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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Trabajo de Grado Presentado previo a la obtención del Título de Médico
Veterinario Zootecnista
“Detección de Encephalitozoon cuniculi en conejos (Oryctolagus
cuniculus) mediante identificación de anticuerpos a través de (Elisa) en
ocho centros de expendio en el Distrito Metropolitano de Quito.”
ANA JACQUELINE GUERRERO ECHEGARAY
TUTOR
Dr. Richard Roberto Salazar Silva
Quito, mayo 2016
ii
DEDICATORIA
A Dios, porque todo lo puedo en el que me fortalece.
María Fernanda Guerrero, donde estés sé que estas orgullosa de mi.
Con amor
Ana Jacqueline Guerrero Echegaray
iii
AGRADECIMIENTOS
A mis padres, Soraya Echegaray, por estar a mi lado en todo momento. A mi
familia por inculcarme sus enseñanzas y valores, Alicia Echegaray quien es
una bendición en mi vida, le agradezco por sus oraciones y consejos a lo
largo de mi vida.
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central
del Ecuador y su personal docente quienes me formaron como profesional y
persona, gracias por impartirme sus conocimientos y su sincera amistad.
Un agradecimiento especial a mi Tutor, Doctor Richard Salazar, quien con
su apoyo y cariño dirigió este proyecto y a mis cotutores, Doctora Susana
Gallo quien con su conocimiento y paciencia ha sido fundamental en la
culminación de esta investigación. Al Doctor Fernando Pazmiño gracias por
su dedicación y palabras de apoyo que han sido de gran ayuda en este
trabajo.
Un sincero agradecimiento al Laboratorio Veterinario del INSPI, por su
apoyo y facilidades para la utilización de los laboratorios, en especial al
Doctor Gustavo Salgado.
Al laboratorio de patología General de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador, al Doctor Sergio Chacha
por su contribución en el área de histología.
iv
A mis amigos, por todos los momentos compartidos a lo largo de nuestra
formación profesional. Finalmente quiero agradecer a Santiago Salazar, por
ser mi apoyo y mi confidente.
Gracias
Ana Guerrero.
v
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORIA INTELECTUAL
Yo, ANA JACQUELINE GUERRERO ECHEGARAY, en calidad de autora del
trabajo de investigación o tesis realizada sobre “Detección de
Encephalitozoon cuniculi en conejos (Oryctolagus cuniculus) mediante
identificación de anticuerpos a través de (Elisa) en ocho centros de
expendio en el Distrito Metropolitano de Quito”, por la presente autorizo a
la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los
contenidos, que me pertenecen, que consta esta obra, con fines
estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo
establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de
Propiedad Intelectual y su reglamento.
En la ciudad de Quito, a_____________________ del 2016.
_______________________________
Ana Jacqueline Guerrero Echegaray
C.I. 1720764735
vi
INFORME DEL TUTOR
En carácter de tutor del Trabajo de Grado, presentado por la señorita ANA
JACQUELINE GUERRERO ECHEGARAY, para optar por el Título o Grado
de Médico Veterinario y Zootecnista, cuyo título es “Detección de
Encephalitozoon cuniculi en conejos (Oryctolagus cuniculus) mediante
identificación de anticuerpos a través de (Elisa) en ocho centros de
expendio en el Distrito Metropolitano de Quito”, considero que dicho
trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a
presentación pública y evaluación por parte del tribunal asignado.
En la ciudad de Quito, a_____________________ del 2016.
______________________________
Dra. Richard Roberto Salazar Silva
C.I. 170760345
vii
viii
x
ÍNDICE GENERAL
DEDICATORIA ------------------------------------------------------------------------------------------------------ ii
AGRADECIMIENTOS --------------------------------------------------------------------------------------------- iii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORIA INTELECTUAL ------------------------------------------------------------ v
INFORME DEL TUTOR ------------------------------------------------------------------------------------------- vi
ÍNDICE GENERAL -------------------------------------------------------------------------------------------------- x
LISTA DE FIGURAS -----------------------------------------------------------------------------------------------xiii
LISTA DE CUADROS --------------------------------------------------------------------------------------------- xiv
Resumen ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- xv
Abstract ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ xvi
CAPÍTULO I ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
INTRODUCCIÓN ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
CAPITULO ll --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4
REVISIÓN DE LITERATURA --------------------------------------------------------------------------------------- 4
Definición: ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4
Antecedentes históricos ----------------------------------------------------------------------------------------- 5
Cuadro 1. Acontecimientos en torno al descubrimiento de Encephalitozoon cuniculi ---------- 5
Taxonomía ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6
Morfología ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6
Estructura de las esporas: --------------------------------------------------------------------------------------- 7
Ciclo biológico ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 8
Hospedadores ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 10
Patogénia --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10
Presentación en el conejo------------------------------------------------------------------------------------- 11
Signos Neurológicos -------------------------------------------------------------------------------------------- 11
Signos Oculares -------------------------------------------------------------------------------------------------- 12
Presentación clínica en el hombre -------------------------------------------------------------------------- 12
Ocurrencia en el humano ------------------------------------------------------------------------------------- 13
Epidemiología ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 13
xi
Prevalencia de E.cuniculi en Latinoamérica y el mundo ----------------------------------------------- 13
Diagnóstico ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 15
Serológico --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 15
Histológico -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 15
Molecular --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 17
Tratamiento ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 17
CAPÍTULO III ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 19
METODOLOGÍA -------------------------------------------------------------------------------------------------- 19
Descripción de la zona de estudio -------------------------------------------------------------------------- 19
Localización ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 19
