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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
RESISTENCIA A ALFA-CIPERMETRINA, IVERMECTINA Y AMITRAZ EN
GARRAPATAS Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1887) COLECTADAS EN CUATRO
LOCALIDADES.
Informe final del trabajo de Investigación presentado como requisito parcial para optar por el
Título de Médico Veterinario Zootecnista.
AUTORA
XIMENA FERNANDA PÉREZ OTÁÑEZ.
TUTOR
RICHAR RODRÍGUEZ HIDALGO, Ph.D
Quito, Abril 2016
I
“Hay una fuerza motriz más poderosa que el vapor, la electricidad y la energía atómica:
la voluntad.”
Albert Einstein.
II
DEDICATORIA
“Al final del día somos solo recuerdos, así que, esfuérzate en ser de los buenos! La vida es el
más grande regalo que podemos tener, a pesar de cada circunstancia, Dios siempre dará
fortaleza a sus hijos y sonrisas reconfortantes”.
XFPO
A la vida por dejarme habitar este cuerpo un tiempo, al tiempo por sorprenderme a cada paso, a
la luna por ser fiel compañera, y a las estrellas por dibujar el camino en noches de desvelo.
A mis padres Fernando y Ximena quienes han sido un ejemplo siempre, a mis tías hermanas
Gisela y Sandra quienes me han acompañado en cada etapa, a mis segundos padres Yolita y
Augusto con quienes hemos formado un hogar y entre altibajos siempre saliendo adelante
juntos, a mis abues Albita y Manuel, quienes siempre me brindaron apoyo y un lugar donde
llegar, a todo el resto de mi familia que no terminaría de nombrarlos pues todos han sido apoyo
en su momento, por ustedes y para ustedes.
A mis amigos David, Diana, Sylvia, Salomé, Michelle, Samuel, Angie, Tomás, Darwin, Fito,
Héctor, Ernest, Franki y todos quienes supieron darme apoyo en momentos de desespero y
palabras de aliento para no decaer, aunque no los vea a menudo, siempre están en mi corazón,
gracias por acompañarme y tenerme en sus oraciones, a Miguel, tu apoyo, paciencia y compañía
han sido fundamentales para mí en ésta etapa, es el fin de una y el inicio de muchas mejores
juntos.
A Alexito que viajó muy pronto al cielo, y desde allí sé que está presente este día tan importante,
gracias por el apoyo incondicional.
Ximena.
III
AGRADECIMIENTOS
Agradezco en primer lugar a Dios, que es quién con su soplo de vida nos permite estar aquí, en
éste lugar que llamamos vida.
A mi familia, quienes estuvieron apoyándome desde inicio de mi vida, no sólo en formación
académica sino las bases de mi carácter y cada lección aprendida, que la vida no es fácil pero es
hermosa al final del día, sin ustedes esto no habría sido posible
Mi más sincero agradecimiento a mi tutor, Richar, quien me dio la oportunidad de realizar éste
proyecto en el Centro Internacional de Zoonosis y de quien su paciencia y guía fueron
fundamentales en todo momento; al equipo de trabajo del Proyecto “Epidemiología Molecular
de Parásitos y Microorganismos de Interés Zoonósico: gusano barrenador del ganado y
garrapatas”, en donde grandes personas con sus conocimientos e ideas aportaron a éste proyecto:
Francisco, Héctor, Jonathan, al equipo de la Unidad de Entomología aplicada del CIZ: Ernesto,
Paul, Franklin, Yessenia; y al personal científico del Centro internacional de Zoonosis: Alfonso,
Sandra, quienes con sus conocimientos no dudaron en ser apoyo técnico y personal en todo
momento.
A mis queridos docentes, quienes han sido parte de mi crecimiento profesional desde el inicio
del mismo, a la comisión de Acreditación y Autoevaluación de la carrera quienes además de ser
excelentes profesionales han sido guías y amigos siempre al pendiente; y al tribunal conferido
por la facultad que con paciencia ha revisado y aprobado éste trabajo.
A los propietarios de las fincas participantes en este proyecto.
A IQ120 diseño y educación.
Gracias, infinitas gracias, que la vida les recompense a millares.
IV
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, Ximena Fernanda Pérez Otáñez, en calidad de autora del trabajo de investigación
“RESISTENCIA A ALFA-CIPERMETRINA, IVERMECTINA Y AMITRAZ EN
GARRAPATAS Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1887) COLECTADAS EN CUATRO
LOCALIDADES”. Por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR,
hacer uso de todos los contenidos que nos pertenecen o de parte de los que contienen esta obra,
con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponde, con excepción de la presente autorización,
seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con el establecimiento en los artículos 5, 6, 8, 19
y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
En la ciudad de Quito, a los 28 días de Abril de 2016.
Ximena Fernanda Pérez Otáñez
CI: 172341960-0
E-mail: [email protected]
V
INFORME DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por la señorita: XIMENA
FERNANDA PÉREZ OTAÑEZ, para optar por el Título o Grado de Médico Veterinario y
Zootecnista, cuyo título es “RESISTENCIA A ALFA-CIPERMETRINA, IVERMECTINA Y
AMITRAZ EN GARRAPATAS Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1887) COLECTADAS EN
CUATRO LOCALIDADES”. Considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos
suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal
examinador que se designe.
Quito, a los 28 días del mes de Abril de 2016.
Dr. Richar Rodríguez H., Ph. D
CI: 171205178-6
VI
VII
VIII
IX
Contenido DEDICATORIA ......................................................................................................................... II
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................. III
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL ........................................................ IV
INFORME DEL TUTOR ........................................................................................................... V
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................ XI
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................. XII
RESUMEN ............................................................................................................................. XIII
ABSTRACT ........................................................................................................................... XIV
CAPITULO I - INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1
1.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1
CAPITULO II - REVISIÓN DE LITERATURA ....................................................................... 4
2. Revisión de literatura. .............................................................................................................. 4
2.1. Garrapatas. ........................................................................................................................ 4
2.2.1. Generalidades de las garrapatas. ............................................................................... 4
2.1.2. Morfología de las garrapatas. ..................................................................................... 5
2.2. Rhipicephalus microplus. .................................................................................................. 5
2.2.1. Generalidades de Rhipicephalus microplus. .............................................................. 5
2.2.2. Taxonomía. ................................................................................................................. 6
2.2.3. Características morfológicas de Rhipicephalus microplus......................................... 6
2.2.4. Ciclo biológico de Rhipicephalus microplus. ............................................................ 6
2.2.5. Distribución geográfica de Rhipicephalus microplus. ............................................... 8
2.2.6. Importancia de Rhipicephalus microplus en la salud del hospedero. ....................... 9
2.2.7. Pérdidas económicas ocasionadas por Rhipicephalus microplus. ........................... 10
2.3 Mecanismos de control de garrapatas. ............................................................................. 10
2.3.1. Control químico........................................................................................................ 10
2.3.2. Control biológico..................................................................................................... 12
2.3.3. Inmunización del ganado vacuno. ............................................................................ 12
2.3.4. Manejo de potreros ................................................................................................... 12
2.3.5. Extractos acaricidas de origen natural ...................................................................... 12
2.4. Que es la resistencia a acaricidas? .................................................................................. 13
X
2.4.1. Mecanismos de resistencia. ...................................................................................... 13
2.4.2. Causas de resistencia. ............................................................................................... 13
2.4.3. Métodos de diagnóstico de resistencias: .................................................................. 14
CAPÍTULO III- METODOLOGÍA .......................................................................................... 16
3. Metodología. ...................................................................................................................... 16
3.1. Descripción del área de estudio. ..................................................................................... 16
3.2. Muestras en estudio: ....................................................................................................... 17
3.3. Métodos específicos del experimento. ............................................................................ 17
3.3.1. Fase de campo. ......................................................................................................... 17
3.3.2. Fase de laboratorio. .................................................................................................. 18
3.3.2.3. Bioensayos ........................................................................................................... 19
3.3. Análisis de datos.......................................................................................................... 22
3.4. Análisis estadístico. ..................................................................................................... 23
CAPITULO IV- RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ................................................................... 24
4. Resultados. 4.1. Presencia de resistencia en las poblaciones de garrapatas. ..................... 24
4.2. Niveles de resistencia. ..................................................................................................... 29
4.3. Comparación de los bioensayos ...................................................................................... 30
4.3.1. Cuantitativa- Análisis de Varianza Multivariante. ................................................... 30
4.4. Dosis efectivas estimadas (DEE) de mortalidad 50 y 99 para LIT y LPT,. .................... 31
CAPITULO V- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .............................................. 36
5.1. Conclusiones. .................................................................................................................. 36
5.2. Recomendaciones. .......................................................................................................... 36
XI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Morfología general de una garrapata. ........................................................................... 5
Figura 2 Características morfológicas de Rhipicephalus microplus. .......................................... 6
Figura 3 Ciclo biológico de la garrapata Rhipicephalus microplus ........................................... 7
Figura 4 Distribución geográfica de Rhipicephalus microplus. ................................................. 8
Figura 5 Área de estudio. ........................................................................................................... 16
Figura 7 Colecta de garrapata en frasco de plástico. ................................................................. 17
Figura 6 Recolección directa del animal. .................................................................................. 17
Figura 8 Recepción de garrapatas ingurgitadas. ........................................................................ 19
Figura 9 Materiales para identificación de garrapatas. .............................................................. 19
Figura 10 Limpieza de garrapatas ............................................................................................. 20
Figura 11 Grupos de garrapatas ................................................................................................. 20
Figura 12 Inmersión en principios activos ................................................................................ 20
Figura 16 Conteo de larvas vivas 72 horas post ensayo. ........................................................... 21
Figura 17 A= larva viva. B= larva muerta ................................................................................. 21
Figura 18 Larvas R. microplus catorce días post eclosión ........................................................ 21
Figura 19 Larvas sobre el papel impregnado de principio activo............................................. 21
Figura 20 Paquetes larvales sellados y etiquetados. .................................................................. 21
Figura 21 Materiales para preparar papeles impregnados con principios activos. .................... 22
Figura 22 Dilución de principio activo sobre papel filtro. ........................................................ 22
Figura 23 Paquetes con papel filtro impregnado etiquetados. ................................................... 22
Figura 24 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de adultos, Amitraz ................................ 28
Figura 25 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de adultos, Ivermectina .......................... 28
Figura 26 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de adultos, Alfacipermetrina.................. 28
Figura 27 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de larvas, Amitraz .................................. 28
Figura 28 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de larvas, Ivermectina ............................ 28
Figura 29 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de larvas, Alfacipermetrina .................... 28
Figura 30 Niveles de resistencia - Paquete larval, Amitraz ....................................................... 28
Figura 31 Niveles de resistencia - Paquete larval, Alfacipermetrina ........................................ 28
Figura 32 Niveles de resistencia - Paquete larval, Ivermectina ................................................. 29
Figura33A-33L Curvas de regresión logística……………………………………………..…32
Figura 33 Curva de regresión, total población…………………………………………….......36
XII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Concentraciones a utilizar ........................................................................................... 18
Tabla 2 Fincas resistentes. ......................................................................................................... 26
Tabla 3 Niveles de resistencia, tres bioensayos. ........................................................................ 30
Tabla 15 Dosis efectivas estimadas ........................................................................................... 33
XIII
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“RESISTENCIA A ALFA-CIPERMETRINA, IVERMECTINA Y AMITRAZ EN GARRAPATAS
Rhipicephalus microplus (CANESTRINI, 1887) COLECTADAS EN CUATRO LOCALIDADES”.
