Embed Size (px)
Citation preview
1
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARCELA LOPES DE SOUZA
AVALIAÇÃO DAS CONSEQUÊNCIAS MOLECULARES APÓS OVERLOAD DE
ALBUMINA EM CULTURA CELULAR DE PODÓCITOS COM E SEM DANO
CAMPINAS
2018
2
MARCELA LOPES DE SOUZA
AVALIAÇÃO DAS CONSEQUÊNCIAS MOLECULARES APÓS OVERLOAD DE
ALBUMINA EM CULTURA CELULAR DE PODÓCITOS COM E SEM DANO
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciência
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências na Área de
Concentração de Genética Médica.
de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de [conforme
consta na ata de defesa]. (em itálico e na segunda língua constante
Orientadora: Dra. Mara Sanches Guaragna
Co-orientadora: Dra. Maricilda Palandi de Mello
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃP DEFENDIDA PELA
ALUNA MARCELA LOPES DE SOUZA, E ORIENTADA PELA
PROF. DR. MARA SANGUES GUARAGNA.
CAMPINAS
2018
3
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES, 02P4565/2018
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Souza, Marcela Lopes de, 1993-
So89a Avaliação das consequências moleculares após overload de albumina em
cultura celular de podócitos com e sem dano / Marcela Lopes de Souza. –
Campinas, SP : [s.n.], 2018.
Orientador: Mara Sanches Guaragna.
Coorientador: Maricilda Palandi de Mello.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Ciências Médicas.
1. Albuminas. 2. Puromicina aminonucleosídeo. 3. Podócitos. 4. Rim -
Fisiopatologia. I. Guaragna, Mara Sanches, 1971-. II. Mello, Maricilda Palandi
de. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas.
IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Molecular consequences evaluation after albumin overload in
podocytes cell culture with and without damage
Palavras-chave em inglês:
Albumins
Puromycin aminonucleoside
Podocytes
Kidney, Physiopathology
Área de concentração: Genética Médica
Titulação: Mestra em Ciências
Banca examinadora:
Mara Sanches Guaragna [Orientador]
Luiz Fernando Onuchic
Carmen Sílvia Bertuzzo
Data de defesa: 10-08-2018
Programa de Pós-Graduação: Ciências Médicas
4
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
MARCELA LOPES DE SOUZA
ORIENTADOR: MARA SANCHES GUARAGNA
COORIENTADOR: MARICILDA PALANDI DE MELLO
MEMBROS:
1. PROF(A). DR(A). MARA SANCHES GUARAGNA
2. PROF. DR. LUIZ FERNANDO ONUCHIC
3. PROF(A). DR(A). CARMEN SÍLVIA BERTUZZO
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas
da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 10 de Agosto de 2018
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço especialmente aos meus pais Carlos e Silvana por sempre me
incentivarem, apoiarem, por acreditarem em mim. Por serem meu maior referencial e
exemplo, minha base, por me ensinarem muito e me possibilitarem ser cada vez
melhor. Eu amo muito vocês. A toda minha família, muito obrigada.
A Mara agradeço não só pelos momentos de crescimento no laboratório, mas
também por todo cuidado e carinho que tem comigo. Obrigada por acreditar em mim,
por toda paciência, por me proporcionar a oportunidade de desempenhar uma
pesquisa tão maravilhosa. Obrigada por ser essa pessoa e orientadora maravilhosa,
por todas as risadas e por me permitir ter a honra de ser sua primeira aluna de
mestrado e doutorado.
A Maricilda, que tão prontamente me recebeu no CBMEG em 2013 e me abriu
as portas, possibilitou meu crescimento profissional, sempre acreditou em mim, me
permitiu cada vez mais aprender e crescer. Obrigada pela incrível pessoa e
pesquisadora que você é.
Agradeço a todos meus amigos do Laboratório Cris, Ana Paula, Edi, Tais,
Luana, Pamela, Adriana, Giulia, João, Beatriz, Nicole, Bárbara. Muito obrigada pelo
convívio, risadas, por todos os momentos no laboratório, pelos dias temáticos e todas
as desculpas que achamos para nos reunir e comer.
Em particular gostaria de agradecer: a Helena, que sempre me ajudou desde
que eu entrei no “lab”, obrigada por todas as ajudas e conversas;
A Giselle, por todas as conversas e por me salvar em alguns momentos bem
loucos;
Ao Matheus, gatinho, obrigada por todos os momentos, por toda risada, pela
companhia e amizade. Só para constar eu gosto mesmo de você;
A Nadya, por todos os conselhos, todas as risadas, por me entender, por estar
sempre pronta a me ajudar e me ouvir, e por compartilhar momentos tão bons e às
vezes bem idiotas. Muito obrigada a todos por acreditarem em mim, vocês são
incríveis!
