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UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO PROFISSIONAL EM FARMÁCIA
Jhonnathã Rérold Henrique Eduardo de Almeida Vendramini
CARACTERIZAÇÃO FARMACOGNÓSTICA DA DROGA VEGETAL CAULES DE
Diclidanthera laurifolia Mart. (jabuticabeira-de-cipó)
São Paulo – 2014
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UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO PROFISSIONAL EM FARMÁCIA
Jhonnathã Rérold Henrique Eduardo de Almeida Vendramini
CARACTERIZAÇÃO FARMACOGNÓSTICA DA DROGA VEGETAL CAULES DE
Diclidanthera laurifolia Mart. (jabuticabeira-de-cipó)
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado Profissional em Farmácia da
Universidade Anhanguera de São Paulo, como
requisito parcial para a obtenção do Título de
Mestre
Orientador: Prof. Dr. Luis Carlos Marques
São Paulo – 2014
3
Lista de figuras
Figura 1. Cartuchos antigo e atual do produto joão-da-costa e associações, do
laboratório Belém Jardim – MG .................................................................. pág 13
Figura 2. Reação positiva para presença de flavonoides: fluorescência azul-
esverdeada ................................................................................................ pág 18
Figura 3. Exemplar de Diclidanthera laurifólia Mart. .................................. pág 25
Figura 4. Rótulo de um dos produtos adquiridos no comércio varejista de São
Paulo, ofertados como joão-da-costa (Echites peltata) .............................. pág 26
Figura 5. Fotos de pedaços da droga vegetal, inteira ou em lascas, de amostras
comerciais .................................................................................................. pág 27
Figura 6. Microscopia em aumento de 100X. Cambio com repetição ....... pág 28
Figura 7. Microscopia em aumento de 400X. Células achatadas no córtex, células
pétreas, floema típico ................................................................................. pág 29
Figura 8. Resultado de analise de identificação de flavonoides pelo método de
reação com cloreto de alumínio ................................................................. pág 30
Figura 9. Curva de quantificação de teor de saponinas do extrato de joão-da-costa
................................................................................................................... pág 31
Figura 10. Curva de quantificação de teor de flavonoides do extrato de joão-da-
costa ........................................................................................................... pág 32
Figura 11. Curva de atividade antioxidante do extrato de joão-da-costa ... pág 35
Figura 12. Curva de atividade antitumoral do extrato de joão-da-costa .... pág 36
4
Lista de tabelas
Tabela 1. Testes físico-químicos na droga vegetal joão-da-costa ............... pág 29
Tabela 2. Screening fitoquímico na droga vegetal joão-da-costa ................ pág 30
Tabela 3. Evolução ponderal dos animais do teste de screening farmacológico
..................................................................................................................... pág 33
Tabela 4. Peso relativo órgão/ camundongo (rim esquerdo, rim direito e baço)
..................................................................................................................... pág 34
Tabela 5. Peso relativo órgão/ camundongo (fígado e coração) ................. pág 34
Tabela 6. Avaliação de atividade antioxidantes de espécies vegetais ......... pág 35
Tabela 7. Especificações da droga vegetal joão-da-costa ........................... pág 37 e
38
5
Abreviaturas
IBOT-SP: Instituto Botânico de São Paulo
Neg: Negativo
ip: Intraperitoneal
Min: Minutos
CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico
Fapemig: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais
6
Agradecimentos
A minha mãe Sandra Regina de Almeida, por todo o suporte necessário em minha
vida.
Ao Prof. Dr. Luis Carlos Marques, orientador, professor e incentivador pela
paciência e estimulo, por muitas vezes uma palavra fez mudar todo um cenário
desfavorável.
A Attivos Magisttrais e seus presidentes Sr. Fernando Luna e Dra. Silvana Cassino
por me proporcionar a oportunidade de realização deste projeto.
Ao colega Renaldo Rocha Silva, por cobrir minhas ausências na empresa e assim
proporcionar minha presença na Universidade e realização deste trabalho.
Aos amigos de sempre Flávio Seki, Juliana Gusmão, Leonardo Pergo pelo
incentivo e apoio nas horas mais difíceis.
Aos meus familiares, em especial ao meu primo Paulo Willi, que mesmo sem
saber, muitas vezes veio com a palavra certa, na hora certa.
A Maria Cristina Santos, Ivair Donizeti Gonçalves e Fernando Munhoz pelo suporte
no desenvolvimento deste trabalho.
Aos Professores Dra. Maria Cristina Marcucci Ribeiro, Dr. Niraldo Paulino, Dr.
Paulo Pardi, Dr. José Quincoces Suarez, Dra. Susana Nogueira Diniz, Dra. Regina Mara
Silva Pereira. Dra. Claudete Valduga, por dividir seus conhecimentos.
À profa. Dra. Berta Villagra pela ajuda neste trabalho, principalmente na coleta e
identificação do material botânico.
7
RESUMO
O comércio de medicamentos “naturais” levou ao aumento de problemas com a
qualidade, como a existência de drogas vegetais comercializadas apenas com nomes
populares ou com citações científicas equivocadas. Nesta pesquisa, decidiu-se avaliar
caules comercializados como ‘joão-da-costa’ e identificados como Echites peltata L.
(Apocynaceae), cujas especificações técnicas inexistem. Realizou-se coleta na mata
nativa do Instituto Botânico de São Paulo, avaliação do material por especialista, estudo
farmacobotânico, farmacognóstico e screenning farmacológico da droga vegetal.
Confirmou-se serem caules oriundos de Diclidanthera laurifolia Mart. (Polygalaceae). Os
caules não apresentam sabor marcante, exalam um leve aroma de madeira, mostram fino
súber granuloso de coloração marrom-escuro com áreas de coloração bege ou cinza
claro, com inúmeras fendas medianas dispostas principalmente no sentido longitudinal;
região medular extensa, amarelada e com tecidos dispostos em camadas concêntricas,
frouxas entre si. Na microscopia apresenta súber espesso de 5 a 10 camadas de células
alongadas e de paredes espessadas. Córtex apresenta aproximadamente 10 camadas de
células levemente achatadas. Apresenta crescimento anômalo e câmbio com repetição,
apresenta esta característica possivelmente por se tratar de uma trepadeira e necessitar
de certa mobilidade para crescimento. É possível visualizar células pétreas com cerca de
3 a 6 camadas formando uma espécie de parede. Nas camadas mais basais, observa-se
de 4 a 7 camadas achatadas de floema típico. Presença de grãos de amidos isolados e
arredondados distribuídos aleatoriamente na casca em quantidade rara. Foram realizados
testes físico-quimicos e fitoquimícos, encontrando os valores de umidade de
11,36±0,38%; cinzas totais 3,11±0,29%; cinzas insolúveis em ácido 0,44±0,27% e teor de
extrativos 4,50±0,00%. O screening fitoquimico aponta para a presença de saponinas,
flavonoides, cumarinas e taninos, ausência de alcaloides e antraquinonas, sendo que
foram avaliados os teores de flavonoides e saponinas. Os valores para teor de
flavonoides encontrados foram de 0,51±0,08% e os valores encontrados para teor de
saponinas foram de 0,75±0,10%. O screening farmacológico indica a ausência de
toxicidade e nenhum efeito farmacológico agudo.
Palavras-chaves: Diclidanthera laurifolia, João-da-Costa, controle de qualidade,
fitoterápicos.
8
ABSTRACT
Trade in medicinal products "natural" led to increased problems with the quality, as
the existence of vegetable drugs marketed only with popular names or with erroneous
scientific citations. In this research, it was decided to evaluate stems marketed as ' João-
da-Costa ' and identified as Echites peltata L. (Apocynaceae), whose technical
specifications are nonexistent. Collection was conducted in the native forest of the
Botanical Institute of São Paulo, evaluation of material by expert, study
pharmacobotanical, pharmacognostic and pharmacological drug screnning vegetable.
Confirmed to be stems from Diclidanthera laurifolia Mart. (Polygalaceae), popularly called '
jaboticaba-de-cipó '. The stems do not have outstanding flavor, exude a faint aroma of
wood, shows thin bark grainy dark brown colouring with beige color areas or light grey,
with numerous crevices medians arranged mainly lengthwise; Medullary region extensive,
yellowish and with tissues arranged in concentric layers, loose among themselves. On
microscopy presents thick Bark 5 to 10 layers of cells elongated and thickened walls.