Autora: Ximena Fernanda Pérez Otáñez
Tutor: Richar Rodríguez H. Ph.D
Fecha: A, los 28 días de abril de 2016
RESUMEN
Rhipicephalus microplus se encuentra ampliamente distribuida en las zonas tropicales y subtropicales
del mundo donde la ganadería es una de las actividades principales. En Ecuador, éste ectoparásito se ha
observado entre 0 a 2600 msnm. de altitud. Una de las principales medidas de control de las garrapatas
es el uso de acaricidas químicos, que se han utilizado de manera indiscriminada y sin tener en cuenta las
normas de uso de estos productos. En Ecuador, no hay estudios publicados se han llevado a cabo para
determinar los niveles de resistencia en Rhipicephalus microplus. Por éstas razones, los objetivos de éste
estudio fueron evaluar los niveles de resistencia de las garrapatas utilizando tres importantes acaricidas
aplicados en Ecuador es decir, amitraz, alfa-cipermetrina e ivermectina; los cuales fueron analizados por
3 bioensayos diferentes: Prueba de inmersión de adultos (AIT), Prueba de Paquete larval (LPT) y la
prueba de Inmersión de larvas (LIT), según lo recomendado por la FAO. Los resultados mostraron, en
términos generales, la presencia de resistencia que va entre 67 y 75% para amitraz; de 42 a 50% para la
alfa-cipermetrina y de 25 a 50% de ivermectina. Del mismo modo, se estableció los niveles de resistencia
de acuerdo con la escala utilizada por Junte (2008) y adaptado en este estudio en 3 niveles para
bioensayos con larvas en base a la mortalidad corregida es decir, alta (< 50%), media (50-80%) y baja
(81-90%) de resistencia y porcentajes entre 91-100% fueron consideradas como susceptibles. Para la
prueba de Inmersión de adultos se utilizaron 2 niveles, resistencia alta (81-100%) y resistencia media
(51 a 80%); y porcentajes menores de 50% fueron consideradas como susceptibles. En este contexto,
amitraz mostró 19, 42 y 13% para alta, media y baja resistencia, respectivamente; mientras que, alfa-
cipermetrina presenta 6% para alta resistencia y 25% para resistencia media y baja respectivamente e
ivermectina presentó 14, 25 y 13% para alta, media y baja resistencia, respectivamente. Por otra parte,
se encontró que los 3 bioensayos no mostraron diferencia estadística entre ellos y, el análisis de regresión
logística confirmó resistencia a los acaricidas en el estudio; por lo tanto, cada finca era un caso diferente
que depende del acaricida utilizado en su propio sistema sanitario. La dosis efectiva estimada necesaria
para matar el 99% de las garrapatas es más que lo prescrito en medicamentos comerciales. Por último,
como conclusión, el amitraz mostró la más alta resistencia seguida de ivermectina y alfa-cipermetrina.
Además, estos resultados permiten, por primera vez, informar de la situación de resistencia a los
productos acaricidas en Ecuador y, también, permitirá proponer medidas alternativas de control de
garrapatas que reduzcan al mínimo las pérdidas de producción y reducir el impacto en la salud pública y
el daño ambiental.
Palabras clave: Garrapatas, amitraz, alfa-cipermetrina, ivermectina, resistencia.
XIV
ABSTRACT Rhipicephalus microplus is widely distributed in tropical and subtropical areas of the world where
livestock is one of the principals’ activities. In Ecuador, this ectoparasite has been observed between 0
to 2600 masl. One of the main ticks control measures is the use of acaricide drugs; which, unfortunately,
have been used indiscriminately without taken into account standards management of these products. In
Ecuador, no published studies have been carried out to determine resistance levels on Rhipicephalus
microplus. For these reasons, the aims of this study were to assess resistance levels of ticks using three
important acaricides applied in Ecuador i.e. amitraz, alpha-cypermethrin and ivermectin; which were
analysed for 3 different bioassays: Adult Immersion test (AIT), Larval Package Test (LPT) and Larval
Immersion Test (LIT), as recommended by FAO. The results showed, in general terms, the presence of
resistance ranging between 67 and 75% for amitraz; between 42 to 50% for alpha-cypermethrin and from
25 to 50% for ivermectin. Similarly, it was established the resistance levels according to the scale used
by Junte (2008) and adapted in this study in 3 levels for larval bioassays based on corrected mortality
i.e. high (under 50%), medium (50-80%) and low (81-90%) resistance; percentages between 91-100%
were considered as susceptible. For the adult test 2 levels were used i.e. high (81-100%) and medium
(51 to 80%) resistance; percentages under 50% were considered as susceptible. In this context, amitraz
showed 19, 42 and 13% for high, medium and low resistance, respectively; whilst, alpha-cypermethrin
presented 6% for high resistance and 25% for medium and low resistance respectively and ivermectin
presented 14, 25 and 13% for high, medium and low resistance, respectively. On the other hand, it was
found that all 3 bioassays did not show statistical difference among them and, the logistic regression
analysis confirmed acaricide resistance in the study; hence each farm was a different case that depends
on the acaricide drug used in its own sanitary system. The effective estimated dose needed for killing
99% of ticks is farther than prescribed in commercial drugs. Finally, as a conclusion, amitraz showed the
highest resistance followed by ivermectin and alpha-cypermethrin. In addition, these findings allow, for
the first time, reporting the resistance situation to acaricide products in Ecuador and, also, will permit to
propose alternatives of ticks’ control which minimize production losses and reduce the impact on public
health and the environmental damage.
Key words: ticks, amitraz, alpha-cypermethrin, ivermectin, resistance.
1
CAPITULO I - INTRODUCCIÓN
1.1 INTRODUCCIÓN
Las garrapatas de la familia Ixodidae son de interés veterinario, debido a que generan la
mayor cantidad de pérdidas económicas (Valencia et al. 2009) y, se les considera como uno de
los principales vectores de enfermedades infecciosas en el mundo, después de los mosquitos
(Ghosh & Nagar 2014). De entre los miembros de la familia Ixodidae, Rhipicephalus microplus
es la especie con el mayor impacto sobre los sistemas pecuarios productivos a nivel mundial
y, se la puede encontrar en todo el mundo en zonas tropicales y subtropicales en diversos
hospedadores (León-Clavijo & Hernandez-Rojas 2012). Además, una de las principales
características de ésta garrapata es que cumple todo su ciclo biológico en un solo hospedero
facilitando el éxito en su reproducción, lo cual dificulta su control (Álvarez & Bonilla 2007).
Entre las principales consecuencias de la infestación de garrapatas es la disminución de la
producción de leche y carne; además de, producir daño en los cueros, mortalidad del ganado
y las pérdidas ocasionadas por el costo derivado de su control (CFSPH 2007). También,
Rhipicephalus microplus, ha sido imputado como vector de enfermedades parasitarias,
bacterianas y víricas (CDC 2012).
La transmisión de enfermedades y las pérdidas ocasionadas en los bovinos es favorecida por
la resistencia de las garrapatas a los acaricidas (Ghosh & Nagar 2014; Guerrero, Léonore Lovis, et al.
2012). La resistencia es el resultado de la exposición a un antiparasitario químico; el cual, es
usado indiscriminadamente (Li et al. 2007; Rodríguez-Vivas et al. 2014) y que, en las garrapatas
modifican su estructura genética el cual, es heredado a las nuevas generaciones
permitiéndoles sobrevivir al contacto de estos productos; por lo tanto, la nueva generación
de garrapatas llevará los genes de resistencia de la anterior (FAO 2003; Rosario-Cruz et al. 2009;
Alonso-Díaz et al. 2006).
Es conocido que, las garrapatas R. microplus, en zonas tropicales y subtropicales alrededor
del mundo, presentan resistencia a acaricidas (Stone et al. 2014; Busch et al. 2014); favoreciendo
la presencia de poblaciones resistentes que causan grandes problemas en ganadería y salud
pública. Adicionalmente, la falta de desarrollo de nuevos acaricidas favorece a la
presentación de las resistencias (Junte 2008).
2
La evolución de resistencias en garrapatas es causada por varios factores intrínsecos y
operativos (Alonso-Díaz et al. 2006). Los factores intrínsecos están relacionados con la biología,
ecología, genética, velocidad de mutación de la garrapata y que predispone a la producción
de alelos resistentes; los cuales afectan el comportamiento de las garrapatas. En cambio, los
factores operativos están netamente bajo el control del ser humano, entre ellos tenemos la
elección del producto químico, la cantidad, la vía de aplicación, frecuencia y método (FAO
2003). Todos estos factores deben conocerse con el fin de establecer medidas de prevención
y estrategias de control (Rodríguez-Vivas et al. 2014).
En América, se han realizado varios estudios en Brasil, México y Colombia; en Brasil se
realizaron bioensayos en R. microplus adultas, que demostró susceptibilidad al amitraz y
resistencia a órganos fosforados, piretroides y combinaciones (Santos et al. 2013). En México
se encontró resistencias tanto al amitraz como a la ivermectina (Rosario-Cruz et al. 2009).
Además, los trabajos realizados con cepas de R. microplus de varias localidades de Colombia
han mostrado grados diversos de resistencia a compuestos piretroides (deltametrina,
cipermetrina, flumetrina, alfa-cipermetrina, y lambdacialotrina); al metilcarbamato y a uno
o varios de los compuestos organoclorados y fosforados (Valencia et al. 2009). En el Ecuador,
se desconoce si existen publicaciones sobre resistencias a los acaricidas. Aunque, se sabe
que un 75% de las ganaderías ecuatorianas se encuentran en áreas infestadas o
potencialmente infestadas por garrapatas (Guillén & Muñoz 2013) y que todas estas, utilizan
productos antigarrapaticidas como parte de sus programas de control (EDIFARM 2011).
Es por esto que, es importante evaluar la resistencia parasitaria y la eficacia y el poder de los
productos químicos y determinar el grado de resistencia y/o sensibilidad que tengan las
garrapatas en el Ecuador con el fin de tener elementos para proponer alternativas de control
o mejorar las que actualmente se tiene, de manera técnica. Una de las consecuencias medio
ambientales potenciales descritas por el uso de estos productos es el efecto nocivo sobre
insectos coprófagos, nematodos del suelo y microorganismos que normalmente degradan y
reciclan los excrementos del ganado (Martínez & Lumaret 2006). Del mismo modo, son
perjudiciales para el ser humano por su efecto residual en carne y leche (Saueressig 2002).
Según resultados previos del proyecto "Encuesta Nacional de Brucelosis, Tuberculosis
bovina y Garrapatas" realizado por el Centro Internacional de Zoonosis (CIZ) (datos no
publicados), los acaricidas químicos más usados en las ganaderías ecuatorianas son la
3
ivermectina y el amitraz, y como alternativa reciente, se está utilizando la alfa-cipermetrina
(EDIFARM 2011).
