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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
Estudio cinético de la biotransformación de d-limoneno para la obtención
de terpenoides mediante el uso de una especie del género Penicillium
Trabajo de titulación, modalidad proyecto de Investigación para la
obtención del título de Ingeniero Químico
Autores: Lovato Granizo Estefanía Carolina
Urbina Quezada Byron Alexander
Tutor: Ing. Andrés Fernando De la Rosa Martínez
Quito, 2019
ii
DERECHOS DE AUTOR
Nosotros, ESTEFANÍA CAROLINA LOVATO GRANIZO Y BYRON ALEXANDER
URBINA QUEZADA, en calidad de autores y titulares de los derechos morales y
patrimoniales del trabajo de titulación ESTUDIO CINÉTICO DE LA
BIOTRANSFORMACIÓN DE D-LIMONENO PARA LA OBTENCIÓN DE
TERPENOIDES MEDIANTE EL USO DE UNA ESPECIE DEL GÉNERO
PENICILLIUM , modalidad proyecto de investigación, de conformidad con el Art. 114
del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS
CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor de la
Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no inclusiva para
el uso no comercial de la obra , con fines estrictamente académicos. Conservamos a
nuestro favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa
citada.
Así mismo, autorizamos a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitación y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 114 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Los autores declaran que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma
de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad
por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la
Universidad de toda responsabilidad.
En la ciudad de Quito, a los 12 días del mes de agosto de 2019.
Firma: Firma:
Estefanía Carolina Lovato Granizo Byron Alexander Urbina Quezada
CC: 0604513150 CC:1727555326
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi calidad de Tutor del Trabajo de Titulación, presentado por ESTEFANÍA
CAROLINA LOVATO GRANIZO Y BYRON ALEXANDER URBINA QUEZADA,
para optar por el Grado de Ingenieros Químicos, cuyo título es: ESTUDIO CINÉTICO
DE LA BIOTRANSFORMACIÓN DE D-LIMONENO PARA LA OBTENCIÓN DE
TERPENOIDES MEDIANTE EL USO DE UNA ESPECIE DEL GÉNERO
PENICILLIUM, considero que este trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para
ser sometidos a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal examinador
que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 12 días del mes de agosto de 2019.
Ing. Andrés Fernando De la Rosa Martínez
DOCENTE-TUTOR
CC: 0401120027
iv
A Dios, por fortalecer mi corazón y
darme la oportunidad de conseguir mi
sueño.
A mis padres, Eduardo y Marina, por su
infinito amor y apoyo constante, por ser
para mi fuente de inspiración y
esfuerzo, agradezco a la vida su
presencia y mis logros se los dedico a
ustedes.
A Sebastián, por ser más que mi
hermano mi amigo, y mi fuente de
alegría constante.
Estefanía
A mis padres Edgar y Fanny por su
aprecio y por fomentarme el valor de
pelear por mis metas, y lo que anhelo.
A mis hermanos, Evelyn y Mauricio
quienes siempre estuvieron cuando se
los necesitaba.
A los que se fueron sin ver este logro,
Gracias de todo corazón.
Byron Fufu Alexander
v
Agradecimientos
A Dios y la Virgen de Baños de Agua Santa por bendecir mi camino, permitiéndome
alcanzar este objetivo tan anhelado.
A mis padres, quienes supieron crear en mí una mujer con fortaleza y tenacidad, que pese
a los obstáculos o sin sabores que se presenten en la vida, sepa levantarse y superarlos
con perseverancia, por enseñarme el gran valor de la convicción, y por darme su amor y
confianza en todo este camino, gracias por ser el pilar que nunca me permitió desfallecer.
A mi hermano Sebastián, quien es motivo de mi alegría y superación, gracias por siempre
estar conmigo, y cuidarme constantemente.
A mis abuelitos Soledad, Félix y Rosita, por su cariño y enseñanzas; tíos, primos, y demás
familiares quienes me han brindado su apoyo y aliento.
A mi tutor Ing. Andres De la Rosa, por la guía y sus conocimientos para que este trabajo
saliera adelante, por ser un gran docente y una excelente persona.
Al Ing. Pablo Londoño, la Ing. Estefanía Villamarin, por su paciencia, tiempo y por
sobretodo ser un apoyo y soporte constante en esta investigación.
A mi familia Rene Chardon, David, Amparito, Ely, Miguel, quienes confiaron en mí
dándome la oportunidad de ejercer esta hermosa profesión, brindándome sus
conocimientos y enseñándome la importancia del compañerismo y trabajo en equipo.
A Byron, gracias Fufu, por ser un excelente amigo y compañero, es un privilegio haber
compartido toda esta investigación contigo, cuenta con mi apoyo siempre que necesites.
A mis amigos y amigas dentro y fuera de la facultad, quienes me han dado innumerables
alegrías, y ha estado en mis mejores y peores momentos, especialmente a Enya, Michelle,
Cynthia, Jhonatan, Jhonny, Fernando, Jean Pierre, Emy, Tannia, Morita, espero tenerlos
siempre en mi vida.
Estefanía
vi
Agradecimientos
Al culminar la travesía llamada universidad, en la que se vive experiencias felices como
devastadoras es necesario mencionar a las personas que hicieron que este final se llegara
a suscitar.
María Auxiliadora de los cristianos mi protectora celestial, quien desde el día de mi
nacimiento fue partícipe de mis victorias como fracasos.
A mis padres, Fanny y Edgar mis viejos que, a pesar de los obstáculos presentados,
sembraron en mi la fuerza para alcanzar mis sueños y de no rendirme a pesar de las
circunstancias. A mis hermanos Mauricio y Evelyn a pesar de rivalidades y peleas
siempre estamos unidos. A mi otra familia Doña Natty, Rafa, Leo y mi mejor amigo de
toda la vida Janji, con los que conviví en muchas ocasiones espero seguir compartiendo
grandes momentos con ustedes.
Al Ing. Andrés De la Rosa, quien con su conocimiento y paciencia supo llevar adelante
este proyecto, y además de ser un excelente docente fue un amigo, quien lucho en todo
momento para alcanzar la meta a pesar de todos los obstáculos que se presentaron.
A la Ing. Carolina Montero, que, a pesar de nunca recibir clases con ella, me brindó su
apoyo intelectual y fue capaz de fomentarme valores y comportarse como docente y
amiga. A los Ing. Pablo Londoño, Ing. Estefanía Villamarín, Ing. Josselyn Alvear e Ing.
Ghem Carvajal, Dr. Ullrich Stahl, Dra. Victoria Cabrera, quienes con su sabiduría,
paciencia y colaboración fueron guía en la culminación de este trabajo, y formarme como
persona y profesional.
Estefi, gracias por acompañarme en este proyecto, y a pesar de las diferencias existentes
supimos llevar juntos este proyecto, nunca nos rendimos y fuimos un excelente equipo,
serás una gran profesional y espero seguir trabajando a tu lado, 5 estrellas excelente
servicio.
A los muchachos que me acompañaron prácticamente en todo este trayecto universitario
los Chkings, Vodkdemia y los Inhibidores, con ustedes se me olvidaba las angustias y los
problemas, grandes anécdotas se vivieron con ustedes.
vii
A mis grandes amigos de la universidad Néstor, Paul, Amaru, gracias por sus consejos y
estar en las buenas y en las malas, espero seguir viviendo momentos inolvidables con
ustedes.
A mis grandes y mejores amigas, confidentes, compañeras, colegas y mis amores Dalis
(flakis), Karly (gordis) y Patty, gracias por siempre acompañarme en todo momento, y
por vivir conmigo grandes experiencias, regañarme cuando lo necesitaba y por su locura
en todo momento, se las quiere un montón.
Morita, eres mi mejor amiga en este transcurso, gracias por eso loca, y ser sincera
conmigo a pesar de lo duro que fuera la realidad y hacer que me lleve con una excelente
persona como es Néstor, te agradezco de todo corazón.
Joss, gracias pequeña por estar prácticamente en todo este trayecto, gracias a ti nunca me
sentí solo, y me ayudaste a seguir adelante pesé cuando quería rendirme y ante todo por
brindarme los mejores recuerdos en esta universidad.
A mis amigos y amigas, Emi, eres una excelente persona a quien siempre te admire por
tu determinación y constancia. Ari, Bryan, Daniela, Fer, Angie, Marie, Jean Pierre, Criss
(mocosa), Santa, Ernesto, Sky quienes agradezco su amistad y los momentos felices y
tristes que supieron acompañarme y hacerme pasar buenos ratos y momentos
inolvidables.
Al departamento de R&D de Pinturas Cóndor, en especial a Cristian, Sabrina, Oswaldo,
Mayra y Vero V., quienes me fomentaron el trabajo en equipo, y me dieron a conocer de
manera práctica lo genial que es la Ingeniería Química. Además, a Marie, Vero M., los
operarios y sobre todo a Jessy quienes conforman el área de producción y las chicas de
calidad de Lamosan, las cuales me dieron la oportunidad de fomentarme en una nueva
experiencia en el campo farmacéutico, gracias por ayudarme en todo momento y a crecer
como persona y profesional inculcándome aptitudes y actitudes.
A la Facultad de Ingeniería Química, donde me forjé como profesional y encontré grandes
amigos, compañeros, docentes con los que conviví momentos alegres, tristes,
emocionantes e imaginables. Gracias totales.
Byron Fufu Alexander
viii
CONTENIDO
1. MARCO TEÓRICO ...................................................................................... 3
1.1. Aceites esenciales .......................................................................................... 3
1.1.1. Composición de los aceites esenciales .......................................................... 3
1.1.2. Fuentes de obtención de aceites esenciales ................................................... 4
1.1.3. Métodos de extracción de aceites esenciales ................................................. 7
1.1.4. Destilación simple con maceración (Hidrodestilación) ................................. 8
1.1.5. Destilación por arrastre de vapor ................................................................... 8
1.2. Terpenos ........................................................................................................ 9
1.2.1. Clasificación de los terpenos ....................................................................... 10
1.2.2. Aplicaciones industriales de los terpenos y terpenoides.............................. 11
1.2.3. Limoneno ..................................................................................................... 13
1.2.4. Productos de la biotransformación de limoneno. ........................................ 14
1.3. Penicillum. ................................................................................................... 15
1.3.1. Morfología del Penicillium. ......................................................................... 16
1.3.2. Ambiente de Pencillium .............................................................................. 16
1.3.3. Condiciones ambientales requeridas para el crecimiento ............................ 16
1.3.4. Investigaciones referentes a la bioconversión del limoneno ....................... 17
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ........................................................ 19
2.1. Extracción de limoneno a partir de las cáscaras de diferentes especies de
naranja.......................................................................................................... 19
2.1.1. Materiales y Equipos ................................................................................... 20
2.1.2. Sustancias y reactivos .................................................................................. 21
2.1.3. Procedimiento experimental para la extracción de limoneno a partir de las
cáscaras de naranja. ..................................................................................... 21
2.1.4. Acondicionamiento de la materia prima. ..................................................... 21
2.1.5. Proceso de Destilación simple con maceración ........................................... 23
2.1.6. Proceso de Destilación por arrastre de vapor .............................................. 24
2.2. Cuantificación del contenido de d-limoneno y componentes del aceite
esencial obtenido. ........................................................................................ 26
ix
2.2.1. Elaboración de la curva de calibración para el análisis del contenido de d-
limoneno de los ensayos realizados. ............................................................ 26
2.2.2. Preparación de muestras para análisis en el espectrómetro de masas GC-MS.
..................................................................................................................... 26
2.3. Determinación de la densidad del aceite esencial de naranja obtenido. ...... 27
2.3.1. Método del picnómetro para la determinación de la densidad del aceite
esencial obtenido. ........................................................................................ 27
2.4. Procedimiento experimental para la selección de medio de cultivo adecuado
para el crecimiento de Penicillium. ............................................................. 28
2.4.1. Materiales y Equipos ................................................................................... 30
2.4.2. Sustancias y reactivos .................................................................................. 31
2.4.3. Procedimiento para la elaboración del medio de cultivo orgánico (Abraham)
para el crecimiento de Penicillium. ............................................................. 31
2.4.4. Procedimiento para la preparación del medio de crecimiento Czapek-Dox 32
2.4.5. Procedimiento para la preparación de la solución de suspensión de esporas
..................................................................................................................... 33
2.4.6. Procedimiento del crecimiento de las esporas en los medios de cultivo
seleccionados. .............................................................................................. 34
2.4.7. Procedimiento para la determinación de la absorbancia del medio de cultivo
por el Espectrofotómetro UV-VIS. .............................................................. 34
2.5. Procedimiento de la Biotransformación de d-limoneno .............................. 35
2.5.1. Materiales y Equipos ................................................................................... 36
2.5.2. Sustancias y Reactivos ................................................................................. 36
2.5.3. Elaboración de la curva de calibración para el consumo de limoneno. ....... 36
2.5.4. Procedimiento para la biotransformación de d-limoneno ............................ 37
2.6. Diseño Experimental ................................................................................... 40
3. DATOS EXPERIMENTALES .................................................................... 42
3.1. Datos experimentales referentes a la extracción de aceite esencial. ............ 42
3.1.1. Identificación de muestras y réplicas. .......................................................... 42
3.1.2. Obtención de aceite esencial. ....................................................................... 43
x
3.2. Datos experimentales referentes al análisis del contenido de d-limoneno en el
aceite esencial. ............................................................................................. 44
3.2.1. Condiciones del GC-MS y método programado al equipo. ......................... 44
3.2.2. Curva de calibración para la determinación del contenido de d-limoneno en
el aceite esencial extraído. ........................................................................... 47
3.2.3. Análisis GC-MS del contenido de d-limoneno para cada ensayo realizado. 47
3.3. Densidad del aceite esencial de naranja. ...................................................... 49
3.4. Datos experimentales referentes a la elección de medio de cultivo para el
crecimiento de Penicillium. ......................................................................... 49
3.4.1. Absorbancias de los blancos para cada medio de cultivo. ........................... 50
3.4.2. Absorbancias de los medios de cultivo a las 24 horas de crecimiento de las
esporas. ........................................................................................................ 50
3.5. Biotransformación de d-limoneno en terpenoides. ...................................... 51
3.5.1. Curva de calibración para el proceso de biotransformación ........................ 52
3.5.2. Consumo de d-limoneno en el proceso de biotransformación. .................... 52
4. CÁLCULOS ................................................................................................ 54
4.1. Extracción del aceite esencial de naranja. ................................................... 54
4.1.1. Porcentaje de Rendimiento de aceite esencial. ............................................ 54
4.1.2. Promedio de los porcentajes de rendimientos para el proceso de destilación
simple y arrastre de vapor. ........................................................................... 55
4.2. Determinación del contenido de d-limoneno presente en el aceite esencial de
la cáscara de naranja lima y naranja dulce. .................................................. 56
4.2.1. Determinación del contenido de d-limoneno en la solución de solvente +
aceite esencial .............................................................................................. 56
4.2.2. Determinación de la concentración de d-limoneno presente en el aceite
esencial. ....................................................................................................... 57
4.3. Determinación de la densidad del aceite esencial. ....................................... 58
4.4. Cálculos referentes a la selección del medio de cultivo para el crecimiento de
esporas de Penicillium. ................................................................................ 59
4.4.1. Absorbancias promedio de los medios de cultivo (Abraham y Czapek-Dox)
..................................................................................................................... 59
xi
4.5. Cálculo de la cinética de biotransformación de d-limoneno. ...................... 60
4.5.1. Cálculo de las concentraciones de d-limoneno en el proceso de
biotransformación ........................................................................................ 61
4.5.2. Cálculo de la velocidad de reacción experimental ...................................... 62
4.5.3. Modelos cinéticos. ....................................................................................... 64
4.5.4. Cálculo de la concentración de d-limoneno teórica. .................................... 66
4.5.5. Cálculo de la velocidad de reacción teórica ................................................ 67
4.5.6. Error existente entre la concentración experimental de d-limoneno y la teórica
..................................................................................................................... 68
4.5.7. Error total generado. .................................................................................... 68
5. RESULTADOS ........................................................................................... 69
5.1. Extracción del Aceite esencial de naranja ................................................... 69
5.1.1. Cuantificación del porcentaje de rendimiento obtenido por destilación simple.
..................................................................................................................... 69
5.1.2. Análisis estadístico de la extracción de aceite esencial de naranja. ............ 72
5.1.2.1. Normalidad de los errores ............................................................................ 72
5.1.2.2. Homogeneidad de varianzas para el rendimiento de aceite esencial ........... 73
5.1.2.3. Influencia de los niveles de la especie de naranja, método aplicado y relación
soluto-solvente en el rendimiento de aceite esencial obtenido. ................... 74
5.1.2.4. Comparaciones múltiples............................................................................. 75
5.2. Contenido de d-limoneno en el aceite esencial obtenido............................. 77
5.2.1. Análisis estadístico del contenido de d-limoneno en el aceite esencial
obtenido. ...................................................................................................... 79
5.2.1.1. Normalidad de los errores en el contenido de aceite esencial. .................... 79
5.2.1.2. Homogeneidad de varianzas en los rendimientos de aceite esencial. .......... 80
5.3. Propiedades fisicoquímicas del aceite esencial de naranja extraído de las
cáscaras de naranja. ..................................................................................... 83
5.3.1. Propiedades fisicoquímicas del aceite esencial de naranja extraído de las
cáscaras de naranja. ..................................................................................... 84
5.4. Resultados Crecimiento Penicillium en medio de cultivo. .......................... 84
5.4.1. Análisis estadístico para el medio de cultivo y concentración .................... 85
5.4.1.1. Normalidad de residuos ............................................................................... 85
xii
5.4.1.2. Homogeneidad de Varianzas ....................................................................... 86
5.4.1.3. Influencia de los niveles de tipo de medio de cultivo y concentración en
relación a las absorbancias. .......................................................................... 87
5.4.1.4. Comparaciones Múltiples. ........................................................................... 88
5.5. Proceso de biotransformación de d-limoneno ............................................. 90
5.5.1. Resultados de la desviación de la concentración experimental con la teórica
..................................................................................................................... 92
5.5.2. Formación de terpenos analizados por Cromatografía de gases y
espectrometría de masas .............................................................................. 92
6. DISCUSIÓN ................................................................................................ 94
6.1. Extracción del aceite esencial ...................................................................... 94
6.2. Crecimiento de esporas de Penicillium en Medios de Cultivos .................. 95
6.3. Biotransformación de d-limoneno a terpenos .............................................. 97
7. CONCLUSIONES ....................................................................................... 99
8. RECOMENDACIONES............................................................................ 101
8.1. Extracción del Aceite Esencial .................................................................. 101
8.2. Selección de medio de cultivo para el crecimiento de Penicillium. .......... 102
8.3. Biotransformación de d-limoneno. ............................................................ 102
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 104
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Etanol, compuesto presente en pequeñas trazas en la composición de un aceite
esencial, debido a la fermentación de la materia prima. ................................................... 3
Figura 2. Limoneno, monoterpeno comúnmente encontrado en aceite esencial de naranja,
.......................................................................................................................................... 4
Figura 3. Farnesol, sesquiterpeno comúnmente encontrado en aceites esenciales de
plantas (rosa, almizcle) ..................................................................................................... 4
Figura 4. Representación esquemática de la distribución de la composición de un fruto
cítrico. ............................................................................................................................... 6
Figura 5. Comportamiento del crecimiento de las naranjas dulces .................................. 7
Figura 6. Estructura molecular de un isopreno (2-metil-1,3-butadieno) .......................... 9
Figura 7. Ejemplos de terpenos lineales y cíclicos. ........................................................ 10
Figura 8. Ejemplo de terpenoide (colesterol) ................................................................. 10
Figura 9. Isómeros ópticos del limoneno d-limoneno (A) y l-limoneno (B) .................. 14
Figura 10. Productos de limoneno por la reacción de biotransformación utilizando
Penicillium digitatum ..................................................................................................... 15
Figura 11. Estructura del Penicillium ............................................................................. 16
Figura 12. Diagrama de flujo del acondicionamiento de la materia prima .................... 22
Figura 13. Diagrama de flujo de la extracción de aceite esencial por el método de
destilación simple. .......................................................................................................... 24
Figura 14. Diagrama de flujo de la extracción de aceite esencial por el método de
destilación por arrastre de vapor. .................................................................................... 25
Figura 15. Diagrama de flujo para la elaboración de medio de cultivo Abraham para el
crecimiento de esporas.................................................................................................... 32
Figura 16. Diagrama de flujo para la elaboración de medio de cultivo Czapeck Dox para
el crecimiento de esporas ................................................................................................ 33
Figura 17. Diagrama de flujo del proceso de biotransformación de d-limoneno ........... 38
Figura 18.Diseño Experimental del método de investigación aplicado ......................... 40
Figura 19. Curva de Calibración para la determinación del d-limoneno ........................ 47
Figura 20. Curva de calibración para el proceso de biotransformación ......................... 52
Figura 21. Concentración de d-limoneno experimental en función del tiempo ............. 63
Figura 22. Linealización para cinética de primer orden ................................................. 66
xiv
Figura 23. Concentración teórica de limoneno en función del tiempo ........................... 67
Figura 24. Rendimientos promedios al aplicar destilación simple como medio de
extracción de aceites esenciales. ..................................................................................... 71
Figura 25. Rendimiento promedio al aplicar destilación por arrastre de vapor como medio
de extracción de aceites esenciales. ................................................................................ 71
Figura 26. Gráfica de probabilidad de residuos para rendimiento de aceite esencial .... 72
Figura 27. Prueba de igualdad de varianzas para rendimiento de aceite esencial .......... 74
Figura 28. Efectos principales para el rendimiento de la extracción de aceite esencial . 77
Figura 29. Gráfica de probabilidad de residuos .............................................................. 79
Figura 30. Prueba de igualdad de varianzas para la concentración de d-limoneno en aceite
esencial ........................................................................................................................... 80
Figura 31. Efectos principales para la concentración de d-limoneno en el aceite esencial
extraído ........................................................................................................................... 82
Figura 32. Gráfica de probabilidad de residuos la selección de medio de cultivo ......... 85
Figura 33. Prueba de igualdad de varianza. .................................................................... 87
Figura 34.. ICs simultaneos de Turkey para el crecimiento de esporas de Penicillium . 89
Figura 35. Gráficas de efectos principales para el crecimiento de esporas de Penicillium
........................................................................................................................................ 89
Figura 36. Espectros combinados de cada día de biotransformación de d-limoneno ..... 91
xv
LISTAS DE TABLAS
Tabla 1. Fuentes de obtención de aceites esenciales (Cervantes Camarena, Galarza
Linares, & León Robladillo, 2012) ................................................................................... 5
Tabla 2. Métodos de extracción de aceites esenciales (SENA, 2004) .............................. 7
Tabla 3. Clasificación de los terpenos (Wade J., 2004) ................................................. 11
Tabla 4. Aplicaciones Industriales de los terpenos y terpenoides .................................. 13
Tabla 5. Investigaciones referentes a la biotransformación de limoneno ....................... 18
Tabla 6. Evaluación del crecimiento basados en la apariencia del crecimiento en matraces
agitados y de la bioconversión medida en 2 días de crecimiento con 1%(v/v) de limoneno.
