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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
MODALIDAD SEMESTRAL
TEMA:
“EVALUACIÓN DE LA PERMEACIÓN Y RETENCIÓN PERCUTÁNEA DEL
EXTRACTO ACUOSO DE Curcuma longa INCORPORADO A
CRISTALES LÍQUIDOS”
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO
PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
AUTORES
Jennifer Denisse Marcos Centeno
Ximena Mariuxi Molina Vivar
TUTORA
Ph.D. Fernanda Kolenyak, Dos Santos
CO-TUTORA
Ph.D. Carolina Del Rosario Santiago Dugarte
GUAYAQUIL – ECUADOR
2019
U R K U N D
X
Urkund Analysis Result
Anaiysed Document EVALUACIÓN DE LA PERMEACIÓN Y RETENCIÓN PERCUTÁNEA
DEL EXTRACTO ACUOSO DE Cúrcuma tonga INCORPORADO A.docx (D548S6795)
Submltted: 8/16/2019 9:18:00 RM-
Submltted^ [email protected] , ^
SIgnIficance: 0 %
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Instantes where selected sources appear:
xi
DEDICATORIA
Dedico mi trabajo de titulación a mis padres Azucena Centeno y Jorge Marcos que
son motivo de mi fortaleza, enseñándome a nunca rendirme a pesar de las diversidades
que nos pone la vida. Agradezco a mi hermano Jorge Marcos Centeno y a mi novio
Hernán Pástor por guiarme en el camino profesional y enseñarme a tener paciencia en
situaciones difíciles. Gracias a toda mi familia y amigos por no perder la fé en mí; esto
no es el fin, es recién el comienzo de una vida profesional.
Jennifer Marcos
A mi familia
Ximena Molina Vivar
Por el amor, confianza y apoyo incondicional que me permitieron
culminar mi carrera profesional. A los docentes quienes dejaron
una huella indeleble de enseñanza, a los verdaderos amigos que nos
acompañan y celebran nuestro triunfo.
Dedico este proyecto a futuras generaciones, quienes han
despertado su deseo de aprender para entender, porque entender es
ser libre.
xii
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a nuestros docentes de la Facultad de Ciencias Químicas de
la Universidad de Guayaquil, por haber compartido sus conocimientos a lo
largo de la preparación de nuestra profesión, de manera especial, a la PhD
Fernanda Kolenyak, tutora de nuestro proyecto de investigación quien ha
guiado con su paciencia, y su rectitud como docente.
Un sincero agradecimiento a las Dras. Rossana Bair y Beatriz Alvarado,
principales colaboradoras durante el proceso experimental, a la Dra. Rocío
Calero, por autorizarnos realizar el muestreo dentro de su área de cultivo,
también al Profesor Clóvis Ribeiro del Laboratorio de Química Analítica del
Instituto de Ciencias Químicas de La “Universidad Estadual Paulista UNESP”
Araraquara, São Paulo, Brasil, por ceder el laboratorio para la realización de los
análisis térmicos y al MSc. Jovan Alonso Durán por la realización de los
experimentos.
A la Universidad de Guayaquil por ser la sede de todo el conocimiento
adquirido en estos años.
xiii
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN .................................................................................................. xx
ABSTRACT ................................................................................................xxi
INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1
CAPÍTULO l: PROBLEMA ........................................................................... 3
l.1. Planteamiento y Formulación del Problema ......................................... 3
l.2. Justificación e importancia ................................................................... 4
l.3 Hipótesis ............................................................................................... 4
l.4 Objetivos ............................................................................................... 5
l.4.1. Objetivo general............................................................................. 5
l.4.2. Objetivos específicos ..................................................................... 5
l.5. Operacionalización de las variables ..................................................... 6
CAPÍTULO ll MARCO TEÓRICO ................................................................. 7
ll.1. Curcuma longa .................................................................................... 7
ll.2. La piel ............................................................................................... 10
ll.2.1. Epidermis .................................................................................... 10
ll.2.2. Dermis ........................................................................................ 11
ll.2.3. Hipodermis .................................................................................. 11
ll.3. Rutas de absorción de moléculas activas a través de la piel ............. 12
ll.4. Desarrollo de cristales líquidos .......................................................... 13
lll.4.1 Cristales líquidos ......................................................................... 13
ll.4.2. Desarrollo de diagrama de fase ternario ..................................... 16
ll.5. Estudio de cristales líquidos .............................................................. 17
ll.5.1. Microscopía de luz polarizada ..................................................... 17
ll.5.2. Técnica de Calorimetría de Barrido ............................................. 17
ll.5.3. Permeación y retención percutánea ............................................ 18
xiv
II.5.3.1. Validación del método analítico ............................................... 19
CAPÍTULO lll: MATERIALES Y MÉTODOS .............................................. 21
lll.1. Tipo de investigación ........................................................................ 21
lll.2. Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos ....................................... 21
lll.2.1. Equipos ...................................................................................... 21
lll.2.2. Aparatos..................................................................................... 21
lll.2.3. Materiales .................................................................................. 21
lll.2.4. Reactivos ................................................................................... 22
lll.3. Muestra Vegetal ............................................................................... 22
lll.4. Metodología experimental ................................................................ 23
lll.4.1. Construcción del diagrama de fases .......................................... 23
lll.4.2. Estudio de estabilidad ................................................................ 23
lll.4.3. Microscopía de luz polarizada .................................................... 24
lll.4.4.Técnica de Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) ................ 24
lll.4.5. Preparación de la solución stock ................................................ 24
lll.4.6. Validación del método analítico .................................................. 25
lll.4.7. Estudios de permeación y retención percutánea in vitro. ............ 26
lll.4.8. Retención cutánea in vitro .......................................................... 27
lll.4.9. Evaluación de la concentración de Cúrcuma retenido en las
diferentes capas de la epidermis y de la dermis ....................................... 27
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIONES ...................................... 28
IV.1. Diagrama de fases .......................................................................... 28
IV.2. Estudio de estabilidad de los CL ..................................................... 30
IV.3. Microscopía de luz polarizada ......................................................... 32
IV.4. Técnica de Calorimetria Diferencial de Barrido (DSC) ..................... 33
IV.5. Validación del método analítico ....................................................... 36
IV.6. Microscopía de luz polarizada de la CC70C .................................... 39
xv
IV.7. Estudios de Permeación y Retención percutánea in vitro. ............... 40
CONCLUSIONES ....................................................................................... 44
RECOMENDACIONES ............................................................................... 45
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 46
GLOSARIO................................................................................................. 51
ANEXOS .................................................................................................... 52
xvi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Operacionalización de las variables ................................................. 6
Tabla II. Curcuminoides y sus radicales ........................................................ 8
Tabla III. Composición nutricional de la cúrcuma .......................................... 9
Tabla IV. Estructura de la piel con sus características y funciones ............. 11
Tabla V. Reactivos usados en el proyecto .................................................. 22
Tabla VI. Nomenclatura de las muestras .................................................... 23
Tabla VII. Periodos del estudio de estabilidad............................................. 24
Tabla VIII. Concentraciones de composición del diagrama de fase. SF ...... 29
Tabla IX. Estudio de estabilidad de los componentes para los CL. ............. 30
Tabla X. Estudio de estabilidad de los sistemas seleccionados .................. 30
Tabla XI. Calorimetría Diferencial de Barrido en calentamiento .................. 35
Tabla XII. Calorimetría Diferencial de Barrido en enfriamiento .................... 35
Tabla XIII. Valores de la precisión intraday ................................................. 37
Tabla XIV. Valores de Reproducibilidad ...................................................... 37
Tabla XV. Valores de Límite de detección y cuantificación ......................... 39
xvii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Planta de Curcuma longa. .............................................................. 7
Figura 2. Estructura química común de los cucuminoides............................. 8
Figura 3. Estructura de la piel ..................................................................... 10
Figura 4. Rutas de administración de la piel. .............................................. 13
Figura 5. Estructura de Fase Lamelar ......................................................... 14
Figura 6. Estructura de Fase Hexagonal ..................................................... 15
Figura 7. Representación de Diagrama de Fases ....................................... 16
Figura 8. Diagrama de fase ternario ............................................................ 28
Figura 9. Microscopía de luz polarizada del CL70 (A) y CL70C (B)............. 32
Figura 10. DSC de Cúrcuma, Comperlan y Aceite de Coco ........................ 33
Figura 11. DSC de los CL70 y CL70C......................................................... 34
Figura 12. Linealidad .................................................................................. 36
Figura 13. Curva de Especificidad de cúrcuma y buffer .............................. 38
Figura 14. Microscopía de luz polarizada de la CC70C ............................... 40
Figura 15. Permeación percutánea de Curcuma longa ............................... 40
Figura 16. Retención percutánea de CC70C, Cúrcuma y CL70C................ 42
Figura 17. Tejido cutáneo de la oreja de cerdo ........................................... 43
xviii
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo A. Identificación y descripción de la especie por el Herbario Guay .. 52
Anexo B. Descripción taxonómica por el Herbario Guay ............................. 54
Anexo C. Tabla de elaboración de diagrama de fases ................................ 55
Anexo D. Muestras seleccionadas con y sin principio activo ....................... 55
Anexo E. Tabla de absorbancias de especificidad ...................................... 56
xix
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
ABS: Absorbancia
CL: Cristal líquido
CL70C: Cristales líquidos (T:70,O:10,W:20) (T:70,O:20,W:10) con cúrcuma
CL70: Cristales líquidos sin cúrcuma
CC70C: Crema
CV: Coeficiente de variación
DSC: Calorimetría diferencial de barrido
HPLC: Cromatografía líquida de alta eficacia
ICH: Harmonisation of beteer health
LOD: Límite de detección
LOQ: Límite de cuantificación
ME: Microemulsión
O: Aceite
T: Tensoactivo
UV: Ultravioleta
W: Agua
xx
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
“Evaluación de la permeación y retención percutánea del extracto
acuoso de Curcuma longa incorporado a cristales líquidos”
AUTORES: Jennifer Denisse Marcos Centeno Ximena Mariuxi Molina Vivar
TUTORA: Ph.D. Fernanda Kolenyak, Dos Santos
COTUTORA: Ph.D. Carolina Santiago Dugarte
RESUMEN
El estudio evaluó la permeación y retención percutánea del extracto acuoso de
Curcuma longa incorporado a cristales líquidos (CL). Inicialmente, se construyó un
diagrama de fases para identificar la región de interés. Los sistemas se caracterizaron
mediante visualización macroscópica, microscopía de luz polarizada, análisis térmico,
estudio de estabilidad y pH, durante seis meses. El estudio de permeación y retención
percutánea in vitro fue realizado durante 24 horas utilizando tejido de la oreja de cerdo.