El presente estudio forma parte del proyecto “Epidemiología molecular de parásitos y
microorganismos de interés zoonósico: gusano barrenador del ganado y garrapatas”, llevado
a cabo en el Centro Internacional de Zoonosis, cuyos objetivos fueron determinar la
presencia y establecer el nivel de resistencia a amitraz, alfa-cipermetrina e ivermectina en
poblaciones de garrapatas Rhipicephalus microplus colectadas en Cantones San Miguel de
los Bancos, Pedro Vicente Maldonado, El Carmen y Santo Domingo de los Colorados; del
mismo modo, se comparó los resultados de resistencia con tres métodos de exposición a los
productos químicos. Finalmente, Los resultados de esta investigación aportarán con
información actualizada referente a la resistencia a amitraz, alfa-cipermetrina e ivermectina
en los cantones en estudio; los cuales, podrían servir para establecer políticas de control por
parte de instituciones oficiales. Del mismo modo, esta información es útil para los ganaderos
cuyos animales son afectados por éste ectoparásito.
4
CAPITULO II - REVISIÓN DE LITERATURA
2. Revisión de literatura.
2.1. Garrapatas.
2.2.1. Generalidades de las garrapatas.
Las garrapatas son artrópodos, ectoparásitos hematófagos obligados que parasitan a aves,
mamíferos, reptiles, anfibios e incluso al hombre (Guglielmone & Nava 2005; Nava et al. 2009) y
se hallan distribuidas en todas las regiones del planeta, aunque no tienen alas, se encuentran
ampliamente distribuidas en el mundo debido al desplazamiento de sus hospederos (Barker &
Murrell 2004) .
Las garrapatas se dividen en cuatro familias tomando en cuenta sus características
morfológicas, las cuales son: Ixodidae o garrapatas de cuerpo duro por su escudo dorsal
quitinizado, Argasidae o garrapatas de cuerpo blando las cuales carecen de escudo dorsal,
Nutalliellidae que tiene una sola especie, descrita para el sur de África la misma que, posee
características intermedias de las dos familias antes mencionadas y Laelaptidae (Barandika
2010; Cortés Vecino et al. 2010). De las dos familias principales: Argasidae e Ixodidae han
sido reconocidas aproximadamente 907 especies.
La familia más numerosa es Ixodidae, además de tener gran importancia médica y veterinaria
por ser vectores de varios patógenos tales como: Bartonella spp., Rickettsia spp., Ehrlichia
spp., Babesia spp. y Anaplasma spp. entre otros (Pennisi et al. 2015), consisten en 241 especies
en el género Ixodes y 442 especies en los géneros Amblyomma, Anomalohimalaya,
Bothriocroton, Cosmiomma, Dermacentor, Haemaphysalis, Hyalomma, Margaropus,
Nosomma, Rhipicentor y Rhipicephalus, con el género Boophilus convirtiéndose en un
subgénero del género Rhipicephalus (Estrada-Peña et al. 2006).
Del género Rhipicephalus existen en aproximación 81 especies, 60 de ellas se encuentran en
el África Subsahariana (países al sur del desierto de Sahara); las otras son originarias de
Eurasia -Europa y Asia- y el norte de África. En el subgénero Boophilus, se describen
cinco especies. R. microplus, Rhipicephalus decoloratus, Rhipicephalus annulatus,
Rhipicephalus geigyi y Rhipicephalus kohlsi. La más importante es R. microplus, la cual ha
desplazado a otras especies como R. decoloratus cuya extensión va desde África hasta el
5
Sahara, sin embargo R. microplus ha comenzado a reemplazarla en el sureste de esta zona
(Levin 2015).
2.1.2. Morfología de las garrapatas.
Las garrapatas tienen dos características importantes que los distingue de otros ácaros: Los
tarsos de las patas anteriores presentan distinguidos poros sensoriales llamados Órgano de
Haller y la mayoría de especies presentan un prominente y dentado hipostoma (Guillén &
Muñoz 2013; Martins et al. 2010). La estructura de las garrapatas consiste en dos partes
fusionadas: el capitulum o gnathosoma y el cuerpo o idiosoma (Veáse figura 1), en el cuerpo
se encuentran unidas las patas, las cuales son seis en el estadío de larva y ocho en ninfas y
adultos (Anderson & Magnarelli 2008), en la
región dorsal tienen un par de ojos
ubicados uno a cada lado entre el
primer par de patas que perciben
movimiento y luz, el orificio genital
está ubicado en la línea media del
cuerpo entre el segundo y tercer par de
patas. En cuanto a la diferenciación
sexual, ésta es muy marcada ya que el
dorso de los machos presenta una
cobertura de quitina llamada escudo,
mientras que, en las hembras solo está parcialmente cubierto en la parte anterior, además el
tamaño de los machos es menor que el de las hembras (Gutiérrez-Osorio 2006).
2.2. Rhipicephalus microplus.
2.2.1. Generalidades de Rhipicephalus microplus.
También conocida como garrapata asiática azul o garrapata del ganado (AFRIVIP 2015),
Rhipicephalus microplus es una garrapata dura (Ixodidae) la cual es especifica del ganado
bovino; sin embargo, se la puede encontrar en diversos huéspedes, entre ellos búfalos,
caballos, asnos, cabras, ovejas, ciervos, cerdos, perros y algunos animales silvestres como el
tapir (Guglielmone & Nava 2005; Nava et al. 2009). Desde el punto de vista económico,
Rhipicephalus microplus es la garrapata más importante en la región neotropical y una de
las importantes del mundo (Martins et al. 2010).
Figura 1 Morfología general de una garrapata. Fuente: Guerrero, 1996
6
2.2.2. Taxonomía.
Orden: Parasitiformes
Suborden: Ixodida
Familia: Ixodidae
Subfamilia: Rhipicephalinae
Género: Rhipicephalus (Boophilus)
Especie: R. microplus
R. decoloratus
R. annulatus
R. geigyi
R. kohlsi (Barandika 2010).
2.2.3. Características morfológicas de Rhipicephalus microplus.
Rhipicephalus microplus es una garrapata que puede ser identificada por su color rojizo en
sus etapas no ingurgitadas, su fórmula dentaria del hipostoma corresponde a 4/4, ausencia
de festones, su escudo no tiene ornamentas, en las hembras la espina en la coxa I está bien
desarrollada, y los machos tienen cuatro placas adanales y un proceso caudal (Barros-Battesti
et al. 2006; Arzua et al. 2005) (Véase figura 2).
Figura 2 Características morfológicas de Rhipicephalus microplus. Modificado de discoverlife.org, 2016
Elaborado por: Ibáñez, 2016; IQ120.
2.2.4. Ciclo biológico de Rhipicephalus microplus.
Las garrapatas tienen cuatro fases en su ciclo de vida: huevo, larva, ninfa y adulto y puede
completarse en 40 días. Las garrapatas Rhipicephalus microplus tienen un solo hospedador;
7
es decir, infesta a un solo animal durante toda su vida; (Álvarez & Bonilla 2007; López-Arias et al.
2014).
El ciclo de ésta garrapata (Véase figura 3), inicia con la postura de huevos en el pasto por
la teleogina o garrapata hembra adulta (Valencia et al. 2009). Una vez que la hembra termina la
fase de ingestión de sangre en el hospedador, se desprende y busca lugares oscuros y
protegidos en el suelo para ovipositar. Éstas tienen una elevada capacidad reproductora ya
que una sola garrapata puede poner entre 2000 a 3000 huevos viables (Barandika 2010).
El periodo de incubación depende del clima (temperatura, humedad y época del año) y dura
aproximadamente de 6 a 8 semanas (Horak et al. 2003; Alvarez et al. 2003). Luego de la eclosión,
las larvas, del género Rhipicephalus suben y se ubican en la punta de los pastos por lo que
se les facilita el infestar al ganado en los potreros (Álvarez & Bonilla 2007). La localización de
las garrapatas en el hospedador por lo general es en todo el cuerpo, las larvas se alimentan
de sangre del hospedero y entre 4 – 7 días muda a ninfa, después de 5-7 días muda a adulta,
espera a ser copulada y se alimenta de sangre para ingurgitarse por completo y caer al suelo
para continuar con el ciclo (Valencia et al. 2009; Guillén & Muñoz 2013).
Figura 3 Ciclo biológico de la garrapata Rhipicephalus microplus Elaborado por: Albán- Pérez, 2016
8
2.2.5. Distribución geográfica de Rhipicephalus microplus.
Se ha propuesto que R. microplus ha tenido su origen en La India (continente asiático) desde
donde con el movimiento de ganado llegó a Madagascar, y de allí fue introducida en la
mayoría de países tropicales y subtropicales mediante la importación de ganado (Levin 2015).
Según Valencia et al. (2009), R. microplus está distribuida en diferentes zonas en todo el
mundo (Véase figura 4), se la puede encontrar en América del Sur, Europa, África, Australia
y centro América. En la región Neotropical de América del Sur, se ha descrito su presencia
en todos los países, excepto Chile (Estrada-Peña et al. 2006; Cortés Vecino et al. 2010). Fue
erradicada de América del Norte entre los años 1904 a 1943 con exhaustivos programas de
erradicación y se mantiene una zona de cuarentena. Se dice que aproximadamente afecta a
800 millones de bovinos en el mundo (Imamura et al. 2013).
En Ecuador, se ha descrito la presencia de esta especie en varios estudios, Guillén & Muñoz
(2013), describieron esta especie en Santo Domingo de los Colorados; Lomas (2015), la
describió en la provincia del Napo; Jacho (2015), menciona ésta especie en la Provincia de
Pichincha, cantón San Miguel de los Bancos; entre otros y con los resultados previos de la
“Encuesta Nacional de Brucelosis, Tuberculosis y Garrapatas”, se sabe que es la especie de
mayor abundancia en las zonas tropicales y subtropicales de Ecuador (Vaca-Moya,
Comunicación personal, 27 de enero de 2016).
Figura 4 Distribución geográfica de Rhipicephalus microplus Modificado de Lovis et. al., 2012
Elaborado por: Ibáñez, 2016; IQ120.
9
2.2.6. Importancia de Rhipicephalus microplus en la salud del hospedero.
Actualmente en regiones tropicales y subtropicales alrededor del mundo, la infestación por
garrapatas y, principalmente, la infestación por Rhipicephalus microplus se ha convertido
en uno de los problemas más importantes en salud y producción animal (Ravindran et al. 2014;
Ghosh & Nagar 2014). Esta especie afecta a explotaciones ganaderas en América latina, y entre
ellos Ecuador (Cortés Vecino et al. 2010).
Los daños que R. microplus ocasiona, son directos al causar traumas en el hospedero o
inocular sus toxinas u otros microorganismos patógenos, e indirectos ya que su presencia
sobre el animal provoca la disminución de la producción tanto de leche como de carne,
estrés, inmunodepresión, anemia, lentitud en el crecimiento además de los problemas
secundarios ocasionados como las miasis que se producen en el lugar donde la garrapata deja
una herida abierta (Ghosh & Nagar 2014; Albán 2016; Carrillo 2015).