Cortex offers approximately 10 layers of slightly flattened cells. Presents anomalous
growth and cambio with repetition, presents this feature possibly because it is a Creeper
and require certain mobility for growth. You can view immutable cells with about 3 to 6
layers forming a kind of wall. In the basal layers, of 4 to 7 flattened layers of phloem
typical. Presence of isolated starches and rounded grains randomly scattered in the bark
in rare amount. Physical-chemical tests were performed and phytochemicals, finding the
values of 0.38 ± 11.36% humidity; total ash 3.11 ± 0.29%; ashes insoluble in acid 0.44 ±
0.27% and extractive content 4.50 ± 0.00%. The screening phytochemical points to the
presence of saponins, flavonoids, coumarins, tannins and absence of alkaloids and
anthraquinones, which assessed the levels of flavonoids and saponins. The values for
content of flavonoids found were of 0.51% ± 0.08 and values found for content of saponins
were 0.75 ± 0.10%. The pharmacological screening indicates the absence of toxicity and
no acute pharmacological effect.
Keywords: Diclidanthera laurifolia, João-da-Costa, quality control, phytotherapy.
9
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 9
2. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 11
2.1 Obtenção do material botânico ......................................................................... 11
2.2 Análise organoléptica, macroscópica e microscópica ....................................... 12
2.3 Testes físico-químicos ...................................................................................... 12
2.3.1 Perda por dessecação ................................................................................... 12
2.3.2 Cinzas totais ................................................................................................... 13
2.3.3 Cinzas insolúveis em ácido ............................................................................ 13
2.3.4 Teor de extrativos .......................................................................................... 13
2.4 Testes fitoquímicos preliminares ....................................................................... 14
2.4.1 Teste de intumescimento ............................................................................... 14
2.4.2 Flavonóides .................................................................................................... 14
2.4.3 Taninos .......................................................................................................... 14
2.4.4 Antraquinonas ................................................................................................ 15
2.4.5 Alcalóides ....................................................................................................... 16
2.4.6 Cumarinas ...................................................................................................... 16
2.4.7 Esteróides e/ou triterpenos ............................................................................ 17
2.5 Doseamento de classes fitoquímicas ................................................................ 17
2.5.1 Doseamento de saponinas............................................................................. 17
2.5.2 Doseamento de flavonoides ........................................................................... 18
2.6 Testes biológicos .............................................................................................. 19
2.6.1 Screening farmacológico ................................................................................ 19
2.6.1.1 Preparo do extrato ...................................................................................... 19
2.6.1.2 Protocolo .................................................................................................... 19
2.6.2 Teste de atividade antioxidante ...................................................................... 20
2.6.3 Teste de atividade antitumoral ...................................................................... 20
10
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 21
3.1 Obtenção e identificação do material botânico.................................................. 21
3.2 Obtenção e identificação do material botânico comercial ................................. 22
3.3 Descrição organoléptica e macroscópica .......................................................... 23
3.4 Descrição microscópica .................................................................................... 24
3.5 Testes físico-químicos ...................................................................................... 24
3.6 Testes fitoquímicos preliminares ....................................................................... 25
3.7 Doseamentos .................................................................................................... 26
3.8 Screening farmacológico ................................................................................... 27
3.9 Atividade antioxidante ....................................................................................... 29
3.10 Atividade antitumoral ...................................................................................... 30
4. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 31
5. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................. 31
11
1 INTRODUÇÃO
A procura por hábitos mais saudáveis nas últimas décadas tem levado as
populações à busca de alimentos e medicamentos “naturais”. Essa tendência tem
promovido um aumento progressivo na produção e consumo de medicamentos
fitoterápicos e produtos afins, como plantas destinadas a chás, complementos alimentares
e “produtos naturais’, nem sempre nas condições adequadas (MARQUES, 1999; TOBIAS
et al., 2007).
Esse desenvolvimento industrial e comercial levou ao aumento paralelo de
problemas com a qualidade, pois são conhecidas há bastante tempo as características
desse segmento no sentido de apresentarem adulterações e falsificações frequentes
(SILVA, 1966). Esses problemas vêm se mantendo ao longo dos anos, envolvendo
diversos segmentos em várias regiões do país (ZAMBONI et ali., 1991; BARA et al., 1995;
FERRAZ et al, 2008), sem que se vislumbre soluções dos mesmos a curto prazo.
A ausência de normas legais contribuiu a esse contexto problemático em termos de
qualidade. Visando reverter essa situação, o Ministério da Saúde tem editado nos últimos
dezenove anos, várias normas e regulamentos sanitários com o objetivo regulamentar o
segmento dos fitoterápicos e procurando dar-lhe o padrão adequado em termos de
segurança, eficácia e qualidade (BRASIL, 1995; BRASIL, 2000; BRASIL, 2010).
Apesar das normas que regulam o segmento industrial e comercial, os problemas
de qualidade persistem por vários motivos, e ensejam esforços institucionais para sua
diminuição. Exemplo disso ocorre atualmente nos Estados Unidos da América, onde mais
de 100 instituições diversas como universidades, empresas e entidades civis se juntaram
e montaram um programa de monitoramento da qualidade de drogas vegetais ofertadas
ao mercado daquele país, o ‘The ABC-AHP-NCNPR Botanical Adulterants Program’
<http://abc.herbalgram.org/site/PageServer?pagename=Adulterants 28/11/2013>.
Nesse cenário de problemas, um aspecto destaca-se no Brasil por sua
particularidade: a existência de vários casos de drogas vegetais comercializadas apenas
com nomes populares ou com citações científicas equivocadas, sobre as quais inexistem
especificações de qualidade, seja em monografias farmacopêicas ou em artigos
científicos indexados, o que inviabiliza qualquer conferência de sua identidade e
qualidade em termos farmacêuticos.
Em pesquisa realizada na universidade Anhanguera de São Paulo – UNIAN-SP
buscou-se avaliar espécies vegetais comercializadas na cidade de São Paulo, incluindo-
12
se nesse objetivo as drogas vegetais jasmim, nó-de-cachorro e joão-da-costa. Os dados
referentes ao jasmim mostraram que o material comercializado no Brasil, oriundo da
China, não se refere à espécie citada em rótulo, Jasminum officinale L., nem é possível
sua identificação sem acesso a exsicatas completas (ALPIOVEZZA et al., 2013); já os
dados do nó-de-cachorro mostraram que a espécie com essa denominação original -
raízes de Heteropteris aphrodisiaca O.Mach. (Malpiguiaceae) - tem sido substituída
comercialmente por rizomas de Vernonia cognata Less. (Asteraceae), espécie daninha
muito pouco estudada em termos químicos e farmacológicos (PINTO, 2012).
Já o material comercial citado como joão-da-costa corresponde a pedaços de
caules, inteiros ou desfiados, rotulado com o nome de Echites peltata L., sendo
recomendado para artrites, cólicas, corrimentos, dores menstruais, orquite, inflamação do
aparelho urogenital, inflamações dos ovários, reumatismos, úlcera crônica e aumento da
fertilidade <http://www.chaecia.com.br/loja/produto-111058-1255-joao_da_costa__erva_
_santa___echites_peltata_lockhart_ex_g_don_100_grg acesso em 28/11/2013>. Porém
esforços iniciais de identificação desse material com base na literatura de Hyakutake
(1967) mostraram tratar-se de outra espécie, distinta da rotulada e sem qualquer indício
de qual efetivamente se tratava.
Essa espécie compõe um medicamento fitoterápico industrial denominado ‘joão-da-
costa e associações®’, produzido pela empresa Laboratório Belém Jardim, de Belo
Horizonte – MG, formulado conjuntamente com as espécies Chondrodendron platiphyllum
(A.St.-Hil.) Miers, Plumeria lancifolia Müll. Arg., Rosmarinus officinalis L. e Gossypium
herbaceum L. (Figura 1), e recomendado para o tratamento de dores ovarianas
intermitentes e anomalias na menstruação, como amenorréia, dismenorréia, metrorragia,
inflamação uterina e inflamações crônicas de útero e ovário
<http://www.belemjardim.com.br/catalogo-on-line/ - acesso em 28/11/13>.
Tal produto foi avaliado em um projeto de pesquisa patrocinado pelo CNPq e
Fapemig sob coordenação da Universidade Federal de Minas Gerais, contando com
parceria da Universidade Estadual de Maringá. O projeto gerou duas publicações, uma
em controle de qualidade e toxicologia e farmacologia agudas que evidenciou um
pequeno efeito antinociceptivo no modelo da formalina (BRANDÃO et al., 2010) e outra
de toxicologia crônica em cães da raça Beagle (MAGRI et al., 2012) que não evidenciou
riscos nesse modelo animal, bem como demonstrou que os animais tratados com o
produto comercial apresentaram uma menor incidência de anormalidades clínicas frente
ao grupo controle.