Los resultados mostraron la formación de CL en elevadas concentraciones de
tensoactivos. Fue posible incorporar 35% de cúrcuma en el sistema CL-70,
observándose una disminución del pH para los CL con y sin cúrcuma después del
cuarto mes de estudio. Todos los sistemas se mantuvieron transparentes y viscosos,
presentando cruces de malta y estrías característicos de la fase lamelar y hexagonal.
El análisis térmico indico un material cristalino, por la presencia de curvas
(endotérmicos y exotérmicos). La crema desarrollada favoreció la permeación del
principio activo hacia la sangre, lo cual sugiere que los CL son sistemas
nanoestructurados innovadores para la preparación de diferentes formas
farmacéuticas.
Palabras claves: Curcuma longa, cristales líquidos, permeación cutánea, retención
cutánea.
1
INTRODUCCIÓN
La familia Zingiberaceae comprende alrededor de 1.300 especies agrupadas
en 52 géneros, distribuidos en las regiones tropicales y subtropicales del
mundo. En términos generales, son hierbas perennes aromáticas y picantes,
que se caracterizan por poseer hojas dísticas con rizomas de diferentes
colores. Entre los principales representantes de esta familia se encuentran el
jengibre de concha (Alpinia), tulipán de verano (Curcuma alismatifolia), lirio de
jengibre (Hedychium), jengibre (Zingiber officinale), pimienta melegueta
(Aframomum melegueta), cardamomo (Amomum; Elettaria) y cúrcuma
(Curcuma longa) (1).
En Ecuador, esta familia está representada por 6 géneros (principalmente
Renealmia) y 31 especies, ubicadas en los bosques húmedos de tierras bajas y
estribaciones de Los Andes, las cuales se presentan como hierbas robustas,
con inflorescencias, que surgen entre las hojas o en la base de la planta,
conformadas por brácteas que varían de verdes a anaranjadas o rojas (2).
En la actualidad estas especies son ampliamente reconocidas por sus usos
ornamentales, culinarios y medicinales (3). Un ejemplo significativo de ello es
la Curcuma longa, una especie originaria del sudeste asiático, cuyos rizomas
están enriquecidos de curcumina (77%), demetoxicurcumina (17%),
bisdemetoxicurcumina (3%) y metabolitos secundarios (3%) derivados
curcuminoides responsables de su potente actividad antiinflamatoria,
hepatoprotectora, cicatrizante, anticancerígena y antimicrobiana (4).
A nivel nacional existe gran interés en el cultivo a gran escala de C. longa,
debido a los beneficios económicos que generaría la extracción, purificación y
secado del extracto obtenido de los rizomas amarillos de dicha especie, el cual
podría ser empleado en las industrias alimentarias como aditivo en bebidas,
salsas (mostaza), quesos y margarinas (5).
Desafortunadamente, diversos estudios han demostrado que altas dosis del
extracto alcohólico y/o acuoso de C. longa, a través de la administración oral,
pueden generar diversos efectos secundarios, tales como: gastritis, obstrucción
de vías biliares e hipersensibilidad (6). De tal manera que, en los últimos años,
2
las investigaciones sobre esta temática se han enfocado en la búsqueda de
nuevas alternativas para mejorar las limitaciones de estos principios activos (7).
En este sentido, los CL, gracias a sus propiedades anfifílicas, han
demostrado eficacia en la liberación de fármacos a través de las diferentes vías
de administración. Estos sistemas isotrócurvas, son capaces de evitar la
degradación química, disminuir los efectos secundarios y aumentar la
biodisponibilidad de los fármacos (8).
En vista de esto, el desarrollo del presente trabajo tiene como finalidad la
evaluación de la permeación y retención percutánea del extracto acuoso de
Curcuma longa incorporado a cristales líquidos, mediante técnicas avanzadas
in vitro en piel de cerdo y tape stripping respectivamente para su potencial
desarrollo como una alternativa farmacéutica.
3
CAPÍTULO l: PROBLEMA
l.1. Planteamiento y Formulación del Problema
Curcuma longa es una especie ampliamente conocida por sus propiedades
culinarias, cosméticas y medicinales, gracias al alto contenido de
curcuminoides presentes en sus rizomas. Sin embargo, estudios han
demostrado que el uso prolongado y la administración oral de altas dosis de
sus extractos presentan efectos adversos, tales como toxicidad, gastritis,
náuseas, diarrea, alcalosis, entre otros (9).
Ante este panorama, la vía tópica surge como una posible alternativa eficaz
y efectiva para la absorción de innumerables fármacos. Por otro lado, tomando
en cuenta la naturaleza química de los extractos de C. longa, los CL, a partir de
una forma farmacéutica convencional, se podrían emplear como potenciales
transportadores, lo que facilitaría la permeación de dichos principios activos a
través de la piel.
Formulación del problema
De acuerdo con los antecedentes expuestos se plantea el problema de la
investigación:
¿Los cristales líquidos pueden favorecer la permeación y retención
percutánea del extracto acuoso de Curcuma longa?
4
l.2. Justificación e importancia
Los cristales líquidos son sistemas espontáneos, isotrócurvas y
termodinámicamente estables, reconocidos por su alta capacidad de incorporar
compuestos de naturaleza polar y apolar. Diversos estudios han demostrado
las numerosas ventajas que éstos poseen, de las cuales destacan el aumento
de la biodisponibilidad, baja degradación química, direccionamiento de
moléculas hacia un sitio diana, disminución de la toxicidad, y su reducido
tamaño de partículas; esta última facilita el transporte de fármacos por
diferentes vías de administración (10,11,12).
En la actualidad se conocen en el mercado ecuatoriano algunas
presentaciones del extracto acuoso y/o alcohólico de C. longa, las cuales
suelen ser empleadas por vía tópica como estimulador de la circulación
sanguínea. No obstante, sí se considera que la piel, debido a su composición,
actúa como una barrera que impide o dificulta el paso de moléculas hacia la
sangre, el desarrollo de nuevos sistemas que aumenten la absorción cutánea
es de suma importancia para el tratamiento de enfermedades vasculares
agudas y/o crónicas, tales como trombosis venosa profunda (TVP), flebitis y
várices (8,9).
El presente proyecto de investigación centra su interés en la evaluación de la
permeación y retención percutánea del extracto acuoso de Curcuma longa
incorporado a cristales líquidos.
l.3 Hipótesis
Los cristales líquidos serán capaces de favorecer la permeación y retención
percutánea del extracto acuoso de la Curcuma longa.
5
l.4 Objetivos
l.4.1. Objetivo general
Evaluar la permeación y retención percutánea del extracto acuoso de
Curcuma longa incorporado a cristales líquidos.
l.4.2. Objetivos específicos
● Desarrollar el diagrama de fases para la obtención de cristales líquidos
● Caracterizar los cristales líquidos mediante microscopía de luz
polarizada, calorimetría diferencial de barrido y por estudio de estabilidad.
● Cuantificar la concentración de Curcuma longa permeada y retenida por
las diferentes capas de la piel.
6
l.5. Operacionalización de las variables
Variable dependiente
Permeación y retención del principio activo
Variable independiente
Cristales líquidos (CL)
Extracto acuoso de Curcuma longa
Formulación propuesta: crema
Tabla I. Operacionalización de las variables.
