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Universidad de Chile
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química
Carrera Ingeniería en Alimentos
VALIDACIÓN Y DESARROLLO DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA
PARA LA DETERMINACIÓN DE POLIFENOLES TOTALES EN ACEITES
DE OLIVA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN (HPLC)
Memoria para Optar al Título de Ingeniero en Alimentos
PATRICIA ALEJANDRA ESCOBAR SALGADO
Profesor Patrocinante Director
Prof. MSc. Nalda Romero P. Prof. MSc Nalda Romero P.
Departamento de Ciencia Departamento de Ciencia
de los Alimentos y Tecnología Química de los Alimentos y Tecnología
Química
Co-Director
Prof. Dra. Paz Robert C.
Departamento de Ciencia
de los Alimentos y Tecnología
Química
SANTIAGO, CHILE
ENERO 2010
2
A ti abuelita Lala,
que me guías desde lo alto.
3
AGRADECIMIENTOS Agradezco a todos aquellos que hicieron posible mi proceso de titulación, a
mi Profesora Guía, Sra. Nalda Romero, quien con su apoyo constante,
preocupación y conocimientos facilitados, pude desarrollar este proyecto,
como también a las personas que integran el grato ambiente del Laboratorio
de Química de Alimentos y Materias Grasas.
También deseo brindar mis agradecimientos a aquellas personas que han
estado a mi lado apoyándome incondicionalmente durante toda mi vida, mi
familia, en especial a mi madre Tatiana, quien me enseñó que con esfuerzo
se alcanzan las metas, mi papá Hugo, mis hermanos Felipe e Ignacio y mis
abuelitas Irene y Nivia.
No puedo dejar de mencionar y agradecer a quienes he ido encontrando en
este largo camino, aprendiendo de cada uno, entregando la mejor de sus
voluntades para el logro de mis propósitos y permitir que sea una mejor
persona, mis amigos.
Y a quien me ha dado la confianza de creer que todo es posible si se desea
intensamente, mi compañero de ésta y todas mis futuras etapas, mi pololo
Cristián.
4
TABLA DE CONTENIDO Página
RESUMEN…………………………………………………………………….. 8
SUMMARY.................................................................................................. 10
1. INTRODUCCION…………………………………………………………. 12
1.1. Reseña histórica del aceite de oliva…………………………… 12
1.2. Cultivo de olivos en Chile……………………………………….. 12
1.3. Caracterización del olivo y su fruto……………………………. 13
1.4. Variedades de Olivos……………………………………………. 14
1.5. El aceite de oliva.............………………………………………… 15
1.5.1. Proceso de obtención del aceite de oliva extra virgen. 15
1.5.2. Tipos de aceite de oliva.………………………………. 20
1.5.3. Composición química...............................................… 22
1.5.4. Compuestos fenólicos.............………………………….. 23
1.6. Validación de Técnicas Analíticas……………………………... 25
2. OBJETIVOS……………………………………………………………….. 28
2.1. Objetivo General…………………………………………………. 28
2.2. Objetivo Específico……………………………………………… 28
3. MATERIALES Y METODOS……………………………………………. 28
3.1. Materiales………………………………………………………… 28
3.1.1. Material de Laboratorio………………………………….. 28
3.1.2. Reactivos…………………………………………………. 29
3.1.3. Equipos…………………………………………………… 29
3.2. Metodología………………………………………………………. 30
3.2.1.Técnica Cromatográfica.....................................……… 30
3.2.2.Implementación de la metodología analítica para la
determinación de biofenoles de aceites de oliva
extra virgen………………………………......................
30
3.2.2.1. Preparación de Soluciones……………........... 31
3.2.2.2. Preparación de las muestras………………… 32
3.2.2.3. Preparación del cromatógrafo………………... 32
3.2.3. Aplicación de las propiedades del método analítico
para la validación de la técnica………………………..
34
5
3.2.4. Evaluación Estadística………………………………….. 35
4. EXPRESION DE RESULTADOS……………………………………….. 35
4.1. Cálculo de los factores de respuesta de los patrones
externos de calibrado (RF)....…………..................................
35
4.2. Cálculo de la relación entre los factores de respuesta (RRF).. 35
4.3. Cálculo del contenido de biofenoles de aceite de oliva extra
virgen........................................................................................
36
4.4. Cálculo de LDM………………………………………………….. 36
4.5. Cálculo de LCM................……………………………………….. 37
4.6. Cálculo de Recuperación......................................................... 37
5. RESULTADOS…………………………………………………………... 38
5.1. Determinación de parámetros para la validación del método.. 38
5.1.1. Límite de detección del método (LDM) y Límite de
cuantificación del método (LCM)..................................
38
5.1.2. Replicabilidad y Repetibilidad…………………............. 39
5.1.3. Recuperación…………………………………………….. 41
5.2. Determinación de Polifenoles Totales en aceites de oliva
extravirgen de las variedades Arbequina, Picual y Frantoio,
producidas en Chile y de la variedad Arauco, producida en
Argentina…………………………………………………………
43
5.3. Contenido de hidroxitirosol y tirosol determinados en las
muestras de aceite de oliva extra virgen..................................
46
6. DISCUSIÓN……………………………………………………………...... 50
6.1. Validación de la técnica............................................................ 50
6.2. Cuantificación de polifenoles de las muestras de aceite de
oliva extra virgen analizadas....................................................
51
6.3. Contenido de Tirosol e Hidroxitirosol de las muestras
analizadas...............................................................................
54
7. CONCLUSIONES……………………………………………………........ 56
8. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………….... 57
6
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla N°1.- Composición de la fracción insaponificable del aceite de oliva...... 22
Tabla N°2.- Gradiente de elusión de los solventes ........................................... 33
Tabla N°3.- Límite de detección (LDM) y cuantificación (LCM) del método
para el compuesto hidroxitirosol.....................................................
39
Tabla N°4.- Replicabilidad y repetibilidad de Polifenoles en aceites de oliva
extra virgen, variedad arbequina...................................................
40
Tabla N°5.- Contenido de tirosol para las muestras de aceite de oliva extra
virgen (variedad arbequina) sin fortificar y fortificada con 30µL y
su porcentaje de recuperación con sus parámetros estadísticos..
41
Tabla N°6.- Contenido de tirosol para la muestra de aceite de oliva extra
virgen (variedad arbequina) sin fortificar y fortificada con 60µL y
su porcentaje de recuperación con sus parámetros estadísticos.
42
Tabla N°7.- Polifenoles totales para las muestras de aceite de oliva extra
virgen, variedad Arbequina..........................................................
43
Tabla N°8.- Cantidad de polifenoles totales para las muestras de aceite de
oliva extra virgen, variedad Picual..................................................
44
Tabla N°9.- Polifenoles totales para las muestras de aceite de oliva extra
virgen, variedad Frantoio..............................................................
44
Tabla N°10.- Polifenoles totales para las muestras de aceite de oliva extra
virgen, variedad Frantoio..............................................................
45
Tabla N°11.- Contenido de hidroxitirosol y tirosol para las muestras de aceite
de oliva extra virgen de la variedad Arbequina.............................
47
Tabla N°12.- Contenido de hidroxitirosol y tirosol para las muestras de aceite
de oliva extra virgen de la variedad Picual...................................
48
Tabla N°13.- Contenido de hidroxitirosol y tirosol para las muestras de aceite
de oliva extra virgen de la variedad Frantoio................................
48
Tabla N°14.- Contenido de hidroxitirosol y tirosol para las muestras de aceite
de oliva extra virgen de la variedad Arauco..................................
49
Tabla N°15.- Promedio y rango de polifenoles obtenidos para variedad
Arbequina, Picual, Frantoio, y Arauco.........................................
51
Tabla N°16.- Parámetros estadísticos (X, DS, CV%) de los compuestos
7
hidroxitirosol y tirosol de las 4 variedades.................................... 54
Tabla N°17.- Contenido de hidroxitirosol y tirosol en aceites de oliva extra
virgen de la variedad picual, del presente estudio (A), de la
primera y segunda campaña (B,C) de la literatura.......................
55
Tabla N°18.- Áreas de Hidroxitirosol para el cálculo de LDM y LCM................ 64
Tabla N°19.- Áreas de Polifenoles Totales de las 10 repeticiones para el
cálculo de X, DS y CV% para obtener la replicabilidad del
método..........................................................................................
65
Tabla N°20.- Áreas de Polifenoles Totales de las 9 repeticiones para el
cálculo de X, DS y CV% para obtener la repetibilidad del
método..........................................................................................
67
Tabla N°21.- Áreas de Tirosol y ácido Siríngico para el cálculo de la
recuperación de las 5 repeticiones realizadas sin fortificar..........
69
Tabla N°22.- Áreas de Tirosol y ácido Siríngico para el cálculo de la
recuperación de las 5 repeticiones realizadas fortificadas con
30μL de Tirosol.............................................................................
70
Tabla N°23.- Áreas de Tirosol y ácido Siríngico para el cálculo de la
recuperación de las 6 repeticiones realizadas fortificadas con
60μL de Tirosol.............................................................................
70
Tabla N°24.- Área de Polifenoles Totales de las muestras de variedad
Arbequina......................................................................................
71
Tabla N°25.- Área de Polifenoles Totales de las muestras de variedad Picual. 76
Tabla N°26.- Área de Polifenoles Totales de las muestras de variedad
Frantoio.........................................................................................
78
Tabla N°27.- Área de Polifenoles Totales de las muestras de variedad
Arauco...........................................................................................
82
Tabla N°28.- ANOVA para el contenido de polifenoles totales entre las 4
variedades....................................................................................
86
8
RESUMEN El aceite de oliva es el zumo de la aceituna, obtenido por medios mecánicos o
físicos, en condiciones especialmente térmicas; está compuesto
principalmente por triglicéridos, en menor proporción por ácidos grasos libres
y por constituyentes no glicéridos. Entre los componentes no glicéridos el
aceite de oliva contiene sustancias fenólicas o “polifenoles”, que son un
conjunto heterogéneo de moléculas, con acción antioxidante, que comparten
la característica de poseer en su estructura varios grupos bencénicos
sustituidos por funciones hidroxílicas. Son compuestos minoritarios y forman
parte de la fracción polar del aceite, la cual es una mezcla compleja, que
influyen en la estabilidad, sabor y aroma del aceite de oliva virgen. De estos
constituyentes, se consideran como mayoritarios el tirosol e hidroxitirosol,
aunque también están presentes la oleuropeína, ácido cafeico, ácido
vainíllico, ácido ρ-cumárico, ácido o-cumárico, ácido protocatépico, ácido
sinápico, ácido ρ-hidroxibenzoico, ácido ρ-hidroxifenilacético y ácido
homovainíllico (Belitz y Grosch, 1999).
El objetivo de esta investigación fue validar la metodología para la
determinación de polifenoles totales por HPLC, utilizando un aceite de oliva
extra virgen monovarietal, variedad Arbequina.
Se empleó la metodología sugerida por la Comisión Técnica Italiana SSOG,
recomendado según resolución Nº RES-4/94-V/06 del Comité Oleícola
Internacional. Esta técnica identifica y cuantifica los componentes menores
polares de naturaleza biofenólica por HPLC con detector de arreglo de diodo
y extracción a 280 nm, expresando el contenido de biofenoles totales
existentes en una muestra de aceite de oliva extra virgen como mg/kg de
tirosol. Se determinaron las propiedades analíticas del método, éstas son:
replicabilidad, repetibilidad, recuperación, límite de detección y límite de
cuantificación. Para ello se realizaron diez determinaciones combinando el
mismo analista, mismo equipo, mismo día o diferentes días, según sea el
caso. Además se determinó el contenido de polifenoles totales,
hidroxitirosol y tirosol en muestras de aceite de oliva extra virgen de las
variedades Arbequina, Picual, Frantoio proporcionadas por Chile Oliva y el
9
varietal Arauco de la provincia de Mendoza, proporcionadas por la
Universidad Nacional de Uncuyo de Mendoza, Argentina.
La replicabilidad y repetibilidad del método presentaron un CV de 7,7% y
7,9% respectivamente. La recuperación se realizó con dos concentraciones
de tirosol obteniéndose valores de 99,9% y 100,9%. Los límites de detección
y cuantificación se determinaron con el compuesto hidroxitirosol, con valores
de 1,97 y 6,55 mg/kg de aceite , respectivamente.
Los aceites analizados presentaron un amplio rango en contenido de
polifenoles totales con valores de 93 a 595 mg de tirosol por kg de aceite, sin
embargo no presentaron diferencias significativas entre variedad.
10
SUMMARY Olive oil is the sap of olives, extracted by physical or mechanical means,
under special thermal conditions. It is mainly made up of triglycerides and --in
a lower proportion—free fatty acids and non-glyceride components. Among
the latter, are phenolic substances or polyphenols, which are a group of
heterogenous molecules with an anti-oxidant function and one other common
feature: they bear within their structure several benzene groups substituted by
hydroxylic functions.They are minority components and belong to the polar
fraction of oil, which is a complex mixture and has an influence on the stability,
flavour and aroma of virgin olive oil. Out of these components, the ones that
are considered a majority are tyrosol and hydroxityrosol, although others are
present as well, like oleuropein, caffeic acid, vanillic acid, p-coumaric acid, o-
coumaric acid, protocatechuic acid, sinapic acid, p-hydroxybenzoic acid, p-
hydroxiphenylacetic acid and homovanillic acid (Belitz and Grosch, 1999).
The purpose of this study was to validate the methodology for assessing the
amount of total polyphenol content by HPLC, using to this effect a single-
variety, extra virgin olive oil –the Arbequina variety.
The methodology for this research was the one suggested by the SSOG
Italian Technical Commission in Resolution nº RES - 4/94-V/06 of the
International Oil Committee. This methodogical approach identifies and
quantifies the minor polar components of biophenolic nature by HPLC with a
diode detector and extraction at 280 nm, indicating the content of total
biophenols in a sample of extra virgin as mg/kg of tyrosol. The study
determined the analytical properties of the method; these are: replicability,
repeatability, recuperation, detection limit and quantification limit. In the
process of doing this, 10 determinations were made by combining the same
analyst, the same equipment, the same day or different days, whichever the
case may be.
Also, the study determined the content of total polyphenols, hydroxytyrosol
and tyrosol in samples of extra virgin olive oil of the Arbequina, Picual and
Frantoio varieties made available by the Chile Oliva company, and the Arauco
11
variety from Mendoza Province, made available by the Universidad Nacional
de Cuyo, in Mendoza, Argentina.
The replicability of the method presented a CV of 7.7%, whereas the
repeatability presented a CV of 7.9%. The recuperation was done with two
concentrations of tyrosol and the values obtained were 99.9% and 100.9%.
The detection and quantification limits were determined with hydroxytyrosol in
values of 1.97 and 6.55 mg/kg of oil, respectively.