6
As minhas amigas, meus amores, Ju, Calu, Kel e Rebeca, por estarem comigo
em todos os momentos, por me ouvirem falar por horas e horas dos meus
experimentos, por entenderem minhas ausências em tantos finais de semana, por
acreditarem em mim e por sonharem junto comigo.
Meus respeitosos agradecimentos pelas contribuições dos integrantes da
qualificação, Dra. Andréa T. Maciel Guerra, Dra. Adriana Torsoni e Dra. Carmen
Veríssima e pela participação dos membros da banca de defesa, Dr. Luiz Fernando
Onuchic e Dra. Carmen Bertuzzo.
Agradeço aos órgãos financiadores FAPESP e CAPES, sem os quais este
projeto não seria viável.
A todos os que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho.
7
RESUMO
A proteinúria é um sinal importante e um marcador do prognóstico da doença renal,
geralmente refletindo aumento na permeabilidade glomerular principalmente para
albumina. Em 10-50% dos pacientes está associada ao desenvolvimento de doença
renal crônica. Um dos principais mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de
proteinúria patológica é o dano na barreira de filtração glomerular, constituída por três
camadas: endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos, células
viscerais especializadas. Desta forma, já se sabe que lesão dos podócitos contribui
para albuminúria progressiva. No entanto existem controvérsias se as proteínas
presentes no filtrado glomerular de indivíduos com dano desencadeiam a lesão, ou se
atuam como coadjuvante nas podocitopatias. Outra questão pouco abordada é se o
aumento de consumo de proteínas na dieta, seja por indivíduos comuns, seja por
atletas, pode causar ou agravar lesão renal e quais são as consequências moleculares
nos podócitos. Algumas moléculas importantes que participam da manutenção da
barreira de filtração glomerular são a nefrina, podocina, podocalixina e o canal de
cálcio receptor potencial transitório C, codificados, respectivamente, pelos genes
NPHS1, NPHS2, PODXL e TRPC6. Desta forma, o presente estudo teve como
objetivo avaliar a expressão desses genes após suplementação progressiva de
albumina em podócitos in vitro, em duas condições: 1) sem tratamento; 2) após a
exposição com a droga nefrotóxica puromicina aminoglicosídeo (PA). Antes dos
experimentos de exposição à albumina foram realizados alguns experimentos de
padronização: a) confirmação da diferenciação dos podócitos; b) viabilidade celular
após exposição à albumina; c) viabilidade celular após exposição à PA; avaliação da
expressão dos marcadores de autofagia LC3-II e p62 e da taxa de transcrito do
PODXL após privação de soro no meio de cultura durante 24 horas. Para os
experimentos de exposição dos podócitos à albumina, foram utilizadas diferentes
concentrações de albumina (0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 20, 30 e 40 mg/mL) por 24 horas,
com e sem tratamento com PA. Para avaliação da expressão relativa foi PCR em
tempo real para os genes. Para avaliação da expressão proteica e localização celular
foram realizados Western Blot e imunocitoquímica indireta, respectivamente. As
condições sem albumina foram utilizadas como controle em ambos os grupos e os
resultados foram analisados com teste ANOVA e Tukey, com p≤0,05. Observamos
maior taxa de transcrito do gene PODXL após suplementação de albumina, com e
8
sem PA. O TRPC6, este apresentou diminuição do transcrito após a suplementação
no grupo sem PA e aumento dessa taxa à 40 mg/mL no grupo com PA. Esta diferença
foi confirmada nos experimentos de ICI. Já no caso dos genes NPHS2 e NPHS1, não
houve amplificação por real-time PCR e a expressão baixa não permitiu observar
diferença, por Western Blot e por ICI. Este estudo é um passo inicial para uma melhor
compreensão dos mecanismos moleculares nos podócitos que podem estar
associados aos danos fisiológicos causados pelo aumento de proteínas no filtrado
glomerular e pelas dietas hiperproteicas.
Palavras – chave: albumina, puromicina aminoglicosídeo, podócitos, dano renal.
9
ABSTRACT
Proteinuria is an important sign and a prognostic marker of kidney disease and usually
reflects an increase in glomerular permeability for albumin. In 10–50% of patients it is
associated with the development of chronic kidney disease. One of the main
mechanisms responsible for the development of pathological proteinuria is the
glomerular filtration barrier (GFB) damage. GFB consists of three main layers:
fenestrated endothelium, glomerular basement membrane and the visceral specialized
cells called podocytes. Podocyte lesion contributes to progressive albuminuria.