Tipo Variables Conceptualización Indicador
Dependientes
Permeación del principio activo
Ensayo in vitro piel de
cerdo Concentración (%)
Tiempo (h)
Retención del principio activo
Ensayo in vitro tape tripping
Concentración (%)
Tiempo (h)
Independientes
Cristales líquidos (CL)
Agua
Aceite
Tensoactivo
Concentración (%)
Extracto acuoso de C. longa
Saturación del sistema
Volumen (mL)
Formulación propuesta: crema
Excipientes Concentración (%)
7
CAPÍTULO ll MARCO TEÓRICO
ll.1. Curcuma longa
Curcuma longa es una planta herbácea que pertenece al Sudeste de Asia y
extendida a África, India y Australia, posee alrededor de 133 especies en todo
el mundo, es proveniente de la familia de las Zingiberáceas, se desarrolla en
climas tropicales o subtropicales (11). Las condiciones adecuadas para el
crecimiento varían entre 20 y 30º C, con altos niveles de luz. La madurez de la
planta ocurre entre 8-10 meses (11,12,13). Presentan grandes rizomas
cilíndricos de coloración que varía de amarillo a anaranjado en su interior, las
hojas parten desde la raíz y su tamaño oscilan entre 90-150 cm. Las flores
presentan una longitud de 10 a 15 cm de largo agrupadas en espigas, no
posee frutos y su coloración es amarilla (12) . La Figura 1 muestra la
representación de la planta Curcuma longa.
Figura 1. Planta de Curcuma longa (12).
Los rizomas de la cúrcuma pueden ser considerados como alimento vegetal
debido a que poseen compuestos fitoquímicos importantes para la salud
humana. Entre los aceites volátiles se encuentran: d-α-felandreno, cinol, el d-
sabinene borneol, sesquiterpenos y el zingibereno (13). La cúrcuma también
posee otros compuestos denominados curcuminoides (cuya estructura química
general se presenta en la Figura 2), entre ellos están la curcumina (77%),
demetoxicurcumina (17%) bisdemetoxicurcumina (3%) y metabolitos
1. Rizoma
2. Hoja
3. Espiga Floral
8
secundarios (3%) (14). Estos pueden ser extraídos en forma de extracto
acuoso, etanólico u oleoso (15).
Figura 2. Estructura química común de los cucuminoides (16).
Los compuestos químicos se diferencian por los radicales R1 y R2, los
cuales pueden ser aldehídos o ácidos carboxílicos (Tabla ll). Diversos estudios
han reportado la separación de estos compuestos curcuminoides por diferentes
técnicas, tales como, la cromatografía líquida de alta eficiencia, cromatografía
de columna, cromatografía de capa fina, entre otros (16,17,18).
Tabla II. Curcuminoides y sus radicales (19).
Compuesto R1 R2
Curcumina OCH3 OCH3
Demetoxicurcumina H OCH3
Bisdemetoxicurcumina H H
La cúrcuma es ampliamente utilizada en la industria cosmética, alimentaria y
farmacéutica; estudiada debido a los más de 100 compuestos activos
presentes en esta planta (19). En el área alimentaria, la cúrcuma fue
introducida en el repositorio de la Food and Drug Administration (FDA) como
conservante y colorante. Su uso como suplemento alimentarrio se debe a los
elevados niveles de proteínas, carbohidratos, fibras totales solubles e
insolubles y baja concentración de contenidos lipídicos (Tabla lll), que confiere
importantes funciones al organismo y ayuda a prevenir enfermedades debido a
sus actividades antioxidante (12). La dosis recomendada para ingesta
nutricional de la cúrcuma es de 300 mg/kg (20).
9
Tabla III. Composición nutricional de la cúrcuma (13).
Nutrientes Unidad Valor por 100g Valor por 3g
Agua g 12,85 0,39
Energía Kcal 312 9
Proteínas g 9,68 0,29
Lípidos totales
(grasas)
g 3,25 0,10
Carbohidratos g 67,14 2,01
Fibra dietética
total
g 22,7 0,7
Azucares
totales
g 3,21 0,10
Varios estudios han reportado importantes actividades terapéuticas de la
cúrcuma provenientes de la curcumina, tales como antidiabética,
hepatoprotectora, antitumoral, antiteratogénica, inmunoestimulante,
antidepresiva, fiebres, infecciones, disentería, hemorragia, trastornos
hepáticos, artritis reumatoide, alergias, sinusitis, congestión estomacal, entre
otros (13,15,17). Sin embargo, se recomienda dosis máximas de 1.200 mg, que
pueden ser divididas en 400 mg por 3 veces al día, ya que la administración de
cúrcuma a dosis superiores produce efectos secundarios, como obstrucción de
las vías biliares, molestias gástricas, efectos tóxicos, entre otros (6,16).
La cúrcuma también presenta considerables actividades terapéuticas en la
administración por vía tópica como antimicrobiana, antifúngica, cicatrizante,
antioxidante y antiinflamatoria (4). Además de ser utilizada para el tratamiento
de acné, psoriasis, dermatitis atópica (eczema), alopecia, fotoenvejecimiento
facial, vitíligo, varices, entre otros (10). Algunos estudios indican que la
actividad antiinflamatoria de la cúrcuma ocurre por la inhibición de la enzima
ciclooxigenasa 2 (COX-2), causante de la producción incrementada de
10
prostaglandina. Ésta es una hormona que cuando es producida en altas
concentraciones es responsable de los procesos inflamatorios (19,20).
ll.2. La piel
La piel es el órgano con mayor superficie del cuerpo humano, responsable
por proteger la estructura corporal interna del ambiente externo como
contaminación, temperatura, humedad y radiación variables. Estas funciones
se deben a la estructura de la piel, que limita la entrada y salida de sustancias
químicas, además de estabilizar la tensión arterial (21). Este órgano está
constituido por tres capas que posee diferentes estructuras, entre ellas:
epidermis, dermis e hipodermis (Figura 3).
Figura 3. Estructura de la piel (21).
ll.2.1. Epidermis
La epidermis es la más superficial formada por múltiples capas (Figura 3), es
considerada la más extensa de la piel, posee alrededor de 95% de células
queratinocitas. Está compuesta por cuatro capas denominadas estrato córneo,
lucido, granuloso, espinoso y germinativo (Tabla IV) (10).
11
Tabla IV. Estructura de la piel con sus características y funciones (10).
Estructura Característica y funciones
Estrato
córneo
Es la capa más externa, es resultado de la
maduración de los queratinocitos, actúa como
principal barrera que limita la absorción cutánea de
moléculas e impide la pérdida de agua corporal.
Estrato lucido Es una delgada capa formado por células eosinófilas
e hialinas aplanadas.
Estrato
granuloso
Está compuesto por dos o tres hileras de células que
produce queratina, ésta es responsable por los
procesos de escamación y formación de la capa
impermeable.
Estrato
espinoso
Está formado por capas que contienen células ricas
en ácido ribonucleico (ARN), responsable por la
síntesis proteica necesaria para la producción de
queratina.
Estrato
germinativo
(basal)
Es la capa más profunda de la epidermis adyacente a
la dermis, es formada por queratinocitos, que se
dividen y generan las demás capas de la piel.
ll.2.2. Dermis
La dermis es la capa más gruesa formada por tejido conjuntivo, localizada en
la parte inferior de la epidermis, está compuesta por una matriz densa de tejido
conectivo, formado por fibras de colágeno y elastina. En este nivel se
encuentran los vasos sanguíneos, como consecuencia los fármacos que
lleguen a la misma podrían pasar a la circulación sistémica (22).
ll.2.3. Hipodermis
La hipodermis es la capa más profunda y espesa de la piel, está unida a la
dermis por fibras de elastina y colágeno, está constituida por adipocitos,
responsables de la producción y almacenamiento de grasas. Su principal
12
función es de amortiguador de golpes, a nivel de absorción de fármacos esta
capa no es relevante (22).
ll.3. Rutas de absorción de moléculas activas a través de la piel
La administración cutánea ha sido estudiada como alternativa farmacéutica
para la absorción de fármacos que presentan algún inconveniente por la vía
oral. Para alcanzar el efecto sistémico, los principios activos deben ser capaces
de atravesar todas las capas de la piel y acceder a los capilares sanguíneos
que irrigan la zona de aplicación, este proceso puede ocurrir por diferentes
rutas, como, por ejemplo: transcelular e intracelular (23).
La permeabilidad de fármacos a través de la piel es determinada por el
coeficiente de partición, coeficiente difusión y coeficiente de permeabilidad. Las
moléculas activas pueden atravesar las diferentes capas de la piel por medio
de difusión de dos principales rutas: intercelular y transcelular. Para que un
fármaco sea absorbido por ambas vías, es necesario que sea difundido a
través de los lípidos intercelulares. Estos presentan una función importante de
barrera protectora del extracto corneo tales como, protección, lubricación,
hidratación, entre otros (23).
En la ruta intercelular, las moléculas activas son transportadas por medio de
la matriz lipídica hacia el torrente sanguíneo, en esta vía ocurre la permeación
de moléculas apolares. La ruta transcelular, sucede a través de células
defectuosas presentes en los lípidos que rodean los corneocitos. Es posible
que esta ruta está asociada con los desosomas que están conectados a los
corneocitos de manera mecánica, esta interacción forma poros hidrofílicos que
es energéticamente desfavorable para la bicapa lipídica del estrato corneo.
Entre los factores que están relacionados con el transporte transcelular se
puede mencionar: el tamaño de las partículas y su grado de liofilia. La Figura 4
muestra una representación esquemática de las vías de permeación
transcelular e intercelular (24).
