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clll UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL
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Ec
A QUIEN CORRESPONDA:
Por medio de la presente se hace constar que el (la): NI. EN C. MAR¡A DE LOURDES ESCAMILLA HURTADO
del Departamento de Blotecnología de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesor6 el siguiente Servicio Social:
.
TITULO
ALUMNO MATR~CULA 93229833 LICENCIATURA lngenierfa de los Alimentos PERIODO
Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a tres de Noviembre de mil novecientos noventa y ocho.
A T E N T A M E N T E
Efecto de tres distintas temperaturas en la producción de diacetilo en cultivos mixtos de almidón. Leyva Cadena Gabrlela de Jesús.
Septiembre 30, 1998 a Octubre nueve 1998.
"Casa Abierta al Tiempo" * -
f \
M. EN SECRETARIO ACADÉMIC~'
UNIDAD IZTAPALAPA Av Mlchoacán y La Purlslma lztapalapa 09340. M6xico. D F A P 55-535 Far: (5)612-80-83 Tels. 724-46-81 y 85
a JCBc:
INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL
JNOMBRE: Leyva Cadena Gabriela de Jesús
1 TELEFONO PARTICULAR: 685-4431
MATRICULA: 93229833
/LICENCIATURA: Ingeniería de los Alimentos
TRIMESTRE LECTIVO: 98-1
HORAS SEMANA: 20 h
[n
/TITULO DEL TRABAJO: Efecto de tres distintas temperaturas en la
producción de diacetilo en cultivos mixtos de
almidón
María de Lourdes Aurora Escamilla Hurtado,
Profesora Titular C, Tiempo completo.
Universidad Autónoma MetroDolitana
Unidad Iztapalapa,
Depto. Biotecnología, Area de Alimentos.
Laboratorio S-152, U. lztapalapa
30 de septiembre de 1997
25 de septiembre de 1998
JAS ES ORA:
LUGAR DE REALIZACIÓN:
FECHA DE INICIO:
4 E C H A DE TERMINACION: /-J-
CLAVE: IA. 061. 97
NOMBRE DEL PROYECTO: Determinación de la relación entre la actividad
de la amilasa de Pediococcus pentosaceus y
las de enzimas de producción de aromas en
cultivos axenicos o mixtos (D.C.B.S., 1998-99) Ill
I, [ p J L)/p ------------ti-------- ----_____------- A L U M N A A S E S O R A
Gabriela de Jesús Leyva Cadena M. en C. Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado Profa. Depto. de Biotecnologia,UAM-I
México, D.F. a 25 de septiembre de 1998
DR JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA
DIRECTOR DE LA D.C B.S., UAM-I
PRESENTE
Por medio de la presente me dirijo a usted, la alumna de la carrera de'lngenieria
de los Alimentos: Gabriela de Jesús Leyva Cadena, con matrícula 93229833 para
solicitar el visto bueno del reporte final del Servicio Social, con clave IA. 061.97
denominado :
'' Efecto de tres distintas temperaturas en la produccián de discetilo en
cultivos mixtos de almidán "
El servicio social fue asesorado por la M. en C. Maria de Lourdes Aurora
Escamilla Hurtado, Profesora titular C, Tiempo completo, adscrita al Area de
Productos Naturales, Depto. Biotecnologia, Div. Ciencias Biológicas y de la Salud.
Unidad Iztapalapa, de la Universidad Autónoma Metropolitana.
El proyecto se llevó a cabo en el laboratorio S-I52 de la Unidad Iztapalapa,
teniendo como fecha de inicio el 3 0 de septiembre de 1997 y finalizando el 25 de
septiembre de 1998
Por la atención que se sirva prestar, quedo de usted agradecida:
A T E N T A M E N T E
Casa abmta a1 tw
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
México. D.F. a 25 de septiembre de 1998.
DR JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA
DIRECTOR DE LA D.C.B.S., UAM-I
PRESENTE
Por medio de la presente hago constar que la alumna de la carrera de Ingenieria
de los Alimentos: Gabriela de Jesús Leyva Cadena, con matrícula 93229833, ha
concluido satisfactoriamente el Servicio Social, con clave IA. 061.97, denominado:
" Efecto de tres distintas temperaturas en la producción de discetilo en
cultivos mixtos de almidón ''
El servicio social fue iniciado el 30 de septiembre de 1997 y finalizado el 25 de
septiembre de 1998. El reporte final ya ha sido revisado y estoy de acuerdo con
su contenido.
Agradezco de antemano la atención prestada y me es grato enviarle un cordial
saludo.
A T E N T A M E N T E ,/? ?,I
M. en C. Ma. de Lourdés Aurora Escamilla Hurtado
Profesora Titular C, tiempo completo
Depto. de Biotecnologia, Area de Prod. Nat.
Universidad Autónoma Metropolitana, lztapalapa
UNIDAD IZTAPALAPA Av. Mihoacán y La Pwisima. Col. Vicontina, ü9340M611i~o. D.F. Tel.: 724JBOü TELEFAX: (5) 812 0885
México, D.F. a 25 de septiembre de 1998.
DR JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA
DIRECTOR DE LA D C.B S , UAM-I
PRESENTE
Por medio de la presente me dirijo a usted, con motivo de exponerle las razones
por las cuales la entrega del informe final de servicio social denominado:
" Efecto de tres distintas temperaturas en la producción de discetilo en
cuftivos mixtos de almidón I' ,
se efectúa 6 meses posteriores a la fecha señalada inicialmente para su
finalización (30 de marzo de 1998).
En primer término, en la fecha señalada de la entrega del informe final, yo
estudiaba el décimo segundo trimestre que consiste en el llamado "Paquete
terminal" y la carga de trabajo era excesiva, por lo que tuve que reducir
substancialmente el tiempo dedicado al Servicio Social.
Por otro lado, tuve problemas personales que me impidieron dedicar el tiempo
requerido para la elaboración del informe final del servicio social a tiempo.
Esto provocó finalmente el retardo que hago de su conocimiento.
Por la atención que se sirva prestar, quedo de usted agradecida
A T E N T A M E N T E n
México D F a 25 de septiembre de 1998
DR JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA
DIRECTOR DE LA D C B S , UAM-I
PRESENTE
RESUMEN DEL SERVICIO SOCIAL
DETERMINACION DEL EFECTO DE TRES DISTINTAS TEMPERATURAS EN LA PRODUCCION DE DlACETlLO EN CULTIVOS MIXTOS DE ALMIDON
La nota aromática "natural" a mantequilla es demandada en las industrias alimentarias, como la láctea, de panificación, confiteria, etc. Así, surge la necesidad de utilizar bacterias Iácticas para obtener ese aroma (cuyo componente principal es el diacetilo), pero en un substrato amiláceo. En este trabajo se evaluó el efecto de la temperatura en la producción de diacetilo y otros aromatizantes en cultivos mixtos de Pd. pentosaceus y Lb. acidophilus sumergidos, en cultivos de almidón. Las temperaturas evaluadas fueron 28, 32 y 35OC, para lo cual se utilizó un arreglo ortogonal de Taguchi, de tipo L-9. Los análisis que se efectuaron al inicio y al final de la fermentación fueron: pH, ácido láctico, carbohidratos (totales y reductores), diacetilo, ácidos grasos volátiles y cuenta viable. En los cultivos se tuvo una alta producción de ácido, con la consecuente disminución del pH, a la que se atribuyó el bajo consumo de almidón. Con respecto a los ácidos grasos volátiles, la producción de ácido acetic0 predominó sobre las de los ácidos propiónico y butírico sus contenidos no sobrepasaron los niveles de aceptación sensorial en el aroma tipo mantequilla. El mejor valor de consurco de almidón fue de 0.29 gil y la cuenta viable más alta fue de 1.18 x IO' U.F.C./ml, que se presentaron a 28% y 32OC, respectivamente. Se concluye que la mejor temperatura para la producción de diacetilo (134.76 mgll) fue la de 32°C. Las tendencias con respecto a la temperatura fueron similares en los consumos de glucosa, los rendimientos de cuentas viables, de ácido láctico, de ácido acético y de diacetilo; posiblemente por la existencia de una relación metabólica entre dichos parámetros, aunque la formación de diacetilo no sólo parece depender del consumo de glucosa, sino también del de almidón.
Alumna : Gabriela de Jesus Leyva Cadena Matrícula : 93229833 -. Licenciatura : Ingeniería de los Alimentos Asesora : Ma. de Lourdes Aurora Escamilla Hurtado. Depto. de Biotecnología,
UAM-I
INFORME FINAL DEL SERVICIO SOCIAL
Efecto de tres distintas temperaturas en la producción de diacetilo en cultivos mixtos de almidón
I. INTRODUCCION
Hasta hace poco, las formulaciones artificiales con arcima tipo mantequilla eran las Únicas disponibles en el mercado, éstas presentan la desventaja de dar origen a productos con detectable aroma artificial ya que no es fácil obtener sintéticamente un perfil que se asemeje al aroma natural, y los costos suelen limitar los compuestos químicos a utilizar (Escamilla, et al., 1996 b).
