGGTGGCGTTTAGCGA 600

TGCTGGAAAAAATTTATATTCATCCGCGCTATAACTGGCGCGAAAACCTGGATCGCGATATTGCGCTGATGAAACTGAAAAAACCGGTGGCGTTTAGCGA 600610 620 630 640 650 660 670 680 690 700

. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

TTATATTCATCCGGTGTGCCTGCCGGATCGCGAAACCGCGGCGAGCCTGCTGCAGGCGGGCTATAAAGGCCGCGTGACCGGCTGGGGCAACCTGAAAGAA 591

TTATATTCATCCGGTGTGCCTGCCGGATCGCGAAACCGCGGCGAGCCTGCTGCAGGCGGGCTATAAAGGCCGCGTGACCGGCTGGGGCAACCTGAAAGAA 700

710 720 730 740 750 760 770 780 790 800. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

ACCTGGACCGCGAACGTGGGCAAAGGCCAGCCGAGCGTGCTGCAGGTGGTGAACCTGCCGATTGTGGAACGCCCGGTGTGCAAAGATAGCACCCGCATTC 691

ACCTGGACCGCGAACGTGGGCAAAGGCCAGCCGAGCGTGCTGCAGGTGGTGAACCTGCCGATTGTGGAACGCCCGGTGTGCAAAGATAGCACCCGCATTC 800

ACCTGGACCGCGAACGTGGGCAAAGGCCAGCCGAGCGTGCTGCAGGTGGTGAACCTGCCGATTGTGGAACGCCCGGTGTGCAAAGATAGCACCCGCATTC 800810 820 830 840 850 860 870 880 890 900

. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

GCATTACCGATAACATGTTTTGCGCGGGCTATAAACCGGATGAAGGCAAACGCGGCGATGCGTGCGAAGGCGATAGCGGCGGCCCGTTTGTGATGAAAAG 791

GCATTACCGATAACATGTTTTGCGCGGGCTATAAACCGGATGAAGGCAAACGCGGCGATGCGTGCGAAGGCGATAGCGGCGGCCCGTTTGTGATGAAAAG 900

910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

CCCGTTTAACAACCGCTGGTATCAGATGGGCATTGTGAGCTGGGGCGAAGGCTGCGATCGCGATGGCAAATATGGCTTTTATACCCATGTGTTTCGCCTG 891

CCCGTTTAACAACCGCTGGTATCAGATGGGCATTGTGAGCTGGGGCGAAGGCTGCGATCGCGATGGCAAATATGGCTTTTATACCCATGTGTTTCGCCTG 1000

CCCGTTTAACAACCGCTGGTATCAGATGGGCATTGTGAGCTGGGGCGAAGGCTGCAATCCCGATGGCAAATATGGCTTTTATACCCATGTGTTTCACCTG 10001010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

AAAAAATGGATTCAGAAAGTGATTGATCAGTTTGGCGAATAAGGATCC---------------------------------------------------- 939

AAAAAATGGATTCAGAAAGTGATTGATCAGTTTGGCGAATAAGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCG-AAAGGAAGCTGAATT-GGCTGCTGCCACCGCTG 1098

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1

GGCGAACGGGAGTCGAGAGGTTTTTGATTTGACTGTGCCAGGACCACATAACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGGAAGAGCCATGGGCGGC 100

GGCGATAAGGGATCAAGAGGGTTTTGATTTGACTGTGCCAGGACCACATAACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGGAAGAGCCATGGGCGGC 100


72

Kementerian Pendidikan Nasional, RepublikIndonesia atas BPPS Program Doktoral.

Daftar PustakaCabrita, L.D., Weiwen, D., and Stephen, P.B,

(2006). A family of Escherichia coli expressionvectors for laboratory scale and highthroughput soluble protein production. BMCBiotechnol 6:12.

Chong, S., Montello, G.E., Zhang, A., Cantor, E.J.,Liao, W., Xu, M.Q., and Benner, J, (1998).Utilizing the C-terminal cleavage activity of aprotein splicing element to purify recombinantproteins in a single chromatographic step.Nucleic Acids Research 26:5109-5115.

Enus, S., Dalimoenthe, N.Z., dan Kartiwa, A.,(2009). Teknik lem fibrin otologus padacangkok konjungtiva bulbi mata kelinci. MKB41:169-173.