13
Figura 4. Rutas de administración de la piel (24).
La administración transdérmica puede permitir que un principio activo
alcance el torrente sanguíneo a través del estrato córneo. Para esto, el fármaco
debe cruzar la epidermis y dermis sin que haya acumulación de este en la capa
dérmica (25). Entre las ventajas de esta vía se destacan las siguientes: evita el
efecto de primer paso (hepático e intestinal) y la degradación en el tracto
gastrointestinal por efecto del pH o del metabolismo intestinal; puede
proporcionar niveles terapéuticos constantes; es cómoda para el paciente,
entre otros (26).
La vía dérmica para administración de fármacos ha sido muy investigada
como alternativa de la vía oral. Para favorecer el transporte de moléculas
activas, la ciencia ha avanzado en el desarrollo de los sistemas de liberación
prolongada los cuales poseen la capacidad de liberar un fármaco a una
velocidad constante, por mayor periodo de tiempo. Entre estos sistemas se
puede mencionar a los CL (26).
ll.4. Desarrollo de cristales líquidos
Para este estudio se elaboraron sistemas para obtener la liberación
prolongada de una forma farmacéutica, los cuales se encuentran relacionados
con las diferentes clasificaciones de los CL (27).
lll.4.1 Cristales líquidos
El uso de los CL como sistema de liberación de fármacos ha sido empleado
desde los años 90 del siglo XX (27). Milleret (2017), plantea que una
14
característica importante de estos sistemas es el mantenimiento de su
estructura interna cuando la liberación del fármaco es mediada por difusión
(28). Estos sistemas poseen características compartidas entre una fase líquida
isotrópica y sólida cristalina; su parte líquida determina la orientación del estado
sólido cristalino (8).
En un líquido, los átomos están orientados y ubicados desordenadamente
sin presentar ninguna clase de anisotropía. Un cristal líquido es una estructura
en la cual se encuentran estados de organización con simetría menor que un
cristal y mayor que un líquido (29). Por lo tanto, se presume nuevas
aplicaciones para este estado de la materia, el cual posee características de un
cristal y propias de un líquido.
Estos sistemas pueden presentar diferentes fases, tales como: cúbicas,
hexagonales y lamerales, esta clasificación va a depender de la disposición de
la molécula de los surfactantes. Es importante mencionar que el presente
proyecto está basado en la caracterización de CL de fase lamelar y hexagonal
(29).
ll.4.1.1 Fase Lamelar
La estructura lamelar está constituida por elementos reticulados lamelares
de una a tres dimensiones de manera ordenada y compacta en su estructura,
como se observa en la Figura 5 (29). Así también, posee una textura
característica que indica la presencia de CL liotrócurvas. La fase lamelar de los
CL es similar a las estructuras de las diferentes capas de la piel (estrato corneo
y epidermis). Su composición puede interaccionar con los principios activos y
facilitar la hidratación de la piel (30).
Figura 5. Estructura de Fase Lamelar (30).
15
Algunos estudios sugieren el desarrollo de CL de fase lamelar que son
empleados para aumentar la penetración de fármacos hidrófilos o lipófilos en la
piel, a diferencia de la fase hexagonal, que presenta un potencial de
penetración menor (8,27,28). La capacidad de penetración de la fase lamelar
es atribuida principalmente a dos mecanismos diferentes: 1) una alta
concentración de agente tensoactivo promueve la mayor cantidad de fármaco
disuelto y, en efecto, una mayor actividad termodinámica, y 2) un efecto
potenciador de la penetración individual en los constituyentes de la formulación
(31).
ll.4.1.2. Fase Hexagonal
La fase hexagonal está constituida por cilindros largos, con micelas en forma
de varilla rodeadas por una región de agua continua. Esta fase depende de la
cantidad de agua y de la temperatura para obtener una orientación
perpendicular y un completo desorden en su estructura, como se muestra en la
Figura 6. Por lo tanto, se encontrará cadenas elongadas con libre rotación y
cadenas con un enrollamiento helicoidal que forman hélices en la estructura de
los CL (32).
Figura 6. Estructura de Fase Hexagonal (32).
Los cambios de las fases hexagonales y lamelares, pueden ocurrir debido a
las variaciones de concentración de los solventes agregados. Para determinar
la concentración exacta de los componentes del sistema necesarios para
formar los CL, es imprescindible elaborar un diagrama ternario de fases.
16
ll.4.2. Desarrollo de diagrama de fase ternario
Un diagrama de fases es una representación triangular de componentes
ternarios en una mezcla, cada vértice del triángulo representa el 100% de uno
de los compuestos, mientras que la arista opuesta representa el 0% del mismo.
Son utilizados para demostrar las proporciones adecuadas de cada solvente,
capaz de generar un equilibrio del sistema (33).
Figura 7. Representación de Diagrama de Fases
La construcción de diagramas de fases puede ser aplicadas a diferentes
ramas, por ejemplo: estudios como la aplicación del campo nuclear, en el área
química, en tecnología de alimentos, en desarrollo de sistemas de liberación
prolongada de fármacos. Los diagramas de fases son empleados para la
elaboración de CL, en los cuales se combina diferentes proporciones de agua,
aceite, tensoactivo y/o co-tensoactivos, para esto se realizan mezclas de los
solventes hasta obtener una solución transparente. Las estructuras internas de
los CL pueden ser evaluadas por la técnica de microscopía de luz polarizada, la
cual indica la formación de estrías para sistemas hexagonales y cruces de
malta para fases lamelares (34).
17
ll.5. Estudio de cristales líquidos
En el presente trabajo es necesario implementar diferentes técnicas que
permitan identificar, caracterizar y cuantificar los CL, tales como: Microscopía
de Luz Polarizada, Calorimetría de Barrido, permeación y retención.
ll.5.1. Microscopía de luz polarizada
La microscopía de luz polarizada (MLP) es una técnica que emite ondas
transversales de luz. El campo electromagnético oscila perpendicular en una
dirección programada y genera un estado de polarización de la luz. La MLP es
un método simple, económico y bien establecido que permite caracterizar
materiales con propiedades anisotrópicas que poseen birrefrigencia. La técnica
de microscopía de luz polarizada ha sido ampliamente utilizada para la
evaluación de CL, ya que estos tienden a mostrar formas y geometrías que
ayudan en su identificación morfológica (32,35).
García ,et al. (2019), utilizaron la técnica de microscopía de luz polarizada
para la identificación de fases isotrópicas de CL liotrócurvas. En esta
publicación, los autores observaron diferentes estructuras hexagonales y
lamelares de los CL cuando el sistema fue evaluado a bajas temperaturas. Por
otra parte, con el aumento de la temperatura, se observó un campo oscuro.
Con los resultados presentados, se argumentó que las condiciones de
temperatura y birrefrigencia óptica son importantes para la identificación de
estructuras cristalinas (36).
Rajabalaya (2017) evaluaron la influencia de tensoactivos en la preparación
de emulsiones y CL de fase lamelar, los resultados de microscopía de luz
polarizada mostraron la presencia de cruces de malta y gotas de aceite que
indican CL de fase lamelar y emulsiones respectivamente (37).
ll.5.2. Técnica de Calorimetría de Barrido
La tecnología de calorimetría de barrido (DSC) es una técnica utilizada para
la identificación de cambios de fases de materiales a través del
comportamiento térmico como la fusión, cristalización, transición vítrea y la
entalpia (36). Para el área farmacéutica este método es importante para el
conocimiento del almacenamiento térmico, ya que la temperatura puede afectar
la estructura e indicar posibles interacciones entre fármaco/fármaco o
18
fármaco/excipiente (38). Otra información importante que puede brindar el DSC
es la característica cristalina o amorfa de un sólido. Kolenyak-Santos ,et al.
(2014), evaluó el DSC de praziquantel incorporado a portadores lipídicos
nanoestructurados (NLC); los resultados mostraron que el curva del fármaco
desapareció cuando éste fue agregado a los sistemas, posiblemente debido a
una interacción del praziquantel con los NLC (39). Por otra parte, Alwadei ,et al.
(2019), desarrollaron un sistema autoemulsificante para la incorporación de
cúrcuma. En el análisis de DSC, se observó un curva de fusión a 176 ºC para
la C. longa libre, el cual desapareció cuando el fármaco fue incorporado al
sistema. Los autores plantean que la estructura de la cúrcuma cambio a un
estado amorfo (40).
ll.5.3. Permeación y retención percutánea
En los últimos años los CL, han sido empleados para la administración
tópica de fármacos, debido a la facilidad de traspasar las capas de la piel lo
que puede favorecer la absorción en el torrente sanguíneo. Los estudios de
permeación y retención in vitro son ampliamente utilizados para evaluar la
difusión transdérmica de los fármacos presentes en una formulación (41).
Los ensayos de permeación y retención pueden ser realizados en tres
biomodelos: humanos, roedores y cerdo. La utilización de la piel humana y de
roedores requiere la aprobación del comité de ética, lo cual limita los estudios
debido al tiempo de espera para la aprobación del protocolo. En este sentido,
se utiliza de forma convencional la oreja de porcino, por tratarse de una
especie para el consumo humano (41).