The oils analyzed here contained a wide range of total polyphenols, going
from 93 to 595 mg of tyrosol for every kilogram of oil. However, no significant
differences were found between varieties.
12
1. INTRODUCCION 1.1. Reseña histórica del aceite de oliva El olivo y sus frutos han estado presentes en la historia de los hombres y han
ocupado un lugar relevante en las antiguas civilizaciones, siendo introducidos
en la Península Ibérica por los romanos y árabes alrededor del siglo VI a.C.
Su expansión se debió a los griegos y fenicios llevando el olivo y el aceite de
oliva por el Mediterráneo y consigo las técnicas de cultivo a España. No cabe
duda que su legado es importante pero quien plantó la península de olivos
fueron los romanos, ya que mejoraron las técnicas de cultivo y de elaboración
de aceite de oliva, el cual en la antigua Roma se utilizaba con fines
terapéuticos, comestibles y combustibles.
En la Edad Media el aceite de oliva era considerado un producto lujoso ya
que su producción decayó debido a que el mundo estaba dominado por las
guerras. Con la llegada de Colón a América, a fines del siglo XV, contribuyó a
que el olivo llegara principalmente a Perú, Chile, Argentina y México.
Actualmente, alrededor de 40 países cuentan con plantaciones de olivos,
entre los cuales destacan España, Túnez, Italia, Grecia, Turquía, Marruecos,
Siria y Portugal, los que en conjunto representan el 91,6% de la superficie
mundial de olivos. (ODEPA, 2004)
1.2. Cultivo de olivos en Chile
Chile es un país con buenas condiciones de clima y suelo para el cultivo del
olivo y la elaboración de aceite ya que consta de un grupo de microclimas que
presentan condiciones similares de temperatura y humedad a las de la
Cuenca del Mediterráneo. Las condiciones climáticas tan marcadas de lluvia
en invierno y sol en verano impiden que las precipitaciones afecten la
maduración de la fruta, pero entregan el agua necesaria para el desarrollo de
la planta. Por otro lado, la ubicación de las plantaciones entre el Valle del
Limarí por el Norte y el Río Biobío por el Sur, aseguran la radiación solar que
necesita la fruta para completar el proceso. Además, la variación térmica
13
entre el día y la noche favorece la concentración de componentes aromáticos,
y los cuatro mil kilómetros de costa ayudan a moderar la temperatura,
creando condiciones particularmente favorables para el cultivo del olivo, a
estos factores debe sumarse el aislamiento geográfico, factor favorable que
minimiza el ataque de plagas y enfermedades (Chileoliva, 2009).
Una amplia gama de escalas de producción, que incluyen plantaciones desde
media hectárea a más de mil hectáreas por productor, utilizan las nuevas
tecnologías productivas orientadas a optimizar el uso de los insumos.
Agricultura de precisión, cultivos convencionales, producciones orgánicas,
plantaciones superintensivas (1.500 plantas/ha) combinadas con intensivas
(400 a 600 plantas/ha), monovarietales o con más de tres variedades por
plantel, sistemas de riego tecnificado, uso de camellones, fertilización
aplicada, manejo productivo, cosecha mecánica o manual, certificación
HACCP y orgánica, son sólo algunos de los indicadores de una creciente
industria nacional. (ODEPA, 2008)
Según estimaciones de ODEPA (2007) la superficie de olivos en la temporada
2006 – 2007 alcanzaría las 8600 has (más del doble de las existentes en el
año 1990). Las plantaciones de olivos se concentran principalmente en la III y
IV región del país.
Las exportaciones de aceite de oliva chileno durante el año 2007 aumentaron
un 58% y 70% en cantidad y valor respectivamente comparado con el año
2006. Los principales países a los cuales Chile exporta son Estados Unidos
(42%), España (14%), Canadá, Venezuela y México con cifras cercanas al
5% cada uno (Iglesias, 2008)
1.3. Caracterización del olivo y su fruto
El olivo (Olea europea) es un árbol muy longevo (puede permanecer vivo y
productivo durante cientos de años) (Rapoport, 2001). Puede alcanzar hasta
15 metros de altura, con copa ancha y tronco grueso, retorcido y a menudo
muy corto. Crece entre las latitudes 30º y 45º en ambos hemisferios, en
14
regiones que poseen climas mediterráneos que se caracteriza por presentar
veranos cálidos y prácticamente secos e inviernos con temperaturas suaves.
El crecimiento del olivo es lento. Suele dar fruto al cabo de 5-10 años desde
su plantación y no alcanza su pleno desarrollo hasta los 20. Desde los 35 a
los 100-150 años se encuentra en su período de madurez y plena producción.
Posteriormente envejece y sus rendimientos son desiguales (ASOLIVA,
2009).
La aceituna, fruto del olivo, es de tamaño pequeño de forma elipsoidal a
globosa según variedades. Botánicamente la aceituna es una drupa como la
ciruela o melocotón. (http://thales.cica.es). Este fruto contiene un 70-90% de
pulpa, 9-27% de hueso y 2-3% de semilla, en relación al peso total del fruto.
Estas diferencias de peso podrían estar relacionadas directamente con la
carga frutal de los árboles, ya que existe una relación negativa entre carga
frutal y peso de los frutos (Rallo y Cuevas, 2001). Además a un mayor nivel
de carga frutal retrasa la maduración de las aceitunas y por lo tanto, el
cambio en la pigmentación de los frutos provocado por la disminución de
clorofila y la posterior acumulación de antocianinas ocurren más lentamente
(Hermoso et al., 2001).
1.4. Variedades de Olivos
Actualmente los cultivos chilenos más importantes son Arbequina, Frantoio,
Leccino, Picual y Coratina. Estas variedades de olivos provienen
principalmente de la zona mediterránea de Europa (Bañados, 2004). El origen
de éstos son:
a) Origen español: Picual, Hojiblanca, Cornicabra, Lechín, Arbequina,
Arbusana, Blanqueta, Changlot real, Empeltre y Manzanilla española.
b) Origen Italiano: Frantoio, Coratina, y Carolea.
c) Origen Griego: Koroneiki y Mastoidis.
d) Originarias de Túnez: Chemlaly y Chetoui.
e) Originarias de Turquía: Memecik, Ayvalik y Gemlic.
15
1.5. El Aceite de Oliva
1.5.1. Proceso de obtención del aceite de oliva virgen
A continuación se detalla cada etapa para obtener un aceite de oliva virgen:
Etapa 1: Recepción y selección de la aceituna
La recepción se debe realizar con precaución para evitar dañar el fruto
durante la descarga. La selección se realiza en función de la variedad, del
estado sanitario del fruto (sano, picado por mosca, atacado por Gloesporium,
etc.) y de la procedencia de éste (de vuelo o de suelo) (Pardo et al, 2002). El
almacenamiento de la materia prima se debe realizar en un lugar fresco y
sombrío, como máximo durante 24 horas, en cajas individuales o bins,
provistos de perforaciones y de capacidad entre 20 a 200 kg. (Marginet y
Mabel, 2000). En cuanto al análisis de calidad del fruto que llega a la
almazara, se debe controlar el tipo de aceituna, en función de la humedad del
fruto, contenido en aceite y acidez (De Panfilis, 1999).
Etapa 2: Limpieza y lavado de las aceitunas
El objetivo principal de esta operación es eliminar las impurezas que
lleva el fruto desde el campo. En la limpieza, las aceitunas se pasan por una
venteadora que retira el polvo, las hojas y pequeñas ramas a través de una
corriente de aire. Luego, para eliminar tierra, arena, piedras y hojas se realiza
un lavado por inmersión en agua. Las impurezas deben eliminarse porque
comunican sabores anómalos a los aceites (amargor, astringencia, verde, a
tierra, a moho, etc.), desgastan la maquinaria y producen roturas (Pardo et al,
2002)
Etapa 3: Molienda de las aceitunas
El aceite se encuentra en la aceituna en forma de pequeñas gotitas,
ubicadas fundamentalmente en las vacuolas del mesocarpio. Mediante la
molienda de la aceituna, es posible triturar y romper el fruto por completo, por
lo que se rompen los tejidos vegetales liberando el aceite junto con las
lipasas, enzimas implicadas en la biogénesis de los constituyentes volátiles
del aceite de oliva virgen y en la formación de los productos primarios de la
16
oxidación. Durante esta operación, no todas las células del mesocarpio
pueden ser destruidas y, por consiguiente, no todo el aceite puede ser
extraído; de igual forma, la membrana que rodea a las células tiende a
mantener el aceite en estado de emulsión (De Panfilis, 1999; Lercker et al.,
1999). Los aspectos importantes a considerar, en cuanto a calidad durante la
molienda son los siguientes:
a) Tiempo y superficie de contacto de la masa con el oxígeno, ya que ocurren
reacciones de oxidación en la masa y se pierden aromas.
b) Catálisis de procesos oxidativos provocada por trazas de metales
provenientes del desgaste de la maquinaria.
c) Formación de emulsiones que dificultan la extracción del aceite y que
conllevan a aumentar los tiempos de amasado de la pasta.
d) Calentamiento de la pasta (De Panfilis, 1999).
Etapa 4: Amasado y batido de la pasta de aceitunas
Durante esta etapa, la pasta de aceitunas se somete a un movimiento
lento y constante a temperatura mayor que la ambiental, con el objetivo de
facilitar la salida de las pequeñas gotas de aceite del interior de las células,
así como también para homogenizar la pasta de aceituna. De este modo las
pequeñas gotas de aceite se unen formando gotas de diámetro superior a 30
micras (tamaño mínimo para separarse de la fase sólida), originando una fase
continua que sobrenada sobre el resto de la masa y facilitando así, la
separación del aceite en operaciones posteriores (De Panfilis, 1999; Marginet
y Mabel, 2000). La operación se realiza en batidoras, de capacidad variable
en cuyo interior circulan unas paletas que voltean la masa y provocan un
efecto de cizallamiento o rotura (De Panfilis, 1999). El amasado de la pasta
de aceitunas es un importante paso en el proceso de obtención del aceite de
oliva, debido a que influencia la calidad del producto y los rendimientos de la
extracción. Los principales factores que influyen en la calidad del producto
durante esta operación, son los siguientes:
17
a) El material de interior de la batidora, el cual debe ser inerte y
perfectamente liso, como por ejemplo el acero inoxidable (De Panfilis,
1999).
b) La acción prolongada de enzimas adicionadas que degradan, en
particular, componentes menores (De Panfilis, 1999).
c) La velocidad de batido, el cual no debe ser excesiva ya que favorece la
formación de emulsiones que perjudican la posterior extracción del aceite
(De Panfilis, 1999).
d) La adición de agua a la pasta para separar más fácilmente la fase acuosa
de la oleosa, ya que altera el equilibrio de partición de los fenoles entre
las fases líquidas, causando una reducción en el contenido de fenoles de
la pasta y, posteriormente, en el aceite (Di Giovacchino et al., 1994).
e) La temperatura, ya que mayores temperaturas aceleran interacciones
químicas, bioquímicas y físico-químicas, comprometiendo la peroxidación
lipídica, el contenido de polifenoles totales, la generación de aromas y la
vida útil del producto final (Lercker at al., 1999).
f) El tiempo, que es responsable de las características físico-químicas y
organolépticas del aceite de oliva virgen, específicamente del contenido
de compuestos volátiles presentes en el espacio de cabeza de los
aceites, del contenido de polifenoles y orto-difenoles y del rendimiento
obtenido en la extracción del aceite (Angerosa et al., 1998; Di
Giovacchino et al., 2002; Servili et al, 2003).
Etapa 5: Extracción del aceite de oliva virgen
Se puede realizar por percolación, presión o centrifugación.
Actualmente, el método más utilizado es la centrifugación horizontal ya que
requiere de menor tiempo y mano de obra para su realización. El equipo
utilizado es un decanter de dos a tres fases, en el cual es necesario controlar
los siguientes factores:
a) La capacidad de trabajo, ya que influye directamente en el período de
centrifugación de la pasta.
b) La cantidad de agua agregada a la pasta (máximo 30%), en el caso
del decanter de tres fases, para lograr la separación de las fases, ya
18
que contribuye a la pérdida de sustancias aromáticas y antioxidantes
hidrosolubles y aumenta los residuos líquidos (Marginet y Mabel,
2000).
Etapa 6: Limpieza del aceite
Esta operación se puede realizar por decantación o centrifugación
vertical. Actualmente, la centrifugación vertical es más utilizada ya que
requiere de menor tiempo y mano de obra. El objetivo de la limpieza es
separar el agua y los residuos del aceite. También en esta etapa, se le puede
agregar agua al aceite para mejorar la separación, pero se corre el riesgo
señalado anteriormente (Marginet y Mabel, 2000).
Etapa 7: Almacenamiento y decantación
El aceite que se produce durante 3 ó 4 meses se consume a lo largo
del año, es por tanto, necesario, su almacenamiento a una temperatura que
oscile alrededor de 15ºC, sin luz ni aire, con el fin de conservar las
características favorables del aceite (evitar oxidaciones, fermentaciones y
pérdidas de aromas) y permitir la maduración (suavizar las características de
amargor, astringencia, etc.) (Cabellos et al., 2001; Marginet y Mabel, 2000;
Pardo et al., 2002).
El almacenamiento del aceite se puede realizar en depósitos aéreos o
subterráneos. Independientemente del sistema utilizado, los depósitos deben
ser aislados y no transmitir sabores u olores al aceite. Actualmente, los
depósitos aéreos de acero inoxidable son los más utilizados, éstos, cuentan
con una estructura troncocónica de la parte inferior en la cual se deposita la
fase acuosa (agua de vegetación) con sustancias en suspensión (sólidos y
enzimas) que transfieren defectos al aceite. Consecuentemente, el agua de
vegetación se elimina fácilmente a través de una válvula; otra operación
importante, que se realiza después de 30 días de almacenamiento, es el
trasvasijo del aceite el cual busca impedir el contacto prolongado del aceite
con las borras, evitando la formación de características organolépticas
desagradables (Marginet y Mabel, 2000).
19
Un aspecto importante en las fábricas de aceites de oliva virgen, es la
clasificación de los aceites de acuerdo a la variedad de aceituna de la cual
provienen, de esta forma, es posible elaborar las mezclas de aceites
varietales (Marginet y Mabek, 2000)
Etapa 8: Mezcla de los aceites varietales
El aceite que se consume es la mezcla de un conjunto de aceites
diferentes que dan como resultado un producto con características
particulares o “coupajes”. Para obtener estas mezclas, se debe contar con
una serie de aceites perfectamente diferenciados y clasificados, que serán
mezclados en distintas proporciones de acuerdo a lo estipulado previamente
por un grupo de catadores (Marginet y Mabel, 2000).
Etapa 9: Filtración
Los aceites se filtran sólo cuando se embotellan. El objetivo de la
filtración es eliminar los pequeños residuos sólidos que se encuentran
suspendidos en el aceite, dejando un producto perfectamente límpido y
traslúcido. Para realizar esta operación se utilizan filtros prensa con láminas
de celulosa al interior.
