UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE UERN … · 2018. 11. 6. · 10 universidade do estado do rio grande do norte – uern programa de pÓs-graduaÇÃo em saÚde e sociedade

10

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE – UERN

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E SOCIEDADE – PPGSS

MESTRADO ACADÊMICO EM SAÚDE E SOCIEDADE – MASS

STEPHAN BARISIC JÚNIOR

COMPORTAMENTO TRÓFICO DOS CARDIOMIÓCITOS EM CULTURA APÓS

ADIÇÃO DE MEIO CONDICIONADO DOS GÂNGLIOS SIMPÁTICOS NA PRESENÇA

DO FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO 2

MOSSORÓ/RN

2017

10





MOSSORÓ, RN

2017

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Saúde e Sociedade da Universidade

do Estado do Rio Grande do Norte como requisite

parcial para obtenção do grau de Mestre em Saúde e

Sociedade

Orientador: Prof. Dr. Fausto Pierdoná Guzen

11

12





Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Sociedade da

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte para obtenção do título de Mestre em Saúde e

Sociedade.

Data da defesa: 24 / 08 / 2017

13

Aos meus pais e Gilka, minha esposa,

que são meu sustentáculo nessa

passagem terrena e à Beatriz, minha

filha, fonte de inspiração inesgotável.

14

AGRADECIMENTOS

A Deus, acima de todas as coisas,

Ao meu orientador, pela fraterna parceria.

Aos colegas professores e pesquisadores pela convivência harmoniosa e colaborativa.

15

“Todo aquele que se dedica ao estudo da ciência

chega a convencer-se de que, nas leis do Universo,

manifesta-se um espírito sumamente superior ao do

homem e perante o qual, com nossos poderes

limitados, devemos subjugar-nos.”

Albert Einstein

16

RESUMO

A célula muscular cardíaca, também chamada de cardiomiócito, possui funções

especializadas e desempenha papel fundamental na manutenção da vida, uma vez que é a

responsável pela atividade elétrica e contrátil do coração. Assim como outras células

especializadas, não possui capacidade efetiva de regeneração e a sua morte, ou apoptose, é

sempre um evento indesejável, com consequências por vezes catastróficas, como ocorre na

Insuficiência Cardíaca (IC), sendo esta conhecida como a “via final” das cardiopatias. Não

obstante, qualquer doença cardíaca em que a apoptose do cardiomiócito está implicada

desenvolverá, em algum momento da evolução, a síndrome da IC. Evidências mostram a

influência de diversas substâncias como fortes componentes responsáveis por induzirem

cardioproteção após danos teciduais. Nessa perspectiva, esse estudo teve como objetivo analisar

o trofismo dos cardiomiócitos, na presença de meio condicionado dos gânglios simpáticos

(MCGS), na adição ou não, do Fator de Crescimento Fibroblástico 2 (FGF-2). Para tanto, foi

analisado o comportamento do gânglio simpático em cultura, mapeando morfologicamente a

população e o perfil migratório ganglionar, o crescimento e a morfologia dos cardiomiócitos ao

longo de 72 horas através da microscopia de contraste de fase. Observou-se incremento

significativamente estatítico tanto na área, quanto perímetro celular no grupo tratado com

MCGS e FGF-2 (Grupo 03). Conclui-se, portanto, haver importante efeito plástico do FGF,

potencializado pelo MCGS no cardiomiócito.

PALAVRAS CHAVE: Cardiomiócito, Fator de Crescimento Fibroblástico 2, Gânglio

Simpático, Meio condicionado.

17

ABSTRACT

The cardiac muscle cell, also called cardiomyocyte, has specialized functions and

plays a fundamental role in the maintenance of life, since it is responsible for the electrical and

contractile activity of the heart. Like other specialized cells, it does not have an effective

capacity for regeneration and its death or apoptosis is always an undesirable event, with

sometimes catastrophic consequences, such as in Heart Failure (HF), which is known as the

"final path" of heart diseases. Nevertheless, any cardiac disease in which cardiomyocyte

apoptosis is implicated will develop, at some point in time, the HF syndrome. Evidence shows

the influence of several substances as strong components responsible for inducing

cardioprotection after tissue damage. In this perspective, this study aimed to analyze

cardiomyocyte trophism, in the presence of conditioned medium of the sympathetic ganglia

(MCGS), in addition or not, of the Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2). For this, the behavior

of the sympathetic ganglion in culture was analyzed, morphologically mapping the population

and the ganglionar migratory profile, the growth and the morphology of the cardiomyocytes

over 72 hours through the phase contrast microscopy. A statistically significant increase was

observed in both the area and the cell perimeter in the group treated with MCGS and FGF-2

(Group 03). It is concluded, therefore, that there is an important plastic effect of FGF,

potentiated by MCGS in the cardiomyocyte.

KEYWORDS: Cardiomyocyte, Fibroblast Growth Factor 2, Sympathetic Ganglion,

Conditioned Medium.

18

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. A figura ilustra a organização estrutural e ultra-estrutural do tecido

cardíaco.....................................................................................................................................14

FIGURA 2. Composição e interrelação celular da matriz extracelular cardíaca........................15

FIGURA 3. Representação da estrutura anatômica da organização simpática do sistema nervoso

autônomo e relações entre a medula espinal e os gânglios simpáticos.......................................17

FIGURA 4. Representação da integração neuro-cardiológica...................................................18

FIGURA 5. Representação esquemática do padrão morfofuncional da hipertrofia ventricular.19

FIGURA 6. Interrelações orgânicas do sistema renina-angiotensina-aldosterona na

Insuficiência Cardíaca...............................................................................................................20

FIGURA 7. . Ilustra célula adiposa, hepatócito, célula β do pâncreas, osteoblasto, osteócito e

fibroblasto, assim como a secreção de tipos de FGFs por essas células e suas ações na injúria

cardíaca.....................................................................................................................................27

FIGURA 8. A figura ilustra Eppendorf com MCGS acondicionado........................................32

FIGURA 9. Campos de observação celular nas P60..................................................................34

FIGURA 10. Organização estrutural da parte interna do gânglio simpático..............................35

FIGURA 11. As figuras ilustram migração celular do gânglio simpático (A e B, aumentos de

10 e 20x, respectivamente) e o padrão morfológico das células satélites apontadas pela cabeça

de seta (C aumento de 40x) nas primeiras 24hs. Escala 100μm..................................................36

FIGURA 12. As figuras ilustram migração de um segundo perfil celular (fibroblastos) do

gânglio simpático (A em aumento de 10x) e o padrão morfológico dos fibroblastos (seta) e das

células satélites (cabeça de seta) em B no aumento de 20x e C no aumento de 40x após 48hs.

Escala 100μm............................................................................................................................37

FIGURA 13 As figuras ilustram migração de um terceiro perfil celular (neurônios) do gânglio

simpático. Neurônios são apontados pela seta e as células satélites pela cabeça de seta em A no

aumento de 10x, em B no aumento de 20x e em C no aumento de 40x após 72hs. Escala

100μm.......................................................................................................................................39

FIGURA 14 As figuras mostram a continuidade da migração neuronal e o desenvolvimento

trófico dessas células. Escala 100μm.........................................................................................40

FIGURA 15 Aspectos Morfológicos dos cardiomiócitos (seta) em A aumento de 20x e em B

aumento de 40x. Escala 100μm.................................................................................................41

19

FIGURA 16 Morfologia das células após formação dos grupos experimentais por 72 horas.

Grupo 1: painéis A (24 horas), B (48 horas), C (72 horas); Grupo 2: Painéis D (24 horas), E (48

horas), F (72 horas); Grupo 3: Painéis G (24 horas), H (48 horas), I (72 horas); Grupo 4: Painéis

J (24 horas), K (48 horas), L (72 horas). Escala 100μm. Aumento de 20x..................................42

20

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................. 12

1.1 ORGANIZAÇÃO MORFOFUNCIONAL DO CARDIOMIÓCITO................................ 12

1.2 ASPECTOS ESTRUTURAIS E FUNCIONAIS DO GÂNGLIO SIMPÁTICO.............. 16

1.3 DEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO DO TECIDO CARDÍACO............................... 18

1.4 FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO........................................................... 22

1.4.1 Fator de Crescimento Fibroblástico-2.......................................................................... 22

1.4.1.1 Isoforma Lo-FGF-2...................................................................................................... 23

1.4.1.2 Isoforma Hi-FGF-2...................................................................................................... 24

1.4.2 Fator de Crescimento Fibroblástico-16........................................................................ 24



2. JUSTIFICATIVA.......................................................................................................... 29

3. OBJETIVOS................................................................................................................... 29

3.1 GERAL............................................................................................................................... 29

3.2 ESPECÍFICOS................................................................................................................... 30

4. METODOLOGIA......................................................................................................... 30

4.1 DESENHO EXPERIMENTAL.......................................................................................... 30

4.2 EXTRAÇÃO E CULTIVO DOS GÂNGLIOS SIMPÁTICOS E DAS CÉLULAS DO

VENTRÍCULO CARDÍACO................................................................................................... 31

4.3 SUBCULTIVO DOS CARDIOMIÓCITOS EM GRUPOS EXPERIMENTAIS…........... 33

4.4 MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE……………………………………..…… 34

21

4.5 ANÁLISE DOS DADOS.................................................................................................... 34

5. RESULTADOS.............................................................................................................. 35

6. DISCUSSÃO................................................................................................................... 54

7. CONCLUSÃO................................................................................................................ 57

REFERÊNCIAS................................................................................................................ 58

ANEXOS.............................................................................................................................. 63

12

1 - INTRODUÇÃO

A célula muscular cardíaca, também chamada de cardiomiócito, possui funções

especializadas e desempenha papel fundamental para a manutenção da vida, uma vez que é a

responsável pela atividade elétrica e contrátil do coração. Assim como outras células

especializadas, não possui capacidade efetiva de regeneração e a sua morte, ou apoptose, é

sempre um evento indesejável, com consequências por vezes catastróficas, como ocorre na

Insuficiência Cardíaca (IC) (1).

A IC é conhecida como a “via final” das cardiopatias. Qualquer doença cardíaca em que

a apoptose do cardiomiócito está implicada desenvolverá, em algum momento da evolução, a

síndrome da IC. A ineficiência energética ou os processos oxidativos deletérios à sobrevivência

celular tem importante papel no desenvolvimento da morte cardiomiocitária (2). Eventos como

a Doença Arterial Coronariana, a qual pode resultar em complicações como o Infarto Agudo

do Miocárdio é importante causa de IC em nosso meio e, dentre outros fatores, é bem

reconhecida à participação dos lípides na fisiopatogenia do processo inflamatório e oxidativo

que dará origem à placa aterosclerótica no endotélio, resultando, por sua vez, em decremento

da oferta de oxigênio ao cardiomiócito, implicando no aumento do processo oxidativo e

inflamatório intracelular.