Enus, S., Natadisastra, G., Shahib, M.N., danSulaeman, R, (2011). Peran lem fibrinotologus pada penempelan tandur konjungtivabulbi mata kelinci terhadap ekspresi genfibronektin dan integrin. MKB 43:183-188.

Freydell, E.J., Ottens, M., Eppink, M., van Dedam,G., and van der Wielen, L, (2007). Efficientsolubilization of inclusion bodies. J Biotechnol2:678-684.

Gustafsson, C., Govindrajan, S., and Minshull, J.(2004). Codon bias and heterologous proteinexpression. Trends in Biotechnol 22:346-353.

Graslund, S., Nordlund, P., Weigelt, J., Hallberg,B.M., Bray, J., Gileadi, O., et al. (2008).Protein production and purification. NatureMethods 5:135-146.

Hughes, R.A., Miklos, A.E., and Ellington, A.D,(2011). Gene synthesis: methods andapplications. Methods in Enzimology 498: 277-309.

Kaufman, H.E., Insler, M.S., Ibrahim-Elzembly,H.A., and Kaufman, S.C, (2003). Human fibrin

tissue e adhesives for suturless lamellarkeratoplasty and scleral patch adhesion.Ophthalmology 110:2168-2172.

Koranji, G., Seregard, S., and Kopp, E.D, (2004).Cut and paste: a no suture, small incisionapproach to pterygium surgery. Br JOphthalmol 88:911-914.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T,(1989). Molecular cloning: a laboratorymanual, 2nd ed. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York.

Soejima, K., Mimura, N., Yonemura, H., Nakatake,H., Imamura, T., and Nozaki, C, (2001). Anefficient refolding method for the preparationof recombinant human prethrombin-2 andcharacterization of the recombinant-derived α-thrombin. J Biochem 130:269-277.

Sorensen, S.P, and Mortensen, K.K, (2005).Advanced genetic strategies for recombinantprotein expression in Escherichia coli. JBiotechnol 115:113-128.

Spotnitz, W.D., and Prabhu, R, (2005). Fibrinsealant tissue adhesive--review and update. JLong Term Eff Med 15: 245.

Uy, H.S., Reyes, J M., Flores, J.D, and Siong,R.L.B, (2005). Comparison of fibrin glue andsutures for attaching conjungtival autograftsafter pterygium excision. Ophthalmology112:667-671.

Wang, X., Li, X., Zhang, Z., Shen, X., and Zhong,F, (2010). Codon optimization enhancessecretory expression of Pseudomonasaeruginosa exotoxin A in E. coli. Protein Expr.Purif 72:101-106.

Zhou, Z., Schnake, P., Xiao, L., and Lal, A.A,(2004). Enhanced expression of a recombinantmalaria candidate vaccine in Escherichia coliby codon optimization. Protein Expr. Purif34:87-94.


146

Sub-Kloning Gen -amilase Saccharomyces fibuligera (Sfamy)

Dalam Inang Escherichia coli

Shabarni Gaffar, Siti Rohanah, Toto Subroto dan Soetijoso Soemitro

Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, UnpadJl. Raya Bandung-Sumedang Km 21, Jatinangor, Sumedang

[email protected]

Abstrak-Amilase (1,4--D-glukan-4-glukanohidrolase [EC. 3.2.1.1] menghidrolisis ikatan glikosidapada pati untuk menghasilkan dekstrin dan oligosakarida yang lebih kecil. Luasnya aplikasi -amilase dibidang industri menyebabkan enzim ini harus diproduksi secara rekombinan.Escherichia coli merupakan inang yang sudah umum digunakan untuk produksi proteinrekombinan karena memiliki beberapa kelebihan seperti tingkat produksinya tinggi, dan mediapertumbuhannya murah. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan sub-kloning gen pengode -amilase Saccharomycopsis fibuligera R64 (Sfamy) menggunakan vektor kloning pJET1.2. Sfamyrekombinan selanjutnya akan digunakan untuk mengekspresikan -amilase dalam E. coli. Sfamydiamplifikasi menggunakan metoda PCR dengan penambahan sisi enzim restriksi Sap1 padaujung 5' dan EcoR1 pada ujung 3'. Selanjutnya, fragmen Sfamy diligasi ke sisi restriksi yangsama pada vektor pJET1.2 menghasilkan plasmid rekombinan pJET1.2-Sfamy, dan di sub-kloningke E. coli galur Top10F’. Plasmid rekombinan dikarakterisasi dengan analisis restriksi danpenentuan urutan DNA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Sfamy dengan ukuran 1422 pb telahberhasil diamplifikasi dengan metoda PCR dan telah berhasil diligasikan ke vektor pJET1.2 dansub-kloning dalam E. coli TOP10F’. Hasil analisis restriksi dan penentuan urutan DNAmemperlihatkan bahwa urutan Sfamy rekombinan memiliki homologi 100% dengan Sfamy S.