Condiciones meteorológicas: -------------------------------------------------------------------------------- 19
Materiales y Equipos ------------------------------------------------------------------------------------------- 22
Factores en estudio --------------------------------------------------------------------------------------------- 23
Tipo de investigación: ------------------------------------------------------------------------------------------ 23
Diseño de la investigación: ----------------------------------------------------------------------------------- 23
Población objeto de estudio ---------------------------------------------------------------------------------- 23
Procedimiento de la Investigación -------------------------------------------------------------------------- 23
PRUEBA SEROLÓGICA ELISA --------------------------------------------------------------------------------- 25
Preparación del diluyente (PBS- T) -------------------------------------------------------------------------- 25
Preparación de las muestras. -------------------------------------------------------------------------------- 25
Protocolo ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 25
Cálculos e Interpretaciones para (ELISA). ----------------------------------------------------------------- 27
MÉTODO DE TINCIÓN TRICRÓMO DE MASSON--------------------------------------------------------- 27
Procedimiento: -------------------------------------------------------------------------------------------------- 28
Análisis estadístico ---------------------------------------------------------------------------------------------- 30
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 31
CAPÍTULO IV ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 32
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ----------------------------------------------------------------------------------- 32
CAPÍTULO V ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 38
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ------------------------------------------------------------------- 38
xii
Conclusiones ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 38
Recomendaciones----------------------------------------------------------------------------------------------- 39
BIBLIOGRAFÍA ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 40
ANEXO 1 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 43
REGISTRO 1: IDENTIFICACIÓN DE LOS ANIMALES SELECCIONADOS -------------------------------- 43
ANEXO 2 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 44
REGISTRO: 2 RESULTADOS DEL ANÁLISIS SEROLÓGICO ELISA --------------------------------------- 44
ANEXO 3 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 45
REGISTRO 3: RESULTADOS DEL ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO DE ENCÉFALO -------------------- 45
ANEXO 4 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 46
RESULTADOS DEL ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO DE RIÑON ----------------------------------------------------- 46
ANEXO 5 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 47
HOJA DE TRABAJO (ELISA) ------------------------------------------------------------------------------------------ 47
ANEXO 6 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 48
RESULTADOS (ELISA) ------------------------------------------------------------------------------------------- 48
ANEXO 7 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 49
FOTOGRAFÍAS ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 49
ANEXO 8 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 51
INFORME DE RESULTADOS HISTOPATOLÓGICOS EN CORTES DE RIÑON Y ENCEFALO ---------------- 51
xiii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA pág
Fig. 1. Espora de E.cuniculi y sus estructuras internas22¡Error! Marcador no
definido.
Fig. 2. Ciclo biológico de Encefalitozoon cuniculi.¡Error! Marcador no
definido.
Fig. 3. Conejo con sintomatología nerviosa adquirido en Centro de Expendio
¨La Ofelia¨ ........................................................ ¡Error! Marcador no definido.
Fig.4 Alteraciones histológicas en cortes de riñón y encéfalo. ........... 31¡Error!
Marcador no definido.
Fig.5.Centros de expendio ubicados en el Distrito Metropolitano de Quito. .. 20
Fig. 6. Porcentaje de seropositividad de E. cuniculi en conejos (Oryctolagus
cuniculus) en 8 centros de expendio del distrito Metropolitano de Quito. ... 32
Fig.7.Porcentaje de seropositividad de E. cuniculi en conejos (Oryctolagus
cuniculus) según el centro de expendio de procedencia. ............................ 34
xiv
LISTA DE CUADROS
CUADROS pág
Cuadro 1. Acontecimientos en torno al descubrimiento de Encephalitozoon
cuniculi ........................................................................................................ 205
Cuadro 2. Clasificación taxonómica de Encephalitazoon Cuniculi .............. 216
Cuadro 3.Hospedador y Distribución Geográfica de E.cuniculi en Europa.
......................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Cuadro 4. Centros de expendio del Distrito Metropolitano de Quito
seleccionados para el presente estudio. ....................................................... 36
Cuadro 5. Interpretación de resultados de la tinción de tricrómo de Masson
en cortes de riñón y encéfalo. ....................................................................... 45
Cuadro 6. Detección de anticuerpos contra Encephalitozoon cunuculi en 8
centros de expendio del Distrito Metropolitano de Quito. .............................. 47
Cuadro 7. Análisis complementario histopatológico, corte en riñón de los
animales que resultaron positivos a (Elisa). .................................................. 50
Cuadro 9. Análisis complementario histopatológico, corte en cerebro. ......... 52
xv
DETECCIÓN DE ENCEPHALITOZOON CUNICULI EN CONEJOS
(ORYCTOLAGUS CUNICULUS) MEDIANTE IDENTIFICACIÓN DE
ANTICUERPOS A TRAVÉS DE (ELISA) EN OCHO CENTROS DE
EXPENDIO EN EL DISTRITO METROPOLITANO DE QUITO
Autora: Ana Jacqueline Guerrero Echegaray
Tutor: Dr. Richard Salazar
Fecha: Abril, 2016
Resumen
A fin de detectar Encephalitozoon cuniculi, en esta investigación se
obtuvieron muestras sanguíneas de un total de 40 animales de 8 Centros de
expendio del Distrito Metropolitano de Quito, las cuales fueron procesadas
para obtener suero sanguíneo y fueron analizados mediante Inmuno ensayo
enzimático (Elisa). Los resultados obtenidos muestran que 12 animales
correspondiente al 30 % que son seropositivos para E. cuniculi, con el
objetivo de complementar la investigación, los 12 animales que resultaron
positivos fueron eutanasiados y se les realizó una prueba histológica
mediante tinción tricrómica protocolo de Masson en cortes de riñón y
encéfalo, de lo que se obtuvo un total de 100% de animales con atrofia
glomerular en riñón y un 8% con infiltración granulomatosa en cerebro, lo que
nos indica la presencia del parasito, sin embargo no se logró observar
esporas correspondientes a E. cuniculi
xvi
Palabras clave: Encephalitozoon cuniculi, conejos, suero sanguíneo, tinción
tricrómica protocolo de Masson.