However, there is controversy if the proteins in the glomerular filtrate may trigger the
lesion, or if they act as coadjuvant in the podocytopathies. Another question is whether
increased protein intake in diets may trigger or worsen kidney damage and the
molecular consequences to the podocytes. Several molecules participate in the
maintenance of the glomerular filtration barrier, among them, nephrin, podocin,
podocalyxin and short transient receptor potential channel 6, encoded by the genes
NPHS1, NPHS2, PODXL and TRPC6, respectively. Therefore, this study aimed to
evaluate the expression of these genes after a progressive supplementation of albumin
in podocytes in vitro, under two conditions: 1) without treatment; 2) after exposure with
the nephrotoxic drug puromycin aminoglycoside (PAN). Several standardization
experiments were performed before the albumin exposure experiments, such as: a)
confirmation of podocyte differentiation; b) cell viability evaluation after albumin
exposure; c) cell viability evaluation after PAN exposure; d) evaluation of expression
of autophagy markers LC3-II and p62 markers and PODXL mRNA expression after
serum depletion for 24 hours before albumin exposure experiments. For albumin
exposure experiments, we exposed podocytes to to different concentrations of albumin
(0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 20, 30 and 40 mg / ml) for 24 hours, with and without PAN
exposure. After 24 hours, we performed total RNA extraction, cDNA synthesis and
real-time PCR for the genes using RPLP0 as the endogenous control. For protein
expression and cellular localization, we performed Western Blot and
immunocytochemistry, respectively. Conditions without albumin were used as control
in both groups, and the results were analyzed using ANOVA and Tukey test, with
p≤0.05. We observed a higher transcript rate of PODXL gene after albumin
supplementation, in both groups, with and without PA. On the other hand, the TRPC6
presented a decrease in the transcript level after supplementation in the non-PA group
10
and an increase in the rate in the 40 mg/mL condition in the PA treatment group. This
difference was confirmed after Western Blot and ICC experiments. Regarding NPHS2
and NPHS1 genes, there was no amplification by real-time PCR and there was no
protein difference in the expression level after Western Blot and ICC experiments. This
study is an initial step towards a better understanding of the molecular mechanisms
that may be associated with the physiological renal damages caused by proteins in the
glomerular filtrate and by high-content diets.
Keywords: Albumin; puromycin aminoglycoside; podocytes; kidney damage.
11
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Componentes do sistema urinário...............................................................19
Figura 2: Néfrons e seus componentes.....................................................................20
Figura 3: Corpúsculo renal e o sistema de filtração...................................................21
Figura 4: Capilar glomerular com podócitos...............................................................22
Figura 5. Modelo funcional da barreira de filtração glomerular..................................24
Figura 6. Diagrama esquemático dos complexos proteicos presentes nos domínios:
AMD, SD e BMD.........................................................................................................25
Figura 7: Interação entre proteínas dos três domínios dos pedicelos dos
podócitos....................................................................................................................31
Figura 8: Ciclo da PCR Real – Time...........................................................................48
Figura 9: Gel de extração de RNA...............................................................................49
Figura 10: Western Blot com imunomarcação de nefrina após exposição à
albumina.....................................................................................................................55
Figura 11: Western Blot com imunomarcação de nefrina após exposição à PA e a
albumina.....................................................................................................................56
Figura 12: ICI com nefrina de podócitos diferenciados sem exposição à PA tratados
com diferentes concentrações de albumina...............................................................57
Figura 13: ICI com nefrina de podócitos diferenciados com exposição à PA tratados
com diferentes concentrações de albumina...............................................................58
Figura 14: Western Blot com imunomarcação de podocina após exposição à
albumina.....................................................................................................................60
Figura 15: Western Blot com imunomarcação de podocina após exposição à PA e a
albumina.....................................................................................................................61
Figura 16: ICI com podocina de podócitos diferenciados sem exposição à PA tratados
com diferentes concentrações de albumina..............................................................62
12
Figura 17: ICI com podocina de podócitos diferenciados com exposição à PA tratados
com diferentes concentrações de albumina................................................................63
Figura 18: Avaliação da expressão relativa de TRPC6 (TRPC6 / RPLP0) após
exposição à albumina.................................................................................................66
Figura 19: Avaliação da expressão relativa de TRPC6 (TRPC6 / RPLP0) após
exposição à PA e albumina........................................................................................67
Figura 20: Western Blot com imunomarcação de canal de cálcio receptor de potencial
transitório C após exposição à albumina....................................................................69
Figura 21: Western Blot com imunomarcação de cálcio receptor de potencial
transitório C após exposição à PA e a albumina........................................................70
Figura 22: ICI com canal de cálcio receptor de potencial transitório C de podócitos
diferenciados sem exposição à PA tratados com diferentes concentrações de
albumina.....................................................................................................................71
Figura 23: ICI com canal de cálcio receptor de potencial transitório C de podócitos