13
Figura 1 Cartuchos antigo e atual do produto João-da-Costa e Associações®, do laboratório Belém Jardim – MG.
Fonte: http://institutobioquimico.com.br/loja/joao-da-costa-belem-jardim-150-ml/ http://www.belemjardim.com.br/fitoterapico/joao-da-costa/
A Pelastes peltatus é uma das espécies da família Apocynaceae. É encontrada no
Brasil, nos Estados de Pernambuco, Bahia, Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso, Minas
Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná e Santa Catarina. Entre seus usos, podemos
destacar a utilização dos seus ramos e folhas no tratamento de inflamações e úlceras
(QUINET; ANDREATA, 2005).
Desse modo, tendo em vista a clara presença comercial de material vegetal
comercializado como Echites peltata e o fato de suas características não conferirem com
os dados da literatura, desenvolveu-se este trabalho na busca da correta identificação
botânica da espécie bem como na geração das especificações farmacognósticas da
droga vegetal respectiva (caules), cujos dados poderão permitir a efetiva avaliação de
qualidade do material comercial.
Complementarmente, buscou-se realizar algumas avaliações biológicas bem como
um screening farmacológico que indique preliminarmente dados de segurança e potencial
farmacológico da espécie em questão.
14
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Obtenção do material botânico
O material utilizado foi constituído de caules inteiros cortados obliquamente
encontrados comercialmente no mercado varejista de drogas vegetais de São Paulo e
rotulado como Echites peltata.
Na busca de auxílio para conferência da identidade botânica, contou-se com
orientação da botânica taxonomista profa. Dra. Berta Vilagra, sendo realizada coleta da
droga vegetal verdadeira na mata do Instituto Botânico de São Paulo (IBOT-SP). A autora
utilizou espécimes marcados de identificação prévia feita em seu trabalho de
doutoramento.
Esta coleta foi autorizada pelo IBOT por intermédio da Sra. Maria de Fátima Scaf,
diretora do núcleo de pesquisa da Reserva Biológica do Alto da Serra de Paranapiacaba
e Parque Estadual das Fontes do Ipiranga (Anexo I).
2.2 Análise organoléptica, macroscópica e microscópica
A avaliação organoléptica e macroscópica foi realizada com as duas formas
ofertadas comercialmente, caules inteiros ou desfiados e com a amostra coletada no
IBOT-SP após secagem, anotando-se todas as características que expressem a cor, odor,
sabor e textura do material, conforme preconizado na Farmacopeia Brasileira V (2010)
A avaliação microscópica da casca foi realizada com auxílio de lâmina de barbear
comum obtendo-se seções transversais que sofreram clarificação com hipoclorito de
sódio comercial (2,5%) e lavadas em seguida com água destilada. Em seguida as
amostras foram coradas pelo sistema safranina - azul de Astra e observadas em
microscópio Binocular Nikon Modelo SC, bem como foram realizadas fotografias
empregando-se maquina fotográfica comum de marca Canon, modelo Power Shot A495.
2.3 Testes físico-químicos
2.3.1 Perda por dessecação
Reduziu-se a droga vegetal a pó fino. Pesou-se, exatamente, cerca de 1 a 2 g e
15
transferiu-se para pesa-filtro chato previamente tarado nas mesmas condições a serem
empregadas na determinação. Após resfriamento em dessecador, pesou-se o pesa-filtro,
tampado, contendo a amostra. Colocou-se o pesa-filtro na estufa. Secou-se a amostra a
105 º C e por 2 horas. Esfriou-se até temperatura ambiente em dessecador. Pesou-se.
Repetiu-se a operação até peso constante (FARMACOPEIA BRASILEIRA V, 2010).
A porcentagem de perda por dessecação é dada pela equação
Pu-Ps X 100
Pa
em que: Pa = peso da amostra
Pu = peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação
Ps = peso do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação
2.3.2 Cinzas totais
Pesou-se, exatamente, cerca de 3 g da amostra pulverizada, transferiu-se para
cadinho de silício previamente tarado. Distribuiu-se a amostra uniformemente no cadinho
e incinerou-se em mufla (Quimis) aumentando, gradativamente, a temperatura até, no
máximo, 600 ± 25 oC, até que todo o carvão fosse eliminado. Resfriou-se em dessecador
e pesou-se. Calculou-se a porcentagem de cinzas em relação à droga seca ao ar
(FARMACOPEIA BRASILEIRA V, 2010).
2.3.3 Cinzas insolúveis em ácido
Ferveu-se o resíduo obtido na determinação de cinzas totais durante 5 minutos
com 25 mL de ácido clorídrico a 7% (P/V) em cadinho coberto com vidro de relógio.
Lavou-se o vidro de relógio com 5 mL de água quente, juntando a água de lavagem ao
cadinho. Recolheu-se o resíduo, insolúvel em ácido, sobre papel de filtro, isento de cinza,
lavando-o com água quente até que o filtrado se mostrasse neutro. Transferiu-se o papel
de filtro contendo o resíduo para o cadinho original, secou-se sobre chapa quente e
incinerou-se a cerca de 500º C até peso constante. Calculou-se a porcentagem de cinzas
insolúveis em ácido em relação à droga seca ao ar (FARMACOPEIA BRASILEIRA V,
2010).
16
2.3.4 Teor de Extrativos
Pesou-se precisamente cerca de 4,0g de pó da droga vegetal em um frasco de
vidro cônico. Adicionou-se 100 mL de água e pesou-se. Misturou-se bem e deixou em
repouso por 1 hora. Refluxou-se por uma hora, esfriou-se e pesou-se. Ajustou-se o peso
ao peso inicial com água. Misturou-se bem e filtrou-se rapidamente. Transferiu 25 mL do
filtrado para cápsula e evaporou em banho-maria. Secou a 105°C por 6 horas, esfriou em
dessecador por 30 minutos, e pesou. Calculou-se o conteúdo de matéria extrativa em mg
por g de material seco (WORD HEALTH ORGANIZATION, 1998).
2.4 Testes fitoquímicos preliminares
2.4.1 Teste de intumescimento (mucilagens)
Pesou-se, exatamente, 1 g da droga vegetal pulverizada e colocou-se em proveta
de 25 mL com tampa esmerilhada. O comprimento da parte graduada foi de,
aproximadamente, 125 mm e o diâmetro, interno, próximo a 16 mm, subdividido em 0,2
mL, marcado de 0 a 25 mL, de forma ascendente. Adicionou-se 25 mL de água, e agitou-
se a cada 10 minutos, por uma hora. Deixou-se a mistura repousar por 3 horas, à
temperatura ambiente. Mediu-se o volume, em mililitros, ocupado pelo material vegetal
acrescido da mucilagem ou qualquer outro material aderido subtraído do volume inicial da
droga. Quando o teste apresenta resultado positivo, o volume intumescido é expresso
semi-quantitativamente como índice de intumescimento (FARMACOPEIA BRASILEIRA V,
2010).
2.4.2 Flavonóides
Reação de Shinoda
Aqueceu-se, sob refluxo, cerca de 3 g da droga pulverizada com 60 mL de água
destilada durante 15 minutos. Esfriou-se e filtrou-se, a 5 mL deste extrato, adicionar
pequenos fragmentos de magnésio metálico e 1 mL de ácido clorídrico. O aparecimento
de coloração vermelha indica a presença de agliconas flavonoídicas (FARMACOPEIA
BRASILEIRA V, 2010; SOCIEDADE BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA, 2013)
17
Reação com cloreto de alumínio
Umedeceram-se áreas diferentes de uma tira de papel de filtro com o extrato
alcoólico obtido através de aquecimento da droga vegetal 5 gramas em solução
hidroalcoólica 70% (100 mL). Colocou-se sobre uma das regiões uma gota de solução de
cloreto de alumínio a 5% e comparou a fluorescência sob luz ultravioleta (ondas longas).
O aparecimento da intensificação de fluorescência, com mudança de cor para verde
amarelado, indica a presença de flavonóides.