Durante los últimos años, ha existido una tendencia a consumir
aceites de oliva vírgenes “turbios”. Según Lercker et al. (1994), las partículas
suspendidas juegan un rol estabilizante en la vida útil de los aceites, actuando
como antioxidantes y como “buffer” contra el aumento de la acidez.
Etapa 10: Envasado y etiquetado
La zona de envasado debe estar separada de cualquier otra zona de
la industria, además, se cuidarán en extremo la condiciones higiénicas del
local y de los manipuladores, ya que en esta operación el aceite se envasa en
botellas de vidrio de color ámbar, en envases metálicos o de diversos
polímeros, para ser tapadas inmediatamente. Es importante mantener un
control visual durante esta etapa (Cabellos et al., 2001).
20
Al etiquetar los envases es importante cumplir con las regulaciones
legales de rotulación del país de destino del producto.
Etapa 11: Embalado y almacenamiento de aceite embalado
El aceite envasado, se debe almacenar en lugar fresco, aislado de la
luz y en palets. La conservación del aceite envasado es fundamental para
garantizar la mantención de las características de calidad hasta su consumo.
Los puntos de ventas, deben asumir su responsabilidad en el mantenimiento
de la calidad del aceite que expenden, no sometiendo el producto a
temperaturas elevadas ni iluminación directa (Cabellos et al., 2001).
1.5.2. Tipos de aceite de oliva
De acuerdo a la manera de obtención y acidez del aceite de oliva, el
COI/T.15/NC nº3/Rev.1.2003 lo denomina de diferentes maneras. La
clasificación es la siguiente:
a) Aceites de oliva vírgenes
Aceite obtenido del fruto del olivo únicamente por procedimientos
mecánicos u otros procedimientos físicos en condiciones, sobre todo
térmicas, que no implique la alteración del aceite y no hayan sufrido
tratamiento alguno distinto del lavado, decantación, el centrifugado y la
filtración, se excluyen de los aceites obtenidos mediante disolventes o por
procedimientos de reesterificación, y toda mezcla con aceites de otra
naturaleza.
Dentro de los aceites de oliva vírgenes se clasifican y denominan de la
siguiente manera:
Aceite de Oliva Virgen Extra: aceite de oliva virgen con una acidez
libre, expresada en cantidad de ácido oleico, como máximo de 0,8 g por 100
g, siendo la mediana de sus defectos 0, y la del atributo frutado superior a 0.
21
Aceite de Oliva Virgen: aceite de oliva virgen con una acidez libre
máxima de 2 g por 100 g, siendo la mediana de sus defectos inferior o igual a
2,5 y la del atributo frutado superior a 0.
Aceite de Oliva Lampante: aceite de oliva virgen con una acidez libre,
superior a 2g por 100g siendo la mediana de sus defectos superior a 2,5 y la
del atributo frutado superior a 0.
b) Aceite de oliva refinado
Aceite de oliva obtenido mediante el refinado de aceites de oliva vírgenes,
cuya acidez no podrá ser superior a 0,3 g por 100 g y cuyas otras
características son conformes a las establecidas por esta categoría.
c) Aceite de oliva – contiene exclusivamente aceites de oliva refinados y
aceites de oliva vírgenes
Aceite de oliva constituido por una mezcla de aceite de oliva refinado y de
aceites de oliva vírgenes distintos del aceite lampante, cuya acidez libre no
podrá ser superior a 1g por 100g y cuyas otras características son conformes
a las establecidas por esta categoría.
d) Aceite de orujo de oliva crudo
Aceite obtenido a partir del orujo de oliva mediante tratamiento con disolvente
o por medios físicos, o que corresponda, con excepción de algunas
características determinadas, a un aceite de oliva lampante.
e) Aceite de orujo de oliva refinado
Aceite obtenido mediante refino de aceite de oliva de orujo crudo, cuya acidez
libre, expresada en ácido oleico, no podrá ser superior a 0,3 g por 100 g y
cuyas otras características son conformes a esta categoría.
22
f) Aceite de orujo de oliva
Aceite constituido por una mezcla de aceite de orujo de oliva refinado y de
aceites de oliva vírgenes distintos del lampante, cuya acidez libre, expresada
en ácido oleico, no podrá ser superior a 1 g por 100 g y cuyas otras
características son conformes a las establecidas para esta categoría.
1.5.3. Composición química
El aceite de oliva está compuesto principalmente por triglicéridos, en menor
proporción por ácidos grasos libres y constituyentes no glicéridos importantes
para la estabilidad, sabor y aroma del aceite de oliva.
Tabla N°1: Composición de la fracción insaponificable del aceite de oliva
Compuesto Concentración/Porcentaje
Hidrocarburos Totales 300-700 mg/100g
escualeno 300-700 mg/100g
Pigmentos
clorofilas 0-9,7 mg/kg
Carotenoides 0,5-10 mg/kg (en β-caroteno)
luteína 30-60%
β-caroteno 5-15%
Tocoferoles 7.-300 mg/kg
α-tocoferol >93%
βy -tocoferol <10%
-tocoferol <1,5%
Esteroles 80-240 mg/100g
β-sitosterol 75-95%
campesterol 2-4%
estigmasterol 1-2%
5-avenasterol 3-14%
7-avenasterol <0,7%
Compuestos fenólicos 50-500 mg/Kg (en ácido cafeico)
Alcoholes triterpénicos 100-300 mg/100g
Compuestos aromáticos
Alcoholes
23
Cetonas
Ésteres
Ëteres
Derivados Furánicos
Fuente: Centro de Información y Documentación Agraria, 1988; Karleskind A. Manel, 1992.
1.5.4. Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos clasificados como metabolitos secundarios de las
plantas, son aquellos productos biosintetizados en las plantas que poseen la
característica biológica de ser productos secundarios de su metabolismo, y la
característica química de contener al menos un grupo fenol (un anillo
aromático unido a al menos un grupo funcional hidroxilo) en su estructura
molecular. En general son sintetizados por una de dos vías biosintéticas: la
vía del ácido shikímico o la vía del ácido malónico (o por las dos, por ejemplo
los flavonoides) (Taiz et al., 2006).
Estos fenoles que encontramos en el aceite de oliva constituyen una fracción
muy compleja formada por un número muy elevado de compuestos, algunos
todavía por identificar. El aceite de oliva contiene fenoles simples como
hidroxitirosol, tirosol, ácido vaníllico, ácido ρ-cumárico, ácido ferúlico y
vainillina. También contiene flavonoides como apigenina y luteolina, así como
otros fenoles más complejos como aldehídos secoiridoides (ej. oleuropeína),
verbacósidos y ligustrósidos, y el dialdehído del ácido elenoico ligado al
tirosol e hidroxitirosol.
24
Figura N°1: Ejemplos de estructuras de compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos son muy importantes en la estabilidad del aceite de
oliva (Gutierrez et al., 2001; Abaza et al.,2005). Por otra parte, les confiere
unas propiedades organolépticas con un gusto fuerte y afrutado que es
indicador de alta calidad aunque no forzosamente sean las características
organolépticas preferidas por los consumidores.
Los compuestos fenólicos contienen propiedades antioxidantes que protegen
el aceite de oliva de la autoxidación. La acción antioxidante consiste en
retrasar o inhibir la oxidación de lípidos u otras moléculas mediante la
inhibición de la iniciación o propagación de estas reacciones. La actividad
antioxidante de los compuestos fenólicos se debe principalmente a sus
propiedades redox, las cuales juegan un rol importante en la adsorción y
neutralización de radicales libres (Zheng y Shiow, 2001).
Además la capacidad antioxidante de tales compuestos polares en sistemas
lipídicos, se debe a que se localizan en la interfase lípido-aire, permitiendo
una mejor protección contra el oxígeno molecular del aire que los
antioxidantes lipofílicos, que permanecen en solución en fases oleosas y que,
por lo tanto, actúan mejor en sistemas aceite en agua (O/W) (Boskou, 1998;
Fogliano et al., 1999).
El hidroxitirosol es considerado en numerosas publicaciones como uno de los
polifenoles naturales con mayor poder antioxidante, siendo especialmente
25
eficaz como captador de radicales peroxilo. Probablemente, relacionado con
ese poder antioxidante, se ha comprobado que este compuesto previene el
daño oxidativo sobre el ADN y evita la oxidación de LDL. Ese elevado poder
antioxidante le confiere además interesantes propiedades estabilizantes, que
pueden ser de gran aplicación en la industria alimentaria, en concreto en la
elaboración de los llamados alimentos funcionales. (www.portalfarma.com)
Con respecto a los polifenoles totales de la aceituna, éstos varían de acuerdo
a la variedad del olivo, el clima, el período de cosecha y sector del cultivo,
mientras que en el aceite, los polifenoles totales dependen en gran parte del
proceso realizado y varían entre 50 y 200 mg/kg, aunque se pueden
encontrar aceites con contenidos de hasta 1000 mg/kg (Gutiérrez et al.,
2001).
Normalmente el aceite de oliva virgen posee un contenido de compuestos
fenólicos superior a 120 mg/kg equivalentes de ácido cafeico (EAC), y el
aceite de oliva común consta de un contenido entre 10 a 100 mg/kg EAC; en
cuanto al aceite de orujo de oliva posee muy pocos. El precio del aceite de
oliva vigente en el mercado varía proporcionalmente al contenido de estos
compuestos (Roche HM, 2001).
1.6. Validación de Técnicas Analíticas
La validación según la FDA es el establecimiento de la evidencia documental
de que un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de seguridad,
a la obtención de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones
y los atributos de calidad previamente establecidos.
La validación de los métodos analíticos es una actividad fundamental en los
sistemas de calidad de los laboratorios. El proceso de validación guarda una
estrecha relación con la representatividad de los resultados, dependiendo del
objetivo de los análisis y del tipo de muestra (San Martín, 2000).
26
El método establece por medio de estudios científicos, que un método
analítico tiene las características de desempeño que son adecuadas para
cumplir los requerimientos de las aplicaciones analíticas pretendidas. (Guía
para la Validación de Métodos Analíticos, Chile 2004).
Una vez validada una metodología analítica, el laboratorio de ensayo deberá
fijar los intervalos de aceptabilidad para el control de calidad para cada una
de las propiedades analíticas del método. Una metodología, aún cuando
tenga el carácter de método estándar u oficial, deberá ser validada antes de
ser utilizada en forma rutinaria. (Guía para la Validación de Métodos
Analíticos, Chile 2004).
Las propiedades de un método analítico que se determinan en el laboratorio
para validar una metodología son las siguientes:
1) Precisión: grado de concordancia de un grupo de resultados entre sí.
Dispersión de estos resultados alrededor de su media. Existen tres formas
de plantear un estudio de precisión:
(i) Replicabilidad: Se define como la dispersión de resultados originados
por aplicaciones del mismo método a alícuotas de la misma muestra,
para determinar el mismo analito, en el mismo laboratorio, por el mismo
operador y con las mismas herramientas analíticas, en un corto intervalo
de tiempo.
(ii) Repetibilidad: Se define como la dispersión de resultados originados
por aplicaciones del mismo método a alícuotas de la misma muestra,
para determinar el mismo analito, en el mismo laboratorio, y al menos
una de las siguientes condiciones es diferente: analista, instrumento, día.
(iii) Reproducibilidad: Se define como la dispersión de resultados
originados por aplicaciones del mismo método a alícuotas de la misma
muestra, para determinar el mismo analito, en diferentes laboratorios y en
las siguientes condiciones: diferente analista, diferente instrumento, igual
o diferente día.
27
2) Exactitud: expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, como un
valor de referencia (material de referencia certificado) y el valor
encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de
análisis un cierto número de veces. Para plantear un estudio de exactitud
se utiliza la recuperación.
(i) Recuperación: corresponde a la diferencia (en porcentaje) entre la
concentración medida de un analito en una muestra fortificada (a la que
se le ha agregado una cantidad conocida de estándar) y la concentración
medida en la misma muestra sin fortificar, dividido por la concentración
de sustancia agregada.
3) Límite de Detección del Método (LDM): corresponde a la concentración
mínima de un compuesto que puede ser detectada en una matriz real, la
cual es tratada siguiendo todas las etapas del método completo,
incluyendo separaciones y pretratamientos. Esta mínima concentración
produce una señal detectable con una fiabilidad definida,
estadísticamente diferente a la señal producto del blanco obtenido en las
mismas condiciones.
4) Límite de Cuantificación del Método (LCM): corresponde a la
concentración mínima de un analito que puede ser cuantificada en una
matriz real, la cual es tratada siguiendo todas las etapas del método
empleado, incluyendo separaciones y pretratamientos. Esta mínima
concentración produce una señal cuantificable con un nivel de confianza
definido.
28
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General
Implementar y validar una metodología analítica para la determinación de
polifenoles totales de aceites de oliva mediante HPLC.
2.2. Objetivo Específico
2.2.1- Implementación de una metodología analítica para la extracción y
cuantificación de los componentes menores polares de naturaleza biofenólica
(BMP) utilizando la técnica HPLC.
2.2.2- Validación del método analítico para la determinación de polifenoles
totales a través de la medición de las propiedades analíticas establecidas.
2.2.3- Ensayar la metodología validada en 41 muestras de aceites de oliva
extra virgen.
3.- MATERIALES Y MÉTODOS
Se recepcionaron 41 muestras de aceite de oliva extra virgen, 31 entregadas
por Chile Oliva, de las variedades arbequina (n= 15), picual (n= 6), frantoio
(n=10) y 10 proporcionadas por la Universidad Nacional de Uncuyo de
Mendoza, Argentina, de la variedad arauco (n=10).
3.1. Materiales
3.1.1. Material de Laboratorio
Matraces de 10 mL y 100 mL Clase A
Pipeta electrónica de 100 µL y de 5000 µL
Probeta con tapón roscado de 10 mL
Embudo de vidrio para filtrado de 4 cm de diámetro aproximadamente
29
Papel filtro
Filtros de jeringa Ø 13 mm tipo PVDF 0,45 µm
Jeringa de plástico de 5 mL
Cristalería normal de laboratorio
3.1.2. Reactivos
Se ocupan reactivos puros para análisis cromatográfico HPLC:
Ácido ortofosfórico 85% (V/V) (Merck)
Sulfato de sodio anhidro (Merck)
Metanol para cromatografía (Merck)
Acetonitrilo para cromatografía (Merck)
Agua para cromatografía (Merck)
2-(4-hidroxifenil) etanol (tirosol) 99,9% (Sigma)
Ácido 3,5 dimetoxi 4-hidroxi benzoico (ácido siríngico) 100% (Sigma)
3.1.3. Equipos
Cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC) Merck-Hitachi provisto
de Bomba L-6200 A, gradiente ternario, columna (4,6 mm x 25 cm, 5
µm) de fase inversa C18, Spherisorb ODS-2, 100 Aº (Water); Horno
La Chron L-7350; Detector de arreglo de fotodiodo 996, acoplado a un
Software Millennium32 3.20.