(Tan, Day, & Cadwallader , 1997) ................................................................................. 29
Tabla 7. Identificación de muestras ................................................................................ 42
Tabla 8. Experiencias y replicas realizadas, para la obtención de aceite esencial de
naranja. ........................................................................................................................... 43
Tabla 9. Datos del método aplicado para la cromatografía de gases acoplada a masas (GC-
MS). ................................................................................................................................ 45
Tabla 10. Respuestas GC-MS, de cada muestra obtenida .............................................. 48
Tabla 11. Datos experimentales para el cálculo de la densidad del aceite esencial a 20°C
aplicando el método del picnómetro ............................................................................... 49
Tabla 12. Absorbancias blanco con medio Abraham ..................................................... 50
Tabla 13. Absorbancias blanco con Medio Czapek-Dox. .............................................. 50
Tabla 14.Absorbancias a 24 horas de los ensayos realizados con medio de cultivo
Abraham. ........................................................................................................................ 51
Tabla 15. Absorbancias a 24 horas de los ensayos realizados con medio de cultivo Czapek
Dox ................................................................................................................................. 51
Tabla 16. Respuesta de la biotransformación de limoneno determinados por GC-MS . 53
Tabla 17. Modelos cinéticos analizados. ........................................................................ 64
Tabla 18. Resultados de los rendimientos al aplicar destilación simple como método de
extracción de aceites esenciales. ..................................................................................... 69
Tabla 19. Prueba de Bartlett ........................................................................................... 73
Tabla 20. Análisis de varianza (Prueba ANOVA), para rendimiento de aceite esencial 74
Tabla 21. Comparaciones múltiples para la extracción de aceite esencial ..................... 76
Tabla 22. Concentración de d-limoneno en el aceite esencial obtenido ......................... 78
xvi
Tabla 23. Prueba Bartlett para el contenido de d-limoneno ........................................... 80
Tabla 24. Análisis de varianza para el contenido de d-limoneno en el aceite esencial
(Prueba ANOVA) ........................................................................................................... 81
Tabla 25. Comparaciones múltiples la concentración de d-limoneno en el aceite esencial
........................................................................................................................................ 83
Tabla 26. Propiedades fisicoquímicas del aceite de naranja extraído ............................ 84
Tabla 27. Absorbancias 24 horas después con medio Abraham .................................... 84
Tabla 28. Absorbancias 24 horas después con medio Czapek-Dox. .............................. 85
Tabla 29. Prueba de Bartlett medios de cultivo .............................................................. 86
Tabla 30. Información del factor .................................................................................... 87
Tabla 31.Análisis de Varianza ........................................................................................ 87
Tabla 32. Comparaciones para absorbancia del crecimiento de esporas de Penicillium 88
Tabla 33. Velocidad de reacción teórica ........................................................................ 90
Tabla 34. Cálculo del error ............................................................................................. 92
Tabla 35. Descripción de la formación de terpenos ....................................................... 93
Tabla 36. Compuestos presentes en el Día 0 de biotransformación ............................. 154
Tabla 37. Compuestos presentes en el Día 1 de biotransformación ............................. 155
Tabla 38. Compuestos presentes en el Día 2 de biotransformación ............................. 157
Tabla 39. Compuestos presentes en el Día 3 de biotransformación ............................. 159
Tabla 40. Compuestos presentes en el Día 4 de Biotransformación ............................ 161
Tabla 41. Compuestos presentes en el Día 5 de Biotransformación ............................ 166
xvii
TÍTULO: Estudio cinético de la biotransformación de d-limoneno para la
obtención de terpenoides mediante el uso de una especie del género
Penicillium
Autores: Estefanía Carolina Lovato Granizo - Byron Alexander Urbina Quezada
Tutor: Ing. Andrés Fernando De la Rosa Martínez
RESUMEN
Obtención de la cinética de la reacción de biotransformación de d-limoneno a partir de
las cáscaras de naranja, utilizando un género Penicillium.
El diseño experimental fue realizado en tres etapas claramente diferenciadas: la primera
consistió en la extracción de aceite esencial de dos variedades de naranja mediante
destilación simple y por arrastre de vapor, cambiando la proporción de solvente, a un
tiempo y temperatura constante. La cuantificación de la pureza de este aceite fue
determinada mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-
MS). En la segunda etapa se desarrolló el crecimiento de Penicillium., en dos medios de
cultivo a diferentes concentraciones de solución de esporas durante 24 horas, las muestras
fueron analizadas mediante espectrofotometría UV-VIS.
De los resultados obtenidos se analiza y escoge las condiciones para la extracción del
aceite esencial y para el crecimiento del Penicilium.; con los que fue realizada la tercera
etapa que consistió en la biotransformación, las muestras fueron cuantificadas mediante
GC-MS, permitiendo determinar el consumo de d-limoneno y la generación de terpenos
en función del tiempo.
Del estudio realizado se desprende que el modelo cinético de mejor ajuste es de primer
orden, en un rango de concentraciones de 3,56 a 3,92 [M] de d-limoneno y constante
cinética de 0,0013 (h-1)
PALABRAS CLAVES: CÁSCARA DE NARANJA / D-LIMONENO/
PENICILLIUM SPP/ BIOTRANSFORMACIÓN/ MODELO CINÉTICO
xviii
TITLE: Kinetic study of d-limonene biotransformation to obtain terpenoids using a
species of genus Penicillium
Authors: Estefanía Carolina Lovato Granizo - Byron Alexander Urbina Quezada
Tutor: Andrés Fernando De la Rosa Martínez
ABSTRACT
Obtention of reaction kinetics of the biotransformation of d-limonene from orange husks,
using a genus Penicillium.
The experimental design was performed in three clearly defined stages: The first one
consisted en the extraction of essential oil from two varieties of orange through simple
and steam distillation, changing the ratio of solvent, at a constant time and temperature.
The quantification of oil purity was determined through gas chromatography coupled to
mass spectrometry (GC-MS). In the second stage, the growth rate of Penicillium. was
determined in two culture media at different spore solution concentrations for 24 hours,
the samples were analyzed by UV-VIS spectrophotometry
From the results raised, the conditions for the extraction of the essential oil and for the
growth of the Penicilium are analyzed and chosen; With which the third stage that
consisted of biotransformation was performed, the samples were quantified by GC-MS,
allowing to determine the rate of consumption of d-limonene and the terpene generation
as a function of time.
The study shows that the kinetic model with better fitting is from first order between a
concentration range of 3.56 to 3.92 [M] of d-limonene and kinetic constant of 0.0013 (h-
1)
KEY WORDS: ORANGE SKIN / D-LIMONENE / SPEN PENICILLIUM /
BIOTRANSFORMATION / KINETIC MODEL
1
INTRODUCCIÓN
El limoneno es considerado un monoterpeno cíclico natural que se encuentra
comúnmente en las cáscaras de las frutas cítricas como limones, limas, y particularmente
en las naranjas. En la industria el limoneno es ampliamente utilizado debido a su aspecto,
aroma, sabor, y especialmente a sus derivados. En Ecuador se lo utiliza generalmente en
la elaboración de desinfectantes o productos de limpieza, además tiene aplicaciones como
disolvente, y es un componente para la elaboración de fragancias, saborizantes,
intermediarios químicos y material de inicio para síntesis de resinas. (Moreno, Morales,
Garcia, Pascual, & Bernal, 2015)
Industrialmente el limoneno es extraído mediante técnicas de prensado en frío de la
cáscara de naranja debido a su bajo costo y alto rendimiento, sin embargo la pureza de
este disminuye debido a la poca selectividad del método, por ende, a pequeña escala la
destilación es un mejor proceso que permite la separación clara de la fase oleosa de los
demás componentes.
Las técnicas de destilación aplicadas fueron la destilación simple y por arrastre de vapor,
variando tanto la relación másica cáscara-solvente y la especie de naranja, llegando a
obtener aceite esencial de alto contenido de limoneno que fue cuantificado mediante la
técnica GC-MS.
El aceite esencial puro es considerando un sustrato de bajo costo y muy utilizado en
proceso de biotransformación, el cual se puede utilizar como potenciador en la obtención
de precursores de terpenos o la producción de sabores y fragancias muy cotizadas; para
ello los microorganismos son usados como biocatalizadores, tales como: Cladosporium,
Penicillium, Pseudomonas, Aspergillus, Balcillus, entre otros.
Estudios anteriores han logrado realizar la biotransformación del limoneno con el
Penicillium, como catalizador, el cual se desarrolla en medios de cultivo líquidos tales
como Abraham y Czapek (Tan, Day, & Cadwallader , 1997), dando como resultado la
2
formación de compuestos como el α-terpineol (Bicas, Barros , Wagner, Godoy , &
Pastore, 2008), alcohol perilílico (Marostica Junior & Pastore , 2007).
En la extracción del aceite esencial se llegó a obtener un rendimiento máximo de 2,22 %
(p/p) de aceite esencial de la variedad de naranja dulce utilizando la destilación simple
como método de extracción y relación soluto-solvente de 1/3. Además el medio Abraham
a una relación 4ml de suspensión de esporas / 50ml de medio de cultivo, genera el mayor
crecimiento de esporas evidenciado por la absorbancia emitida de 1,6554.
La biotransformación fue realizada en un periodo de cuatros días, midiendo su
concentración cada 24 horas mediante ensayos en el GC-MS, donde se evidencia un
consumo del contenido de d-limoneno y la formación de terpenos de manera cualitativa.
El modelo cinético que mejor se ajustó al consumo del sustrato fue el de primer orden
con una k=0,0013 h-1 con un coeficiente de correlación (r2) de 0, 987, obteniéndose
terpenos representativos como el γ-Terpineno, trans-carveol, entre otros.
3
1. MARCO TEÓRICO
1.1. Aceites esenciales
Los aceites esenciales pertenecen al grupo de los lípidos sencillos, ya que no son capaz
de hidrolizarse con un ácido o base acuosa. (Wade J., 2004). Son mezclas de fracciones
liquidas volátiles de color variable de acuerdo del origen de extracción, que es producto
del metabolismo secundario de las plantas, los cuales contienen las sustancias
responsables del aroma de las plantas y de gran importancia en la industria cosmética
(perfumes y aromatizantes), alimenticia (condimentos y saborizantes) y farmacéutica
(principios activos y saborizantes) (Palà , 2002).
1.1.1. Composición de los aceites esenciales
Los aceites esenciales son extractos vegetales con aroma característico y de alta
complejidad, ya que pueden llegar a contener más de una centena de moléculas en
proporciones variables Según Alejandro Martínez M (2003) en su obra “Aceites
esenciales”, indica que los componentes que pueden conformar un aceite esencial son:
• Compuestos alifáticos de bajo peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehídos,
cetonas esteres y ácidos)
Figura 1. Etanol, compuesto presente en pequeñas trazas en la composición de
un aceite esencial, debido a la fermentación de la materia prima.
4
• Monoterpenos. Compuestos orgánicos, formados de dos unidades de isopreno.
•
Figura 2. Limoneno, monoterpeno comúnmente encontrado en aceite esencial de
naranja,
• Sesquiterpenos. Compuestos orgánicos, formados de tres unidades de isopreno.
Figura 3. Farnesol, sesquiterpeno comúnmente encontrado en aceites esenciales de
plantas (rosa, almizcle)
1.1.2. Fuentes de obtención de aceites esenciales
Los aceites esenciales se forman en las partes verdes (con clorofila) del vegetal y al crecer
la planta estos son transportados a diferentes tejidos, específicamente a los brotes en la
flor (Cervantes Camarena, Galarza Linares, & León Robladillo, 2012), por ende, los
aceites esenciales son encontrados en diferentes partes de la planta, como se detalla en la
Tabla 1.
5
Tabla 1. Fuentes de obtención de aceites esenciales (Cervantes Camarena,
Galarza Linares, & León Robladillo, 2012)
Aceite esencial Parte de la planta
Ciprés, jara Ramas
Lavanda, lavandin Sumidades floridas
Menta, hierba buena, eneldo Planta entera
Geranio, petitgrain Hojas
Neroli, rosa, ylang ylang Flor
Limón, mandarina, naranja (frutos cítricos) Flavedo
Romero, tomillo, ajedrea, mejorana Planta entera con flor
Melisa Planta fresca
Aneto de Siberia Acículas
Manzanilla Flor seca
Canela Corteza
Cedro Madera
Los aceites esenciales de cítricos se encuentran en el flavedo del fruto, que es la capa
externa del fruto y que presenta coloración, provocado por la presencia de pigmentos que
confieren el color a medida que el fruto madura con el tiempo, esto debido a la formación
de compuestos carotenoides y de aceites esenciales, que confieren la coloración
característica de cada fruta.
A diferencia, el albedo que carece de grupos cromóforos y por ende su coloración es
blanca, la cual posee en su composición pectina, favonoides y mínimo contenido de
aceites esenciales (Londoño Londoño, Sierra, Álvarez , Restrepo Duque , & Pássaro
Carvalho, 2015). En la Figura 1, se distingue las partes de un fruto cítrico.
6
Figura 4. Representación esquemática de la distribución de la composición de
un fruto cítrico.
La maduración de los frutos influye en la composición del aceite esencial debido a la
reestructuración metabólica y química en los azúcares y los ácidos orgánicos, que
influyen en el color, sabor, olor y textura. (Durán Barón, Villa, Montes de C., & Paláez
J., 2012).
El crecimiento de las naranjas dulces posee un típico comportamiento sigmoide (Agustí,
1999). donde la producción de aceite esencial se encuentra en la fase II de tendencia
lineal, en la cual se producen los procesos de elongación celular y de la acumulación de
compuestos, tal y como se observa en la Figura 5 (Galván Luna, y otros, 2009).
7
Figura 5. Comportamiento del crecimiento de las naranjas dulces
1.1.3. Métodos de extracción de aceites esenciales
Los métodos aplicados para la extracción de aceites esenciales son de índole físico, y
aplicados de acuerdo al tipo de materia vegetal, la parte a ser empleada y la estabilidad
que otorgue a los procedimientos de extracción, tal y como se observa en la Tabla 2,
(SENA, 2004).
Tabla 2. Métodos de extracción de aceites esenciales (SENA, 2004)
Tipo de método Procedimiento Productos obtenidos
Método directo Extrusión Aceites esenciales cítricos
Exudación Gomas, resinas, bálsamos
Destilación
Directa Aceites esenciales y aguas
aromáticas Arrastre de vapor
Destilación – maceración
Extracción con solventes
Solventes volátiles Infusiones y resinoides alcohólicos,
concretos y absolutos
Solventes fijos (grasas) Absolutos de pomadas y enflorados
Extracción con fluidos en estado supercrítico
8
En la presente investigación se analiza las técnicas empleadas comúnmente en laboratorio
como son la destilación simple con maceración y la destilación por arrastre de vapor.
1.1.4. Destilación simple con maceración (Hidrodestilación)
El método es aplicado para favorecer la separación del aceite esencial ya que sus
componentes se encuentran ligados a componentes del residuo del flavedo.
Posteriormente es aplicado un proceso de destilación simple, que consiste en alcanzar el
punto de ebullición del sistema conformado por la materia vegetal sumergida en el
solvente (agua), preferiblemente el material vegetal debe ser acondicionado para el
aumento del área superficial con lo cual el vapor de agua ejerza su acción en el mayor
número de partículas vegetales. Debido a la temperatura ejercida en los sistemas los
componentes orgánicos como fibra tienden a degradarse térmicamente, por eso el material
vegetal debe ser sumergido en agua, evitando el sobrecalentamiento del mismo, además
de una constante agitación para evitar la aglomeración y la sedimentación al adherirse en
las paredes.
Los aceites obtenidos por este método son no son de alta concentración, debido a que
algunos componentes terpénicos, son sensibles a reacciones de hidrolisis y otros a
polimerización. (SENA, 2004)
1.1.5. Destilación por arrastre de vapor
Proceso basado en la obtención de un destilado a partir del vapor de agua como medio de
extracción, en el cual se aprovecha la propiedad que tienen las moléculas de agua en
estado vapor de asociarse con moléculas.
El proceso consiste en la inyección de vapor de agua directamente en el seno de la materia
vegetal acondicionada por medio de tubos difusores, el cual tiene la funcionalidad de
condensarse, formando otra fase inmiscible que cederá su calor latente a la mezcla a
9
destilar para lograr su evaporación, con lo cual se formaran dos fases inmiscibles, las
cuales se separan por un proceso de decantación. (Paredo Luna, Palou García, & López
Malo, 2009)
La destilación por arrastre de vapor es un método sencillo, esto por poseer mejor control
de la velocidad de destilación y existiendo la posibilidad de variar la presión de vapor.
Asimismo, el método satisface operaciones a gran escala por su reproducibilidad y
constancia en los resultados (SENA, 2004).
Las desventajas del método de destilación por arrastre de vapor radican en el
requerimiento de largos periodos de ejecución y bajos rendimientos en comparación a
otros métodos. Además, la ejecución del proceso provoca la aparición de efectos
colaterales, como la polimerización de los terpenos e hidrolisis de ésteres (SENA, 2004)
1.2. Terpenos
Los terpenos son el principal componente de los aceites vegetales, y los responsables de
los aromas y sabores específicos de las plantas, entre mayor sea la cantidad de oxígeno
que posea en su estructura mayor será del aroma que produzca.
Los terpenos se forman a partir del isopreno (2-metil-1,3-butadieno) tal y como se
muestra en la Figura 2, los cuales pueden arreglarse de manera lineal o cíclica (limoneno)
(Gonzáles López, Quiñonez Aguilar, & Rincón Enriquez, 2016).
Figura 6. Estructura molecular de un isopreno (2-metil-1,3-butadieno)
10
Figura 7. Ejemplos de terpenos lineales y cíclicos.