Debemos recalcar que las garrapatas son estrictamente parásitos hematófagos, por lo que
causan una gran pérdida de sangre en los animales que infestan llegando a causar severas
anemias. Se conoce que una teleogina -hembra ingurgitada- puede llegar a extraer 3
centímetros cúbicos de sangre bovina diaria (Busch et al. 2014; Canales et al. 2008), lo que se
desencadenará en una anemia progresiva pero poco perceptible, aunque en infestaciones
altas puede conducir al animal a la muerte.
La garrapata en el momento de alimentarse, inyecta saliva que contienen sustancias tóxicas
que van directo al torrente sanguíneo del hospedero, una de estas toxinas es la
holociclotoxina, que produce parálisis flácida aguda -parálisis por garrapatas- (Bazán 2002;
Ribeiro & Francischetti 2003). Esta proteína también evita la coagulación, por lo que las heridas
tardan más en cicatrizar y el hospedero se vuelve susceptible a que en estas heridas abiertas
se formen gusaneras (Hernández 2005; Albán 2016; Carrillo 2015). Además de esto, se debe tomar
en cuenta que las infestaciones altas causan estrés en el animal, lo que provoca irritación,
prurito constante y por ende una disminución en la alimentación, todo esto provoca
inmunodepresión (Guillén & Muñoz 2013).
10
2.2.6.1. Rhipicephalus microplus como vector de enfermedades.
Las garrapatas ocupan el segundo lugar como vectores de agentes patógenos después de los
mosquitos (Ghosh & Nagar 2014); Rhipicephalus microplus transmite varios microorganismos
patógenos, como los protozoos pertenecientes a los géneros Babesia (bovis y bigemina), de
la rickettsia Anaplasma marginale (Bazán 2002) causantes de ranilla roja, babesiosis o fiebre
de garrapata, de ranilla blanca o anaplasmosis y de Borrelia theileri (Ghosh & Nagar 2014).
Babesiosis y anaplasmosis pueden llegar a ser fatales (Busch et al. 2014).
2.2.7. Pérdidas económicas ocasionadas por Rhipicephalus microplus.
La especie con el mayor impacto sobre el ganado bovino a nivel mundial es Rhipicephalus
microplus, y es en zonas tropicales y subtropicales de Centro y Sur América y el occidente
de África donde generan la mayor cantidad de pérdidas económicas (Andreotti et al. 2011); para
lo cual, Valencia et al. (2009) mencionan pérdidas entre US$ 13,9 y 18,7 billones anuales;
debido a que, causan disminución en la producción de leche, carne, mortalidad del ganado;
además del costo derivado de su control.
Según Imamura et al. (2013), determinaron que las garrapatas afectan aproximadamente a 800
millones de bovinos en el mundo de una población total de cerca de 1.339 millones de
bovinos aproximadamente. Se calculó un promedio de pérdida anual de 7,3 USD animal año
por animal (FAO 2004). Jonsson (2006), calculó que aproximadamente se pierde 8,9 ml de
producción de leche diaria y 0,5 kg de peso vivo del animal por cada garrapata al año, en
otro estudio, Rodríguez-Vivas et al. (2014), determinaron que la diferencia entre un animal con
una infestación media de garrapatas y uno no infestado, es de 1,29 kg menos para el animal
infestado así mismo, las pérdidas económicas, debido a enfermedades causadas por
garrapatas, fueron cercanas a 7.000 millones USD anual (León-Clavijo & Hernandez-Rojas 2012).
Según Guillén & Muñoz (2013) más del 75% de vacunos en ganaderias ecuatorianas, se
encuentran en áreas infestadas o potencialmente infestadas por R. Microplus.
2.3 Mecanismos de control de garrapatas.
2.3.1. Control químico.
La principal manera de controlar a las garrapatas ha sido el uso de acaricidas químicos, los
cuales son aplicados en baños de inmersión, aspersión, bolos intraruminales, aretes, por vía
sistémica (inyectable) y como reciente alternativa en forma de “Pour-on” –derramado dorsal-
11
(Rodríguez-Vivas et al. 2014; Lopez-Arias et al. 2014; Andrés & Malaver 2009). En el pasado se
utilizaban productos a base de cloro y arsénico; sin embargo, su uso quedó prohibido por los
efectos residuales en la carne y medio ambiente; además de, ser tóxicos para el operario
(Bazán 2002). En la actualidad los grupos de acaricidas más comunes son: organofosforados,
carbamatos, organoclorados, piretroides, amidinas y lactonas macrocíclicas (Ghosh & Nagar
2014). Sin embargo, al momento el uso de organofosforados está prohibido en el Ecuador
debido a su alta toxicidad (AGROCALIDAD 2016).
2.3.1.1. Generalidades del amitraz:
Perteneciente a las Amidinas, tiene un efecto antagonista a la Octopamina (Castelli et al. 2013),
lo que produce hiperexitabilidad en la garrapata, por lo que se desprende del hospedero y
muere, ésto en etapa larval, en adultos provoca la disminución de la alimentación e
imposibilita la digestibilidad de las proteínas sanguíneas lo que afecta a la reproducción,
disminuye la oviposición y la viabilidad larval (Soberanes et al. 2002; Baron et al. 2014). El
Amitraz ha sido ampliamente utilizado e ingresó al mercado en los 60’s.
2.3.1.2. Generalidades del alfa-cipermetrina:
Pertenece al grupo de los Piretroides sintéticos (origen natural los crisantemos), es un núcleo
mejorado (2da generación) que tiene solamente isómeros –cis, los que son efectivos en
contra de las garrapatas, producen el efecto Knock out, inmovilizándolas y posteriormente
causando su muerte en larvas, en adultas de recuperarse, disminuye el porcentaje de
oviposición y eclosión (mantienen abiertos los canales de sodio) (Palomino et al. 2007; Mendes
et al. 2013). La alfa-cipermetrina ha sido utilizada desde los 90’s , y ahora es usada como
alternativa ante la falta de acción de otros acaricidas (EDIFARM 2011).
2.3.1.3. Generalidades de la ivermectina:
Representante del grupo de Lactonas macrocíclicas, incrementa la producción del ácido
Gamma Aminobutírico en las terminaciones nerviosas de la garrapata, conllevando a la
parálisis y muerte del parásito en etapa larval, en adultos tiene una mejor acción,
disminuyendo el porcentaje de oviposición y eclosión (EDIFARM 2011; Niell et al. 2012;
Rodríguez-Vivas et al. 2014). Esta es de acción sistémica y desde hace pocos años, ha sido
introducida al mercado en presentación de pour-on con este principio activo, su efecto se
muestra tanto por contacto como por ingesta. Por su efecto residual en leche no es
recomendado usarlo en vacas en producción (17 días de retiro). Fue introducida en el
12
mercado en la década de los 80’s (Niell et al. 2012), se la utiliza para el control de garrapatas,
insectos y parásitos internos como nematodos para los cuales es muy efectivo. Su precursor
es el Streptomyces por fermentación (Klafke et al. 2012).
2.3.2. Control biológico
Este se logra mediante la utilización de hongos entomopatógenos que infectan y matan a las
garrapatas tales como: Metarhizium anisopliae cepas 127 y Brasil, Paecilomyces
fumosoroseus, Verticillium lecanii cepas 1 y 2, Beauveria bassiana cepa LBBb14 entre otros
(Gutiérrez-Osorio 2006). Los hongos entre sus principales características se puede citar su alto
poder residual, la especificidad con el hospedero, elevado poder patógeno, las altas
posibilidades de multiplicación en laboratorio y la conservación de su virulencia en campo
(Bazán 2002).
2.3.3. Inmunización del ganado vacuno.
Varios antígenos a partir de extractos complejos de garrapatas han sido aislados como Bm95,
Bm86, inhibidores de tripsina, SBm7462 entre las principales (Gutiérrez-Osorio 2006; Rodríguez
et al. 1995). Existen en el mercado de países vecinos como Colombia dos vacunas contra
garrapatas Rhipicephalus microplus (TickGardPlus y GavacTM) y, las dos se basan en la
proteína Bm86 (Canales et al. 2008); sin embargo, su uso en Ecuador no se percibe aún
(Comunicación personal C. Molina, 21 noviembre de 2015).
2.3.4. Manejo de potreros
Varios recursos tienen como objetivo disminuir la carga de garrapatas en etapa de larva fuera
del hospedero, entre ellos, la rotación sistémica de potreros que permite matar a un
porcentaje de larvas por inanición ya que éstas sobreviven en el pasto entre 30 y 60 días,
disminuyendo su viabilidad con el paso del tiempo por lo que una rotación de mínimo 45
días sería lo ideal (Pavón-Leyva 2014), la literatura menciona que la quema controlada de
potreros es otra posibilidad; sin embargo, no es muy recomendable debido a los riesgos que
conlleva esta práctica (Hernandez 2005).
2.3.5. Extractos acaricidas de origen natural
El uso de extractos naturales de plantas ha sido cada vez más estudiado, debido a sus
beneficios en comparación con el uso de principios activos químicos (Rodríguez-Vivas et al.
2014), los acaricidas de origen natural se obtienen de materia prima que se degrada con
facilidad, no causa daño al medio ambiente ni deja residuos en el animal tratado sin embargo,
es un proceso lento de extracción (de Oliveira Monteiro et al. 2010)
13
Se ha demostrado, como ejemplo, que extractos etanólicos de la semilla de la fruta anona
(Annona squamosa) y las hojas del árbol de nim (Azadirachta indica) tienen eficacia de un
70.8% y 80%, contra R. microplus (Magadum et al. 2009), en un estudio de Álvarez et al.
(2006) se logró mortalidad y reducción de oviposición con: el clavo de olor (Zizygium
aromaticum), las hojas del árbol de la morera (Morus alba), pimientra negra (Piper nigrum),
y la mezcla de dientes de ajo (Allium sativum) con clavo de olor (Z. aromaticum).
2.4. Que es la resistencia a acaricidas?
La resistencia es un fenómeno resultado de la exposición de las garrapatas a un
antiparasitario químico usado indiscriminadamente (Li et al. 2007).
Es común observar en las ganaderías ecuatorianas que el manejo de los acaricidas químicos
no es de manera técnica; es decir, no se considera la biología de la garrapata, la dosis correcta
ni el manejo adecuado del químico; afectando la eficacia del producto. Consecuentemente,
el ganadero “experimenta” diversas formas de utilizar el producto lo cual, favorece el
aparecimiento de poblaciones de garrapatas resistentes (de Oliveira Monteiro et al. 2010).
2.4.1. Mecanismos de resistencia.
Las garrapatas modifican su estructura genética, la cual es heredada a las nuevas
generaciones permitiéndoles sobrevivir al contacto de estos productos; por lo tanto la nueva
generación de garrapatas llevará los genes de resistencia de la anterior (FAO 2004; Guerrero,
Leonore Lovis, et al. 2012; Alonso-Díaz et al. 2006). Estas modificaciones pueden afectar al código
genético en sitios blancos para la acción del acaricida, el aumento del metabolismo o el
aumento de la detoxificación, o el aumento de la capacidad de las capas protectoras externas
de la garrapata para evitar que el acaricida penetre a través de estas (Lovis et al. 2012; Li et al.