CUNICULI ENCEPHALITOZOON DETECTION IN RABBITS
(ORYCTOLAGUS CUNICULUS) BY IDENTIFICATION OF ANTIBODIES
THROUGH (ELISA) DISPENSING CENTERS IN EIGHT IN THE
METROPOLITAN DISTRICT OF QUITO
Abstract
To detect Encephalitozoon cuniculi, blood samples in this study was obtained
from a total of 40 animals of 8 outlay centers of Distrito Metropolitano de
Quito, which were processed to obtain blood serum and they were analyzed
by enzyme immune assay (ELISA). The results show that 12 animals
corresponding to 30% are seropositive for E.cuniculi, with the aim of
complementing research the 12 animals that tested positive were euthanized
and they performed a histological test by trichrome Masson protocol in kidney
and brain cuts what was obtained a total of 100% of animals with kidney
glomerular atrophy and 8% with granulomatous infiltration brain, which
indicates the presence of the parasite, however it fails to observe
corresponding spores to E. cuniculi
Keywords: Encephalitozoon cuniculi, rabbits, blood serum, staining protocol
Masson trichrome.
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
La encephalitozoonosis es una enfermedad zoonótica causada por el
protozoario Encephalitozoon cuniculi, que es un parásito intracelular
obligado, oportunista, perteneciente al orden Microsporidia del phylum
Microspora, caracterizado por producir esporas infectantes. (Barrantes &
Alfaro ,2015; Dipineto et al., 2008).
Este microorganismo tiene amplia distribución mundial y con gran variedad
de huéspedes, siendo el conejo (Oryctolagus cuniculus) el mayor reservorio,
pero además se presenta en roedores silvestres y de laboratorio, carnívoros,
rumiantes, primates no humanos, y el hombre. Las especies de microsporidio
identificadas en el hombre son Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon
intestinalis (antes Septata intestinalis), Encephalitozoon hellem y
Encephalitozoon cuniculi (Barrantes & Alfaro ,2015; Dipineto et al., 2008).
2
La carne de conejo es apetecida por sus propiedades organolépticas, y por
ser baja en grasa y colesterol, con un alto porcentaje proteico. La producción
de carne de conejo a nivel global en el período comprendido entre los años
2002 al 2005 fue 1,1 millones de toneladas, siendo los países con mayor
producción China, Italia, España y Francia. A nivel de Latinoamérica,
Argentina ocupa el décimo noveno lugar ya que en este país se considera
mascota (Vieira ,2009;citado por Cury, Martínez, Aguas, & Olivero, 2011).
Redondo (2006) demostró que el 13.8 % de estudiantes de la Universidad de
Sevilla no consumían carne de conejo por motivos emocionales y morales. A
pesar de tratarse de una fuente proteica alternativa para el consumo
humano, esta información respalda la tendencia creciente de mirar al conejo
como animal de compañía.
En el Ecuador anualmente el 98% de un total de 800.000 animales son
destinados al consumo de carne y el 2% se ocupa como mascota. El 50%
de la producción nacional se localiza en las provincias Tungurahua,
Pichincha, Chimborazo, Imbabura y Cotopaxi (Fiallos, 2009; citado por
Tipantasig, 2014).
Por tanto, la interacción del conejo con el humano a partir de la crianza,
producción, comercialización, consumo o mantenimiento como mascota,
constituye un factor de riesgo considerable para el contagio de E.cuniculi
debido al estrecho contacto que conllevan estas actividades (Macías &
Heuze, 2005).
3
Por estas razones, es importante destacar el potencial zoonósico de E
cuniculi, ya que se transmite mediante esporas presentes en la orina, heces,
alimentos contaminados y por el consumo de carne contaminada de conejo.
El riesgo es mayor en personas inmunológicamente deprimidas y
desnutridas, como en aquellas que padecen de inmunodeficiencia adquirida
VIH SIDA, produciendo inflamación, necrosis hepática, enteritis severa,
peritonitis, nefritis túbulo-intersticial, cistitis, bronquitis, neumonía, conjuntivitis
y sinusitis, constituyendo así un problema de salud pública (Macías & Heuze,
2005; Rodríguez et al., 2001; Deplazes, Mathis, Baumgartner, Tanner, &
Weber, 1996).
El propósito de la presente investigación fue detectar Encephalitozoon
cuniculi en conejos (Oryctolagus cuniculus) aparentemente sanos o con
sintomatología clínica mediante técnicas de laboratorio en ocho centros de
expendio del Distrito Metropolitano de Quito. Los objetivos planteados en la
investigación fueron: Identificar anticuerpos de Encephalitozoon cuniculi
mediante Elisa, utilizar pruebas histológicas y Tinción de azul de tricrómo
como análisis complementario de Encephalitozoon cuniculi a partir de cortes
de tejidos de riñón y cerebro en los animales que resulten positivos a Elisa.
4
CAPITULO ll
REVISIÓN DE LITERATURA
Definición:
La Encephalitazoonosis es una enfermedad parasitaria causada por el
microsporidio Encephalitazoon spp, que es un protozoario intracelular
obligado, oportunista, que se caracteriza por producir esporas infectantes,
tiene amplia distribución mundial, afecta principalmente al encéfalo y riñón de
sus hospedadores que pueden ser roedores silvestres y de laboratorio,
carnívoros, rumiantes, primates no humanos, y el hombre (Edgar et al.,
2011).
5
Antecedentes históricos
Cuadro 1. Acontecimientos en torno al descubrimiento de
Encephalitozoon cuniculi
Año Autor Acontecimiento
1922 Wright y Craighead Descubrimiento de protozoario
asociado a Meningo-Encefalitis
en mamíferos.
1923 Levaditi et al ., Denomina al protozoario como
Encefalitozoon cuniculi.
1962 Nelson Confirma E.cuniculi como
microsporidio.
1959
Matsubayashi et al ., Aisló por primera vez Nosema
cuniculi de sangre, líquido
céfalo raquídeo y orina de un
niño japonés de 9 años con
meningo-encefalitis febril.
1988 Cali,Canning,Weber,
Bryan
Hallazgos y descripción de
nuevos géneros y especies en
el hombre.
1995 Dier et al., Mediante estudios genéticos y
moleculares se han detectado
tres tipos de cepas de E
cuniculi: I=conejos, II=ratón,
lll=perro.