Los terpenoides son compuestos orgánicos similares a los terpenos, también conocidos
como isoprenoides, se encuentran formados por unidades de 5 carbonos (isopreno), que
se encuentran ensambladas y modificadas de diferentes maneras, formando estructuras
multicíclicas las cuales difieren en un grupo funcional. Los terpenoides son considerados
como terpenos modificados, a través del reordenamiento, la perdida de átomos de carbono
o bien por la introducción de átomos de carbono adicionales. El colesterol es un ejemplo
de un terpenoide que ha perdido algunos de los átomos de carbono isoprenoides, tal y
como se observa en la Figura 8 (Wade J., 2004).
Figura 8. Ejemplo de terpenoide (colesterol)
El colesterol es un triterpenoide formado a partir de seis unidades de isopreno con la
perdida de tres átomos de carbono.
1.2.1. Clasificación de los terpenos
Los terpenos y terpenoides poseen una clasificación similar de acuerdo número de
unidades de isoprenos (2-metil-1,3-butadieno) o isoprenoides, tal y como se muestra en
la Tabla 3.
11
Tabla 3. Clasificación de los terpenos (Wade J., 2004)
Número de unidades
de isoprenos
Número de
carbonos
Nombre del
terpeno
1 5 Hemiterpeno
2 10 Monoterpeno
3 15 Sesquiterpeno
4 20 Diterpeno
6 30 Triterpeno
8 40 Tetraterpeno
mayor a 8 mayor a 40 Politerpeno
1.2.2. Aplicaciones industriales de los terpenos y terpenoides
Los terpenos y los terpenoides son los principales constituyentes de los aceites esenciales,
los cuales son aplicados desde la antigüedad en el campo de la medicina, ya que poseen
una alta actividad terapéutica, además los grupos funcionales poseen propiedades
utilizados de manera aromatizante, tópica o de uso interno.
En plantas y vegetales, se ha comprobado que los constituyentes terpénicos de los aceites
esenciales repelen los posibles depredadores, e incluso agentes patógenos debido a sus
propiedades antifúngica o antibacteriana. Por efecto de las propiedades biológicas que
poseen los aceites esenciales, en el campo de la medicina han sido utilizados como
bactericidas, insecticidas, fungicidas, antiparasitarios, antinflamatorios, antiartrítico, ya
que poseen un impacto positivo tanto en el sistema nervioso central como en los aparatos
digestivos como respiratorio. (Palà , 2002)
12
En la Tabla 4, se da a conocer algunos aplicativos de los terpenos y terpenoides en aceites
esenciales, que actualmente son aprovechados en las diferentes industrias:
13
Tabla 4. Aplicaciones Industriales de los terpenos y terpenoides
Aplicación Productos
Adhesivos Pegamentos para porcelanas y caucho
Industria alimentaria animal Comidas preparadas y piensos
Industria automovilística Limpiaparabrisas y ambientadores
Repostería Condimentos, saborizantes y aromatizantes
Chicles Saborizantes
Condimentos Saborizantes, colorantes
Dentífricos Saborizantes, colorantes
Insecticidas repelentes, aromatizantes
Industria alimentaria Aromatizantes, saborizantes, bebidas, sopas, adobos
Productos de limpieza Aromatizantes, saborizantes, bebidas, sopas, adobos
Pintura Disolventes, barnices
Perfumería y Cosmética Aromatizantes, colorantes
Industria Farmacéutica Principios activos, aromatizantes, saborizantes,
colorantes
Industria tabaquera Aromatizantes
En la industria química, son usados como materia prima para obtener compuestos de
interés comercial, al igual que son utilizados como disolventes biodegradables y como
vehículos de flotación en la industria petroquímica. (Palà , 2002)
1.2.3. Limoneno
También denominado 1,8-p-mentadieno o 1-metil-4-(1-metiletenil)-ciclohexano,
conocido por ser uno de los componentes más comunes de los aceites esenciales
14
provenientes de plantas aromáticas. En la Figura 9, se ilustra que el limoneno es un
compuesto ópticamente activo, que posee dos formas enantiomericas: R y S.
Figura 9. Isómeros ópticos del limoneno d-limoneno (A) y l-limoneno (B)
El enantiómero R (+), también conocido como d-limoneno es el compuesto principal de
los aceites esenciales de las cáscaras de Citrus spp. y el S (-) también conocido como l-
limoneno se encuentra principalmente en aceites esenciales de Pinus y Mentha. (Erasmo
& Viljoen, 2008, pág. 1194)
1.2.4. Productos de la biotransformación de limoneno.
El limoneno se encuentra en varios géneros de plantas, por lo cual lo convierten en un
precursor fundamental del cual derivan varios monoterpenos monocíclicos, tales como el
carveol, carvona, alfa-terpineol, pulegona y 1,8-cineol los cuales son derivados del
limoneno (Erasmo & Viljoen, 2008).
En la Figura 10, se ilustra los productos debido al proceso de biotransformacion del
limoneno, al utilizar como biocatalizador el hongo Penicillium Digitatum, esta ruta
metabólica es propuesta por Gloria A. Prieto (2011) en su obra: “Microbial
Biotransformation of R(+)-limonene by Penicillium digitatum DSM 62840 for producing
R(+)-terpineol”.
15
Figura 10. Productos de limoneno por la reacción de biotransformación
utilizando Penicillium digitatum
1.3. Penicillum.
16
Son tipos de mohos muy comunes que crecen en diversos sustratos como granos, frutas,
paja, entre otros, su estudio fue de gran importancia debido a que los mohos en los
alimentos pueden causar deterioro o toxinas. (Carrillo, 2003)
1.3.1. Morfología del Penicillium.
Este género posee una estructura que forma ramificaciones que terminan en células
conidiógenas como podemos observar en la Figura 11. Según sus ramificaciones pueden
ser mono verticilados o polivercilados (Carrillo, 2003).
Figura 11. Estructura del Penicillium
1.3.2. Ambiente de Pencillium
Los Penicillium crecen sobre los alimentos, materias primas de origen animal o vegetal,
hasta conseguir la actividad de agua y los nutrientes necesarios. (Corry, 1987).
1.3.3. Condiciones ambientales requeridas para el crecimiento
El crecimiento del Penicillium se ve influenciado por varios factores entre ellos se
destacan:
17
• Oxígeno. La mayoría de Penicillium son aerobios y su crecimiento es más
satisfactorio cuando el oxígeno es abundante.
• pH. Tienen una alta tolerancia pueden crecer en concentraciones muy acidas y
alcalinas, el rango generalmente es de 2 a 9.
• Temperatura. La mayoría de hongos pueden ser mesófilos su temperatura optima
de crecimiento están entre 22 y 30 C, algunos hongos patógenos tienen una
temperatura optima un poco más elevada entre 30 y 37 C, otros pueden crecer a
temperaturas de refrigeración y aun a 0 grados o menos, adicionalmente existen
grupos de hongos termófilos que pueden crecer a 62 C
• Concentración de solutos. Los hongos pueden crecer en medios cuya
concentración de azúcar o sal seria inhibitoria para la mayoría de las bacterias.
Esta tolerancia a altas concentraciones hace que los hongos sean importantes en
la descomposición de materia orgánica.
• Medio de cultivo. En los laboratorios el medio de cultivo de los hongos debe ser
uno que favorezca el crecimiento de hongo mas no de bacterias ya que crecen a la
par, eso se logra regulando el pH o variando algún factor beneficioso para los
hongos y desfavorable para las bacterias, existen también medios sintéticos y
generalmente están constituidos por carbohidratos y agar.
• Condiciones de incubación. A temperatura ambiente, bajo condiciones
anaerobias (Garcia, 2004)
1.3.4. Investigaciones referentes a la bioconversión del limoneno
En la Tabla 5, se detallan algunas investigaciones previas que fueron la base
fundamentadas para esta investigación.
18
Tabla 5. Investigaciones referentes a la biotransformación de limoneno
Bioconversión del
R(+) Limoneno por
P. digitatum
La bioconversión del limoneno por Penicillium Digitatum es
realizada durante la fase temprana del crecimiento, se observa que
la actividad aumento 4 veces después de la inducción de sustrato,
se cuantifica el desgaste de d-limoneno, el que respondía a la
cinética de transformación de Michaelis-Menten, su constante fue
determinada mediante el método de Lineweaver y Burk, este
proceso de lo realiza cada 12 horas a 100 rpm después de la adición
de 50 ul de limoneno (Tan, Day, & Cadwallader , 1997).
Biotrasformation
of limonene by an
endophytic fungus
using synthetic and
orange reidue-
based media
La biotransformación de terpenos por microorganismos mediante
fermentación, utilizando un hongo endófito aislado Pinus taeda
identificado como Phomopsis.sp la presencia de varios productos
fue detectado e identificado por GC-MS. La cepa estudiada mostro
un comportamiento metabólico divergente, como compuestos de
interés a terpineol, carvona y limoneno-1,2-diol, bajo diferentes
condiciones en un medio sintético en un medio de extracto de
naranja natural (Jucoski Bier, Pedroni Medeiros, & Soccol, 2017).
Production of R(+)-
α-terpineol by the
biotrasformation of
limonene from
orange essential oil,
using cassava waste
wáter as medium
Este estudio relata el uso de dos tipos de residuos agroindustriales:
el aceite esencial de naranja y desechos de la yuca, los componentes
fueron analizados con GC-MS determinando que el aceite contiene
limoneno en un 94% del total de su contenido. El Penicillium
desarrollo su crecimiento en un medio mineral, al que añadido el
aceite obtenido y después de tres días fue convertido el R(+)-α-
terpineol con el 1%(v/v). (Maróstica & Pastore, 2005)
Flavors and
Aromas
La demanda de sabores y aromas motivó esta investigación es
determinar la biotransformación utilizando microorganismos como
precursores para poder obtener un producto con aromas más
intensos utilizando una menor cantidad de aceite puro, con
diferentes propiedades dependiendo el tipo de microorganismo
usado (Agrawal, 2004)
19
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
En este capítulo se detallan las materias primas, materiales, equipos y las diferentes etapas
experimentales empleadas para llevar a cabo la investigación, la cual se divide en tres
procesos fundamentales:
a) Extracción de aceite esencial a partir de las cáscaras de naranja comúnmente
consumidas en el Ecuador (naranja dulce – naranja lima), aplicando métodos de
destilación habituales en laboratorio (destilación simple – destilación arrastre de
vapor), variando la relación cáscara pretratada-solvente.
b) Selección de medio de cultivo adecuado para la máxima producción de
Penicillium en un tiempo determinado.
c) Biotransformación de d-limoneno por medio del uso de Penicillium, y
determinación de un modelo cinético que se ajuste al proceso.
La parte experimental fue realizada tanto en el Laboratorio de Termodinámica,
Laboratorio de Ingeniería de las Reacciones Químicas, Laboratorio de Investigación,
Laboratorio de Micología de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central
del Ecuador.
2.1. Extracción de limoneno a partir de las cáscaras de diferentes especies de
naranja.
Para el diseño experimental se determinan variables independientes tales como: el tipo de
destilación a ser utilizada (destilación simple y por arrastre de vapor), relación cáscara
20
pretratada / solvente (1/2, 1/3), especie de naranja comunmente produccida y consumida
en el Ecuador (naranja dulce y naranja lima), registrado en el Banco Central del Ecuador,
y como variables dependientes el rendimiento de aceite esencial obtenido y la
concentración de d-limoneno generado en cada caso.
Las especies de naranja dulce (citrus sinensis) y de naranja lima fueron obtenidas de la
Provincia de Chimborazo en la ciudad de Riobamba en el Sector del Mercado Mayorista,
donde desembarcan camiones de frutas cítricas cosechadas en el cantón Caluma de la
provincia de Bolívar.
Las muestras de las experimentaciones realizadas, fueron analizaron mediante
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas; cada una de estos ensayos
fue comparado con un estándar de alta pureza provisto de una empresa dedicada a la
obtención de aceites esenciales por prensado en frío, Doterra ubicada en la ciudad de
Quito.
2.1.1. Materiales y Equipos
• Balón de destilación R= [0-1000]ml
• Balón de destilación de tres bocas R= [0-500]ml
• Vasos de precipitación R= [0-100]ml Ap.= ±20ml
R= [0-250]ml Ap.= ±50ml
R= [0-600]ml Ap.= ±100ml
• Plancha de Calentamiento R= [0 - 1500]rpm Ap. ±200 rpm
R= [0 - 550]°C Ap.= ± 0,1°C
• Termómetro R= [-10 - 250]`C Ap.= ±2°C
• Probeta R= [0-100]ml Ap.= ±10ml
• Molino
• Refrigerante
• Mangueras
• Corchos
21
• Adaptador para destilación
• Kitasato R= [0-500]ml Ap.= ±100ml
• Frascos ámbar R= [0-5]ml
• Cronómetro Ap.= ±0.01s
• Soporte Universal
• Pinzas
• Agitador magnético
• Embudo de decantación R= [0-500]ml Ap.= ±100ml
• Viales R= [0-1,5]μl Ap.= ± 0,5μl
• Micropipeta automática R= [100-1000]μl Ap.= ± 1μl
R= [10-100]μl Ap.= ± 1μl
• Micropipetas R= [0-2]ml Ap.= ±0,5 ml
• Balón aforado R= [0-20]ml
• Cromatógrafo de gases acoplada a espectrometría de masas GC-MS
2.1.2. Sustancias y reactivos
• Agua 𝐻2𝑂(𝑙)
• Cáscaras de naranja
• Limoneno estándar 𝐶10𝐻16(𝑙)
• Metanol 𝐶𝐻3𝑂𝐻(𝑙)
• Aceite esencial comercial
• Aceite esencial obtenido experimentalmente.
2.1.3. Procedimiento experimental para la extracción de limoneno a partir de las
cáscaras de naranja.
2.1.4. Acondicionamiento de la materia prima.
22
• Lavar las cáscaras superficiales de las especies de naranja, tanto la naranja dulce
como la naranja lima, para eliminar impurezas y contaminaciones que puedan
interferir en el proceso de extracción.
• Separar la cáscara de la pulpa, mediante un proceso de cortado.
• Eliminar los residuos de albedo de la cáscara, mediante un tratamiento basado en
el corte minucioso, para evitar la interferencia de materia innecesaria (sin la
presencia de d-limoneno en su composición), en el destilador.
• Lavar el flavedo de la naranja, para eliminar residuos producidos por procesos
anteriores.
• Moler el flavedo de la cáscara de naranja, para el aumento tanto en el área
superficial y la interacción con el solvente. Ver Anexo C.1. referente al
acondicionamiento de la materia prima.
En la Figura 12, se muestra el diagrama de flujo correspondiente al proceso de
acondicionamiento de la materia prima, donde se evidencia las condiciones a las que fue
sometida la materia prima para la obtención de cáscara pretratada.
Figura 12. Diagrama de flujo del acondicionamiento de la materia prima
23
2.1.5. Proceso de Destilación simple con maceración
• Cargar la materia prima al balón de destilación (cáscara de naranja pretratada),
a razón de las relaciones en masa (1/2; 1/3) (cáscara de naranja : solvente).
• Armar el equipo de destilación simple, verificando que las conexiones posean
un buen sello, para evitar las pérdidas de vapor generado. (Ver Anexo B.1),
referente al armado del equipo destilación simple.
• Encender la plancha de calentamiento, regulando la temperatura alrededor de
550 °C.
• Recolectar el destilado por 1 hora, a partir de la primera gota generada en el
proceso.
• Tomar lecturas de la cantidad de destilado obtenido, tanto de la fase orgánica
(aceite esencial) y del solvente (agua), al igual que del residuo generado en el
proceso de destilación.
• Separar la fase acuosa y la fase orgánica del destilado, mediante un embudo de
decantación.
• Pesar tanto la fase orgánica como el solvente (agua) generado en la destilación.
Ver Anexo C.2., referente al proceso de decantación.
• Recolectar el aceite esencial obtenido en un envase ámbar.
• Registrar los datos en una tabla de valores. (Ver Tabla 8)
• Analizar el rendimiento de aceite esencial obtenido.
En la Figura 13, se da a conocer las operaciones y las condiciones de proceso aplicadas
para el método de destilación simple.
24
Figura 13. Diagrama de flujo de la extracción de aceite esencial por el método
de destilación simple.
2.1.6. Proceso de Destilación por arrastre de vapor
• Cargar la cáscara pretratada en el balón de tres bocas y el agua en un Kitasato a
las razones preestablecidas de cáscara pretratada y solvente (1/3; 1/2).
• Introducir un tubo capilar en una de las boquillas del balón de destilación,
haciendo que la salida del capilar tenga contacto con la cáscara pretratada, de tal
manera que el vapor generado caliente la materia prima.
• Introducir un tubo capilar en otra de las boquillas de tal manera que el vapor sea
dirigido hacia el refrigerante, y posteriormente sea este condensado.
• Tapar tanto el matraz que contiene el agua, las boquillas del balón que contiene
la materia prima y el refrigerante con corchos de caucho, sellando correctamente
cada una de las conexiones.
• Armar un equipo de destilación por arrastre de vapor, verificando que las
conexiones posean un buen sello para evitar fugas de vapor generado tanto en
mangueras como en conexiones. Ver Anexo B.2., referente al armado al equipo
de destilación por arrastre de vapor.
25
• Encender el plancha de calentamiento, regulando la temperatura alrededor de
550 `C.
• Recolectar el destilado por 1 hora, a partir de la primera gota generada en el
proceso.
• Tomar lecturas de la cantidad de destilado obtenido, tanto de la fase orgánica
(aceite esencial) y del solvente (agua), al igual que del residuo generado en el
proceso de destilación.
• Separar la fase acuosa y la fase orgánica del destilado, mediante un embudo de
decantación.
• Pesar tanto la fase orgánica como el solvente generado en la destilación. Ver
Anexo C.2., referente al proceso de decantación.
• Recolectar el aceite esencial obtenido en un envase ámbar.
• Registrar los datos en una tabla de valores. (Ver Tabla 8)
• Analizar el rendimiento de aceite esencial obtenido.
En la Figura 14, se da a conocer las operaciones y condiciones de proceso aplicadas para
el método de destilación por arrastre de vapor.
Figura 14. Diagrama de flujo de la extracción de aceite esencial por el método
de destilación por arrastre de vapor.
26
2.2. Cuantificación del contenido de d-limoneno y componentes del aceite esencial
obtenido.
El análisis de los componentes y del contenido de d-limoneno en el aceite esencial
obtenido de los ensayos, fue realizado por cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas GC-MS.
2.2.1. Elaboración de la curva de calibración para el análisis del contenido de d-
limoneno de los ensayos realizados.
• Preparar soluciones del estándar comercial a concentraciones de (18; 9; 4,5; 1,8;
1,35) %V/V, utilizando metanol como solvente, las cuales fueron
homogenizadas uniformemente.
• Tomar una alícuota de 100𝛍l de las soluciones de estándar preparadas y
disolverla en 1500𝛍l de solvente (metanol), y homogenizar uniformemente.
• Analizar las soluciones preparadas basándose en el método programado para el
GC-MS descrito en la Tabla 9 en la sección de datos experimentales.
• Verificar que la curva de calibración presentada posea un coeficiente de
correlación aproximado de 1. (Ver Figura 19 en la sección datos experimentales)
2.2.2. Preparación de muestras para análisis en el espectrómetro de masas GC-MS.
• Tomar una alícuota de 100𝛍l de cada una de las muestras obtenidas en la
extracción del aceite esencial, y posteriormente colocar en los viales.
• Disolver las muestras con 1500𝛍l de metanol, y homogeneizar para que exista
uniformidad en toda la solución.
• Analizar cada una de las muestras en el GC-MS, basándose en el método
programado en la Tabla 9, referente a datos experimentales.
• Registrar los valores de respuesta GC-MS en una tabla de datos. (Ver Tabla 10)
27
• Analizar los resultados obtenidos y determinar las condiciones en la cual se
produce la mayor concentración de d-limoneno.
Los espectros y las concentraciones determinadas por el GC-MS del aceite esencial
obtenido, se evidencian en el Anexo D.
2.3. Determinación de la densidad del aceite esencial de naranja obtenido.
La densidad es un parámetro fisicoquímico importante para la caracterización de
sustancias, en este caso del aceite esencial obtenido de la extracción.
La densidad del aceite esencial de naranja fue obtenida por el método del picnómetro que
es comúnmente utilizado en laboratorios y se basa en la gravimetría a una temperatura
determinada y con el uso de una sustancia de densidad conocida comúnmente agua.