1.1. ORGANIZAÇÃO MORFOFUNCIONAL DO CARDIOMIÓCITO

O Cardiomiócito é uma célula de formato cilíndrico, considerada de pequenas

dimensões quando comparada a outras células do corpo humano. Medindo aproximadamente

80 µm e 15 µm em seu maior e menor diâmetro, respectivamente, apresenta-se como uninuclear

na maioria das vezes, mas podendo apresentar mais de um núcleo, ocasionalmente, onde, em

suas extremidades, são observados depósitos energéticos, representados por triglicerídeos e

glicogênio (3, 4). Outrossim, o cardiomiócito constitui aproximadamente um terço do

arcabouço celular cardíaco, embora ocupe apenas um quarto do volume miocárdico (5).

Durante seu funcionamento, está submetido a diversos fatores neuro-humorais e, apesar de

possuir diversas propriedades adaptativas a condições fisiológicas ou patológicas, apresenta

13

limitação profunda à capacidade de regeneração, haja vista tratar-se uma célula diferenciada

(6).

As mitocôndrias ocupam grande parte do sarcoplasma cardíaco, representando um terço

do volume do cardiomiócito, sendo, desta forma, o tipo celular com a maior quantidade de

mitocôndrias (4). A vasta presença mitocondrial no cardiomiócito demonstra a relevante

magnitude do metabolismo cardíaco, refletindo-se no alto consumo de oxigênio. Um miócito

cardíaco pode chegar a consumir uma quantidade de oxigênio equivalente ao triplo do seu peso

e, em corações humanos, durante um dia de ciclos de consumo e regeneração de adenosina

trifosfato (ATP), pode representar 15 a 20 vezes o seu próprio peso celular (7). Organizadas de

forma a ocupar o sentido longitudinal do cardiomiócito, dividem espaço com as miofibrilas

cardíacas, estas últimas, unidades funcionais celulares, bem como com a mioglobina - proteína

de baixo peso molecular, carreadora de oxigênio (3).

O retículo sarcoplasmático do cardiomiócito tem presença discreta, em comparação às

demais células. Assim, a capacidade para retenção de Ca++ para início da contração muscular é

insuficiente. O sarcolema, por sua vez, apresenta canais rápidos de cálcio, bem como canais

lentos de sódio, participantes ativos da contração muscular ao permitirem o trânsito de Na+ e

Ca++ no sarcoplasma, adjacentes ao retículo sarcoplasmático. Assim, os íons Ca++ abrem canais

liberadores de cálcio no retículo sarcoplasmático, promovendo entrada adicional de cálcio para

o sarcoplasma, resultando na contração muscular, através do influxo de íons positivos no

interior da célula muscular cardíaca, provocando a despolarização celular (3).

Funcionalmente, o cardiomiócito apresenta poder de contração celular, mas também de

automaticidade e ritmicidade. A contração celular promoverá a função contrátil cardíaca e isso

só é possível devido às terminações do miócito cardíaco, as quais alinham-se e se entrelaçam

para formar os discos intercalares (Figura 1) (3). Os discos intercalares são compostos de três

diferentes tipos de contatos de célula-célula: i) faixa de adesão; ii) desmossomas; iii) gap

junctions. As faixas de adesão ancoram os filamentos de actina (as miofibrilas) e são compostos

de caderina-N como um componente transmembrana, o qual fornece a ligação à célula vizinha

e uma placa citoplasmática contendo, entre outros α-catenina e β-catenina, que, por sua vez,

conectam-se aos filamentos de actina (8).

A conexão intercelular em desmossomas é fornecida pelas caderinas desmosomal,

desmogleína e desmocolina, enquanto a placa citoplasmática consiste de desmoplaquina

14

plaquifilina e plaquiglobina, a qual conecta-se ao filamento de citoesqueleto intermediário,

composto por desmina em células musculares (8).

Por fim, gap junctions são representadas por conexina-43 nos cardiomiócitos

ventriculares e fornecem canais iônicos para comunicação intercelular (9).

Figura 1. A figura ilustra a organização estrutural e ultra-estrutural do tecido cardíaco (3).

15

Figura 2. Composição e interrelação celular da matriz extracelular cardíaca (10).

Além do funcionamento celular propriamente dito, a matriz extracelular é de suma

importância para a homeostase cardíaca, oferecendo um ambiente de comunicação entre as

várias células cardíacas, além do cardiomiócito (11), representada na figura 2. Essa

comunicação é relevante, uma vez que, tanto as células musculares, bem como as outras células

cardíacas, sobretudo os fibroblastos, interagem de diversas formas, em diversas situações, em

condições normais, ou em corações doentes, através da interação de substratos elétricos ou

mecânicos, contribuindo sobremaneira para mudanças fenotípicas observadas em processos

patológicos (12). Enfim, a matriz extracelular cardíaca também promove a regulação entre

outras moléculas do espaço intersticial, distribuindo a força contrátil celular por todo o órgão.

A disfunção ou desequilíbrio dessas condições é uma das condições essenciais para o

desenvolvimento de condições patológicas, traduzidas por remodelamento anormal e fibrose,

observadas após situações de injúria cardíaca (10).

16

1.2. ASPECTOS ESTRUTURAIS E FUNCIONAIS DO GÂNGLIO SIMPÁTICO

Os gânglios simpáticos, assim como grande parte das células do sistema nervoso

autônomo (SNA) periférico, originam-se das porções laterais simétricas da placa neural. No

aspecto sensorial, os derivados da crista neural incluem neurônios unipolares, cujos corpos

celulares estão nos gânglios da raiz dorsal (13).

Os corpos celulares neuronais simpáticos, pré-ganglionares, localizam-se na substância

cinzenta dos cornos laterais da medula espinal. Os axônios dos neurônios pré-ganglionares

saem da medula espinal pelas raízes ventrais dos nervos espinhais, entre os segmentos torácico

(T1) e lombar (L2), conforme observa-se na figura 3, percorrendo o interior de tais nervos, até

atingirem os gânglios simpáticos (14).

Há duas variedades de gânglios simpáticos: i) gânglios da cadeia simpática; ii) gânglios

colaterais. Os primeiros são conectados entre si, formando uma cadeia bilateral, ao longo da

coluna vertebral, sendo, por esse motivo, também denominados de gânglios paravertebrais. Os

gânglios colaterais, entretanto, não se apresentam em pares e estão localizados na cavidade

abdominal e pélvica. Podem receber a denominação de gânglios pré-vertebrais, por estarem

situados anteriormente à coluna vertebral (14).

Os axônios da divisão simpática emergem dos gânglios simpáticos por diversas rotas,

inervando diversos órgãos e estruturas. Dentre tais rotas, destacamos os nervos simpáticos, nos

quais os axônios pré-ganglionares entram na cadeia simpática e fazem sinapse com neurônios

pós-ganglionares (15). Os axônios pós-ganglionares, ao deixarem os gânglios da cadeia

simpática, dão origem aos nervos simpáticos, os quais inervam órgãos da cavidade torácica,

abdominal e pélvica (14).

Nos seres humanos, os corpos celulares pré-ganglionares que se destinam para área

cardíaca estão localizados na substância cinzenta da medula espinal, no segmento torácico entre

T1 e T6. Seus axônios saem da medula espinal para juntar-se à cadeia simpática e,

posteriormente, fazem sinapse em neurônios pós-ganglionares nos gânglios de origem espinal

(Figura 3) ou para o gânglio estrelado (16). A inervação simpática cardíaca, em quase sua

totalidade, surge a partir de tais gânglios, embora exista a descrição de corpos de células pós-

ganglionares presentes no próprio miocárdio. São estes neurônios os responsáveis por modular

17

funções cardíacas vitais para o seu funcionamento (Figura 4), tais como cronotropismo,

dromotropismo, lusitropismo e inotropismo (17).

Figura 3. Representação da estrutura anatômica da organização simpática do sistema nervoso

autônomo e relações entre a medula espinal e os gânglios simpáticos (14).

A maioria dos axônios simpáticos pós-ganglionares responsáveis pela inervação do

coração origina-se de corpos celulares no gânglio estrelado (18), ou do gânglio cervical caudal

(inferior e médio). Chegando ao coração, os nervos simpáticos ramificam-se abundantemente

para inervar os 3 folhetos cardíacos (pericárdio, miocárdio e endocárdio) (19).

18

Figura 4. Representação da integração neuro-cardiológica (14).

1.3. DEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO DO TECIDO CARDÍACO

A IC é uma síndrome clínica complexa e abrangente, por vezes, com limites imprecisos

quanto à sua definição, haja vista a heterogeneidade de cardiopatias que podem levar ao

desenvolvimento da IC (20). Atinge, aproximadamente, 38 milhões de indivíduos no mundo,

representando um problema de saúde global, sendo mais frequente em populações acima de 65

anos (21).

Entretanto, a condição clínica observada na síndrome da IC é apenas um resultado de

múltiplas disfunções moleculares, celulares e neuroadaptativas, culminado no desarranjo do

funcionamento e comunicação intercelular de cardiomiócito e fibroblastos cardíacos, com

perda de suas funções e, consequente falência orgânica cardíaca (1, 22).

No desenvolvimento da IC as alterações metabólicas, em nível celular, representadas

por alterações na quantidade e funcionamento mitocondrial, provocando insuficiente produção

energética é uma condição bem caracterizada (23). Além disso, mecanismos de apoptose

celular, com proliferação de fibroblastos (24), em associação com maior produção de colágeno

e degradação da matriz extracelular levam a uma condição conhecida como remodelamento

cardíaco e fibrose cardíaca (25, 26).

19

O termo remodelamento cardíaco refere-se às alterações na estrutura e funcionamento

cardíaco, traduzidas em anormalidades da forma, volume, massa e composição muscular, após

injúria ou lesão miocárdica (27). Durante o remodelamento cardíaco, observam-se dois padrões

básicos de hipertrofia miocárdica: i) hipertrofia concêntrica e ii) hipertrofia excêntrica (27-29),

representadas na Figura 5. A hipertrofia concêntrica é decorrente da sobrecarga de pressão

intraventricular, provocando aumento da massa e hipertrofia, com organização dos

cardiomiócitos em paralelo. Na hipertrofia excêntrica, há aumento da massa muscular, com

organização em série dos cardiomiócitos, sendo decorrente da sobrecarga de volume sanguíneo

ao ventrículo. Observa-se dilatação ventricular progressiva, com falência sistólica do coração

(28, 29).

Figura 5. Representação esquemática do padrão morfofuncional da hipertrofia ventricular (27).