El mecanismo de penetración de moléculas activas dependerá del tipo de
lípido, tensoactivo, concentración de potenciador de permeación, tamaño,
forma, elasticidad, entre otros. Las partículas con > 600nm no son capaces de
atravesar las diferentes capas de la piel, mientras que las partículas <300 nm
pueden penetrar con facilidad las capas más profundas de la piel (23).
Para corroborar los resultados de análisis de permeación y retención
percutánea, es necesario constatar la validación de un método analítico que
cumpla con los parámetros estandarizados.
19
II.5.3.1. Validación del método analítico
La validación es un conjunto de técnicas empleadas para determinar que un
procedimiento analítico es confiable y adecuado para la finalidad pretendida,
para esto, es necesario seguir un plan que permita alcanzar los límites de
aceptación USP NF40; ICH 2005 (42). La USP NF40 e ICH 2005 estipulan
parámetros de que deben ser cumplidos para validar un método, tales como la
linealidad, Reproducibilidad, precisión, exactitud límites de detección y
cuantificación, entre otros (43). A continuación, se detalla cada parámetro:
Linealidad: es definida como la capacidad de un método analítico
brindar respuestas relacionadas con la concentración de un analito
dentro de un rango establecido, para esto se calcula un coeficiente de
correlación el cual se considera 1 como el ajuste adecuado de una
recta.
Exactitud: Es un parámetro que indican que los resultados obtenidos
están de acuerdos o aproximados a los valores reales.
Precisión: En este parámetro se evalúa la concordancia de las
respuestas o resultados individuales del experimento, ésta es
expresada a través de la desviación estándar y coeficientes de
variación en diferentes mediciones.
Límite de detección: Demuestra la concentración mínima de un
analito que puede ser detectado, pero no necesariamente
cuantificado.
Límite de cuantificación: Indica la concentración mínima de un
analito que puede ser cuantificado.
Las técnicas de espectrofotometría y cromatografía han sido ampliamente
utilizadas para la cuantificación de fármacos (44). Purohit ,et al. (2014)
validaron un método analítico por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)
para la cuantificación de cúrcuma y ácido gálico en diferentes formulaciones.
En este trabajo, los autores demuestran la importancia de la validación de un
método analítico para cuantificar con precisión las concentraciones de los
principios activos evaluados (45).
20
Para el desarrollo de un nuevo medicamento, la validación de un método es
imprescindible para cuantificar con precisión la concentración del principio
activo presente en la forma farmacéutica; además permite cuantificar la
absorción y permeación del fármaco (46).
21
CAPÍTULO lll: MATERIALES Y MÉTODOS
lll.1. Tipo de investigación
El presente trabajo con lleva estudio experimental del extracto acuoso de la
Curcuma longa, desarrollado en el laboratorio de Tecnología Farmacéutica y el
Laboratorio de Análisis de Medicamentos en la Facultad de Ciencias Químicas
de la Universidad de Guayaquil. La caracterización de los sistemas
desarrollados se llevó a cabo mediante la construcción de un diagrama de
fases, estudios de estabilidad, análisis por Microscopía de Luz Polarizada y
Calorimetría Diferencial de Barrido. Los ensayos de retención y permeación
percutánea fueron realizados de acuerdo con la metodología reportado por los
autores Baque y Reyes.
lll.2. Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos
lll.2.1. Equipos
Espectrofotómetro (UV-VIS) marca HITACHI U-2900
Balanza analítica (Mettler Toledo®)
Microscópio de luz polarizada (Leica® DMLP microscope)
Baño María
DSC (Mettler DSC1)
Permeador Mocon (Ametek Aquatran)
lll.2.2. Aparatos
Vórtex (IKA®)
Hornilla eléctrica HACEB EM-1
Extractor
pH-metro (Boeco®)
lll.2.3. Materiales
Beakers (50-500mL)
Cinta Scoth 750 3M
Embudos de vidrio (cuello corto)
Espátula
Frascos (30 mL)
22
Jeringas (10 mL)
Pipeta automática (1000 L)
Pipeta volumétrica (1-10 mL)
Auxiliar de pipetas
Probeta graduadas (1000mL)
Probeta graduada (500 mL)
Mangueras
Matraz (2000 mL)
Matraz (150 mL)
Matraz (10 mL)
Mortero
Placas Petri
Tijeras
Vidrio de reloj
lll.2.4. Reactivos
Tabla V. Reactivos usados en el proyecto
Elaboración de los CL Validación del método analítico
Comperlan Fosfato monobásico de potasio dihidrogenado
Aceite de coco Metanol
Agua destilada Ácido Clorhídrico (HCl) concentrado
lll.3. Muestra Vegetal
La especie vegetal fue descrita e identificada por el M.Sc. Xavier Cornejo,
curador del Herbario GUAY de la Facultad de Ciencias Naturales de la
Universidad de Guayaquil, donde se reportó la muestra vegetal como Curcuma
longa L.
La muestra vegetal fue colectada manualmente en el cantón La Troncal en el
Recinto Zhucay, cuya ubicación de coordenadas corresponde a FMMF+Q5
Zhucay -2.5155158042907715, -79.32709503179828. Una vez colectada la
23
especie vegetal Curcuma longa L. se procedió a obtener el extracto acuoso de
la misma, realizada la extracción, fue transportada al Laboratorio de Tecnología
Farmacéutica de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de
Guayaquil, obteniendo las condiciones adecuadas para el almacenamiento de
la muestra que se empleó para el desarrollo del presente trabajo de
investigación.
Para un mayor entendimiento en la lectura del proyecto, en la tabla VI se
redacta las nomenclaturas de las muestras utilizadas en el experimento.
Tabla VI. Nomenclatura de las muestras
Formulación Nomenclatura
Cristales líquidos (T:70,O:10,W:20)
con cúrcuma
CL70C
Cristales líquidos (T:70,O:20,W:10)
sin cúrcuma
CL70
Crema CC70C
Cristales líquidos CL
lll.4. Metodología experimental
lll.4.1. Construcción del diagrama de fases
El diagrama de fase fue desarrollado de acuerdo con lo descrito por Grusko
(2018); en este caso, se utilizaron mezclas de aceite de coco, comperlan
(tensoactivo) y agua, en diferentes concentraciones con la finalidad de
encontrar la región de CL (47). Las muestras de CL fueron mantenidas a 25.0 ±
0.1 °C durante 24 horas para completar el equilibrio del sistema.
lll.4.2. Estudio de estabilidad
En los sistemas desarrollados y seleccionados se realizaron los ensayos de
estabilidad a 25.0 ± 0.1°C durante seis meses. Los periodos de tiempos
evaluados se muestran en la Tabla VIl. En este proyecto se analizaron la
estructura microscópica y las características macroscópicas, como parte del
24
estudio de estabilidad. Posteriormente, se evaluaron las variaciones de pH y se
estudió la solubilidad incorporando Curcuma longa en los CL en dosis
sucesivas de 0,01 mL del extracto acuoso hasta la saturación del sistema.
Tabla VII. Periodos del estudio de estabilidad
Estabilidad Tiempo
T0 24 horas
T1 15 días
T2 1 mes
T3 2 meses
T4 4 meses
T5 6 meses
lll.4.3. Microscopía de luz polarizada
Las estructuras de los CL fueron observadas por un fotomicroscopio
(Microscopio Leica DMLP), para investigar la presencia de la fase cristalina
líquida en cada muestra. El fotomicroscopio estuvo equipado con una cámara:
primero, bajo el campo brillante y, en segundo lugar, bajo luz polarizada
(usando polarizadores cruzados). Se empleó el software Leica IM 1000 para
analizar las micrografías obtenidas.
lll.4.4.Técnica de Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)
El análisis DSC se realizó por medio del equipo Mettler Toledo DSC1, con un
software STAR®, se evaluó la temperatura de fusión y la entalpia. Para este
estudio, se colectaron 4,0 mg de muestra, las cuales fueron llevadas de 25 °C a
-80 °C y de -80°C hasta 120°C.
lll.4.5. Preparación de la solución stock
Se preparó una solución de 100 µg/mL de cúrcuma diluida con metanol en
un matraz de 100 mL.
25
lll.4.6. Validación del método analítico
Para la cuantificación de la cúrcuma permeada, se procedió en validar un
método analítico por espectrofotometría de ultravioleta (UV) de acuerdo con los
parámetros de la ICH (2005) y USP-NF38 (2015). Los parámetros evaluados
fueron: linealidad, precisión, Reproducibilidad, especificidad, límites de
detección (LOD) y cuantificación (LOQ). Las lecturas fueron realizadas a una
longitud de onda de 421 nm que representa el punto de mayor absorción para
la Curcuma longa.
Linealidad
La linealidad fue realizada en seis concentraciones diferentes por triplicado,
siendo 0,005, 0,010, 0,015, 0,020, 0,025 y 0,030 µg/mL a partir de la solución
stock. Con los resultados obtenidos se evaluó la regresión lineal calculada por
el método de mínimos cuadrados, los criterios de aceptación fueron
determinados según el estipulado por la ICH (2005).
Precisión
- Repetibilidad
La presicion intraday se efectuó de acuerdo a lo estipulado a la ICH (2005).