2.4.3 Taninos
Aqueceu-se sob refluxo cerca de 3 g da droga vegetal moída com 60 mL de água,
durante 15 minutos, filtrando-se após resfriamento e distribuindo-se o decocto em alguns
tubos de ensaio. Em seguida foram realizados os testes gerais para a classe de taninos:
a) A 2 mL do extrato adicionou-se duas gotas de ácido clorídrico e gotejou-se
gelatina até precipitação. O aparecimento de precipitado nítido indica reação positiva para
taninos totais.
b) A 2 mL do extrato, adicionou-se 10 mL de água e duas a quatro gotas de
solução de cloreto férrico a 1% (p/V) em metanol. O desenvolvimento de coloração cinza-
escura indica reação positiva para taninos totais.
c) A 2 mL do extrato, adicionou 10 mL de ácido acético 2 M e 5 mL de acetato de
chumbo solução reagente. O aparecimento de precipitado esbranquiçado indica presença
de taninos (FARMACOPEIA BRASILEIRA V, 2010).
2.4.4 Antraquinonas
Antraquinonas livres
Extraiu-se 500 mg da droga pulverizada com 5 mL de éter etílico. Deixou-se
decantar e transferiu-se o sobrenadante para um tubo de ensaio. Repetiu-se o
procedimento novamente e reuniu-se os extratos etéreos. Não desprezou-se a droga.
Adicionou-se à solução etérea cerca de 1 mL de solução aquosa de hidróxido de amônio
a 10% agitando-se. Uma coloração rósea ou vermelha na camada aquosa indica a
presença de antraquinonas livres (SOCIEDADE BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA,
2013).
18
O-heterosídeos
Adicionou-se 40 mL de água destilada ao resíduo da droga obtido no item anterior
e aqueceu-se até a fervura mantendo em aquecimento brando por 10 minutos,
completou-se o volume com água destilada. Esfriou-se e filtrou-se em algodão em funil
para um erlenmeyer. Adicionou-se 5 mL de ácido clorídrico concentrado e levou-se a
ebulição, mantendo-a por 10 minutos. Esfriou-se e filtrou-se em papel de filtro para funil
de separação. Extraiu-se a solução aquosa ácida com 3 porções (10 mL cada) de éter
etílico (não desprezou-se a camada aquosa ácida). Agitou-se 5 mL da solução etérea
com 2 mL de solução hidróxido de amônio a 10%. Uma coloração avermelhada na fase
alcalina aquosa indica a presença de O-heterosídeos (SOCIEDADE BRASILEIRA DE
FARMACOGNOSIA, 2013).
C-heterosídeos
Adicionou-se 5 mL de solução de cloreto de ferro a 25% à solução aquosa ácida
obtida no item anterior. Levou-se à ebulição branda por 15 minutos. Adicionou-se mais
água para completar o volume. Esperou-se esfriar e transferiu-se a solução para funil de
separação. Efetuou-se partição com 20 mL de clorofórmio. Separou-se a fase orgânica e
lavou-se com 2 porções, de 10 mL cada, de água destilada. Adicionou-se 2 mL de
solução de hidróxido de amônio a 10% à 5 mL da fração clorofórmica. Uma coloração
avermelhada da fase aquosa indica a presença de C-heterosídeos (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA, 2013).
2.4.5 Alcalóides
Teste direto
Aqueceu-se à fervura, cerca de 5 g da droga vegetal (moída) em teste, e 30 mL de
ácido clorídrico diluído. Filtrou-se e dividiu-se o filtrado em 3 tubos de ensaio. Em 3 tubos
acrescentou-se três gotas dos reagentes de Dragendorff, Mayer e Bertrand,
respectivamente. Observou-se a formação de turvação e/ou precipitado (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA, 2013).
Teste confirmatório
Aqueceu-se à fervura, cerca de 5 g da droga vegetal grosseiramente pulverizada e
50 mL de ácido clorídrico diluído. Deixou-se resfriar a temperatura ambiente e filtrou-se.
Alcalinizou-se o meio com hidróxido de amônio diluído e verificou-se o pH até pH 8 a 9.
19
Adicionou-se o filtrado em funil de separação. Acrescentou-se 50 mL de clorofórmio.
Separou-se a fração que contém o alcaloide. Acrescentou-se 20 mL de ácido clorídrico
diluído e agitou-se. Separou-se a fase ácida em 4 tudos de ensaios em quantidades
equivalentes. Adicionou-se em cada tubo, e gotas dos reagentes Dragendorff, Mayer e
Bertand. Observou-se a formação de turvação e/ou precipitado (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA, 2013).
2.4.6 Cumarinas
Aqueceu-se em chapa-quente, durante cerca de 10 min, o pó da droga vegetal em
uma câmara de microssublimação (o sublimado apresenta-se sob a forma de gotas
incolores ou cristais aciculares). Dissolveu-se o sublimado obtido com 0,5 mL de metanol.
Lançou-se cinco gotas, concentrando-se num único ponto, de modo a obter duas
manchas de 1 cm de diâmetro em uma folha de papel filtro e secou-se; juntou depois de
seco, uma gota de solução alcoólica de hidróxido de potássio ou sódio 10% e secou-se.
Cobriu-se uma das manchas com papel preto e expôs às radiações ultravioletas
(lâmpada UV com λ de 254 a 366 nm); a mancha exposta adquire, pouco a pouco,
fluorescência verde, já aparente ao final do primeiro minuto. Descubriu-se depois a outra
e verificou-se que, de início, esta não possui fluorescência, mas também adquire por
idêntica exposição às radiações ultravioletas (SOCIEDADE BRASILEIRA DE
FARMACOGNOSIA, 2013).
Figura 2: Reação positiva para presença de flavonóides: fluorescência azul-
esverdeada. Fonte: SOCIEDADE BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA, 2013
2.4.7 Esteroides e/ou triterpenos
Ferveu-se sob refluxo, durante 10 minutos, 5 g da droga vegetal com 30 mL de
etanol a 50%, deixou-se decantar e filtrou-se através de algodão. Repetiu-se o processo
de extração por mais duas vezes. Juntou-se 30 mL de solução de acetato de chumbo
20
neutro a 10%, deixou-se esfriar e filtrou-se. Adicionou-se 20 mL de água, transferiu-se
para funil de separação. Extraiu-se com três porções de 10 mL de clorofórmio. Deixou-se
em repouso até a completa separação das fases. Filtrou-se e evaporou-se em cápsula de
porcelana em banho Maria até resíduo. Adicionou-se ao resíduo, 1 mL de anidrido acético
e em seguida 1 mL de ácido sulfúrico concentrado. Observou-se o aparecimento de
coloração.
2.4.8 Saponinas (teste de espuma)
Pesou-se cerca de 2 g do material vegetal reduzido a pó fino e transferiu para
erlenmeyer contendo 50 mL de água fervente. Manteve-se sob fervura moderada durante
30 minutos. Resfriou, filtrou e distribuiu-se o decocto obtido em tubos de ensaio. Tampou-
se os tubos e agitou-se com movimentos verticais por 15 segundos, com duas agitações
por segundo. Deixou-se em repouso por 15 minutos e verificou-se a presença de espuma
persistente, resistente à adição de gotas de ácido diluído (FARMACOPEIA BRASILEIRA
V, 2010).
2.5 DOSEAMENTOS
2.5.1 Saponinas totais
a) Por espectrofotometria
Curva padrão
Foi preparada uma solução mãe de 1 mg/mL, em triplicata, empregando-se a
saponina padrão SIGMA-Quilaia. A partir desta preparou-se as concentrações de 0,08;
0,12; 0,16; 0,20 e 0,28 mg/mL e para cada concentração foram realizadas cinco leituras
em espectrofotômetro (FEMTO) em 284 nm, calculando-se a média aritmética.
Amostra teste
Desengordurou-se 1,0 g da droga em refluxo com hexano por 2 h, filtrou-se e
secou-se o pó em estufa. Pesou-se 0,2g desta droga desengordurada e realizou-se
extração sob refluxo com três alíquotas de 20 mL de metanol-água (4:1) por 30 minutos.
Filtrou-se o extrato metanólico e concentrou-se. Extraiu-se com três porções de n-butanol
saturado com água. Recolheu-se a fração butanólica e concentrou-se esta até a secura.
Dissolveu-se o resíduo em 100 mL de água. A uma alíquota de 1 mL desta solução foram
adicionados 1 mL de cloreto de cobalto 0,2% e 1 mL de ácido sulfúrico concentrado.
21
Realizou-se a leitura da solução em 284 nm para verificar a absorbância da amostra em
espectrofotômetro (FEMTO).