fibuligera R64 dengan nomor akses HQ172905 di Genebank. Gen Sfamy rekombinan yangdihasilkan dari penelitian ini dapat digunakan untuk ekspresi Sfamy di E. coli.

Kata Kunci: Sfamy, sub-kloning, vektor pJET1.2.

1. Pendahuluanα-Amilase (1,4-α-D-glukan glukanohidrolase

[EC 3.2.1.1]) adalah enzim yang mengkatalisishidrolisis pati atau oligosakarida lain yang memilikiikatan 1,4-α-glikosida yang menghasilkan produkberupa dekstrin, maltosa atau glukosa (Hashida &Bisgaard-Frantzen, 2000; Itoh et al., 1987). α-Amilase merupakan satu dari tiga jenis enzimamilolitik yang paling dikenal bersama β-amilasedan glukoamilase, yang berperan sangat pentingdalam dunia bioteknologi (Hostinova, 2002; Vander Maarel et al., 2002). Enzim ini berpotensi untukdiaplikasikan pada bidang klinis, analitis dan medis(Pandey et al., 2000). Selain itu, enzim ini jugasudah diaplikasikan pada industri seperti industrideterjen, pengolahan pati, bahan bakar, makanan,tekstil, kertas dan alkohol (Kirk et al., 2002).

Menurut Cowan (1996), sebagian besar (sekitar45%) enzim yang telah digunakan diindustrimerupakan hasil rekayasa, baik rekayasa pada

tingkat genetik maupun protein. Enzim rekombinandihasilkan melalui proses kloning, yaitu denganmemindahkan gen pengode enzim tertentu ke suatuinang (host), dengan harapan diperolehnyapeningkatan produksi. Karena jumlah enzim yangdiekspresikan oleh mikroba asalnya biasanya lebihrendah dibandingkan dengan enzim rekombinan(Gogoi et al., 1987).

E. coli sudah sering digunakan untuk produksiprotein rekombinan, karena tingkat produksinyayang tinggi, media pertumbuhannya murahsehingga memudahkan dilakukan peningkatan skalaproduksi untuk industri. Sistem ekspresi E. colicocok digunakan untuk ekspresi protein yang tidakmemiliki modifikasi pascatranslasi ataupun proteinyang diinginkan tidak mengalami modifikasipascatranslasi (Fukusumi et al., 1988). Beberapaprotein telah berhasil diekspresikan menggunakansistem ekspresi E. coli diantaranya, α-amilasePyrococcus fusarius (Laderman et al., 1993), α-


147

amilase Streptococcus bovis 148 (Satoh et al.,1993) dan proteinase serin dari Bacillus spp(Maciver et al., 1994).

-Amilase S. fibuligera R64 dapatmendegradasi pati mentah, sehingga berpotensiuntuk digunakan dalam industri (Hasan et al.,2008). Tujuan jangka panjang penelitian ini adalahekspresi α-amilase S. fibuligera R64 (Sfamy)menggunakan sistem ekspresi E. coli. Sistemekspresi E. coli dipilih dengan harapandiperolehnya tingkat ekspresi yang tinggi dan tidakterjadi glikosilasi sehingga dapat digunakan untukpenentuan struktur Sfamy. Glikosilasi merupakansalah satu modifikasi pasca tanslasi, yaitupenambahan beberapa residu oligosakarida padaprotein. Tambahan residu oligosakarida ini dapatmengganggu penentuan struktur protein.

Salah satu tahap yang dilakukan pada ekspresiprotein adalah konstruksi vektor ekspresi yangmembawa gen yang akan diekspresikan. Konstruksivektor ekspresi biasanya meliputi tahapanamplifikasi gen yang akan dikloning denganpenambahan sisi restriksi yang cocok dengan yangterdapat pada vektor ekspresi, subkloning untukmemperbanyak gen yang akan diekspresikan sertapenggabungan gen yang akan diekspresikan kevektor ekspresi.