Se procedió a evaluar las concentraciones máxima (0,030 µg/mL), media
(0,015 µg/mL) y mínima (0,005 µg/mL). Los ensayos evaluados fueron
realizados por triplicado y el criterio de aceptación es de 2% para el coeficiente
de variación.
- Reproducibilidad
El análisis se efectuó en diferentes días, para ello se procedió a realizar las
lecturas por triplicado con la concentración media de la curva (0,015 µg/mL)
con diferente analista. El criterio de aceptación fue ≤ 2 % para el coeficiente de
variación.
Especificidad
Se evaluó la ausencia de interferentes por parte de los excipientes de la
formulación, lo cual se realizó las lecturas del buffer fosfato monobásico de
potasio dihidrogenado (pH: 7,4) con y sin solución acuosa de cúrcuma.
Límite de detección
26
El límite de detección (LOD) se calculó empleando la Ecuación 1 presentada
en el ICH Q2 (2005).
𝐿𝑂𝐷=3.3σS
Ecuación 1
Donde,
LOD límite de detección
σ es la desviación estándar del intercepto
S es la pendiente de la curva de calibración
Límite de Cuantificación
El límite de cuantificación se calcula empleado la siguiente ecuación
presentada en el ICH Q2 (2005).
𝐿𝑂Q=10σS
Donde,
LOQ límite de cuantificación
σ es la desviación estándar del intercepto
S es la pendiente de la curva de calibración
lll.4.7. Estudios de permeación y retención percutánea in vitro.
Los ensayos de permeación y retención cutánea in vitro de los sistemas
seleccionados fueron realizados utilizando piel de oreja de cerdo, para ello, las
orejas fueron lavadas y removido los pelos en exceso con la ayuda de una
tijera. Las orejas fueron disecadas separando la piel del cartílago con la ayuda
de una lámina y luego separada del tejido adiposo. Antes del ensayo, las pieles
se hidrataron, y se recortaron en tamaños pequeños para los ensayos de
permeabilidad cutánea. Los tejidos recortados se colocaron en la célula de
difusión con el lado de la dermis hacia abajo poniéndose en contacto con la
solución receptora y en la parte superior de la región del estrato córneo, se
añadió la formulación.
27
lll.4.8. Retención cutánea in vitro
De acuerdo al procedimiento señalado por Ventura (2016), la piel quedó
expuesta en las condiciones experimentales de la permeación cutánea in vitro
(48). Posteriormente, las pieles fueron retiradas de la célula de difusión y
fueron fijadas en una superficie lisa. Finalmente, en el área expuesta a la
formulación (2,00 cm2) se realizó la técnica tape stripping. En estos ensayos,
se utlizaron 16 cintas adhesivas (Scoth 750 3M), siendo la primera utilizada
para la remoción del exceso de la muestra, la cual fue descartada. Las 15
cintas adhesivas (Scoth 750 3M) restantes, se colocaron en un envase que
contiene 5 mL de metanol, se agitaron en vórtex por 2 minutos y
posteriormente colocadas en lavadora ultrasónica por 30 minutos. La solución
fue cuantificada por espectrofotometría ultravioleta a una longitud de onda de
421 nm utilizando como blanco buffer, los resultados del ensayo de retención in
vitro sirvieron para evaluar la concentración de cúrcuma retenida en el estrato
córneo.
lll.4.9. Evaluación de la concentración de Cúrcuma retenido en las
diferentes capas de la epidermis y de la dermis
Pasado el período del estudio de permeación cutánea, las pieles fueron
cortadas en trozos muy pequeños, y llevadas a un envase con 5 mL de
metanol, se agitó en vórtex por 2 minutos. Posteriormente la solución fue
cuantificada por espectrofotometría ultravioleta a una longitud de onda 421 nm
utilizando como blanco buffer.
El estudio de permeación, retención cutánea y la evaluación de la
concentración de cúrcuma retenido en las diferentes capas de la epidermis y de
la dermis se realizó en el Laboratorio de Medicamentos de la Facultad.
28
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIONES
IV.1. Diagrama de fases
La Figura 8 muestra la formación de diferentes sistemas en el diagrama de
fases.
Figura 8. Diagrama de fase ternario
Es posible observar la formación de diferentes sistemas de acuerdo a la
concentración de agua, aceite y tensoactivo. El diagrama de fases es una
representación gráfica capaz de proporcionar conocimientos generales sobre
las transiciones de fases (49). De acuerdo con esto, se observaron tres
regiones diferentes: separación de fases, CL en su fase hexagonal y
microemulsión. Los sistemas seleccionados fueron el CL70 y CL80, lo cual
presentaron una mayor formación de estrías en su estructura a diferencia de
29
los otros sistemas. Las composiciones del diagrama de fases se enumeran en
la Tabla VIIl.
Tabla VIII. Concentraciones de composición del diagrama de fase. SF
(separación de fase), CL (cristales líquidos), ME (microemulsión), T
(tensoactivo), O (aceite) y W (agua)
SF-T SF-O SF-W CL-T CL-O CL-W ME-T ME-O ME-W
10 10 80 40 10 50 50 10 40
10 20 70 40 20 40 50 20 30
10 30 60 40 30 30
10 40 50 40 40 20
10 50 40 40 50 10
10 60 30 50 30 20
10 70 20 50 40 10
10 80 10 60 10 30
20 10 70 60 20 20
20 20 60 60 30 10
20 30 50 70 10 20
20 40 40 70 20 10
20 50 30 80 10 10
20 60 20
20 70 10
30 10 60
30 20 50
30 30 40
30 40 30
30 50 20
30
30 60 10
IV.2. Estudio de estabilidad de los CL
Para facilitar la interpretación de los resultados de estabilidad por pH se
procedió a medir el pH de los componentes de la formulación, como se
presenta en la Tabla lX.
Tabla IX. Estudio de estabilidad de componentes para el desarrollo de CL.
Se determinó el estudio de estabilidad de los sistemas CL70 y CL80 (con y
sin principio activo) durante seis meses a temperatura ambiente. Se evaluaron
parámetros, tales como: aspecto, pH y microscopía de luz polarizada. De
acuerdo a los resultados obtenidos, las materias primas y formulaciones se
mantienen estables dentro del periodo de tiempo estudiado. La Tabla X exhibe
los resultados del estudio de estabilidad.
Tabla X. Estudio de estabilidad de los sistemas seleccionados
Estabilidad Muestra O
(%) W
(%) Aspecto pH. Microscopía
T0
CL70 10 20 Sistema
homogéneo estable
11,32 Estrías
20 10 11,43 Estrías
CL70C 10 20 Sistema
homogéneo estable
10,41 Estrías
20 10 10,90 Estrías
CL80 10 10 Sistema homogéneo
estable
11,21 Estrías
CL80C 10 10 10,05 Estrías
T1 CL70
10 20 Sistema homogéneo
estable
10,30 Estrías
20 10 10,90 Estrías
Componente pH.
Solución acuosa de cúrcuma 5,71
Aceite de coco 6,08
Agua destilada 7,55
Comperlan 10,10
31
CL70C 10 20 Sistema
homogéneo estable
10,70 Estrías
20 10 10,32 Estrías
CL80 10 10 Sistema homogéneo
estable
10,82 Estrías
CL80C 10 10 10,52 Estrías
T2
CL70 10 20 Sistema
homogéneo estable
10,70 Estrías
20 10 10,76 Estrías
CL70C 10 20 Sistema
homogéneo estable
10,08 Estrías
20 10 10,36 Estrías
CL80 10 10 Sistema homogéneo
estable
10,14 Estrías
CL80C 10 10 10,18 Estrías
T3
CL70 10 20 Sistema
homogéneo estable
9,80 Estrías
20 10 10,00 Estrías
CL70C 10 20 Sistema
homogéneo estable
9,90 Estrías
20 10 10,00 Estrías
CL80 10 10 Sistema homogéneo
estable
9,10 Estrías
CL80C 10 10 9,70 Estrías
T4
CL70 10 20 Sistema
homogéneo estable
9,24 Estrías
20 10 9,33 Estrías
CL70C 10 20 Sistema
homogéneo estable
9,12 Estrías
20 10 9,13 Estrías
CL80 10 10 Sistema homogéneo
estable
8,95 Estrías
CL80C 10 10 8,71 Estrías
T5
CL70 10 20 Sistema
homogéneo estable
9,07 Estrías
20 10 8,83 Estrías
CL70C 10 20 Sistema
homogéneo estable
9,00 Estrías
20 10 9,30 Estrías
CL80 10 10 Sistema homogéneo
estable
9,35 Estrías
CL80C 10 10 9,76 Estrías
De acuerdo con la Tabla X se observa que no hubo cambio estructural de los
sistemas CL70, CL70C, CL80 y CL80C, todas las muestras presentaron estrías
durante los seis meses. En los tiempos T0-T5 las muestras presentaron una
variación de pH alcalino, lo que sugiere un predominio del comperlan sobre la
32
formula, debido probablemente a la concentración elevada del tensoactivo. La
adición de cúrcuma logró disminuir los valores de pH para todos los periodos
de tiempo, posiblemente porque el principio activo interacciona con los cristales
líquidos. La disminución del pH ayudaría a mejorar la estabilidad para estos
sistemas.