Não obstante, em situações de injúria cardíaca, a resposta neuronal decorrente da lesão

miocárdica provoca consequências diretas no funcionamento cardíaco, levando à redução do

débito cardíaco, provocando redução de enchimento vascular, situação detectável por

barorreceptores arteriais (30). Inicialmente, como tentativa adaptativa em uma situação de

anormalidade, através dos barorreceptores, há ativação aferente do sistema neuroendócrino,

20

com aumento do tônus simpático e redução do tônus parassimpático, promovendo aumento do

débito cardíaco, por elevação da frequência cardíaca e resistência vascular periférica (31).

Além da ativação do sistema simpático, a redução do débito cardíaco, consequente à

disfunção da bomba cardíaca, promove o surgimento de outros mecanismos adaptativos, dentre

os quais o sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) apresenta papel tão importante

quanto a hiperestimulação simpática (1, 20), representados na Figura 6. Os efeitos imediatos da

estimulação do SRAA são observados pelo aumento da retenção de sódio e água e aumento da

resistência vascular periférica (5). Outrossim, tais mecanismos, inicialmente também

adaptativos, tornam-se deletérios ao longo do tempo (1), com consequente aumento da apoptose

do cardiomiócito (32), hiperativação dos fibroblastos, e aumento da fibrose cardíaca,

promovendo aumento da disfunção cardíaca e servindo de substrato para ocorrência de

arritmias e até morte súbita (30).

Figura 6. Interrelações orgânicas do sistema renina-angiotensina-aldosterona na Insuficiência

Cardíaca (27).

21

Em situações de injúria cardíaca, mecanismos como apoptose e autofagia tornam-se

presentes. Enquanto a apoptose representa um processo ativo na evolução da disfunção

cardíaca, a autofagia parece exercer uma função dupla e antagônica (32). Inicialmente, a

autofagia protege o coração, destruindo cardiomiócitos com disfunções mitocondriais e

estruturais, apresentando-se como um mecanismo adaptativo em situações como a IC.

Entretanto, também pode desenvolver potencial deletério, tal qual a apoptose, uma vez que a

destruição abundante dos cardiomiócitos tornará o miocárdio ainda mais insuficiente, além de

disseminar, através de vacúolos autofágicos, diversas substâncias citotóxicas (32).

Existe, portanto, uma busca incessante quanto ao surgimento ou aprimoramento de

técnicas capazes de proteger os cardiomiócitos de processos inflamatórios e oxidativos que

levariam à morte celular. Tal busca tem levado a diversas direções, como o transplante de

células musculares esqueléticas para o coração, com intuito de que assumam função similar às

desempenhadas pelo cardiomiócito; transplante de células troncos em áreas cardíacas

fibrosadas; aplicação de fatores tróficos, melhorando a vascularização celular, além da

administração de fatores antioxidantes e antiinflamatórios, o que poderia reduzir as taxas de

apoptose celular em determinadas condições desfavoráveis ao funcionamento do cardiomiócito

(21).

Apontada como perspectiva no tratamento de disfunções do cardiomiócito, a

regeneração cardíaca endógena exige a presença e divisão de cardiomiócitos, sendo assim, uma

possibilidade historicamente remota para remissão de situações de disfunção miocárdica.

Intervenções e técnicas para estimulação da proliferação de cardiomiócitos tem sido

amplamente pesquisadas, com potencial promissor na linha de pesquisa de células troncos, ou

processos de “remuscularização”, através da adição de cardiomiócitos exógenos (33). Em

situações de infarto do miocárdio, uma das causas no desenvolvimento da IC (1), fibroblastos

cardíacos apresentam potencial para reprogramação e diferenciação em cardiomiócitos (34). A

reprogramação genética de cardiomiócitos em animais, na tentativa de regeneração e

reprodução muscular tem apontado resultados ainda de pouco impacto clínico, sugerindo que,

à luz de maior conhecimento genético do cardiomiócito, torne-se uma opção mais efetiva no

futuro (35).

Recentemente, estudos sugerem que populações de células cardíacas, distintas dos

cardiomiócitos, tais quais macrófagos e fibroblastos, em situações de agressão e inflamação do

22

miocárdio, podem induzir regeneração miocárdica, apontando para a possibilidade de que a

própria reação inflamatória possa significar uma via alternativa para a regeneração, desde que

adequadamente modulada (36).

Por sua vez, os fatores neurotróficos são polipeptídeos que auxiliam no processo

regenerativo. Compreendem basicamente um conjunto de famílias de moléculas e seus

receptores responsáveis por manter o crescimento e a sobrevivência celular, após danos

teciduais, sendo os Fatores de Crescimento Fibroblástico um dos seus representantes. Diversos

fatores tróficos, também conhecidos como fatores de crescimento, são utilizados e testados in

vitro e in vivo na regeneração celular. Essas proteínas atuam diretamente na proliferação e

diferenciação de diferentes tipos celulares, sendo capazes de promover reparo tecidual e

recuperação funcional (37).

1.4 FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO

Os Fatores de Crescimento Fibroblástico (FGFs) apresentam papel de destaque como

perspectiva para tratamento de doenças cardíacas. Tratam-se de polipetídeos com diversas

funções biológicas, desde o desenvolvimento de tecidos até o controle metabólico (38).

Consistem num conjunto de 23 proteínas responsáveis pela proliferação, migração

diferenciação e sobrevida de células que expressem receptores de FGFs (39). No coração,

exercem influência desde o desenvolvimento e diferenciação, até o mecanismo de autofagia e

apoptose cardiomiocitária (40).

Assim, o efeito dos FGFs no funcionamento do cardiomiócito desponta como

importante campo de pesquisa para desenvolvimento de terapias adjuvantes e efetivas em casos

de injúria cardíaca.

1.4.1 Fator de Crescimento Fibroblástico-2 (FGF-2)

O FGF-2 pertence a uma vasta família (FGF-1 a FGF-23) de fatores de crescimento

heparina conjugados, com ampla função em nível tecidual e celular. Os FGFs, em geral, agem

23

por mecanismo de ligação aos receptores tirosina-quinase da membrana plasmática, embora

com diferentes afinidades (41). A tendência ou preferência de ligação nas interações entre os

FGFs e seus receptores são apontadas como responsáveis para o desenvolvimento celular e

definição da especificidade de cada tecido (42). Além disso, estudos sugerem que o FGF-2

participa da diferenciação de células cardíacas em cardiomiócitos, o que apresentaria potencial

valor, não só regenerativo cardíaco para tratamento de cardiopatias, mas também

cardioprotetor, através de seu potencial mitogênico e angiogênico (40, 43). Sua expressão

genética é estimulada por condições de estresse e injúria cardíaca, tais como hipóxia e isquemia,

bem como angiotensina II e estímulos adrenérgicos (41).

Especificamente, o FGF-2 é extensivamente encontrado e apresenta 2 isoformas com

pesos moleculares diferentes: Lo-FGF-2, considerada de baixo peso molecular (18kDa) e Hi-

FGF-2, de alto peso molecular (20-34 kDa) (44).

1.4.1.1 Isoforma Lo-FGF-2

A isoforma LoFGF-2 é a partícula mais estudada do FGF-2. Apresenta atividades de

estímulo cardíaco, hipertrofia do cardiomiócito, levando à hipertrofia ventricular. Pode ser

encontrado tanto em ambiente intracelular quanto extracelular e é capaz de desempenhar suas

funções por ativação intracelular ou através de sinalização parácrina e autócrina (45).

Além de potente agente mitogênico, o Lo-FGF-2 é também importante e poderoso fator

angiogênico. Sua atividade é estimulada por processo de injúria celular, aguda ou crônica. Uma

vez que os cardiomiócitos expressam receptores funcionais para o FGF-2, em todas as fases da

vida, estão plenamente susceptíveis à sua ação. O Lo-FGF-2 desenvolve ações moleculares que

resultam em efeitos protetores do cardiomiócito, com preservação da viabilidade muscular,

através da migração de células para angiogênese e preservação de metabólicos energéticos

cardíacos (41), agindo, inclusive na proteção mitocondrial (46).

24

1.4.1.2 Isoforma Hi-FGF-2

Embora seja a isoforma menos estudada do FGF-2, tal molécula apresenta importante

papel na definição da manutenção do cardiomiócito, sendo também denominada FGF-2

nuclear, por exercer atividades exclusivamente nucleares (47). Estudos apontam que sua

influência no cardiomiócito é indireta, provocando apoptose celular por inibição da

angiogênese e migração de células endoteliais (48). Assim, observa-se que níveis elevados de

Hi-FGF-2 estão associados à susceptibilidade de isquemia e injúria celular, não apresentando

qualquer efeito benéfico no cardiomiócito. Embora não se conheça ainda a forma que o Hi-

FGF-2 exerce sua função extracelular, há fortes indícios de sua ação pró-inflamatória e

promotora de fibrose, com morte do cardiomiócito e sua substituição por fibroblastos, sendo

aparentemente implicada em mecanismos de apoptose e morte celular (45).


Caracterizado inicialmente em modelos animais, apresenta concentração e expressão no

tecido gorduroso pardo de embriões (49). Apresenta potencial de regulação e proliferativo dos

cardiomiócitos no período perinatal (50). Entretanto, estudos apontam para uma ausência de

efeitos significativos do FGF-16 em corações adultos, apesar de observar-se a persistência da

sua expressão nesta fase da vida (38).


O FGF-21 é encontrado no fígado, tecido adiposo e células beta do pâncreas. Enquanto

a maioria das moléculas pertencentes à família FGF regulam a proliferação e diferenciação

celular, o FGF-21 apresenta função primordialmente de regulação do metabolismo glicídico e

lipídico (51, 52). Estudos experimentais em ratos demonstraram, no entanto, importantes

efeitos cardiomiocitários. Em resposta à injúria cardíaca, há liberação maciça de FGF-21, o

qual, por sua vez, contribui para cardioproteção em eventos isquêmicos, através de mecanismos

25

endócrinos, promovendo redução da apoptose celular e consequente sobrevida do

cardiomiócito ( 53). Há também indícios de que a infusão de FGF-21 em ratos apresenta

redução da disfunção sistólica ventricular após eventos de infarto do miocárdio, além de

redução da apoptose celular após reperfusão cardíaca (54), bem como redução do estresse

oxidativo, também reduzindo a morte celular após reoxigenação do cardiomiócito isquêmico

(55).

Além disso, recentemente, estudos em ratos obesos comprovaram que o FGF-21

também é secretado por cardiomiócitos e apresenta efeito de “feedback” positivo, estimulando

a sua própria produção e secreção, em situações de injúria miocárdica, promovendo efeitos

cardioprotetores (56), provavelmente por facilitar e aumentar a captação de glicose pelo

cardiomiócito em condição de isquemia tissular (57).