A partir de esta limitación ha surgido la demanda de aromatizantes preparados por algún proceso alternativo a la síntesis química. Entre los compuestos formados por métodos biotecnológicos destaca la nota aromática a mantequilla, cuyo componente más importante es el diacetilo o 2,3-butanodiona (CH3COCOCH3). Este se complementa con una mezcla compleja de otros aromatizantes como son los ácidos grasos volátiles y algunos otros en concentraciones traza (Cachon y Divies, 1993; Dziezak, 1986; Pollock, 1994).
Cuando se desarrollan este tipo de saborizantes se busca que tengan un costo atractivo, al incluir en la misma base funciones adicionales al aroma, como las de estabilización, extensión, etc. (Hatchwell, 1994; Pollock, 1994; Escamilla, et al., 1996) lo que justifica que en este trabajo se utilice un sustrato alternativo a la leche, como el almidón, que además de ser más económico, la industria alimentaria lo utiliza como extensor y espesante.
Durante la fermentación Iactica que se establece naturalmente en algunos alimentos tradicionales mexicanos como el pozol, que es una masa de maíz nixtamalizada y fermentada (Escamilla y Mozqueda, 1992), y en el atole agrio del grupo étnico tzotzil, que se elabora a partir de maíz sumergido en agua durante varios días (Escamilla et ai., 1993), se han detectado aromas tipo lácteo por pruebas sensoriales, predominando las notas butíricas y a mantequilla (Olguín et al. I 1988).
.. nc'
El dhokla es un alimento tradicional hindú elaborado a base de cereales y leche que tiene aroma a mantequilla, debido a que se forman diacetilo ( 5.2 mg Kg-') y ácidos grasos volátiles durante la fermentación Iáctica (Joshi et al., 1989)
1
La biosíntesis de diacetilo por bacterias tácticas ha sido estudiada principalmente en productos lácteos, y en menor medida, en bebidas alcohólicas y en algunos ensilados vegetales (Marshall, 1996, Sanofi, 1994). Se ha logrado mejorar cepas microbianas, pero se necesita avanzar en el proceso biotecnológico para controlar completamente la producción del diacetilo y los compuestos relacionados (Escamilla et ai., 1996).
La temperatura es un parámetro ambiental importante en las fermentaciones con bacterias lacticas, ya que la ruta metabólica para la formación del diacetilo es fácil de alterar. La variación de la temperatura no favorece de igual manera la producción del aroma y la acidificación (Escamilla et ai., 1996 a). Para Pd. pentosaceus, la temperatura óptima de crecimiento es de 28OC, y también se produce diacetilo. La temperatura óptima de crecimiento de Lb. acidophilus por otro lado, es de 35OC; esta cepa tiene una mayor capacidad para hidrolizar el almidón en comparación con el pediococo, pero no produce diacetilo (Verde et. al, 1995).
Distintos factores nutrimentales y ambientales que afectan la producción de diacetilo se evaluaron previamente en tres series de experimentos con cultivos axénicos de estas dos cepas. En dichas series se consideraron factores como: citrato, temperatura, glucosa, Caco3, extracto de levadura y treonina, siendo las variables de respuesta: la producción de diacetilo, el consumo de almidón y la actividad amilolítica extracelular. De entre las variables de respuesta se considera a la producción de diacetilo como la más importante ya que es el objetivo principal del proyecto global que se titula "Formación de diacetilo en cultivos axénicos mixtos a base de maíz" del cual forman parte todas las series mencionadas, y también el presente trabajo.
El objetivo principal de este servicio social fue determinar la temperatura óptima para la obtención de diacetilo y otros aromatizantes relacionados en cultiv,os mixtos de Pd. pentosaceus y Lb. acidophilus desarrollados en almidón, ya que se conocen los efectos de otros parametros ambientales, además de las temperaturas óptimas de crecimiento y acidificación para cada cepa; pero en las series anteriores no había sido posible predecir la temperatura que debiera utilizarse en el cultivo mixto para producir diacetilo.
2
11. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECIFICOS
OBJETIVO GENERAL:
Determinar la temperatura óptima a la cual se obtenga una mayor producción de diacetilo a partir de almidón, utilizando un cultivo mixto de íactobac///us aodophilus y Pediococcus pentosaceus
OBJETIVOS ECPECIFICOS :
1. Adaptar técnicas analíticas para la evaluación de diacetilo y de los sustratos relacionados, durante la fermentación Iactica en cultivos mixtos de almidón.
2. Estudiar el efecto que tiene la temperatura sobre la producción de diacetilo en un cultivo mixto de almidón.
3. Aplicar estadística descriptiva a los resultados obtenidos.
4 Aplicar un análisis de varianza para seleccionar la mejor temperatura de producción de diacetilo en el cultivo mixto.
3
ill. OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS
1 Se adaptaron técnicas analíticas para la cuantificación de los substratos y productos durante la fermentación Iáctica en cultivos de almidón particularmente en las etapas de preparación, dilución de las muestras, antes de los analisis
2. Se desarrolló una metodología confiable de análisis de cromatografía gaseosa apropiada al análisis del diacetilo y de los ácidos grasos volátiles disueltos en la muestra.
3. Se determinó la ventaja de utilizar el método cromatográfico sobre el fotocolorimétrico para el análisis de diacetilo, por su mayor sensibilidad y exactitud.
4. Se determinó que la temperatura tiene un importante efecto sobre la producción de diacetilo , sobre la acidificación y sobre el consumo de almidón
5. Mediante los resultados del análisis de varianza se seleccionó como óptima la temperatura de 32OC para la mayor producción de diacetilo y para la formación de ácido láctico, pero para el consumo de almidón fue de 28OC.
4
IV. MATERIALES Y METODOS
4 1 REVISION BlBLlOGRAFlCA
Se tuvo acceso por red a los bancos de datos que maneia la UAM-I ara tener referencias y resúmenes del Biological Abstract y de FSTA, por cd-rom. se consultó et material de bibliotecas y préstamo interbibliotecario de la UAM-I. se revisaron artículos específicos sobre la formación e importancia del diacetilo en los aromas producidos por bacterias lacticas, así como también se efectuó la revisión de artículos referentes a los fundamentos y metodologias de las pruebas físicas y químicas utilizadas para el análisis de productos de fermentación.
4.2 DISENO EXPERIMENTAL
Se realizaron cultivos mixtos sumergidos de las siguientes cepas Pediococcus pentosaceus (aislada en el laboratorio a partir de sidra) y Lactobacillus acidophilus (cepa No.1748 de la colección de Hansen) en medio de almidón, para evaluar el efecto de la temperatura a tres niveles: 28O, 3 2 O y 35OC. Las variables de respuesta fueron: el consumo de almidón y la producción de diacetilo. También se realizaron otros análisis quimicos.
El desarrollo del diseño experimental está basado en los arreglos ortogonales de Taguchi, con los cuales se realiza sólo una parte de todas las posibles combinaciones, manteniendo la ortogonalidad del diseño, y utilizando solo un reducido número de experimentos (Ross,l989).
El diseño experimental utilizado fue tipo L-9 con un factor y 3 niveles. La asignación del factor y del error a las columnas del arreglo ortogonal L-9 de Taguchi (Ross, 1989) se presenta en el Cuadro No. 1
4 3 PREPARACION DEL MEDIO DE CONSERVACION
Se prepararon tubos con el medio de cultivo sólido cuya composición se muestra en el Cuadro No. 2. El medio fue esterilizado a 121OC durante 15 min, en tubos de rosca de 15 x 150 mm que después se enfriaron de manera inclinada y se colocaron en la incubadora Felisa Mod. FE a una temperatura de 35OC por 48 h como prueba de esterilidad.
Posteriormente se efectuó la siembra de las dos cepas en dos tubos para cada una de ellas, tomando asadas cargadas de cultivos anteriores y sembrando mediante la técnica de estría y piquete. Los tubos se incubaron a una temperatura
5
de 35OC para Lb. acidophilus, y a 28 O C para Pd. pentosaceus, durante 48 h, por separado, en dos estufas Felisa Mod. FE.
Cuadro No. 1 Asignación del factor y del error a las columnas del arreglo ortogonal
por el cultivo mixto con Pd. pentosaceus y Lb. acidophilus.
Experimentos A error - No. Nivel 1 2 3 4
1 28% - 1 1 1 1 I 2 2aoc - 2 1 2 2 2 3 2aoc - 3 1 3 3 3 4 32OC - 1 2 1 2 3 5 32OC - 2 2 2 3 1 6 32OC - 3 2 3 1 2 7 35% - 1 3 1 3 2 8 35% - 2 3 2 1 3 9 35% - 3 3 3 2 1
Cuadro No. 2 Composición del medio de conservación
Componente Concentración Caldo de microinóculo (Merck) 18.5 g Agar 15.0 g Almidón soluble 5.0 g Solución de vitaminas y minerales" 5.0 ml Biotina 80.0 mg Acido fólico 40.0 mg Agua destilada 1000.0 ml
pH=6.5 Verde de bromocresol 0.01 g
*Una cápsula de Viterra Plus@ y una de Calanda". disueltas en 40 ml de solución de etanol al 20%. filtrado.
6
4 4 PREPARACION DE LOS CULTIVOS DE INOCULACION
Agua destilada
El medio de inoculación se preparó en 2 matraces erlenmeyer de 125 ml, cada uno conteniendo 50 ml de medio, cuya composición se muestra en el Cuadro No. 3. Los matraces se esterilizaron a 12IoC por 15 min y se les realizó la prueba de esterilidad a 35°C por 48 h, en estufa Felisa Mod. FE. Los medios estériles se inocularon por separado con asadas cargadas de los cultivos de 48 h en condiciones asépticas. Los matraces de inoculación se incubaron, en dos estufas Felisa Mod, FE, con agitación de 120 rpm con un agitador orbital ESM-SA, a una temperatura de 35% para Lb. acidophilus, y a 28% para Pd. pentosaceus.