Fuente:(Albelo & Cañete, 2000)
6
Taxonomía
Cuadro 2. Clasificación taxonómica de Encephalitazoon Cuniculi
Dominio Eucariota
Reino Fungi
Filo Microsporidia
Familia Encephalitozoonidae
Genero Encephalitazoon
Especie Cuniculi
Fuente: (Rodríguez-Tovar et al., 2016)
Morfología
Espora
La espora es la forma infecciosa de E.cuniculi, Son pequeñas, ovaladas y
miden entre 1.0 y 1.5 x 2.0 a 2.5 um es muy resistente al medio ambiente,
característica importante de este Phyllum. Pueden sobrevivir fuera de la
célula hospedadora debido a que están rodeadas de una pared gruesa
formada por tres capas: Una capa externa o exospora constituida por
glicoproteínas, una capa interna formada por quitina llamada endospora y
una membrana plasmática que recubre el citoplasma que es el material
infeccioso, como se observa en la Figura. 1 (Frasen y Muller, 2001; citado en
Chilón, 2014).
7
Estructura de las esporas:
• Citoplasma o Esporoplasma
• Núcleo
• Vacuola
• Disco de anclaje
• Polaroplasto (Aparato de Golgi atípico)
• Vacuola posterior
• Tubo polar
Fuente. M.C. Javier Pineda Murillo (2014).
Fig. 1. Espora de E.cuniculi y sus estructuras internas
8
Ciclo biológico
El parásito presenta un ciclo de vida directo con una duración de entre 3 a 5
semanas, los hospedadores se infectan por ingestión o inhalación de las
esporas excretadas por la orina, heces y por vía transplacentaria (Miguel &
Vargas, 2009).
Después de la ingestión, el ooquiste entra al epitelio intestinal del anfitrión u
hospedador donde la espora sufre una serie de divisiones merogónicas y
esporogónicas dando lugar a los esporontes que se localizan en una vacuola
parasitófora o aislados en el citoplasma. El esporonte sufre un proceso de
maduración llamado esporulación el cual culmina con la formación de nuevas
esporas que por vía sanguínea llegan a otros órganos de colonización como
hígado, pulmones, cerebro y riñones (Didier, 2004).
Un mes después de la infección, el conejo comienza a eliminar las esporas a
través de la orina o deposiciones, continuando hasta por tres meses y
posiblemente por intervalos de por vida. (Dykes y Davies, 2004; citado en
Marchant, 2004).
9
Fuente: Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 2014.
Fig. 2. Ciclo biológico de Encephalitozoon cuniculi.
Merogónia
También llamada fase proliferativa o asexual, en esta fase el tubo polar se
desenrolla en el momento de invasión de la célula del huésped, penetrando
la membrana plasmática y permitiendo que el esporoplasma infectante sea
inyectado. Una vez que el esporoplasma ingresa a la célula hospedadora, los
merontes aumentan en número (Didier ES, Stovall ME, Grenn LC, Brindley
PJ, 2004; citado por Chilón, 2014).
10
Esporogónia
Es la fase de maduración o fase sexual, donde el meronte se convierte en
esporontes, esta se caracteriza por la formación de una capa superficial
densa y engrosada. Los esporontes se multiplican por fisión binaria y se
dividen en esporoblastos, los que finalmente, se convertirán en esporas
maduras (Didier ES, Stovall ME, Grenn LC, Brindley PJ, 2004; citado por
Chilón, 2014).
Hospedadores
El principal reservorio de E.cuniculli es el conejo (Oryctolagus cuniculus), sin
embargo, es capaz de infectar a otros mamíferos tales como roedores,
carnívoros, rumiantes, primates no humanos y al humano (Mathis et al.,
2005; citado en Chilón, 2014).
Patogénia
Las esporas que infectan al huésped por vía oral llegan al intestino y se
transportan a la circulación sistémica. Los órganos diana iniciales son
aquellos que requieren de gran flujo de sangre como pulmones, hígado,
riñones y encéfalo (Macías & Heuze, 2005).
11
Presentación en el conejo
La mayoría de los animales infestados por E.cuniculi son asintomáticos pero
cuando se observan signos clínicos por lo general son de tipo neurológico.
En la mayor parte de animales la presentación es de forma súbita y
generalmente después de un evento estresante (Jordán et al., 2006; citado
por Chilón, 2014).
Signos Neurológicos
Los signos pueden variar en severidad, desde inclinación y temblores de la
cabeza, ataxia, caminata en círculos, nistagmo, movimientos de rotación del
eje longitudinal del cuerpo, convulsiones, hemiparesia, parálisis, cambios de
comportamiento como agresión y automutilación Chillón (2014) como se
observa en la Figura 3.
Fuente: La Autora (2015).
Fig. 3. Conejo con sintomatología nerviosa adquirido en Centro de
Expendio ¨La Ofelia¨
12
Las alteraciones macroscópicas causadas por E.cuniculi en los riñones
pueden ser observadas post mortem, estas son: Cicatrices y superficie
irregular. Dentro de las alteraciones microscópicas principalmente se observa
glomerulonefritis, atrófia glomerular y nefritis intersticial (Chillón, 2014).
Signos Oculares
La enfermedad ocular es común en conejos infectados con E.cuniculi, la
uveítis facoclástica presente se caracteriza por un nódulo inflamatorio blanco
adherido al lente que se extiende a la cámara anterior y a la úvea anterior.
El parasito causa la ruptura de la cápsula del lente, provocando salida de
material del mismo produciendo así esta patología (Varga 2014; citado por
Barrantes & Alfaro, 2015).
Presentación clínica en el hombre
La Encefalitozoonosis es considerada una zoonosis potencial para humanos
inmunodeprimidos o muy jóvenes. Sin embargo estudios más recientes han
demostrado que es capaz de infestar tanto a personas inmunodeprimidas
como a humanos competentes.(Barrantes & Alfaro, 2015).