O FGF-23 é uma proteína pertencente à subfamília do FGF-19, produzida nos

osteoblastos e osteócitos. Originalmente, apresenta função endócrina com atividade renal,

inibindo a reabsorção de fosfato no túbulo contorcido proximal, reduz a circulação e níveis

sérios de vitamina D, bem como suprime a secreção do paratormônio (PTH) (58).

Embora as funções endócrinas do FGF-23 em nível renal estejam estabelecidas, estudos

em modelos experimentais apontam para a quebra de um novo paradigma, uma vez que níveis

elevados desta proteína, em torno de mil vezes do valor habitual, estão presentes em condições

de disfunção cardíaca por hipertrofia ventricular esquerda (HVE) (59). A HVE, por sua vez, é

uma condição clínica prevalente em pacientes com insuficiência renal em estágio terminal e

atribui-se sua existência a condições de enrijecimento vascular, com consequente aumento da

pós-carga, resultando em hipertrofia do músculo cardíaco (60).

Ainda não existe consenso se a presença de níveis elevados de FGF-23 em nefropatas

terminais representam apenas um marcador diagnóstico de cardiopatia, ou se podem ser

relacionados como fatores ativos causais na disfunção cardíaca (59). Por outro lado, um número

cada vez maior de estudos aponta para uma relação direta e causal entre níveis elevados do

FGF-23 e a presença de HVE. Experimentos com ratos apontam para mecanismos complexos,

26

mas com ação em nível vascular e cardíaco, efeito dose-dependente no aumento de tamanho do

cardiomiócito, incremento na síntese e liberação de proteínas marcadoras de hipertrofia e

aumento na expressão de genes marcadores de hipertrofia (59, 61, 62). Além disso, demonstrou-

se que a exposição aguda a elevadas concentrações de FGF-23 promoveaumento substancial do

cálcio intracelular no cardiomiócito, aumentando a contratilidade cardíaca (59).

Pesquisas recentes tem apontado para uma interação entre o FGF-23 e o receptor celular

de FGF-4, onde a ação deste último sinalizaria para o desenvolvimento de HVE e posterior

morte cardiomiocitária, através de um processo acelerado de envelhecimento celular (63).

Dados complementares comprovam essa interação, inclusive apontando para a inibição da ação

do FGF-24 através da vitamina D (64).

Por fim, o FGF-23 representa importante e poderoso fator de risco para eventos

cardiovasculares em pacientes portadores de nefropatia avançada (58) e pode apresentar-se

como importante agente de intervenção para tratamento de cardiopatias relacionadas à doença

renal avançada (58, 65).

A tabela 1 e a figura 7 demonstram síntese dos diversos FGFs e suas relações com

localização, ação primordial, estímulo para ativação, efeito no cardiomiócito e perspectivas de

aplicabilidade na regeneração cardíaca.

27

Figura 7. Ilustra célula adiposa, hepatócito, célula β do pâncreas, osteoblasto, osteócito e

fibroblasto, assim como a secreção de tipos de FGFs por essas células e suas ações na injúria

cardíaca.

FGF-23

FGF-23

28

Tabela 1. Demonstra os diversos fatores de crescimento derivados da linhagem dos fibroblastos (FGFs 2, 16, 21 e 23) e suas relações com

localização, ação primordial, estímulo para ativação, efeito no cardiomiócito e perspectivas de aplicabilidade na regeneração cardíaca.

Características FGF-2 FGF-16 FGF-21 FGF-23

Localização - Ampla, presente na

maioria dos tecidos

- Tecido gorduroso pardo de

embriões

- Fígado

- Tecido adiposo

- Células beta do pâncreas

- Cardiomiócito

- Osteoblastos

- Osteócitos

Ação primordial - Diferenciação celular - Formação celular cardíaca - Regulação do mecanismo

lipídico e glicídico

- Regulação endócrina do

metabolismo renal

Estímulo para ativação

- Injúria cardíaca (isquemia)

- Angiotensina II

- Efeitos adrenérgicos

- Desconhecido - Injúria cardíaca (isquemia)

- Enrijecimento vascular

(aumento de pós-carga)

Efeito no cardiomiócito

- Diferenciação celular

- Mitogênese

- Hipertrofia

- Angiogênese

- Proliferação de

cardiomiócitos no período

perinatal

- Inibição da apoptose

celular

- Redução do estresse

oxidativo

- Aumento da captação de

glicose

- Hipertrofia

Perspectiva de

aplicabilidade

- Regeneração celular

cardíaca

- Cardioproteção celular

- Regeneração celular

cardíaca - Cardioproteção celular

- Marcador diagnóstico e

prognóstico de hipertrofia

ventricular

29

2 - JUSTIFICATIVA

A busca de mecanismos para interrupção do processo de deterioração do cardiomiócito

tem apontado em diversas direções. Destaca-se, em importância, a perspectiva de utilização de

Fatores de Crescimento Fibroblástico (FGF), uma vez que tem se observado, em estudo

experimentais, a liberação de tais proteínas por miócitos cardíacos em condições de injúrias e

lesões do miocárdio (66). Diversos outros estudos tem demonstrado a importância do FGF, não

apenas na regeneração da célula cardíaca, mas também na proteção e melhora da sobrevida do

miócito cardíaco em situações adversas (67), tornando-o uma promissora esperança na

interrupção do processo de desenvolvimento da falência cardíaca. O gânglio simpático possui

componentes celulares importantes como: fibroblastos e células satélites, os quais exercem

efeitos tróficos na organização neuronal desta estrutura. Sendo assim torna-se relevante avaliar

o efeito do meio condicionado produzido por esses gânglios na plasticidade e trofismo de

cardiomiócitos em cultura, desta forma analisando o efeito direto deste meio, podendo servir

como alternativa de composição sintética para tratamento de áreas cardíacas prejudicadas.

Além disso, espera-se o efeito sinérgico do FGF-2 e meio condicionado do gânglio simpático

(MCGS) na plasticidade e trofismo dos cardiomiócitos em cultura.

3 - OBJETIVOS

3.1 - GERAL

Analisar o comportamento tróficos dos cardiomiócitos em cultura após adição de meio

condicionado dos gânglios simpáticos (MCGS) na presença do fator de crescimento

fibroblástico 2 (FGF-2).

30

3.2 - ESPECÍFICOS

- Avaliar o trofismo morfológico promovido pelo MCGS e pela adição do FGF-2 a partir

dos seguintes parâmetros:

- Morfologia do gânglio simpático pela microscopia de contraste de fase (MCF);

- Intesidade e perfil celular migratório do gânglio simpático através da MCF;

- Tipo de migração celular do gânglio simpático em função do tempo em cultura através

da MCF;

- Evolução do perímetro e da área dos cardiomiócitos por 72 horas através da MCF;

- Confecção e solicitação de um pedido de patente da potencialidade do MCGS em tratar

injúria cardíaca no Instituto Nacional da Propriedade Intelectual (INPI).

4 - METODOLOGIA

4.1 DESENHO EXPERIMENTAL

Para a realização do experimento foram utilizados 4 animais (ratos da linhagem Wistar

- Rattus novergicus) machos com idade entre 40 a 50 dias e peso aproximado de 150 gramas

que permaneceram na sala de acondicionamento de animais do laboratório de Neurologia

Experimental da UERN em estante ventilada com fluxo bacteriológico por uma semana antes

de serem utilizados, sendo mantidos em gaiola plásticas (30 x 16 x 19 cm) coletiva, com 2

animais por gaiola e com temperatura média de 22 ± 2ºC, alimentados com ração padrão e água

de torneira fornecida ad libitum. O projeto atendeu às normas para a realização de pesquisa em

animais com todos os procedimentos, sendo aprovado pela Comissão de Ética em

Experimentação Aninal (CEEA) da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN),

recebendo número de protocolo 006/15 (Anexo).

31

4.2 EXTRAÇÃO E CULTIVO DOS GÂNGLIOS SIMPÁTICOS E DAS CÉLULAS DO

MIOCÁRDIO DO VENTRÍCULO CARDÍACO

No interior do fluxo laminar, placas para cultura, P60 foram preparadas com 5ml do

meio Leibovitz-15 (L-15: GIBCO Invitrogen Corporation). Nos animais que foram submetidos

à extração dos gânglios simpáticos, foi realizada a eutanásia e, posteriormente, a realização de

tricotomia na região torácica anterior e abdominal, procedendo à assepsia local com álcool a

70%. A seguir, foram realizados os acessos cirúrgicos na região mediana da face anterior do

tronco, afastando os planos musculares e ósseos, removendo os blocos de vísceras do tronco e

abdome, resultando na exposição da cadeia paravertebral (tronco simpático) dos gânglios

simpáticos.

Procedeu-se a exérese dos gânglios simpáticos e estes foram acondicionados em placas

P60 com meio L-15, sob técnica cirúrgica asséptica com o auxílio de microinstrumentos

(tesoura, pinça, afastadores). Todo excesso de tecido (músculo, gordura e vasos sanguíneos) foi

removido sob magnificação por lupa estereoscópica SZ61 (Olympus®).

A cadeia paravertebral de gânglios simpáticos dissecada foi segmentada em gânglios

isolados no interior do fluxo laminar, sendo estes colocados em placas P30 com 2mL de meio

Knockout DMEM low (Dulbecco`s modified Eagle`s medium), suplementado com 10% de soro

bovino fetal e 10μg/mL de gentamicina, meio este denominado de D-10, sendo todos obtidos

da Cultilab®. Em cada placa P30 foram adicionados 10 gânglios simpáticos.

O excesso do meio foi removido de forma que os gânglios não ficassem flutuando, nem

tão pouco submersos no meio. Com o progredir do tempo o meio condicionado foi coletado,

colocado em eppendorfs de 1,5mL e acondicionados em freezer -80ºc conforme ilustra a figura

8, o qual foi utilizado para tratar os cardiomiócitos em cultura, na adição ou não do FGF-2.

32

Figura 8. A figura ilustra eppendorf com MCGS acondicionado.

Regiões ventriculares esquerdas foram removidas do coração de 2 ratos Wistar e, em

seguida, submetidas a extração de fragmentos do miocárdio. Para isto foi utilizado o protocolo

de Chlopcikova e colaboradores (2001). Os ratos foram decapitados e realizado toracotomia

para remoção dos corações. Em seguida, procedeu a separação de átrios e ventrículos, sendo os

átrios desprezados e os ventrículos imersos em tubo falcon de 15 mL, contendo 4 mL de meio

L-15. No interior do fluxo laminar, foi realizado o processo de limpeza e isolação ventricular

em placa P60 com L-15, com auxílio de tesouras, pinças e espátula pequena, resultando a coleta

de fragmentos do miocárdio.