diferenciados com exposição à PA tratados com diferentes concentrações de
albumina.....................................................................................................................72
Figura 24: Avaliação da expressão relativa de PODXL (PODXL / RPLP0) após
exposição à albumina.................................................................................................77
Figura 25: Avaliação da expressão relativa de PODXL (PODXL / RPLP0) após
exposição à PA e albumina.........................................................................................78
Figura 26: Western Blot com imunomarcação de podocalixina após exposição à
albumina.....................................................................................................................79
Figura 27: Western Blot com imunomarcação de podocalixina após exposição à PA e
a albumina..................................................................................................................80
Figura 28: ICI com podocalixina de podócitos diferenciados sem exposição à PA
tratados com diferentes concentrações de albumina..................................................81
Figura 29: ICI com podocalixina de podócitos diferenciados com exposição à PA
tratados com diferentes concentrações de albumina..................................................82
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estadiamento e classificação da doença renal crônica..............................28
Tabela 2: MIX da reação do Real Time PCR............................................................48
Tabela 3: Condições utilizadas para cada proteína no SDS-PAGE...........................50
Tabela 4: Comparação dos tratamentos com PA, para análise de expressão dos
RNAs..........................................................................................................................53
Tabela 5: Expressão da proteína Nefrina....................................................................54
Tabela 6: Expressão da proteína Podocina.................................................................59
Tabela 7: Expressão relativa do gene TRPC6.............................................................65
Tabela 8: Expressão do Canal de cálcio receptor potencial transitório C....................68
Tabela 9: Expressão relativa do gene PODXL............................................................76
Tabela 10: Expressão da proteína podocalixina..........................................................78
14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
IC – Imunocitoquímica
ICI – Imunocitoquímica indireta
SPSS - Statistical Package for the Social Sciences
TA - Temperatura ambiente
DRC – doença renal crônica
KDIGO – National Kidney Foundation Guilines
DM – Diabetes mellitus
GESF – glomeruloesclerose segmentar e focal
IRC – insuficiência renal crônica
NP - dieta proteica normal
HP – dieta hiperproteica
BFG – barreira de filtração glomerular
MBG – membrana basal glomerular
AMD – domínio apical da membrana
SD – diafragma de fenda
BMD – domínio basal da membrana
FE – endotélio fenestrado
PHB – proteínas mitocondriais proibitinas
TRP – receptores potenciais transitórios
PA – puromicina aminoglicosídeo
H0 -hipótese nula
H1 – hipótese alternativa
SV-40 - Simian vacuolating virus 40
TA – temperatura ambiente
15
FBS – soro fetal bovino
h – hora
rmp – rotações por minuto
mL – mililitro
µL – microlitro
DMSO – dimetilsulfóxido
°C – graus Celsius
ICI – imunocitoquímica indireta
MTT – rometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio - sal tetrazólico
PBS – solução salina tamponada com fosfato
mg – miligrama
nm – nanômetro
mM – milimolar
HCl – ácido clorídrico
µg – micrograma
PCR -reação em cadeia da polimerase
V – volts
PVDF –
mA – microampère
EP – erro padrão da média
16
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO........................................................................................................19
1.1. Os Rins e seus componentes.............................................................................19
1.1.1. Néfrons.............................................................................................................19
1.1.2. Barreira de filtração glomerular.........................................................................20
1.1.3. Podócitos..........................................................................................................22
1.2. Proteinúria e Lesão podocitária...........................................................................26
1.3. Visão geral sobre doença renal crônica (DRC) e seus fatores de risco..............28
1.4. Consumo de proteínas como fator de risco para DRC........................................29
1.5 Proteínas e genes envolvidos com a barreira de filtração glomerular (BFG)
....................................................................................................................................31
1.5.1 Gene NPHS1 e proteína nefrina........................................................................31
1.5.2 Gene NPHS2 e a podocina................................................................................32
1.5.3 Gene TRPC6 e o canal de cálcio receptor potencial transitório C.....................33
1.5.4 Gene PODXL e a podocalixina...........................................................................34
2. JUSTIFICATIVA.....................................................................................................36
3. HIPÓTESE..............................................................................................................37
4. OBJETIVOS...........................................................................................................38
4.1 Objetivo geral........................................................................................................38
4.2 Objetivos específicos............................................................................................38
5. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................39
5.1 Genes e proteínas utilizadas como controle nos estudos.....................................39
5.1.1. RPLP0 e GAPDH..............................................................................................39
5.1.2. Sinaptopodina...................................................................................................39
5.2. Cultura Celular.....................................................................................................39