Berdasarkan latar belakang tersebut, penelitianini bermaksud untuk mengamplifikasi danmensubkloning gen Sfamy S. fibuligera R64 yangselanjutnya akan digunakan untuk ekspresi α-amilase S. fibuligera R64 dalam inang E. coli.

2. Bahan dan Metoda2.1 Bahan

Galur yang digunakan pada penelitian iniadalah Escherichia coli TOP10F’ (Invitrogen) yangdigunakan sebagai inang untuk kloning. TemplatPCR menggunakan pGemT-Sfamy (Gaffar, 2011).Vektor yang digunakan adalah pJET1.2(Fermentas). Enzim EcoR1 dan Sap1, Taq DNApolymerase, dan T4 DNA ligase dari Fermentas.Primer disintesis oleh First Base Singaporeberdasarkan urutan Sfamy (Gaffar, 2011) denganpenambahan sisi restriksi pada ujung 5' dan 3' nya.Primer 5'Sfamy-SapI (5'-GAGGAAACGGAAGA-GCTGTGACTCTATTCAAAAGAG-3') dan prim-er 3'Sfamy-EcoRI (5'-GAGGAGAATTCTCATG-AACAAATGTCAGAAG-3') dengan urutan yangdigaris bawahi merupakan urutan sisi pengenalanenzim restriksi. Kit isolasi DNA GeneJET PlasmidMiniprep Kit dari Fermentas. Marker DNA 1 kbdari Fermentas. Media pertumbuhan, E. coliTOP10F’ dari Pronadisa dan Oxoid. Reagen reagenlain yang umum digunakan pada laboratoriumbiologi mulekul dari Sigma Aldrich dan Merck.

2.2 MetodeAmplifikasi gen Sfamy dengan PCR

Amplifikasi gen Sfamy dilakukan denganmetoda PCR dalam 50 μL campuran reaksi yangmengandung 20 μM masing-masing primer maju5'Sfamy-SapI dan primer balik 3'Sfamy-EcoRI,1,25 unit enzim Taq DNA polimerase, 5 μL bufferPCR 10x (10 mM Tris HCl pH 8,3; 50 mM KCl;0,01 % gelatin), 2,5 mM MgCl2, 10 mM dNTP dan50 ng DNA plasmid pGem-Sfamy. Proses PCRdilakukan dalam mesin Mastercycler® 5330(Eppendorf) sebanyak 30 siklus, dengan masing-masing siklus terdiri dari tahap-tahap denaturasitemplat pada suhu 95C selama 1 menit, tahappenempelan primer (annealing) pada suhu 50Cselama 1 menit, dan tahap pemanjangan primerpada suhu 72C selama 1 menit. Hasil PCRdianalisis dengan elektroforesis gel agaros 1%(b/v).

Ligasi fragmen Sfamy dengan vektor pJET1.2.Reaksi ligasi dilakukan dengan perbandingan

molar antara vektor pJET 1.2 dan fragmen Sfamy1:1. Campuran reaksi ligasi terdiri dari 10 μl bufferLigasi 2x , 1 μl Sfamy hasil PCR, 1 μl (0,05 pmol)vektor pJET1.2, 1 uL blunting enzyme, air bebasnuklease hingga 19 μl; dan 1 μl enzim T4 DNAligase. Volume total reaksi ligasi adalah 20 μL.Campuran kemudian divortex dan dispin selama 3-5 detik. Campuran diinkubasi pada suhu 22Cselama 5 menit.

Transformasi E. coli TOP10F’ menggunakanplasmid pJET1.2-Sfamy.

Pembuatan sel kompeten E. coli TOP10F’.Koloni tunggal E. coli TOP10F’ ditumbuhkandalam 6 mL media LB cair yang telah mengadungantibiotik tetrasiklin 6 μL (15 μg/mL) pada suhu37C selama 16-18 jam dengan pengocokan 150rpm. Sejumlah sel (sekitar 250 μL) diinokulasikanke dalam 20 mL media cair LB baru, kemudiandiinkubasi pada suhu 37C dengan kecepatan 150rpm hingga OD600 mencapai 0,2-0,4. Sel kemudiandipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifugasiyang jumlahnya disesuaikan dengan jumlah sampelyang akan ditransformasi. Kemudian disentrifugasidengan kecepatan 5.000 rpm, 4C, selama 5 menit.Pelet sel yang didapatkan kemudian diresuspensidengan 1 mL larutan kalsium klorida 0,1 M dingin.Setelah diinkubasi di dalam es selama 10 menit,campuran disentrifugasi selama 10 menit dengankecepatan 5000 rpm pada suhu 4C. Pelet sel yangdiperoleh diresuspensi kembali dalam 300 μLkalsium klorida dingin, kemudian disimpan padasuhu 4C selama 2-24 jam sebelum digunakanuntuk ditransformasi.