El proceso de determinación de la densidad del aceite esencial, se efectúa en las
condiciones de la muestra que genera el mayor rendimiento y contenido de d-limoneno
(M010).
2.3.1. Método del picnómetro para la determinación de la densidad del aceite
esencial obtenido.
• Verificar que el picnómetro se encuentre totalmente limpio, pesar el picnómetro
vacío.
• Llenar el picnómetro con agua destilada hasta muy cerca del borde y colocar el
tapón dejando que el agua ingrese por capilar, y que salga por la parte superior.
• Secar perfectamente el picnómetro evitando dejar contaminaciones y verificar que
el picnómetro se encuentre totalmente lleno y sin la presencia de burbujas.
28
• Pesar el contenido del picnómetro lleno del agua destilada, la diferencia existente
entre el picnómetro vacío y el lleno de agua será la masa de agua destilada.
• Limpiar y secar el picnómetro.
• Llenar el picnómetro con el aceite esencial, hasta muy cerca del borde y colocar
el tapón dejando que el aceite ingrese en el capilar, y que salga por la parte
superior.
• Secar perfectamente el picnómetro evitando dejar contaminaciones y verificar que
el picnómetro se encuentre totalmente lleno y sin la presencia de burbujas.
• Pesar el contenido del picnómetro lleno de aceite esencial de naranja, la diferencia
existente entre el picnómetro vacío y el lleno de aceite esencial de naranja será la
masa de aceite esencial.
• Registrar los datos obtenidos en una tabla de datos. (Ver Tabla 11)
2.4. Procedimiento experimental para la selección de medio de cultivo adecuado
para el crecimiento de Penicillium.
Para la elección del medio de cultivo para el crecimiento del Penicillium evaluamos
estudios previos obtenidos de (Tan, Day, & Cadwallader , 1997) en el que estudia nueve
medios de crecimiento comunes descritos en la Tabla 6, de los cuales para corroborar los
datos analizaremos cuantitativamente dos de estos el Czapek-Dox que lo prepararemos
según indicó el autor George Smith en su investigación The effect of adding trance
elements to Czapek-Dox Medium (Smith, 1948), y Abraham mediante ensayos de
turbidez en un tiempo de 24 horas a diferentes concentraciones de medio y constante
solución de esporas Penicillium.
Previamente a la elaboración de los medios de cultivo los materiales deben estar
esterilizados y sanitizados correctamente, exponiéndoles a un proceso de autoclavado
durante un tiempo de 20 minutos a una temperatura de 120°C, para evitar la
contaminación de la experimentación realizada por efecto de microorganismos presentes
en el medio ambiente, además de esterilizar y sanitizar la cámara de flujo laminar con
alcohol al 96%, para evitar la contaminación cruzada.
29
Para el análisis del crecimiento de las esporas de Penicillium se opta por la espectrometría
UV–Vis, en la cual se analiza la absorbancia durante un tiempo de exposición del medio
de cultivo ante las esporas de Penicillium, la diferencia de la turbidez generada entre el
blanco y el medio de cultivo determinada por la absorbancia, establece el medio adecuado
para el crecimiento del hongo.
Tabla 6. Evaluación del crecimiento basados en la apariencia del crecimiento
en matraces agitados y de la bioconversión medida en 2 días de crecimiento
con 1%(v/v) de limoneno. (Tan, Day, & Cadwallader , 1997)
Medio
Composición (g-l)
Evaluación
de
crecimiento
Valor de
bioconversión (α-
terpineol mg ml)
Mgp Extracto de malta (20), glucosa
(20), peptona (1).
+
0,02
Czapek’s 𝑁𝑎𝑁𝑂3(3),𝐾2𝐻𝑃𝑂4(1),
𝑀𝑔𝑆𝑂4. 7𝐻2𝑂(0.5),𝐾𝐶𝑙(0.5),
𝐹𝑒𝑆𝑂4. 7𝐻2𝑂(0,01), sacarosa
(30), licor de maíz fermentado
(10)
+
0,18
Ymg Extracto de levadura (10),
extracto de malta (30), glucosa
(10).
+
0,04
Ymgp Extracto de levadura (10),
extracto de malta (30), glucosa
(10), peptona (1).
++
0,06
Pyp Potato dextrosa (24), extracto de
levadura (5), peptona (5).
+++
0,37
Mea Extracto de malta (20), glucosa
(20), peptona (1)
+
0,29
Abraham’
s
Glucosa (10), peptona (10),
extracto de malta (20), extracto de
levadura (3)
++++
0,83
Leonian’s Peptona (0.625), maltosa (6.5),
extracto de malta (6,25),
𝐾𝐻2𝑃𝑂4(1.25),
++
0,15
30
𝑀𝑔𝑆𝑂4. 7𝐻2𝑂(0.625),extracto de
malta (1)
Hotop’s Glucosa (30), lactosa (10),
KH2PO4(0.5), (NH4)2SO4(5), licor
de maíz fermentado (15)
+
0,08
2.4.1. Materiales y Equipos
• Vasos de precipitación R= [0-100]ml Ap.= ± 20ml
R= [0-250]ml Ap.= ± 50ml
• Plancha de calentamiento R= [0 - 1500]rpm Ap.= ± 0.1°C
• Probetas R= [0-100]ml Ap.= ± 10ml
R= [0-10]ml Ap.= ± 1ml
• Agitador magnético
• Vidrio reloj
• Balón aforado R= [0-20] ml
• Asa bacteriológica
• Matraz R= [0-100] ml Ap.= ± 25ml
• Autoclave R= [0-0.25]MPas Ap.= ± 5MPas
• Cámara de flujo
• Mechero bunsen
• Caja Petri
• Frasco de vidrio R= [0-1000] ml Ap.= ± 10ml
• Balanza R= [0-300]g Ap.= ± 0,0001
• Parafilm
• Potenciómetro R= [0-14]pH Ap.= ±
0.001pH
• Fundas autoclavables
• Tubos de ensayo
• Espectrofotómetro UV-VIS
31
2.4.2. Sustancias y reactivos
• Agua Destilada 𝐻2𝑂(𝑙)
• Extracto de Levadura
• Sacarosa 𝐶12𝐻22𝑂11(𝑠)
• Glucosa 𝐶6𝐻12𝑂6(𝑠)
• Extracto de malta
• Peptona
• Fosfato monopotásico 𝐾𝐻2𝑃𝑂4(𝑠)
• Sulfato de magnesio 𝑀𝑔𝑆𝑂4(𝑠)
• Cloruro de potasio 𝐾𝐶𝑙(𝑠)
• Sulfato ferroso heptahidratado 𝐹𝑒𝑆𝑂4 ∗ 7𝐻2𝑂(𝑆)
• Hidróxido de sodio 𝑁𝑎𝑂𝐻(𝑠)
• Nitrato de sodio 𝑁𝑎𝑁𝑂3(𝑠)
• Etanol 96% 𝐶5𝐻5𝑂𝐻(𝑙)
• Penicillium.
2.4.3. Procedimiento para la elaboración del medio de cultivo orgánico (Abraham)
para el crecimiento de Penicillium.
• Pesar 8 gramos de glucosa, 8 gramos de peptona, 16 gramos de extracto de malta,
y 2,4 gramos de extracto de levadura en un frasco de 1000ml y ajustar con agua
destilada hasta 800ml.
• Ajustar el pH del medio de cultivo mediante una solución de hidróxido de sodio
al 40%, hasta que el pH se encuentro alrededor de 7.
• Autoclavar el medio de cultivo preparado durante 20 minutos a una temperatura
de 120`C.
• Esterilizar la cámara de flujo con alcohol y exponiéndola a luz ultravioleta por
10 minutos.
32
• Colocar la solución dentro de la cámara por 30 minutos, sellar con parafilm y
mantenerla en refrigeración
En la Figura 15, se presenta las condiciones de procesos, para cada etapa en la elaboración
del medio de cultivo Abraham para el crecimiento de Penicillium, adaptado a un volumen
de 800ml.
Figura 15. Diagrama de flujo para la elaboración de medio de cultivo
Abraham para el crecimiento de esporas.
2.4.4. Procedimiento para la preparación del medio de crecimiento Czapek-Dox
• Pesar 24 gramos de sacarosa, 0,8 gramos de fosfato monopotásico, 0,4 de sulfato
de magnesio, 0,4 de cloruro de potasio, 1,6 gramos de nitrato de sodio y 0,014 g
de sulfato ferroso heptahidratado y colocarlas en un frasco de 1000ml y ajustar
con agua destilada hasta 800ml.
• Verificar que el potenciómetro se encuentre calibrado, esto mediante la medición
de soluciones buffer.
33
• Ajustar el pH del medio de cultivo alrededor de 6,8 a 7, mediante la agregación
de gotas de una solución de hidróxido de sodio al 40%.
• Autoclavar la solución preparada, a una temperatura de 120°C durante 20
minutos.
• Esterilizar la cámara de flujo limpiándola con alcohol y exponiéndola a luz
ultravioleta por 10 minutos.
• Colocar la solución dentro de la cámara por 30 minutos, sellar con parafilm y
mantenerla en refrigeración.
En la Figura 16, se presenta el diagrama de flujo con las condiciones del proceso de
elaboración del medio de cultivo Czapek-Dox, adaptado para un volumen de 800ml.
Figura 16. Diagrama de flujo para la elaboración de medio de cultivo Czapeck
Dox para el crecimiento de esporas
.
2.4.5. Procedimiento para la preparación de la solución de suspensión de esporas
• Autoclavar 100ml de agua destilada en un frasco y colocar en la cámara de flujo
previamente esterilizada.
• Esterilizar con alcohol la cámara de flujo y con la luz ultravioleta por 10 minutos.
34
• Apagar la luz ultravioleta y encender el flujo de aire.
• Encender y colocar el mechero bunsen en el área de trabajo.
• Realizar un corte con un asa bacteriológica del micelio de Penicillum formado
en la caja Petri.
• Colocar el Penicillium cortado en el frasco y agitar el frasco de tal manera que
el agua interactúe con las esporas contenidas en el pedazo de micelio durante un
tiempo aproximado de 10 minutos.
• Separar el pedazo de micelio de la suspensión de esporas formada, sellar la
suspensión de esporas con parafilm y someterla a refrigeración para la
conservación de las esporas.
2.4.6. Procedimiento del crecimiento de las esporas en los medios de cultivo
seleccionados.
• Tomar un volumen aproximado de 25, 50 y 100 ml de los medios de cultivo
colocar en los matraces, posteriormente adicionar en cada uno de los matraces 4
ml de la suspensión de esporas.
• Ajustar la plancha de calentamiento a 100 rpm sin calentamiento, y colocar los
agitadores magnéticos en cada uno de los matraces.
• Colocar los matraces sobre la plancha de calentamiento, y sellar con parafilm
sus aberturas, evitando el ingreso de aire en la muestra.
• Mantener una agitación constante en los matraces durante un tiempo aproximado
de 24 horas.
2.4.7. Procedimiento para la determinación de la absorbancia del medio de cultivo
por el Espectrofotómetro UV-VIS.
• Verificar que el UV-Vis se encuentre calibrado, mediante el análisis de agua
destilada la cual debe poseer una absorbancia aproximada de 0.
• Preparar el blanco del medio con la concentración inicial de esporas.
35
• Tomar alícuotas de los medios obtenidos después de las 24 horas en tubos de
ensayo.
• Colocar cada uno de los blancos de los ensayos realizados y efectuar el análisis
espectroscópico mediante 5 corridas y determinar la absorbancia,
• Registrar datos en una tabla. (Ver Tablas 12 y 13)
• Analizar con espectrometría UV-VIS las muestras que se sometieron a 24 horas
con la suspensión de esporas.
• Registrar datos en una tabla de ensayos. (Ver Tablas 14 y 15)
Cada uno de los registros de las absorbancias emitidas por UV-Vis se muestra en el Anexo
F.
2.5. Procedimiento de la Biotransformación de d-limoneno
La biotransformación es realizada tomando las mejores condiciones tanto para la
extracción de aceite esencial a partir de las cáscaras de naranja mencionado en el punto
2.1, como para la selección de medio de cultivo para el crecimiento del Penicillium. El
procedimiento se encuentra detallado en el punto 2.4.
La experimentación establece la cantidad de aceite esencial inicial que interactúa con el
medio de cultivo aproximadamente de 100μl, en distintos lapsos de tiempos para
evidenciar el consumo de d-limoneno contenido en el aceite esencial y la generación de
terpenos derivados del d-limoneno.
La cinética de biotransformación se ha analizado mediante cromatografía de gases
acoplada espectrometría de masas, en el cual se verifica de manera cualitativa los terpenos
generados, y de manera cuantitativa el consumo de d-limoneno en el tiempo, con lo cual
se estima un modelo matemático que interprete el proceso de biotransformación.
36
2.5.1. Materiales y Equipos
• Matraces R= [0-100]ml Ap. = ±25ml
• Agitador Magnético
• Plancha de calentamiento R= [0-1500]rpm
• Mechero bunsen
• Cámara de flujo
• Viales
• Embudo
• Papel filtro
• Probeta R= [0-10] ml Ap= ±2 ml
• Vaso de precipitación R= [0-100]ml Ap.= ±25ml
• Tubos de ensayo
• GS MS
2.5.2. Sustancias y Reactivos
• Limoneno 𝐶10𝐻16(𝑙)
• Éter di etílico 𝐶4𝐻10𝑂(𝑙)
• Medio de cultivo Orgánico (Abraham).
• Penicilium
2.5.3. Elaboración de la curva de calibración para el consumo de limoneno.
• Preparar soluciones del estándar comercial, para la elaboración de soluciones al
(70; 50; 40; 14; 8) %V/V utilizando éter di etílico como solvente, las cuales
fueron homogenizadas uniformemente.
• Tomar una alícuota de 1500μl de cada una de las soluciones preparadas e
identificarlas.
37
• Analizar las soluciones preparadas al instante de ser elaboradas para evitar la
evaporación de los componentes volátiles, esto basándose en el método descrito
en la Tabla 8 en el GC-MS.
• Analizar la curva de calibración presentada, mediante el coeficiente de
correlación que indica la factibilidad de uso de la curva para el análisis del
proceso de biotransformación. (Ver Figura 20 en la sección de Datos
Experimentales)
2.5.4. Procedimiento para la biotransformación de d-limoneno
• Colocar 50 ml del medio de cultivo Abraham y añadir una alícuota de cuatro
mililitros de la solución de esporas; agitar durante tres días a 100 rpm en la
cámara de flujo laminar.
• Filtrar por gravedad al transcurrir los tres días de crecimiento del hongo, para
separar el micelio de la solución.
• Tomar una alícuota de 100μl del aceite esencial obtenido a la mejor condición
de extracción, y añadir al medio de cultivo.
• Tomar una alícuota de 3ml de cada solución en tubos de ensayos identificados.
• Realizar una extracción liquido-liquido utilizando 3ml de éter dietílico en cada
tubo de ensayo, y dejarlo reposar durante 10 minutos para una correcta
separación de las fases formadas.
• Tomar 1,5 ml de la fase menos densa (solución transparente), y colocarlas en
viales identificados.
• Analizar en el GC-MS la concentración inicial de d-limoneno, y registrar en la
tabla de datos. (Ver Tabla 15)
• Colocar las soluciones en agitación constante a 100 rpm y de manera anaerobia
mediante un correcto sellado de los matraces e identificarlos.
• Repetir la extracción y análisis cada 24 horas, añadiendo 100 μl de aceite
esencial cada día.
• Registrar datos en la tabla de datos. (Ver Tabla 16)
38
En la Figura 17, se presentan las condiciones de proceso y las operaciones realizadas para
la biotransformación de limoneno. En el Anexo G, se observa cada proceso realizado a
nivel de laboratorio referente a la biotransformación de d-limoneno.
Figura 17. Diagrama de flujo del proceso de biotransformación de d-limoneno
En la Figura 18, se indica el diagrama de flujo que fue designado para el proceso de
biotransformación de d-limoneno que consistió en un análisis de dos especies de naranja
para la extracción de aceite esencial por medio de destilación simple y arrastre de vapor,
las cuales fueron evaluadas y replicadas consiguiendo la mejor condición para este
proceso.
Además, fueron escogidos dos medios de cultivo para el crecimiento del Penicillium, los
cuales fueron replicados a diferentes concentraciones de solución de esporas, y
39
analizando la absorbancia emitida en un día de crecimiento, con lo cual fue elegido el
medio que presento mayor crecimiento en 24 horas de crecimiento. Finalmente, con los
resultados de los análisis de ambos procesos se procede a realizar la biotransformación.
40
2.6. Diseño Experimental
Figura 18.Diseño Experimental del método de investigación aplicado
Cás
cara
de
nar
anja
Especie 1
D.S
R:(1/3) R1,R2
R:(1/2) R1,R2
D.V
R:(1/3) R1,R2
R:(1/2) R1,R2
Especie 2
D.S
R:(1/3) R1,R2
R:(1/2) R1,R2
D.V
R:(1/3) R1,R2
R:(1/2) R1,R2
Análisis de resultados y elección de mejor proceso
Med
ios
de
cult
ivo
s Medio 1
C1 R1,R2
C2 R1,R2
C3 R1,R2
Medio 2
C1 R1,R2
C2 R1,R2
C3 R1,R2
Análisis de resultados y eleccion de mejor proceso
Proceso de
Biotransformación
41
Donde:
DS: Destilación simple
DV: Destilación por arrastre de Vapor
R:(1/2): Relación 1/2 de soluto y solvente
R:(1/3): Relación 1/3 de soluto y solvente
R1: réplica 1
R2: réplica 2
C1: Concentración 1
C2: Concentración 2
C3: Concentración 3
42
3. DATOS EXPERIMENTALES
3.1. Datos experimentales referentes a la extracción de aceite esencial.
3.1.1. Identificación de muestras y réplicas.
La Tabla 7, detalla e identifica cada ensayo mediante la utilización de un código, que
establece la especie de naranja, el método y la relación cáscara pretratada / solvente
utilizado.
Tabla 7. Identificación de muestras
Especie naranja Método Relación Muestras
Naranja Dulce
Destilación Simple
1/2 M001
1/2 M009
1/2 M017
1/3 M002
1/3 M010
1/3 M018
Arrastre de vapor
1/2 M003
1/2 M011
1/2 M019
1/3 M004
1/3 M012
1/3 M020
Naranja Lima
Destilación Simple
1/2 M005
1/2 M013
1/2 M021
1/3 M006
1/3 M014
1/3 M022
Arrastre de vapor
1/2 M007
1/2 M015
1/2 M023
1/3 M008
1/3 M016
1/3 M024
43
3.1.2. Obtención de aceite esencial.
La Tabla 8, muestra los datos en peso (gramos) de las diferentes corrientes en el proceso
de obtención de aceite esencial (DS y DAV), variando la especie de naranja comúnmente
consumidas en el Ecuador: naranja dulce (citrus sinensis) y naranja lima (hibrido), y la
relación de cáscara pretratada y solvente (agua) de 1/3 y 1/2, además de un balance de
masa que determina el contenido en gramos de cada uno de los componentes que
conforma cada corriente de interés: alimentación, residuo y destilado, y las perdidas
suscitadas en el proceso.
Tabla 8. Experiencias y replicas realizadas, para la obtención de aceite
esencial de naranja.