Após a obtenção dos fragmentos do miocárdio, os mesmos foram depositados em placas

P30 com 2 ml de D-10 por 3 dias. Em seguida, estes fragmentos foram submetidos a sucessivos

ciclos de digestão enzimática com 5 mL de solução de 1mg/mL de tripsina (fornecida pela Call

Fisher) e digestão mecânica com movimento de pipetagem repetitiva.

A amostra foi centrifugada a 3000 rpm, por 5 minutos, por 3 vezes com a finalidade de

se recuperar o decantado celular. As células obtidas com os ciclos de digestão enzimática e

mecânica foram, então, ressuspensas em 5 mL de D-10. Após, semeadas em placas de Petri de

30mm e incubadas por quarenta minutos em incubadora com atmosfera de 5% de CO2 a 37°C.

33

Os cardiomiócitos foram normalmente separados das células mesenquimais

(fibroblastos) por tempo de aderência diferencial à placa de P30. As células mesenquimais se

aderem mais rapidamente à placa em relação aos cardiomiócitos (66, 67). Após o período de

incubação de 40 minutos, e em suspensão, procedeu com a coleta dos cardiomiócitos, por

aspiração do meio de cultura e, em seguida, contados em câmara de Neubauer.

Placas para cultura com 6 poços foram preparadas com 2 mL de soro bovino fetal,

retirado e desprezado após 30 minutos. Na sequência, adicionado 2 mL de D-10, em seguida,

realizado o gotejamento das células recém extraídas, mantidas em estufa úmida a 370C com 5%

de CO2 e 95% de ar. A microscopia de luz invertida com contraste de fases foi utilizada para

observação da adesão celular no fundo dos poços.

4.3 SUBCULTIVOS DOS CARDIOMIÓCITOS EM GRUPOS EXPERIMENTAIS.

As células foram depositadas em 12 poços, sendo 3 poços para cada grupo e observadas

em quatro período de tempo: 24, 48 e 72 horas. Com este procedimento foi possível avaliar a

aderência, proliferação e plasticidade/trofismo dos cardiomiócitos nos seguintes grupos:

Grupo 1 (G1): Cardiomiócito + meio D-10;

Grupo 2 (G2): Cardiomiócito + meio D-10 + MCGS;

Grupo 3 (G3): Cardiomiócito + meio D-10 +MCGS + FGF-2;

Grupo 4 (G4): Cardiomiócito + meio D-10 + FGF-2;

Nos grupos de 2 e 3 foi retirado 0,2ml de meio D-10 e adicionado 0,2ml de meio MCGS,

o qual foi coletado do meio onde estavam plaqueados os gânglios simpáticos.

34

4.4 MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE

Para observação celular foi utilizado um MCF CKX41 (Olympus®) com câmera digital

Moticam 3.0 (Motic®) acoplada.

Para análise morfométrica celular foi realizado a captação de imagens em 9 campos

demarcados inicialmente, conforme ilustra a figura 9, não sobrepostos no aumento de 20x, desta

forma foram feitas microfotografias dos 4 grupos nos 3 períodos de tempo.

Figura 9. Campos de observação celular nas P60.

4.5 ANÁLISES DOS DADOS

Dois investigadores independentes e cegos analisaram a morfometria celular, desta

forma procedendo com a contagem das células em sistema previamento calibrado (Kappa =

0,94) por campo em número absolutos, aferindo o perímetro (µm) e área (µm2) de cada célula

em campos visuais não sobrepostos, usando cultura de células de no mínimo 3 experimentos

diferentes com aumento de 20x. Foram utilizados o software Motic Images Plus 2.0 (Motic®)

para observação morfométrica, o software Image-J para contagem celular, bem como software

Adobe Photshop CS6.0 (Adobe®) para correção mínima de brilho e contraste das

fotomicrografias.

35

O banco de dados da pesquisa foi construído na plataforma do software, com posterior

verificação de consistência da digitação. Após a estruturação final do banco de dados, foi

realizada inicialmente uma análise descritiva de todos os dados (área e perímetro celular).

Os dados da morfologia celular ao longo das 72 horas foram comparados

estatisticamente através da análise de variância (51) com pós teste de Fisher e Bonferone

considerando significante quando p < 0,05.

5 - RESULTADOS

Nas placas com gânglios simpáticos (Figura 10) observa-se a organização estrutural da

parte interna ganglionar no aumento de 40x através da MCF.

Figura 10. Organização estrutural da parte interna do gânglio simpático. Escala 100μm.

Nas culturas com gânglios simpáticos (24hs) constatou-se a migração de uma grande

população celular, sendo essas células identificadas como células satélites (Figura 11A, B e C).

36

Figura 11. As figuras ilustram migração celular do gânglio simpático (A e B, aumentos de 10

e 20x, respectivamente) e o padrão morfológico das células satélites apontadas pela cabeça de

seta (C aumento de 40x) nas primeiras 24hs. Escala 100μm.

No período de 48hs em cultura foi observado a migração das células fibroblastóides dos

gânglios simpáticos (setas). Observamos o gânglio simpático e o perfil de migração celular

(Figura 12A), fibroblastos (seta) e células satélites (cabeça de seta) em aumento de 20x (Figura

12B) e 40x (Figura 12C).

Migração

Celular

Migração

Celular

A B

C

37

Figura 12. As figuras ilustram migração de um segundo perfil celular (fibroblastos) do

gânglio simpático (A em aumento de 10x) e o padrão morfológico dos fibroblastos (seta) e das

células satélites (cabeça de seta) em B no aumento de 20x e C no aumento de 40x após 48hs.

Escala 100μm.

Gânglio

Simpático

Migração

Celular

Fibroblasto

Fibroblasto

A

B

C

38

Após 72hs foi observada a migração de neurônios dos gânglios simpáticos. Observamos

o gânglio simpático e o perfil de migração celular (Figura 13A em aumento de 10x). Neurônios

(seta) e células satélites (cabeça de seta) em aumento de 20x (Figura 13B) e 40x (Figura 13C).

Neste período de análise observamos diminuição na migração de células com perfis

celulares satélite e fibroblasto e predominância da migração neuronal.

No período de 96hs de análise os neurônios continuaram a migrar do gânglio simpático

conforme ilustra a figura 14A, demonstrando células neuronais em diversos estágios de

desenvolvimento, sendo assim observamos o desenvolvimento morfológico mais trófico dessas

células conforme aponta a seta em 14B aumento de 20x e em 14C no aumento de 40x.

Após os procedimentos de subcultivos e formação dos grupos de estudo, as células

ficaram aderidas ao fundo das placas e foram acompanhadas ao longo de 3 dias para

observação do crescimento populacional, área e perímetro.

As culturas de células realizadas, quando cultivadas em MCGS acrescido de FGF-2,

apresentaram alterações mais visíveis quando comparadas com culturas desprovidas desse

tratamento, possibilitando a identificação mais evidente da morfologia dos cardiomiócitos,

resultando desta forma em efeito plástico (Figura 15).

39

Fgura 13. As figuras ilustram migração de um terceiro perfil celular (neurônios) do gânglio

simpático. Neurônios são apontados pela seta e as células satélites pela cabeça de seta em A no

aumento de 10x, em B no aumento de 20x e em C no aumento de 40x após 72hs. Escala 100μm.

Gânglio

Simpático

Célula

satélite

Neurônio

Célula

satélite

Neurônio

Célula

satélite

Neurônio

A

B

C

40

Figura 14. As figuras mostram a continuidade da migração neuronal e o desenvolvimento

trófico dessas células. Escala 100μm.

Célula satélite

Neurônio

Neurônio

Neurônio

Célula satélite

C

B

A

41

Figura 15. Aspectos Morfológicos dos cardiomiócitos (seta) em A aumento de 20x e em B

aumento de 40x. Escala 100μm.

A

B

42

As populações dos cardiomiócitos utilizados foram morfologicamente homogêneas.

As culturas de células derivadas do miocárdio, quando cultivadas em MCGS e FGF-2 (G-

24hs, H-48hs e I-72hs), apresentaram alterações mais visíveis quando comparadas com as

culturas cultivadas somente em meio D-10 (A-24hs, B-48hs e C-72hs) MCGS (D-24hs, E-

48hs e F-72hs) ou somente com FGF-2 (J-24hs, K-48hs e L-72hs), sobretudo com o passar

dos dias de observação microscópica (Figura 16).

Figura 16. Morfologia das células após formação dos grupos experimentais por 72 horas.

Grupo 1: painéis A (24 horas), B (48 horas), C (72 horas); Grupo 2: Painéis D (24 horas), E (48

horas), F (72 horas); Grupo 3: Painéis G (24 horas), H (48 horas), I (72 horas); Grupo 4: Painéis

J (24 horas), K (48 horas), L (72 horas). Escala 100μm. Aumento de 20x.

A B C

D E F

G H I

J K L

43

Considerando a medição do perímetro celular dos cardiomiócitos como parâmetro

morfométrico, observou-se que ao longo dos três dias de observação dos grupos 1, 2, 3 e 4 (D-

10, MCGS, MCGS+FGF-2 e FGF-2, respectivamente) as células aumentaram seu perímetro.

No dia 1 (24horas) de aferição, o perímetro médio das células dos grupos 2, 3 e 4 foram

superiores às do grupo 1 apresentando mesmo valor de p=0,0001 entre eles. Na análise

comparativa entre os grupos 2, 3 e 4 observamos que o grupo 3 apresentou perímetro mais

extenso quando comparado aos grupos 2 e 4 (p=0,0001). Além disso, foi observado que o grupo

2 demonstrou perímetro maior quando comparado ao grupo 4 (p=0,016). O valor de p=0,0001

foi mais significativo quando comparado o grupo 3 com o grupo 4, já a comparação entre o

grupo 2 e o grupo 4 mostrou um valor de p=0,016, mostrando assim desenvolvimento trófico

mais evidente proporcionado pelo MCGS acrescido de FGF-2 (Gráfico 1).

No dia 2 (48horas) e 3 (72horas) de análise, o perímetro médio das células dos grupos

2, 3 e 4 permaneceram superiores às do grupo 1, conforme apresentado em 24horas (p=0,0001).

Na análise comparativa entre os grupos 2, 3 e 4 também observamos que o grupo 3 apresentou

perímetro mais amplo quando comparado aos grupos 2 e 4 (p=0,0001). Além disso, observamos

que o grupo 2 aumentou seu perímetro quando comparado ao grupo 4, aumentando assim seu

nível de significância de um valor de p=0,0016 apresentado em 24horas para um valor de

p=0,0001 em 48horas, se mantendo nas 72horas (Gráfico 1).