148

Transformasi E. coli TOP10F’ menggunakanplasmid pJET1.2-Sfamy. Sejumlah 5 μL DNA hasilligasi pJET1.2-Sfamy) ditambahkan ke dalamtabung mikrosentrifugasi yang berisi 50 μL selkompeten. Campuran diinkubasi selama 30 menitpada suhu 4C, kemudian dilakukan heat shockpada suhu 42C selama 90 detik. Kemudian segeradidinginkan di dalam es selama 10 menit. Ke dalamcampuran ini kemudian ditambahkan 950 μLmedia LB cair dan diinkubasi pada suhu 37Cselama 2 jam dengan laju pengocokan 150 rpm.Kemudian disentrifugasi pada 12000 rpm selama30 detik. Sebanyak 900 μL supernatan dibuang,pelet sel diresuspensi dengan sisa supernatan dankemudian 50 μL sel ditumbuhkan pada media LBpadat yang telah mengandung tetrasiklin 15 μg/mLdan ampisilin 100 μg/mL, kemudian diinkubasipada suhu 37C selama 16-18 jam.

Karakterisasi plasmid rekombinan melaluianalisis restriksi

Koloni transforman E. coli yang tumbuhberwarna putih dikarakterisasi melalui isolasiplasmid rekombinan menggunakan kit GeneJETPlasmid Miniprep Kit (Fermentas) mengikutiprosedur, hasil isolasi plasmid dikarakterisasidengan elektroforesis agarose 1%. Sebanyak 10 uLplasmid pJET1.2-Sfamy hasil isolasi ditambahkan 2uL buffer EcoRI 10x, 1 uL enzim EcoRI (10U/mL), dan air bebas nuklease hingga volume totalreaksi 20 uL. Kemudian diinkubasi pada suhu 37Cselama 2 jam. Setelah itu dikarakterisasi denganelektroforesis gel agarosa 1% (b/v).

Penentuan urutan nukleotida pJET1.2-SfamyUrutan nukleotida gen Sfamy hasil kloning

dalam E. coli TOP10F’ ditentukan dengan metodeDideoksi Sanger (Dye Terminator) di First Base,Singapore. Penentuan urutan nukleotida dilakukanmenggunakan pasangan primer pJET-for dan pJET-ref (primer universal untuk vektor pJET1.2). Hasilsekuensing di jajarkan menggunakan programSeqman pada program DNAStar.

3. Hasil dan Pembahasan3.1 Amplifikasi fragmen Sfamy dengan PCR

Pita yang terlihat pada lajur 2 gambar 3.1menunjukkan bahwa gen Sfamy telah berhasildiamplifikasi dengan metoda PCR dengan ukuran1422 pb. Fragmen DNA hasil PCR ini mengandungtambahan urutan pengenal enzim SapI pada ujung5' dan EcoRI pada ujung3'. Adanya sisi pengenalanenzim ini berguna untuk menyisipkan gen Sfamy kedalam vektor ekspresi pTYB21 yang akandigunakan untuk ekspresi α-amilase di E. coli. Sisirestriksi EcoRI dan SapI dipilih karena tidak

memotong Sfamy sehingga akan memudahkankarakterisasi plasmid rekombinan.

Gambar 3.1 Hasil amplifikasi Sfamy dengan metodaPCR. (lajur 1) marker 1 kb, (lajur 2) amplikon Sfamy.

3.2 Subkloning Sfamy dalam E. coli TOP10F’Ligasi fragmen Sfamy dengan pJET1.2

dilakukan menggunakan enzim T4 DNA ligase(Fermentas). Perbandingan mol antara vektor danfragmen Sfamy pada penelitian ini adalah 1:1(pJET1.2:fragmen Sfamy). Perbandingan mol inidigunakan untuk hasil PCR yang tidak dimurnikanmengikuti sticky-end cloning protocol (Fermentas).Amplikon Sfamy memiliki basa adenin pada ujung3', sehingga dilakukan prosedur penghilangan basaadenin pada ujung 3' melalui inkubasi pada T=70Cselama 5 menit sehingga fragmen Sfamy menjadiblunt-end.