Balanza Analítica
Modelo: Precisa 125A
Capacidad: 125 g
Capacidad de medición: 0,1 mg
Baño Ultrasónico
Moldelo: Fisher Scientific FS30H
Agitador Vortex para tubos
Modelo: Cenco-Instrument MIJ.B.V
Centrífuga Sorval
30
3.2. Metodología
3.2.1. Técnica Cromatográfica
La técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) son las más
empleadas para la separación y cuantificación de compuestos fenólicos.
Existen distintos soportes y fases móviles que permiten el análisis de los
distintos compuestos fenólicos.
Las técnicas de HPLC han sido utilizadas para la caracterización de los
polifenoles en una gran variedad de extractos vegetales, frutas, zumos, aceite
de oliva, vinos y otras bebidas.
3.2.2. Implementación de la metodología analítica para la determinación
de biofenoles en aceites de oliva extra virgen
Se implementó la metodología para la identificación y cuantificación de
biofenoles de los aceites de oliva mediante HPLC considerando el método de
la Comisión Técnica Italiana SSOG, recomendado según resolución Nº RES-
4/94-V/06 del Comité Oleico Internacional.
El método se basa en la extracción de los componentes menores polares de
naturaleza biofenólica directamente a partir del aceite de oliva, mediante una
solución metanólica y su posterior cuantificación mediante HPLC con detector
de arreglo de diodo. La extracción de los espectros se realiza a 280 nm
utilizando ácido siríngico como patrón interno.
El contenido en derivados naturales u oxidados de la oleuropeína y del
ligustrósido, de los lignanos, de los flavonoides y de los ácidos fenólicos se
expresa en mg/kg de tirosol.
31
3.2.2.1. Preparación de Soluciones
a) Solución para la extracción: metanol/agua 80/20 (V/V).
b) Solución de los patrones externos de calibrado (tirosol y ácido
siríngico). Se pesa exactamente 0,030 g de tirosol y 0,015 g de ácido
siríngico en un matraz aforado de 10 ml. Se diluye a volumen con la
solución de metanol/agua 80/20 (V/V) (a). Se toman 100 µL de la
solución y se transfiere a un matraz aforado de 10 ml. Se diluye a
volumen con la solución de metanol/agua 80/20 (V/V).
Las concentraciones de solución de calibrado externa son las
siguientes: tirosol 0,030 mg/ml, ácido siríngico 0,015 mg/ml.
Dicha solución se mantiene estable durante 3 meses en frigorífico a
+4ºC.
c) Solución de patrón interno (ácido siríngico). Se pesa exactamente
0,015 g de ácido siríngico en un matraz aforado de 10 ml y se lleva a
volumen con la solución de metanol/agua 80/20 (V/V). Se toma 1 ml
de la solución, se transfieren a un matraz aforado de 100 ml y se
llevan a volumen con la misma solución de metanol/agua 80/20 (V/V).
La concentración final es de 0,015 mg/ml.
Dicha solución se mantiene estable durante 3 meses en frigorífico a
+4ºC.
d) Solución de tirosol para la fortificación de la muestra. Se pesa
exactamente 0,027 gr de tirosol en un matraz aforado de 10 ml y se
lleva a volumen con la solución de metanol/agua 80/20 (V/V). Se toma
1 mL de la solución, se transfieren a un matraz aforado de 100 ml y se
llevan a volumen con la misma solución de metanol/agua 80/20 (V/V).
La concentración final es de 0,027 mg/ml. Luego se toman 30µL y
60µL para adicionar a las muestras.
32
3.2.2.2. Preparación de las muestras
a) Se prepara un embudo con papel filtro y se añade 20 g aprox. de
sulfato de sodio.
b) Se filtran 40 ml aprox. de aceite de oliva bien homogeneizado a través
de la fase adsorbente de sulfato de sodio.
c) Se pesan 2,0 g de aceite de oliva anhidro en un tubo con tapón
roscado de 10 ml.
d) Se transfiere 1 ml de la solución patrón interno a la muestra
previamente pesada.
e) Se cierra con el tapón roscado y se agita durante 30 segundos
exactos.
f) Se añaden 5 ml de la solución de extracción constituida por
metanol/agua 80/20 (V/V).
g) Se agita durante 1 minuto exacto.
h) Se extrae en baño de ultrasonidos durante 15 minutos a temperatura
ambiente.
i) Se centrifuga a 5.000 r.p.m. durante 30 min.
j) Se toma una alícuota del sobrenadante y se filtra a través de un filtro
de PVDF de 0,45 µm y una jeringa de plástico de 5 mL.
3.2.2.3. Preparación del cromatógrafo
a) El espectrofotómetro UV se ha de encender al menos 1 hora antes del
análisis.
b) La columna cromatográfica debe acondicionarse durante al menos 15
min con el solvente de elusión de composición inicial (agua 0,2 %
H3PO4 (V/V) /metanol/acetonitrilo 96/2/2 (V/V/V)) (Tabla 1).
c) Es preciso hacer una primera prueba cromatográfica (para asegurarse
de que no se producen picos de interferencia por coelusión),
consistente en la inyección de 20 μl de metanol/agua 80/20 (V/V) en el
sistema HPLC.
d) Se inyectan 20 μl de la solución de patrones externos de calibrado,
33
extrayendo el cromatograma a 280 nm. Se calculan los valores de los
factores de respuesta RF correspondientes a 1 μg de tirosol y 1 μg de
ácido siríngico.
e) Se calcula la relación entre el factor de respuesta del ácido siríngico
respecto al tirosol, denominado RRFsir/tir. Se apuntan los valores.
f) Se inyectan 20 μl de la solución final de la muestra (punto 3.2.2.2 letra
j) en el sistema HPLC, extrayendo el cromatograma a 280 nm.
g) Se efectúan dos determinaciones independientes con la misma
muestra y se comprueba que los resultados están dentro de los
parámetros de precisión del método.
h) Para determinar el contenido total de polifenoles han de sumarse las
áreas de los distintos picos que presenta el trazado típico de los
biofenoles.
i) Al final de la jornada, inyectar en la columna cromatográfica
metanol/acetonitrilo 1/1 (V/V) con flujo de 1,0 ml/min durante un
mínimo de 15 min y conservar la columna en metanol/acetonitrilo 1/1
(V/V).
Condiciones cromatográficas:
Temperatura: 30º C
Flujo: 1 ml/min
Tiempo de corrida: 82 min
Tabla N°2: Gradiente de elusión de los solventes
Tiempo (min) Flujo (mL/min) A % B% C% Flujo (mL/ min)
0 1,00 96 2 2 1
40 1,00 50 25 25 1
45 1,00 40 30 30 1
60 1,00 0 50 50 1
70 1,00 0 50 50 1
72 1,00 96 2 2 1
82 1,00 96 2 2 1
A: agua 0,2% H3PO4 (V/V); B: metanol; C: acetonitrilo
34
3.2.3. Aplicación de las propiedades del método analítico para la
validación de la técnica
La técnica se valida de acuerdo a los siguientes parámetros:
a) LDM Y LCM:
Para la determinación del LDM y LCM se preparan 10 muestras de
aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, de acuerdo a la
metodología descrita (3.2.1.2) para su posterior análisis en HPLC.
b) Replicabilidad:
Se preparan 10 muestras de aceite de oliva extra virgen, variedad
arbequina, de acuerdo a la metodología descrita (3.2.1.2), dentro del
intervalo de 2 a 10 veces el límite de cuantificación del método. Las
condiciones que se mantienen constantes son: el analista, el
instrumento y el día.
c) Repetibilidad:
Se preparan 10 muestras de aceite de oliva, variedad arbequina, de
acuerdo a la metodología descrita (3.2.1.2), dentro del intervalo de 2 a
10 veces el límite de cuantificación del método. Las condiciones que
se mantienen constantes son: el analista y el instrumento. La
condición variable es el día.
d) Recuperación:
Se preparan 6 muestras de aceite de oliva sin fortificar y 12 muestras
de aceite de oliva extra virgen fortificadas, adicionando a 6 de ellas
una concentración de 0,415 mg/kg de tirosol (30 µL de la solución de
tirosol preparada) y a las otras 6 una concentración de 0,827 mg/kg de
tirosol (60 µL de la solución de tirosol preparada)
35
3.2.4. Evaluación Estadística
Se realiza la validación de la técnica con la muestra de aceite de oliva extra
virgen de variedad arbequina, donde se calculan los promedios, desviaciones
estándar y coeficientes de variación de todas las variables paramétricas.
Para el análisis de las muestras, además de calcular los promedios, las
desviaciones estándar y coeficientes de variación, se comparan entre ellas
realizando un análisis de varianza (ANOVA) considerándose una significación
de un 5%, con un 95% de confiabilidad, efectuándose un análisis de
correlación simple, tomándose como variable independiente el tipo de cultivo
(la variedad) y como variable dependiente el contenido de polifenoles totales.
Para ello se utiliza el software Statgraphics Plus, versión 5.1 Professional.
4.- EXPRESION DE RESULTADOS
Se realiza la determinación de polifenoles a la muestra de aceite de oliva
extra virgen de variedad arbequina para la validación del método y a las 41
muestras de aceite de oliva extra virgen de cuatro distintas variedades
(arbequina, picual, frantoio y arauco) expresando los resultados de la
siguiente manera:
4.1. Cálculo de los factores de respuesta de los patrones externos de
calibrado (RF)
RF1µg(ácido siríngico) = Área ácido siríngico/µg ácido siríngico inyectado
RF1µg(tirosol) = Área tirosol/µg tirosol inyectado.
4.2. Cálculo de la relación entre los factores de respuesta (RRF)
RRFsir/tir = RF1µg(ácido siríngico)/ RF1µg(tirosol)
El valor de RRFsir/tir ha de ser constante y estar comprendido en el intervalo
5,1 ± 0,4; deberá permitir expresar el resultado final en tirosol, utilizando ácido
siríngico como patrón interno.
36
4.3. Cálculo del contenido de biofenoles de aceite de oliva extra virgen
El contenido en biofenoles (derivados naturales u oxidados de la oleuropeína
y del ligustrósido, lignano, flavonoides, y ácidos fenólicos) expresado en
mg/kg se calcula sumando las áreas de los distintos picos cromatográficos,
mediante la siguiente fórmula, expresando el resultado sin decimales.
(mg/kg) = (∑A) x 1000 x RRFsir/tir x (P ac.sir.) (A ac.sir.) x (P)
Siendo:
(∑A): suma de las áreas de los picos de los biofenoles (hidroxitirosol, tirosol,
derivados naturales y oxidados de la oleuropeína y del ligustrósido, lignanos,
flavonoides y ácidos fenólicos) registrados a 280 nm.
A ac.sir. : área del patrón interno ácido siríngico registrada a 280 nm
1000 : factor utilizado para expresar el resultado en mg/kg
P : peso en gramos del aceite utilizado
RRFsir/tir : coeficiente entre los dos factores de respuesta (ácido siríngico y
tirosol) para expresar los resultados finales en tirosol
P ac.sir. : el peso en miligramos de ácido siríngico utilizado como patrón
interno en 1mL de la solución añadida a la muestra
4.4. Cálculo de LDM
La concentración del compuesto analizado, en este caso tirosol, se debe
situar entre 2 y 10 veces la concentración del límite de detección estimado. Si
por el contrario la concentración es demasiado elevada, cambiar la muestra.
Si la concentración es demasiado baja, ajustar mediante la adición de un
37
estándar la concentración del compuesto de interés, para situarla entre 2 y 10
veces el límite de detección.
A partir de los resultados obtenidos, se calcula la media y desviación estándar
(σB) de las repeticiones realizadas.
CLDM = 3σB
4.5. Cálculo de LCM
El límite de cuantificación del método se determina siguiendo el mismo
procedimiento que el usado para el LDM pero finalmente la expresión que
debe considerarse es:
CLCM = 10σB
4.6. Cálculo de Recuperación
Para el cálculo de la recuperación se utiliza la siguiente expresión:
Recuperación (%) = (Cs-C) x100
Ca
Donde:
Cs = concentración de la muestra fortificada
C = concentración de la muestra no fortificada
Ca = concentración agregada
38
5.- RESULTADOS
5.1. Determinación de parámetros para la validación del método
5.1.1. Limite de Detección del Método (LDM) y Límite de Cuantificación
del Método (LCM)
La figura N°2 representa un cromatograma HPLC registrado a 280 nm con los
polifenoles típicos presentes en un aceite de oliva extra virgen de variedad
arbequina. Los pics destacados corresponden al compuesto hidroxitirosol y
ácido siríngico, detectándose al tiempo 11,941 y 21,997 minutos
respectivamente.
Figura N°2: Cromatograma obtenido mediante HPLC de una muestra de aceite de
oliva extra virgen, variedad arbequina. El hidroxitirosol y ácido siríngico se presentan
integrados.
En la tabla N°3 se presentan los valores de límite de detección y de
cuantificación (mg/kg) para el compuesto hidroxitirosol. También se muestra
el promedio y la desviación estándar de las 10 repeticiones realizadas. El
término 2LD-10LD representa el rango en el que debe estar el promedio,
calculado para el compuesto hidroxitirosol (mg/kg).
AU
0,000
0,005
0,010
Minutes
10,00 20,00 30,00 40,00 50,00
11,941
21,997
39
Tabla N°3: Límite de detección (LDM) y cuantificación (LCM)
del método para el compuesto hidroxitirosol.
(X)
(mg/kg)
DS 2LD-10LD LDM (mg/kg) LCM (mg/kg)
4,4 0,66 3,96-19,8 1,98 6,6
X:promedio, DS: desviación estándar, LD: límite de detección, LDM: límite
de detección del método, LCM: límite de cuantificación del método.
5.1.2. Replicabilidad y Repetibilidad
La figura N°3 representa un cromatograma HPLC que corresponde a la
primera de 10 inyecciones realizadas para determinar la replicabilidad del
método. Se realizan además otras 9 inyecciones para la repetibilidad del
método. Para ambas propiedades analíticas se integra el total de los
compuestos detectados, de esta forma se obtiene el promedio, desviación
estándar y coeficiente de variación de los polifenoles totales la muestra.
AU
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0,016
Minutes
5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00
11,8
59
16,2
06
22,2
13
23,6
20
26,4
13
26,8
72
31,3
98
32,2
54
34,7
62
35,2
58
36,1
48
38,3
12
38,8
45
39,6
60
40,1
81 4
1,0
07
42,8
24
44,4
46
44,5
47
45,3
75
47,8
70
Figura N°3: Cromatograma obtenido mediante HPLC de la primera inyección
realizada para la replicabilidad de una muestra de aceite de oliva extra virgen,
variedad arbequina.