, ~OOO.O m i I
Cuadro No. 3 Composición del medio de inoculación
Composición Glucosa Almidón soluble Extracto de levadura Caco3 Peptona de caseína KzHP04 MgS04.7H20 Solución de Vit. y Min.* Biotina Acido fólico
Concentración 509-( 10.0 g 2.0 g
2.0 g 0.2 g 0.1 g
0.3 g
3.0 ml 80.0 mg 40.0 ma
4.5 PREPARACION DEL MEDIO DE FERMENTACION
Las fermentaciones se llevaron a cabo en cultivos mixtos sumergidos en medio de almidón, utilizando el medio que se indica en el Cuadro No. 4. Se prepararon 8 matraces erlenmeyer de 250 ml con tapón de algodón y gasa, cada uno conteniendo 100 ml del medio; dichos matraces se esterilizaron a 121 "C durante 15 min y se les aplicó la prueba de esterilidad en estufa Felisa Mod. FE a 35OC por 48 h.
Cuadro No. 4 Composición del medio de fermentación
Componente I Concentración Almidón soluble 5.0 g Glucosa Peptona de caseína Extracto de levadura CaCO,
Solución de Vit. y Min.* Biotina Acido fólico
*Preparación indicada en el
5.0 g 2.0 g 2.0 g 0.3 g 0.2 g 0.1 g 3.0 ml
80.0 mg 40.0 mg
1000.0 ml hadro No. 2.
4 6 INOCULACION Y FERMENTACION PRINCIPAL
Cada matraz se inoculó asepticamente con 0.5 ml de cada uno de los Cultivos de inoculación indicados en el inciso 4.4. Después de agitar para mezclar bien, dos de los matraces inoculados se tomaron como muestras iniciales de fermentación, por lo cual no se incubaron. Se incubaron 2 matraces a una temperatura de 28OC, 2 a 32OC y los últimos 2 a 35OC. Los matraces se cultivaron durante 5 días en estufas Felisa Mod. FE y se agitaron a 120 rpm con agitador orbital ESM-SA durante todo ese tiempo, con el fin de mantener un redox alto y evitar que las bacterias Iácticas formaran conglomerados; estos Últimos 6 matraces fueron tomados como muestras finales de fermentación.
4.7 MUESTRE0
A los 2 matraces que se tomaron como muestras iniciales, se les midió su volumen real (para considerar la variación debida a la esterilización) y su pH. Enseguida, se congelaron a -1 2OC. Para poder realizar los análisis fisicoquímicos (Fig. No. I], se descongelaron las muestras pasándolas al refrigerador desde la noche anterior al análisis, luego se introdujeron los frascos en baño de agua a temperatura ambiente. Se agitaron y reposaron las muestras antes de utilizarlas.
De los caldos fermentados de las finales se tomaron asépticamente alícuotas para el análisis microbiológico, inmediatamente despues de retirarlas de la incubadora.
8 ..
Después, de cada caldo de cultivo (tanto muestras iniciales como finales), se tomó una alícuota de 30 ml, la cual se congeló para realizar posteriormente el análisis de carbohidratos totales, el resto del caldo se centrifugó.
4.8 METODOS DE ANALISIS MICROBIOLOGICOS
1. Determinación de cuenta viable de bacterias Iácticas en el inóculo
Preparación de las diluciones
Se preparó una solución diluyente, isotónica y amortiguadora de pH, con la siguiente composición. en g por cada 1000 ml de agua destilada: 8.0 NaCI: 0,34 KH2P04, 1.21 K2HP04, y se ajustó el pH a 7.3, utilizando como reguladores de pH: HzS04 al 10% y NaOH al 10%. Se vertieron 99 ml de la solución diluyente en frascos de dilución de 120ml, y 9 ml en tubos de cultivo de 15 x 120 rnm, posteriormente se esterilizaron a 120 OC durante 15 min. Se tomó 1 ml del matraz del cultivo del inóculo de fd. penfosaceus y se prepararon asépticamente las diluciones: lo-', lo', y I O ? Se prepararon de igual forma las mismas diluciones para el matraz del cultivo del inóculo de Lb. acidophilus. Para mantener las condiciones asepticas se trabajó en un cuarto estéril y con campana de flujo laminar marca VECO 6HFL-A12.
Preparación de los cultivos en placa
Se tomaron asépticamente alícuotas de 0.1 ml de las diluciones preparadas anteriormente, para sembrar por duplicado placas de medio de conservación. cuya composición se muestra en el Cuadro No.2. Cada alícuota se dispersó asépticamente en la superficie de las placas con'el asa bacteriológica, por lo que las diluciones en las placas fueron de l o 5 y l o 6 .
Incubación y cuenta de colonias
Las placas con Pd penfosaceus se incubaron a 28 "C y las placas con Lb acidophilus a 32OC, todas las placas se incubaron por 72 h y se contó el número de colonias con un aoarato cuenta colonias marca Sol-Bat HRT-50-60 Para calcular la concentración de unidades formadoras de colonias (UFC), se usó la Ec 1
No. colonias. x 1IDil. = UFClml caldo del inóculo .... .. ... ..... ... .. .Ec. 1
.e 9
2. Determinación de cuenta viable de bacterias tácticas en los matraces de fermentación
Se preparó una solución diluyente, isotónica y amortiguadora de pH con el mismo procedimiento que el que se utilizó en el conteo de cuenta viable en el inóculo. Se tomó. por separado, 1 ml de cada uno de los matraces fermentados y se prepararon asépticamente las diluciones 10.' a I O 6 para cada matraz, de manera similar al indicado previamente. Luego se tomaron asépticarnente alicuotas de O. 1 rnl de las diluciones l o 4 a 10.' y se sembraron por duplicado placas de medio de conservación, de igual forma que la mencionada en la preparación de los cultivos del inóculo. En este caso, las diluciones en las placas fueron de l o 5 , 10' y Las placas se incubaron a 32 "C por 72 h y se contó el número de colonias con un aparato cuenta colonias como se indicó previamente.
10
Fig. 1 Diagrama de actividades de trabajo
Preparación de medios
4 , 4 Preparación de Inoculación de
inóculos axénicos cultivos ,mixtos I ,
Medición de pH y volqrnen
I CongeTación
I
v final 1 ... I *
L I Centrifugación 1 Anal is I s7
1 Determinación de cuenta viable 2 C.G.L. (diacetilo) 3 C.G.L. (ácidos acético, própionico y butírico) 4 Determinación de diacetilo colorimétrico 5 Determinación de azúcares reductores 6 Determinación de ácido láctico 7 Determinación de carbohidratos totales .
I 1
4 9 CENTRIFUGACION DEL CALDO DE CULTIVO
La centrifugación de los caldos de cultivo se realizó en frascos de 250 ml en una centrífuga modelo Beckman J2-MI usando un rotor de ángulo fijo JA-14 en las siguientes condiciones 5000 rpm, a una temperatura de 4 "C por 30 minutos
AI término de la centrifugación del caldo de cultivo, se separó el sobrenadante del sedimento con una micropipeta, manteniendo el frasco de la centrífuga inclinado sin moverlo y dejando un poco de liquido para evitar tomar los sólidos (biomasa y almidón)
Para calcular la fuerza centrífuga relativa (FCR), se utilizó la Ec. 2, con los siguientes datos:
RCF (9) = 1.12 x r x (rpm/l000) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ec.2
En la centrifugación los datos fueron los siguientes: rotor de ángulo fijo JA-20 r = 137mm rpm= 5000
Con un valor de FCR igual a 3836 xg
4.10 METODOS DE ANALISIS FlSlCOS Y QUlMlCOS
1. Determinación del pH
La medicion del pH de las muestras iniciales y finales del caldo fermentado se realizó con un potenciómetro Conductronic pH 20, según los procedimientos de A.O.A.C. (1985).
2. Determinación de volumen
Para la medición del volumen de las muestras iniciales y finales de caldo fermentado se utilizó una probeta de 100 ml. Cada muestra se vació del matraz de fermentación directo a la probeta y se midió su volumen.
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3. Determinación de diacetilo, ácido acético, ácido propiónico y ácido butirico por cromatografia gas - líquido.
Para el análisis de los compuestos volátiles por cromatografia gas-líquido se empleó un cromatógrafo de gases analítico Hewlet-Packard, modelo 5890. equipado con un detector de ionización de flama de la misma marca y un integrador Shimadzu C-R3A Chromatopac. La columna utilizada fue de Megaboro AT-I000 de 10 m con diámetro interior de 0.53 mm y espesor de pelicula de 1.2 Llm.
Se trabajó en las siguientes condiciones: Inyector: Ti,,. = 200 "C. Columna: T, = 80 "C, ti = 1 min; T2 = 150 "C; t z = 3 min; R = 10 "Clmin, flujo de N2 = 5 mllmin. Detector: TD.~ = 220 OC, tEq = 3 min, Aten.D.1, = 1.0, flujo de H2 = 20-30 mllmin. flujo de aire = 200 - 300 mllmin. Integrador: Programa No. 5, Aten.,,, = 2.0, Vel. carta 1 cmlmin, TFin. = 10 min.