Especie de
naranja y
Tipo de
destilación
Muestra
Alimentación Destilado
Residuo
(g)
Pérdidas
en
destilación
(g)
Cáscara
pretratada Agua Aceite Agua
(g) (g) (g) (g)
Naranja
Dulce
Destilación
simple
R=1/2
M001 100,50 201,00 2,03 50,51 242,29 6,67
M009 100,03 201,06 2,03 103,68 184,74 10,64
M017 100,50 201,00 2,01 102,82 191,12 5,55
Naranja
Dulce
Destilación
simple
R=1/3
M002 100,00 300,00 2,22 71,04 318,65 8,09
M010 100,03 300,09 2,29 90,94 305,04 1,85
M018 100,72 302,16 2,18 20,71 377,20 2,79
Naranja
Dulce
Arrastre de
vapor
R=1/2
M003 100,74 201,48 0,85 69,12 224,48 7,77
M011 100,24 200,48 0,61 50,56 242,93 6,62
M019 100,27 200,54 0,35 76,11 219,39 4,96
Naranja
Dulce
Arrastre de
vapor
R=1/3
M004 99,97 299,91 1,04 44,32 346,78 17,74
M012 99,98 299,94 0,80 81,64 311,40 6,08
M020 100,12 300,36 0,92 47,23 341,18 11,15
M005 100,50 201,00 1,24 66,74 229,64 3,88
44
Naranja
Lima
Destilación
simple
R=1/2
M013 101,50 203,00 1,02 99,01 199,89 4,58
M021 101,20 202,40 1,02 120,34 178,44 3,80
Naranja
Lima
Destilación
simple
R=1/3
M006 101,20 302,40 1,33 125,17 271,17 5,93
M014 101,68 302,00 1,83 57,40 341,88 2,57
M022 100,20 300,60 1,26 46,18 344,91 8,45
Naranja
Lima
Arrastre de
vapor
R=1/2
M007 100,05 200,10 0,89 36,48 258,23 4,55
M015 100,04 200,08 0,91 27,76 258,28 13,17
M023 99,85 199,70 0,78 73,62 221,90 3,25
Naranja
Lima
Arrastre de
vapor
R=1/3
M008 100,20 300,60 0,59 0,59 340,66 0,45
M016 100,62 301,86 0,30 76,46 323,81 1,91
M024 100,00 300,00 0,46 46,09 353,02 0,43
3.2. Datos experimentales referentes al análisis del contenido de d-limoneno en el
aceite esencial.
El análisis del contenido de d-limoneno en el aceite esencial obtenido de los ensayos se
realiza por GC-MS, la cual genera respuestas basada en conteo de pesos o abundancia, y
por medio de una curva de calibración de un estándar de alta pureza se determina el
contenido de d-limoneno en las muestras.
3.2.1. Condiciones del GC-MS y método programado al equipo.
En la Tabla 9, se detalla el método programado para el análisis de las muestras obtenidas
tanto en las experimentaciones como en las replicadas, tal como la columna utilizada, el
tiempo de análisis, y los parámetros de los componentes que conforman el GC-MS.
45
Tabla 9. Datos del método aplicado para la cromatografía de gases acoplada a
masas (GC-MS).
Información de control
Entrada de muestra GC
Fuente de inyección GC ALS
Ubicación de inyección FRENTE
Espectrómetro de masas HABILITADO
GC
Resumen de GC
Tiempo de ejecución 13 min
Post tiempo de ejecución 3 min
Horno
Temperatura
Punto de ajuste Activado
Inicial 50 °C
Tiempo de espera 3 min
Post ejecución 300 °C
Programa
#1 ritmo 5 °C/min
#1 valor 100 °C
#1 hold time 0 min
Tiempo de equilibrio 0 min
Temperatura máxima 325 °C
Anulación de temperatura máxima
Desactivado
Ventilador lento
Desactivado
ALS
Inyector frontal
Tamaño de jeringa 10 µl
Volumen de inyección 1 µl
Disolvente a de lavado (pre inyección) 3 Disolvente a de lavado (post inyección) 3 Z
Volumen de solvente a 8 µl
Disolvente b de lavado (pre inyección) 0
Disolvente b de lavado (post inyección) 0
Volumen de disolvente b 8 µl
Lavados de muestra 3
Volumen de lavado de muestra 8 µl
Bombas de muestra 3
Tiempo de permanecia (pre inyección) 0 Min
46
Tiempo de permanencia (post inyección) 0 Min
Velocidad de extracción del lavado del solvente 300 µl/min
Velocidad de dispensado de lavado con solvente 3000 µl/min
Velocidad de extracción de lavado de muestra 300 µl/min
Velocidad de dispensado de lavado de muestra 3000 µl/min
Velocidad de dispensación de inyección 6000 µl/min
Retardo de viscosidad 0 sec
Profundidad de muestra Desactivado
Tipo de inyección Estándar
L1 AIRGAP 0,2 µl
Modo de lavado con solvente A,B Frente SSZ INLET HE
Modo Split
Calentador 225 °C
Presión 12,675 psi
Ahorrador de gas 15
ml/min cada
3min
Proporción de división 70:01:00
Flujo dividido 105 ml/min
Thermal aux 1 (MSD transfer line)
Temperatura
Punto de ajuste Activado
Inicial 320 °C
Post ejecución 0 °C
Columna
Columna #1
Flujo
Punto de ajuste Apagado
Inicial 1,5 ml/min
Post ejecución 1,5 ml/min
Agilent 19091S-433UI
HP-5ms ultra inert
-60 °C—325 °C (325 °C): 30 m x 250 μm x 0.25 μm
In SSZ INLET HE
Out Msd
Temperatura inicial 50 °C
Presión 12,675 psi
Flujo 1,5 ml/min
Velocidad media 44,635 cm/seg
Tiempo de espera 11,202 min
Presión de salida de la columna 0 psi
47
3.2.2. Curva de calibración para la determinación del contenido de d-limoneno en
el aceite esencial extraído.
En la Figura 19, se evidencia la curva de calibración realizada con un estándar comercial
de d-limoneno de alta pureza y utilizando metanol como solvente.
Figura 19. Curva de Calibración para la determinación del d-limoneno
3.2.3. Análisis GC-MS del contenido de d-limoneno para cada ensayo realizado.
En la Tabla 10., se evidencia las respuestas GC-MS generadas por el detector del equipo,
la cual representa la concentración de d-limoneno contenido en cada muestra.
48
Tabla 10. Respuestas GC-MS, de cada muestra obtenida
Especie naranja Método Relación Muestra Respuesta
GC-MS
Naranja Dulce
Destilación
Simple
1/2 M001 1180843905
1/2 M009 119246127
1/2 M017 723730966
1/3 M002 1300825412
1/3 M010 936602881
1/3 M018 1239744567
Arrastre de
vapor
1/2 M003 782796833
1/2 M011 777456745
1/2 M019 1100686723
1/3 M004 1167606095
1/3 M012 1229482283
1/3 M020 437731280
Naranja Lima
Destilación
Simple
1/2 M005 836017719
1/2 M013 327511821
1/2 M021 45466337
1/3 M006 2811079
1/3 M014 1112757137
1/3 M022 644701475
Arrastre de
vapor
1/2 M007 1494891
1/2 M015 2539982
1/2 M023 82106923
1/3 M008 867638423
1/3 M016 235078
1/3 M024 602924716
49
3.3. Densidad del aceite esencial de naranja.
En la Tabla 11, se muestra los datos a ser utilizados en el cálculo de la densidad del aceite
esencial por el método del picnómetro.
El aceite esencial analizado fue el de mayor rendimiento y contenido de limoneno, es
decir el proveniente de los parámetros que involucran a la muestra M010.
Tabla 11. Datos experimentales para el cálculo de la densidad del aceite
esencial a 20°C aplicando el método del picnómetro
Reactivo Valor Unidades
Picnómetro vacío 14,6835 G
Picnómetro + agua 24,6100 G
Picnómetro + aceite esencial 23,1185 G
Densidad del agua a T = 20°C 998,204 kg/m3
La densidad del agua a una temperatura de 20°C fue extraída del Manual del Ingeniero
Químico, Tomo III, sexta edición, de Robert H. Perry, Don W. Green y James O.
Maloney.
3.4. Datos experimentales referentes a la elección de medio de cultivo para el
crecimiento de Penicillium.
El crecimiento del Penicillium, se evidencia en la turbidez generada en un lapso de tiempo
debido al crecimiento del hongo. El análisis espectrofotométrico realizado por el UV-
VIS, es el método aplicado para la determinación del crecimiento a través de las
absorbancias presentadas.
50
3.4.1. Absorbancias de los blancos para cada medio de cultivo.
En la Tablas 12 y 13, se analiza las absorbancias de los blancos para el del crecimiento
en el medio Abraham y Czapek-Dox.
Tabla 12. Absorbancias blanco con medio Abraham
Corrida
Medio Medio + esporas
nm Abs Abs
1 0,0012 0,0012 500
2 0,0011 0,0011 500
3 0,0013 0,0013 500
4 0,0013 0,0013 500
5 0,0014 0,0014 500
Tabla 13. Absorbancias blanco con Medio Czapek-Dox.
Corrida
Medio Medio + esporas
nm ABS ABS
1 0,0211 0,0475 500
2 0,0204 0,0434 500
3 0,0208 0,0422 500
4 0,0206 0,0427 500
5 0,0206 0,0413 500
3.4.2. Absorbancias de los medios de cultivo a las 24 horas de crecimiento de las
esporas.
En las Tablas 14 y 15, presenta la absorbancia en los medios de cultivo en un lapso de
tiempo de un día la cual demuestra el crecimiento de las esporas.
51
Tabla 14.Absorbancias a 24 horas de los ensayos realizados con medio de
cultivo Abraham.
Ensayo 1 2 3 4 5 6
Volumen del Medio (ml) 25 50 100
Réplica 1 2 1 2 1 2
Número de Corrida Abs Abs Abs Abs Abs Abs
1 1,4138 1,7538 1,6545 1,4838 0,7806 0,8214
2 1,4122 1,7499 1,658 1,4827 0,7741 0,8106
3 1,4129 1,7486 1,6553 1,4795 0,7658 0,8124
4 1,4122 1,7456 1,6545 1,4701 0,7723 0,8119
5 1,4125 1,7455 1,6548 1,4701 0,7722 0,8094
Tabla 15. Absorbancias a 24 horas de los ensayos realizados con medio de
cultivo Czapek Dox
Ensayo 1 2 3 4 5 6
Volumen del Medio (ml) 25 50 100
Réplica 1 2 1 2 1 2
Número de Corrida Abs Abs Abs Abs Abs Abs
1 0,3986 0,4317 0,4173 0,3871 0,3781 0,3721
2 0,4062 0,4444 0,4088 0,3902 0,3769 0,3738
3 0,3905 0,4346 0,3944 0,3913 0,3787 0,3737
4 0,3959 0,4315 0,3883 0,3909 0,3764 0,3823
5 0,3928 0,4337 0,3929 0,3881 0,3744 0,3936
3.5. Biotransformación de d-limoneno en terpenoides.
El proceso de biotransformación de d-limoneno en sus derivados terpénicos fue realizado
en un lapso de 4 días de transformación, en donde se evidencia el consumo de d-limoneno
52
y la formación de terpenos mediante GC-MS. Se utilizaron los resultados obtenidos
anteriormente para la realización de este procedimiento.
3.5.1. Curva de calibración para el proceso de biotransformación
En la Figura 20 se muestra la curva de calibración de d-limoneno a diferentes
concentraciones disuelta en di etil éter.
Figura 20. Curva de calibración para el proceso de biotransformación
3.5.2. Consumo de d-limoneno en el proceso de biotransformación.
En la Tabla 16, se muestra la respuesta generada por el GC-MS para cada día de
biotransformación.
53
Tabla 16. Respuesta de la biotransformación de limoneno determinados por
GC-MS
Caso Respuesta
Día 0 375311720
Día 1 95450218
Día 2 87966734
Día 3 41778772
Día 4 8957824
Día 5 6870669
Las respuestas generadas representan la concentración de d-limoneno presente en cada
día de biotransformación, en un tiempo de retención de 9,64 min.
54
4. CÁLCULOS
4.1. Extracción del aceite esencial de naranja.
En la extracción del aceite esencial de naranja se elaboran cálculos referentes al
rendimiento y el contenido de d-limoneno presente en el aceite esencial de las muestras
realizadas, considerando los factores estudiados.
4.1.1. Porcentaje de Rendimiento de aceite esencial.
Para el cálculo del rendimiento se usa la ecuación 1, que relaciona la masa de aceite
esencial obtenida en el destilado respecto a la masa de cáscara pretratada utilizada en la
alimentación.
Cálculo modelo
El cálculo modelo está basado en la mejor condición para la obtención de aceite esencial,
la cual es la muestra 2 (M002), realizada a R= 1/3, mediante un proceso de destilación
simple y utilizando como materia prima la naranja dulce (citrus sinensis).
%𝑹 = 𝒎𝒂𝒔𝒂 𝒅𝒆 𝒂𝒄𝒆𝒊𝒕𝒆 𝒆𝒔𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂𝒍 (𝒈𝒓𝒂𝒎𝒐𝒔)
𝒎𝒂𝒔𝒂 𝒅𝒆 𝒄á𝒔𝒄𝒂𝒓𝒂 𝒑𝒓𝒆𝒕𝒓𝒂𝒕𝒂𝒅𝒂 (𝒈𝒓𝒂𝒎𝒐𝒔)∗ 𝟏𝟎𝟎% (1)
%𝑅 = 2.22
100.34∗ 100%
55
%𝑹 = 𝟐. 𝟐𝟐 %
Donde:
%R: rendimiento de aceite esencial en porcentaje.
4.1.2. Promedio de los porcentajes de rendimientos para el proceso de destilación
simple y arrastre de vapor.
Mediante la ecuación (2), se realiza el promedio de los rendimientos generados por los
procesos de destilación aplicados considerando la especie de naranja y la relación soluto-
solvente, esto para la elección de las condiciones de extracción efectivas para la obtención
de aceite esencial.
%𝑅 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 =%𝑅1+ %𝑅2……..+%𝑅𝑛.
𝑛 (2)
Donde:
%R promedio: rendimiento promedio en porcentaje; generado por los métodos de
destilación considerando la especie de naranja y la relación soluto-solvente
%R: rendimiento individual en porcentaje
n: número total de muestras
Cálculo modelo
El cálculo modelo está realizado por los mejores rendimientos establecidos en la
extracción de aceite esencial y están dados por las muestras M010, M002 y M018
correspondientes a la destilación simple utilizando una naranja dulce como materia prima
y una relación soluto-solvente de 1/3.
56
%𝑅 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 =2,22 + 2,29 + 2,16
3
%𝑅 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 = 2,22 %
4.2. Determinación del contenido de d-limoneno presente en el aceite esencial de la
cáscara de naranja lima y naranja dulce.
El análisis de la composición química del aceite esencial es para evidenciar las
condiciones, especie y factores favorables para obtener un aceite esencial con alto
contenido de d-limoneno.
La muestra M002, es la utilizada para llevar a cabo los cálculos referentes al contenido
de d-limoneno en el aceite esencial de naranja extraído.
4.2.1. Determinación del contenido de d-limoneno en la solución de solvente + aceite
esencial
Cálculo modelo
Siendo la ecuación (3) la que representa a la curva de calibración:
𝑅𝑒𝑠𝑝 = 256,0 ∗ 108 𝐶 − 1,241 ∗ 107 (3)
Despejando Cs, se obtiene la ecuación (4), donde:
𝐶𝑠 =𝑅𝑒𝑠𝑝+12855563.6
256,0 ∗ 108 (4)
57
𝐶𝑠 =1300825412 + 1,241 ∗ 107
26926687782.3
𝐶𝑠 = 0,0503𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜
𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛
Sabiendo que:
Resp: Respuesta GC-MS generada por el análisis instrumental.
Cs: concentración de d-limoneno en la muestra. (ml de d-limoneno / ml de solución
(solvente + aceite esencial)).
4.2.2. Determinación de la concentración de d-limoneno presente en el aceite
esencial.
Sabiendo que el volumen de solución es equivalente a la suma entre el volumen de aceite
esencial y el del solvente, el contenido de d-limoneno presente en la solución estará
determinado por la relación dada por la ecuación (5) y (6).
Cálculo modelo
𝐶 =𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜
𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (5)
𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜 = 𝐶 ∗ (𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 + 𝑚𝑙 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙) (6)
𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜 = 0,0503𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜
𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛∗ (1,5 𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 + 0,1 𝑚𝑙 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙)
𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜 = 0,0821 𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
58
Dado a que todo el d-limoneno presente en la solución proviene de la alícuota de 0,1 ml
utilizada en la elaboración de la dilución, la concentración de d-limoneno en el aceite
esencial estará dado por la ecuación (7):
Cálculo modelo
𝐶𝑎 =𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜
𝑚𝑙 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙 (7)
𝐶𝑎 =0,0821 𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜
0,1 𝑚𝑙 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙
𝐶𝑎 = 0,821𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜
𝑚𝑙 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙
4.3. Determinación de la densidad del aceite esencial.
La determinación de la densidad del aceite esencial de la cáscara de naranja, permite la
caracterización de las propiedades fisicoquímicas necesarias para la biotransformación de
d-limoneno.
Para lo cual se utiliza el método del picnómetro, determinado por la ecuación (8) y en
donde las condiciones de proceso se encuentran detalladas en la Tabla 10.
𝝆𝒔 =𝒎𝟐− 𝒎𝟏
𝒎𝟑−𝒎𝟏∗ 𝝆𝒂 (8)
Donde:
m2: masa del picnómetro más la masa de aceite contenida en el picnómetro a una
temperatura de 20°C, en gramos.
59
m1: masa del picnómetro a una temperatura de 20°C, en gramos.
m3: masa del agua a una temperatura de 20°C, en gramos.
𝛒a: densidad del agua a una temperatura de 20°C, en gramos / ml.
𝛒s: densidad del aceite esencial a una temperatura de 20°C., en gramos / ml.
𝜌𝑠 =23,1185 𝑔 − 14,6835 𝑔
24,6100 𝑔 − 14,6835 𝑔∗ 0,998204
𝑔
𝑚𝑙
𝜌𝑠 = 0,84822𝑔
𝑚𝑙
4.4. Cálculos referentes a la selección del medio de cultivo para el crecimiento de
esporas de Penicillium.
Los cálculos referentes a la selección de medio se basan en la diferencia de absorbancias
existentes entre los medios previo a la incorporación de una suspensión de esporas y las
producidas debido al crecimiento ocurrido durante un lapso de tiempo, aproximadamente
24 horas.
4.4.1. Absorbancias promedio de los medios de cultivo (Abraham y Czapek-Dox)
Las absorbancias de cada uno de los ensayos realizados para determinar el medio que
genere el mayor crecimiento, se efectúa por espectrofotometría UV-VIS, en donde se
analiza la turbidez generada a diferente concentración en un periodo de 24 horas,
realizando 5 corridas de cada muestra cómo se observa en el Anexo F. Mediante la
ecuación (9), se realiza el promedio de las absorbancias generadas de cada medio de
cultivo.
60
Cálculo modelo
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 =𝑚1+ 𝑚2……..+𝑚𝑛.
𝑛 (9)
Donde:
m: absorbancia de cada muestra.
n: número de corridas realizadas
Cálculo modelo para el medio Abraham, ensayo 1
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 =1,4138 + 1,4122 + 1,4129 + 1,4122 + 1,4125
5
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 1,4127
Cálculo modelo para el medio Czapek-Dox, ensayo 1
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 =0,3986 + 0,4062 + 0,3905 + 0,3959 + 0,3928
5
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0,3957
4.5. Cálculo de la cinética de biotransformación de d-limoneno.
La cinética de biotransformación de d-limoneno, se realiza por el análisis GC-MS en cada
uno de los días del proceso de biotransformación, para la determinación cuantitativa de
la concentración y cualitativamente los terpenoides generados en el proceso.
61
4.5.1. Cálculo de las concentraciones de d-limoneno en el proceso de
biotransformación
A partir de la curva de calibración descrita e., se obtiene la ecuación (10) que determina
el comportamiento de la respuesta generada por el GC-MS en m/e en función de la
concentración en (%) de limoneno puro:
𝑅𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎 = 1,58 × 107 ∗ 𝐶𝐴 + 9 × 108 (10)
Donde:
Respuesta: Valor obtenido del análisis GC-MS, referente al contenido de limoneno.
𝐶𝐴: Concentración de limoneno en %.
Despejando la concentración de limoneno de la ecuación (10), se obtiene:
𝑅𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎−9×108
1,58×107 = 𝐶𝐴 (11)
La ecuación (11) representa la concentración de limoneno, en base a la respuesta dada
por el GC-MS, por ende, con las respuestas obtenidas de la biotransformación descritas
en el Anexo M, se calcula la concentración en cada día de biotransformación.
Cálculo modelo
El cálculo modelo se realiza con la concentración de d-limoneno generada en el Día 0,
para todos los cálculos en este apartado, observar la Tabla 15.
62
95450218 − 9 × 108
2 × 107= 𝐶𝐴
63(%𝑣
𝑣) = 𝐶𝐴
El contenido de d-limoneno determinado por la curva de calibración esta expresado en %
volumétrico, el cual lo transformamos en concentración molar (mol limoneno / L
solución) mediante la siguiente relación:
Cálculo modelo
63 𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜
100 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 ∗
1000 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛
1 𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 ∗
0,8482 𝑔 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜
𝑚𝑙 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜∗
1 𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜
136,24 𝑔 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑚𝑜𝑛𝑒𝑛𝑜= 3,92 𝑀
4.5.2. Cálculo de la velocidad de reacción experimental
A partir de las concentraciones obtenidas en los tiempos determinados, se realiza la curva
que representa el cambio de concentración en función del tiempo, ajustada a la función
que represente el comportamiento cinético tal y como se observa en la Figura 15.