Considerando a medição da área celular dos cardiomiócitos como parâmetro

morfométrico, observou-se que ao longo dos três dias de observação dos grupos 1, 2, 3 e 4 as

células aumentaram sua área. No dia 1 (24horas) e dia 2 (48horas) de aferição, a área das células

dos grupos 2, 3 e 4 foram superiores às do grupo 1, apresentando o mesmo valor de p=0,0001).

Na análise comparativa entre os grupos 2, 3 e 4 observamos que o grupo 3 apresentou área

maior quando comparado aos grupos 2 e 4 (p=0,0001). Além disso, foi observado que o grupo

2 demonstrou área maior também quando comparado ao grupo 4 (p=0,0001) (Gráfico 2).

44

Gráfico 1: Representação gráfica mostra as médias e erro padrão da média dos níveis do

perímetro celular dos cardiomiócitos tratados com D-10, MCGS, MCGS+FGF-2 ou FGF-2. As

análises foram conduzidas diariamente por 3 dias, seguida de teste ANOVA de comparações

múltiplas com pós testes de Tukey e Bonferroni de comparação entre os grupos nos períodos

das análises.

No dia 3 (72horas) de análise, a área das células dos grupos 2, 3 e 4 permaneceram

superiores às do grupo 1, conforme apresentado em 24 e 48horas de análise (p=0,0001). Na

análise comparativa entre os grupos 2, 3 e 4 também observamos que o grupo 3 apresentou área

maior quando comparado aos grupos 2 e 4 (p=0,0001). Além disso, observamos que o grupo 4

diminuiu sua área celular quando comparado ao grupo 1, diminuindo assim seu nível de

significância de um valor de p=0,0001 apresentado em 24 e 48horas para um valor de p=0,018,

entretanto o nível de significância apresentado demonstra efeito plástico importante (Gráfico

2).

45

Gráfico 2: Representação gráfica demonstra as médias e erro padrão da média dos níveis de

área dos cardiomiócitos tratados com D-10, MCGS, MCGS+FGF-2 ou FGF-2. As análises

foram conduzidas diariamente por 3 dias, seguida de teste ANOVA de comparações múltiplas

com pós testes de Tukey e Bonferroni de comparação entre os grupos nos períodos das análises.

Na análise do tempo de observação referente ao perímetro celular dos cardiomiócitos,

observou-se que ao longo dos três dias de observação do grupo 1 as células aumentaram seu

perímetro (24 para 48horas p=0,001, 24 e 48 para 72horas p=0,0001) conforme demonstra

Gráfico 3.

46

Gráfico 3: Representação gráfica mostrando as médias e erro padrão da média dos perímetros

dos cardiomiócitos tratados com D-10. As análises foram conduzidas diariamente por 3 dias,

seguida de teste ANOVA de comparações múltiplas com pós testes de Tukey e Bonferroni de

comparação entre os grupos nos períodos das análises.

Em se tratando do tempo de observação referente à área celular dos cardiomiócitos como

parâmetro morfométrico, observou-se que ao longo dos três dias de observação do grupo 1 as

células aumentaram sua área apresentando valor de p=0,0001 nos três períodos conforme ilustra

o Gráfico 4.

47

Gráfico 4: Representação gráfica mostrando as médias e erro padrão da média da área dos

cardiomiócitos tratados com D-10. As análises foram conduzidas diariamente por 3 dias,




observou-se que ao longo dos três dias de observação do grupo 2 que as células aumentaram

sua área apresentando valor de p=0,0001 em relação a comparação entre os períodos de tempo

conforme demonstra Gráfico 5.

48


dos cardiomiócitos tratados com MCGS. As análises foram conduzidas diariamente por 3 dias,





células aumentaram sua área (p=0,0001) em relação a comparação entre os períodos de tempo


.

49


cardiomiócitos tratados com MCGS. As análises foram conduzidas diariamente por 3 dias,





sua área (p=0,0001) em relação a comparação entre os períodos de tempo conforme ilustra o

Gráfico 7.

50


dos cardiomiócitos tratados com MCGS+FGF-2. As análises foram conduzidas diariamente por

3 dias, seguida de teste ANOVA de comparações múltiplas com pós testes de Tukey e

Bonferroni de comparação entre os grupos nos períodos das análises.





.

51


cardiomiócitos tratados com MCGS+FGF-2. As análises foram conduzidas diariamente por 3

dias, seguida de teste ANOVA de comparações múltiplas com pós testes de Tukey e Bonferroni

de comparação entre os grupos nos períodos das análises.



seu perímetro (24 para 48horas p=0,002, 24 e 48horas para 72horas p=0,0001) conforme

demonstra Gráfico 9.

.

52


dos cardiomiócitos tratados com FGF-2. As análises foram conduzidas diariamente por 3 dias,







.

53


cardiomiócitos tratados com FGF-2. As análises foram conduzidas diariamente por 3 dias,



54

6 – DISCUSSÃO

Atualmente, diversos estudos apontam importantes efeitos do FGF-2 no cardiomiócito,

sobretudo na prevenção da morte celular (41). Tais efeitos podem ser determinantes desde o

surgimento de alterações no relaxamento do cardiomiócito, levando à disfunção diastólica

ventricular até a inibição de mecanismos de oxidação celular e disfunção mitocondrial (46).

A interação do FGF-2 com o cardiomiócito desenvolve-se como uma ação em looping,

pois o próprio cardiomiócito é capaz de produzir o FGF-2, o qual atuará nele próprio desde a

embriogênese, além de participar na angiogênese (68). Evidências apontam para uma função,

aparentemente paradoxal do FGF-2 e de outras moléculas de FGF na própria cardiogênese,

determinando a diferenciação de células precursoras em cardiomiócitos, em estágios inicias do

desenvolvimento, mas impedindo a diferenciação prematura em estágios mais tardios, através

da sua ação na determinação e controle da apoptose celular (69). Tais efeitos tem levado à busca

de caminhos para a diferenciação de fibroblastos em cardiomiócitos, através dos efeitos

adjuvantes do FGF-2 (70).

Estudos experimentais tem explorado a importante relação entre o FGF-2 e o

desenvolvimento das células musculares cardíacas. A reprogramação direta de fibroblastos, por

exemplo, para células com funções similares ao cardiomiócito tornava-se um processo

ineficiente, mas a utilização do FGF-2, além da ação do Fator de Transcrição GATA-4,

mostrou-se um processo eficiente, abrindo novas fronteiras para a reprogramação celular e

desenvolvimento de terapias contra as doenças cardíacas (70). Além disso, a adição de baixas

doses da forma “hi-FGF-2” em cultura de cardiomiócitos tem efeitos positivos no potencial

mitogênico de tais células, se realizados em momentos iniciais da cultura, mas promovem

inibição da proliferação e morte celular, caso a administração da molécula seja feita em altas

doses e períodos tardios da cultura (71). A atividade do FGF-2 também foi demonstrada em

estudo da regulação da proliferação do miocárdio fetal, onde evidenciou-se o aumento da

síntese de DNA através da ação, dentre outros fatores, deste fator de crescimento (72).

Em estudos de reparação ou recuperação de áreas cardíacas necróticas, similares ao

observado nos casos de infarto, o FGF-2 também demonstra importante função. Em um estudo

acerca da capacidade de regeneração da célula muscular cardíaca, evidenciou-se que o FGF-2

pode ser utilizado in vivo para viabilizar tanto a migração, quanto a diferenciação de

55

precursores 'residentes' de células cardíacas (40). A demonstração da maior taxa de

sobrevivência de células tronco da medula óssea, implantadas em área necróticas, induzidas por

lesão criogênica, ao serem tratadas com FGF-2 (73) é importante evidência de quão promissora

pode ser a utilização do FGF-2 no tratamento de lesões cardíacas tidas como irreversíveis.

No presente estudo, observamos o efeito plástico positivo ao cultivarmos cardiomiócitos

com a adição de FGF-2, sobretudo no grupo com adição de meio condicionado dos gânglios

simpáticos paravertebrais. Observamos que a adição do meio condicionado na cultura dos

cardiomiócitos favorece o seu desenvolvimento. Desta forma as células possuem um suporte

estrutural mais organizado para realizar as suas funções. Além disso, observamos que o efeito

realizado pelo meio condicionado dos gânglios simpáticos paravertebrais é potencializado pela

adição do FGF-2, mostrando assim um efeito sinérgico no desenvolvimento morfométrico dos

cardiomiócitos. Tal efeito é de suma importância na recuperação celular em processo de morte

celular. Sendo assim o meio condicionado dos gânglios simpáticos paravertebrais possui

componentes na sua matriz extracelular que são cruciais para a funcionalidade do

cardiomiócito. Tais achados são corroborados por diversos estudos que apontam para relação

precisa e intrínseca entre o sistema simpático e o coração, na qual existe uma junção “neuro-

cardíaca”, onde a neurotransmissão simpática ocorreria em uma via similar a sinapses neuronais

(74, 75), além da presença de neurônios pós ganglionares projetando-se a diversas áreas do

coração (76). Adicionalmente, os efeitos dos neurônios simpáticos e parassimpáticos

desempenham importante atividade em cultura de cardiomiócitos (77).

Em estudo de cultura combinada de cardiomiócitos e neurônios autonômicos

provenientes do gânglio estrelado, evidencia-se a interação anatômica, através de numerosas

projeções axonais sobre o cardiomiócito (78), bem como funcional entre as duas células (79).

O contato direto entre neurônios e cardiomiócitos, em cultura, pode levar ao incremento da

expressão funcional de canais de cálcio, essenciais para a atividade e sobrevida dos

cardiomiócitos (80). A interrelação entre o sistema nervoso simpático e o cardiomiócito é

também evidenciada por achados que sugerem ser o sistema simpático, através de sues efeitos

no cardiomiócito, um dos importantes responsáveis pela proliferação e hipertrofia de tais

células, contribuindo assim para a desenvolvimento do controle neural no coração adulto (81).

Atribui-se, ainda, aos neurônios simpáticos o estímulo à contração de cardiomiócitos isolados

em cultura, bem como no desenvolvimento da função cardíaca em si (82).

56

Entretanto, a interação entre cardiomiócitos e neurônios simpáticos estende-se muito

além das junções neuro-cardíacas. As neurotrofinas, inicialmente descritas como controladoras

da função e desenvolvimento neuronal, também exercem funções no âmbito cardiovascular,

contribuindo, inclusive para a homeostase desse sistema (83). Desempenham, portanto,

importante papel na modulação de propriedades sinápticas dos neurônios autonômicos,

projeção e desenvolvimento axonal, formação de redes neurais e vasculares, migração de

músculo liso e controle da apoptose das células endoteliais e cardiomiócito (83, 84)

A evidência da interrelação neuro-cardíaca torna-se mais consistente ao se demonstrar,

através de culturas celulares de neurônios e cardiomiócitos, que os neurônios exercem

importante influência na expressão do fenótipo de cardiomiócitos beta-adrenérgicos, estes

sensíveis a doenças mediadas pela resposta à adenosina monofostato cíclica (AMPc), molécula

importante na determinação da resposta dos cardiomiócitos ao sistema simpático, podendo ser

a atividade neuronal, portanto, um importante determinante na expressão de cardiomiócitos

com potencial para desenvolvimento da doença hipertensiva (85).