Todo el material en esta técnica se lavó cuidadosamente, se enjuagó con agua destilada y por último con agua desionizada antes de usarlo.
Preparación de una solución de HCI - H20, 1:l , vlv.
1. Se adicionaron 5 ml de agua destilada y desionizada con pipeta volumétrica a
2. Se adicionó HCI concentrado (Baker Analyzed) gota a gota con ayuda de una
3. La solución anterior se transfirió a un frasco para reactivo ámbar y se guardó
un matraz aforado de 10 ml
pipeta de 1 ml hasta la marca, se tapó y se agitó el matraz.
en refrigeración a 4 O C .
Preparación de soluciones concentradas de los estándares
Se prepararon por separado soluciones de diacetilo (Merck-Shucharrdt, >98%), ácido acético (Baker Analyzed, 99.87%), ácido propionico (Merck, >99%) y ácido butírico (Baker Analyzed, purificado), de acuerdo al siguiente procedimiento:
1. En un vasos de precipitados de 10 ml se vertieron aproximadamente 2 ml de agua destilada y desionizada. Los vasos se colocaron en una balanza analitica OHAUS, modelo GalaxyTM 160, ajustando el peso a Cero.
2. Con espátulas pequeñas se pesaron por separado, cada de uno de los compuestos en las cantidades que indica el Cuadro No. 5, (pesando un ligero exceso, y dejando evaporar en la balanza hasta el peso deseado).
3. El contenido de cada vaso se vació inmediatamente a su respectivo matraz volumétrico de 50 ml, lavando el vaso con pequeñas porciones de agua
13
desionizada, las SOlUCiOneS se aforaron con la misma agua, tapando rápidamente y agitando para mezclar perfectamente
4 Las soluciones anteriores se transfirieron por separado a frascos de plástico roscado, con capacidad de 125 ml y se guardaron en congelación a - 18 "C
(s/moi)
hasta su utilización.
soluciones concentradas (1 O0 mmolll)
Cuadro No. 5 Preparación de soluciones concentradas de cada estándar de los
ácidos grasos volátiles y del diacetilo
Acido propiónico 74
Acido butirico 88
~ ~
Peso molecular Concentración en mgll de las
7400
8800
8600 I 86 I I Diacetilo
Acido acético 60 6000
Preparación de soluciones estándares mixtas
Se prepararon 3 soluciones estándares mixtas mezclando alicuotas de la concentrada de diacetilo, junto con las de los ácidos (acético, propiónico y butírico). Las concentraciones de cada componente en las tres mezclas fueron de concentraciónes de 1, 5 y 1 O mmolll de cada compuesto. La preparación se llevo a cabo en viales de plástico con capacidad de 2 ml de acuerdo al Cuadro No 6 y con las indicaciones que se describen a continuación:
1. Los volúmenes menores a 50 pI se vertieron con una pipeta automática de 50
2. Los volúmenes de 50 a 200 PI se vertieron con ayuda de una pipeta automática 111 ajustable de 10 a 50 PI , marca Oxford"' Samp'ler Sistem.
fija de 50 pl marca Brand, Transsferpette'".
14
I I I I
O 8 - c, O 0 0 0 O O 0 0 0 rn > .c - 7 - 7 rn
o! 2 1 I I I I
O O O O O O
O 0 0 O goma iB > E 7 - C i I o) - 7 3 o m
O U m o
O O o
O rn - 7 > E t zzmq m a o m
3. Los volumenes de 700 a 1000 pl se vertieron con una pipeta automática marca
4. La preparación se realizó en viales de plástico de 2 ml; al final se cerraron y se
5. Los viales con soluciones estandares mixtas se prepararon un día antes de su
Gilson- , P500, de volumen variable hasta 5 O00 pl.
mezclaron a mano.
uso en el cromatógrafo, guardándolas en congelación a - 18 O C .
De las soluciones de los estandares se inyectaron 3 pl al cromatógrafo. realizándolo por quintuplicado, para tener suficientes datos para ajuste de la curva estándar.
Preparación de las muestras
1. Se descongeló el caldo fermentado clarificado por centrifugación. 2. Se tomó un ml del mismo, con una pipeta Gilson"', P 5000, y se vertió en un vial
3. Se adicionaron al vial 25 pI de la solución de HCI con una pipeta automática de
4. El vial se cerro y se agitó a mano 5. Posteriormente, los viales se centrifugaron durante 30 min, a 5000 rpm y 4 O C ,
en una centrifuga Beckman, Jz - Mi, utilizando el rotor JA-14 y adaptadores especiales para viales.
En esta centrifugación los datos fueron íos siguientes: r = 1 4 c m N = 5000 rpm, obteniendo un valor de RCF igual a 3913 x g
7. El sobrenadante se vertió en otro vial de 2 ml y se guardó en congelación a -18 OC. Las muestras se prepararon un día antes de su análisis .en el cromatógrafo, al igual que los estándares mixtos.
de 2 ml.
vlolumen ajustable de 10 a 50 pI Oxford", modelo P 5058-2.
6. Se calculó el valor de la fuerza centrífuga relativa utilizando la Ec, # 4
Las muestras se inyectaron por duplicado en cantidades de 3 p1 cada una. Entre muestra y muestra se inyectaba 1 pI de ácido fórmim concentrado (Baked Analyzed, 88 %), para acidificar la columna.
' .
4. Determinación fotocolonmétrica de diacetilo
El diacetilo producido fue determinado por un método fotocolorimétrico basado en el de Voges Proskauer (McFaddin, 1980), modificado para analizar solamente diacetilo y no acetoina. El cambio consistió en utilizar una solución de KOH al 1 % (para apenas dar un medio alcalino), en lugar de 4056, que se usa para oxidar a la acetoína.
16
Reactivos
Solución de a- naftol al 1 % en alcohol-agua (32) Se pesaron 2 g de a-naflol disolviendo en 120 ml de etanol absoluto, la solución se aforó a 200 ml con agua destilada. Se adicionaron 2 g de carbón activado, se tapó y se agito regularmente durante una hora para eliminar el color. Se filtró al vacío con papel Whatman No. 2 y se filtró nuevamente sin vacío con papel del mismo número. Finalmente, se guardó en un frasco ámbar, por un máximo de tres días, conservando en refrigeración y al resguardo de la luz.
Solución de KOH al 1 % y creatinina al O. 3% Se disolvieron por separado 2 g de KOH y 0.6 g de creatinina en agua destilada hervida y fría, se juntaron estas disoluciones y se aforaron a 200 ml. Se guardó al abrigo de la luz y en refrigeración.
Solución estándar de diacetilo para la curva estándar Se preparó una solución acuosa de 60 pg de diacetilo por mililitro para lo cual se partió de una solución de diacetilo de 10 mglml previamente preparada. Se tomó 1 ml de la solución de diacetilo, se vertió en un matraz aforado de 200 ml y se aforó con agua destilada.
O Método para desarrollo de la curva patrón de diacetilo para análisis fotocolorimétrico
Se realizó una curva estándar tal como se indica en el Cuadro No. 7. Se añadieron a una serie de tubos, de 150x20 mm, de O a 1 ml de la solución estándar de diacetilo, obteniendo concentraciones de 0-60 pg/tubo. Posteriormente se afiadió agua desionizada, luego se adicionó la solución de a- naflol y la solución de KOHlcreatinina y se agitaron los tubos durante 10 seg después de cada adición en un vórtex Lab-line Instruments modelo Super-Mixer. Se leyó la'absorbancia a 530 nm en un espectrofotómetro Jenway modelo 6105 U:V:Nis., después de exactamente 15 minutos de reposo.
Método para el análisis de diacetilo fotocolorimétrico en los matraces de fermentación
Para analizar las muestras, se tomó 1 ml del sobrenadante de cada caldo de cultivo centrifugado, y se vertió a los tubos de ensayo en lugar de la solución de diacetilo. Posteriormente se procedió como con el tubo no. 5 del Cuadro No. 7 a partir del paso No. 2.
17
Cuadro No. 7 Desarrollo de color de la curva patrón de diacetílo
por análisis fotocoioiirn6trico
Tubo No.
Concentración de diacetilo (p9/ml)
1 Solución de diacetilo (mi)
2 Agua destilada (mi)
3 Solución a-naftol (mi)
4 Agitar con vórtex
5 Solución de KOH 1% ) creatinina al O 3% (mi)
6 Agitar con vórtex
7 Colocar canicas
8 Reposar en la obscuridad
9 Leera530nm
O
2.0
2
2
-
- 1
I_
6
o. 1
1.90
2
2
-
18
- 2 - 15
0.25
1 75
2
2
-
- 3
_.
30
1.50
1.50
2
2
-
4 - 45
3.75
1.25
2
2
-
- 5
- 60
1 .o
1 .o
2
2
-
Volumen o
.o- 1
2
4
6
Reactivos
Acido 3 3 dinitrosalicílico NaOH Na2S03 Fenol Agua destilada, hervida y fría
Procedimiento
1. Se pesó y se mezcló cada reactivo hasta la dilución completa, en el orden indicado en el Cuadro No. 8.
2. La solución se aforó a 100 ml con agua destilada, hervida y fria, se conservó en frasco color ámbar hasta el momento de sul iso. La solución no debe guardarse más de 24 h.