63
Figura 21. Concentración de d-limoneno experimental en función del tiempo
La Figura 21, representa la curva del consumo de limoneno en función del tiempo, en
donde los puntos generados son ajustados a una ecuación de segundo grado.
La ecuación (12) corresponde a la velocidad de reacción, con las concentraciones
obtenidas en el punto 4.5.1, se calcula la velocidad de reacción experimental para cada
día de biotransformación, dado el caso del Día 0, se obtiene que:
𝐶𝐴 = −6 × 10−6𝑡 2 − 0,0045𝑡 + 3,9317 (12)
Donde:
𝐶𝐴: Concentración de limoneno
𝑡: Tiempo
Cálculo de la derivada de la ecuación propuesta:
−𝑟𝐴 =𝑑𝐶𝐴
𝑑𝑡 = 2(−6 × 10−6)𝑡 − 0,0045 (13)
CA = -6E-06t2 - 0,0045t + 3,9317R² = 0,9877
3,5
3,55
3,6
3,65
3,7
3,75
3,8
3,85
3,9
3,95
4
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Co
ncn
tra
cio
n (
M)
Tiempo (h)
64
De la ecuación anterior cálculo la velocidad de reacción para cada concentración
Cálculo modelo
−𝑟𝐴 = 2(−6 × 10−6)3,922 − 0,0045
−𝑟𝐴 = 0,0045 𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑙−1 ∙ ℎ−1
4.5.3. Modelos cinéticos.
Para determinar del modelo cinético representativo de la biotransformación de d-
limoneno se analizaron diferentes modelos matemáticos que describien el proceso de
consumo de d-limoneno, los cuales presentaron variabilidad en sus resultados de ajuste a
la linealidad del modelo, basado en la concentración y velocidad de reacción como se
detalla en la Tabla 16.
Tabla 17. Modelos cinéticos analizados.
Número Modelo Velocidad de
reacción (mol/l h)
Constante
cinética
𝑹𝟐
1 Michaelis Menten
(Lineweaver y Burk)
1
−𝑟𝐴=
1
𝑉𝑚𝑎𝑥+
𝐾𝑀
𝑉𝑚𝑎𝑥(
1
𝐶𝐴)
KM= - 75784,47 0,981
2 Primer orden −𝑟𝐴 = 𝑘𝐶𝐴 K= 0,0013 (h-1) 0,987
3 Segundo orden −𝑟𝐴 = 𝑘𝐶𝐴2 K= 0,0004 (mol-1 h-1) 0,986
4 Tercer orden −𝑟𝐴 = 𝑘𝐶𝐴3 K = 0,0153 (mol-2 h-1) 0,9865
La Tabla 16, establece que la biotransformación de d-limoneno posee una tendencia de
primer orden, por tanto, se establece el modelo matemático representativo determinado
por la ecuación (14) que define a una cinética de primer orden, en el rango de
concentraciones obtenidas.
−𝑟𝐴 = 𝑘𝐶𝐴 (14)
65
Y por medio de la ecuación (15), que define el balance molar para un reactor batch se
obtiene que:
−𝑟𝐴 = −𝑑𝐶𝐴
𝑑𝑡 (15)
Igualando las ecuaciones (14) y (15) se tiene la ecuación (16):
𝑘𝐶𝐴 = −𝑑𝐶𝐴
𝑑𝑡 (16)
𝑑𝐶𝐴 = −𝑘𝐶𝐴𝑑𝑡 (17)
𝑑𝐶𝐴
𝐶𝐴= −𝑘𝑑𝑡 (18)
∫𝑑𝐶𝐴
𝐶𝐴
𝐶
𝐶0= − ∫ 𝑘𝑑𝑡
𝑡
0 (19)
𝑙𝑛 (𝐶𝐴
𝐶𝐴0) = −𝑘𝑡 (20)
La ecuación (20) representa la linealización para una cinética de primer orden, por ende
se procede a graficar, 𝑙𝑛 (𝐶𝐴
𝐶𝐴0) en función del tiempo (t). Dado el caso para el dia 0 se
obtiene que:
Cálculo modelo
𝑙𝑛 (𝐶𝐴
𝐶𝐴0) = 𝑙𝑛 (
3,922
3,922) = 0
Se determina la constante cinética de primer orden mediante la linealización de la
ecuación (20).
66
Figura 22. Linealización para cinética de primer orden
En la Figura 22, la pendiente de la curva de linealización es la constante cinética k, que
equivale a 0,00131
ℎ y su modelo cinético es: −𝑟𝐴 = 𝑘𝐶𝐴.
4.5.4. Cálculo de la concentración de d-limoneno teórica.
De la ecuación (20), despejamos la concentración teórica 𝐶𝐴, obteniéndose la ecuación
(22), que establece la concentración teórica de limoneno presente.
𝑙𝑛 (𝐶𝐴
𝐶𝐴0) = −𝑘𝑡 (20)
(𝐶𝐴
𝐶𝐴0) = 𝑒−𝑘𝑡 (21)
𝐶𝐴 = 𝑒−𝑘𝑡 ∗ 𝐶𝐴0 (22)
Cálculo modelo
𝐶𝐴 = 𝑒−0,0013∗0 ∗ 3,922
ln(𝐶𝐴/𝐶𝐴0 = -0,0013t + 0,0051R² = 0,9871
-0,12
-0,1
-0,08
-0,06
-0,04
-0,02
0
0,02
0 10 20 30 40 50 60 70 80
ln(𝐶
𝐴/𝐶
𝐴0
)
Tiempo (h)
67
𝐶𝐴 = 3,922𝑀
Figura 23. Concentración teórica de limoneno en función del tiempo
4.5.5. Cálculo de la velocidad de reacción teórica
A partir de la Figura 17, se obtiene la ecuación de concentración teórica de d-limoneno
en función de tiempo, cuya derivada representa la velocidad de reacción tal y como se
muestra en la ecuación (23).
Cálculo modelo
−𝑑𝑪𝑨
𝑑𝑡= 2(3 × 10−6) ∗ 𝑡 − 0,0053 (23)
−𝑑𝑪𝑨
𝑑𝑡= 2(3 × 10−6) ∗ 0 − 0,0053
−𝑟𝐴 = 0,0053
𝑪A = 3E-06t2 - 0,0053t + 3,9225R² = 1
3,5
3,55
3,6
3,65
3,7
3,75
3,8
3,85
3,9
3,95
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Co
nce
ntr
acio
n (
M)
Tiempo (h)
68
4.5.6. Error existente entre la concentración experimental de d-limoneno y la
teórica
El error establece la desviación existente entre el modelo experimental y el teórico el cual
es determinado por ecuación (24).
𝑠2 = (𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 − 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑎)2 (22)
Cálculo modelo
𝑠2 = (3,922 − 3,922)2
𝑠2 = 0
Donde:
s2: error individual de cada día de biotransformación.
4.5.7. Error total generado.
𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 =𝑠2+⋯+𝑛𝑠2
𝑛 (23)
𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 =0 + 0,002 + 0,0001 + 4,069 × 10−5 + 0,0007
5
𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 0,0006 ≈ 0
69
5. RESULTADOS
5.1. Extracción del Aceite esencial de naranja
Los resultados de la extracción de aceite esencial evidencian el proceso para la generación
del mayor rendimiento de aceite esencial y con un alto contenido de d-limoneno.
5.1.1. Cuantificación del porcentaje de rendimiento obtenido por destilación
simple.
En la Tabla 18, se evidencia los rendimientos individuales y los rendimientos promedios
al utilizar la destilación simple y arrastre de vapor como método de extracción de aceite
esencial de naranja, variando la especie de naranja y la relación de soluto-solvente.
Tabla 18. Resultados de los rendimientos al aplicar destilación simple como
método de extracción de aceites esenciales.
Factores Muest
ra
Rendimiento
(%)
Rendimiento
promedio (%)
Naranja Dulce
Destilación simple
R=1/2
M001 2,02
2,02 M009 2,03
M017 2,00
Naranja Dulce
Destilación simple
R=1/3
M002 2,22
2,22 M010 2,29
M018 2,16
M003 0,84 0,60
70
Naranja Dulce
Arrastre de vapor
R=1/2
M011 0,61
M019 0,35
Naranja Dulce
Arrastre de vapor
R=1/3
M004 1,04
0,92 M012 0,80
M020 0,92
Naranja Lima
Destilación simple
R=1/2
M005 1,23
1,08 M013 1,00
M021 1,01
Naranja Lima
Destilación simple
R=1/3
M006 1,31
1,46 M014 1,80
M022 1,26
Naranja Lima
Arrastre de vapor
R=1/2
M007 0,89
0,86 M015 0,91
M023 0,78
Naranja Lima
Arrastre de vapor
R=1/3
M008 0,59
0,45 M016 0,30
M024 0,46
El aceite esencial obtenido posee un rendimiento que rodea entre el 1,45 al 2,22 % en
peso, al realizar una destilación simple. Por otro lado, el rendimiento al aplicar un método
de destilación por arrastre de vapor es inferior al 1% en peso de aceite esencial obtenido,
En las Figuras 24 y 25, se representa de manera gráfica el rendimiento promedio total
para cada factor interviniente en los procesos de destilación para la obtención de aceite
esencial.
71
Figura 24. Rendimientos promedios al aplicar destilación simple como medio
de extracción de aceites esenciales.
Figura 25. Rendimiento promedio al aplicar destilación por arrastre de vapor
como medio de extracción de aceites esenciales.
Naranja Dulce(Citrus
Sinensis) -R=1/2
Naranja Lima(Hibrido) -
R=1/2
Naranja Dulce(Citrus
Sinensis) -R=1/3
Naranja Lima(Hibrido) -
R=1/3
PROMEDIO DERESULTADOS
2,01% 1,09% 2,22% 1,45%
0,00%
0,50%
1,00%
1,50%
2,00%
2,50%
Ren
dim
ien
to %
Especie de naranja - Relación cáscara pretratada
/ solvente (g cas. / g solvente)
Naranja Dulce(Citrus
Sinensis) -R=1/2
Naranja Lima(Hibrido) -
R=1/2
Naranja Dulce(Citrus
Sinensis) -R=1/3
Naranja Lima(Hibrido) -
R=1/3
PROMEDIO DERESULTADOS
0,60% 0,86% 0,92% 0,45%
0,00%
0,10%
0,20%
0,30%
0,40%
0,50%
0,60%
0,70%
0,80%
0,90%
1,00%
Ren
dim
ien
to %
Especie de naranja - Relación de cáscara pre tratada / solvente
72
5.1.2. Análisis estadístico de la extracción de aceite esencial de naranja.
Para el análisis estadístico en primer lugar se verifica los supuestos generados, tal y como
son la normalidad de los errores y la homogeneidad de la varianza. Todos los análisis
estadísticos fueron realizados en un software especializado Minitab 18.
5.1.2.1. Normalidad de los errores
Los residuos en un diseño experimental verifican como los factores y la interacción entre
ellos inciden en una variable de respuesta. A su vez con la generación de los residuos el
estadístico de Anderson Darlin (AD) permite medir que tan bien siguen los datos una
distribución especificada, para un conjunto de datos y distribución en particular, mientras
mejor se ajuste la distribución de datos menor será este estadístico.
En la Figura 26, se observa la probabilidad de residuos generada por los factores a analizar
en el diseño experimental como (especie, método, y relación soluto solvente) y la
interacción entre ellos en la variable rendimiento, la gráfica permite determinar como el
residuo generado se ajusta a una distribución normal.
Figura 26. Gráfica de probabilidad de residuos para rendimiento de aceite
esencial
73
Hipótesis;
Ho: los errores tienen una distribución normal
H: los errores no tienen una distribución normal
Nivel de significancia: α = 0,05
Estadístico de prueba. AD = 0,318
P-valor: 0,515
Decisión; No se rechaza la hipótesis nula (Ho)
Con una significancia del 5%, los errores tienen una distribución normal.
5.1.2.2. Homogeneidad de varianzas para el rendimiento de aceite esencial
El estadístico Bartlett prueba que todas las muestras provengan de poblaciones con la
misma varianza.
Tabla 19. Prueba de Bartlett
Método Estadística de prueba Valor p
Bartlett 11.60 0.115
TODO DE DESTILACION RELACION DE CASCARA PRETRATADA/ ESPECIE DE NARANJA
DESTILACION SIMPLE
ARRASTRE DE VAPOR
1/3
1/2
1/3
1/2
NARANJA LIMA
NARANJA DULCE
NARANJA LIMA
NARANJA DULCE
NARANJA LIMA
NARANJA DULCE
NARANJA LIMA
NARANJA DULCE
543210
Valor p 0.115
Prueba de Bartlett
Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para Desv.Es
Prueba de igualdad de varianzas: RESID vs. METODO DE DESTILACION; REL
74
Figura 27. Prueba de igualdad de varianzas para rendimiento de aceite
esencial
Hipótesis;
Ho: las varianzas son iguales (homogéneas)
H: al menos una varianza es diferente
Nivel de significancia: α = 0,05
Estadístico de prueba. Bartlett = 11,6
P-valor: 0,115
Decisión; No se rechaza la hipotesis nula (Ho)
Con una significancia del 5%, las varianzas son homogéneas.
5.1.2.3. Influencia de los niveles de la especie de naranja, método aplicado y relación
soluto-solvente en el rendimiento de aceite esencial obtenido.
Tabla 20. Análisis de varianza (Prueba ANOVA), para rendimiento de aceite
esencial
Fuente GL SC MC F P
Método de destilación 1 5.79184 5.79184 63.11 0.000
Especie de naranja 1 1.36804 1.36804 14.91 0.001
Relación de soluto/solvente 1 0.08284 0.08284 0.90 0.353
Error 20 1.83538 0.09177
Total 23 9.07810
Donde:
75
GL : grados de libertad
SC: suma de cuadrados.
MC: media de cuadrados
F: factor de Fisher
P: probabilidad
La Tabla 20, determina el ANOVA que descompone la variabilidad de porcentaje (%) de
rendimiento en peso en las contribuciones debidas a los factores intervinientes en la
experimentación. Los valores de P aprueban la significación estadística de cada uno de
los factores.
Dado el caso del método de destilación y especie de naranja donde sus valores son
inferiores a α=0,05, poseen un efecto estadísticamente significativo sobre el % de
rendimiento al nivel de confianza de 95%. En el caso de la relación soluto-solvente, el
valor generado por el análisis ANOVA es superior a α=0,05, por lo tanto, no posee un
efecto estadísticamente significativo sobre el porcentaje de rendimiento.
5.1.2.4. Comparaciones múltiples.
El método de Tukey se utiliza para comparar las medias de los tratamientos elaborados
en la extracción del aceite esencial determinado por el rendimiento generado en el
proceso, para finalmente evaluar las hipótesis supuestas.
La Tabla 21, presenta la información a ser utilizada para el método de Tukey con un nivel
de confianza del 95%, donde las agrupaciones son diferenciadas por letras (A, B, C, D)
determinando que las agrupaciones que no comparten una letra son significativamente
diferentes en sus medias.
76
Tabla 21. Comparaciones múltiples para la extracción de aceite esencial
Método de destilación*relación de
cáscara pretratada/*especie de naranja N Media Agrupación
Destilación simple 1/3 naranja dulce 3 2.22000 A
Destilación simple 1/2 naranja dulce 3 2.01333 A
Destilación simple 1/3 naranja lima 3 1.44667
B
Destilación simple 1/2 naranja lima 3 1.08333
B C
Arrastre de vapor 1/3 naranja dulce 3 0.92000
C D
Arrastre de vapor 1/2 naranja lima 3 0.86667
C D E
Arrastre de vapor 1/2 naranja dulce 3 0.60000
D E
Arrastre de vapor 1/3 naranja lima 3 0.44667
E
Con una significancia del 5% se puede afirmar que las interacciones convenientes para
obtención de un alto rendimiento en la extracción de aceite esencial son las determinadas
por la agrupación A, donde la media varia de 2,22 a 2,01 % en peso. Y donde la
agrupación E determina las condiciones menos favorables e ineficientes para realizar la
extracción de aceite esencial, con una media aproximada de 0,44667 % en peso.
En la Figura 28, se evidencia gráficamente el comportamiento de la especie de naranja,
método de destilación y relación soluto:solvente en comparación a la media.
77
Figura 28. Efectos principales para el rendimiento de la extracción de aceite
esencial
La Figura 28, se observa que la destilación simple, la naranja dulce y una relación de
soluto:solvente de 1/3, son las condiciones que superan la media del proceso, con lo cual
se establece que son los factores adecuados para la obtención de un alto rendimiento de
aceite esencial.
5.2. Contenido de d-limoneno en el aceite esencial obtenido.
La concentración de d-limoneno en el aceite esencial se evidencia en al Tabla 22, en la
cual se detalla el contenido existente de d-limoneno en la solución analizada por el GC-
MS, el volumen contenido en dicha solución y finalmente la concentración de d-limoneno
en el aceite esencial extraído
.
78
Tabla 22. Concentración de d-limoneno en el aceite esencial obtenido
Factores Muestra
Concentración
(d-limoneno
ml/ solución
ml)
Volumen de d-
limoneno en
1.6 ml de
solución
Volumen de
d-limoneno
en 0.1ml de
aceite
esencial
Concentraci
ón (d-
limoneno ml
/ ml aceite
esencial)
Naranja Dulce
Destilación
simple
R=1/2
M001 0,0466 0,0746 0,0746 0,746
M009 0,0051 0,0082 0,0082 0,082
M017 0,0288 0,0460 0,0460 0,460
Naranja Dulce
Destilación
simple
R=1/3
M002 0,0513 0,0821 0,0821 0,821
M010 0,0371 0,0593 0,0593 0,593
M018 0,0489 0,0783 0,0783 0,783
Naranja Dulce
Arrastre de
vapor
R=1/2
M003 0,0311 0,0497 0,0497 0,497
M011 0,0309 0,0494 0,0494 0,494
M019 0,0435 0,0696 0,0696 0,696
Naranja Dulce
Arrastre de
vapor
R=1/3
M004 0,0461 0,0738 0,0738 0,738
M012 0,0485 0,0776 0,0776 0,776
M020 0,0176 0,0281 0,0281 0,281
Naranja Lima
Destilación
simple R=1/2
M005 0,0331 0,0530 0,0530 0,530
M013 0,0133 0,0212 0,0212 0,212
M021 0,0023 0,0036 0,0036 0,036
Naranja Lima
Destilación
simple R=1/3
M006 0,0006 0,0010 0,0010 0,010
M014 0,0440 0,0703 0,0703 0,703
M022 0,0257 0,0411 0,0411 0,411
Naranja Lima
Arrastre de
vapor R=1/2
M007 0,0005 0,0009 0,0009 0,009
M015 0,0006 0,0009 0,0009 0,009
M023 0,0037 0,0059 0,0059 0,059
Naranja Lima
Arrastre de
vapor R=1/3
M008 0,0344 0,0550 0,0550 0,550
M016 0,0005 0,0008 0,0008 0,008
M024 0,0240 0,0385 0,0385 0,385
79
5.2.1. Análisis estadístico del contenido de d-limoneno en el aceite esencial obtenido.
Para el análisis estadístico en primer lugar se verifica los supuestos generados, tal y como
son la normalidad de los errores y la homogeneidad de la varianza. Todos los análisis
estadísticos fueron realizados en un software especializado Minitab 18.
5.2.1.1. Normalidad de los errores en el contenido de aceite esencial.
En la Figura 29, se evidencia la gráfica de normalidad de los residuos generados al evaluar
los factores intervinientes en el contenido de d-limoneno al ser estudiados.
Figura 29. Gráfica de probabilidad de residuos
Hipótesis;
Ho: los errores tienen una distribución normal
H: los errores no tienen una distribución normal
Nivel de significancia: α = 0,05
80
Estadístico de prueba. AD = 0,352
P-valor: 0,440
Decisión; No se rechaza la hipótesis nula (Ho)
Con una significancia del 5%, los errores tienen una distribución normal.
5.2.1.2. Homogeneidad de varianzas en los rendimientos de aceite esencial.
En la Tabla 23, se evidencia la homogeneidad de varianzas referente al contenido de d-
limoneno evaluado en las muestras de extracción.