La tabla N°4 presenta el promedio (X), la desviación estándar (DS) y el
coeficiente de variación (CV%) para la replicabilidad y repetibilidad de la
muestra de aceite de oliva de la variedad arbequina.
40
Tabla N°4: Replicabilidad y repetibilidad de
Polifenoles en aceites de oliva extra virgen, variedad
arbequina.
Replicabilidad Repetibilidad
N° de Inyección Total polifenoles (mg/kg)
1 308 266
2 279 255
3 266 226
4 278 239
5 324 270
6 305 248
7 314 210
8 299 232
9 260 219
10 289 -
X 292,3 240,5
DS 21,3 20,9
CV (%) 7,3 8,7
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de
variación.
El gráfico N°1 representa los valores de polifenoles totales en cada
inyección realizada para la replicabilidad y repetibilidad.
Gráfico N°1: Presenta las 10 inyecciones realizadas en una muestra de aceite
de oliva extra virgen variedad arbequina para replicabilidad y repetibilidad.
41
5.1.3. Recuperación
En la tabla N°5 se presentan los porcentajes de recuperación, desviación
estándar y coeficiente de variación de las 5 inyecciones realizadas para la
muestra sin fortificar y fortificada con 30 µL de tirosol.
Tabla N°5: Contenido de tirosol para las muestras de aceite de oliva extra virgen
(variedad arbequina) sin fortificar y fortificada con 30µL y su porcentaje de
recuperación con sus parámetros estadísticos.
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
* Se realiza la diferencia de las muestras fortificadas con el promedio de las muestras sin fortificar
En la tabla N°6 se presentan los porcentajes de recuperación, desviación
estándar y coeficiente de variación de las 5 inyecciones realizadas para la
muestra de aceite sin fortificar y fortificada con 60 µL de tirosol.
N° de Inyección Aceite no fortificado (mg/kg)* Aceite fortificado
(mg/kg)
% recuperación
1 0,393 0,794 102,3
2 0,318 0,813 106,3
3 0,362 0,777 97,3
4 0,360 0,771 95,8
5 0,411 0,779 97,5
X 0,369 0,787 99,9
DS 0,034 0,022 5,1
CV (%) 9,02 2,81 5,1
42
Tabla N°6: Contenido de tirosol para la muestra de aceite de oliva extra virgen
(variedad arbequina) sin fortificar y fortificada con 60µL y su porcentaje de
recuperación con sus parámetros estadísticos.
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
* Se realiza la diferencia de las muestras fortificadas con el promedio de las muestras sin fortificar
El gráfico N°2 representa los niveles de recuperación para las muestras de
aceite de oliva extra virgen, fortificadas con 30 µL y 60 µL de tirosol. Se
obtuvo un porcentaje de recuperación de 99,8% para la muestra de aceite
fortificada con 30 µL y de 101,0% para la muestra de aceite fortificada con 60
µL.
Gráfico 2: Contenido de tirosol en aceite de oliva extra virgen variedad
arbequina para la muestra sin fortificar y fortificada con 0,8352 mg/kg
(30µL) y 1,6704 mg/kg (60µL).
N° de
Inyección
Aceite no fortificado
(mg/kg)*
Aceite fortificado
(mg/kg)
%
recuperación
1 0,393 1,222 102,6
2 0,318 1,192 98,3
3 0,362 1,187 98,6
4 0,360 1,282 109,5
5 0,411 1,169 95,7
X 0,369 1,210 100,9
DS 0,034 0,051 5,4
CV (%) 9,02 4,22 5,3
43
5.2. Determinación de polifenoles totales en aceites de oliva extra virgen
de las variedades Arbequina, Picual y Frantoio, producidas en Chile y
de la variedad Arauco, producida en Argentina
Se analizó el contenido total de polifenoles de un conjunto de muestras de
aceite de oliva extravirgen, de las variedades arbequina, picual, frantoio y
arauco.
Las tablas N° 7, 8, 9 y 10 presentan los resultados de polifenoles totales para
las variedades arbequina, picual, frantoio y Arauco, respectivamente.
Tabla N°7: Polifenoles totales para las muestras de
aceite de oliva extra virgen, variedad Arbequina.
Código Muestra Polifenoles Totales (mg/kg)
I217 225
I219 290
I222 275
I225 176
I228 166
I231 249
I234 151
I236 200
I238 93
I240 166
I241 148
I244 156
I251 153
I329 154
I371 177
X 185,3
DS 53,3
CV% 28,8
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
44
Tabla N°8: Cantidad de polifenoles totales para las
muestras de aceite de oliva extra virgen, variedad
Picual.
Código Muestra Polifenoles Totales (mg/kg)
I215 193
I218 368
I221 245
I224 147
I227 117
I230 393
X 243,8
DS 114,6
CV% 47
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
Tabla N°9: Polifenoles totales para las muestras de
aceite de oliva extra virgen, variedad Frantoio.
Código Muestra Polifenoles Totales (mg/kg)
I216 217
I220 271
I229 239
I232 269
I235 172
I239 249
I242 201
I245 266
I247 294
I326 272
X 245
DS 37,9
CV% 15,5
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
45
Tabla N°10: Cantidad de polifenoles totales para las
muestras de aceite de oliva extra virgen, variedad
Arauco.
Nº Muestra Polifenoles Totales (mg/kg)
32 133
33 525
34 288
35 168
36 277
37 316
38 164
39 307
40 371
41 139
X 268,8
DS 123,2
CV% 45,8
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
En el gráfico N°3 se observa el promedio del contenido de los polifenoles
totales (mg de tirosol/kg de aceite) para las 4 variedades de aceite de oliva
analizadas.
46
185,3
243,8 245,0268,8
0
50
100
150
200
250
300
Po
life
no
les T
ota
les (
mg
tiro
so
l/kg
de a
ceit
e)
Arbequina Picual Frantoio Arauco
Variedad
Gráfico Nº3: Contenido de Polifenoles Totales en aceite de oliva extra virgen de
las variedades Arbequina, Picual, Frantoio y Arauco
5.3. Contenido de hidroxitirosol y tirosol determinados en las muestras
de aceite de oliva extra virgen.
En las tablas 11, 12, 13 y 14, se presenta el contenido de hidroxitirosol y
tirosol para los aceites de oliva extra virgen de las variedades arbequina,
picual, frantoio y arauco, respectivamente.
Los datos de áreas totales para cada pick detectado para las diferentes
variedades en cada muestra se presentan en extenso en Anexo.
47
Tabla N°11: Contenido de hidroxitirosol y tirosol para las
muestras de aceite de oliva extra virgen de la variedad
Arbequina.
Código Muestra Hidroxitirosol (mg/kg) Tirosol (mg/kg)
I217 15,1 19,7
I219 4,5 2,0
I222 3,5 1,0
I225 7,9 8,5
I228 2,3 1,2
I231 2,6 2,0
I234 1,9 1,7
I236 0,6 3,2
I238 0,8 0,6
I240 0,5 2,8
I241 2,4 0,7
I244 17,5 3,6
I251 1,8 1,4
I329 2,8 4,3
I371 1,9 2,3
X 4,4 3,7
DS 5,2 4,9
CV% 117,5 132,3
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
48
Tabla N°12: Contenido de hidroxitirosol y tirosol para las
muestras de aceite de oliva extra virgen de la variedad Picual.
Código Muestra Hidroxitirosol (mg/kg) Tirosol (mg/kg)
I215 5,7 29,7
I218 7,0 7,3
I221 3,5 1,8
I224 3,8 7,7
I227 0,5 0,7
I230 3,4 3,9
X 4,0 8,5
DS 2,2 10,8
CV% 55,9 126,3
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
Tabla N°13: Contenido de hidroxitirosol y tirosol para las muestras
de aceite de oliva extra virgen de la variedad Frantoio.
Código Muestra
Hidroxitirosol (mg/kg) Tirosol (mg/kg)
I216 15,5 19,8
I220 3,3 3,9
I229 0,5 1,6
I232 0,7 2,6
I235 0,4 2,5
I239 9,7 14,5
I242 0,7 3,4
I245 0,9 2,3
I247 4,2 3,2
I326 9,3 3,4
X 4,5 5,7
DS 5,2 6,2
CV% 116 108,2
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
49
Tabla N°14: Contenido de hidroxitirosol y tirosol para las muestras
de aceite de oliva extra virgen de la variedad Arauco.
Nº Muestra Hidroxitirosol (mg/kg) Tirosol (mg/kg)
32 1,1 9
33 24,7 13,8
34 13 22,4
35 4,3 11,6
36 9,5 28,2
37 13,7 19,3
38 1,2 18,9
39 26,3 29,6
40 1,1 7,5
41 0,6 1,2
X 9,6 16,1
DS 9,8 9,2
CV% 102,3 56,8
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
50
6.- DISCUSIÓN
6.1. Validación de la Técnica
Fue posible poner a punto la metodología para polifenoles totales por HPLC
con detector de arreglo de diodo.
La precisión del método analítico se determinó calculando las propiedades de
Replicabilidad y Repetibilidad en una muestra de aceite de oliva extra virgen
variedad arbequina. La Replicabilidad de la muestra (10 inyecciones) mostró
un contenido de polifenoles totales promedio de 292 mg de tirosol por
kilogramo de aceite, con una DS de 21,3 y un CV de 7,3 %. La Repetibilidad
para la misma muestra realizada en nueve días consecutivos mostró un
contenido de polifenoles totales promedio de 241 mg de tirosol por kilogramo
de aceite con una DS de 20,9 y un CV de 8,7 %. Estos valores de CV %
están dentro de los valores señalados por la Directiva 657 de la comunidad
Europea del año 2002 (2002/657/CE), que señala los criterios para los
métodos cuantitativos mediante el uso de la ecuación de Horwitz. “El
coeficiente de variación (CV%) para el análisis repetido de un material de
referencia o enriquecido, en condiciones de reproducibilidad, no superará el
nivel calculado mediante la ecuación de Horwitz, a saber:
CV = 2 ( 1 – 0.5 log c)
Donde c representa la fracción de masa expresada como potencia
(exponente) de 10. Siguiendo la ecuación de Horwitz para un valor de analito
de aproximadamente 300 mg por kg el CV sería 8%. El valor de CV en la
Repetibilidad se encuentra levemente sobrepasado según la ecuación de
Horwitz. Sin embargo se debe considerar que la metodología implica
condiciones de operación como extracción del analito de la matriz que estaría
aumentando este coeficiente.
La Recuperación para la adición de tirosol (0,415 mg/kg y 0,828 mg/kg) a una
muestra de aceite de oliva extra virgen (variedad arbequina) fue de 99,9% y
51
100,9% respectivamente, con una DS de 5,1 y un CV de 5,1% para la
muestra fortificada con 0,415 mg/kg y una DS de 5,4 y un CV de 5,3% para la
muestra fortificada con 0,828 mg/kg. Debido a que los valores promedios de
polifenoles totales para las muestras fortificadas con 30uL de tirosol fue de
0,787 mg/kg y 1,210 mg/kg para las muestras fortificadas con 60uL tirosol,
sigue con la ecuación de Horwitz para valores de analito alrededor de 1
mg/kg. El valor de CV sería 16%, por tanto los valores de CV para la
recuperación de tirosol se encuentran dentro de lo esperado según la
ecuación de Horwitz.
Los resultados de Límite de Detección del Método (LDM) y Límite de
Cuantificación del Método (LCM) fueron 1,97 y 6,55 mg/kg de aceite
respectivamente, realizado con el compuesto hidroxitirosol con una
concentración de 4,4 mg/kg, encontrándose dentro de los rangos de 2LDM y
10LDM, 3,96 y 19,8 mg/kg respectivamente.
6.2. Cuantificación de polifenoles de las muestras de aceite de oliva
extra virgen analizadas
Para las 41 muestras analizadas entre todas las diferentes variedades de
aceite de oliva extra virgen (Arbequina, Picual, Frantoio y Arauco) se
encontraron contenidos de polifenoles totales entre 93 y 595 mg/kg,
(expresados como mg de tirosol por kg) perteneciendo la de 93 mg/kg a una
muestra de variedad Arbequina y la de 595 mg/kg a una muestra de variedad
Arauco. La tabla N°15 muestra el promedio y rango de polifenoles obtenidos
para cada variedad estudiada.
Tabla N°15: promedio y rango de polifenoles obtenidos para
variedad Arbequina, Picual, Frantoio, y Arauco.
Variedad N° muestras Promedio
(mg/kg)
Rango de
polifenoles (mg/kg)
Arbequina n=15 185,3 ± 53,3 a 93 – 290
Picual n= 6 243,8 ± 114,6 a 117 – 393
Frantoio n=10 245 ± 37,9 a 172 – 294
Arauco n=10 268,8 ± 123,2 a 133 – 525
a letras iguales no presentan diferencias significativas
52
La variedad Frantoio y la variedad Picual presentaron valores promedios
similares de polifenoles totales, alrededor de 245 y 244 mg de tirosol/kg
respectivamente. Sin embargo la variedad Picual presenta una desviación
estándar mayor a la de la variedad Frantoio debido a que el rango de
polifenoles es más amplio. La variedad arbequina presentó el menor
promedio con 185 mg de tirosol/kg y la variedad Arauco el mayor con un
promedio de 268 mg de tirosol/kg.
El contenido en polifenoles totales para los aceites de oliva extra virgen
analizados en este estudio fue similar a los descritos en la literatura de 347
ppm (Tous, 1997), 346±131 ppm (Gracia, 2001), 100-904 ppm (Beltrán,
2000), 150-500 ppm (Ranalli, 1999), 214 ppm (Giacometti, 2001). Por otro
lado se han encontrado varietales de Cornicabra con casi 600 ppm, o de
Picual con casi 500 mg/kg. En el extremo contrario se encuentran los aceites
de Verdial de Vélez con 100 mg/kg y de Arbequina con 220 mg/kg. (Romero,
C. “et al”, Expoliva 2003). Un estudio realizado por el Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), para la Producción de
aceite de oliva virgen de la variedad Arauco, mostró un contenido de
polifenoles totales de 290 mg/kg en un lote de 100 kg de fruto. Sin embargo
también se pueden encontrar aceites con contenidos de hasta 1000 mg/kg
(Gutiérrez et al., 2001).