Los síntomas característicos son pérdida de peso, causada por la mala
absorción y diarrea acuosa, abundante, no sanguinolenta, sin mucosidades
ni leucocitos, puede ocasionar deshidratación y debilidad marcada. Algunas
veces se puede presentar anorexia y dolor abdominal concomitante con
colangitis causada por el parásito, manifestándose con dolor en el cuadrante
superior derecho del abdomen (Botero y Montoya, 2002; citado por Marchant
et al., 2007).
13
Ocurrencia en el humano
En muestreos de poblaciones humanas en Perú, se ha detectado la
presencia de anticuerpos contra E cuniculi hasta en un 5%, principalmente
en personas inmunodeprimidas (Chillón, 2014).
Epidemiología
Prevalencia de E.cuniculi en Latinoamérica y el mundo
Según varios estudios realizados en Latinoamérica se puede inferir que la
prevalencia en poblaciones de conejos mantenidos como mascota es
elevada, de igual forma ocurre en explotaciones cunícolas y bioterios. Esto
no se observa en poblaciones de conejos silvestres.
A nivel de Latinoamérica, Argentina y Cuba se informan prevalencias entre
50 y 70% en explotaciones cunícolas y bioterios causando pérdidas
económicas e interfiriendo en el desarrollo de trabajos de investigación
(Rodríguez et al., 2001).
En poblaciones de conejos mascotas del norte de Inglaterra, los rangos de
seroprevalencia son altos, con valores entre 37% a 68% de animales
positivos, a diferencia de poblaciones de conejos silvestres en las cuales la
prevalencia es menor (Harcourt-Brown, 2004).
14
E. cuniculi es uno de los microsporidios con mayor potencial zoonótico en los
animales domésticos, por esta razón la Asociación Federal Europea de
Laboratorios de Ciencia Animal (FELASA), ha recomendado realizar
monitoreos periódicos en conejos de laboratorio y granja (Macías & Heuze,
2005)
Cuadro 3 Hospedador y Distribución Geográfica de E.cuniculi en
Europa.
Cepa de E.
cuniculi
Hospedador Área Geográfica
l ( Cepa Conejo ) Conejo
Humano
Suiza, Estados Unidos, Alemania,
Italia, Japón.
Suiza, Estados Unidos, Italia.
II (Cepa ratón) Ratón, Rata,
Lobo Silvestre
Republica Checa, Reino Unido,
Estados Unidos
Noruega, Finlandia.
lll (Cepa perro) Perro Estados Unidos Sudáfrica.
Fuente: (Mathis, Weber & Deplazes, 2005)
15
Diagnóstico
Serológico
La detección serológica de anticuerpos es de gran valor diagnóstico en
Encephalitozoonosis, ya que es la herramienta diagnóstica más sensible
durante la etapa temprana de la enfermedad. La seroconversión se puede
demostrar 2 meses antes de que los organismos intracelulares aparezcan
en los tejidos y 4 semanas antes de encontrar lesiones histopatológicas en
riñón (Csokai et al ., 2009; citado por Chilón 2014).
Histológico
Ciertos cambios histológicos en riñón y encéfalo son indicativos de la
presencia de E.cuniculi en conejos. Las esporas intracelulares pueden ser
identificadas post mortem en secciones de tejidos de riñón y encéfalo como
se observa en la Figura 4. Si se emplean métodos de tinción de rutina como
eosina- hematoxilina la detección de las esporas resulta difícil debido a su
tamaño, por lo que se deben usar métodos específicos como tinción
cromotrópica, Ziehl Neelsen Modificado, inmunoflorescencia o tinción
quimiofluorescente (Weber et al ., 2000; citado por Chillón (2014).
16
A. Meningoencefalitis
mononuclear severa
B .Encefalitis granulomatosa
multifocal severa
C. Necrosis, Infiltrado
inflamatorio
granulomatoso
Fuente:(Barrantes & Alfaro, 2015)
D. Infiltrado inflamatorio
perivascular
E.SNC Esporas Parasitarias F. Ojo: uveítis
facoclástica severa.
Infiltrado inflamatorio
granulomatoso.
Fuente:(Barrantes & Alfaro, 2015)
Fig.4 Alteraciones histológicas en cortes de riñón y encéfalo.
A B C
D E F
17
Molecular
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha utilizado para la
confirmación rápida y precisa de E. cuniculi en conejos. Sin embargo, tanto
las muestras de orina como las de líquido cefalorraquídeo analizados
mediante esta técnica han resultado poco fiables (Chilón, 2014).
Se puede obtener buenos resultados si se utiliza el material orgánico
adecuado, como material del cristalino de conejos con uveítis facoclástica, en
el cual se han observado resultados satisfactorios, probablemente debido a
una mayor concentración de esporas en el cristalino que en el resto de
tejidos (Chilón, 2014).
Tratamiento
No existe un protocolo estándar establecido para el tratamiento de conejos
infestados con E. cuniculi, este depende del curso que tome la infestación.
Sin embargo, en conejos infestados tratados con fenbendazol por vía oral a
dosis de 20mg/kg/día, durante 28 días, no se logró aislar el organismo.
Por esta razón se ha considerado al fenbendazol como el medicamento de
elección para la prevención y tratamiento de Encephalitoozonosis en
conejos. (Suter et al,. 2001) Citado por Marchant (2004).
18
El fenbendazol interfiere en la asimilación de la glucosa, evitando su
integración en forma de glucógeno, de tal forma que se altera la producción
de energía. Altera la morfología de los huevos y evita la eclosión de la larva
(Sumano, 2007).
Se usan corticoides para reducir la inflamación causada por la multiplicación
en el cerebro. Sin embargo el uso de corticoides es polémico debido a su
efecto inmunosupresor, el cual podría afectar los mecanismos de defensa del
animal contra E.cuniculi. (Chilón, 2014).
19
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
Descripción de la zona de estudio
Localización
El estudio fue realizado en ocho centros de expendio de la provincia de
Pichincha. En el cuadro 4 se detallan los centros de expendio donde se
realizó el presente estudio y en la Figura 5 podemos observar la ubicación.
Condiciones meteorológicas:
Temperatura anual: de 16°C a 26°C
Humedad relativa: oscila entre 50 y 80(%).