Como desdobramento deste teste, evaporou-se o hexano por completo e verificou-
se o percentual de gordura da amostra.
b) Pelo índice de espuma
Pesou-se, exatamente, 5 g do material vegetal reduzido a pó fino e transferiu para
erlenmeyer contendo 50 mL de água fervente. Manteve-se sob fervura moderada durante
30 minutos. Resfriou, filtrou para balão volumétrico de 100 mL. Completou-se o volume,
através do filtro, até 100 mL.
Distribuiu-se o decocto obtido, em 10 tubos de ensaio, em série sucessiva de 1, 2,
3, até 10 mL, e ajustou-se o volume do líquido em cada tubo a 10 mL com água. Tampou-
se os tubos e agitou-se com movimentos verticais por 15 segundos, com duas agitações
por segundo. Deixou-se em repouso por 15 minutos e mediu a altura da espuma
calculando o índice de espuma como a diluição com espuma na altura de 1 cm e referida
a 1 g da droga vegetal. (FARMACOPEIA BRASILEIRA V, 2010).
2.5.2 Flavonóides totais
Dois mil microlitros do extrato etanólico de joão-da-costa a 0,468% foram
transferidos para balão volumétrico de 10 mL, cujo volume foi acrescido de 200 µL de
solução de cloreto de alumínio a 5%. A seguir, adicionou-se cerca de 5 mL de metanol no
balão, que foi colocado sob temperatura de 0 °C, durante 30 minutos. Após este período,
o volume do balão foi completado em 10mL com metanol. O procedimento foi realizado
em triplicata.
A absorbância dos três balões foi lida três vezes em espectrofotômetro (Varian
modelo Cary 50 Probe) num comprimento de onda de 425nm. Os resultados foram
analisados usando como referência a curva de calibração para o cálculo de flavonóides
totais expresso em quercetina.
22
2.6 TESTES BIOLÓGICOS
2.6.1 Screening farmacológico
O screening farmacológico foi realizado segundo a literatura (CARLINI, 1972).
2.6.1.1 Preparo do extrato
O extrato foi preparado utilizando-se 20% da droga vegetal em pó em solução
hidroalcoólica a 30%. Preparou-se a mistura e foi colocada em shaker por 48 horas, de
modo a extrair a maior quantidade de ativos da droga. Após as 48 horas, o extrato foi
armazenado em geladeira para posterior filtragem. Este extrato foi filtrado em funil comum
com a utilização de algodão como filtro. O sobrenadante foi levado a rotaevaporação para
retirada de todo o álcool e congelado a -8°C em freezer para posterior liofilização.
O extrato congelado foi deixado em nitrogênio liquido para atingir a temperatura de
-30°C e levado ao liofilizador. Após o processo de liofilização o pó foi armazenado em
geladeira para utilização no screening farmacológico.
2.6.1.2 Protocolo do Screening Farmacológico
Foram aplicadas nos camundongos as dosagens e vias de administração segundo
protocolo a seguir:
O alimento das gaiolas dos animais foi retirados e aguardados 2 horas antes do
teste; os animais foram pesados individualmente, buscando um valor médio e marcados
cada um com caneta de retroprojetor ou similar; as gaiolas foram colocadas na bancada e
identificadas por grupo (7 grupos: 1; 10; 100; 500 e 1000 mg/kg ip e 500 e 2000 mg/kg
oral); colocou-se um cronometro por gaiola. Preparou-se o extrato solubilizando o
liofilizado em água com auxilio de bastão de vidro; foram preparadas cada uma das doses
a serem aplicadas nos animais; administrou-se os extratos aos animais pelas vias
indicadas, prevendo o volume de 0,1 mL para cada 10 g de peso do animal; administrou-
se os extratos ao primeiro grupo e acionou-se o cronômetro; administrou-se os extratos
aos grupos restantes e acionou-se o cronômetro respectivo. Os animais foram
observados nos tempos de 5 minutos, 15 minutos, 1 hora, 4 horas e posteriormente 24-48
horas. Utilizou-se uma ficha para anotações das ocorrências e suas graduações (ex.:
movimentação - ; ou contorções + + +; etc.); avaliou-se a possível mortalidade ao longo
de 14 dias após o tratamento e ao final repetiu-se a pesagem dos animais;
Este estudo e protocolo foram aprovados em comitê de ética conforme anexo 2.
23
2.6.2 Atividade antioxidante (BRAND-WILLIANS; CURELIER; BERSET, 1995)
Foi utilizado o extrato etanólico da amostra a 0,01% para fracionamento de 10
soluções em diferentes concentrações, além de uma solução sem adição do extrato de
joão-da-costa, considerada controle. Foi adicionado volume de 1000 µL de DPPH (2,2-
difenil-1-picrilhidrazila) a todas as soluções. Este teste foi realizado em triplicata e em
ambiente de baixa luminosidade.
Após 30 minutos de preparo, a absorbância das 11 soluções foi lida três vezes no
espectrofotômetro (FEMTO), de mesma especificação, num comprimento de onda de
517nm. Os resultados foram analisados comparando-se a absorbância obtida das
amostras com as concentrações das soluções.
2.6.3 Atividade Antitumoral
Para a realização do experimento de citotoxicidade as células da linhagem tumoral
de melanoma murino “B16F10” foram cultivadas em placas de 96 poços com RPMI
completo, composto por RPMI-1640, enriquecido com glutamina 2 mM, tamponado com
bicarbonato de sódio 24 mM, HEPES 20 mM, 10% de soro fetal bovino (SFB) e
antibióticos (10000 U/mL de penicilina e 10000 µg/mL de estreptomicina) e Garamicina 30
mg/mL (Schering-Plough) na concentração de 1,0 x104/poço e tratadas com diversas
concentrações do extrato hidroalcóolico de joão-da-costa (a partir da solução estoque de
10mg/mL), ou com somente o veículo alcoólico a 50%, por 24 h. Os controles não foram
tratados com o extrato.
Após esse período, a proliferação foi avaliada pelo método do “MTT” brometo de
(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolo, da Sigma-Aldrich), que utiliza tetrazolio bio-
reduzido pelas células gerando um produto colorido chamado de formazona. Nos poços
contendo as células tratadas ou não com os compostos, foram adicionado 50µL de solução
de MTT (5mg/mL) e incubados por 4h. Após esse período, o sobrenadante foi retirado e as
células foram lisadas com 200µL DMSO (dimetilsulfóxido, Aldrich). A absorbância foi medida
a 540 nm em espectrofotômetro (FEMTO), e a medida da formazona formada correlaciona
diretamente com o número de células viáveis na cultura.
24
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Coleta e identificação botânica
Na busca da identificação da droga vegetal comercializada realizou-se contato com
o distribuidor (Nutri Ervas, por intermédio da farmacêutica Luciana F. F. Santos)
solicitando-se auxílio na obtenção de partes aéreas floridas da espécie, que permitissem
a identificação botânica. O distribuidor auxiliou nessa tarefa e conseguiu, do coletor
primário, alguns galhos da planta, os quais porém não estavam floridos.
Buscou-se, então, especialista botânico que pudesse auxiliar na tarefa de
identificação desse material vegetativo, chegando-se à Dra. Berta Villagra, à época
doutoranda do Instituto Botânico de São Paulo e trabalhando com espécies trepadeiras
da mata atlântica. A verificação do material pela botânica indicou, por características
macroscópicas, não tratar-se de Peltastes peltatus, nome atualizado da anteriormente
denominada Echites peltata, e referindo semelhança com caules da jabuticabeira-de-cipó
Diclidanthera laurifolia Mart. – Polygalaceae.
Como ambas faziam parte do trabalho de doutorado da especialista, realizou-se
coleta na mata existente na área do Instituto Botânico de São Paulo seguindo-se
marcações prévias dos exemplares na mata Figura 3), coletando-se material constituído
de caules frescos que foram, então, comparados com as amostras comerciais, as quais
mostraram-se totalmente compatíveis com a amostra padrão de coleta.
Desse modo, com base na orientação de coleta e identificação da Dra. Berta
Villagra, adota-se para esta pesquisa os dados de exsicata e incorporação em herbário
realizados por ela em seu doutoramento e referidas de forma conclusiva como sendo
Diclidanthera laurifolia Mart. – Polygalaceae (Exsicata 27-IX-2007).
25
Figura 3 Foto de exemplar de Diclidanthera laurifolia Mart.
Fonte: Arquivo pessoal.