Da interação neuro-cardíaca surgem direcionamentos de avanços, embora ainda em

desenvolvimento, de terapia baseada em cultura de células-tronco, utilizando substâncias

produzidas pelos neurônios, como o fator de crescimento neuronal, bem como sua atividade no

desenvolvimento do cardiomiócito (86). A possibilidade de alcançar terapias gênicas,

utilizando-se culturas de células troncos para derivar neurônios simpáticos com potencial para

formar interação, tanto anatômica quanto funcional, já tem sido demonstrada (87).

Nesse contexto, surgem perspectivas de tratamento molecular da IC. A demonstração

de que enzimas, como a retículo sarcoendoplasmático de cálcio ATPase 2a, associada com o

desenvolvimento de IC em infecções por Citomegalovírus, promove hiperativação neuronal

simpática, com consequente maior excitação simpática no cardiomiócito (88), indica a

importância do entendimento dessa interação. Embora não seja um conhecimento recente, a

ação da adenosina trifosfato (ATP), liberada pelos neurônios, juntamente com a noradrenalina,

como co-transmissores, também desempenha papel fundamental na comunicação intercelular e

apresenta-se também como importante perspectiva no entendimento não apenas de diversas

doenças cardíacas, mas também vasculares (89).

Outrossim, não menos importante é o reconhecimento do potencial de desenvolvimento

da terapia com células tronco embrionárias. A geração de cardiomiócitos, a partir de células

57

tronco embrionárias, depende da expressão de fatores de transcrição como o GATA-4, a qual é

induzida por fatores de crescimentos fibroblásticos (90).

Assim, a busca pela extensa e adequada compreensão da interação entre as ações de

fatores neuronais e FGFs no cardiomiócito torna-se promissor campo de pesquisa no tratamento

futuro das cardiomiopatias.

7 – CONCLUSÃO

Os cardiomiócitos demonstraram uma morfologia típica, rápida expansão e efeito

trófico, sobretudo no grupo que foi exposto ao meio condicionado de gânglio simpático

paravertebral com adição de FGF-2. Esse efeito plástico deve-se a propriedades encontradas no

meio condicionado, sendo potencializada pela adição do FGF-2, pois esse efeito sinérgico

possibilitou um ambiente rico, nutritivo e com um grande potencial elétrico, ideal para a

sobrevivência e desenvolvimento estrutural e funcional do cardiomiócito. O presente estudo

melhora nosso conhecimento sobre a plasticidade dos cardiomiócitos e facilita a compreensão

na busca por melhores técnicas com terapia celular no uso de injúrias cardíacas. Além disso, o

meio condicionado abre uma opção de produzir uma substância sintética com base na sua

constituição química.

58

REFERÊNCIAS

1. Braunwald E. A Textbook of Cardiovascular Medicine. 9a ed. Philadelphia: Saunders

Elsevier, 2013. Volume 1 e 2. 2013.

2. Braunwald E. Biomarkers in heart failure. The New England journal of medicine.

2008;358(20):2148-59.

3. Gartner L, Hiatt J. Histologia Essencial. Elsevier, 2011. 2011.

4. Kolwicz SC, Jr., Purohit S, Tian R. Cardiac metabolism and its interactions with

contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation research. 2013;113(5):603-

16.

5. Haque ZK, Wang DZ. How cardiomyocytes sense pathophysiological stresses for

cardiac remodeling. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2016.

6. Kumar V, Abbas A, Aster J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease, 9th edn.

Elsevier/Saunders, Philadelphia. 2015.

7. Bairwa SC, Parajuli N, Dyck JR. The role of AMPK in cardiomyocyte health and

survival. Biochimica et biophysica acta. 2016.

8. Franke WW, Borrmann CM, Grund C, Pieperhoff S. The area composita of adhering

junctions connecting heart muscle cells of vertebrates. I. Molecular definition in intercalated

disks of cardiomyocytes by immunoelectron microscopy of desmosomal proteins. European

journal of cell biology. 2006;85(2):69-82.

9. Ehler E. Cardiac cytoarchitecture - why the "hardware" is important for heart function!

Biochimica et biophysica acta. 2016;1863(7 Pt B):1857-63.

10. Baudino TA, Carver W, Giles W, Borg TK. Cardiac fibroblasts: friend or foe? American

journal of physiology Heart and circulatory physiology. 2006;291(3):H1015-26.

11. Valiente-Alandi I, Schafer AE, Blaxall BC. Extracellular matrix-mediated cellular

communication in the heart. Journal of molecular and cellular cardiology. 2016;91:228-37.

12. Ongstad E, Kohl P. Fibroblast-myocyte coupling in the heart: Potential relevance for

therapeutic interventions. Journal of molecular and cellular cardiology. 2016;91:238-46.

13. Boron W, Boulpaep E. Fisiologia Médica. 2a ed: Rio de Janeiro, Elsevier, 2015. 2015.

14. VanPutte C, Regan J, Russo A. Anatomia e Fisiologia de Seeley, 10a. edição. AMGH

Editora, 2016. 2016.

15. Gibbins IL, Morris JL. Structure of peripheral synapses: autonomic ganglia. Cell and

tissue research. 2006;326(2):205-20.

16. Kawashima T. The autonomic nervous system of the human heart with special reference

to its origin, course, and peripheral distribution. Anatomy and embryology. 2005;209(6):425-

38.

17. Coote JH, Chauhan RA. The sympathetic innervation of the heart: Important new

insights. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 2016;199:17-23.

18. Pardini BJ, Lund DD, Schmid PG. Organization of the sympathetic postganglionic

innervation of the rat heart. Journal of the autonomic nervous system. 1989;28(3):193-201.

19. Baptista CA, Kirby ML. The cardiac ganglia: cellular and molecular aspects. The

Kaohsiung journal of medical sciences. 1997;13(1):42-54.

20. Krum H, Abraham WT. Heart failure. Lancet (London, England). 2009;373(9667):941-

55.

21. Braunwald E. The war against heart failure: the Lancet lecture. Lancet (London,

England). 2015;385(9970):812-24.

59

22. Bang C, Antoniades C, Antonopoulos AS, Eriksson U, Franssen C, Hamdani N, et al.

Intercellular communication lessons in heart failure. European journal of heart failure.

2015;17(11):1091-103.

23. Neubauer S. The failing heart--an engine out of fuel. The New England journal of

medicine. 2007;356(11):1140-51.

24. Moore-Morris T, Cattaneo P, Puceat M, Evans SM. Origins of cardiac fibroblasts.

Journal of molecular and cellular cardiology. 2016;91:1-5.

25. Kamo T, Akazawa H, Komuro I. Cardiac nonmyocytes in the hub of cardiac

hypertrophy. Circulation research. 2015;117(1):89-98.

26. Horn MA. Cardiac Physiology of Aging: Extracellular Considerations. Comprehensive

Physiology. 2015;5(3):1069-121.

27. Hartupee J, Mann DL. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection

fraction. Nature reviews Cardiology. 2016.

28. Hill JA, Olson EN. Cardiac plasticity. The New England journal of medicine.

2008;358(13):1370-80.

29. Toischer K, Rokita AG, Unsold B, Zhu W, Kararigas G, Sossalla S, et al. Differential

cardiac remodeling in preload versus afterload. Circulation. 2010;122(10):993-1003.

30. Fukuda K, Kanazawa H, Aizawa Y, Ardell JL, Shivkumar K. Cardiac innervation and

sudden cardiac death. Circulation research. 2015;116(12):2005-19.

31. Kember G, Armour JA, Zamir M. Neural control hierarchy of the heart has not evolved

to deal with myocardial ischemia. Physiological genomics. 2013;45(15):638-44.

32. Nishida K, Otsu K. Autophagy during cardiac remodeling. Journal of molecular and

cellular cardiology. 2016;95:11-8.

33. Breckwoldt K, Weinberger F, Eschenhagen T. Heart regeneration. Biochimica et

biophysica acta. 2016;1863(7 Pt B):1749-59.

34. Laflamme MA, Murry CE. Heart regeneration. Nature. 2011;473(7347):326-35.

35. Batty JA, Lima JA, Jr., Kunadian V. Direct cellular reprogramming for cardiac repair

and regeneration. European journal of heart failure. 2016;18(2):145-56.

36. Frangogiannis NG. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Current

opinion in cardiology. 2015;30(3):240-5.

37. Boyd JG, Gordon T. Neurotrophic factors and their receptors in axonal regeneration and

functional recovery after peripheral nerve injury. Molecular neurobiology. 2003;27(3):277-

324.

38. Hotta Y, Sasaki S, Konishi M, Kinoshita H, Kuwahara K, Nakao K, et al. Fgf16 is

required for cardiomyocyte proliferation in the mouse embryonic heart. Developmental

dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists.

2008;237(10):2947-54.

39. Eswarakumar VP, Lax I, Schlessinger J. Cellular signaling by fibroblast growth factor

receptors. Cytokine & growth factor reviews. 2005;16(2):139-49.

40. Rosenblatt-Velin N, Lepore MG, Cartoni C, Beermann F, Pedrazzini T. FGF-2 controls

the differentiation of resident cardiac precursors into functional cardiomyocytes. The Journal

of clinical investigation. 2005;115(7):1724-33.

41. Kardami E, Detillieux K, Ma X, Jiang Z, Santiago JJ, Jimenez SK, et al. Fibroblast

growth factor-2 and cardioprotection. Heart failure reviews. 2007;12(3-4):267-77.

42. Ornitz DM. FGFs, heparan sulfate and FGFRs: complex interactions essential for

development. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology.

2000;22(2):108-12.

43. Nugent MA, Iozzo RV. Fibroblast growth factor-2. The international journal of

biochemistry & cell biology. 2000;32(2):115-20.

60

44. Okada-Ban M, Thiery JP, Jouanneau J. Fibroblast growth factor-2. The international

journal of biochemistry & cell biology. 2000;32(3):263-7.

45. Santiago JJ, McNaughton LJ, Koleini N, Ma X, Bestvater B, Nickel BE, et al. High

molecular weight fibroblast growth factor-2 in the human heart is a potential target for

prevention of cardiac remodeling. PloS one. 2014;9(5):e97281.