Cantidad
1 O0 1 O0 O 05 o 20 1 O0
(9)
PreparaciÓn.de la solución estándar de glucosa
Procedimiento I . 2. Se deshidrataron aproximadamente 1.5 g de glucosa en una estufa a 60" C,
hasta peso constante, colocando la muestra en un desecador. 3. Se pesó exactamente 0.1000 g de glucosa anhidra en balanza analítica
OHAUS GalaxyTM 160. Se disolvió la glucosa en un vaso de precipitados de 100 ml conteniendo aproximadamente 50 ml de agua destilada.
4. Esta solución se vertió en un matraz volumetrico de 100 ml, lavando con pequeñas porciones de agua destilada.
5. La solución se aforó a 100 ml con agua destilada. Esta solución se preparó en el momento de su uso.
0 Desarrollo de color en la curva estándar de glucosa
El desarrollo de color para la curva estándar se llevó a cabo de acuerdo al procedimiento del Cuadro No. 9 en tubos de ensayo de 15 x 150 mm.
20
Fundamento En presencia de calor el ácido 33 dinitrosalisilico se reduce a ácido 3-amino-5 nitrosalisilico por los azúcares reductores presentes, desarrollándose un color amarillo café
1. Se adicionó a cada tubo la solución de glucosa con pipeta automática Gilson@ modelo P500, en las cantidades indicadas en el Cuadro No. 9.
2. Se agregó agua destilada hasta completar un volumen de 1 ml en cada tubo, y se procedió a mezclar en un vórtex Super Mixer, durante 5 seg.
3. Se colocó en cada tubo 1 ml de la solución de DNS previamente preparada con pipetero automático de vidrio Oxford modelo P5058-2 y se mezcló nuevamente durante 5 seg.
4. Los tubos se taparon con canicas para que los vapores de reacción que se generan durante el calentamiento no se evaporen y no arrastren impurezas que pudieran interferir en el desarrollo de color.
5. El calentamiento se efectuó en baño maría a 98 ’ C durante 5 min exactos para que se llevara a cabo la reacción completamente, e inmediatamente los tubos se colocaron en baño de hielo con el fin de detener la reacción.
6. Se adicionó agua destilada con pipeta automática Gilson@ modelo P500 hasta completar un volumen de 10 ml en cada tubo.
7. Se mezcló en vórtex durante 5 seg para que la mezcla se homogeneice y se dejó reposar durante 5 min.
8. La lectura se realizó a 575 nm utilizando un espectrofotómetro JENWAY modelo 6105 U.V.Nis., tomando como blanco el tubo no. 1 de la curva de desarrollo de color.
Preparación de la muestra para determinación de azúcares reductores (Escamilla, 1991)
1. Se efectuó una dilución 1:100, para lo cual se tomó una alícuota de 1 ml de la solución problema (sobrenadante de la centrifugación), y se vertió en un matraz volumétrico de 100 ml, aforando con agua destilada.
2. Se tomó 1 ml de la solución anterior y se vertió en un tubo de ensayo de 20 X 170 mm.
3. Se procedió al desarrollo de color como en la curva estándar a partir de la adición de la solución de DNS.
4. Se calculó la concentración de azúcares reductores interpolando en la curva estándar, previamente ajustada por mínimos cuadrados, y aplicando la Ec.4
X = A (pglml) 100 ml / 1 ml * 1000 ml / I * 1 g/ 1” lo6 pg ........................ Ec.4
X = Contenido de azúcares reductores en (911) A = Valor obtenido de la interpolación en la curva estándar (pgiml)
Cuadro No. 9 Desarrollo de color en la curva estándar de glucosa
para la determinación de azúcares reductores
Tubo No.
Concentración de glucosa ( W W
1. Solución de glucosa (mi)
2. Agua destilada (mi)
3. Mezclado
4. Solución de DNS
5. Mezclado 3. Tapado con canicas
7. Calentamiento a ,bullición
3. Enfriamiento en hielo iasta temperatura ambiente 3. Agua destilada (mi)
IO. Mezclado 11. Reposo
12. Lectura 575 nm
1 -
O
O
1 .o
1 .o
- 8.0
2
200
0.2 -
0.8
1 .o
- 8.0
21
t-
- 5 -
800
0.8 -
0.2
1 .o
-
- 8.0
- 6
1 O00
1 .o -
0.0
1 .o
- 8.0
- Vol. total
(mi)
o - 1.0
0 - 1 0
1 0
2.0
2.0
10.0
10.0
6. Determinación fotocolorimétrica de ácido láctico (Barker y Summerson,l941)
Reactivos
Solución de sulfato cúprico al 20%. Se disolvieron 20 g de sulfato cúprico (CuSOp 5Hz0 “Baker Analyzed, cristales finos) en agua destilada y desionizada y se llevó el volumen a 1 O0 rnl, en un matraz volumetrico
Solución de sulfato cúprico al 4%. Se disolvieron 4 g de sulfato cúprico (CuS04* 5H20 “Baker Analyzed”, cristales finos) en agua destilada y desionizada y se llevó el volumen a 100 ml. en un matraz volumetrico.
Ca(OUJ2 (“Baker Analyzed polvo anhidro pulverizado). Se usa el reactivo directamente.
U2SO4 concentrado (“Baker Analyzed” grado reactivo) . Se usa el reactivo directamente.
*I-
Solución alcalina de p-hidroxidifenilo (1 S % de p-hidroxidifenilo en una solución 0.5 YO de NaOH).
Preparación de la solución estándar de lactato de litio
1. Se deshidrataron aproximadamente 2 g de lactato de litio (C3H5Li03 98% SIGMA, polvo neutro para preparar patrones de ácido láctico) en una estufa (FELISA mod. 242A) manteniéndola a 60° C hasta alcanzar un peso constante.
2. Se pesaron con exactitud 0.500 g de lactato de litio deshidratado en balanza analítica OHAUS, GALAXYTM 160.
3. Se disolvió el lactato en un vaso de precipitados de 100 ml, conteniendo aproximadamente 25 ml de agua destilada y desionizada.
4. Se transfirió la mezcla a un matraz volumétrico de 100 ml, se lavó y se aforó con agua destilada y desionizada.
5. Se tomó 1 ml de la solución anterior con pipeta de vidrio y se transfirió a un matraz volumetrico de 100 ml, aforando con agua destilada y desionizada (obteniéndose una concentración de 50 pgiml).
Nota: todo el material utilizado se enjuagó previamente con agua destilada y desionizada y se secó.
...
22
Preparación de diluciones de lactato para el desarrollo de la curva estándar
Con la solución estándar de lactato de litio se realizaron diluciones intermedias. como se muestra en el Cuadro No 1 O
Solución I Concentración de lactato de litio 5.0
(pglml) 1. Solución estándar de lactato 1 .o de litio de 50 pg/ml (mi) 2. Agua desionizada (mi). 9.0 3. Agitar en vórtex
II 111 IV 12.5 25.0 37.5
2.5 5.0 7.5
7.5 5.0 2.5
Las soluciones del cuadro No. 1 O fueron preparadas el mismo dia de su uso
Desarrollo de color en la curva estándar de lactato
El desarrollo de color para la curva estándar se llevo a cabo en material previamente enjuagado con agua destilada y desionizada. Las indicaciones para cada acción se presentan en el Cuadro No. 11 y se explican a continuación:
1. Se adicionaron las soluciones de lactato o agua con pipeta automática Gilsonn modelo Pipetman 500 en las cantidades serialadas en el Cuadro No. 10 en tubos de 15x1 50 mm.
2. La solución de sulfato cúprico al 20% se adicionó con pipetero automático (Oxford, modelo P5058-2) y se mezcló agitando en vórtex (Lab-Linc. Instruments, Mod. Seper-Mixer) por 30 seg.
3. El agua desionizada se adicionó con pipeta automática Gilson" modelo Pipetman 500.
4. Se agregó el carbonato de calcio con ayuda de una microespátula y se agitó en vórtex inmediatamente, se dejó reposar durante 30 min. a temperatura ambiente, agitando ocasionalmente con el vÓrtex.(si no hay color azul se agrega más carbonato de calcio antes de desarrollar color).
5. Los tubos se centrifugaron en una centrifuga Solbat, modelo J-12 a 5000 rpm (9) durante 1 O min.
6. De la parte de en medio del sobrenadante, se tomó una alícuota de 1 ml con pipeta automática Gilson" modelo Pipetman 500, traspasándose a tubos de ensayo de 20x1 70 mm.