A Diclidanthera laurifólia é conhecida popularmente como jabuticabeira-de-cipó, é
uma espécie trepadeira lenhosa, escandente, de ramos cilíndricos, folhas simples
alternas, estreitamente obovadas, de ápice agudo, obtuso a arredondado, às vezes
acuminado, de margem inteira e base aguda a longamente cuneada; apresenta
inflorescências em racemos terminais ou axilares e flores alvas ou alvo-amareladas. Seus
frutos tipo bagas globosas pretas ou quase pretas assemelham-se à uva na cor, polpa e
no sabor, além de serem produzidos em cachos; a casca é grossa e a polpa
extremamente doce e existe semelhança deste fruto com a uva. É uma espécie de
interesse florestal, ocorrente na mata atlântica de São Paulo (VILLAGRA; ROMANIUC
NETO, 2011).
Sua avaliação em termos farmacêuticos é mínima, encontrando-se apenas um
estudo farmacognóstico com resultados preliminares utilizando para o estudo as raízes de
Diclidanthera laurifólia Mart. e encontrou-se como principal ativo as saponinas, com teor
de 2,1%. As saponinas foram purificadas e foram realizados testes de absorção no
ultravioleta e absorção no infravermelho. Não encontrou-se agentes cromóforos na
saponinas quando realizado o teste de absorção no ultravioleta. O teste de absorção do
infravermelho indicou a hipótese de se tratar de um triterpeno, para comprovação, foi
realizada a pesquisa de carboxila e o resultado encontrado levou o autor a concluir que
seja muito provavelmente um triterpeno. (PECKOLT; SIQUEIRA-JACCOUD, 1971).
26
A família Polygalaceae, vem sendo alvo de diversos estudos fitoquimicos, algumas
de suas espécies têm importância medicinal pela presença de salicilato de metila em seu
cortéx, utilizado na indústria farmacêutica para o tratamento de contusões e dores
musculares em medicamentos de uso tópico (SILVEIRA et al., 1995; OLIVEIRA et al.,
2000; PIZZOLATTI et al., 2004; MARQUES, 1996).
3.2 Obtenção e identificação do material botânico comercial
As amostras comerciais foram adquiridas no comércio varejista de drogas vegetais
do bairro do Brás, na cidade de São Paulo, selecionando-se aleatoriamente pacotes do
material oriundos da empresa Nippon Flora, de São Paulo (Figura 4). Tais produtos são
rotulados como ‘isentos de registro’, conforme a RDC nº 23 (BRASIL, 2000), uma norma
relativa a alimentos exclusivamente. Essa norma instrui sobre o registro e isenção de
registros de alimentos. Em um dos seus anexos verifica-se que entre os alimentos isentos
de registros estão os chás, razão pela qual as empresas declaram que essa droga
vegetal é isenta de registro alegando se tratar de um chá.
Figura 4 Rótulo de um dos produtos adquiridos no comércio varejista de São Paulo,
ofertados como joão-da-costa (Echites peltata)
27
3.3 Descrição organoléptica e macroscópica
O material vegetal era constituído de caules inteiros ofertados comercialmente em
pedaços cortados obliquamente, medindo de 5 a 10 cm de comprimento por 1,5 a 4,5 cm
de largura. Além dessa forma, havia material cortado em lâminas longitudinais, com 2,0 a
4,5 cm de comprimento, por 0,2 a 0,5 cm de largura.
A parte mais externa dos caules (súber) mostra coloração marrom escuro,
passando pelo bege e cinza claro. O aspecto do súber é granuloso, com inúmeras fendas
largas dispostas principalmente no sentido longitudinal e em menor número, também no
sentido transversal.
O lenho possui na região medular extensa de coloração amarela de intensidade
moderada, cujos tecidos estão dispostos em camadas concêntricas, provavelmente
correspondendo aos anéis de crescimento, camadas estas que se destacam umas das
outras. A observação longitudinal da região interna evidencia apenas tecido vascular de
coloração amarela, fibroso e disposto em camadas que também se destacam.
A amostra no formato de lascas evidencia inúmeros segmentos fibrosos, de
coloração bege-amarelado, e raros pedaços de súber, de coloração cinza escuro e
ausência de materiais estranhos.
Em termos organolépticos, os caules e mesmo as cascas, ou lascas, isoladamente
não apresentam qualquer odor ou sabor. As lascas apresentam leve aroma lembrando a
madeira.
Figura 5 Foto de pedaços e lascas da droga vegetal, de amostras comerciais.
Fonte: Arquivo Pessoal
28
Essas características conferem com o levantamento prévio de Vilagra e Romaniuc
(2011) <http://fm2.fieldmuseum.org/plantguides/guide_pdfs/307-04.pdf> sobre a
macroanatomia do lenho espécies vegetais trepadeiras ocorrentes no Parque Estadual
Fontes do Ipiranga, mesmo local onde se realizou a coleta deste trabalho.
3.4 Descrição microscópica
Na observação microscópica, em corte transversal da casca encontram-se súber
espesso de 5 a 10 camadas de células alongadas e de paredes espessadas.
O córtex apresenta aproximadamente 10 camadas de células levemente
achatadas. Apresenta crescimento anômalo e cambio com repetição, apresenta esta
característica possivelmente por se tratar de uma trepadeira e necessitar de certa
mobilidade para crescimento. É possível visualizar células pétreas com cerca de 3 a 6
camadas formando uma espécie de parede. Nas camadas mais basais, observa-se de 4 a
7 camadas achatadas de floema típico. Presença de grãos de amidos isolados e
arredondados distribuídos aleatoriamente na casca em quantidade rara.
Na microscopia do lenho, os cortes transversais das lascas mostram apenas faixas
contínuas de vasos de xilema, distribuídos principalmente em vasos de pequeno calibre
numerosos, intercalados por grandes vasos, com dimensão equivalente a 20 vezes a dos
menores vasos.
Figura 6 Microscopia em aumento de 100x Câmbio com repetição
29
Figura 7 Microscopia com aumento de 400X – Células achatadas no córtex,
células pétreas, floema tipico
3.5 Testes físico-químicos
Os resultados das avaliações físico-químicas, umidade, cinzas totais, cinzas
insolúveis em ácido e teor de extrativos, estão expressos na Tabela 1
Tabela 1 Testes físico-químicos da droga vegetal joão-da-costa.
Testes N Resultado CV
Perda por dessecação 3 11,36±0,38% 3,34
Cinzas totais 3 3,11±0,29% 9,32
Cinzas insolúveis em ácido 3 0,44±0,27% 61,36
Teor de extrativos 3 4,50±0,00% 0,00
Onde N é o numero de amostras e CV o coeficiente de variação. O resultado expresso é a
média aritmética de 3 determinações
Tais resultados são compatíveis com espécies onde a droga vegetal é o caule, a
Farmacopeia Brasileira apresenta em sua 5ª edição, a monografia da Carqueja –
Baccharis trimera, suas características físico-química, são parecidas com as encontradas
neste trabalho. O percentual de água descrito em farmacopeia é de no máximo 12,0%, e
o de cinzas totais, no máximo 8,0%, valores que condizem com os encontrados nos
experimentos realizados.
30
3.6 Screening fitoquímico
Os resultados das avaliações fitoquímicas preliminares estão expressos na tabela
2, onde se encontram os resultados de identificação das principais classes de substâncias
químicas geralmente presentes nas drogas vegetais. Cada teste foi devidamente
acompanhado de avaliação com amostra padrão.
Tabela 2 Screening fitoquímico da droga vegetal joão-da-costa.
Testes Resultado
Saponinas +
Flavonóides +
Taninos +
subtipo condensado +
Cumarinas +
Alcalóides Neg
Antraquinonas Neg
Esteróides/ triterpenos +
Onde Neg significa negativo
Figura 8 Resultado da análise de Identificação de flavonóides pelo método
de reação com cloreto de alumínio.
Fonte: Arquivo pessoal
Os resultados encontrados neste Screening fitoquimico corroboram com os dados
encontrados na literatura para espécies da família Polygaceae. Estudos anteriores nas
Positivo
31
ultimas 3 décadas, revelam um vasto espectro de metabólitos nesta família, que inclui:
saponinas, esteroides, flavonoides livres e glicosilados, cumarinas, ésteres de ácidos
cinâmicos com oligossacarídeos e polissacarídeos, dihidroestiril-2-pironas e estéril-2-
pironas. (JUNIOR, 2002).