46. Chen Q, Chen X, Han C, Wang Y, Huang T, Du Y, et al. FGF-2 Transcriptionally

Down-Regulates the Expression of BNIP3L via PI3K/Akt/FoxO3a Signaling and Inhibits

Necrosis and Mitochondrial Dysfunction Induced by High Concentrations of Hydrogen

Peroxide in H9c2 Cells. Cellular physiology and biochemistry : international journal of

experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 2016;40(6):1678-91.

47. Delrieu I. The high molecular weight isoforms of basic fibroblast growth factor (FGF-

2): an insight into an intracrine mechanism. FEBS letters. 2000;468(1):6-10.

48. Piotrowicz RS, Maher PA, Levin EG. Dual activities of 22-24 kDA basic fibroblast

growth factor: inhibition of migration and stimulation of proliferation. Journal of cellular

physiology. 1999;178(2):144-53.

49. Miyake A, Konishi M, Martin FH, Hernday NA, Ozaki K, Yamamoto S, et al. Structure

and expression of a novel member, FGF-16, on the fibroblast growth factor family. Biochemical

and biophysical research communications. 1998;243(1):148-52.

50. Lu SY, Sontag DP, Detillieux KA, Cattini PA. FGF-16 is released from neonatal cardiac

myocytes and alters growth-related signaling: a possible role in postnatal development.

American journal of physiology Cell physiology. 2008;294(5):C1242-9.

51. Kharitonenkov A, Shiyanova TL, Koester A, Ford AM, Micanovic R, Galbreath EJ, et

al. FGF-21 as a novel metabolic regulator. The Journal of clinical investigation.

2005;115(6):1627-35.

52. Kharitonenkov A, Larsen P. FGF21 reloaded: challenges of a rapidly growing field.

Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 2011;22(3):81-6.

53. Liu SQ, Roberts D, Kharitonenkov A, Zhang B, Hanson SM, Li YC, et al. Endocrine

protection of ischemic myocardium by FGF21 from the liver and adipose tissue. Scientific

reports. 2013;3:2767.

54. Joki Y, Ohashi K, Yuasa D, Shibata R, Ito M, Matsuo K, et al. FGF21 attenuates

pathological myocardial remodeling following myocardial infarction through the adiponectin-

dependent mechanism. Biochemical and biophysical research communications.

2015;459(1):124-30.

55. Cong WT, Ling J, Tian HS, Ling R, Wang Y, Huang BB, et al. Proteomic study on the

protective mechanism of fibroblast growth factor 21 to ischemia-reperfusion injury. Canadian

journal of physiology and pharmacology. 2013;91(11):973-84.

56. Patel V, Adya R, Chen J, Ramanjaneya M, Bari MF, Bhudia SK, et al. Novel insights

into the cardio-protective effects of FGF21 in lean and obese rat hearts. PloS one.

2014;9(2):e87102.

57. Diaz-Delfin J, Hondares E, Iglesias R, Giralt M, Caelles C, Villarroya F. TNF-alpha

represses beta-Klotho expression and impairs FGF21 action in adipose cells: involvement of

JNK1 in the FGF21 pathway. Endocrinology. 2012;153(9):4238-45.

58. Kovesdy CP, Quarles LD. The role of fibroblast growth factor-23 in cardiorenal

syndrome. Nephron Clinical practice. 2013;123(3-4):194-201.

59. Touchberry CD, Green TM, Tchikrizov V, Mannix JE, Mao TF, Carney BW, et al.

FGF23 is a novel regulator of intracellular calcium and cardiac contractility in addition to

cardiac hypertrophy. American journal of physiology Endocrinology and metabolism.

2013;304(8):E863-73.

61

60. Davies JE, Whinnett ZI, Francis DP, Manisty CH, Aguado-Sierra J, Willson K, et al.

Evidence of a dominant backward-propagating "suction" wave responsible for diastolic

coronary filling in humans, attenuated in left ventricular hypertrophy. Circulation.

2006;113(14):1768-78.

61. Ford ML, Smith ER, Tomlinson LA, Chatterjee PK, Rajkumar C, Holt SG. FGF-23 and

osteoprotegerin are independently associated with myocardial damage in chronic kidney

disease stages 3 and 4. Another link between chronic kidney disease-mineral bone disorder and

the heart. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis

and Transplant Association - European Renal Association. 2012;27(2):727-33.

62. Arnlov J, Carlsson AC, Sundstrom J, Ingelsson E, Larsson A, Lind L, et al. Higher

fibroblast growth factor-23 increases the risk of all-cause and cardiovascular mortality in the

community. Kidney international. 2013;83(1):160-6.

63. Grabner A, Schramm K, Silswal N, Hendrix M, Yanucil C, Czaya B, et al.

FGF23/FGFR4-mediated left ventricular hypertrophy is reversible. Scientific reports.

2017;7(1):1993.

64. Leifheit-Nestler M, Grabner A, Hermann L, Richter B, Schmitz K, Fischer DC, et al.

Vitamin D treatment attenuates cardiac FGF23/FGFR4 signaling and hypertrophy in uremic

rats. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and

Transplant Association - European Renal Association. 2017.

65. Vatner SF. FGF induces hypertrophy and angiogenesis in hibernating myocardium.

Circulation research. 2005;96(7):705-7.

66. Blondel B, Roijen I, Cheneval JP. Heart cells in culture: a simple method for increasing

the proportion of myoblasts. Experientia. 1971;27(3):356-8.

67. Chlopcikova S, Psotova J, Miketova P. Neonatal rat cardiomyocytes--a model for the

study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart.

Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc,

Czechoslovakia. 2001;145(2):49-55.

68. Krejci E, Pesevski Z, Nanka O, Sedmera D. Physiological role of FGF signaling in

growth and remodeling of developing cardiovascular system. Physiological research.

2016;65(3):425-35.

69. Zhang J, Liu J, Huang Y, Chang JY, Liu L, McKeehan WL, et al. FRS2alpha-mediated

FGF signals suppress premature differentiation of cardiac stem cells through regulating

autophagy activity. Circulation research. 2012;110(4):e29-39.

70. Yamakawa H, Muraoka N, Miyamoto K, Sadahiro T, Isomi M, Haginiwa S, et al.

Fibroblast Growth Factors and Vascular Endothelial Growth Factor Promote Cardiac

Reprogramming under Defined Conditions. Stem cell reports. 2015;5(6):1128-42.

71. Hirst CJ, Herlyn M, Cattini PA, Kardami E. High levels of CUG-initiated FGF-2

expression cause chromatin compaction, decreased cardiomyocyte mitosis, and cell death.

Molecular and cellular biochemistry. 2003;246(1-2):111-6.

72. Armstrong MT, Lee DY, Armstrong PB. Regulation of proliferation of the fetal

myocardium. Developmental dynamics : an official publication of the American Association

of Anatomists. 2000;219(2):226-36.

73. Song H, Kwon K, Lim S, Kang SM, Ko YG, Xu Z, et al. Transfection of mesenchymal

stem cells with the FGF-2 gene improves their survival under hypoxic conditions. Molecules

and cells. 2005;19(3):402-7.

74. Conforti L, Tohse N, Sperelakis N. Influence of sympathetic innervation on the

membrane electrical properties of neonatal rat cardiomyocytes in culture. Journal of

developmental physiology. 1991;15(4):237-46.

62

75. Zaglia T, Mongillo M. Cardiac sympathetic innervation, from a different point of

(re)view. 2017;595(12):3919-30.

76. Kucera M, Hrabovska A. [Cholinergic system of the heart]. Ceska a Slovenska farmacie

: casopis Ceske farmaceuticke spolecnosti a Slovenske farmaceuticke spolecnosti.

2015;64(6):254-63.

77. Oiwa K, Shimba K, Numata T, Takeuchi A, Kotani K, Jimbo Y. A device for co-

culturing autonomic neurons and cardiomyocytes using micro-fabrication techniques. The

Journal of physiology. 2016;8(3):341-8.

78. Landis SC. Rat sympathetic neurons and cardiac myocytes developing in microcultures:

correlation of the fine structure of endings with neurotransmitter function in single neurons.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.

1976;73(11):4220-4.

79. Horackova M, Huang MH, Armour JA, Hopkins DA, Mapplebeck C. Cocultures of

adult ventricular myocytes with stellate ganglia or intrinsic cardiac neurones from guinea pigs:

spontaneous activity and pharmacological properties. Cardiovascular research.

1993;27(6):1101-8.

80. Ogawa S, Barnett JV, Sen L, Galper JB, Smith TW, Marsh JD. Direct contact between

sympathetic neurons and rat cardiac myocytes in vitro increases expression of functional

calcium channels. The Journal of clinical investigation. 1992;89(4):1085-93.

81. Kreipke RE, Birren SJ. Innervating sympathetic neurons regulate heart size and the

timing of cardiomyocyte cell cycle withdrawal. The Journal of physiology. 2015;593(23):5057-

73.

82. Lloyd TR, Marvin WJ, Jr. Sympathetic innervation improves the contractile

performance of neonatal cardiac ventricular myocytes in culture. Journal of molecular and

cellular cardiology. 1990;22(3):333-42.

83. Pius-Sadowska E, Machalinski B. BDNF - A key player in cardiovascular system.

Journal of molecular and cellular cardiology. 2017.

84. Osadchii OE. Emerging role of neurotensin in regulation of the cardiovascular system.

European journal of pharmacology. 2015;762:184-92.

85. Larsen HE, Lefkimmiatis K, Paterson DJ. Sympathetic neurons are a powerful driver of

myocyte function in cardiovascular disease. Scientific reports. 2016;6:38898.

86. Coskun V, Lombardo DM. Studying the pathophysiologic connection between

cardiovascular and nervous systems using stem cells. Journal of neuroscience research.

2016;94(12):1499-510.

87. Oh Y, Cho GS, Li Z, Hong I, Zhu R, Kim MJ, et al. Functional Coupling with Cardiac

Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell stem cell.

2016;19(1):95-106.

88. Shanks J, Herring N, Johnson E, Liu K, Li D, Paterson DJ. Overexpression of

Sarcoendoplasmic Reticulum Calcium ATPase 2a Promotes Cardiac Sympathetic

Neurotransmission via Abnormal Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Ca2+ Regulation.

The Journal of physiology. 2017;69(4):625-32.

89. Burnstock G. Purinergic Signaling in the Cardiovascular System. Circulation research.

2017;120(1):207-28.

90. Sachinidis A, Kolossov E, Fleischmann BK, Hescheler J. Generation of cardiomyocytes

from embryonic stem cells experimental studies. Herz. 2002;27(7):589-97.

63

ANEXOS

Documents

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE UERN … · 2018. 11. 6. · 10 universidade do estado do rio grande do norte – uern programa de pÓs-graduaÇÃo em saÚde e sociedade