(INAMHI, 2015).
20
Fig.5.centros de expendio ubicados en el Distrito Metropolitano de Quito
.
Fuente: Google Maps (2015).
1 Las
cuadras
2 Mayorista
3 Chiriyacu
4 San
Roque
5 La Ofelia
6 Calderón
7 Pintag
8 Tumbaco
Red Vial
Red vial
Provincial
Limitación
D.M.Q
N
22
Materiales y Equipos
Materiales de Oficina:
Resma de papel
Esferográficos
Tablero
Calculadora
Materiales Tecnológicos
Computador
Internet
Materiales de Laboratorio
Mandil
Guantes de manejo
Mascarillas descartables
Tubos de ensayo tapa roja
Jeringas 1ml
Kit Elisa para la detección de anticuepos contra EC
Placas porta objetos
Placas cubre objetos
Medio de Montaje
Químicos de Tinción
Casset Histológicos
Centrifuga
Microscopio
23
Factores en estudio
Determinación de anticuerpos contra E.cuniculi, mediante Elisa
Interpretación de alteraciones en cortes histológicos de riñón y
encéfalo.
Tipo de investigación:
Observacional de tipo transversal
Diseño de la investigación:
Población objeto de estudio
La población objetivo estuvo conformada por los conejos (Oryctolagus
cuniculus) de ocho centros de expendio del Distrito Metropolitano de Quito, la
población en estudio fueron 5 conejos de cada centro de expendio del distrito
Metropolitano de Quito.
Procedimiento de la Investigación
1. Adquisición de 40 conejos (Oryctolagus cuniculus) adquiridos en 8
centros de expendio del Distrito Metropolitano de Quito.
2. Registro de datos de los animales muestreados correspondientes a
edad sexo y procedencia, se llevaron en el registro 1(anexo 1).
24
3.Recoleccion de 1.5 ml de sangre de cada animal en frascos sin
anticoagulante, mediante punción de la vena yugular, previamente se
administró a los conejos 0.01mg/kg de maleato de acepromacina y
3mg/kg de tramadol por vía Intramuscular para tranquilización y pre
anestesia previo a la eutanasia.
4. Las muestras sanguíneas fueron rotuladas y centrifugadas a 2500
rpm para la extracción de suero y congeladas a -8°C para su
procesamiento.
5. El protocolo de eutanasia de los animales en estudio, se realizó
mediante la aplicación de 1mg/kg de maleato de acepromacina y
10g/kg de tramadol por vía Intramuscular para la tranquilización y
control del dolor, finalmente se administró clorhidrato de ketamina a
dosis de 40mg/kg vía IM como dosis letal, este procedimiento se
realizó tomando en cuenta la especie, edad y estado de salud de los
animales (Close et al., 1997).
6. Las muestras fueron transportadas al Laboratorio Veterinario del
INSPI donde se procesó el kit comercial de Elisa contra anticuerpos de
E.cuniculli para el diagnóstico serológico basado en el protocolo
suministrado por Medicago AB Laboratorio.
25
PRUEBA SEROLÓGICA ELISA
Preparación del diluyente (PBS- T)
1. Diluir dos tabletas de PBS- T en 1000 ml de agua destilada desionizada.
Preparación de las muestras.
1. Cambiar las puntas de las micropipetas para cada muestra, registrar
cuidadosamente la posición de cada muestra de suero.
2. Realizar una dilución 1:40 del suero de cada muestro con el diluyente
PBS- T
3. Mezclar y colocar en los pocillos cubiertos con el antígeno.
4. Hacer una dilución 1:100 de los controles positivos y negativos,
mezclar con el diluyente, y colocar en los pocillos con el antígeno.
5. Hacer una dilución 1:1000 del conjugado junto con el diluyente PBS-
T.
6. Mesclar y colocar en todos los pocillos
Protocolo
1. Lavar cada pocillo una vez, antes de su uso, con el diluyente.
2. Colocar la placa según la especificación de la hoja de trabajo.
(ANEXO 6).
3. Distribuir 100 microlitros del control negativo diluido (N) en el pocillo
A1, B1y A2, B2.
4. Distribuir 100 microlitros del control positivo diluido (P) en el pocillo C1,
D1 y C2, D2.
26
5. Distribuir 100 microlitros de cada muestra de suero diluido, en los
pocillos restantes.
6. Sellar las placas e incubar durante 60 minutos a temperatura
ambiente.
7. Vacíe el plato y lávelo tres veces con 350 microlitros de PBS-T,
Golpee el plato boca abajo sobre una toalla de papel para vaciarlo por
completo, evitar que se seque el plato entre lavados o antes de añadir
el conjugado.
8. Distribuir 100 microlitros de conjugado HRP de anticuerpo secundario
diluido en cada pocillo.
9. Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente.
10. Repetir el paso 7.
11. Distribuir 100 microlitros de sustrato líquido TMB en cada pocillo.
Golpear suavemente para mezclar.
12. Incubar 15 minutos a temperatura ambiente.
13. Distribuir 50 microlitros de Solución Stop en cada uno de los pocillos
para detener la reacción.
14. Medir y leer en Absorbancia de 450 (A 450) para las muestras y los
controles.
Para que los ensayos se consideren como válidos se deben cumplir los
siguientes requisitos:
El valor medio de absorción del control negativo (N) para los pocillos
cubiertos de antígeno debe ser menor o igual a 0,200. (A 450)
El valor de absorción del control positivo (P) para los pocillos
cubiertos de antígeno debe ser mayor de 0,800 (A 450).
27
Cálculos e Interpretaciones para (ELISA).
La muestra A450 de suero/ muestras de control.
Si este valor excede a 2 se considera positivo a EC.
Si este valor es menor a 2 la muestra se clasifica como negativa para EC.
MÉTODO DE TINCIÓN TRICRÓMO DE MASSON
Esta técnica de tinción se usó como análisis complementario para la
observación de alteraciones histológicas en cortes de riñón y encéfalo
causados por E.cuniculi en los animales que resultaron positivos a (Elisa).