La concentración final de compuestos fenólicos en aceites de oliva es fruto de
la interacción de varios factores. En la literatura, se señala que la variedad y
la localización geográfica son uno de los principales factores. Sin embargo,
otros factores como las condiciones climatológicas, las características del
suelo de cultivo y el tipo de riego si es tecnificado o no adquieren gran
relevancia, también se han estudiado (Galli C, Visioli F.1999; Gutfinger
T.1981; Gimeno E. et al. 2002)
La reglamentación del contenido de polifenoles en aceite de oliva no tiene
ningún parámetro establecido por la legislación chilena, argentina, CODEX
Alimentarius ó COI. Sin embargo, un mayor contenido de éstos aumenta la
calidad del aceite, en términos de estabilidad, como lo muestran las
53
normas del INN (Nch 107. Of 2001, Nch 112. Of1956 y Nch 2586. Of 2001),
todas de carácter no obligatorio. Tales normas tratan sobre la clasificación y
los requisitos de calidad del aceite de oliva en sus distintas formas de
presentación para consumo humano, el método para comprobar las
adulteraciones del aceite de oliva hechas con otros aceites o con colorantes,
y la clasificación y los requisitos de calidad del aceite de orujo de oliva en sus
distintas formas de presentación para consumo humano.
Respecto al análisis de varianza (ANOVA) con un 5% de significación y un
95% de confiabilidad, de las 41 muestras de aceites de oliva extra virgen de
las cuatro variedades analizadas no se observaron diferencias significativas
en la cantidad de polifenoles (gráfico N°6). Estos resultados están de
acuerdo con Gutierrez et al., que señala que en el aceite de oliva los
polifenoles totales dependen en gran parte del proceso realizado,
mientras que en las aceitunas el contenido de polifenoles totales varían
de acuerdo a la variedad del olivo, el clima, el período de cosecha y
sector del cultivo (Gutiérrez et al., 2001).
Gráfico N°6: Medias de Polifenoles Totales según variedad
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Variedad
Polif
eno
les T
ota
les
Arauco Arbequina Frantoio Picual150
190
230
270
310
54
6.3. Contenido de Tirosol e Hidroxitirosol en las muestras analizadas
La tabla N°16 muestra un resumen de promedios, desviación estándar y
coeficiente de variación para hidroxitirosol y tirosol de las 4 variedades
estudiadas.
Tabla Nº16: Parámetros estadísticos (X, DS, y CV%) de los compuestos hidroxitirosol
y tirosol de las 4 variedades.
Hidoxitirosol (mg/kg) Tirosol (mg/kg)
Arbequina Picual Frantoio Arauco Arbequina Picual Frantoio Arauco
(n=15) (n=6) (n=10) (n=10) (n=15) (n=6 (n=10) (n=10)
X 4,4 4,0 4,5 9,6 3,7 8,5 5,7 16,1
DS 5,2 2,2 5,2 9,8 4,9 10,8 6,2 9,2
CV% 117,5 55,9 116,0 102,3 132,3 126,3 108,2 56,8
X:promedio, DS: desviación estándar, CV(%): coeficiente de variación.
En la tabla N°16 se puede ver la alta dispersión de los datos analizados (DS y
CV%), en algunos casos la desviación estándar fue superior al valor del
promedio, mostrando una variabilidad excesivamente grande y un coeficiente
de variabilidad mayor del 100% para las muestras de Arbequina, Frantoio y
Arauco en el caso del compuesto hidroxitirosol y para las variedades
Arbequina, Picual y Frantoio para el compuesto tirosol. En este caso no se
realizó un análisis de varianza (ANOVA).
Para comparar los resultados obtenidos con la literatura se hace referencia a
una publicación realizada por el Instituto de la Grasa (CSIC), el cual señala
valores para Hidroxitirosol y Tirosol (tabla N° 17) en muestras frescas de
aceite de oliva extra virgen de variedad Picual, el cual presenta un rango de
valores promedio referidos al inicio y fin de dos campañas, 1999/2000 y
2000/2001, provenientes de las nueve comarcas agrarias de la Provincia de
Jaén, España.
55
Tabla N°17: Comparación del contenido de hidroxitirosol y tirosol en
aceites de oliva extra virgen de la variedad picual, del presente estudio
(A), de la primera y segunda campaña (B,C) obtenidos de la literatura
A B C
Hidroxitirosol (mg/kg) 7,0 – 0,5 12,6 – 9,4 6,0 – 1,9
Tirosol (mg/kg) 29,7 – 0,7 12,3 – 16,4 8,7 – 10,0
A:contenido de compuestos fenólicos obtenidos en el presente estudio, B:rango de
contenido de compuestos fenólicos obtenidos en la primera campaña (1999/2000),
C:rango de contenido de compuestos fenólicos obtenidos en la segunda
campaña(2000/2001).
Referencia: Papel de los Polifenoles en la Oxidación del Aceite de Oliva Virgen Proyecto
CA098- 006. Instituto de la Grasa (CSIC), Gutiérrez F.
En la tabla N°17, los datos de hidroxitirosol y tirosol, señalados para ambas
campañas, la primera (B) presenta valores superiores para los dos
compuestos fenólicos comparada con la segunda campaña (C),
asemejándose esta última a los resultados obtenidos en el presente estudio
(A). Sin tener más antecedentes del aceite oliva de variedad Picual (A) que la
procedencia de éste, se podría plantear que estos valores inferiores respecto
a B se debe a las diferentes fechas de recolección, que para A y C las
condiciones climáticas no fueron las óptimas o tuvieron un distinto grado de
madurez comparado con B.
56
7.- CONCLUSIONES
La determinación de polifenoles por el método HPLC permite identificar
moléculas relevantes, pero no proporciona información sobre todas las
moléculas de compuestos fenólicos.
Al comparar los valores obtenidos del contenido de polifenoles totales de los
aceites analizados en el presente estudio con los reportados por la literatura
fueron similares.
Se detectaron en los aceites de oliva extra virgen analizados componentes
con elevado carácter antioxidante, entre los que destacan el hidroxitirosol y
tirosol. El rango de polifenoles totales fue desde 93 mg de tirosol/kg de aceite
(muestra de variedad arbequina) a 525 mg de tirosol/ kg de aceite (muestra
de variedad arauco), en el que no se observó un efecto de la variedad de
aceite de oliva extra virgen sobre el contenido de polifenoles totales.
El método validado resultó preciso, exacto para el aceite de oliva ensayado,
con CV% para replicabilidad, repetibilidad y recuperación esperados según la
ecuación de Horwitz. Estos resultados permiten postular que el método es
una buena alternativa para análisis cuantitativo de polifenoles totales.
57
8.- BIBLIOGRAFÍA
1. ABAZA L, TAAMALLI W, BEN TEMIME S, DAOUD D, GUTIERREZ F,
ZARROUK M. 2005. Natural antioxidant composition as correlated to
stability of some Tunisian virgin olive oils. Riv. Ital. Sostanze Grasse 82,
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2. ANGEROSA F, BASTI C, VITO R. Biogeneration of Volatile Compound in
Virgin Olive Oil: Their Evolution in Relation to Malaxation Time. JAFC.
(46): 2940-2944. 1998.
3. Asociación Española de la Industria y el Comercio Exportador del Aceite
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9.- ANEXOS
Anexo 1
Tabla N°18: Áreas de Hidroxitirosol para el cálculo de LDM y LCM
Arbequina1 Arbequina2 Arbequina3 Arbequina4 Arbequina5
Área Hidroxitirosol 17408 20494 21479 18287 12572
Área Ac. Siríngico 144844 149363 156190 152914 151379
Peso aceite (gr) 2,0264 1,9983 2,0778 2,1943 2,1767
Ac. Sir. Inyectado (mg) 0,01513 0,01513 0,01513 0,01513 0,01513
FFR 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
TIROSOL (mg/kg) 4,5 5,2 5,0 4,1 2,9
Arbequina6 Arbequina7 Arbequina8 Arbequina9 Arbequina10
Área Hidroxitirosol 17113 17628 19477 17196 18609
Área Ac. Siríngico 152482 148665 158723 170842 162537
Peso aceite (gr) 2,0033 2,0021 2,0218 2,0282 1,9952
Ac. Sir. Inyectado (mg) 0,01513 0,01513 0,01513 0,01513 0,01513
FFR 5,0 5,2 5,2 5,2 5,2
TIROSOL (mg/kg) 1,8 2,2 2,4 1,7 1,5
Anexo 2
Cálculo de LDM y LCM:
CLDM = 3σB
CLDM = 3(0,66)
CLDM = 1,98
CLCM = 10σB
CLCM = 10(0,66)
CLCM = 6,6
65
Anexo 3
Tabla N°19: Áreas de Polifenoles Totales de las 10 repeticiones para el cálculo de X, DS y
CV% para obtener la replicabilidad del método.
Arbequina1 Arbequina2 Arbequina3
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick Tiempo de Retención Área
1 12,147 17408 1 12,212 20494 1 12,086 21479
2 16,37 9544 2 16,391 11899 2 16,217 9583
3 22,39 144844 3 22,413 149363 3 22,26 156190
4 23,931 23461 4 23,898 31746 4 23,743 22943
5 26,711 11188 5 26,676 6074 5 26,499 12702
6 27,528 57347 6 27,513 59353 6 27,353 54841
7 30,732 3169 7 31,206 1763 7 32,709 421787
8 32,844 468033 8 31,695 671 8 38,719 369728
9 38,921 535554 9 32,837 420312 9 41,157 172954
10 43,893 6058 10 36,189 4130 10 45,479 55170
11 45,862 44903 11 38,88 487363
12 48,383 16477 12 45,169 9567
13 45,752 37157
14 48,313 12068
Σ Ärea 1193142 Σ Ärea 1102597 Σ Ärea 114118
7
RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,0
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,0151
3
Peso Muestra (gr) 2,0264 Peso Muestra (gr) 1,9983 Peso Muestra (gr) 2,0778
Total Polifenoles (mg/kg) 308 Total Polifenoles (mg/kg) 279 Total Polifenoles (mg/kg) 266
Arbequina4 Arbequina5 Arbequina6
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 11,837 18287 1 12,055 11919 1 11,224 17113
2 16,077 9832 2 16,139 14050 2 15,535 7287
3 22,142 152914 3 22,04 151379 3 21,422 152482
4 23,582 24164 4 23,573 37241 4 22,925 23536
5 26,37 9441 5 25,554 10125 5 26,483 74914
6 27,262 65403 6 26,299 8476 6 31,875 429935
7 31,725 8612 7 27,131 69129 7 34,103 1266
8 32,613 446866 8 30,632 1022 8 37,913 618426
9 34,861 4250 9 31,377 2556 9 44,594 46719
10 38,691 573724 10 32,301 553172 10 47,362 11646
11 43,613 6779 11 36,209 23396
12 44,952 758 12 38,469 408174
13 45,434 46117 13 40,862 178863
14 48,141 20686 14 45,224 94266
Σ Ärea 1234919 Σ Ärea 1412389 Σ Ärea 1230842
RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,0
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,1943 Peso Muestra (gr) 2,1767 Peso Muestra (gr) 2,0033
Total Polifenoles (mg/kg) 278 Total Polifenoles (mg/kg) 324 Total Polifenoles (mg/kg) 305
66
Arbequina7 Arbequina8 Arbequina9
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,317 17569 1 12,273 19477 1 12,035 17196
2 16,41 8368 2 16,394 9693 2 16,298 7336
3 22,456 148665 3 22,466 158723 3 22,318 170842
4 23,971 22671 4 23,937 19788 4 23,815 13708
5 26,75 6441 5 26,765 21766 5 26,591 4814
6 27,533 62261 6 27,564 70224 6 27,421 62450
7 31,819 7790 7 32,845 451341 7 30,71 6612
8 31,485 5672
9 32,745 410523
10 34,988 6636
11 38,777 357245
12 40,54 24047
13 41,243 156494
14 43,298 357
15 44,299 10598
16 45,571 20455
17 46,699 15175
18 48,166 24683
Σ Ärea 1188995 Σ Ärea 1221485 Σ Ärea 1144001
RRFsir/tir 5,2 RRFsir/tir 5,2 RRFsir/tir 5,2
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0021 Peso Muestra (gr) 2,0218 Peso Muestra (gr) 2,0282
Total Polifenoles (mg/kg) 314 Total Polifenoles (mg/kg) 299 Total Polifenoles (mg/kg) 260
Arbequina10
Pick Tiempo de Retención Área
1 12,234 18609
2 16,309 6067
3 22,299 162537
4 23,732 24331
5 26,612 26802
6 27,381 59541
7 30,698 12021
8 32,749 449241
9 38,824 376239
10 41,223 145947
11 45,625 59254
12 48,226 12488
Σ Ärea 1190540
RRFsir/tir 5,2
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 1,9952
Total Polifenoles (mg/kg) 289
67
Anexo 4
Tabla N°20: Áreas de Polifenoles Totales de las 9 repeticiones para el cálculo de X, DS y CV%
para obtener la repetibilidad del método.