17
5.2.1 Descongelamento..............................................................................................40
5.2.2. Plaqueamento...................................................................................................40
5.3. Testes para padronização dos experimentos.......................................................41
5.3.1. Comparação entre podócitos indiferenciados e diferenciados por
imunocitoquímica indireta (ICI)...................................................................................41
5.3.2. Viabilidade por Calceína AM e MTT.................................................................43
5.3.2.1. Viabilidade com Calceína AM........................................................................43
5.3.2.2. Viabilidade com MTT.....................................................................................44
5.3.3. Time Course para determinar dano após exposição à droga PA......................44
5.3.3.1. Marcação com faloidina.................................................................................45
5.3.4. Avaliação de marcadores de autofagia após carenciamento de soro fetal bovino
no meio de cultura, por 24 horas................................................................................46
5.4. Estudos de exposição à albumina em podócitos normais e após indução com a
PA...............................................................................................................................46
5.4.1. Avaliação da taxa de transcrito dos RNAs.........................................................46
5.4.1.1. Extração de RNA...........................................................................................47
5.4.1.2 Síntese de cDNA.............................................................................................48
5.4.1.3. Análise de expressão por Real Time PCR....................................................48
5.4.2. Avaliação da expressão das proteínas.............................................................49
5.4.2.1 Extração de proteína.......................................................................................49
5.4.2.2 Quantificação das proteínas totais por BCA....................................................50
5.4.2.3 Western Blot...................................................................................................50
5.4.2.3.1 SDS-PAGE..................................................................................................50
5.4.2.3.2 Transferência para a membrana..................................................................51
5.4.2.3.3 Teste com Ponceau S.................................................................................51
18
5.4.2.3.4 Imunorreação...............................................................................................51
5.4.3. Imunocitoquímica para localização das proteínas alteradas............................52
5.4.4. Montagem das imagens....................................................................................52
5.5. Análise estatística................................................................................................52
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................53
6.1. Estudos de exposição à albumina em podócitos normais e após indução com a
PA...............................................................................................................................53
6.1.1. Avaliação da expressão relativa de PODXL, NPHS1, NPHS2 e TRPC6.........53
6.2 Genes NPHS1 e NPHS2 - proteínas nefrina e podocina......................................53
6.2.1. Nefrina e o gene NPHS1...................................................................................53
6.2.2. Podocina e o gene NPHS2................................................................................59
6.3. Canal de Cálcio receptor potencial transitório C e o gene TRPC6......................65
6.4. Podocalixina e o gene PODXL.............................................................................76
7. CONCLUSÕES ......................................................................................................85
8. LIMITAÇÕES DO ESTUDO...................................................................................86
9. REFERÊNCIAS……………………………………………………………………........87
10. ANEXOS.............................................................................................................100
10.1. Anexo I: Termo comitê de ética........................................................................100
10.2. Anexo II: protocolo das soluções......................................................................106
10.3. Anexo III: resultados e discussão dos protocolos de padronização.................110
19
1.INTRODUÇÃO
1.1 Os Rins e seus componentes
Os rins fazem parte do sistema urinário e localizam-se no retroperiônio (Figura
1). Suas principais funções são: filtração e remoção dos resíduos metabólicos, ajuste
da concentração de água e sais minerais, manutenção do pH dos fluídos corporais
além da regulação da pressão arterial pelo sistema renina-angiotensina-aldosterona
(1,2).
Figura 1: Componentes do sistema urinário, com destaque para os rins, em laranja.
Adaptado de Patton KT e Thibodeau GA, 2010 (3).
Para exercerem suas funções, os rins se dividem em estruturas, cada uma com
características específicas.
1.1.1 Néfrons
Nos rins existem cerca de um milhão de néfrons que são definidos como as
unidades filtradoras renais. Estes são divididos funcionalmente em duas partes
principais: túbulo renal e corpúsculo renal (Figura 2). A ultrafiltração do sangue fica a
cargo do corpúsculo renal formado pelo glomérulo, uma rede de capilares
emaranhados, e pela cápsula de Bowman (4).
20
Figura 2: Néfrons e seus componentes. A: Ilustração de corte longitudinal de um
rim com a região do córtex e medula ampliada mostrando a localização dos Néfrons
B: Disposição do néfrons corticais e justamedulares O sangue entra pela arteríola
aferente, retorna para a circulação pela arteríola eferente e a urina formada sai pelo
túbulo coletor (5)
Ao redor do glomérulo situa-se a cápsula de Bowman que envolve os
glomérulos e que possui uma camada de células epiteliais parietais e outra camada
de células epiteliais viscerais especiais, conhecidas como podócitos, que recobrem os
capilares glomerulares. A camada de células parietais mantém o ultrafiltrado separado
do sangue dentro da cápsula (4) (figura 3 A).