2007).
2.4.2. Causas de resistencia.
La resistencia genética es producido por el uso intensivo de productos químicos acaricidas;
la cual, ha sido demostrado en varios estudios, en los cuales, una población de garrapatas y
su progenie es expuesta sucesivamente a un mismo principio activo por varias generaciones,
dando como resultado una población o cepa resistente (Chevillón et al. 2007). La evolución de
resistencias en garrapatas es causada por varios factores intrínsecos y operativos (Alonso-Díaz
et al. 2006); los factores intrínsecos corresponden a la biología, ecología, genética, velocidad
de mutación de la garrapata y que predispone a la producción de alelos resistentes; los cuales
afectan el comportamiento de las garrapatas y, en cambio, los factores operativos están
14
netamente bajo el control del ser humano, entre ellos tenemos la elección del producto
químico, la cantidad, la vía de aplicación, frecuencia y método (FAO 2003). Todos estos
factores deben conocerse con el fin de establecer medidas de prevención y estrategias de
control (Rodríguez-Vivas et al. 2014).
2.4.3. Métodos de diagnóstico de resistencias:
Para el adecuado diagnóstico de resistencias a acaricidas químicos en garrapatas, se han
desarrollado: métodos químicos, bioensayos y pruebas moleculares (FAO 2004).
2.4.3.1. Bioensayos para el diagnóstico de resistencias:
Son tres los bioensayos desarrollados, dos de ellos para estadio larval y uno para estadio
adulto.
Prueba de Inmersión de adultos: Fue desarrollada por Drummond et al. (1973), es usada para
determinar la eficacia de acaricidas en poblaciones de garrapatas, en estadío adulto (Junte
2008).
Prueba de Paquete larval: fue descrita por primera vez por Stone & Haydock (1962) y modificada
para el amitraz por Santos et al. (2013), esta prueba ha sido reconocida por la FAO (2004) para
diagnosticar resistencia, y es promovida por esta organización.
Prueba de Inmersión de larvas: fue describa por Shaw (1966) y ha tenido varias
modificaciones; sin embargo, no ha sido estandarizada, pero ha sido usada especialmente
para acaricidas de acción sistémica (Santos et al. 2013; Klafke et al. 2012).
Estudios como el de Soberanes et al. (2002), utilizaron estos tres métodos para determinar el
primer caso de resistencia al amitraz y piretroides en México al igual que Mendes et al. (2013)
en Brasil; Rosario-Cruz et al. (2009) mediante paquete larval determinaron la resistencia a
piretroides en México. Andreotti et al. (2011) usando la prueba de inmersión de adultos encontró
resistencia a Alfacipermetrina, Cipermetrina y Amitraz en Brasil.
2.4.3.2. Pruebas químicas:
Las pruebas químicas son ensayos para determinar la actividad de la esterasa que determina
si existe una correlación entre la supervivencia de las larvas y la actividad de la esterasa
cuando estos son afectados por los antiparasitarios; sin embargo, su realización requiere
reactivos y equipos costosos (Rosario-Cruz et al. 2009).
15
2.4.3.3. Pruebas moleculares:
Se utiliza la PCR para buscar alelos específicos para cada acaricida (Stone et al. 2014). En el
caso de los piretroides se busca detectar una substitución de una fenilalanina por una
isoleucina dentro del dominio III S6 en el segmento del gen para el canal de sodio (Rosario-
Cruz et al. 2009), para el amitraz, se correlacionan dos SNPs conocidos en el receptor de
octopamina para determinar la presencia de resistencias usando la técnica RFLP-PCR –
marcadores génicos- (Baron et al. 2014). las pruebas moleculares son complementarias a otro
método, ya sea bioensayos o pruebas químicas (Stone et al. 2014).
16
CAPÍTULO III- METODOLOGÍA
3. Metodología.
3.1. Descripción del área de estudio.
El estudio fue realizado en cuatro diferentes zonas: cantón San Miguel de los Bancos ubicado
en la estribación occidental de la cordillera, provincia de Pichincha con una superficie de
839 Km2, registrando una temperatura entre 15 y 32°C en una altitud media de 1.500 msnm,
máxima de 2.000 msnm y mínima de 1.000 msnm; cantón Pedro Vicente Maldonado ubicado
al noroeste de la provincia de Pichincha con una superficie de 620 Km2, registrando una
temperatura de 15 y 30°C promedio en una altitud media de 1.150 msnm, máxima de 1.500
msnm y mínima de 800 msnm; cantón Santo Domingo de los Colorados ubicado en los
flancos externos de la cordillera de los Andes, provincia de Santo Domingo de los Tsáchilas
con una superficie de 3.085 Km2, registrando una temperatura entre 18 y 35°C en una altitud
media de 1.000 msnm, máxima de 700 msnm y mínima de 400 msnm; cantón El Carmen
ubicado en la provincia de Manabí con una superficie de 1.245 Km2, registrando una
temperatura entre 20 y 35°C en una altitud media de 225 msnm, máxima de 300 msnm y
mínima de 150 msnm (AME 2016). Las muestras fueron colectadas de doce fincas; 3 por cada
uno de los cantones (ver figura 5). En el anexo 1, se encuentran los datos de cada una de las
fincas de éste estudio.
Figura 5 Área de estudio Fuente: CIZ, 2015
Elaborado por: Duque-Pérez, 2015.
17
3.2. Muestras en estudio:
De cada una de las fincas se colectaron, directamente del animal, un mínimo de 250
garrapatas hembras ingurgitadas (teleoginas) vivas de más de 5 mm, y algunos ejemplares
para identificación; mismas que, se retiraron del animal cuidando de no romper el hipostoma
ya que es una estructura importante para la identificación y supervivencia de la garrapata
(Junte 2008).
3.3. Métodos específicos del experimento.
3.3.1. Fase de campo.
El Centro Internacional de Zoonosis ha generado una base de datos gracias a los proyectos
que desarrolla; ésta información ayudó a seleccionar las tres fincas por cada cantón, tomando
en consideración el uso de acaricidas químicos y su frecuencia. Cada una de las fincas
seleccionadas fue visitada, georeferenciada (GPS Garmin eTrex 3) y muestreada con la
previa autorización del propietario. La colecta de las garrapatas ingurgitadas (teleoginas) se
realizó directamente de los animales, pasando lentamente la mano y tomando las que se
desprendían fácilmente, en caso de no desprenderse, se procedió a extraerlas por tracción,
sin romper el hipostoma (Véase figura 6) (Rivera et al. 2009; González-Coloma et al. 2012). Las
teleoginas fueron colocadas en frascos de plástico (Véase figura 7), debidamente etiquetadas,
con pequeños agujeros en la tapa para el intercambio de aire y en el fondo del frasco se
colocó una base de algodón poco humedecido. Este procedimiento se realizó en cada finca
a un número de máximo 25 teleoginas por frasco (Bravo & Coronado 2008; FAO 2004; Rivera et al.
2009). Luego, las muestras fueron transportadas, en un lapso no mayor a dos días, al
laboratorio de entomología aplicada del Centro Internacional de Zoonosis, en donde se
colocaron en condiciones adecuadas de humedad y temperatura hasta la realización de los
diferentes bioensayos (FAO 2004) .
Figura 6 Recolección directa del animal. Figura 7 Colecta de garrapata en
frasco de plástico.
18
3.3.2. Fase de laboratorio.
3.3.2.1. Preparación de diluciones de principios activos.
Tabla 1. Concentraciones a utilizar
Las diluciones a diferentes concentraciones
fueron realizadas en las instalaciones del CIZ.
Cada uno de los principios activos fueron pesados
en balanza microanalítica; los cuales,
posteriormente, fueron diluídos en 10ml de Xileno
(solvente orgánico utilizado para disolver y activar
principios activos) en el caso de Amitraz y
Alfacipermetrina y Glicerina para la Ivermectina. Las concentraciones utilizadas se
detalladas en la tabla 3; mismas que, fueron adaptadas de la FAO, (2004) y Rivera, (2009). La
dosis media utilizada en este estudio (modificación a la propuesta por la FAO) es la dosis
stock con la que se comercializa el producto en Ecuador. Una vez preparadas, las diluciones
fueron almacenadas en frascos ámbar en un lugar adecuado sin luz solar ni humedad.
3.3.2.2. Fase de laboratorio
Para realizar la fase de laboratorio se consideró todas las medidas de bioseguridad respecto
al manejo de sustancias tóxicas de clase 3, en el laboratorio del CIZ (Rivera et al. 2009; FAO
2004). En primer lugar se realizó la limpieza de las garrapatas en seguida de su recepción
para evitar contaminación de cualquier tipo (Véase figura 8), luego fueron colocadas en
incubadoras a 27ºC, y 80% de humedad relativa, hasta la realización de los diferentes
ensayos (FAO 2004). Paralelamente, se identificó las garrapatas en base a las diferentes
estructuras morfológica con la ayuda un estéreo microscopio Olympus SZ60 (Véase figura
9). Además, se siguió las claves dicotómicas de Cooley, 1946; Keirans & Durden, 1998; Martins,
Onofrio, Vargas, 2006 y Barros-Battesti, & Labruna, 2010
ACARICIDA % AIT* % LIT % LPT
0.002 0.002 0.002
Alfa - 0.02 0.02 0.02
cipermetrina 0.5 0.5 0.5
0.01 0.01 0.01
Ivermectina 0.1 0.1 0.1
0.5 0.5 0.5
0.002 0.002 0.002
Amitraz 0.1 0.1 0.1
0.25 0.25 0.25
* AIT= Inmersión de adultas; ** LIT= Immersion de
larvas *** LPT= Paquete larval
19
Figura 8 Recepción de garrapatas ingurgitadas.
Figura 9 Materiales para identificación de
garrapatas.
3.3.2.3. Bioensayos
Prueba de inmersión de adultos (AIT): El protocolo descrito por Drummond et al. 1973, y
adaptado por la FAO en el 2004 fue utilizado en este estudio; para lo cual, se retiraron las
teleoginas de la incubadora, las cuales fueron previamente limpiadas (Véase figura 10),
luego se seleccionaron las teleoginas mayores a 5 mm y se formaron grupos homogéneos
en términos de tamaño y número (Véase figura 11). En total se formaron 10 grupos de 10
teleoginas por cada finca. Cada grupo fue sumergido durante tres minutos en cada uno de
los tres acaricidas químicos y en cada una sus tres concentraciones; además de un grupo
control el cual fue sumergido en agua destilada (Véase figura 12). Luego, se procedió a secar
las teleoginas por treinta minutos sobre papel absorbente y se las inmovilizó dorsalmente
sobre tiras de cinta adhesiva colocadas en cajas petri. Las cajas fueron llevadas a cámaras de
incubación a 27° C de temperatura y 85% de humedad relativa para prepararse para la
oviposición (Cupp 1991). La mortalidad y el número de hembras que ovipositaron fueron
anotados al día siete del bioensayo; al final del mismo, las masas de huevos fueron recogidas
y pesados individualmente y colocados en tubos crioviales de 2ml., hasta el final de la
eclosión.