Plasmid rekombinan hasil ligasi (pJET1.2-Sfamy) digunakan untuk mentransformasi E. coliTOP10F’. Transforman E. coli [pJET1.2-Sfamy]ditumbuhkan pada media LB padat yangmengandung antibiotik tetrasiklin dan ampisilinuntuk menyeleksi transforman. Setelah diinkubasiselama semalam, diperoleh sejumlah kolonitransforman E. coli [pJET1.2-Sfamy]. Kolonitransforman yang tumbuh semuanya merupakankoloni yang berwarna putih (data tidakdiperlihatkan). Vektor pJET1.2 memiliki genEco47IR yang mengekspresikan enzimendonuklease Eco47I yang bersifat mematikanuntuk seluruh strain E. coli yang tidak mengandungplasmid rekombinan. Adanya DNA sisipanmenyebabkan gen eco47IR terpotong sehinggaenzim Eco47I rusak, sehingga semua koloni yangtumbuh merupakan koloni rekombinan.

Penambahan antibiotik bertujuan untuk seleksikoloni transforman. Transforman E. coli TOP10F’yang telah mengandung plasmid rekombinanpJET1.2-Sfamy akan resisten terhadap antibiotikampisilin karena vektor pJET1.2 membawa genpengode resistensi ampisilin. Antibiotik tetrasiklinditambahkan ke dalam media karena E. coliTOP10F’ resisten terhadap tetrasiklin. Dengan


149

demikian, hanya E. coli yang mengandung plasmidrekombinan yang akan tumbuh pada mediapertumbuhan LB padat.

Setiap koloni tunggal transforman E. coliTOP10F’ [pJET1.2-Sfamy] diremajakan dengancara direplika dan ditumbuhkan kembali dalammedium LB padat baru yang mengandungantibiotik tetrasiklin dan ampisilin. Hasil replikadiperoleh sebanyak 104 koloni (foto tidakdiperlihatkan).

3.3 Karakterisasi transforman E.coli TOP10F’[pJET1.2-Sfamy]Karakterisasi transforman dilakukan untuk

memastikan E. coli TOP10F’ sudah mengandungplasmid rekombinan yang diinginkan. Karakterisasiyang dilakukan meliputi isolasi plasmid pJET1.2-Sfamy dengan metode miniprep (Sambrook, et al.,1989), analisis restriksi pJET1.2-Sfamy, danpenentuan urutan nukleotida Sfamy.

Isolasi plasmid pJET1.2-Sfamy dengan metodeminiprep.

Hasil isolasi plasmid rekombinan pJET1.2-Sfamy dengan metode miniprep (Sambrook et al.,1989) ditunjukkan pada Gambar 3.2. PlasmidpJET1.2-Sfamy memiliki ukuran ~4396 pb. Hasilisolasi plasmid kemudian dikarakterisasi dengan

elektroforesis gel agarosa. Pada Gambar 3.2 dapatdilihat pita plasmid pJET1.2-Sfamy lebih dari satupita dalam satu lajur. Adanya beberapa pita padasatu lajur menunjukkan bahwa hasil isolasimengandung DNA plasmid yang sama tetapimemiliki konformasi superkoil yang berbeda-bedaseperti supercoiled monomer, supercoiled dimer,dan nicked circular (Jazwinski & Edelman, 1982).

Gambar 3.2 Hasil isolasi plasmid pJET1.2-Sfamy. (lajur 1) koloni 30A, (lajur 2) koloni43A, (lajur 3) koloni 47A.

Gambar 3.3 Hasil restriksi plasmid pJET1.2-Sfamy dengan enzim EcoRI. (lajur 1) marker 1 kb, (lajur 2)pJET1.2-Sfamy koloni 30A/EcoRI, (lajur 3) pJET1.2-Sfamy koloni 43A/EcoRI, (lajur 4) pJET1.2-Sfamy koloni47A/EcoRI.