1.1.2 Barreira de filtração glomerular
A barreira de filtração glomerular (BFG), que separa a corrente sanguínea do
espaço urinário, é responsável pela ultrafiltração do plasma no processo de formação
da urina (4,6). É composta por três camadas especializadas: a camada de células
21
endoteliais glomerulares, a membrana basal glomerular (MBG) e a camada de células
epiteliais viscerais, os denominados podócitos (figura 3).
Figura 3: Corpúsculo renal e o sistema de filtração. A: corte longitudinal de um
corpúsculo renal, evidenciando suas estruturas internas; B: corte transversal da figura
exibida em A; C: Barreira de filtração glomerular (BFG) ampliada, ilustrando: o
endotélio fenestrado, representado pela camada de células amarelas; a membrana
basal glomerular (MBG), representada em azul; a camada de células epiteliais
viscerais, os podócitos, em vermelho. Adaptado de McCance K, Huether SE, 2010 (6).
A primeira camada da BFG é constituída de células achatadas, as chamadas
células endoteliais, que separam o sangue do tecido e regulam o tônus vasomotor e
a homeostase. Em humanos, o endotélio dos glomérulos é fenestrado, contendo
numerosos poros com aproximadamente 70 a 100 nm de diâmetro que correspondem
a uma área de 20 a 50% da superfície capilar total. Recobrindo as células endoteliais
há uma malha superficial carregada negativamente, composta por proteoglicanos
sulfatados, o glicocálix, e que forma projeções do tipo escova ao redor dos poros.
Deste modo, o endotélio possui um papel ativo na filtração glomerular, auxiliando na
repulsão das proteínas (7). A segunda camada da BFG é a membrana basal
22
glomerular (MBG), descrita como uma malha semelhante a um gel, com volume de
água entre 90 a 93% e com íons carregados negativamente, é uma rede
heteropolimérica composta por colágeno tipo IV, laminina, fibronectina, nidogêneo e
quantidades abundantes de proteoglicanas de heparan sulfato (1% do peso seco da
MBG). Exercendo diversas funções, tais como a filtração e a compartimentalização
das moléculas, além de participar na adesão, migração e diferenciação celulares. Por
fim, recobrindo os capilares glomerulares, estão os podócitos, células altamente
especializadas e diferenciadas que recobrem a face externa (urinária) da MBG e
formam a terceira camada da BFG.
1.1.3 Podócitos
São compostos por três diferentes segmentos morfológica e funcionalmente
diferentes: um corpo celular, processos principais e pedicelos, que são longas
projeções citoplasmáticas (8) (figura 4).
Figura 4: Capilar glomerular com podócitos. À esquerda: imagem de porção de um
capilar glomerular recoberto por podócitos e seus pedicelos; à direita: ilustração da
barreira de filtração glomerular (BFG), evidenciando seus pedicelos ao longo do
capilar, bem como o diafragma de fenda (destaque em amarelo) que se forma entre
eles e o endotélio fenestrado. Adaptado de Marieb e Hoehn, 2010 (4).
Os pedicelos são funcionalmente definidos por três domínios: o domínio apical
da membrana (AMD), o diafragma de fenda (do inglês, slit diaphragm - SD) e o
domínio basal da membrana (BMD), este último associado à MBG (Figura 5A). Os três
domínios estão física e funcionalmente ligados entre si e ao citoesqueleto de actina
23
dos pedicelos, de forma que a actina é comum a diferentes vias fundamentais na
função e disfunção dos podócitos (8,9) (Figura 6). Especial atenção é dada ao domínio
SD, pois além da complexidade dos sinais que são gerados a partir das interações
protéicas homofílicas e heterofílicas dentro dos diafragmas de fenda propriamente
ditos, esta delicada estrutura é exposta a fatores circulantes, pressão da filtração
glomerular, desafios das moléculas de polaridade celular e eventos de fosforilação
que acontecem na porção intracitoplasmática da nefrina. Devido à sua posição
específica dentro das fendas de filtração, várias moléculas dos diafragmas de fenda
têm sido designadas como receptores de sinalização. Diversas e distintas vias de
sinalização intracelular integram estes sinais de chegada, por meio dos quais os
diafragmas de fenda influenciam ou iniciam diferentes processos intracelulares,
incluindo sensação mecânica, sinalização de cálcio, sobrevivência celular,
transcrição, modulação do citoesqueleto de actina e polaridade celular e endocitose
(10,11). Assim, as últimas seis décadas de pesquisa dedicadas ao diafragma de fenda
resultaram na visão de que este local extremamente especializado de contato célula-
célula serve como um complexo especializado de sinalização. A cada ano novas
moléculas são identificadas o que torna este local de sinalização cada vez mais
complexo (Figura 6).