IV.3. Microscopía de luz polarizada
La microscopía de luz polarizada (PLM) es un método sencillo que facilita la
detección e identificación de CL (31). En la Figura 9 se observa la microscopía
de luz polarizada para los sistemas CL70; hace referencia a la muestra sin
cúrcuma y CL70C; el cual contiene extracto acuoso de cúrcuma.
Figura 9. Microscopía de luz polarizada del CL70 (A) y CL70C (B)
Es posible observar la presencia de estrías para los CL70 (A) y CL70C (B),
lo que sugiere la formación de CL de fase hexagonal. Estos presentan una
estructura ordenada en micelas cilíndricas (33). En la microscopía, la fase
hexagonal es caracterizada por bandas de birrefrigencia de aspecto columnar
(50). Los autores Oyafuso y Carvalho (2017), desarrollaron CL para la
liberación prolongada de dexametasona, los resultados evidenciaron la
formación de estrías en los análisis de microscopía de luz polarizada,
sugiriendo la formación de CL de fase hexagonal (49).
A B
33
IV.4. Técnica de Calorimetria Diferencial de Barrido (DSC)
La Calorimetria Diferencial de Barrido (DSC) es una técnica analítica que
permite evaluar el comportamiento térmico de una muestra (Figura 10 y 11), en
el cual se obtienen diferentes informaciones, tales como la temperatura de
fusión, entalpia y transición vítrea (51). El comportamiento endotérmico de las
muestras se presenta en la Tabla Xl, en donde el curva A y B representan el
punto exotérmico y endotérmico respectivamente. Los resultados del
comportamiento exotérmico se evidencian en la Tabla Xll.
Figura 10. DSC de Cúrcuma, Comperlan y Aceite de Coco.
Se observa en la Figura 10 los gráficos del DSC de los componentes
utilizados en la preparación de los CL. En la curva de calentamiento, la
cúrcuma presenta dos curvas endotérmicas, el primero (A) sugiere la forma
cristalina, seguido de evaporación de agua (B). La curva de enfriamiento
presenta una curva angosta que representa una reacción exotérmica, indicando
EN
DO
A
B
B
EN
DO
EN
DO
34
que la cúrcuma presenta una forma cristalina. Mientras que el comperlan
presentó dos curvas de fusiones (A y B) y un curva exotérmico. Adicionalmente
el aceite de coco no presentó curvas endo y exotérmico, lo que sugiere que el
material posee una estructura no cristalina, debido a la presencia de ácidos
grasos.
Figura 11. DSC de los CL70 y CL70C.
En la Figura 11 se observa que los CL70 presentan un comportamiento
semejante al comperlan (Figura 10), lo que pudiera relacionarse con una
interacción del tensoactivo con la matriz del sistema. La adición de cúrcuma
llevó a la formación de una nueva curva de fusión endotérmica, lo cual tiene
relación por una interacción con el sistema, posiblemente debido a que el
principio activo este encapsulado en la matriz del sistema. Kolenyak y Oliveira
(2015), desarrollaron nanopartículas lipídicas como estrategia para mejorar la
actividad in vitro esquistomicida del praziquantel (39). Los autores mencionan
que los resultados de DSC mostraron un nuevo evento de fusión, con esto,
sugieren la interacción del fármaco con la matriz del sistema.
EN
DO
EN
DO
35
Tabla XI. Calorimetría Diferencial de Barrido en calentamiento.
Tabla XII. Calorimetría Diferencial de Barrido en enfriamiento.
Se observa que la cúrcuma presenta un evento de fusión endotérmico inicial
en -0.54 °C y la transición para el estado líquido ocurre en 4,99 °C. La entalpía
de la reacción fue de 165,17 Jg-1 lo que muestra una reacción endotérmica. El
enfriamiento exhibió una curva de fusión exotérmica con una entalpía de
183,77Jg-1. Los CL70 presentan un evento de fusión endotérmico inicial -38,88
°C y la transición para el estado líquido ocurre en -24,88 °C. La entalpía de la
reacción fue de 8,47 Jg-1 lo que muestra una reacción endotérmica. El
enfriamiento exhibió una curva de fusión exotérmica con una entalpía de -2,78
Jg-1.
Calentamiento (Eventos endotérmicos)
Componentes
Curva Inicio EntalpÍa
Cúrcuma 4,99 °C -0.54 °C 165,17 Jg-1
CL70C 68,68 °C 52,79 °C 149,05 Jg-1
CL70 -24,88 °C -38,88 °C 8,47 Jg-1
Comperlan A B A B A B
-23,06°C 43,87°C -42,92°C 36,53°C -18,13 Jg-1
-8,38 Jg
-1
Aceite de Coco -------------- ------------- -------------
Enfriamiento (Eventos exotérmico)
Componentes Curva Inicio EntalpÍa
Cúrcuma -13,97°C -13,58°C -183,77 Jg-1
CL70C -------------- ------------- -------------
CL -15,77 °C -14,00 °C -2,78 Jg-1
Comperlan -15,25°C -13,36°C -4,28 Jg-1
Aceite de Coco -------------- ------------- -------------
36
IV.5. Validación del método analítico
Para la cuantificación del extracto acuoso de cúrcuma, se procedió a validar
un método analítico de acuerdo con los parámetros de la ICH (2005) y USP-
NF38 (2015).
Linealidad
La linealidad es un parámetro que indican resultados directamente
proporcionales a la concentración del analito (52).
Figura 12. Linealidad.
El parámetro de linealidad fue analizado mediante el coeficiente de
correlación lineal (R ≥ 0.9990). La Figura 12 demuestra la linealidad expresada
por la concentración del extracto acuoso de cúrcuma en relación con el grado
de dilución de la solución stock. Estos valores van de acuerdo con la ICH 2005,
que determina que el valor mínimo aceptable es de R= 0,99. La Linealidad en
comparación con otros estudios se obtuvieron excelentes correlaciones lineales
entre la absorbancia y la concentración en el rango seleccionado entre 0,005 a
0,025 µL/m con un coeficiente de correlación (43).
y = 5,2091x + 0,0016 R = 0,998
0,0000
0,0200
0,0400
0,0600
0,0800
0,1000
0,1200
0,1400
0,1600
0,1800
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035
Ab
so
rban
cia
(n
m)
Concentración (µL/mL)
37
Precisión
- Repetibilidad (intraday)
La precisión es una medida que demuestra el grado de concordancia entre
mediciones replicadas de la misma cantidad, también se lo puede expresar
como: rango, desviación estándar y porcentaje de coeficiente de variación. La
Tabla XIIl exhibe los datos de la precisión intraday (53).
Tabla XIII. Valores de la precisión intraday
Concentración Abs
Promedio Abs
DS (±) CV (%)
0,005 0,0270 0,0015 0,0578
0,015 0,0784 0,0006 0,0074
0,030 0,2629 0,1934 0,4051
El parámetro de precisión se basó en los ensayo intraday; en donde la
operación se realiza en la misma sesión, es decir, en el mismo día por
triplicado a tres concentraciones diferentes 0,005 ug/mL (mínima), 0,015
ug/mL (media), 0,030 ug/mL (máxima). Los datos obtenidos en la Tabla XIIl
demuestran que el método es preciso para la cuantificación del extracto acuoso
de cúrcuma, teniendo valores inferiores al 0,5%. Según la ICH 2005 indica que
los resultados deben ser menor al 3,0%.
- Reproducibilidad (interday)
El estudio se apoyó en los ensayos interday; cuya operación se evalúa en
diferentes días, en la cual se evidenció la fiabilidad del análisis en relación a la
reproducción del parámetro distintos analistas (52).
Tabla XIV. Valores de Reproducibilidad
Concentración: Buffer 7,4
0,015 ug/mL
Promedio
(Abs)
DS
(±)
CV
(%)
Analista 1
0,0820 0,0009 1,1115
0,0849 0,0011 1,3833
38
0,0856 0,0012 1,4114
0,0818 0,0008 1,0524
Analista 2
0,0847 0,0007 0,0088
0,0804 0,0008 0,0090
0,0830 0,0004 0,0046
0,0830 0,0006 0,0072
La Tabla XIV evidencia que la técnica de reproducibilidad indica resultados
óptimos para el método, obteniendo resultados inferiores al 3,0%.
Especificidad
La especificidad es la capacidad de un método analítico evaluar un analito
sin interferencia en la presencia de los componentes que pueden estar
presentes en una muestra ICH 2015.
Figura 13. Curva de Especificidad de cúrcuma y buffer.
39
Es posible observar en la Figura 13 que los componentes presentes en la
muestra no interfieren en la lectura de la cúrcuma, por lo cual no se observa
curvas de absorción en la longitud de onda de 421 nm.
Límite de detección y cuantificación
La Tabla XV demuestra los resultados LOD y LOQ.
Tabla XV. Valores de Límite de detección y cuantificación
Límite de detección L𝑂𝐷= 3.3 * 0,0016 * 5,2091
𝐿𝑂𝐷= 0,027
Límite de cuantificación 𝐿𝑂C= 10 * 0,0016 * 5,2091
𝐿𝑂𝐷= 0,083
Es posible observar un límite de detección (LOD) de 0,027, que indica la
concentración mínima del analito detectado. El límite de cuantificación (LOC)
fue 0,083 que representa la concentración mínima de un analito que puede ser
cuantificado (52).