Los paquetes de huevos fueron revisados a diario (humedad y temperatura) para evitar la
desecación y muerte de los mismos. Después de seis semanas comenzó la eclosión y el
porcentaje de eclosión fue anotado entre 1 y 100% tomando en cuenta la relación entre los
huevos no eclosionados y las larvas vivas (Drummond et al. 1973; FAO 2004).
20
Figura 10 Limpieza de garrapatas
Figura 11 Grupos de garrapatas
Figura 12 Inmersión en principios
activos
Prueba de inmersión de larvas (LIT): Un grupo de teleoginas fueron colocadas en cajas
petri durante el periodo de ovoposición, posteriormente fueron retiradas las teleoginas y el
paquete de huevos fue colocado sobre papel filtro durante seis semanas hasta que empezó la
eclosión. En total, se utilizó aproximadamente 100 larvas por biensayo y por concentración
de entre 14 a 21 días post eclosión (Véase figura 13), ya que a esta edad las larvas se
encuentran completamente desarrolladas y se encuentran en fase infectiva (Gallardo 1999;
Anderson & Magnarelli 2008). Para este experimento, se utilizó el protocolo descrito por Shaw
(1966) y modificado por Mekonnen (2005), para el cual las larvas fueron colocadas
cuidadosamente con la ayuda de pinceles en las diferentes soluciones acaricidas de cada
principio activo durante 10 minutos (Véase figura 14); además un grupo control fue
sumergido agua destilada (Santos et al. 2013); luego se las seco sobre papel absorbente durante
treinta minutos para enseguida ser empaquetadas en sobres individuales, selladas y
colocadas en la incubadora (Véase figura 15). La lectura de los resultados de mortalidad se
hizo 72 horas más tarde (Véase figura 16 y 17) (Santos et al. 2013; Junte 2008).
21
Figura 13 Conteo de larvas vivas 72
horas post ensayo.
Figura 14 A= larva viva. B= larva
muerta
Prueba del Paquete larval (LPT): Al igual que para LIT, se empezó con la cría de una
muestra de diez garrapatas hembras ingurgitadas hasta la etapa de larva desarrollada
apropiadamente hasta el día 14 a 21 post eclosión (Véase figura 18) (Junte 2008). Para este
bioensayo, las larvas de garrapatas fueron expuestas a papeles filtro previamente
impregnados con los principios activos a excepción del Amitraz cuya base fue nylon; de
acuerdo al protocolo de la FAO (2004) (Véase figura 19). Para la lectura de los resultados, en
el caso del alfa-cipermetrina e ivermectina, los paquetes fueron abiertos 24 horas después, y
para el amitraz 48 horas después (Véase figura 20). Al abrirlos se realizó el conteo de larvas
vivas y larvas totales (FAO 1984; FAO 2004).
Figura 15 Larvas R. microplus catorce
días post eclosión
Figura 16 Larvas sobre el papel
impregnado de principio activo.
Figura 17 Paquetes larvales sellados y
etiquetados.
A
B
22
3.3.2.3.1 Proceso para impregnar papeles filtro con el principio activo.
Para la preparación de estos, se utilizó la solución madre preparada como base. En total se
preparó 10ml de cada concentración de cada uno de los principios activos. El papel filtro
como de tela nylon (el papel filtro fue usado para el alfa-cipermetrina y la ivermectina,
mientras que, nylon para el amitraz) fue recortado en círculos de diámetro de 3,5 cm (Véase
figura 21). Estos papeles fueron impregnados con 1ml de las distintas concentraciones; luego
de una hora de colocar 1ml sobre cada papel filtro, se esperó una hora para que el principio
activo quede impregnado (Véase figura 22). Para finalizar, se cubrió con papel aluminio, y
los paquetes fueron colocados en fundas selladas herméticamente y correctamente
etiquetados para su almacenamiento hasta ser usados en los bioensayos.
Figura 18 Materiales para preparar
papeles impregnados con principios
activos.
Figura 19 Dilución de principio activo
sobre papel filtro.
Figura 20 Paquetes con papel
filtro impregnado etiquetados.
3.3. Análisis de datos.
En total se realizaron 600 ensayos, considerando el tipo de bioensayo, finca, principio activo
y concentración el toda la investigación. Los datos fueron procesados en el programa Excel
2007, donde se aplicaron las fórmulas utilizadas por la FAO (2004) para determinación de
resistencia, en el caso de la prueba de Inmersión de adultos, y se calculó mortalidad corregida
para las pruebas de Inmersión de larvas y Paquete larval.
Las fórmulas aplicadas para Inmersión de adultos fueron las siguientes:
Cálculo de estimado reproductivo (ER): (Fórmula 1)
ER=Peso de los huevos puestos (g) X eclosión estimada (%) X 20.000 ( # de huevos)
Numero de hembras
23
Cálculo de Corrección del ER comparado con el grupo control. (Fórmula 2)
(%)𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 =ER garrapatas control – ER garrapatas tratadas
ER garrapatas tratadas x100
Cálculo de porcentaje de resistencia (RE). (Fórmula 3)
(%) Resistencia = 100 – (%) control
Cálculo de la mortalidad corregida en pruebas larvales (LPT y LIT) (Fórmula 4)
(%)Mortalidad corregida =mortalidad de la prueba − % mortalidad del control
100 − % control de mortalidad x 100
3.4. Análisis estadístico.
Obtenidos los resultados de mortalidad corregida, se realizó una base de datos para los
posteriores cálculos estadísticos, los datos de porcentajes fueron transformados a logaritmos
(log +1) para reducir el error experimental; se realizó un Análisis de Multivarianza para
determinar si existe o no diferencia significativa entre Inmersión de larvas y paquete larval
(Otero 2002; Whitlock & Schluter 2009).
Para el análisis de dosis-respuesta para predecir, en base a una regresión logística binomial
(tasa de mortalidad), se utilizó el software libre “R” statistics versión 3.2.3 y el paquete
estadístico “dcr”. La predicción se orientó a obtener valores estimados de las DL50 y DL99
ante el uso de estos productos químicos; del mismo modo, se evidenció los porcentajes de
resistencia que cada una de las fincas tiene respecto al uso de estos principios activos (Ritz &
Streibig 2005; Ritz et al. 2015; Ritz et al. 2015; Ritz & Van der Vliet 2009).
24
CAPITULO IV- RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
4. Resultados.
4.1. Presencia de resistencia en las poblaciones de garrapatas.
Los resultados obtenidos en este estudio muestran, en términos generales, la presencia de
resistencia a los diferentes productos químicos en las garrapatas y va entre 67 y el 75% para
el amitraz; entre 42 al 50% para el alfa-cipermetrina y, entre 25 a 50% para la ivermectina.
Es evidente observar que el amitraz posee los valores más altos de resistencia observados en
el estudio. Según la encuesta realizada a los productores, el amitraz, en diferentes
presentaciones, concentraciones y nombres, ha sido utilizado masivamente desde 1990
(EDIFARM 2011). Del mismo modo, la Encuesta Nacional de Brucelosis, Tuberculosis y
Garrapatas, ejecutada por el CIZ, a nivel nacional, indica que el amitraz es el más utilizado,
corroborando con la información obtenida en este estudio (datos no publicados).
La situación en algunos países de Latinoamérica es similar a lo observado en estas
localidades de Ecuador. En otros países se han reportado casos de resistencia a diferentes
acaricidas químicos como en Colombia, Araque et al. (2014) quienes reportan resistencias al
amitraz en un 97% de fincas en estudio; en Venezuela, Coronado & Mujica (1997) reportan
resistencia a Piretroides; en Cuba, Vega et al. (2007) determinan resistencias a cipermetrina,
amitraz e ivermectina sin mencionar los porcentajes; en México, también se indicó la
presencia de resistencia al amitraz (Soberanes et al. 2002); En Uruguay, del mismo modo, se
reportó la resistencia de R. microplus a la ivermectina (Niell et al. 2012); mientras que, Andreotti
et al. (2011) usando la prueba de Inmersión de adultos encontraron resistencia a alfa-
cipermetrina, cipermetrina y amitraz en Brasil.
En la tabla 2, se indica el comportamiento de la resistencia a los diferentes productos
químicos en función de la finca y el tipo de bioensayo utilizado. Todas las fincas, excepto
una (finca No. 8), muestran resistencia a uno o varios productos químicos, los cuales son
correlacionables entre los 3 bioensayos. Los resultados se basan en un porcentaje de igual o
superior al 10% de supervivencia de las larvas e igual o superior a 50% de resistencia en
garrapatas adultas, según lo descrito por (Junte 2008).
Según los resultados obtenidos para la prueba de Inmersión de adultos, se obtiene 8 de 12
fincas resistentes al amitraz (67%); 6 de 12 fincas son resistentes al alfa-cipermetrina (50%)
y para la ivermectina se observó el 25% de resistencia (3/12). Este protocolo, según la FAO
(2004), indica que el porcentaje de resistencia se basa en el cálculo del porcentaje de hembras
25
que ovipositaron, el número huevos por garrapata y el porcentaje de eclosión (ver sección
MM, 3.3); sin embargo, los resultados obtenidos por esta prueba en comparación con las
pruebas realizadas en larvas, al Chi2, no es significativo (P=0.91), lo que confirma la
asociación de estas pruebas en la determinación de resistencias en las fincas en estudio. Es
importante destacar que el 58% de las fincas muestran resistencia a 2 productos químicos,
siendo el más frecuente la combinación amitraz-alfacipermetrina (33%); el 33% de las fincas
analizadas muestran resistencia a un solo producto, siendo el amitraz (16,7%), seguido de la
ivermectina (8.33%)(%).
Con el bioensayo Inmersión de larvas se identificó resistencias para el amitraz en 9 fincas
de 12 (75%); por el contrario, las resistencias mostradas en las fincas para el alfa-
cipermetrina y la ivermectina fueron 5 de 12, es decir un 42 %. Como se observa en la tabla
2, la presencia de la resistencia es dispersa en todas las fincas; sin embargo, 8 fincas (66.6%)
muestran resistencia a 2 productos químicos siendo la combinación amitraz-ivermectina la
principal seguida de amitraz-alfacipermetrina.
Por último en el bioensayo de Paquete larval, reportó a 8 fincas resistentes al amitraz,
equivalentes al 67%; mientras que, para el alfa-cipermetrina e ivermectina fueron 6 fincas
resistentes, siendo el 50% en relación a las 12 fincas. En éste bioensayo, 2 fincas reportaron
resistencia a los 3 productos químicos utilizados, 6 fincas a 2 productos químicos, 2 a un
solo producto y 1 no presentó resistencia.