Analisis restriksi plasmid pJET1.2-SfamyAnalisis restriksi dilakukan untuk memastikan

bahwa plasmid pJET1.2-Sfamy yang diisolasi dari

transforman E. coli TOP10F’ [pJET1.2-Sfamy]merupakan plasmid rekombinan yang diinginkan.Analisis restriksi dilakukan dengan menggunakan

2 31

BA


150

enzim restriksi EcoRI yang merupakan salah satusisi pengenal enzim restriksi yang ditambahkanpada ujung 3'Sfamy. Enzim restriksi EcoRImerupakan enzim restriksi endonuklease yangdiisolasi dari E. coli, memiliki sisi pengenalan padaurutan polindrom 5′ G↓AATTC 3′ danmenghasilkan ujung lengket (sticky-end) danmempunyai kondisi reaksi optimum pada suhu37°C dan mengalami inaktivasi pada suhu 65°C.

Hasil restriksi plasmid yang ditunjukkan padaGambar 3.3A menunjukkan bahwa koloni 43 (lajur3) positif mengandung plasmid pJET1.2-Sfamy,ditunjukkan dengan adanya pita pada daerah ~4396pb yang sesuai dengan ukuran plasmid pJET1.2(2974 pb) ditambah Sfamy (1422 pb). Koloni

lainnya (lajur 2 dan 4) diduga mengandung vektorpJET1.2 yang mengalami religasi. Peta plasmidrekombinan pJET1.2-Sfamy diperlihatkan padagambar 3.3B.

Karakterisasi (isolasi plasmid dan analisisrestriksi) dilanjutkan untuk koloni 9B, 25B, 32B,43B, dan 49B. Hasil karakterisasi keempat kolonitersebut menunjukkan koloni 9B, 25B, 32B, 43B,dan 49B merupakan koloni positif mengandungplasmid pJET1.2-Sfamy, ditunjukkan denganadanya pita hasil restriksi pada daerah ~4396 pb(gambar tidak ditunjukkan). Berdasarkan hasilanalisis ini, telah diperoleh 6 koloni E. coli yangpositif mengandung plasmid rekombinan pJET1.2-Sfamy.

Gambar 3.4. Hasil homologi urutan nukleotida Sfamy dengan program BLAST.

Penentuan urutan nukleotida gen Sfamy.Penentuan urutan nukleotida Sfamy dilakukan

untuk memastikan bahwa urutan nukleotida Sfamyyang dikloning dalam vektor pJET1.2 sesuaidengan urutan gen Sfamy NCBI (nomor akses:HQ172905.1). Penentuan urutan nukleotidadilakukan dengan menggunakan metode DideoksiSanger dengan menggunakan primer pJET-for.

Urutan nukleotida yang dihasilkan kemudiandibandingkan dengan urutan nukleotida gen Sfamy(Genebank: HQ172905.1) menggunakan perangkatanalisis Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) untuk mengetahui tingkat homologiantara kedua urutan nukleotida tersebut. Hasilanalisis BLAST diperoleh informasi urutan genSfamy hasil subkloning dalam E. coli memiliki


151

homologi 100% dengan urutan gen Sfamy NCBInomor akses: HQ172905.1 (Gambar 3.4).

Pada hasil analisis BLAST (Gambar 3.4),menunjukkan bahwa urutan basa Sfamy hasilsekuensing dimulai dari urutan basa nomor 61 padaSfamy NCBI HQ172905.1. Urutan basa nomor 1-60pada Sfamy NCBI merupakan urutan pengodepeptida sinyal, sedangkan Sfamy hasil sekuensingtidak memiliki urutan pengode paptida sinyal. GenSfamy yang disubkloning di dalam E. colidirancang tidak memiliki pengode peptida sinyalkarena akan digunakan untuk ekspresi dalam sistemekspresi E. coli. Ekspresi protein asing di E. coliakan menghasilkan protein intraselular karena E.coli merupakan prokariot yang tidak memilikiorganel perangkat untuk sekresi protein, oleh sebabitu urutan pengode peptida sinyal tidak diperlukan.Selanjutnya, gen Sfamy hasil subkloning ini akandisisipkan ke vektor ekspresi pTYB21 untuk E.coli. Menggunakan vektor ekspresi ini, α-amilaseakan diekspresikan dalam bentuk protein fusidengan intein, suatu protein yang dapat melakukanself-splicing. Multi cloning site (MCS) pada vektorini berada setelah intein, sehingga tidak diperlukanstart codon (AUG) dari Sfamy untuk memulaisintesis protein.