Tabla 23. Prueba Bartlett para el contenido de d-limoneno
Figura 30. Prueba de igualdad de varianzas para la concentración de d-
limoneno en aceite esencial
Hipótesis;
Ho: las varianzas son iguales (homogéneas)
Especie naranja Método Relación
Naranja Lima
Naranja Dulce
Destilación Simple
Arrastre de vapor
Destilación Simple
Arrastre de vapor
1/3
1/2
1/3
1/2
1/3
1/2
1/3
1/2
76543210
Valor p 0.262
Prueba de Bartlett
Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para Desv.Est.
rueba de igualdad de varianzas: RESID vs. Especie naranja; Método; Relació
Método Estadística de prueba Valor p
Bartlett 8.88 0.262
81
H: al menos una varianza es diferente
Nivel de significancia: α = 0,05
Estadístico de prueba. Bartlett = 8.88
P-valor: 0,262
Decisión; No se rechaza la hipótesis nula (Ho)
Con una significancia del 5%, las varianzas son homogéneas.
5.2.1.3. Influencia de los niveles de la especie de naranja, método aplicado y relación
soluto-solvente en el rendimiento de aceite esencial obtenido.
Tabla 24. Análisis de varianza para el contenido de d-limoneno en el aceite
esencial (Prueba ANOVA)
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Especie naranja 1 0,68145 0,681445 11,43 0,004
Método 1 0,03271 0,032706 0,55 0,470
Relación 1 0,20664 0,206643 3,47 0,081
Especie naranja*Método 1 0,03223 0,032225 0,54 0,473
Especie naranja*Relación 1 0,00155 0,001551 0,03 0,874
Método*Relación 1 0,00324 0,003239 0,05 0,819
Especie naranja*Método*Relación 1 0,07266 0,072659 1,22 0,286
Error 16 0,95356 0,059597
Total 23 1,98402
La Tabla 24, determina el ANOVA que descompone la variabilidad de concentración en
las contribuciones debidas a varios factores. Los valores de P aprueban la significación
estadística de cada uno de los factores.
82
La especie de naranja posee valores inferiores a α=0,05, por tanto, tienen un efecto
estadísticamente significativo sobre la concentración de d-limoneno al nivel de confianza
de 95%. Por otra parte, las demás interacciones y factores, sus valores generados por el
análisis ANOVA es superior a α=0,05, por lo tanto, no posee un efecto estadísticamente
significativo sobre la concentración de d-limoneno, tal y como se observa en la Figura
25, referente a los efectos principales del rendimiento de aceite esencial.
Figura 31. Efectos principales para la concentración de d-limoneno en el
aceite esencial extraído
5.2.1.4. Comparaciones múltiples de los niveles en el rendimiento de aceite esencial.
La Tabla 25., presenta la información a ser utilizada para el método de Tukey con un nivel
de confianza del 95%, donde las medias que no comparten una letra son
significativamente diferentes.
83
Tabla 25. Comparaciones múltiples la concentración de d-limoneno en el
aceite esencial
Especie naranja*Método*Relación N Media Agrupación
Naranja Dulce Destilación Simple 1/3 3 0.732167 A
Naranja Dulce Arrastre de vapor 1/3 3 0.598344 A B
Naranja Dulce Arrastre de vapor 1/2 3 0.562119 A B
Naranja Dulce Destilación Simple 1/2 3 0.429386 A B
Naranja Lima Destilación Simple 1/3 3 0.374479 A B
Naranja Lima Arrastre de vapor 1/3 3 0.314173 A B
Naranja Lima Destilación Simple 1/2 3 0.259630 A B
Naranja Lima Arrastre de vapor 1/2 3 0.025702 B
Con una significancia del 5% se puede afirmar que las interacciones convenientes la
óptima concentración de d-limoneno en la extracción de aceite esencial son las
determinadas por la agrupación A.
5.3. Propiedades fisicoquímicas del aceite esencial de naranja extraído de las
cáscaras de naranja.
Las propiedades de índole fisicoquímicas permiten la caracterización del aceite esencial
extraído, con la cual se permite la conversión de unidades para el proceso de
biotransformación del aceite esencial.
84
5.3.1. Propiedades fisicoquímicas del aceite esencial de naranja extraído de las
cáscaras de naranja.
En la Tabla 26, se evidencia las propiedades características del aceite esencial extraído, a
su mejor condición de rendimiento como se evidencia en las tablas 19 y 20, referente al
rendimiento de extracción.
Tabla 26. Propiedades fisicoquímicas del aceite de naranja extraído
Propiedad Valor
pH 3.34
Densidad (g/ml) 0.84822
Olor Característico
Color Incoloro
5.4. Resultados Crecimiento Penicillium en medio de cultivo.
En las Tablas 27 y 28, se detallan el promedio de las absorbancias de los medios de cultivo
a diferentes relaciones de solución de esporas emitidas por el espectrofotómetro UV-VIS.
Tabla 27. Absorbancias 24 horas después con medio Abraham
Volumen Medio = 25 ml Volumen Medio= 50 ml Volumen Medio= 100
ml
Volumen esporas = 4 ml Volumen esporas= 4 ml Volumen esporas= 4 ml
Réplica Absorbancia Réplica Absorbancia Réplica Absorbancia
1 1,4127 1 1,6554 1 0,773
2 1,6709 2 1,4772 2 0,813
85
Tabla 28. Absorbancias 24 horas después con medio Czapek-Dox.
Volumen Medio = 25 ml Volumen Medio= 50 ml Volumen Medio= 100
ml
Volumen esporas = 4 ml Volumen esporas= 4 ml Volumen esporas= 4 ml
Réplica Absorbancia Réplica Absorbancia Réplica Absorbancia
1 0,3968 1 0,4000 1 0,3769
2 0,4352 2 0,3895 2 0,3791
5.4.1. Análisis estadístico para el medio de cultivo y concentración
5.4.1.1.Normalidad de residuos
En la Figura 32, para el conocimiento del tipo de distribución a la cual los datos se ajustan
o poseen una tendencia se evalúa el estadístico de Anderson Darling.
Figura 32. Gráfica de probabilidad de residuos la selección de medio de
cultivo
86
Hipótesis:
Ho: Los errores tienen una distribución normal.
H1: Los errores no tienen distribución normal.
Nivel de significación: α=0,05
Hipotesis;
Ho: las varianzas son iguales (homogéneas)
H: al menos una varianza es diferente
Nivel de significancia: α = 0,05
Estadístico de prueba. Anderson Darling: AD = 0,329
P-valor: 0,462
Decisión; No se rechaza la hipotesis nula (Ho)
Con una significancia del 5%, las errores poseen una distribución normal.
5.4.1.2.Homogeneidad de Varianzas
El estadístico Bartlett prueba que todas las muestras provengan de poblaciones con la
misma varianza.
Tabla 29. Prueba de Bartlett medios de cultivo
Método Estadística de
prueba
Valor p
Bartlett 12,77 0,026
87
Figura 33. Prueba de igualdad de varianza.
5.4.1.3. Influencia de los niveles de tipo de medio de cultivo y concentración en
relación a las absorbancias.
Tabla 30. Información del factor
Factor Tipo Niveles Valores
Medio Fijo 2 1. 2
Concentración Fijo 3 25. 50. 100
Tabla 31.Análisis de Varianza
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Medio 1 2,8108 2,81078 152,74 0,000
Concentración 2 0,3388 0,16941 9,21 0,015
Medio*Concentración 2 0,4693 0,23463 12,75 0,007
Error 6 0,1104 0,01840
Total 11 3,7293
MEDIO CONCENTRACION
2
1
100
50
25
100
50
25
50403020100
Valor p 0,026
Prueba de Bartlett
Intervalos de confianza de Bonferroni de 95% para Desv.Est.
Prueba de igualdad de varianzas: RESID vs. MEDIO. CONCENTRACION
88
Partimos de la hipótesis en la que:
Ho: No hay interacción de los niveles concentración y medio.
H1: Hay interacción de los niveles concentración y medio
Con la que determinamos que con una significancia del 5% y con un P-valor=0,007, que
es menor al valor de α. Existe un efecto significativo de la combinación de los niveles del
medio y concentración.
5.4.1.4.Comparaciones Múltiples.
Para el análisis de efectos principales realizaremos comparaciones por parejas de Turkey
entre la combinación de los niveles medio y concentración, obteniendo los siguientes
resultados, en la Tabla 32.
Tabla 32. Comparaciones para absorbancia del crecimiento de esporas de
Penicillium
Medio*concentración N Media Agrupación
1 50 2 1,56630 A
1 25 2 1,54180 A
1 100 2 0,79300 B
2 50 2 0,39475 B C
2 100 2 0,37800 B C
2 25 2 0,22450 C
89
Figura 34.. ICs simultaneos de Turkey para el crecimiento de esporas de
Penicillium
Figura 35. Gráficas de efectos principales para el crecimiento de esporas de
Penicillium
90
5.5. Proceso de biotransformación de d-limoneno
En la Tabla 33, se observan las velocidades de reacción para cada concentración a los
diferentes tiempos establecidos, con un modelo cinético de primer orden.
−𝑟𝐴 = 𝑘𝐶𝐴
Tabla 33. Velocidad de reacción teórica
𝑪𝑨 -𝒓𝑨
3,9225 0,0053
3,8443 0,00521
3,6974 0,005036
3,5753 0,004886
3,5466 0,00485
En la Figura 36, se evidencia el consumo de d-limoneno en un lapso de 5 días de
biotransformación para la formación de terpenos, al igual que la generación de
terpenoides derivados del limoneno producto de la biotransformación.
Los espectros individuales de cada día de biotransformación y los compuestos obtenidos
del proceso se evidencian en el Anexo J, en la cual se distinguen los diversos compuestos
formados al igual que el consumo de d-limoneno producto de la biotransformación.
91
Figura 36. Espectros combinados de cada día de biotransformación de d-limoneno
92
5.5.1. Resultados de la desviación de la concentración experimental con la teórica
En la Tabla 34., se observan las concentraciones teóricas y experimentales, su
comparación para la determinación del error.
Tabla 34. Cálculo del error
Concentración
Experimental (M)
Concentración
Teórica (M)
𝑺𝟐
3,917571579 3,91757158 0
3,888120499 3,83943159 0,00237061
3,70634883 3,69275296 0,00018485
3,577182739 3,57081138 4,0594E-05
3,568968789 3,54214967 0,00071927
Error 0,00066306
5.5.2. Formación de terpenos analizados por Cromatografía de gases y
espectrometría de masas
En la Tabla 35., que se encuentra a continuación, se describen los productos obtenidos
cada día de la biotransformación, los mismos que están detallados en el Anexo J.
93
Tabla 35. Descripción de la formación de terpenos
Día Compuesto
Día 0 D-limoneno
Día 1
D-limoneno
Butanol
2-Pentanona, 5-metoxy
Día 2
D-limoneno
Butanol
2-Ciclopentana-1-one, 2-metil
Día 3
D-limoneno
Butanol
Ciclohexa, 4-metilene-1-(1-methiletil)-
Día 4
D-limoneno
1-Bencil-3,3-dimetildiaziridine
6-Etoxy-6-metil-2-ciclohexanone
Oxirane, (1,1-dimetilbutil)-
Bencene, 1-metil-4-[(2-propeniloxy)metil]-
1,6-Octadien-3-ol, 3,7-dimetil-, propanone
Día 5
D-limoneno
1R)-2,6,6-Trimetilbiciclo[3.1.1]hept-2-ene
β-Mircene
Octanal
Ciclohexene, 4-metilene-1-(1-metilethil)-
γ-Terpineno
Ciclopropane, pentil-
Ciclohexene, 1-methil-4-(1-metiletilidene)-
Limoneno oxide, cis-
Ciclohexanol, 1-methil-4-(1-metiletenil)-, cis-
Decanal
trans-Carveol
2-Ciclohexen-1-ol, 2-metil-5-(1-metilethenil)-, cis
94
6. DISCUSIÓN
6.1. Extracción del aceite esencial
• Las diferencias estadísticas en el rendimiento de aceite esencial referente al
método de destilación aplicado y las especies de naranja a ser utilizados son
significativas tal y como se en la Tabla 17, que indican que el método adecuado
para la extracción de aceite esencial es la destilación simple utilizando naranja
dulce como materia prima durante un lapso de 1 hora de ejecución del proceso
para la obtención máxima de 2,22% de rendimiento de aceite esencial. El
rendimiento se ve afectado por la especie de naranja utilizada, ya que al utilizar
un hibrido en la experimentación el contenido de aceite esencial en la cáscara de
naranja difiere de la naranja dulce sin hibridar, esto por la presencia de otra agua
y otros componentes provenientes de la hibridación con la lima, por otro lado, el
método de extracción afecta en la rapidez del proceso debido a la generación y el
flujo de vapor que interactúa con la materia prima.
• El contenido de d-limoneno presente en el aceite esencial posee diferencias
estadísticas significativas referente a la especie de naranja utilizada. Los
resultados mostrados Figura 25, muestran que la naranja posee una media de
(0,25) que se encuentra muy por debajo de la media obtenida por la naranja dulce
(0,58), esto es debido a que la naranja lima es una hibridación de la naranja común,
por ende, en la composición del aceite esencial se evidencia la reducción del
contenido de d-limoneno reemplazo por compuestos provenientes de la lima.
• Según los estudios de Paredo-Luna H. A., Palou-García y López-Malo A. (2009)
en su obra, “Aceites esenciales: métodos de extracción”, afirma que: la extracción
con disolventes tiene la desventaja de que el aceite obtenido posee en su
composición trazas de los disolventes utilizados, con lo cual se limita su uso en la
95
experimentación debido a que el objetivo es obtener el d-limoneno en su mayor
pureza posible; por ende, el agua es el solvente seleccionado debido a la poca
afinidad que posee con el aceite esencial y facilita los procesos de separación entre
el soluto y solvente por ser componentes inmiscibles..
• La presencia de etanol en el aceite esencial tal y como se observa en el Anexo D.
es debido a un proceso de fermentación en la cáscara de la naranja, producto de la
oxidación de los compuestos orgánicos presentes en su estructura, lo cual
disminuye la concentración de d-limoneno en el destilado y la pureza de aceite
esencial.
• El proceso de destilación para los métodos aplicados fue aproximado de 1 hora,
debido a dificultades presentadas, tal como la evaporación del solvente, que en el
proceso de destilación simple dificulta la agitación provocando la sedimentación
de la materia prima ocasionando reacciones de degradación térmica, y en la
destilación por arrastre de vapor la reducción del agua, el descenso en la
generación de vapor que interactuara con la cáscara de naranja pretratada.
• Los parámetros de extracción difieren de otros autores debido a las condiciones
medioambientales existentes, en este caso realizado en la ciudad de Quito con
una presión atmosférica que rodea 0,7106 atm donde alcanzar el punto de
ebullición fue efectuada con mayor rapidez 92ºC, en comparación a la presión
atmosférica 100ºC, por eso según la obra realizada por Florencia Verónica Grasso:
“Diseño del proceso: Pretratamiento enzimático para la extracción de aceites
vegetales en un extractor de columna”, afirma que: estudios realizados emplean
parámetros diferentes de extracción para la obtención de resultados específicos, a
las condiciones del sistema propuesto.
6.2. Crecimiento de esporas de Penicillium en Medios de Cultivos
• Se determinó diferencias estadísticas significativas en el medio de cultivo para el
crecimiento de las esporas de Penicillium, tal y como se muestra en la Figura 28,
determinando al medio Abraham como el medio apto para el crecimiento del
96
hongo, esto debido a que el medio Abraham posee una composición netamente
orgánica en comparación con el medio Czapek Dox, que posee una composición
semisintética, que al no poseer los nutrientes necesarios el crecimiento de las
esporas se efectúa en menor concentración en un lapso de 24 horas.
• La Figura 28, evidencia que a mayor cantidad de medio de cultivo expuesto a la
solución de esporas de Penicillium en un lapso de 24 horas, la concentración de
esporas es menor, ya que el consumo de los nutrientes de los medios de cultivo se
efectúa con menor rapidez, para la saturación del medio de cultivo con esporas.
• El método UV-VIS, utilizado para la determinación del crecimiento del
Penicillium, no es comúnmente utilizado para la determinación del crecimiento
de microorganismo, pero en si determina cuantitativamente la absorbancia
generada en un periodo de tiempo de crecimiento, corroborando los datos
obtenidos de la bibliografía, en la actualidad se utilizan métodos exactos de
análisis turbidimétricos, o de dispersión de luz para recuentos microbianos, que
identifican el crecimiento de microorganismos en específico.
• Es importante al realizar el crecimiento del hongo manteniendo una agitación
constante, esto impide que las células se sedimenten en el fondo logrando que se
realice un proceso uniforme, obteniendo datos más precisos, además aumenta la
superficie de contacto, sin embargo, en ciertos momentos se pudo formar espuma,
la cual provoca una dificultad para la circulación de aire o gases, la cual pudo
haber incidido en los resultados tanto para el crecimiento como para la
biotransformación
• Para la toma de muestras fue necesaria una manipulación manual, lo que incide
que se produzcan ligeras contaminaciones que pudieron incidir en la evaluación
del crecimiento, o en el caso de la biotransformación cambios bruscos en el
consumo del limoneno debido a la volatilización del mismo.
97
6.3. Biotransformación de d-limoneno a terpenos
• En la Figura 29, se evidencia que el d-limoneno genera una variedad de terpenos
derivados, esto fue suscitado por la elección de una cepa de Penicillium no
concretamente identificada y aislada, con lo cual las enzimas intervinientes en el
proceso de biotransformación son las que producen una gama alta de compuestos
derivados del d-limoneno, debido a que cada enzima producida por el hongo tiene
la tendencia a generar un producto en específico a las condiciones adecuadas.
• La Tabla 34., evidencia una gran variedad de compuestos formados por el proceso
de biotransformación, que son compuestos derivados del d-limoneno, a su vez
también se evidencia compuestos que difieren a la estructura de un terpeno, esto
pudo deberse a la contaminación debido al medio de cultivo y al disolvente
utilizado para la separación de los productos generados.
• El modelo cinético establecido para la determinación del consumo de d-limoneno
al utilizar enzimas generadas por el Penicillium, no determina la selectividad de
cada producto obtenido, por ende, es un modelo que abarca un análisis general del
comportamiento enzimático, de las esporas de las especies de Penicillium al
usarse como biocatalizador en un proceso de biotransformación.
• El análisis del contenido de d-limoneno en el proceso de biotransformación fue
estimado por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, ya que
es una técnica instrumental combinada capaz de separar e identificar mezclas
complejas, posee una alta precisión y exactitud al cuantificar (basándose en un
estándar de alta pureza) y cualificar los diferentes componentes que existan
inyectando una pequeña cantidad de muestra. La limitación del método radica que
es una técnica de medición discontinua.
• El análisis del consumo de d-limoneno en el proceso de biotrasformacion fue
realizado cada 24 horas, a temperatura ambiente, debido a las limitaciones del uso
del equipo, así como de los tiempos para realizar en ensayo.
98
• Para el proceso de biotransformación se utilizaron matraces como reactores, los
cuales son poco eficientes, debido a que no se pueden controlar factores como:
temperatura uniforme, humedad del ambiente, cambios de pH, entre otros; que
impiden que el proceso se realice homogéneamente. En la actualidad existen
sistemas de reactores batch que pueden lograr un mejor control de estas variables
medioambientales.
99
7. CONCLUSIONES
• El rendimiento de aceite esencial de naranja extraído esta entre 0,3 a 2,22 %, que
es un rendimiento aceptable, ya que el rango comúnmente de aceite extraído esta
alrededor 0,7 a 2,7% de aceite esencial, según Irene Casado Villaverde en su obra
“Optimización de la extracción de aceites esenciales por destilación en corriente de
vapor”.
• Mediante la aplicación de un proceso de destilación simple se obtiene un
rendimiento máximo de 2,22% en un lapso de 1 hora de ejecución del proceso,
utilizando naranja dulce y relación 1/3 y mediante la aplicación de un proceso de
destilación por arrastre de vapor se obtiene un rendimiento máximo de 0,92% en un
lapso de 1 hora de ejecución del proceso utilizando naranja dulce y una relación 1/3
tal y como se observa en la Figura 18.
• Según las comparaciones múltiples de Turkey se estima que la mejor condición para
la extracción de aceite esencial es mediante el uso de la naranja dulce y utilizando
un proceso de destilación simple; debido a que la relación soluto-solvente no influye
estadísticamente porque sus medias son similares aproximadamente de 2,22 y 2,01,
el uso del solvente puede ser tanto a una relación 1/2 y 1/3.