La finca 8, es considerada una finca sensible a los productos acaricidas ya que el porcentaje
de mortalidad evidenciado fue superior al 95% excepto en el amitraz que presentó
mortalidades superiores al 85%; muy probablemente se deba a que, la finca utiliza otros
productos para el control de garrapatas como el diclorvos, el fipronil, la cipermetrina o
combinaciones entre estos, diferentes a los analizados en este estudio; consecuentemente, se
no se evidenció resistencia al amitraz, alfa-cipermetrina e ivermectina; aunque, podrían
presentar resistencia a los productos comúnmente utilizados en esa finca. En poblaciones
que no han sido sometidas a la presencia de un producto químico; es decir, no han sido
sometidas a presión de selección, la probabilidad de mutación de genes que generan
resistencia es baja o nula (Alonso-Díaz et al. 2006). Por lo tanto, es importante realizar
futuros estudios con otros productos antiparasitarios.
26
Tabla 2 Fincas resistentes.
La valoración de la resistencia de las garrapatas a los diferentes productos químicos se basa
en los resultados encontrados cuando se utiliza la dosis recomendada por los farmacéuticos
también llamada “dosis discriminante” o “dosis stock” la que equivale, en teoría, a la DL99;
es decir que mata al 99% de la población total de las garrapatas. En este estudio se incluyó
una dosis mínima y una dosis máxima que permite relacionar y corroborar los resultados
obtenidos por la dosis discriminante (ver Figura 33 a 41). Es por esto que, los resultados
muestran que a menor concentración, la supervivencia es mayor debido a que la cantidad de
producto activo podría ser insuficiente para matar a la totalidad de la población o que, debido
a la resistencia desarrollada en esa población, el producto no surta efecto; por el contrario,
si se aumenta la concentración en cada principio activo sobre la dosis discriminante o DL99,
se esperaría o garantizaría que todas las garrapatas no sobrevivan. La realidad muestra que,
a pesar de ser dosis hipertóxicas, el 63,9%, 2,8%, 27,8% de las fincas, muestra resistencia al
amitraz, alfa-cipermetrina e ivermectina, respectivamente. Es interesante observar que la
resistencia de las garrapatas respecto del amitraz, a la dosis máxima, es la más significativa,
seguida por la ivermectina; por el contrario, el alfa-cipermetrina solo presentó resistencia en
una sola finca y a un solo bioensayo (LPT). Esta información corrobora la observaciones
encontradas por otros autores (Veiga et al. 2012; Araque et al. 2014; Muyobela et al. 2015; Rosario-Cruz
et al. 2009) en el sentido de que las drogas que has sido utilizadas frecuentemente y por largos
periodos de tiempo, son susceptibles de generar mayor resistencia que las drogas que han
sido recientemente introducidas al mercado y que su frecuencia de uso aún no es
representativo, como es el caso del alfa-cipermetrina.
Bioensayo
Inmersión de adultos Inmersión de larvas Paquete larval
finca Amitraz α-cipermetrina Ivermectina Amitraz α -cipermetrina Ivermectina Amitraz α-cipermetrina Ivermectina
1 x x x x x x x
2 x x x x x 3 x x x x x x
4 x x x x x x
5 x x x x x x x 6 x x x x x x
7 x x x x
8 9 x x x x x x
10 x x
11 x x x 12 x x x x
Total 8 6 3 9 5 5 8 6 6
% 67 50 25 75 42 42 67 50 50
27
Por otro lado, hay que considerar que las variaciones mínimas en los resultados cuando se
analiza por producto químico, son influenciadas por los mecanismos de acción de los
principios activos utilizados en este estudio actúan de manera diferente en larvas y adultos.
Por ejemplo en el caso de la ivermectina, el producto presenta mayor resistencia en larvas
que en adultos; mientras que, el alfa-cipermetrina fue más eficaz en larvas y el amitraz afecta
de manera similar en ambos estadios (Véase figuras 24-32). Por esta razón, se observó
diferencias en los valores de resistencia y porcentaje de mortalidad entre los dos estadíos
(AIT y LPT o LIT); aunque su diferencia estadísticamente no es significativa (Chi2=
P=0.91). Del mismo modo, se constató que cada finca, como unidad muestreal, es totalmente
diferente una de otra, ya que tiene un comportamiento individual caracterizado por el manejo
de pasturas, alimentación y uso de productos acaricidas, favoreciendo o desfavoreciendo la
presión de selección a la que se somete a cada población de garrapatas. Un ejemplo de lo
anteriormente citado es que las fincas 3, 10 y 12 presentaron mediana resistencia al alfa-
cipermetrina en el estadío adulto y en larvas fue susceptible; para la ivermectina la finca 12
fue susceptible en estadío adulto y en larvas presentó baja resistencia; en cambio, la finca 3
presentó susceptibilidad en la escala usada aunque ésta fue del 48% de RE pero en larvas
fue altamente resistente, en cambio para el amitraz presentaron resultados semejantes tanto
en adultos como en larvas. Del mismo modo, se debe considerar que parte de estas
variaciones también pudieron estar influidas por el laboratorio, el manejo de las muestras, el
producto químico y el laboratorista.
A continuación se presentan los gráficos (Figuras 24-32) que detallan el comportamiento de
los porcentajes de resistencia en función del producto acaricida, el bioensayo y la finca
participante en el estudio. Estos gráficos ya fueron analizados en párrafos anteriores.
28
Figura 2423 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión
de adultos, Amitraz
Figura 25 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de
adultos, Alfacipermetrina.
Figura 26 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de
adultos, Ivermectina
Figura 27 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de
larvas, Amitraz
Figura 28 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de
larvas, Ivermectina
Figura 29 Niveles de resistencia - Prueba Inmersión de
larvas, Alfacipermetrina
Figura 230 Niveles de resistencia - Paquete larval,
Amitraz
Figura 231 Niveles de resistencia - Paquete larval,
Alfacipermetrina
29
4.2. Niveles de resistencia.
La escala utilizada para determinar los niveles de resistencia es la propuesta por Junte (2008)
y modificada en este estudio. Para el bioensayo de Inmersión de adultos, se consideró que
un porcentaje inferior al 50% del cálculo de resistencia (RE, ver fórmula 3) se le consideró
susceptible; mientras que, del 51 a 80% se tomó como resistencia media y del 81 a 100%
como resistencia alta. Del mismo modo, para las pruebas de Inmersión de larvas y Paquete
larval se tomó en cuenta los porcentajes de resistencia menores a 10% como susceptibles
(>90% de mortalidad), de 11 a 20% como resistencia baja (80 a 90% de mortalidad), 21 a
50% resistencia media (50 a 80% de mortalidad) y mayores a 50% como resistentes (<50%
de mortalidad).
4.2.1. Prueba de Inmersión de Adultos.- Esta prueba, en el caso del amitraz, demostró que
4 fincas fueron susceptibles (33,33%), 6 tuvieron resistencia media (50%) y 2 mostraron
resistencia alta (16,7%). Para el caso de alfa-cipermetrina, 6 fincas fueron susceptibles
(50%), y 6 presentaron resistencia media (50%); para ivermectina, 9 fincas fueron
susceptibles (75%), 3 presentaron resistencia media (25%) y ninguna resistencia alta. En las
figuras 33, 34 y 35, se puede observar el nivel de resistencia en cada una de las fincas con
sus respectivos porcentajes. En el estadio adulto, se denota una mayor resistencia al amitraz,
seguida de alfa-cipermetrina y por último a la ivermectina.
4.2.2. Prueba de Inmersión de Larvas.- para el caso de amitraz, 3 fincas fueron
susceptibles (25%), 2 presentaron resistencia baja (16,7%), 4 resistencia media (33,3%) y 3
resistencia baja (25%). Para alfa-cipermetrina, 7 fincas fueron susceptibles (58,3%), 4
presentaron resistencia baja (33,3%), ninguna resistencia media y 1 con resistencia alta
(8,3%). En la ivermectina, 7 fincas fueron susceptibles (58,3%), 1 presentó resistencia baja
(8,3%), 3 resistencia media (25%) y 1 resistencia alta (8,3%). En las figuras 36, 37 y 38 se
puede observar el nivel de resistencia en cada una de las fincas con sus respectivos
Figura 32 Niveles de resistencia - Paquete larval,
Ivermectina
30
porcentajes. Para éste bioensayo, se observa una mayor resistencia al amitraz, seguida de
ivermectina y por último alfa-cipermetrina.
4.2.3. Prueba de Paquete larval.- para el amitraz, 4 (33,3%) fincas fueron susceptibles, 1
(8,3%) presentó resistencia baja, 5 (41,6%) resistencia media y 2 (16,7%) resistencia baja.
Con Alfa-cipermetrina, el 50% (6/12) de fincas fueron susceptibles, 2 presentaron resistencia
baja (16,7%), 3 resistencia media (25%) y 1 resistencia alta (8,3%). Por último, a
Ivermectina, 6 fincas fueron susceptibles (50%), 2 presentaron resistencia baja (16,7%), 3
resistencia media (25%) y 1 resistencia alta (8,3%). En las figuras 39, 40 y 41 se puede
observar el nivel de resistencia en cada finca con sus respectivos porcentajes. Para éste
bioensayo, se observa una mayor resistencia al amitraz, seguida de alfa-cipermetrina e
ivermectina con similares resultados.
Como se puede observar en los resultados, en el caso de los bioensayos utilizados en Larvas,
el 74% de las fincas que presentaron resistencia baja o media, podrían ser, en un futuro
cercano, altamente resistentes a los productos químicos de no tomar medidas de control
adecuadas. Para el ensayo de Inmersión de adultos, se observan porcentajes de resistencia
superiores al 100%, esto se debe a que el cálculo es corregido en base al grupo control, por
lo que, por ejemplo, con el amitraz se observaron valores de oviposición, peso de huevos y
porcentaje de eclosión superiores al del grupo control, dándose claramente a notar la
resistencia de éstas fincas, como por ejemplo la finca 4.
Tabla 3 Niveles de resistencia, tres bioensayos.
4.3. Comparación de los bioensayos
4.3.1. Cuantitativa- Análisis de Varianza Multivariante.
Según la prueba estadística, al comparar Inmersión de larvas vs Paquete larval, no se obtuvo
diferencia significativa entre tratamientos (p = 0.055), lo que concuerda con el estudio de
Junte (2008).
Bioensayo
Inmersión de adultos Inmersión de larvas Paquete larval
S RM RA S RB RM RA S RB RM RA Total
Amitraz 4 6 2 3 2 4 3 4 1 5 2 12
α-cipermetrina 6 6 0 7 4 0 1 6 2 3 1 12
Ivermectina 9 3 0 7 1 3 1 6 2 3 1 12
S= susceptibles; RB= Resistencia baja; RM= Resistencia media; RA= Resistencia alta.
31
4.4. Dosis efectivas estimadas (DEE) de mortalidad 50 y 99 para LIT y LPT, según la
finca.