Outras drogas vegetais utilizadas com o mesmo fim medicinal, como Angelica
sinensis apresentam como constituintes principais cumarinas e fitoesteróides, ativos que
foram encontrados na droga vegetal pesquisada, porém não é possível afirmar que estes
sejam os responsáveis pela ação farmacológica de seu uso popular.
3.7 Avaliações Quantitativas
3.7.1 Saponinas
Os seguintes resultados foram obtidos considerando a curva de calibração para o
cálculo de saponinas, foi obtida a concentração média de saponinas de 0,75%±0,10 nas
amostras analisadas.
Figura 9 Curva de calibração para quantificação de teor de saponinas do extrato
de joão-da-costa. Padrão: Quilaia
Os valores de teor de saponinas encontrados são considerados baixos frente a
outras drogas vegetais como a Quilaia, que possuí em torno de 8,5% - 16,4% de
saponinas e o Alcaçuz, que contém em torno de 6% (glicirrizina). Em trabalho anterior
realizado com as raízes de Diclidanthera laurifólia Mart., os valores encontrados para o
y = 1,4303x + 0,1555R² = 0,9579
% A
bs
em 0
,284
nm
Concentração (mg/mL)
Curva de Calibração - Saponinas
32
teor de saponinas foram de 2,1%. Esse resultados demonstram que possivelmente a
parte utilizada nesta droga vegetal não deveria ser o caule, mas sim as raízes que
possuem maior concentração ativos.
3.7.2 Flavonóides
Os seguintes resultados foram obtidos considerando a curva de calibração (Figura
8) para o cálculo de flavonóides totais expresso em quercetina, foi obtida a concentração
média de flavonóides de 0, 239 + 0,037 µg/mL ou 0,512 ± 0,080 % (m/m) nas amostras
analisadas.
Figura 10 Curva de calibração para quantificação de teor de flavonóides do extrato
de joão-da-costa.
Entre as drogas vegetais presentes na farmacopeia com valores de flavonoides
expressos em quercetina é possível localizar as drogas Pitangueira, Sabugueiro e
Sabugueiro do Brasil, que apresentam como valores de teor de flavonoides 1,0%; 2,0% e
1,5%, respectivamente. Os valores encontrados no presente estudo e apresentados
acima são baixos comparados com estas drogas, apresentando só a metade dos valores
encontrados na droga com a menor concentração de flavonoides expressos em
quercetina.
3.8 Screening farmacológico
Não foram observadas alterações comportamentais nos animais, com exceção do
grupo 1000 mg (via i.p.). Neste grupo os animais diminuíram consideravelmente sua
y = 0,0776x - 0,0064R2 = 0,9982
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
Concentração mcg/mL
33
movimentação nas gaiolas, desde o momento da administração do extrato até 4 horas de
observação. Após 4 dias da administração, todos os animais morreram, sendo essa dose
considerada letal. O grupo tratado com 500 mg (via i.p.) apresentou 2 mortes após 4 dias
de administração, sendo assim, restaram apenas 3 animais desse grupo para avaliação.
As tabelas 3, 4 e 5 demonstram os resultados obtidos com os camundongos após
a administração de liofilizado da droga vegetal joão-da-costa.
Verificou-se os pesos dos mesmos anteriores à administração e nos dias 7 e 14
após a administração (tabela 3).
Tabela 3 Evolução ponderal (peso em gramas) dos animais do teste de screening
farmacológico (N= 5 por grupo)
Grupos inicial 7 dias 14 dias
Controle 31,6±1,14 34,0±2,45 35,2±2,77
1 mg/kg ip 30,8±2,17 32,4±1,95 32,8±2,77
10 mg/kg ip 30,0±3,16 31,6±2,41 32,8±2,59
100 mg/kg ip 32,4±1,14 33,8±1,79 35,2±2,05
500 mg/kg ip 32,6±2,79 33,3±4,51 35,6±5,13
1000 mg/kg ip 34,0±2,12 morte morte
500 mg/kg oral 34,0±3,00 35,4±2,88 36,0±2,45
2000 mg/kg oral 33,6±1,67 35,6±2,79 36,0±2,55
Anova não significante. P< 0,05
A evolução ponderal (peso em gramas) dos animais, não sofreu alterações
significantes, exceção feita ao grupo 1000 mg/Kg ip, onde constatou-se a morte de todos
os animais , sendo dois destes após 2 dias de administração e o restante após 4 dias de
administração. Observou-se que no grupo 500 mg/Kg ip ocorreu a morte de 2 animais
após 4 dias de administração. Tais doses administradas onde ocorreram a morte dos
animais são doses altas e apresentaram uma toxicidade retardada. Os animais que
receberam tratamento via oral, não apresentaram sintomas que indiquem uma possível
toxicidade aguda na droga vegetal, mesmo em dosagem altas.
As Tabelas 4, 5 e 6 demonstram os pesos dos órgãos dos camundongos após
eutanásia e o percentual (órgão/ peso).
34
Tabela 4 Peso relativo órgão/camundongo (rim esquerdo, rim direito e baço).
Grupos Percentual orgão/camundongo (em %)
Baço Rim E Rim D
Controle 0,30±0,05 0,64±0,05 0,61±0,06
1 mg/kg ip 0,30±0,03 0,63±0,04 0,60±0,03
10 mg/kg ip 0,54±0,27 0,66±0,05 0,70±0,05
100 mg/kg ip 0,31±0,08 0,60±0,03 0,64±0,04
500 mg/kg ip 0,51±0,07 0,68±0,17 0,68±0,19
1000 mg/kg ip morte morte morte
500 mg/kg oral 0,36±0,13 0,62±0,05 0,66±0,04
2000 mg/kg oral 0,36±0,18 0,59±0,05 0,61±0,06 Anova não significante. P< 0,05
Tabela 5 Peso relativo Órgão/Camundongo (Fígado e Coração).
Grupos Percentual Orgão/Camundongo (em %)
Fígado Coração
Controle 4,98±0,37 0,52±0,07
1 mg/kg ip 5,25±0,10 0,52±0,08
10 mg/kg ip 5,88±0,14 0,54±0,04
100 mg/kg ip 5,10±0,36 0,52±0,12
500 mg/kg ip 6,12±1,93 0,57±0,18
1000 mg/kg ip - -
500 mg/kg oral 5,37±0,17 0,52±0,05
2000 mg/kg oral 4,94±0,36 0,53±0,06
Anova não significante. P< 0,05
Os resultados apresentados mostram que o aumento das doses não interfere no
peso relativo órgão/camundongo em nenhuma das doses aplicadas e em nenhum dos
órgãos avaliados, o que corrobora com a abordagem inicial da ausência de toxicidade
aguda desta droga vegetal.
35
3.9 Atividade Antioxidante
A estimativa de atividade antioxidante, estimativa da CE50 (dose que elimina 50%
dos radicais livres), foi de 71,24 µg/mL.
Figura 11 Curva da atividade antioxidante do extrato de joão-da-costa.
Os valores encontrados apontam para uma possível utilização como antioxidante.
Em comparação com outras drogas vegetais, o IC 50 apresentado é baixo. Abaixo tabela
com outras drogas vegetais e IC50. Possivelmente a responsabilidade da atividade
antioxidante apresentada esta ligada a presença dos flavonoides.
Tabela 6 Avaliação de antioxidantes de espécies vegetais
Espécie IC50 (mg/ml)
Carduus marianus (Padrão) 0,77±0,016
Cupressus sempervirens 1,00±0,054
Maytenus ilicifolia 1,08±0,062
Mangifera indica 2,09±0,068
Annona muricata 0,92±0,025
Aloe vera 2,53±0,071
Plantago sp. 1,28±0,066
Adiantium sp. 0,71±0,035
Fontes: Lima, W. Q. F, et. Al 2012
y = -0,68x + 98,444
R² = 0,8849
% D
PP
H r
est
an
te
Concentração (ug/mL)
Atividade antioxidante-João da Costa
36
3.10 Atividade antitumoral
Com respeito à atividade antitumoral, o cálculo da medida de IC50, que é a
concentração inibitória do composto onde é observada uma inibição de 50% da viabilidade
celular comparada com 100% de viabilidade dos poços controle (sem o tratamento), ou seja,
é a concentração do composto onde teremos um efeito tóxico para 50% das células
adicionadas nos poços com os compostos foi realizados nas culturas e nossos resultados
demonstraram uma capacidade antitumoral do extrato hidroalcoolico de João da Costa
com um valor de IC50 = 1421,68 ug/ml.