Arbequina1 Arbequina2 Arbequina3
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,086 21479 1 12,035 17196 1 12,684 18621
2 16,217 9583 2 16,298 7336 2 17,012 11760
3 22,26 156190 3 22,318 170842 3 23,163 149963
4 23,743 22943 4 23,815 13708 4 24,642 27154
5 26,499 12702 5 26,591 4814 5 27,406 12478
6 27,353 54841 6 27,421 62450 6 28,19 62166
7 32,709 421787 7 30,71 6612 7 32,573 3344
8 38,719 369728 8 31,485 5672 8 33,422 250525
9 41,157 172954 9 32,745 410523 9 35,609 4225
10 45,479 55170 10 34,988 6636 10 37,211 9866
11 38,777 357245 11 39,3 272474
12 40,54 24047 12 41,067 15344
13 41,243 156494 13 41,787 161863
14 43,298 357 14 45,418 3223
15 44,299 10598 15 46,061 15052
16 45,571 20455 16 47,127 8316
17 46,699 15175 17 48,582 18583
18 48,166 24683
Σ Ärea 1141187 Σ Ärea 1144001 Σ Ärea 894994
RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,0
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0778 Peso Muestra (gr) 2,0282 Peso Muestra (gr) 2,0016 Total Polifenoles (mg/kg) 266
Total Polifenoles (mg/kg) 255
Total Polifenoles (mg/kg) 226
68
Arbequina4 Arbequina5 Arbequina6
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,373 16519 1 12,259 10067 1 12,409 14092
2 16,533 8848 2 16,512 8998 2 16,56 9413
3 22,471 150963 3 22,509 156610 3 22,584 162660
4 23,91 27400 4 24,007 20628 4 24,038 27657
5 25,88 5320 5 26,793 7201 5 26,801 5007
6 26,712 10779 6 27,541 56874 6 27,553 57799
7 27,458 60919 7 31,95 3688 7 32,061 891
8 31,93 1082 8 32,865 396843 8 32,846 419631
9 32,742 335102 9 35,078 601 9 34,017 3130
10 38,852 483761 10 35,594 214 10 35,091 3644
11 43,778 8453 11 36,802 13155 11 36,828 10939
12 45,139 1218 12 38,905 338563 12 37,653 72374
13 45,739 54533 13 40,713 10841 13 38,551 60466
14 41,44 155467 14 38,907 189292
15 43,874 11680 15 40,705 13153
16 45,779 47330 16 41,468 138968
17 48,29 18411 17 43,865 1168
18 45,102 5568
19 45,85 16774
20 46,924 8368
21 48,366 14326
Σ Ärea 1013934 Σ Ärea 1100561 Σ Ärea 1072660
RRFsir/tir 4,9 RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,0
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0831 Peso Muestra (gr) 2,0065 Peso Muestra (gr) 2,0135
Total Polifenoles (mg/kg) 239 Total Polifenoles (mg/kg) 270 Total Polifenoles (mg/kg) 248
69
Arbequina7 Arbequina8 Arbequina9
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,152 16652 1 12,327 19001 1 12,164 14388
2 16,375 10864 2 16,594 7193 2 16,376 10894
3 22,373 158066 3 22,574 149702 3 22,457 160073
4 23,85 18573 4 23,972 21086 4 23,924 18460
5 26,653 6413 5 26,783 8266 5 26,703 4637
6 27,419 56348 6 27,496 57653 6 27,45 58070
7 31,86 318 7 32,047 1813 7 31,946 2626
8 32,737 280521 8 32,852 306997 8 32,839 332863
9 33,182 31353 9 34,044 6695 9 35,131 2963
10 35,004 1097 10 35,137 5921 10 36,837 2128
11 36,733 2329 11 36,831 2250 11 38,937 288504
12 37,553 36888 12 37,208 51 12 40,738 9689
13 38,459 50770 13 38,902 299424 13 41,464 136962
14 38,825 179068 14 39,822 2855 14 43,879 4380
15 40,611 9965 15 40,285 1125 15 45,235 234
16 41,343 139029 16 40,722 4892 16 45,804 18554
17 43,777 1510 17 41,023 11 17 46,89 10229
18 44,483 771 18 41,114 21 18 48,321 12510
19 45,702 15967 19 41,44 138485
20 46,788 8249 20 43,843 1702
21 48,209 13876 21 45,828 17092
22 46,918 8039
23 48,315 12372
Σ Ärea 880561 Σ Ärea 922944 Σ Ärea 928091
RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,0
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0046 Peso Muestra (gr) 2,0104 Peso Muestra (gr) 2,0055
Total Polifenoles (mg/kg) 210 Total Polifenoles (mg/kg) 232 Total Polifenoles (mg/kg) 219
Anexo 5
Tabla N°21: Áreas de Tirosol y ácido Siríngico para el cálculo de la recuperación de las 5
repeticiones realizadas sin fortificar.
Arbequina 1 Arbequina 2 Arbequina 3
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
Tirosol 16,065 1488 Tirosol 16,170 1209 Tirosol 16,058 1361 Acido Siríngico 22,257 154082
Acido Siríngico 22,263 155596
Acido Siríngico 22,173 153950
RRFsir/tir 5,5 RRFsir/tir 5,5 RRFsir/tir 5,5
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496
Peso Muestra (gr) 2,0217 Peso Muestra (gr) 2,0128 Peso Muestra (gr) 2,0068
70
Arbequina 4 Arbequina 5
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
Tirosol 16,260 1566 Tirosol 16,720 1444 Acido Siríngico 22,263 155817 Acido Siríngico 22,425 150327
RRFsir/tir 5,5 RRFsir/tir 5,5
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496
Peso Muestra (gr) 2,0123 Peso Muestra (gr) 2,0022
Anexo 6
Tabla N°22: Áreas de Tirosol y ácido Siríngico para el cálculo de la recuperación de las 5
repeticiones realizadas fortificadas con 30μL de Tirosol.
Arbequina 1 Arbequina 2 Arbequina 3
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
Tirosol 16,155 3110 Tirosol 15,925 3034 Tirosol 15,834 2824 Acido Siríngico 22,299 158797
Acido Siríngico 22,158 159657
Acido Siríngico 22,038 154360
RRFsir/tir 5,5 RRFsir/tir 5,5 RRFsir/tir 5,5
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496
Peso Muestra (gr) 2,0291 Peso Muestra (gr) 2,0121 Peso Muestra (gr) 2,0121
Arbequina 4 Arbequina 5
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
Tirosol 16,376 3007 Tirosol 16,296 2981 Acido Siríngico 22,505 159716
Acido Siríngico 22,449 157010
RRFsir/tir 5,5 RRFsir/tir 5,5
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496
Peso Muestra (gr) 2,0138 Peso Muestra (gr) 2,0084
Anexo 7
Tabla N° 23: Áreas de Tirosol y ácido Siríngico para el cálculo de la recuperación de las 6
repeticiones realizadas fortificadas con 60μL de Tirosol.
Arbequina 1 Arbequina 2 Arbequina 3
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
Tirosol 16,401 4636 Tirosol 16,279 4370 Tirosol 16,315 4479 Acido Siríngico 22,528 154614
Acido Siríngico 22,416 155751
Acido Siríngico 22406 154140
RRFsir/tir 5,5 RRFsir/tir 5,5 RRFsir/tir 5,5
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496
Peso Muestra (gr) 2,0188 Peso Muestra (gr) 2,0412 Peso Muestra (gr) 2,0061
71
Arbequina 4 Arbequina 5 Arbequina 6
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
Tirosol 16,340 4423 Tirosol 16,343 5138 Tirosol 16,420 4483 Acido Siríngico 22,435 151515
Acido Siríngico 22,459 163889
Acido Siríngico 22,479 157092
RRFsir/tir 5,5 RRFsir/tir 5,5 RRFsir/tir 5,5
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01496
Peso Muestra (gr) 2,0240 Peso Muestra (gr) 2,0127 Peso Muestra (gr) 2,0081
Anexo 8
Tabla N°24: Área de Polifenoles Totales de las muestras de variedad Arbequina.
Muestra 1 (I217) Arbequina Muestra 2 (I219) Arbequina Muestra 3 (I222) Arbequina
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 11,976 61853 1 12,593 17043 1 12,131 12449
2 16,243 80873 2 16,584 7375 2 16,088 3474
3 22,33 154298 3 22,515 146403 3 22,183 136531
4 23,74 11314 4 24,011 10172 4 23,576 6057
5 26,456 7932 5 26,793 15595 5 27,194 23987
6 27,374 11435 6 27,546 47064 6 31,296 2929
7 32,8 110040 7 31,993 3485 7 32,612 389912
8 38,828 204839 8 32,883 370028 8 36,345 25139
9 39,703 64 9 36,343 8767 9 38,604 258825
10 40,171 1012 10 38,979 388173 10 39,456 454
11 40,628 2249 11 40,305 1286 11 39,919 66
12 42,268 326632 12 40,758 3269 12 40,402 3088
13 43,741 2493 13 41,477 184962 13 40,984 198325
14 46,594 88788 14 43,926 2876 14 45,295 23262
15 48,271 14243 15 45,862 12349 15 46,449 7136
16 46,919 13000 16 48,064 14300
17 48,348 9877
Σ Ärea 923767 Σ Ärea 1095321 Σ Ärea 969403
RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,2 RRFsir/tir 5,2
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,009 Peso Muestra (gr) 2,032 Peso Muestra (gr) 2,0283
Total Polifenoles (mg/kg) 225 Total Polifenoles (mg/kg) 290 Total Polifenoles (mg/kg) 275
72
Muestra 4 (I225) Arbequina Muestra 5 (I228) Arbequina Muestra 6 (I231) Arbequina
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 11,892 31813 1 11,975 10045 1 11,941 10644
2 16,317 34221 2 16,229 5470 2 16,134 7902
3 22,375 142960 3 22,2 169739 3 22,333 158133
4 23,855 6270 4 23,64 8689 4 23,757 21643
5 26,691 6437 5 26,395 5101 5 26,504 14051
6 27,503 1973 6 27,239 20408 6 27,325 37792
7 32,795 62765 7 31,501 3258 7 32,773 393439
8 38,846 256754 8 32,632 198463 8 36,546 15347
9 41,39 220973 9 33,835 9181 9 37,564 106197
10 43,809 8304 10 34,822 2301 10 38,435 54215
11 44,677 605 11 36,409 14873 11 38,778 143752
12 45,066 1490 12 36,841 878 12 40,14 992
13 47,056 64210 13 38,637 272988 13 40,56 2301
14 47,706 1094 14 39,999 2177 14 41,211 50258
15 48,292 11551 15 40,476 2809 15 42,241 113745
16 41,106 127513 16 45,5 10352
17 43,597 4973 17 46,63 12345
18 45,401 14441 18 48,229 11278
19 46,576 14572
20 48,117 21834
Σ Area 708460 Σ Area 739974 Σ Area 1006253
RRFsir/tir 5,2 RRFsir/tir 5,2 RRFsir/tir 5,2
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (mg) 2,2209 Peso Muestra (mg) 2,0637 Peso Muestra (mg) 2,0092
Total Polifenoles (mg/kg) 176 Total Polifenoles (mg/kg) 166 Total Polifenoles (mg/kg) 249
73
Muestra 7 (I234) Arbequina Muestra 8 (I236) Arbequina Muestra 9 (I238) Arbequina
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,236 8551 1 12,003 2394 1 12,234 3467
2 16,38 7488 2 16,114 13036 2 16,376 2493
3 22,265 169446 3 22,075 156597 3 22,403 158679
4 23,729 4449 4 23,482 16889 4 23,811 4655
5 27,243 10244 5 26,117 13410 5 26,686 1839
6 27,993 2756 6 27,034 48188 6 27,354 7940
7 32,565 108502 7 32,471 191651 7 32,682 7186
8 34,84 2344 8 34,291 19 8 34,952 2245
9 36,474 10909 9 34,7 3314 9 36,092 9099
10 37,379 43489 10 35,126 496 10 38,805 211989
11 38,282 47992 11 36,138 6466 11 40,579 14201
12 38,623 190135 12 37,238 28970 12 41,338 76110
13 40,432 7722 13 38,461 282861 13 43,727 2246
14 41,112 99245 14 40,734 147712 14 45,654 12322
15 41,698 62613 15 43,375 5459 15 46,78 13846
16 43,62 2121 16 45,017 19133 16 48,208 17502
17 44,49 474 17 46,192 18340
18 44,876 56 18 46,945 18
19 45,462 29274 19 47,916 15868
20 46,576 11673
21 48,089 20032
Σ Ärea 670069 Σ Ärea 814224 Σ Ärea 387140
RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngicom(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0172 Peso Muestra (gr) 2,0106 Peso Muestra (gr) 2,0192
Total Polifenoles (mg/kg) 151 Total Polifenoles (mg/kg) 276 Total Polifenoles (mg/kg) 93
74
Muestra 10 (I240) Arbequina Muestra 11 (I241) Arbequina Muestra 12 (I244) Arbequina
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,063 1929 1 12,201 9954 1 11,982 80904
2 16,166 11285 2 16,452 2985 2 16,278 16447
3 22,153 155525 3 22,44 157906 3 22,409 174406
4 23,554 13847 4 24,724 1511 4 23,813 13735
5 26,317 10282 5 26,646 4774 5 27,379 28010
6 27,14 8001 6 27,435 20553 6 31,645 616
7 32,606 37812 7 31,718 2586 7 32,796 94475
8 33,745 8012 8 32,744 111580 8 33,822 3415
9 36,355 7422 9 33,917 812 9 35,034 533
10 36,743 189 10 34,99 1701 10 35,934 8165
11 37,389 56357 11 35,531 346 11 36,697 4297
12 38,318 69379 12 36,78 3721 12 37,593 27816
13 38,658 238594 13 38,875 255047 13 38,862 212683
14 39,481 695 14 39,71 3381 14 39,693 704
15 40,009 1720 15 40,194 2871 15 40,203 1110
16 40,432 3587 16 40,632 5045 16 41,282 158498
17 41,022 124618 17 41,337 119773 17 43,806 2492
18 43,594 2522 18 43,798 1978 18 44,859 363
19 45,298 58415 19 44,649 2269 19 45,605 41211
20 48,057 15373 20 45,702 28820 20 46,735 10480
21 46,812 16586 21 48,258 15351
22 48,208 15629
Σ Ärea 670039 Σ Ärea 61192 Σ Ärea 721305
RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0024 Peso Muestra (gr) 2,0238 Peso Muestra (gr) 2,0398
Total Polifenoles (mg/kg) 166 Total Polifenoles (mg/kg) 148 Total Polifenoles (mg/kg) 156
75
Muestra 13 (I251) Arbequina Muestra 14 (I329) Arbequina Muestra 15 (I371) Arbequina
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 11,486 7906 1 12,178 7575 1 11,958 11626
2 15,909 9880 2 16,435 6194 2 16,041 17922
3 22,014 162126 3 22,47 160664 3 22,11 154821
4 23,419 8162 4 23,942 1355 4 23,534 4522
5 26,2 17614 5 26,696 8392 5 26,152 16161
6 27,092 12605 6 27,443 64456 6 27,044 21495
7 32,483 24491 7 32,772 124681 7 31,624 2154
8 33,256 128 8 33,946 3300 8 32,576 97543
9 33,45 71 9 35,076 2934 9 34,763 5594
10 33,645 497 10 35,493 1718 10 36,554 58772
11 34,106 4407 11 36,21 682 11 38,579 289771
12 35,21 384 12 36,756 2320 12 40,777 102788
13 35,674 1075 13 37,159 428 13 42,889 346
14 36,328 5521 14 38,861 265774 14 43,76 29246
15 37,33 39282 15 39,791 1194 15 46,282 32956
16 38,24 62873 16 40,228 7861 16 48,034 45468
17 38,591 244612 17 40,688 6440
18 40,918 134723 18 41,391 114870
19 43,552 3868 19 43,888 2233
20 45,228 51987 20 45,779 17682
21 47,998 17998 21 46,882 9764
22 48,14 15784
Σ Area 648084 Σ Area 665637 Σ Area 736364
RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,0
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0104 Peso Muestra (gr) 2,0323 Peso Muestra (gr) 2,0300
Total Polifenoles (mg/kg) 153 Total Polifenoles (mg/kg) 154 Total Polifenoles (mg/kg) 177
76
Anexo 9
Tabla N°25: Área de Polifenoles Totales de las muestras de variedad Picual.