4. KesimpulanGen pengode α-amilase S. fibuligera telah

berhasil di subkloning menggunakan vektorpJET1.2 untuk E. coli. Hasil penentuan urutannukleotida menunjukkan urutan Sfamy hasilsubkloning homologi dengan urutan Sfamy yangterdapat di GenBank.

Daftar Pustaka.Cowan, D. 1996. Industrial enzyme technology.

Trends Biotechnol. 14, 177-178.Fermentas, 2010. Molecular Biology Catalog and

Product Application Guide. Canada.Fukusumi, S., S. Horinouchi, T. Ohshima & T.

Beppu. 1988. Cloning and expression inEscherichia coli of two additional amylasegenes of a strictly anaerobic thermophile,Dictyoglomus thermophilum, and theirnucleotide sequences with extremely lowguanine-plus-cytosine contents. Eur. J.Biochem. 176, 243-253.

Gogoi, B.K., R.L. Bezbaruah, K.R. Pillai & J.R.Baruah. 1987. Production, purification andcharacterization of an -amilase produced bySaccharomycopsis fibuligera. J. Appl.Bacteriol, 63, 373-379.

Hasan, K., Ismaya, W.T., Kardi, I., Andiyana, Y.,Kusumawidjaya, S., Ishmayana, S., Subroto,T., and Soemitro, S. 2008. Proteolysis of -amylase from Saccharomycopsis fibuligera:

characterization of digestion products.Biologia. 63: 1044-1050.

Hashida, M & H. Bisgaard-Frantzen. 2000. Proteinengineering of new industrial amylase. TrendsGlycosci. Glycotechnol. 12, 389-401.

Hostinova, E. 2002. Amylolytic enzymes producedby the yeast Saccharomycopsis fibuligera.Biologia, Bratislava. 57, 247-251.

IMPACTTM. 2004. CN Instruction Manual, NewEngland Biolabs.

Itoh, T., I, Yamashita & S. Fukui. 1987. Nucleotidesequence of the α-amylase gene (ALP1) in theyeast Saccharomycopsis fibuligera. FEBS Lett.219, 339-342.

Jazwinski, S.M. & G.M. Edelman. 1982. Proteincomplexes from active replicative fractionsassociate in vitro with the replication origins ofyeast 2-μm DNA plasmid. Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 79, 3428-3432.

Kirk, O., T.V. Borchert & C.C. Fuglsang. 2002.Industrial enzyme applications. Curr. Opin.Biotechnol. 13, 345-351.

Laderman, K.A., K. Asada, T. Uemori, H. Mukai,Y. Taguchi, I. Kato & C.B. Anfinsen. 1993. a-Amylase from the HyperthermophilicArchaebacterium Pyrococcus furiosus cloningand sequencing of the gene and expression inEscherichia coli. The American Society forBiochemistry and Molecular Biology, Inc. 268,32.

Maciver, B., R.H. McHale, D.J. Saul & P.L.Bergquist. 1994. Cloning and sequencing of aserine proteinase gene from a ThermophilicBacillus Species and its expression inEscherichia coli. Applied and EnviromentalMicrobiology. 60, 3981-3988.

Pandey, A., P. Nigam, C.R. Soccol, V.T. Soccol, D.Singh & R. Mohan. 2000. Review: advances inmicrobial amylases. Biotechnol. Appl.Biochem. 31, 135-152.

Sambrook, J., E.F. Fritsch, & T. Maniatis. 1989.Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd

ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor. New York.

Shabarni Gaffar. 2011. Pengaruh kombinasimanipulasi genetik terhadap tingkat sekresi -amilase Saccharomycopsis fibuligera r64dalam Pichia pastoris. Disertasi. UniversitasPadjadjaran.

Satoh, E., Y. Niimura, T. Uchimura, M. Kozaki &K. Komagata. 1993. Molecular cloning andexpression of two α-amylase genes fromStreptococcus bovis 148 in Escherichia coli.Applied and Enviromental Microbiology. 59,3669-3673.

Van der Maarel, M.J.E.C., B. Van der Veen, J.C.M.Uitdehaag, H. Leemhuis & L. Dijkhuizen.


152

2002. Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family. J.

Biotechnol. 94, 137-155.

Documents

UNDANG-UNDANG REPUBLIK INDONESIA NO 19 …pustaka.unpad.ac.id/wp-content/uploads/2016/08/07-Konstruksi-dan... · Isolasi Senyawa Steroid dari Umbi ... Analisis Zat Gizi Biskuit Difortifikasi