Se les realizó eutanasia mediante las ”Pautas Éticas Internacionales”
establecidas por Consejo Internacional de Organizaciones Médicas (CIOM)
(Yunta, 2012).
28
Procedimiento:
1. Extracción de cerebro y encéfalo con las debidas normas de bioseguridad
del Laboratorio de Patología General de la Facultad de Medicina Veterinaria
y Zootecnia de la Universidad Central Del Ecuador.
2. Se realizaron cortes de 1mm de cada tejido se fijaron en formol al 10%
durante 24 horas.
3.Envio de cortes al Instituto de Patología donde se realizó la inclusión de los
cortes en parafina y se continuó con el protocolo de Masson el cual se detalla a
continuación.
1. Cortar las muestras a 5 µm de diámetro y adhesión al portaobjetos con
goma.
2. Realizar 2 repeticiones durante 10 minutos cada una en xileno para
desparafinar.
3. Sumergir 2 veces en Etanol 100%
4. Sumergir en Etanol 96%
5. Sumergir en Etanol 80%
6. Sumergir en Etanol 50%
7. Sumergir 5 min en agua destilada
8. Sumergir 3 por 3 min en agua destilada
9. Sumergir 5 min en Hematoxilina Ferrica de Weigert
10. Sumergir 5 min en Agua corriente para diferenciación.
11. Lavar por 3 min en agua destilada
12. Sumergir 5 min en Fuscina Escarlata
13.Lavar 2 min en agua estilada
14.Sumergir 15 min en ácido fosfomolibdico al 5% en agua destilada
15. Sumergir 10 min en azul de anilina
16. Sumergir 15 seg en agua destilada
29
17. Sumergir 3 min de diferenciación ácido acético al 1% en agua
destilada
18. Deshidratar en etanol (graduación creciente) 80% 96%y 100%
19. Sumergir 2 veces por 10 min en xileno.
Preparación Fuscina Escarlata
90 ml de Escarlata de Biebrich
Al 1% de Agua Destilada
9 ml Fuscina Acida de solución acuosa al 1% en agua destilada
1ml de ácido acético glacial
Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud (2014).Atlas de histología animal
y vegetal. Obtenida el 18 de noviembre del 2015.
30
Cuadro 5. Interpretación de resultados de la tinción de tricrómo de
Masson en cortes de riñón y encéfalo.
Tejido Coloración
Colágeno verde azulado
Citoplasma Rosado
Espora Roja
Fuente:(Dto. de Biologia Funcional y ciencias, 2014)
Análisis estadístico
Se utilizará la técnica de Muestreo a criterio (Muestreo no Probabilístico),
cuyo tamaño de muestra será obtenida según la cantidad de animales
necesarios para detectar una enfermedad en una población. Con los
siguientes parámetros:
El número de centros de expendio donde se quiere determinar la
enfermedad se tomará al azar.
Se deben muestrear 5 animales por cada centro de expendio para
determinar que un centro es positivo con un 95% de probabilidad.
31
Los datos obtenidos fueron clasificados en tablas de Excel 2010 y se realizó
un cálculo de frecuencias expresadas en porcentaje e interpretados en
tablas dinámicas con la siguiente fórmula:
x = Porcentaje
n= Tamaño de la población total
A=Número de animales analizados de los cuales se desea conocer el
porcentaje.
32
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuadro 6. Detección de anticuerpos contra Encephalitozoon cunuculi
en 8 centros de expendio del Distrito Metropolitano de Quito.
Centro de
expendio
Número de
animales
Detección
de
Anticuerpos
(+) (-)
Porcentaje
(%)
(+)
Porcentaje
(%)
(-)
Las cuadras 5 0 5 0 12.5
Mayorista 5 0 5 0 12.5
Chiriyacu 5 3 2 7.5 5
San Roque 5 2 3 5 7.5
La Ofelia 5 5 0 12.5 0
Calderón 5 2 3 5 7.5
Pintag 5 0 5 0 12.5
Tumbaco 5 0 5 0 12.5
40 12 28 30 70
33
Fig. 6. Porcentaje de seropositividad de E. cuniculi en conejos
(Oryctolagus cuniculus) en 8 centros de expendio del distrito
Metropolitano de Quito.
En el cuadro 6, de un total de 40 animales muestreados 12 resultaron
seropositivos a la prueba serológica ensayo inmunoenzimático (ELISA), lo
que indica que el porcentaje de infestación en conejos (Oryctolagus
cuniculus) es del 30% mientras que el 70% corresponde al porcentaje de
animales negativos a la infestación. (Anexo 6).
Este hallazgo confirma la existencia de E.cuniculi en conejos destinados
tanto como mascota, crianza y comercialización.
34
En contraste con la Figura 6. En estudios realizados en Latinoamérica se
registran porcentajes mayores de seropositividad como en Lima-Perú en la
Universidad Nacional Mayor de San Marcos con un porcentaje de
56.6%.(Chilon 2014). En Chile con 52% de animales positivos diagnosticados
mediante técnicas de colaboración Tinción Gram y Cromotrópo (C. Marchant,
2004).
Fig.7.Porcentaje de seropositividad de E. cuniculi en conejos
(Oryctolagus cuniculus) según el centro de expendio de procedencia.
17%
25%
42%
17%
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
40,00%
45,00%
Calderón Chiriyacu Ofelia San Roque
POSITIVO
35
Según el lugar de procedencia, el centro de expendio ¨La Ofelia¨ presentó el
mayor porcentaje de seropositividad correspondiente al 42 %, (5) animales,
seguido del centro de expendio ¨Chiriyacu¨ con 25%(3), ¨Calderón¨ y ¨San
Roque¨ con 17% de seropositividad (2) animales.
Cuadro 7. Análisis complementario histopatológico, corte en riñón de
los animales que resultaron positivos a (Elisa).