23
Cuadro No. 11 Procedimiento de desarrollo de color en la curva estándar de glucosa
Tubo No.
para la determinación de lactato
O I 2 3 4 5
Lactato (pg/tubo)
(50 w/ml) 1 . Soluci6n de lactato
Tubo No.1
O 10 25 50 75 1 O0
2.0 2.0
Tubo No. II Tubo No. 111 Tubo No. IV
2.0 2.0
2.0
24
- lol. tota
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
2.0 3.0
10.0 10.0 10.0
-
1.0
El valor de la fuerza centrifuga relativa RCF (9) se calculó utilizando la siguiente ecuación
RCF (9) = 11.18 x r x (N/1000)* .................................. Ec. 5
En esta centrifugación los datos fueron los siguientes: r = 9.14 cm N = 5000 rpm
obteniéndose un valor de RCF igual a 2552.639
7. Se agregó la solución de sulfato de cobre al 4% con pipeta automática marca Brand modelo Trasferpett' y se enfriaron los tubos en baño de hielo durante 10 min aproximadamente. 8. Posteriormente, se agregó a cada tubo ácido sulfúrico concentrado pre-enfriado en hielo con un pipetero automático Oxford modelo P5058-2, con el cuidado de que resbalara por las paredes del tubo lentamente, para evitar que la reacción se iniciara antes del calentamiento; inmediatamente se colocaron en baño de hielo y se mantuvieron en éste, hasta antes del mezclado 9. Se mezcló, agitando en un vórtex Lab-Line Instruments mod.Super Mixer durante 1 O seg. I O . Se taparon los tubos con canicas para evitar la fuga de vapores producidos durante la reacción. 11. Inmediatamente después se procedió a calentarlos en un baño de agua hirviendo. Una vez transcurrido el tiempo indicado (tomado con exactitud), se enfriaron los tubos en un baño de hielo hasta temperatura ambiente. 12. Se agregó la solución de p-hidroxidifenilo con pipeta automática Brand modelo Trasferpette' y se agitaron en vórtex Lab-Line Instruments mod.Super Mixer durante 5 seg. 13. Se taparon los tubos con canicas y se calentaron en un baño de agua estático con control de temperatura Grant,' manteniéndolos a 30%. Los tubos se agitaron a mano a los 15 y 30 min. 14 Los tubos tapados con canicas se volvieron a calentar en un baño de agua hirviendo, para posteriormente enfriarlos en un baño de hielo el tiempo indicado. 15 Los tubos se agitaron en vórtex y posteriormente se dejaron reposar el tiempo indicado. 16 La lectura se efectuó en un espectrofotómetro-Jenway modelo 6105 U:VNis., a 560 nm.
Preparación de la muestra para la determinación colorimétrica de ácido láctico
1. Se agregaron 2 ml de las muestras iniciales en un un matraz aforado de 100 ml, aforando con agua desionizada.
25
2. Posteriormente se tomaron 2 ml de esta solución utilizando pipeta automática Gilson" modelo Pipetman 500 y se continuó con el paso 3 del Cuadro No. 11 para el desarrollo de color.
3. De las muestras finales se tomaron 0.5 ml de la muestra original. aforando a 100ml con agua desionizada, y de esta solución se tomaron 2 rnl para continuar con el desarrollo de color, como se indica en el inciso anterior.
7. Determinación de carbohidratos totales por el método de antrona (Hassid, 1964)
Preparación de la solución de antrona
I . Se pesaron 0.5000 g de antrona (marca Merck con pureza de 99%) en un envase de aluminio y después se coloca en un vaso de precipitados de 100 ml.
2. Se colocó el vaso en un baño de hielo, se adicionaron 75 ml de H2S04 concentrado (marca J.T.. Baker, reactivo analítico de 97.4%) y se disolvió la antrona.
3. La mezcla se transfirió a un matraz volumétrico de 250 ml enjuagando el vaso con pequeñas porciones del ácido sulfúrico concentrado y finalmente se aforó con el ácido mencionado.
4. La solución se vertió a un frasco ámbar. Todo el procedimiento se realizó usando lentes de seguridad y bajo un extractor de aire.
Preparación de la solución estándar de glucosa
1. Se deshidrató aproximadamente 1 g de glucosa en una estufa FELISA modelo 242A a 60°C, hasta peso constante, colocándola posteriormente en un desecador.
2. Se pesaron exactamente 0.2500 g de glucosa anhidra en balanza analítica OHAUS modelo GalaxyTM 160.
3. La glucosa se disolvió en un vaso de precipitados de 100 ml, que contenía aproximadamente 25 ml de agua destilada.
4. La mezcla se transfirió a un matraz volumétrico de 50 ml enjuagando con pequeñas porciones de agua destilada; por Último, se aforó con agua destilada.
5. Se tomaron 0.5 ml con pipeta automática Gilson" modelo Pipetman 500 y se vertieron en un matraz volumétrico de 50 ml, el cual se aforó con agua destilada.
Las soluciones anteriores se prepararon el mismo día de su uso
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Desarrollo de color en la curva estándar
El desarrollo de color para la curva estándar se llevó a cabo en tubos de ensayo de 15 x 150 mm ó 20 x 170 mm . Las indicaciones para cada acción del Cuadro No. 12 se presentan a continuación:
1 . Se adicionó a cada tubo de 20 x 170 mm la solución de antrona con pipetero automático de vidrio Oxford modelo P5058-2 e inmediatamente se colocaron en baño de hielo y se mantienen en éste hasta antes del mezclado en vórtex.
2. Posteriormente se agregó la solución de glucosa, con pipeta automática Gilson modelo P500, en las cantidades señaladas en el cuadro de desarrollo de color. y se tuvo cuidado de que la solución resbalara por las paredes del tubo lentamente para evitar que la reacción se iniciara antes del calentamiento.
3. Se adicionó agua destilada a cada uno de los tubos con el fin de completar un volumen de 7.5 mi.
4. El mezclado en vórtex Super Mixer, se realizó a una velocidad rápida durante 5 seg para evitar que la temperatura se elevara demasiado, provocando una reacción entre los azúcares y el ácido, los tubos se colocaron inmediatamente en baño de hielo.
5. Se taparon los tubos con canicas para evitar que los vapores que se generan durante la reacción se evaporen, o arrastren impurezas que pudieran interferir en el desarrollo de color.
6. El calentamiento se efectuó en baño maría a ebullición durante 10 min exactos para dar lugar a que se dé la reacción química completa.
7. Posteriormente los tubos se colocaron en baño de hielo para detener la reacción, se enfriaron hasta alcanzar la temperatura ambiente y se dejaron en reposo por 10 min.
8. La lectura se efectuó en un espectrofotómetro marca JENWAY modelo 6105 U.V./Vis., a 625 nm, tomando como blanco al tubo No. 1 de la curva de desarrollo de color.
Preparación de la muestra para determinación de carbohidratos totales (Escamilla,l991)
1. Se calentó el caldo no centrifugado en baño Grant a 6OoC por 30 rnin, agitando cada 5 min.
2. Se tomó 1 ml de la solución problema con pipeta automática Gilson@ modelo P500 y se vertió en un matraz volumétrico de 100 ml, aforándolo con agua destilada.
3. Se tomaron 3 ml de la solución anterior y se vertieron en un tubo de ensaye de 20 X 170 mm, adicionando 9 ml de agua destilada de forma que se aproximara a una concentración de 25 pg de carbohidratos totales por ml de caldo de
27
fermentación. Para ambos líquidos se utilizó una pipeta automática Gilsona modelo P500.
4. Se tomaron 2.5 ml de la dilución anterior con la pipeta automática antes mencionada y se colocaron en un tubo de ensayo 20 X 170 mm el cual ya contenia los 5 ml de solución de antrona, pre-enfriada.
5. Se repite el procedimiento como en la curva estándar desde el paso de mezclado en vórtex (paso No. 4 del Cuadro No. 12).
6. Se calculó la concentración de carbohidratos totales interpolando en la curva estándar, previamente ajustada por minimos cuadrados, aplicando la Ec. 6.
X = A (pglml) 12m1/2.5ml *100m1/3ml 1000ml/l * 1g/1x106 pg . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ec.6
Donde: X = Contenido de carbohidratos totales (g/I) A = Valor obtenido de la interpolación en la curva estándar (pg/Tubo)
Cuadro No. 12 Procedimiento de desarrollo de color en la curva estándar
de glucosa para análisis de carbohidratos totales
6. Llevar a ebullición
7. Enfriamiento en hielo hasta temperatura
28
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
El objetivo principal de este experimento fue a determinación del efecto de la temperatura en cultivos mixtos con Pd. pentosaceus y Lb. acidophilus para la formación de diacetilo en un medio de almidón. En cultivos axénicos realizados anteriormente se había intentado evaluar el efecto de la temperatura de incubación, pero al ser sus efectos distintos en cada cepa y cada variable de respuesta, no se había seleccionado un nivel Único (Escamilla, 1996-98).
En la presente serie de cultivos, los valores de pH tuvieron una drástica disminución en las tres temperaturas de incubación evaluadas (Cuadro No. 14), presentándose la máxima variación a una temperatura de 35'C. La producción del ácido láctico también fue importante, pero en este caso la temperatura de 32OC fue la más activa (Cuadro No. 15). El contenido de carbohidratos totales disminuyó muy poco (Cuadro No. 16). probablemente debido al efecto de la intensa acidez; el mayor consumo se presentó a 32% (2.798 911). Los datos reportados para los azúcares reductores se presentan en el Cuadro No. 17, dándose el mejor valor de consumo (-2.76 gll) también a la temperatura de 32OC.
La concentración de almidón soluble en el medio de cultivo utilizado fue baja (5 g/I) debido a que se deseaba proporcionar una cantidad similar a la que se esperaba como consumo; sin embargo, la utilización de almidón fue más baja de lo esperado. siendo la mayor a 28°C (Cuadro No. 18).