En el mercado ecuatoriano existen productos que, según las recomendaciones, contienen la
dosis discriminante o stock, efectiva para matar al 99% de los ácaros cuando éstas son
utilizadas en el control de garrapatas en las ganaderías de las zonas tropicales y subtropicales
del Ecuador y, garantiza un adecuado manejo y una eficiente rentabilidad de los productos
obtenidos de estos animales. Las dosis discriminantes o stock disponibles en el mercado y
utilizadas en este estudio fueron para el amitraz el 0,1%(p/v), el alfa-cipermetrina el
0,02%(p/v) y la ivermectina el 0,1%(p/v) las que se consideran DL99, para las garrapatas
(Alonso-Díaz et al. 2006; EDIFARM 2011; Lovis et al. 2011) y que corresponden para matar
efectivamente al 99% de las garrapatas considerando que el animal no sea afectado por la
toxicidad del producto. Es conocido que, conforme avanza los porcentajes de resistencia en
las garrapatas, a falta de un nuevo producto o por los costos que implica el cambio de uno
nuevo, las empresas farmaceúticas se han visto en la necesidad de modificar su
concentración haciéndola más tóxica para los ácaros, para los animales y el medio ambiente.
A modo de ejemplo se destaca que por los años 80 del siglo pasado, la concentración de
ivermectina utilizada era 33 veces menor a la que se utiliza en la actualidad (0.003% vs
0.1%).
El análisis de dosis-respuesta permite predecir el comportamiento de las drogas utilizadas
en el estudio a las diferentes concentraciones. Para una mejor explicación el análisis de
regresión logística fue analizado por finca y en conjunto los dos bioensayos. En términos
generales, los gráficos demuestran y confirman los resultados obtenidos por los porcentajes
de mortalidad en los bioensayos LPT y LIT que, en el 92% de los casos (gráficos 33A- 33L),
se observa que la mortalidad incrementa conforme se aumenta la concentración de la dosis.
En algunos casos, se observó que el comportamiento de las drogas en relación a la mortalidad
de las garrapatas tuvo un efecto ligeramente adverso al esperado; quizás, esto se deba a
problemas en la manipulación de las drogas en cada bioensayo o incluso a errores de
laboratorio.
En particular, la finca no. 8 (ver gráfico 33H) en el análisis químico de los bioensayos LPT
y LIT mostró mortalidades de las larvas superiores al 91% en los 3 principios activos. Los
gráficos predictivos de regresión logística confirman los resultados encontrados en cada
bioensayo.
32
Figura 33 Análisis predictivo
Fig. 33A. Curva de regresión logística, finca 1 Fig. 33B. Curva de regresión logística, finca 2
Fig. 33C. Curva de regresión logística, finca 3 Fig. 33D. Curva de regresión logística, finca 4
Fig. 33E. Curva de regresión logística, finca 5 Fig. 33F. Curva de regresión logística, finca 6
Fig. 33G. Curva de regresión logística, finca 7 Fig. 33H. Curva de regresión logística, finca 8
33
.
Del mismo modo, al análisis de dosis-respuesta (Ritz & Streibig 2005; Ritz et al. 2015; Ritz et al.
2015; Ritz & Van der Vliet 2009), permite estimar la DEE que cada principio activo debería ser
utilizado para matar el 50% y el 99% de las garrapatas que, en éste estudio correspondería a
la dosis discriminante y máxima, respectivamente. En la tabla 4, se resume los resultados
obtenidos por el modelo de regresión logística que para matar al 50% de garrapatas, en fincas
resistentes para el amitraz (75%) se requiere hasta 3,25 veces más que la dosis discriminante
y que, para matar al 99% se requeriría entre 10 y 13,8+141 veces más lo que virtualmente es
imposible de usar por su toxicidad; en el caso de la alfacipermetrina (58% fincas resistentes)
para matar al 50% de garrapatas se requiere hasta 89 veces más que la dosis discriminante
y, para matar al 99% se requeriría entre 84 y 25,2 +38 veces la dosis discriminante; y
finalmente para las fincas resistentes a la ivermectina (50%) se requiere hasta 3,25 veces
más que la dosis discriminante y que, para matar al 99% se requeriría entre 10 y 13,8+141
veces más de la misma.
De similar manera, las DEE en las fincas susceptibles para el amitraz (25%), muestran que
se encuentran dentro de los parámetros normales utilizados, como dosis discriminante, en
los principios activos utilizados en éste estudio; sin embargo, las fincas (2, 4 y 5) no
proporcionan una DEE coherente debido principalmente a la interacción de resultados que
Fig. 33I. Curva de regresión logística, finca 9 Fig. 33J. Curva de regresión logística, finca 10
Fig. 33K. Curva de regresión logística, finca 11 Fig. 33L. Curva de regresión logística, finca 12
34
se encuentran dentro del modelo estadístico; es decir que a una dosis discriminante correcta,
el modelo no es capaz de determinar una DL99 cercana a la realidad.
Tabla 4 Dosis efectivas estimadas, finca 12.
Principio activo Amitraz Alfacipermetrina Ivermectina
Bioensayos LPT * LIT ** LPT LIT LPT LIT
Finca 1 DEE*** 50 0,273 0,232 0,082 0,084 0,096 0,0002 DEE 99 5,47 3,305 0,168 0,307 0,496 6,285
Finca 2 DEE 50 0,002 0,002 0,006 0,0006 0,128 0,271
DEE 99 0,013 1,99+37 2,52+38 21,11 1,962 1,478
Finca 3 DEE 50 0,169 0,213 0,002 0,001 0,095 0,17 DEE 99 1,021 2,32 0,006 0,097 11,129 4,93+02
Finca 4 DEE 50 0,05 0,026 0,071 0,099 0,338 2,436
DEE 99 1,38+141 9,47+30 0,311 0,246 10,029 23,147
Finca 5 DEE 50 0,214 0,009 0,001 0,006 4,612 0,022 DEE 99 4,525 0,009 5,29+04 0,64 69.125 NA
Finca 6 DEE 50 0,116 0,103 0,129 0,178 0,309 0,013
DEE 99 8,20+29 1,25+34 282,38 59,63 2,37 1,71-01
Finca 7 DEE 50 0,028 0,108 0,069 0,117 0,031 0,274 DEE 99 2,93+06 1,04+25 0,243 0,435 2,18+06 810,449
Finca 8 DEE 50 0,124 0,163 0,189 0,651 0,012 0,335
DEE 99 1,092 1,171 1,814 0,955 0,057 1,227
Finca 9 DEE 50 0,05 0,11 0,0001 0,00007 0,183 0,079 DEE 99 1,48+15 1,80+25 4511,9 7,90+07 1,37+06 5,37+14
Finca 10 DEE 50 0,049 0,115 0,002 0,0003 0,0001 0,164
DEE 99 5,88+05 NA 0,219 3,495 1,34+17 5294,9
Finca 11 DEE 50 0,325 0,01 0,01 0,011 0,064 0,209 DEE 99 25,018 1,39+13 2,55+18 0,448 0,694 4,24+110
Finca 12 DEE 50 0,027 0,052 0,019 0,002 0,058 0,053
DEE 99 4,4 5,87+08 0,815 55,559 0,718 4127,8
* = Paquete larval ** = Inmersión larval ***= Dosis efectiva estimada
La importancia de estos estudios, radica en aportar información para mejorar los planes de
control, y de esta manera, realizarlos de manera integrada, utilizando productos de eficacia
comprobada en cada finca, combinados con alternativas como manejo de pastos, rotación de
potreros, entre otros.
Con respecto a los bioensayos, para la prueba de Inmersión de adultos, la principal limitante
de éste es la necesidad de tener que contar con un gran número de muestras de teleoginas
colectadas en campo, además del poco tiempo disponible entre colectar las muestras y
empezar los bioensayos, ya que si las teleoginas empiezan a ovipositar ya no son útiles, sin
embargo, este ensayo es importante para conocer el efecto en etapa adulta la cuál es diferente
que en etapa larval. La prueba de Inmersión de larvas, involucra más complicaciones en el
proceso que la prueba de Paquete larval, tomando en cuenta que las dos dan el mismo tipo
de resultados y necesitan el mismo tiempo de aproximadamente 8 a 10 semanas,
corroborando la sugerencia de la FAO (2004) sobre el uso de Paquete larval para ensayos en
larvas de garrapatas.
35
En general, el principio activo con mayor eficacia corresponde al alfa-cipermetrina
alcanzando valores de más de 90%, seguido de la ivermectina que llega a 83% en una
mediana eficacia y por último el amitraz, el cual demuestra una baja y en algunos casos, nula
eficacia, ya que se necesitarían dosis completamente altas para llegar al 99% de mortalidad
de la población lo que no sería viable (Véase figura 34).
Con respecto a los datos reflejados en las curvas de regresión logística existe la tendencia de
que la mortalidad aumenta en medida que la concentración lo hace, sin embargo en algunas
fincas por más que se aumente la dosis de manera considerable, la mortalidad no va a llegar
a la deseada por lo que el principio activo no va a ser efectivo de ninguna manera, además
no se debe sobredosificar ya que representa un riesgo tanto para los animales como para el
personal que los maneja; además del daño al medio ambiente por los residuos en el suelo
que provoca la muerte de la microfauna que degrada los desechos orgánicos en él (Pavón-
Leyva 2014).
El uso intensivo e indiscriminado de acaricidas provoca una fuerte presión de selección, pero
si se utiliza de manera racional, combinándolos con alternativas como rotación de potreros,
mejoramiento genético, entre otros, es posible combatir y disminuir las resistencias, aunque
con el grado de resistencias disperso, es necesario realizar monitoreos en cada finca para
generar planes de control específicos a las necesidades de éstas (Ojeda-Chi et al. 2011).
Figura 34. Regresión logística total
población
36
CAPITULO V- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones.
Se concluye que el amitraz presentó un 67% de fincas resistentes en Inmersión de
Adulto y Paquete larval respectivamente; y un 75% en Inmersión de larvas. Con el
alfa-cipermetrina se determinó un 50% de fincas resistentes en Inmersión de Adultos
y Paquete larval; y un 42% en Inmersión larval, por último para la ivermectina, se
encontró un 25% de fincas resistentes en Inmersión de Adultos, 42% en Inmersión
de larvas y 50% en Paquete Larval.
Al término de los ensayos, se determinó que para el amitraz, un 13% de fincas
presentaron resistencia baja, 42% resistencia media y 19% resistencia alta, con el
alfa-cipermetrina 25% de las fincas tuvieron resistencia baja y media
respectivamente, mientras que, un 6% resistencia alta, por último, a la ivermectina
13% de fincas tuvieron resistencia baja, 25% resistencia media y 14% resistencia
alta.
Posterior a la realización del análisis estadístico se determinó que no existe diferencia
significativa entre los tres bioensayos utilizados en el estudio.
5.2. Recomendaciones.
Basados en los resultados obtenidos en éste estudio, se recomienda considerar cada
finca como un ente individual que presenta sus propios comportamientos en términos
de resistencia lo cual permitirá a las autoridades y los organismos competentes
puedan proponer mejores planes de control de esta garrapata y de manejo.
Para un buen diagnóstico utilizando bioensayos, se recomienda utilizar uno para
estadío adulto y uno para estadío larval, ya que el comportamiento de los principios
activos es diferente en cada estadío. Se recomienda utilizar la prueba de Paquete
larval, la cual ha sido aceptada por la FAO, además de presentar menor complejidad
en su realización versus Inmersión de larvas.
37
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