Número de
animales
Centro de
expendio
Observación
de espora
(+) (-)
Porcentaje
(%)
Alteración
Chiriyacu 3 0 3 0 Atrofia Glomerular,
Glomérulo nefritis
San Roque 2 0 2 0 Atrofia Glomerular,
Glomérulo nefritis
La Ofelia 5 0 5 0 Atrofia Glomerular,
Glomérulo nefritis
Calderón 2 0 2 0 Atrofia Glomerular,
Glomérulo nefritis
12 0 12 0
36
Se realizó la tinción tricrómica de Masson a 12 animales que resultaron
positivos a (ELISA) en el Cuadro 7 se puede observar las alteraciones
histológicas encontradas en riñón que fueron atrofia glomerular y glomérulo
nefritis en el 100% de las muestras lo que complementa el estudio ya que
estas alteraciones son causadas por Encephalitozoon cuniculi.
Esto coincide con el estudio realizado en Colombia, en la Universidad de
Antioquía,por otro lado, no se logró determinar la presencia de esporas de
E.cuniculli, si bien es cierto la especificidad de las pruebas histológicas es
alta, para la identificación del parasito, no es sensible para el diagnóstico,
pudiendo así ocasionar falsos negativos (Rodríguez et al., 2001).
Se debe tener en cuenta que el parásito se encuentre cursando una fase del
ciclo biológico donde este aún no invada el sistema renal por tanto no se
encuentren esporas en este órgano (Harcourt-Brown, 2004),además hay que
considerar su difícil observación debido al pequeño tamaño de la espora que
es de 1 a 2 micrones (C. Marchant, 2004).
37
Cuadro 8. Análisis complementario histopatológico, corte de cerebro.
Número de
animales
Centro de
expendio
Detección
de espora
+ -
Porcentaje
(%)
Alteración
Chiriyacu 3 0 3 0 Infiltración
Granulomatosa(1)
San Roque 2 0 2 0 Ninguna
La Ofelia 5 0 5 0 Ninguna
Calderón 2 0 2 0 Ninguna
0 12 0
En el cuadro 8. Se detallan las alteraciones histológicas en cortes de
cerebro, el 100% (12) animales presentaron ausencia de la espora, el 92%
(9) animales no presentaron alteraciones, el 8% (3) animales presentaron
necrosis e infiltrado inflamatorio granulomatoso.
Esto debido a que las lesiones en cerebro producidas por E.cuniculi se
pueden detectar mucho después de la seroconversión, 8 semanas después
de la respuesta de anticuerpos séricos (Chilón Cornejo, 2014).
38
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones
En este estudio se identificó un 30% de seropositividad para
Encephalitozoon cuniculi en conejos (Oryctolagus cuniculus) de un
total de 40 conejos muestreados, en 8 centros de expendio del Distrito
Metropolitano de Quito, empleando la prueba serológica ensayo
inmunoenzimático (ELISA).
Los 12 animales que resultaron positivos a (ELISA) se realizó tinción
de tricrómo de Masson en cortes de riñón y encéfalo como análisis
complementario.
En el 100% de los cortes de riñón se observó atrofia glomerular y
glomérulo nefritis, en el corte de encéfalo no se observaron
alteraciones en el 92% de las muestras, el 8% presentó infiltración
granulomatosa.
No se logró observar la espora de Encephalitozoon cuniculi en cortes
histológicos de riñón y encéfalo.
39
Recomendaciones
Se recomienda realizar el estudio a nivel nacional, con un número
mayor de animales, aislar el parásito y determinar la prevalencia.
Informar a las autoridades gubernamentales sobre la detección de
esta enfermedad para que se determinen medidas de control y
manejo.
Realizar en los centros de reproducción cunícola, un programa de
control y prevención contra Encephalitozoon cuniculi en los animales
reproductores, como parte del cual se puede considerar un análisis
serológico provenientes de otros centros.
Educar a los productores y propietarios de mascotas, con el fin de
realizar un control periódico de sus animales.
40
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43
ANEXO 1
REGISTRO 1: IDENTIFICACIÓN DE LOS ANIMALES SELECCIONADOS
NUMERO FECHA SEXO
M H
EDAD PROCEDENCIA CENTRO DE EXPENDIO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
44
ANEXO 2
REGISTRO: 2 RESULTADOS DEL ANÁLISIS SEROLÓGICO ELISA
NÚMERO DE ANIMAL
NUMERO DE SUERO
FECHA DETECCIÓN DE AC Positivo Negativo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
45
ANEXO 3
REGISTRO 3: RESULTADOS DEL ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO DE
ENCÉFALO
NUMERO DE MUESTRA DETECCIÓN DE ESPORA POR TINCIÓN
Positivo Negativo
HALLAZGOS HISTOLÓGICOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
46
ANEXO 4
RESULTADOS DEL ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO DE RIÑON
NUMERO DE MUESTRA DETECCIÓN DE ESPORA POR TINCIÓN
POSITIVO NEGATIVO
HALLAZGOS HISTOLÓ GICOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
47
ANEXO 5
HOJA DE TRABAJO (ELISA)
Ensayo: __________________ Fecha de ensayo: ______________ Marca: ______________ Vencimiento Kit: _______________ Plato No: _____________
A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
B
C
D
E
F
G
H
Observaciones:
48
ANEXO 6
RESULTADOS (ELISA)
49
ANEXO 7
FOTOGRAFÍAS
Descripción A: Adquisición e identificación
de animales
Descripción. B: Recolección e
identificación de muestras sanguíneas.
Descripción C: procesamiento del kit
comercial de Elisa contra anticuerpos de
E.cuniculli
Descripción D: Placa de Elisa con
sueros de los conejos en estudio.
A B
C D
50
Descripción E: Infiltrado perivascular corte
de cerebro
Descripción F: vaso sanguíneo
linfocitos y neutrófilos en corte de
cerebro
Descripción G: Atrofia Glomerular con
pérdida de la continuidad en corte de riñón.
Descripción H: Congestión e infiltrado
inflamatorio en zona cortical corte de
riñón.
E F
G H
51
ANEXO 8
INFORME DE RESULTADOS HISTOPATOLÓGICOS EN CORTES DE RIÑON Y
ENCEFALO