En los cultivos axénicos se había determinado que la temperatura no influia significativamente en los consumos de almidón in situ por ambas bacterias, siempre y cuando se tuviera un control de pH, gracias a una cantidad apropiada de CaCO, (Escamilla, 1996-98); pero en los cultivos mixtos, la capacidad de regulación fue sobrepasada por el exceso de ácido producido, con lo que la notable disminución de pH pudo influir en el bajo consumo de almidón en las tres temperaturas, pues las amilacas de las bacterias Iácticas suelen inhibirse a valores de pH menores a 5.0 (Champ et al., 1983; Giraud eta/., 1993; Li and Chan, 1983; Olympia et al., 1995).
No obstante, los datos de consumo de almidón in situ fueron considerados una variable de respuesta en el análisis estadístico de Taguchi. En base al análisis de varianza (Cuadro No. 19) y al cálculo de contribuciones porcentuales realizados (Cuadro No. 20), se deduce que la temperatura si influyó significativamente en el consumo de almidón in situ. La ecuación de estimación de medias indicó que la temperatura de 28°C fue la que favoreció el mayor cambio de esta variable (Cuadro No. 21 ); pero dadas las circunstancias discutidas previamente, es más apropiado decir que a esa temperatura se inhibió menos el mnsumo del almidón.
En la formación del diacetilo evaluado a partir de la técnica fotocolorimétrica de Voges - Proskauer (Cuadro No. 22), se presentó una mayor producción a la temperatura de 32%.
29
Cuadro No. 13 Cambio de volumen del caldo en los cultivos sumergidos mixtos
con Pd. penfosaceus y Lb. acidophilus en medio de almidón,
Nivel Iniciales Finales Diferencia Yo
de T ( g 4 ( 1 (Fin- Inic.) del
(“1 X S Ti S ( 9 4 inicial
28 92 O 88 5 IO 7071 -3 5 3 80
32 92 O 84 5 I3 5356 -7 5 8 15 35 92 O 85 5 +3 5356 -6 5 7 07
-
Nivel E Cuadro No. 14
Cambio de pH en los cultivos sumergidos mixtos con Pd. pentosaceus y Lb. acidophilus en medio de almidón
Iniciales Finales Diferencia Yo
(gN (d1) (Fin- Inic.) del
2 S ii S (9/1) inicial
6.73 10.0141 4.69 40.0071 -2.03 30.24
6.73 +0.0141 4.6 i0.0141 -2.13 31.65
6.73 40.0141 4.58 40.0283 -2.15 31.95
30
Nivel
de T
("C)
28
32
35
Iniciales
(gil) - X S
O O O O
O O
Cuadro No. 15 Cambio de ácido láctico en los cultivos sumergidos mixtos
con Pd. pentosaceus y Lb. acidophilus en medio de almidón.
Finales Diferencia
(gN (Fin- Inic.)
x S (glU
2 95 N 1388 2 95 3 08 +O 1558 3 08 2 56 +O 0648 2 56
Nivel de i
W ) 28
32
35
Cuadro No. 16 Cambio de carbohidratos totales en los cultivos sumergidos mixtos
con Pd pentosaceus y Lb acidophilus en medio de almidón
Iniciales Finales Diferencia %
(sn) (@I) (Fin- Inic.) del
x S ii S (@I) inicial
9908 M0833 7913 io1062 -1 995 20 1
9908 M0833 7110 io0727 -2 798 28 2
9908 MOO833 7296 io0858 -2 612 26 4
31
Cuadro No. 17 Cambio de azúcares reductores en los cultivos sumergidos mixtos
con Pd. penfosaceus y Lb. acidophilus en medio de almidón.
Nivel Iniciales de T
("C) í< S
28 4835 io0489
32 4835 a0489
35 4835 +o0489
(dl 1 Finales Diferencia Qh
(sN (Fin- Inic.) det
3 S (@I) inicial
3 130 +o 0622 -1 705 35 3
2 073 a 0622 -2 761 57 1 2 406 io0978 -2 428 50 2
Nivel Iniciales
(@I) de T
("C)
28 5.07
32 5.07
35 5.07 .
32
Finales Diferencia %
(@U (Fin- Inic.) del
4.78 -0.2902 5.7
5.04 -0.0369 0.7 4.89 -0.1836 3.6
(sn) inicial
;j, ""(O
o m
m
Cuadro No. 22 Cambio en la concentración de diacetilo (por Voges - Proskauer)
en los cultivos sumergidos mixtos con Pd. pentosaceus y Lb. acidophilus en medio de almidón.
Nivel 1 Iniciales I Finales 1 Diferencia 1 % I
- (“C) X S x S (WN inicial
28 1.175 10.168 3.4923 k0.5687 2.3174 197.2
32 I 1.175 1 k0.168 I 4.0412 110.2394 1 2.8662 I 243.9 I 35 I 1.175 I ‘0.168 I 3.9192 I k0.3006 2.7443 233.6
35
Interesaba conocer los contenidos de los ácidos grasos volátiles (A.G.V.) porque en un perfil de nota aromática tipo mantequilla, estos no deben sobrepasar los niveles de aceptación sensorial. La producción del ácido acético fue menor en estos cultivos mixtos (Cuadro No. 23) que la de los cultivos axénicos (Escamilla, 1996-98); aunque en todos los casos, este ácido predominó sobre los otros volátiles. Algunas cepas de Pd. pentosaceus no son capaces de producir ácido acético (Rodriguez y Manca 1995b), pero otras lo forman en un nivel muy bajo, como 40 mgil (Rodriguez y Manca, 1994). Las temperaturas de mayor producción de los otros dos A.G.V. presentados en los Cuadros No. 24 y 25 fueron diferentes, siendo 35°C para el ácido propiónico, y 28°C para el butirico.
Joshi et ai. (1989) determinaron que en el dhokla, que es un alimento fermentado hindú a base de cereales y leche con aroma tipo mantequilla, ,el contenido de A.G.V, que resultó más aceptable sensorialmente fue de 605.6 mgil, valor muy superior al máximo acumulado en el cultivo mixto a 35OC (200.6 mg/l). Algunas bacterias lácticas que forman diacetilo también producen A.G.V., como se observó en la maduración de quesos parcialmente substituidos con leche-mantequilla, encontrando un efecto del grado de substitución y del tiempo de maduración en el incremento de esos compuestos (Joshi y Thakar,l993); otro dato importante fue que el mejor nivel de A.G.V. se alcanzó en esos 'quesos a los 9,000 mg/Kg, y el rechazo a los 22.800 mglKg.
Como el diacetilo es el compuesto más importante en el aroma tipo mantequilla, el mayor interés en estos cultivos mixtos fue determinar la temperatura que favoreciera su formación. A pesar de que el consumo de los carbohidratos fue bajo (Cuadros No. 16, 17 y 18), la formación de diacetilo fue más elevada (Cuadro No. 26). La mayor producción se observó a 32"C, que es un nivel de temperatura que no se habia utilizado en los cultivos axenicos de Pd. pentosaceus (Escamilla, 1996-98). Los datos de diacetilo producido (Cuadro No. 26) constituyeron la variable de respuesta en el análisis estadístico de Taguchi, con el arreglo ortogonai L-9 del Cuadro No. 1. El análisis de varianza (Cuadro No. 27) y el cálculo de contribuciones porcentuales aplicados (Cuadro No. 28) demostraron que la temperatura tuvo una alta significancia en estos cultivos. La ecuación de estimación de medias confirmó que el mejor nivel fue el de 32°C (Cuadro No. 29).
. .
En estos cultivos mixtos, la mejor temperatura de producción de diacetilo fue ligeramente superior al rango Óptimo de crecimiento de Pd. pentosaceus, que está entre 28 - 30°C (Krieg y Holt, 1986); lo que es peculiar, pues otras bacterias Iácticas mesofilicas han producido mayores cantidades de diacetilo a 18 - 24% en cultivos axénicos (Escamilla et a/., 1996a; Green y Manning, 1982; Yadav y Srinivasan, 1985). La presencia de Lb. acidophilus mar& la diferencia al elevar la temperatura Óptima del presente sistema, probablemente porque como su amilasa extracelular tiene mayor actividad a 35"C, ésta pudo aumentar la disponibilidad de productos de hidrólisis del almidón.
36
Cuadro No. 23 Cambio de ácido acético (por C.G.L.) en los cultivos sumergidos mixtos
con Pd. penfosaceus y Lb. acidophilus en medio de almidón.
Nivel iniciales Finales I Diferencia I YO
de T (mgW (mgll) (Fin- Ink) del
("C) X S ji S (mg/l) inicial
28 50.5800 110.91 79 4241 I14 52 28.8440 57 03
-
I 32 I 50.5800 1 110.91 I 105.2488 I 15.10 I 54.6687 I 108 08 I 35 I 50.5800 I 110.91 99.2025 I1 1.21 48.6224 96.13
Cuadro No. 24 Cambio de ácido propiónico (por C.G.L.) en los cultivos sumergidos mixtos
con f d . pentosaceus y Lb. acidophilus en medio de almidón.
I Nivel I Iniciales I Finales I Diferencia I % I de T (msn) (mgll) (Fin- Inic.) del
("C) 2 S x S (mgll) inicial
28 57.1277 O 59.9479 +1 .O7 2.8203 4 94 I 32 I 57.1277 1 O I 60.4889 I i11.95 I 3.3612 I 5.88 I 35 57.1277 O 67.21 62 k3.83 10.0885 17.66 I
37
Cuadro No. 25 Cambio de ácido butírico (por C.G.L.) en los cultivos sumergidos mixtos
con Pd. pentosaceus y Lb. acidophilus en medio de almidón.