IV.6. Microscopía de luz polarizada de la CC70C
Mediante el empleo del método tradicional para el estudio de microscopía de
luz polarizada, se reporta en la figura 14, la formación de estrías para los
sistemas con y sin fármaco (A y B), lo cual sugiere la formación de CL de fase
hexagonal.
40
Figura 14. Microscopía de luz polarizada de la CC70C
IV.7. Estudios de Permeación y Retención percutánea in vitro.
Los estudios de permeación y retención percutánea llevan relación con la
transferencia del principio activo, desde la superficie de la piel hacia la dermis
(54). Estos comportamientos dependen de los componentes de la formulación
o el vehículo en que la muestra está incorporada como se indica en la Figura
14 (55).
Figura 15. Permeación percutánea de Curcuma longa
A B
CC70C
41
Es posible observar en la Figura 15 los CL en relación a la crema, este
sistema mejoró la permeación de la cúrcuma a través de la piel. El efecto de la
crema fue superior a los CL a partir del período de 15 horas, esto puede haber
ocurrido debido a la composición de la crema que posee excipientes
promotores de permeación, los cuales pueden traspasar de la superficie de la
piel hacia el torrente sanguíneo e incrementar la permeación del fármaco.
Después de las 24 horas del estudio, se observó que la crema presentó un 50
% de la cúrcuma permeada frente a un 41 % en los CL. Ello muestra que la
crema fue más eficaz que los CL y la cúrcuma aislada. Los resultados
muestran que la CC70C actúa como un importante vehículo para la permeación
de la cúrcuma.
Al respecto Wan (2018), desarrolló sistemas de CL liotrócurvas para
incorporar fitantriol como sistema de administración transdérmica. Los
resultados de permeación cutánea mostraron que los CL tuvieron más
permeación en la piel, en comparación con el gel comercial. Los autores
sugieren que los CL tiene una alta afinidad por el estrato córneo logrando
aumentar la permeabilidad de las sustancias (56).
Así también, un estudio realizado por Carvahlo (2016), desarrolló sistemas
de CL de fase lamelar para la evaluación de sistemas de microemulsión y CL
laminares para la administración de ziduvina transdérmica. Los resultados
mostraron para la permeación cutánea que los CL junto con excipientes
promotores de permeación aumentan la solubilidad y la permeabilidad de los
fármacos. Los autores proponen que los CL con la adición de excipientes
promotores de permeación permiten atravesar las diferentes capas de la piel,
logrando ingresar las sustancias para obtener un efecto terapéutico (57).
Junqueira (2018), realizó fases cristalinas líquidas para mejorar la
administración cutánea de azul de metileno. De acuerdo con los resultados de
permeación cutánea el autor expuso que la penetración en la piel con fases
cristalinas líquidas aumentó la permeabilidad en el tejido cutáneo, en relación
con el gel de control. Los autores sugirieron que los CL incrementan la
permeabilidad de los fármacos hacia la piel proporcionando un sistema de
liberación prolongado (59).
42
Figura 16. Retención percutánea de CC70C, Cúrcuma y CL70C
En la Figura 16 es posible observar los resultados de retención cutánea, en
donde la CC70C presentó una concentración de fármaco retenida superior
(cerca de 50%) de cúrcuma en la epidermis y dermis, seguido de un 48% para
CL70C. la retención cutánea para la cúrcuma libre fue de alrededor de 30%.
Los resultados demuestran que el sistema de CL70 y la crema CC70C,
mejoran la interacción del principio activo con la formulación favoreciendo el
transporte de cúrcuma en las diferentes capas.
Rossetti (2016) desarrolló CL para la optimización de la administración de
protoporfirina IX a la piel para terapia fotodinámica tópica como es el caso de
las nanodispersiones de fase cristalina líquida como nanotransportadores. Los
resultados de retención percutánea mostrarón que la formulación elaborada por
el sistema de CL se retuvo en un 50% en el tejido cutáneo. El autor sugiere que
las propiedades fisicoquímicas, tales como peso molecular y coeficiente de
partición, pueden interferir en la permeabilidad de la piel, dando efecto a que
las sustancias sean retenidas en las diferentes capas de la piel (59).
Wan (2018), en el estudio anteriormente mencionado, indica que los
resultados para la retención percutánea de los CL fueron muy bajos. El autor
sugiere que los CL no se retienen en el estrato córneo por su la alta afinidad
con las capas de la piel (56, 60).
0
10
20
30
40
50
60
% CC70C % Cúrcuma % CL70C
CO
NC
EN
TR
AC
IÓN
Retención percutánea
Epidermis + Dermis Estrato Córneo
43
Adicionalmente, en la Figura 17 es posible observar las coloraciones en el
tejido cutáneo de oreja de cerdo, debido a las diferentes concentraciones de
cúrcuma para cada muestra. La muestra CC70C (A) presenta una coloración
más oscura en relación a la muestra CL70C (B), lo que sugiere que los
componentes de la muestra A logró traspasar las capas de la piel, cumpliendo
de esta manera el propósito del desarrollo del sistema. Sin embargo, la
muestra con cúrcuma libre (C) presenta alta coloración amarilla indicando que
podría estar relacionado a la retención del extracto acuoso de Curcuma longa
en la epidermis.
Figura 17. Tejido cutáneo de la oreja de cerdo
A B C
44
CONCLUSIONES
En el desarrollo del sistema de liberación prolongada de principios activos,
fue posible obtener los cristales líquidos de fase hexagonal, a partir de la
construcción del diagrama de fases a partir de la región cuatro.
De acuerdo con el método de microscopía de luz polarizada, los resultados
obtenidos indicaron la formación de las diferentes estructuras en los sistemas
de cristales líquidos, presentando fase lamelar y hexagonal, debido a la
representación de cruces de malta y estrías respectivamente.
Se ha demostrado con los ensayos de permeación y retención cutánea, que
el empleo de los cristales líquidos fue capaz de favorecer en un 20% el
transporte de Curcuma longa hacia el torrente sanguíneo.
45
RECOMENDACIONES
Determinar el perfil farmacocinético in vivo para confirmar el transporte del
principio activo hacia el torrente sanguíneo por medio de la técnica de
permeación y retención percutánea.
Desarrollar estudios de toxicidad dérmica de la crema de cristales líquidos
con cúrcuma.
Evaluar las propiedades terapéuticas de la crema frente a afecciones
inflamatorias como es el caso de las varices.
46
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GLOSARIO
Anfifílico: son aquellas moléculas que poseen un extremo hidrofílico, es
decir, que es soluble en agua, y otro que es hidrófobo, lo cual significa que
rechaza el agua.
Anisotrópica: es la característica que una sustancia posee en que una
cierta propiedad física varía con la dirección.
Biodisponibilidad: alude a la fracción y la velocidad a la cual la dosis
administrada de un fármaco alcanza su diana terapéutica, lo que implica llegar
hasta el tejido sobre el que actúa.
Birrefringencia: es una propiedad de ciertos cuerpos de desdoblar un rayo
de luz incidente en dos rayos linealmente polarizados de manera perpendicular
entre sí, como si el material tuviera dos índices de refracción distintos.
Cinética: Parte de la física que estudia los sistemas estáticos o en
movimiento mediante el empleo de los conceptos de longitud, tiempo y masa.
Liotrócurvas: Es una categoría de los cristales líquidos, formados por
agregados de moléculas anfifílicas, cuando son colocadas en un medio polar
(agua) o apolar (solvente orgánico).
Mesofase: Fase entre el estado sólido y líquido como, por ejemplo, el
estado de los cristales líquidos.
Percutánea: se refiere a las sustancias o medicamentos administrados a
través de la piel.
Pseudoternario: es la representación de códigos de líneas para la
transmisión de de una fuente destino
Rizomas: En biología, un rizoma es un tallo subterráneo con varias yemas
que crecen de forma horizontal emitiendo raíces y brotes herbáceos de sus
nudos.
52
ANEXOS
Anexo A. Identificación y descripción de la especie por el Herbario Guay
53
54
Anexo B. Descripción taxonómica por el Herbario Guay
55
Anexo C. Tabla de elaboración de diagrama de fases
Región
1
Región
2
Región
3
Región
4
Región
5
Región
6
Región
7
Región
8
T= 10% T=20% T=30% T=40% T=50% T=60% T=70% T=80%
O W O W O W O W O W O W O W O W
10 80 10 70 10 60 10 50 10 40 10 30 10 20 10 10
20 70 20 60 20 50 20 40 20 30 20 20 20 10
30 60 30 50 30 40 30 30 30 20 30 10
40 50 40 40 40 30 40 20 40 10
50 40 50 30 50 20 50 10
60 30 60 20 60 10
70 20 70 10
80 10
Anexo D. Muestras seleccionadas sin y con principio activo
Sin principio
activo
Con principio
activo
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Anexo E. Tabla de absorbancias de especificidad
ABS Cúrcuma Buffer
380 0,0484 0,0170
390 0,0520 0,0170
400 0,0597 0,0170
421 0,0719 0,0170
430 0,0757 0,0170
440 0,0710 0,0170
450 0,0684 0,0170