Figura 12 Curva da atividade antitumoral do extrato de joão-da-costa.
% de ABS
[ ] JC
37
4 CONCLUSÃO
Com os dados apresentados no presente trabalho é possível produzir uma
especificação nos moldes da farmacopeia (tabela 7), possibilitando um controle de
qualidade farmacognóstico da droga vegetal em questão. É importante ressaltar a
necessidade de um controle botânico desta droga vegetal, uma vez que são encontradas
facilmente amostras no mercado desta droga com identificação botânica incorreta, este
sendo um problema comum e já conhecido do mercado fitoterápico, cabendo as
autoridades sanitárias um controle mais rigoroso e intenso.
Tabela 7 – Especificações da droga vegetal joão-da-costa
Especificação Resultado
Descrição Macroscópica
Caules inteiros em pedaços cortados
obliquamente, medindo de 5 a 10 cm de comprimento
por 1,5 a 4,5 cm de largura. A parte mais externa dos
caules (súber) mostra coloração marrom escuro,
passando pelo bege e cinza claro. O aspecto do súber
é granuloso, com inúmeras fendas largas dispostas
principalmente no sentido longitudinal e em menor
número, também no sentido transversal. O lenho
possui na região medular extensa de coloração
amarela de intensidade moderada, cujos tecidos estão
dispostos em camadas concêntricas, provavelmente
correspondendo aos anéis de crescimento, camadas
estas que se destacam umas das outras. A
observação longitudinal da região interna evidencia
apenas tecido vascular de coloração amarela, fibroso
e disposto em camadas que também se destacam.
Em termos organolépticos, os caules e mesmo as
cascas, ou lascas, isoladamente não apresentam
qualquer odor ou sabor. As lascas apresentam leve
aroma lembrando a madeira.
38
Descrição Microscópica
Súber espesso de 5 a 10 camadas de células
alongadas e de paredes espessadas. Córtex
apresenta aproximadamente 10 camadas de células
levemente achatadas. Apresenta crescimento
anômalo e cambio com repetição, apresenta esta
característica possivelmente por se tratar de uma
trepadeira e necessitar de certa mobilidade para
crescimento. É possível visualizar células pétreas com
cerca de 3 a 6 camadas formando uma espécie de
parede. Nas camadas mais basais, observa-se de 4 a
7 camadas achatadas de floema típico. Presença de
grãos de amidos isolados e arredondados distribuídos
aleatoriamente na casca em quantidade rara.
Perda por dessecação 11,36±0,38%
Cinzas totais 3,11±0,29%
Cinzas insolúveis em
ácido 0,44±0,27%
Teor de extrativos 4,50±0,00%
Flavonóides +
Saponinas +
Flavonóides +
Taninos +
subtipo condensado +
Cumarinas +
Alcalóides Neg
Antraquinonas Neg
Esteróides/ triterpenos +
Saponinas (%) 0,751±0,10%
Flavonoides (%) 0,512±0,080%
Em termos fItoquímicos foi possível concluir que a droga vegetal apresenta como
possíveis marcadores: saponinas, flavonoides, cumarinas e taninos, não sendo
detectadas as presenças de alcaloides e antraquinonas.
39
Os dados do screening farmacologico mostram que a droga vegetal possui uma
toxicidade retardada, uma vez que foi possível observar a morte de todos os animais do
grupo 1000mg/Kg ip, sendo dois destes após 2 dias da administração e o restante após 4
dias da administração. Observou-se também a morte de 2 animais do grupo 500 mg/Kg ip
após 4 dias de administração, sendo necessários maiores estudos farmacológicos afim de
concluir o motivo do óbito destes animais.
Os dados de atividade antitumoral e antioxidante sinalizam para possíveis
atividades biológicas de interesse para esta droga vegetal, sendo necessários estudos
farmacológicos direcionados a patologias específicas, a partir dos indícios obtidos neste
trabalho.
40
BIBLIOGRAFIA
ALICE, C.B., DE SIQUEIRA, N.C.S., MENTZ, L.A., SILVA, G.A.A.B., JOSÉ, K.F.D.
Plantas medicinais de uso popular: atlas farmacognóstico. Porto Alegre, Ulbra, 1995.
BARA, M.T.F., TELES, M.F.B., BARBOSA, N.L. Avaliação da qualidade de plantas
medicinais comercializadas em Goiânia – GO. In: CONGRESSO PAULISTA DE
FARMACÊUTICOS, 9º. Anais. São Paulo, CRF, 1995.
BRAND-WILLIANS, W., CURELIER, M. E. e BERSET, C. Use of a free radical method to
evaluate antioxidant activity. Lebensm-Wiss. u. Technol, v.28, p. 25-30, 1995
BRANDÃO, M.G.L.; COSENZA, G.P.; CESAR, I.C.; TAGLIATI, C.A.; MARQUES, L.C.
Influence of the preparation method on the low efficacy of multi-herb commercial products:
the example of João da Costa e Associações®. Rev. Bras. Farmacogn. v.20, n.2, p.250-
255, 2010.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC
nº 14 de 2010. Aprova o Regulamento Técnico, em anexo, visando normatizar o registro
de medicamentos fitoterápicos junto ao Sistema de Vigilância Sanitária. Diário Oficial da
União, 2010.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC
nº 33 de 19.04.00. Aprova regulamentos técnicos para as farmácias de manipulação.
Diário Oficial da União, 20.04.2000.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Portaria nº 06 de 1995
CARLINI, E.A. Screening farmacológico de plantas brasileiras. Revista Brasileira de
Biologia, v.32, n.2, p. 65-274, 1972.
FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 5ª ed. Brasília: Anvisa, 2010.
GILG, E., BRANDT, W., SCHÜRHOFF, P.N. Farmacognosia: materia farmacéutica
vegetal y animal. Barcelona. Editorial Labor, 1942.
HYAKUTAKE. S. Contribuição ao estudo morfológico e anatômico da espécie Peltastes
peltatus (Vell.) Woodson (Echites peltata Vell.) Apocynaceae. Rev. Fac. Farm. Bioquim.
Univ. S. Paulo, v.5. n.1, p.77-91, 1967.
41
MAGRI, E.G.; NEVES, F.T.A; KANESHIMA, E.N.; SILVA, J.C.; ANTUNES, V.S.; COSTA,
F.P.; ROCHA, O.A.; TAGLIATI, C.A.; MARQUES, L.C.. Toxicological evaluation of the
João da Costa e Associações® on Beagle dogs. Rev. bras. farmacogn. v.22, n.1, p.109-
114, 2012.
MARQUES, L.C. Legislação de fitoterápicos: para onde iremos? Revista Racine, v.9,
n.50, p.18-20, 1999.
MATOS, F.J.A. Introdução à fitoquímica experimental. Fortaleza, UFC, 1988.
PECKOLT, O., SIQUEIRA-JACCOUD, R.J. de. Estudo farmacognóstico da Diclidanthera
laurifolia Martius. Rev. Bras. Farm., v.52, n.1, p.1-13, 1971.
SILVA, J.B. Algumas falsificações e adulterações de drogas encontradas em material
comercial. Revista da Faculdade de Farmácia e Bioquímica S. Paulo, v.4, n.1, p. 71-
84, 1966.
TOBIAS, M.L., OLIVEIRA, F., OLIVEIRA, K.P., MARQUES, L.C. Controle de qualidade de
drogas vegetais de farmácias de manipulação de Maringá (Paraná, Brasil). Revista
Eletrônica da Faculdade de Farmácia, v.14, p. 95-103, 2007.
VILLAGRA, B.L.P., ROMANIUC NETO, S. Plantas trepadeiras do Parque Estadual das
Fontes do Ipiranga (São Paulo, Brasil). Hoehnea v.38, n.3, p. 325-384, 46 fig., 2011.
WAGNER, H., BLADT, S. Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas.
Berlin: Springer-Verlag, 1996.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Quality control methods for medicinal plant
materials. Geneva: 1998.
ZAMBONI, C.Q., ALVES, H.I., RODRIGUES, R.M.M.S., SPITERI, N., ATUI, M.B.,
SANTOS, M.C. Fraudes e sujidades em condimentos comercializados na cidade de São
Paulo. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.51, n.1/2, p.19-22, 1991.
http://abc.herbalgram.org/site/PageServer?pagename=Adulterants - acesso em 28/11/13
http://www.belemjardim.com.br/catalogo-on-line/ - acesso em 28/11/13
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ANEXO
1. autorização de coleta
2. autorização ética animal