• Existe mayor contenido de d-limoneno en la naranja dulce debido a la pureza de la
fruta en cambio la naranja lima a tratarse de un hibrido posee diversos
constituyentes debido a la hibridación.
• El análisis ANOVA presentado en la Tabla 30., referente al crecimiento de
Penicillium, determina que el medio de cultivo, la relación suspensión de esporas-
medio y la interacción entre los factores poseen diferencias estadísticamente
100
significativas en el crecimiento del Penicillium, con un nivel de significancia del
95%.
• La comparación múltiple de Turkey establece que la interacción entre el medio
Abraham y la concentración de suspensión de esporas – medio, ya sea a 25 o 50 ml
generan el mayor crecimiento de Penicillium, debido a que sus medias son
relativamente similares (1,56 y 1,54).
• La formación de terpenos en los dos primeros días es mínima, ya que solo se forman
algunos pocos productos en forma de largas cadenas de carbono, a partir del tercer
día esta producción aumenta considerablemente con la formación de compuestos
de estructuras más definidas y complejas como se observa en el Anexo J.
• La determinación de la absorbancia de los medios de cultivo en el
espectrofotómetro UV-VIS, demuestra la turbidez del medio generada después de
24 horas de exposición a las esporas de Penicillium, sin embargo, al ser un análisis
discontinuo puede afectar la pureza de las muestras debido a microorganismo en el
medio ambiente.
• La biotransformación de d-limoneno se ajusta a una cinética de primer orden en un
rango de concentraciones de [3,92 – 3,57]M, con una constante cinética aproximada
de 0,0013 1
ℎ. , con un error general respecto a la cinética teórica de: 0,0006.
101
8. RECOMENDACIONES
8.1. Extracción del Aceite Esencial
• La maduración de la naranja en el proceso de extracción define el rendimiento de
aceite esencial a ser obtenido, por ende la especie de naranja debe encontrarse en
un nivel dos de maduración donde la producción de aceite esencial es máxima y
no hay fermentación existente en la cáscara de la naranja que interfiera en la
composición final del aceite esencial
• Al efectuar el proceso de decantación para la separación de la fase orgánica del
sistema aceite-agua, puede ser necesario la utilización de procesos
complementarios que eliminen las micelas de agua en el aceite. El uso de
sustancias higroscópicas capaces de adsorber el agua contenida en el aceite como
el sulfato sodio anhidro, además de la utilización de procesos de evaporación a
vacío que eliminen las trazas de compuestos existentes en el aceite esencial por
diferencia de puntos de ebullición mediante la utilización de un rotavapor.
• El Ecuador además de poseer a la naranja lima y naranja dulce como especies de
naranja comúnmente comercializadas, tiene a variedad de cítricos a los cuales no
se le da importancia a nivel alimenticio debido al sabor tal y como es el caso de
la naranja amarga debido a su alto contenido de limonina en su composición, esta
fruta puede llegar a tener un uso industrial en la fabricación de aceites esenciales
al analizar en primer lugar el rendimiento generado por la fruta.
• La factibilidad y estabilidad económica al realizar la extracción por métodos
basados en la destilación, comparados con métodos tradicionales comúnmente
aplicados en la Industria Cosmética, deben ser evaluados considerando
parámetros como los recursos energéticos y la pureza del aceite esencial obtenido.
102
• La caracterización del aceite esencial para venta y consumo en el Ecuador debe
basarse en normativas INEN de a la finalidad que posea el aceite esencia ya sea
alimenticio, cosmético o farmacéutico, por ende, es necesario la evaluación de
parámetros fisicoquímicos, microbiológicos, químicos que aseguren la calidad
del aceite esencial para su venta y comercialización.
8.2. Selección de medio de cultivo para el crecimiento de Penicillium.
• Analizar el comportamiento de crecimiento que posee las especies de Penicillium
al desarrollarse en un medio u otro, para que por medio de un modelo matemático
se prediga la cinética de generación de esporas.
• Utilizar métodos instrumentales que evidencien de manera cuantitativa el
crecimiento de hongos, ya sea por el conteo microbiano u otros métodos
8.3. Biotransformación de d-limoneno.
• En la extracción liquido-liquido suscitada para la separación del limoneno y los
terpenos generados mediante el uso de di etil éter, es necesario el análisis del
comportamiento del diagrama ternario de fases a temperatura ambiente, debido a
que parte del producto de interés (terpenos) no se concentra en su totalidad en el
extracto y parte de este se pierde en el refinado.
• La biotransformación de d-limoneno mediante la utilización de Penicillium
conlleva a la producción de diferentes derivados del limoneno, por ende, es
necesario el estudio de un modelo cinético que involucre la generación de todos
los subproductos, tal y como son los modelos cinéticos enzimáticos competitivos
y no competitivos.
103
• En las primeras etapas de biotransformación de d-limoneno se genera el mayor
consumo de la materia prima, es por eso que es determinante analizar el
comportamiento cinético en la fase inicial de transformación para estimar un
modelo que abarque toda la etapa de generación de terpenos en el proceso.
• Es necesario evaluar el comportamiento de la cinética de biotransformación a
diferentes concentraciones de d-limoneno, para corroborar que el comportamiento
de la velocidad de reacción responde a un modelo cinético de primer orden a
cualquier concentración.
• Realizar un estudio económico que determine si el proceso de biotransformación
de terpenos reduciría los costos de producir sus derivados
• Ampliar la investigación realizar la biotransformación con distintos tipos de
hongos, en distintas condiciones, con la finalidad de evidenciar el comportamiento
cinético del d-limoneno ante diversas especies de microorganismo y la generación
de productos de interés en el tiempo.
104
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107
ANEXOS
108
Anexo A. Materiales y equipos empleados
Figura A.1. Balón de destilación
Figura A.2. Balón de tres bocas
Figura A.3. Vasos de precipitación
Figura A.4. Plancha de Calentamiento
Figura A.5. Termómetro
Figura A.6.Probetas
Figura A.7. Molino
Figura A.8. Refrigerante
109
Figura A.9. Corchos
Figura A.10. Adaptador para destilación
Figura A.11. Kitasato
Figura A.12. Frascos ámbar
Figura A.13. Cronometro
Figura A.14.Soporte Universal
Figura A.15. Pinzas
Figura A.16. Agitador magnético
110
Figura A.17. Embudo de decantación
Figura A.18. Viales
Figura A.19. Mangueras
Figura A.20. Espátula
Figura A.22. Embudo
Figura A.23. Balanza analítica
Figura A.24. Espectrómetro de masas GC ALS
111
Figura A.25. Balones aforados
Figura A.26. Asa bacteriológica
Figura A.27. Matraces
Figura A.28. Autoclave
Figura A.29. Celda para
espectrofotómetros
Figura A.30. Espectrofotómetro UV-VIS
Figura A.31. Picnómetro
Figura A.32. Tubos de ensayo
112
Figura A.33. Cámara de flujo laminar
Figura A.34. Mechero bunsen
Figura A.35. Caja Petri
Figura A.36. Frasco de vidrio
Figura A.37. Balanza analítica
Figura A.38. Parafilm
Figura A.39. Potenciómetro
Figura A.40. Fundas autoclavables
113
Figura A.41. Micropipetas
Figura A.42. Micropipetas automáticas
114
Anexo B. Diagramas de equipos para la extracción de aceite esencial
Figura B.1. Diagrama de equipo destilación simple
Figura B.2. Diagrama de equipo destilación por arrastre de vapor
115
Anexo C. Procesos realizados en la extracción de aceite esencial de naranja.
Figura C.1. Proceso de acondicionamiento de la materia prima (cáscara pretratada)
La Figura C.1, detalla la materia prima acondicionada al someterse a un proceso de
molienda, provocando un aumento en el área superficial y la disminución del tamaño
de partícula.
Figura C.2. Proceso de decantación del aceite esencial.
La Figura C.2, da a conocer el proceso de decantación realizado, en el cual se distinguen
dos fases claramente diferenciadas, la fase menos densa correspondiente al aceite
esencial y la fase más densa correspondiente al solvente (agua).
116
Anexo D. Cromatogramas y respuestas para la determinación de contenido de
limoneno en el aceite esencial extraído, analizadas en el GC-MS.
Figura D.1. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M001.
Figura D.2. Espectro de la composición la muestra M001
117
Figura D.3. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M002
Figura D.4. Espectro de la composición la muestra M002.
118
Figura D.5. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M003
Figura D.6. Espectro de la composición la muestra M003.
119
Figura D.7. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M004
Figura D.8. Espectro de la composición la muestra M004.
120
Figura D.9. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M005
Figura D.10. Espectro de la composición la muestra M005.
121
Figura D.11. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M006
Figura D.12. Espectro de la composición la muestra M006.
122
Figura D.13. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M007
Figura D.14. Espectro de la composición la muestra M007.
123
Figura D.15. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M008
Figura D.16. Espectro de la composición la muestra M008.
124
Figura D.17. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M009
Figura D.18. Espectro de la composición la muestra M009.
125
Figura D.19. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M010
Figura D.20. Espectro de la composición la muestra M010.
126
Figura D.21. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M011
Figura D.22. Espectro de la composición la muestra M011.
127
Figura D.23. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M012
Figura D.24. Espectro de la composición la muestra M012.
128
Figura D.25. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M013
Figura D.26. Espectro de la composición la muestra M013.
129
Figura D.27. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M014
Figura D.28. Espectro de la composición la muestra M014.
130
Figura D.29. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M015
Figura D.30. Espectro de la composición la muestra M015.
131
Figura D.31. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M016
Figura D.32. Espectro de la composición la muestra M016.
132
Figura D.33. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M017
Figura D.34. Espectro de la composición la muestra M017.
133
Figura D.35. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M018
Figura D.36. Espectro de la composición la muestra M018.
134
Figura D.37. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M019
Figura D.38. Espectro de la composición la muestra M019.
135
Figura D.39. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M020
Figura D.40. Espectro de la composición la muestra M020.
136
Figura D.41. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M021
Figura D.42. Espectro de la composición la muestra M021.
137
Figura D.43. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M022
Figura D.44. Espectro de la composición la muestra M022.
138
Figura D.45. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M023
Figura D.46. Espectro de la composición la muestra M023.
139
Figura D.47. Reporte de la concentración de limoneno contenido en la muestra M024
Figura D.48. Espectro de la composición la muestra M024.
140
Anexo E. Proceso realizado para la selección del medio de cultivo para el
crecimiento de Penicillium.
Figura E.1.Preparacion de Medios de Cultivo
Figura E.2. Autoclave de medios de cultivo y material de vidrio
Medio Czapek-
Dox
Medio
Abraham
Solución de
Esporas
141
Figura E.3.Esterilización de medios de cultivo y material de vidrio
Figura E.4.Crecimiento de medios de cultivo
142
Figura E.5.Crecimiento de medios de cultivo 24 horas después
Figura E.6.Extracción de Muestras para el análisis en el espectrofotómetro UV-VIS
143
Anexo F. Análisis en el espectrofotómetro UV-VIS
Figura.F.1. Análisis UV-VIS blanco (agua destilada).
Figura F.2. Análisis UV-VIS blanco (medio sin esporas).
Figura F.3.Analisis UV-VIS blanco( medio con esporas)
144
Figura F.4.Analisis UV-VIS del ensayo 1 con medio Abraham
Figura F.5.Analisis UV-VIS del ensayo 2 con medio Abraham
Figura F.6.Analisis UV-VIS del ensayo 3 con medio Abraham
145
Figura F.7.Analisis UV-VIS del ensayo 4 con medio Abraham
Figura F.8.Analisis UV-VIS del ensayo 5 con medio Abraham
|
Figura F.9.Analisis UV-VIS del ensayo 6 con medio Abraham
146
Figura F.10. Análisis UV-VIS blanco (agua destilada).
Figura F.11. Análisis UV-VIS blanco Czapek-Dox (sin esporas)
Figura F.12. Análisis UV-VIS blanco Czapek-Dox (con esporas)
147
Figura F.13.Analisis UV-VIS del ensayo 1 con medio Czapek-Dox
Figura F.14.Analisis UV-VIS del ensayo 2 con medio Czapek-Dox
Figura F.15.Analisis UV-VIS del ensayo 3 con medio Czapek-Dox
148
Figura F.16.Analisis UV-VIS del ensayo 4 con medio Czapek-Dox
Figura F.17.Analisis UV-VIS del ensayo 5 con medio Czapek-Dox
Figura F.18.Analisis UV-VIS del ensayo 6 con medio Czapek-Dox
149
Anexo G. Proceso de biotransformación de d-limoneno
• Figura G.1. Muestras durante el proceso de crecimiento de las esporas.
• Figura G.2. Filtración del micelio en el medio de cultivo
• Figura G.3. Biotransformación de d-limoneno (Día 0).
150
• Figura G.4. Biotransformación de d-limoneno Día 1.
•
• Figura G.4. Biotransformación de d-limoneno Día 2.
• Figura G.4. Biotransformación de d-limoneno Día 5.
•
151
Anexo H. Respuestas GC-MS del proceso de biotransformación de d-limoneno.
Figura H.1. Respuesta GC-MS para el Día 0 de Biotransformación
Figura H.2. Respuesta GC-MS para el Día 1 de Biotransformación
152
Figura H.3. Respuesta GC-MS para el Día 2 de Biotransformación
Figura H.4. Respuesta GC-MS para el Día 3 de Biotransformación
153
Figura H.5. Respuesta GC-MS para el Día 4 de Biotransformación
Figura H.6. Respuesta GC-MS para el Día 5 de Biotransformación
154
Anexo J. Espectros y compuestos obtenidos en el cada día del proceso de
biotransformación de d-limoneno.
Figura J.1. Espectro de los compuestos contenidos en el Día 0 de
biotransformación.
Tabla 36. Compuestos presentes en el Día 0 de biotransformación
Número
de pico
Figura Tiempo de
retención
Componente determinado
(estructura molecular)
1 J.2. 9,649 d-limoneno
Figura J.2. Compuesto presente a un tiempo de retención de 9,649 min en el Día
0 de biotransformación.
155
Figura J.3. Espectro de los compuestos contenidos en el Día 1 de
biotransformación.
Tabla 37. Compuestos presentes en el Día 1 de biotransformación
Numero
de pico
Figura Tiempo de
retención
Componente determinado
(estructura molecular)
1 J.4 4,04 Butanol
2 J.5 6,602 2-Pentanona, 5-metoxy
3 J.6 9,649 D-limoneno
Figura J.4. Compuesto presente a un tiempo de retención de 4,04 min en el Día 1
de biotransformación.
156
Figura J.5. Compuesto presente a un tiempo de retención de 6,602 min en el Día
1 de biotransformación.
Figura J.6. Compuesto presente a un tiempo de retención de 9,649 min en el Día
1 de biotransformación.
157
Figura J.7. Espectro de los compuestos contenidos en el Día 2 de
biotransformación.
Tabla 38. Compuestos presentes en el Día 2 de biotransformación
Numero
de pico
Figura Tiempo de
retención
Componente determinado
(estructura molecular)
1 J.8 4,04 Butanol
2 J.9 8,013 2-Cyclopenten-1-one, 2-metil-
3 J.10 9,649 D-limoneno
Figura J.8. Compuesto presente a un tiempo de retención de 4,04 min en el Día 1
de biotransformación.
158
Figura J.9. Compuesto presente a un tiempo de retención de 8,013 min en el Día
1 de biotransformación.
Figura J.10. Compuesto presente a un tiempo de retención de 9,649 min en el Día
1 de biotransformación
159
Figura J.11. Espectro de los compuestos contenidos en el Día 3 de
biotransformación.
Tabla 39. Compuestos presentes en el Día 3 de biotransformación
Numero
de pico
Figura Tiempo de
retención
Componente determinado
(estructura molecular)
1 J.11 4,04 Butanol
2 J.12 8,655 Ciclohexane, 4-metilene-1-
(1-metiletil)-
3 J.13 9,649 D-limoneno
Figura J.12. Compuesto presente a un tiempo de retención de 4,04 min en el Día 3 de
biotransformación
160
Figura J.13. Compuesto presente a un tiempo de retención de 8,655 min en el Día 3
de biotransformación
Figura J.14. Compuesto presente a un tiempo de retención de 9,649 min en el
Día 3 de biotransformación
161
Figura J.15. Espectro de los compuestos contenidos en el Día 4 de
biotransformación.
Tabla 40. Compuestos presentes en el Día 4 de Biotransformación
Número
de pico
Figura Tiempo de
retención
Componente determinado
(estructura molecular)
1 J.14 6,1 1-Bencil-3,3-dimetildiaziridine
2 J.15 6,535 6-Etoxy-6-metil-2-cyclohexenone
3 J.16 7,6 Oxirane, (1,1-dimetilbutil)-
4 J.17 8,6 Benzene, 1-metil-4-[(2-
propenyloxy)metil]-
5 J.18 9,64 D-limoneno
6 J.19 11,4 1,6-Octadien-3-ol, 3,7-dimetil-,
propanoate
162
Figura J.16. Compuesto presente a un tiempo de retención de 6,1 min en el Día 4 de
biotransformación.
Figura J.14. Compuesto presente a un tiempo de retención de 6,535 min en el Día 4
de biotransformación
163
Figura J.17. Compuesto presente a un tiempo de retención de 6,6 min en el Día 4 de
biotransformación
Figura J.18. Compuesto presente a un tiempo de retención de 7,6 min en el Día 4 de
biotransformación
164
Figura J.19. Compuesto presente a un tiempo de retención de 8,6 min en el Día 4 de
biotransformación
Figura J.20. Compuesto presente a un tiempo de retención de 9,64 min en el Día 4 de
biotransformación
165
Figura J.21. Compuesto presente a un tiempo de retención de 11,4 min en el Día 4 de
biotransformación
166
Figura J.22. Espectro de los compuestos contenidos en el Día 5 de
biotransformación.
Tabla 41. Compuestos presentes en el Día 5 de Biotransformación
Número
de pico
Figura Tiempo de
retención
Componente determinado
(estructura molecular)
1 J.23 7,2 (1R)-2,6,6-Trimetilbicyclo[3.1.1]hept-
2-ene
2 J.24 8,6 β-Mirceno
3 J.25 8,9 Octanal
4 J.26 8,17 Cyclohexene, 4-methylene-1-(1-
methylethyl)-
5 J.27 9,64 D-limoneno
6 J.28 10,48 γ-Terpineno
7 J.29 10,7 Ciclopropane, pentil-
8 J.30 11,1 Ciclohexene, 1-metil-4-(1-
metiletilidene)-
9 J.31 12,2 Limonene oxide, cis-
10 J.32 13,38 Ciclohexanol, 1-metil-4-(1-
metilethenil)-, cis-
11 J.33 14 Decanal
12 J.34 14,3 trans-Carveol
13 J.35 14,4 2-Ciclohexen-1-ol, 2-metil-5-(1-
metilethenil)-, cis
167
Figura J.23. Compuesto presente a un tiempo de retención de 7,2 min en el Día 5 de
biotransformación
Figura J.24. Compuesto presente a un tiempo de retención de 8,6 min en el Día 5 de
biotransformación
Figura J.25. Compuesto presente a un tiempo de retención de 8,9 min en el Día 5 de
biotransformación
168
Figura J.26. Compuesto presente a un tiempo de retención de 8,17 min en el Día 5 de
biotransformación
Figura J.27. Compuesto presente a un tiempo de retención de 9,649 min en el Día 5
de biotransformación
Figura J.28. Compuesto presente a un tiempo de retención de 10,48min en el Día 5 de
biotransformación
169
Figura J.29. Compuesto presente a un tiempo de retención de 10,7 min en el Día 5 de
biotransformación
Figura J.30. Compuesto presente a un tiempo de retención de 11,1 min en el Día 5 de
biotransformación
Figura J.31. Compuesto presente a un tiempo de retención de 12,2 min en el Día 5 de
biotransformación
170
Figura J.32. Compuesto presente a un tiempo de retención de 13,38 min en el Día 5
de biotransformación
Figura J.33. Compuesto presente a un tiempo de retención de 14 min en el Día 5 de
biotransformación
Figura J.34. Compuesto presente a un tiempo de retención de 14,3 min en el Día 5 de
biotransformación
171
Figura J.35. Compuesto presente a un tiempo de retención de 14,4 min en el Día 5 de
biotransformación