Muestra 16 (I215) Picual Muestra 17 (I218) Picual Muestra 18 (I221) Picual
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,363 25253 1 12,348 28499 1 12,202 14296
2 16,624 131195 2 16,511 29908 2 16,368 7477
3 22,597 160577 3 22,498 158987 3 22,421 158574
4 24,052 3044 4 23,899 8649 4 23,898 8478
5 26,802 2431 5 26,669 35125 5 27,45 5653
6 27,593 5683 6 27,486 6657 6 28,164 3604
7 33,019 94786 7 32,742 415285 7 32,771 58071
8 35,672 1372 8 38,489 856809 8 33,958 189932
9 36,807 2575 9 46,983 111421 9 36,713 4580
10 38,999 157371 10 48,255 10493 10 37,598 53237
11 42,43 326836 11 38,47 128952
12 43,934 10483 12 38,819 111718
13 47,028 77846 13 41,325 81422
14 47,68 1269 14 42,587 225043
15 48,426 14465 15 43,773 6240
16 45,663 20511
17 46,692 32361
18 46,934 19266
19 48,284 13671
20 48,797 6457
21 49,32 7176
22 49,94 6559
Σ Area 854609 Σ Area 1502846 Σ Area 1004704
RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,2 RRFsir/tir 5,2
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0844 Peso Muestra (gr) 2,0211 Peso Muestra (gr) 2,0334
Total Polifenoles (mg/kg) 193 Total Polifenoles (mg/kg) 368 Total Polifenoles (mg/kg) 245
77
Muestra 19 (I224) Picual Muestra 20 (I227) Picual Muestra 21 (I230) Picual
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,203 14806 1 12,014 1922 1 12,161 13508
2 16,436 30201 2 16,235 2838 2 16,513 15257
3 22,532 152052 3 22,24 157946 3 22,634 155522
4 24,024 3978 4 23,736 7725 4 24,023 10068
5 26,783 5118 5 26,045 24486 5 26,833 6966
6 27,589 728 6 32,599 92169 6 27,575 10707
7 32,217 1172 7 38,331 143341 7 32,962 326997
8 34,573 62627 8 41,059 128233 8 38,625 386349
9 35,659 1004 9 42,969 57 9 42,664 568988
10 36,882 15844 10 43,594 11569 10 47,022 190275
11 38,589 187711 11 45,4 10715 11 48,382 28526
12 40,313 1152 12 45,957 80
13 40,775 2355 13 46,75 11503
14 41,488 209439 14 47,328 881
15 43,902 6855 15 48,085 34736
16 45,123 2207
17 45,85 13023
18 47,15 12355
19 47,75 100
20 48,356 5279
Σ Area 575954 Σ Area 470255 Σ Area 1557641
RRFsir/tir 5,2 RRFsir/tir 5,2 RRFsir/tir 5,2
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,0151 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0248 Peso Muestra (gr) 2,0062 Peso Muestra (gr) 2,0033
Total Polifenoles (mg/kg) 147 Total Polifenoles (mg/kg) 117 Total Polifenoles (mg/kg) 393
78
Anexo 10
Tabla N°26: Área de Polifenoles Totales de las muestras de variedad Frantoio.
Muestra 22 (I216) Frantoio Muestra 23 (I220) Frantoio Muestra 24 (I229) Frantoio
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,218 63344 1 12,214 13063 1 12,498 2147
2 16,491 81080 2 16,389 15446 2 16,582 6539
3 22,521 154523 3 22,399 152284 3 22,581 159023
4 23,963 2795 4 23,938 17463 4 24,073 13336
5 26,677 6538 5 26,71 2266 5 27,595 5286
6 27,512 17717 6 27,531 5490 6 32,816 211524
7 32,966 141194 7 32,797 179292 7 35,562 1830
8 35,561 7547 8 38,864 523451 8 36,798 7313
9 36,716 8009 9 40,254 10129 9 38,863 449099
10 38,978 269047 10 42,635 221930 10 40,209 757
11 42,406 196013 11 43,808 6201 11 40,688 1087
12 43,87 1512 12 44,448 4475 12 41,086 263
13 45,674 78596 13 45,106 342 13 42,636 179371
14 48,403 15193 14 45,727 13539 14 43,846 11594
15 46,974 25577 15 45,078 660
16 48,277 23098 16 47,01 49360
17 48,852 1601 17 47,538 1230
18 48,32 25571
Σ Area 888585 Σ Area 1063363 Σ Area 966967
RRFsir/tir 5,0 RRFsir/tir 5,2 RRFsir/tir 5,2
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0056 Peso Muestra (gr) 2,0254 Peso Muestra (gr) 2,0008
Total Polifenoles (mg/kg) 217 Total Polifenoles (mg/kg) 271 Total Polifenoles (mg/kg) 239
79
Muestra 25 (I232) Frantoio Muestra 26 (I235) Frantoio Muestra 27 (I239) Frantoio
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,119 2652 1 12,167 1528 1 11,994 41716
2 16,374 10441 2 16,349 10373 2 16,265 62238
3 22,399 156306 3 22,273 157984 3 22,318 162965
4 23,88 10612 4 23,736 4981 4 23,74 5626
5 26,668 1840 5 26,393 2616 5 26,536 1722
6 27,46 7326 6 27,277 7834 6 27,31 3601
7 32,317 10 7 32,642 41654 7 32,64 165993
8 32,773 153672 8 33,772 1286 8 33,664 1484
9 35,53 923 9 34,859 2526 9 36,594 5210
10 36,188 301 10 35,783 981 10 38,733 470798
11 36,76 3888 11 36,426 2255 11 39,543 119
12 37,598 180831 12 37,448 48534 12 40,084 1434
13 38,497 51778 13 38,338 23711 13 40,525 1877
14 38,87 284703 14 38,694 254658 14 41,235 221119
15 40,21 3576 15 39,568 724 15 43,726 5353
16 41,38 55123 16 40,051 6266 16 45,574 66043
17 42,033 25948 17 41,065 179648 17 48,183 15017
18 42,357 73366 18 43,128 181
19 42,646 67243 19 43,62 2452
20 43,818 1977 20 44,276 1678
21 44,439 2104 21 45,388 34371
22 45,728 14865 22 46,511 5398
23 46,949 35551 23 46,726 10907
24 47,457 18058 24 47,328 2687
25 48,244 88920 25 48,135 60091
Σ Area 1095708 Σ Area 707340 Σ Area 1069350
RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0113 Peso Muestra (gr) 2,0062 Peso Muestra (gr) 2,0357
Total Polifenoles (mg/kg) 269 Total Polifenoles (mg/kg) 172 Total Polifenoles (mg/kg) 249
80
Muestra 28 (I242) Frantoio Muestra 29 (I245) Frantoio Muestra 30 (I247) Frantoio
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 13,391 2982 1 11,998 3650 1 12,186 17475
2 17,953 14181 2 15,892 9152 2 16,354 13369
3 24,292 161207 3 22,019 152423 3 22,487 155968
4 25,743 23193 4 23,486 6427 4 23,701 12245
5 28,583 3072 5 32,747 156667 5 24,653 2155
6 29,325 6889 6 36,469 5812 6 27,449 1360
7 34,702 152410 7 38,767 534094 7 31,886 1320
8 36,959 994 8 41,07 269516 8 32,776 331700
9 37,506 36 9 45,372 36654 9 35,52 119
10 38,717 2158 10 46,749 18179 10 36,2 15971
11 39,533 137720 11 48,217 10923 11 37,641 483603
12 40,466 49191 12 40,252 1992
13 40,829 205071 13 40,702 2531
14 42,154 3139 14 42,644 250116
15 42,616 1469 15 43,835 6485
16 44,583 185010 16 44,437 1979
17 45,746 3226 17 45,23 472
18 46,386 2311 18 45,787 60242
19 47,694 18215 19 48,326 12627
20 48,965 30094 20 48,891 275
Σ Area 841361 Σ Area 1051074 Σ Area 1216036
RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,0151 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0078 Peso Muestra (gr) 2,0024 Peso Muestra (gr) 2,007
Total Polifenoles (mg/kg) 201 Total Polifenoles (mg/kg) 266 Total Polifenoles (mg/kg) 294
81
Muestra 31 (I326) Frantoio
Pick Tiempo de Retención Área
1 12,089 40548
2 16,211 14847
3 22,315 162723
4 23,66 7093
5 26,531 8061
6 27,389 9843
7 31,835 1650
8 32,743 390003
9 35,52 2088
10 36,985 1993
11 38,809 430746
12 40,151 2124
13 42,179 184373
14 43,695 6438
15 44,196 6273
16 44,813 1305
17 45,49 6675
18 46,785 20621
19 47,378 11071
20 48,185 34242
Σ Area 1179994
RRFsir/tir 5,1
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,017
Total Polifenoles (mg/kg) 272
82
Anexo 11
Tabla N°27: Área de Polifenoles Totales de las muestras de variedad Arauco.
Muestra 32 Arauco Muestra 33 Arauco Muestra 34 Arauco
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 8,749 4970 1 11,965 107384 1 11,908 58089
2 13,045 40948 2 16,164 59830 2 16,189 99785
3 19,263 174572 3 22,28 164444 3 22,272 169371
4 20,738 3729 4 23,782 2412 4 23,68 2861
5 22,676 2388 5 26,489 21542 5 26,44 46235
6 23,529 13331 6 27,307 24499 6 27,257 23063
7 30,082 2681 7 32,75 360558 7 32,085 27
8 30,744 30682 8 36,568 882 8 32,664 214991
9 32,432 4922 9 36,955 1876 9 35,295 1295
10 33,13 421 10 37,528 455655 10 36,375 13330
11 33,903 9393 11 42,148 905436 11 37,465 292140
12 34,401 100781 12 43,616 11256 12 40,997 292366
13 36,098 732 13 44,942 28304 13 43,597 5263
14 36,6 2031 14 46,515 303076 14 44,004 893
15 37,104 3571 15 44,348 846
16 37,547 1141 16 44,692 9157
17 37,906 4386 17 45,324 140318
18 38,275 84391 18 47,965 82005
19 41,066 7504
20 41,525 485
21 41,843 10160
22 42,589 107595
23 44,353 3344
24 44,942 78734
25 45,949 12092
26 46,418 739
27 46,781 5656
28 47,982 68388
Σ Area 605195 Σ Area 2282710 Σ Area 1282664
RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0080 Peso Muestra (gr) 2,0393 Peso Muestra (gr) 2,0321
Total Polifenoles (mg/kg) 133 Total Polifenoles (mg/kg) 133 Total Polifenoles (mg/kg) 288
83
Muestra 35 Arauco Muestra 36 Arauco Muestra 37 Arauco
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,355 19239 1 12,284 43431 1 11,899 59799
2 16,59 52018 2 16,481 128263 2 16,309 84367
3 22,644 172019 3 22,641 173884 3 22,49 167112
4 24,099 5882 4 24,14 3303 4 23,99 884
5 26,932 31297 5 26,886 29796 5 26,733 31011
6 27,454 2727 6 27,449 13914 6 27,458 14807
7 33,493 30482 7 32,108 898 7 31,588 1293
8 34,179 4645 8 32,927 177888 8 32,81 235470
9 35,264 469 9 35,692 1164 9 35,083 402
10 35,667 345 10 37,715 423333 10 35,561 276
11 36,353 2399 11 41,552 249035 11 36,257 3780
12 36,93 1946 12 43,977 7391 12 36,752 822
13 37,766 252796 13 44,776 4377 13 37,069 1595
14 39,909 1810 14 45,131 15207 14 37,628 390840
15 40,377 3170 15 45,926 136418 15 40,201 5869
16 41,547 124827 16 47,78 6008 16 40,657 707
17 44,401 4777 17 48,246 20539 17 42,323 293275
18 44,794 271 18 43,828 8176
19 45,197 10145 19 44,589 2409
20 45,941 138440 20 45,023 14292
21 48,252 68420 21 46,653 159136
22 48,129 68824
Σ Ärea 756105 Σ Ärea 1260965 Σ Ärea 1378034
RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0160 Peso Muestra (gr) 2,0212 Peso Muestra (gr) 2,0157
Total Polifenoles (mg/kg) 168 Total Polifenoles (mg/kg) 277 Total Polifenoles (mg/kg) 316
84
Muestra 38 Arauco Muestra 39 Arauco Muestra 40 Arauco
Pick Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área Pick
Tiempo de Retención Área
1 12,48 4957 1 11,847 121281 1 12,458 5174
2 16,119 79029 2 16,023 136766 2 16,631 34579
3 22,367 161254 3 22,214 176004 3 22,692 174012
4 24,024 1402 4 23,585 5061 4 23,8 770
5 26,517 28656 5 26,322 33743 5 26,064 5391
6 27,141 12647 6 27,151 10312 6 26,846 79938
7 32,54 1123 7 32,597 212859 7 27,541 12648
8 33,06 7527 8 34,857 847 8 28,293 6627
9 33,858 3818 9 37,378 392035 9 32,067 309
10 36,087 940 10 42,036 240823 10 32,886 434945
11 36,872 9199 11 44,663 29182 11 35,269 103
12 37,453 321617 12 47,892 235322 12 35,706 781
13 42,561 34881 13 36,327 1759
14 43,146 639 14 36,842 5132
15 44,453 30710 15 37,139 155
16 46,7 117307 16 38,565 517168
17 48,328 30433 17 42,424 411989
18 43,876 28412
19 45,168 783
20 45,9 162706
Σ Area 684885 Σ Area 1418231 Σ Area 1709369
RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1 RRFsir/tir 5,1
Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513 Peso Ácido Siríngico(mg) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0039 Peso Muestra (gr) 2,0233 Peso Muestra (gr) 2,0041
Total Polifenoles (mg/kg) 164 Total Polifenoles (mg/kg) 307 Total Polifenoles (mg/kg) 371
85
Muestra 41 Arauco
Pick Tiempo de Retención Área
1 10,387 2810
2 16,394 5503
4 22,471 167656
5 23,911 458
6 26,714 22668
7 27,446 32574
8 28,164 1993
9 32,774 43386
10 33,906 1035
11 34,576 603
12 35,053 1622
13 35,549 1105
14 36,154 1623
15 36,651 1728
16 36,991 622
17 38,847 259187
18 39,749 2278
19 40,151 4360
20 40,596 4497
21 41,306 117855
22 43,079 29
23 43,193 27
24 43,337 254
25 43,799 19173
26 45,647 70893
27 48,262 21963
Σ Ärea 618246
RRFsir/tir 5,1
Peso Ácido Siríngico(gr) 0,01513
Peso Muestra (gr) 2,0137
Total Polifenoles (mg/kg) 139
86
Anexo 12
Tabla N°28: ANOVA para el contenido de polifenoles totales entre las cuatro
variedades.
Contraste Múltiple de Rango para Polifenoles Totales según Variedad
-------------------------------------------------------------------------------
-
Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey
Variedad Frec. Media Grupos homogéneos
-------------------------------------------------------------------------------
-
Arbequina 15 185,267 X
Picual 6 243,833 X
Frantoio 10 245,0 X
Arauco 10 268,8 X
-------------------------------------------------------------------------------
-
Contraste Diferencias +/- Límites
-------------------------------------------------------------------------------
-
Arauco - Arbequina 83,5333 91,173
Arauco - Frantoio 23,8 99,875
Arauco - Picual 24,9667 115,326
Arbequina - Frantoio -59,7333 91,173
Arbequina - Picual -58,5667 107,877
Frantoio - Picual 1,16667 115,326
-------------------------------------------------------------------------------
-
* indica una diferencia significativa.