Danos em qualquer um dos três domínios dos pedicelos alteram os feixes
contráteis de actina, normalmente paralelos (11), havendo reorganização ativa dos
filamentos de actina, perda do padrão normal de interdigitações causando o
espessamento dos pedicelos e a consequente perda de proteína pela urina
(proteinúria). Desde o início anos 90 até hoje foram identificadas mutações em
diversos genes que codificam as proteínas importantes na manutenção da estrutura e
da função do complexo de filtração glomerular (11). Estas proteínas são expressas
principalmente nos podócitos e estão envolvidas direta ou indiretamente na
organização dos diafragmas de fenda e do citoesqueleto de actina (Figuras 5B e 6).
24
Figura 5. Modelo funcional da barreira de filtração glomerular. A. Na ilustração observa-se os pedicelos e seus três domínios ABD =
domínio apical da membrana; SD = diafragma de fenda; BMD = domínio basal da membrana; GBM = membrana basal glomerular; MBG:
membrana basal glomerular; FE: endotélio fenestrado. Adaptado de Joshi et al. (12). B. Complexidade das moléculas presentes nos três
domínios dos pedicelos. Adaptado de Grahammer et al.(13).
25
Figura 6. Diagrama esquemático dos complexos proteicos presentes nos
domínios: AMD, SD e BMD. A. AMD: A superfície apical dos pedicelos possui um
glicocálix bem desenvolvido, que contribui com uma carga negativa para a BFG e
preserva a citoarquitetura dos podócitos mantendo os pedicelos separados dos
outros. As proteínas podocalixina e GLEPP1 (PTPRO) possuem ligação com o
citoesqueleto de actina (14,15). B. SD: Complexo multiproteico dos diafragmas de
fenda e suas relações com a actina. C. BMD: complexo multiproteico do domínio
basal, mostrando somente uma parte das interações. Várias moléculas de adesão
estão presentes no BMD, além da proteína de adesão integrina 31. Vermelho:
proteínas de membrana; laranja: proteínas adaptadoras; verde: proteínas efetoras.
Setas duplas: interações bioquímicas entre proteínas; setas verdes: vias de
sinalização efetoras. BS: espaço de Bowman; SD: diafragma de fenda; GBM:
membrana basal glomerular. Adaptado de Faul et al. (16).
26
1.2. Proteinúria e Lesão podocitária
Proteinúria é um problema de saúde que afeta centenas de milhares de
pessoas no mundo inteiro. A proteinúria é um sinal importante e um marcador de
prognóstico para doença renal. Em uma pessoa comum, a excreção de proteína pela
urina é de menos de 150 mg/dia e consiste principalmente nas proteínas plasmáticas
que são filtradas (60%) e proteínas tubulares Tamm-Horsfall (40%). A principal
proteína plasmática presente na urina é a albumina e constitui 20% da excreção diária
de proteínas. Em indivíduos saudáveis, a quantidade de albumina urinária é menor do
que 20 mg (13.8 mg/min) (17). Proteinúria geralmente reflete um aumento na
permeabilidade glomerular para albumina e outras macromoléculas plasmáticas,
sendo que uma coleta de urina de 24 horas com mais de 150 mg de proteína é
considerada patológica. A microalbuminúria é, desta forma, um indicativo de
complicações renais de Diabetes Mellitus, obesidade, síndrome metabólica e de
origem genética. A proteinúria pode progredir e, em 10-50% dos pacientes está
associada ao desenvolvimento de doença renal crônica (DRC), podendo culminar em
diálise e transplante. Existem alguns mecanismos principais responsáveis pelo
desenvolvimento de proteinúria patológica: glomerular, tubular e “overflow”. A
glomerular é a mais comum e representa cerca de 90% dos casos. Existe ainda a
proteinúria induzida por exercícios e a pós-prandial, sendo que há controvérsias se
nestes casos a proteinúria deve ser considerada como proteinúria transiente,
fisiológica, ou se pode ser associada à progressão de doença renal.
Existem quatro tipos celulares envolvidos nas doenças glomerulares e que
podem sofrer dano: células mesangiais, células endoteliais, células viscerais
(podócitos) e células parietais. No caso das podocitopatias, aonde a lesão encontra-
se nos podócitos, alguns dos principais tipos de lesão são a glomeruloesclerose
segmentar focal (GESF), nefropatia membranosa, glomerulonefrite
membranoproliferativa e nefropatia diabética. As podocitopatias podem ser
congênitas, hereditárias ou adquiridas. Na primeira encontram-se anormalidades nas
proteínas estruturais dos podócitos, como no caso da Síndrome Nefrótica Congênita
(18). Lesão podocitária congênita também pode ser originada pelo desenvolvimento
de anticorpos maternos contra a endopeptidase neutra. Nesse caso os anticorpos são
adquiridos no útero, sendo considerados congênitos (19). As condições hereditárias
incluem alterações em proteínas específicas de podócitos, como na α -actinina-4 e
27
podocina (20). Já as lesões de caráter adquirido, em sua maioria são imunes ou não
imunes mediadas, e aquelas que não imunes são por exemplo nefropatia associada
ao HIV (21). A diabetes também está associada a lesão do podócito (22).