Nivel
de T
("C)
28
32
35
Iniciales Finales Diferencia %
(mg4 (mgN - (Fin- Inic.) del
ii S ii s (mg4 inicial
31 3132 O 40 1200 I1 92 8 8068 28 13 31 3132 O 34 3210 k0 40 3 0078 9 60 31 3132 O 34 1454 +o o 2 8322 .9 04
Nivel
de T
("C)
28
32
35
Iniciales Finales Diferencia %
(m9ll)
x S
15.0325 fl.97 15.0325 . k1.97
15.0325 k1.97
38
(mgW (Fin- Inic.) del
E S (mgW inicial
31.4867 e.20 16.4542 109.46
38.1242 k4.59 23.0916 153.61 33.9540 ~ d.50 18.9214 125.87
m m
El tipo de substrato tiene influencia en la producción de diacetilo por Pd. pentosaceus; en este sentido, la leche no parece ser muy eficiente, pues en investigaciones en donde se han utilizado cepas de esta especie con iniciadores mixtos para quesos, si bien se han logrado desarrollar aromas agradables atribuidos a la proteólisis, la producción de diacetilo ha sido muy pobre o nula (Martins et al., 1979; Tzanetakis et, ai., 1991; Vafopoulou et al., 1990), Por otro lado, en los estudios de caracterización de la cepa utilizada en el presente trabajo, se observó una.formaciÓn del volátil nula o muy débil cuando se utilizaron glucosa o almidón, como fuentes aisladas de carbono (Verde et ai., 1995), pero al conjuntar ambas en el mismo medio de cultivo, como en la presente serie, Pd. pentosaceus ha producido niveles notablemente más elevados de diacetilo. De manera similar, la producción de este compuesto se ha observado en las fermentaciones Iacticas mixtas de otros productos amiláceos como el dhokla, alcanzando un contenido de 2.03 mgíKg (Escamilla et ai.. 1996b; Joshi et al., 1989); también en ciertos alimentos tradicionales mexicanos de maíz, como el pozo1 y el atole de maíz agrio, que presentaron una nota aromática a mantequilla, detectada por medio de análisis sensorial (Escamilla et ai., 1996b) o en productos tipo yoghurt a base de soya, con un contenido de diacetilo de 80 WgíKg, que fue de 3.8 veces la del yoghurt normal (Granata y Morr, 1996).
Se calcularon las cuentas viables de bacterias en cada uno de los inóculos axénicos de Pd. pentosaceus y de Lb. acidophilus; estos datos se muestran en el Cuadro No. 30. En base a estos datos y en el tamaño del inóculo utilizado (0.5% de dcepa). se calcularon las cuentas viables iniciales de los cultivos principales; para Pd. pentosaceus, fue de 9.46 x lo5 y para Lb. acidophilus, de 8.89 x l o 4 U.F.C./ml. La suma de ambas se muestra como cuenta viable inicial en el Cuadro No. 31. En las muestras finales se determinaron las cuentas viables totales (Cuadro No. 31), ya que no fue posible diferenciar la morfología colonial de las dos bacterias: colonias puntiformes, borde entero, lisas, brillantes y formando un halo de acidificación pequeño, observable gracias al indicador verde de bromo - cresol. El mejor incremento se presentó a 32OC, teniendo un valor notablemente mayor que el menor, ocurrido a 35OC, por lo tanto, se deduce que el crecimiento microbian0 también fue influenciado por la temperatura.
De manera comparativa, una cepa de Pd. pentosaceus estudiada por Rodriguez y Manca (1995a) fue inhibida por la producción excesiva de acidez y de peróxido de hidrógeno (H202) de un lactobacilo; en el presente trabajo es poco probable que el Hz02 formado por Lb. acidophilus hubiera inhibido al pediococo, ya que este Último produce una pseudocatalasa que descompone a los peróxidos (Verde et a/, 1995); pero la excesiva acidez sí pudo inhibirlo.
Los valores promedio de C.V. que se muestran en el Cuadro No. 32 fueron generalmente aceptables; aunque se observó que el correspondiente al ácido acético sí sobrepasó el IO% , debido a que el método analítico dio resultados más variables a
41
Inóculo
Pd. pentosaceus
Lb. acidophilus
ii S (UFClml) (UFClml)
1.64 X 10' ~ 1 . 2 2 ~ 1 0 ~
1.55X107 1-7 07 X l o 4
42
Nivel
deT
("C)
28
32
35
Iniciales Finales Diferencia %
(UFClml) (UFClml) (Fin- Inic) del
i-c iz S (UFClml) inicial
1.O3X1O6 5.65X106 +4.95 X lo5 4.62 X l o6 446.02
1 . 0 3 ~ 1 0 ~ 1 . 2 8 ~ 1 0 ~ k3.18X 10' 1.18X lo7 1136.69
1.O3X1O6 1.49X106 21.21 x io5 4.51 x lo5 43.55 -
Cuadro No. 32 Coeficientes de variación de los análisis
I Parámetro
Volumen (mi)
IpH Acido láctico (gll)
Carbohidratos totales (gll)
Azúcares reductores (911)
Almidón (gll)
Diacetiloa (gll)
Acido acéticob (mgli)
Acido propihicob (mgll)
Acido butiricob (mgll)
Diacetilob (mgli)
Cuenta viable (U.F.C.1ml)"
Coeficiente de variacibn (%) 2.28
0.32
4.10
1.10
2.51
-_--_
11.04
14.00
2.64
1.53
9.87
5.45 I b) Determinado por cromatografia gas-líquido. c) U.F.C.lrn1: unidades fonadoras de colonias por mililitro del caldo de cultivo.
concentraciones bajas, como las determinadas en las muestras iniciales. El C.V. del análisis de diacetilo fotocolorimétrico también presentó un valor mayor al 10%.
En el presente sistema mixto fue evidente que la temperatura de 32OC favoreció las variables relacionadas directamente con el crecimiento microbiano, como son las cuentas viables, el consumo de glucosa y los rendimientos de los ácidos láctico y acético. También favoreció la producción de diacetilo, pero a diferencia de los primeros, la relación del diacetilo es indirecta, pues en este caso influyeron los consumos simultáneos de glucosa libre y de los productos de hidrólisis del almidón. También se observó en este caso que la excesiva acidificación no inhibió la síntesis de diacetilo, como lo hizo con el consumo de almidón.
El diacetilo formado por fermentación Iáctica alcanza normalmente un nivel de 0.5 a 20 mglKg en los productos lácteos, nivel muy superior a su umbral de detección oifativa, que varía entre 5 y 50 pgíkg, dependiendo del alimento en el que se encuentre y de la sensibilidad del jurado (Escamilla et al., 1996b). Por otro lado, la aromatización artificial con nota tipo mantequilla que se aplica a diversos alimentos (repostería, botanas, confitería, productos lácteos formulados, etc.), suele tener un nivel de diacetilo en el rango de 100 - 300 mglKg, y después de las pérdidas por los procesos, se reduce a un contenido apropiado (Escamilla et al., 1996b). La concentración alcanzada a 32°C en el cultivo mixto de este trabajo (134.76 rrigli) se ubicó dentro del rango mencionado.
VI. CONCLUSIONES
Se determinó d n estos cultivos mixtos que la mejor temperatura para la formación del diacetilo fue de 32°C; con lo que se cumplió con el objetivo principal de esta serie de experimentos
Los consumos de glucosa y los rendimientos de cuentas viables, de ácido láctico, de ácido ac6tico y de diacetilo respondieron a las temperaturas de incubación con tendencias similares, indicando que hay una relación metabólica entre ellos, aunque la producción de diacetilo no dependió únicamente del consumo de glucosa, sino también del consumo de almidón.
En los tres cultivos se obtuvieron niveles elevados de acidez, que disminuyeron el consumo de almidón en relación a los cultivos axénicos, pero no los rendimientas de diacetilo, que fueron superiores a los observados en los cultivos axénicos.
Los elevados niveles de diacetilo formados en estos cultivos mixtos, justifican el interés de determinar algunos factores de preparación y fermentación de una materia prima amilácea con nota aromática tipo mantequilla, que en un futuro
44
pueda ser usada (previo desarrollo tecnológico) en la formulación de varios alimentos procesados.
VII. RECOMENDACIONES
O Si se desea realizar un cultivo mixto con Lb. acidophilus y Pd. penfosaceus en un medio de almidón con el objetivo de formar diacetilo, se recomienda utilizar una concentración de almidón soluble menor a la utilizada en esta serie de experimentos(5 gil) para disminuir los contenidos residuales.
O Se recomienda tener un mejor control de pH (con Caco3), si se desea realizar un cultivo mixto con Pd. penfosaceus y Lb. acidophilus en un medio de almidón, ya que una notable disminución del pH influye en el consumo de almidón debido a que las amilasas de las bacterias Iácticas suelen inhibirse a valores de pH menores a 5.0.
O El papel del almidón en la biosíntesis del diacetilo por Pd. penfosaceus aún está por aclararse, realizando posteriormente una investigación básica en el área bioquímica, que sale de la estructura del presente trabajo.
45
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