UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA

MAESTRÍA EN CIENCIAS: PRODUCTOS NATURALES Y ALIMENTOS

ANÁLISIS QUÍMICO CUANTITATIVO

ARTÍCULO A REVISAR:

Application of quality by design elements for the development and

optimization of an analytical method for protamine sulfate

Autores: David Awotwe-Otoo, Cyrus Agarabi, Patrick J. Faustino, Muhammad J. Habib, Sau Lee, Mansoor A. Khan, Rakhi B. Shah.

DORA JHANINA RODRÍGUEZ FERNÁNDEZ

INTRODUCCIÓN

Estructura química de la Protamina

EXPERIMENTAL

• Factores cromatográficas y respuestas de las variables del diseño experimental Plackett-Burman

Condiciones cromatográficas

• Detector: G1365D arreglo de diodos (DAD).

• Detección UV: 214nm.

• Para la separación cromatográfica:

- 4.6 mm x 150 mm, 5um

- Tipo de columna: Zorbax-SB C8

- Software: ChemStation.

- Fase móvil: sistema de elución isocrática de 1.8% de ACN, 0,2 o 0,4% metanol y 100mM buffer de monobasic sodium phosphate.

- Se ajustó con ácido fosfórico a pH 2 o 2.5.

Preparación de la muestra de sulfato de protamina

Stock solución de sulfato de

protamina

100mg de sulfato de protamina

Disolver en 10mL de

0.01N HCl

Concentración final:

2.5mg/ml

Dilución de solución stock de protamina con 750 uL de

fase móvil

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Diseño experimental Plackett- Burmann: Para Resolución del pico cromatográfico

Diseño experimetal Plackett-Burmann: Para el factor de cola del pico cromatográfico

De la Fig. 2. Pareto chart showing the effect and the direction of factors affecting peak USP tailing of the four peptide peaks of protamine sulfate.

OPTIMIZACIÓN DE PARÁMETROS

Para:

- pH de la fase móvil.

- Temperatura de la columna.

- Velocidad del flujo.

Son constantes:

- Concentración de metanol: 0.3%

- Volumen de inyección : 20uL.

Diseño experimental Box–Behnken

Donde: Y= Respuesta (USP tailing y peak resolution) B: Constante X1 : pH de la fase móvil X2: Temperatura X3: Velocidad del flujo X2,X3: Temperatura, Velocidad flujo. X1,X3: pH, velocidad de flujo X1,X2: pH, Temperatura

Diseño experimental Box–Behnken: Coeficientes de regresión de resolución de picos cromatográficos

De Table 3: Regression coefficients and associated probability values (p-value) for peak resolution.

Table 4: Regression coefficients and associated probability values (p-value) for USP tailing.

Diseño experimental Box–Behnken: Coeficientes de regresión de USP tailing.

Gráfico de respuesta de superficie para tailing peak

De la Fig. 3. Response surface (3D) and contour plots showing the effects of pH, flow rate and temperature on peak resolution and USP tailing

factor of protamine sulfate peaks.

Gráfico de respuesta de superficie para resolución de pico

De la Fig. 3. Response surface (3D) and contour plots showing the effects of pH, flow rate and temperature on peak resolution and USP tailing

factor of protamine sulfate peaks.

RP-HPLC analysis showing the composition of each peptide peak in protamine sulfate from five different sources

• La optimización de los parámetros constó en:

- Velocidad de flujo : 0.8 min/min

- pH del buffer : 2.41

- Temperatura : 24°C

* 6 réplicas de 2.5 mg/ml sulfato de protamina.

** Diferencias entre Resoluciones y factor de cola del pico cromatográfico predicho y observada < 5%

MÉTODO DE VALIDACIÓN

• Rango : 0.5-5 mg/ml • Lineabilidad : R2 > 0.999 • Exactitud : Buena recuperación 95-100% • Precisión :

Desviación estándar relativa < 2% • Límites de detección : 0.06mg/ml • Límite de cuantificación : 0.5mg/ml • Robustez : No fue significativo (TC, FR, IV) para la

respuestas, así como área de pico, platos teóricos.

CONCLUSIÓN

• Un enfoque sistemático y práctico se utilizó para desarrollar un método de HPLC eficiente y robusto para cuantificar los picos de péptidos de sulfato de protamina.

• Análisis multivariado de regresión se utilizó con éxito para

detectar con eficacia los efectos principales de los factores que de manera significativa afectado a la resolución y factor de cola de los picos de los péptidos .

• Hay tres factores que se determinaron para afectar significativamente los picos

fueron luego analizados para determinar sus interacciones y efectos cuadráticos con el menor número de corridas como sea posible utilizando un Box- Behnken conjuntamente con la metodología de superficie de respuesta .

• Las condiciones óptimas fueron validados según Directrices ICH Q2R1 . El método se aplicó con éxito para determinar cualquier diferencia en los picos de péptidos de sulfato de protamina obtenido a partir de cinco fuentes diferentes .