Alguns estudos apontam para outro fator causador de lesão nos podócitos,
sendo ele o aumento da tensão glomerular com o aumento da pressão glomerular
(23). Nesse último caso, podemos associar o que foi proposto por Brenner et al, 1982
(24), que propuseram que existem situações nas quais há aumento da taxa de filtração
glomerular e na pressão glomerular e que isto poderia culminar com o
comprometimento da função renal e potencialmente aumentar o risco de progressão
para doença renal. Brenner propôs que uma destas situações, decorrente de uma
ingesta habitual alta de proteínas na dieta, poderia ter um impacto negativo para a
função renal, devido ao aumento contínuo de pressão glomerular e hiperfiltração renal.
Do ponto de vista histológico a lesão nos podócitos apresenta formação de
vacúolos, presença de corpos citoplasmáticos de inclusão e separação da membrana
basal glomerular. No entanto uma resposta característica ao dano é o esfacelamento
dos pedicelos (25). Esse evento acontece por uma simplificação gradual dos
pedicelos, levando a formação de uma célula plana e alongada, reduzindo e
encurtando os pedicelos (26).
Com relação a possíveis causas dessa lesão, Okamura et al, 2013
demostraram que podócitos expostos a níveis de albumina similares ao do ultrafiltrado
de pacientes com proteinúria, em decorrência de síndrome nefrótica (SN),
apresentaram aumento da morte celular, com regulação positiva das vias pró
apoptóticas e das citocinas inflamatórias. Além disso, os glomérulos isolados de
camundongos com SN também apresentaram aumento de expressão de citocinas
pró-inflamatórias, demonstrando que a exposição prolongada à albumina é prejudicial
aos podócitos, contribuindo para a perda progressiva de podócitos observada na
doença renal. Outros estudos também abordam os mecanismos subjacentes à
indução de cascatas inflamatórias e pró-apoptóticas induzidas pela albumina (27).
Já se sabe que lesão podocitária contribui para albuminúria progressiva e que,
inclusive, a lesão pode ser quantificada pela albuminúria. No entanto ainda permanece
obscuro se a albuminúria é uma consequência do dano ou se é um agravante em
potencial da podocitopatia.
28
1.3. Visão geral sobre doença renal crônica (DRC) e seus fatores de risco
A doença renal crônica (DRC) é definida classicamente por anormalidades da
estrutura ou função dos rins presentes por mais de três meses e com implicações para
a saúde. De acordo com o “National Kidney Foundation Guidelines” (KDIGO) (28)
pode ser classificada em cinco estágios, de acordo com o grau de redução da filtração
glomerular (Tabela 1).
Tabela 1. Estadiamento e classificação da doença renal crônica
O Diabetes mellitus (DM) é a principal causa de insuficiência renal crônica (IRC)
no mundo, sendo que a nefropatia diabética apresenta como principais alterações:
albuminuria, hiperfiltração renal e glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF) (29);
uma das principais consequências é a perda podocitária, como evidenciado pelo
estudo realizado por Pagtaluman et al.(1997) (22) e observado em diversos outros
estudos que relataram a apoptose dos podócitos em modelos animais com diabetes,
como o feito por Fangqiang et al., 2016 (30). A segunda maior causa de IRC é a
hipertensão (31), sendo seguida pelos fatores de risco tais como: etnia, gênero,
história familiar, além de sedentarismo, fumo e obesidade (32). Existem poucos dados
sobre o papel da ingesta de proteínas como um fator de risco do desenvolvimento
inicial ou para progressão da doença renal. No entanto estudos populacionais têm
demostrado dados da relação inversa entre consumo proteico e pressão sanguínea
(33–35).
EstágioTaxa de Filtração Glomerular
(ml/min/1.73m2)
Função Renal
1 ≥90 Normal
2 60-89Levemente
deminuída
3a 45-59Leve a
moderadamente
3b 30-45Moderada a
severamente
4 15-29Severamente
diminuída
5 <15 Falência renal
Doença Rena Crônica
29
1.4. Consumo de proteínas como fator de risco para DRC
Um dos fatores de risco para doença renal crônica, descritos na literatura, é o
consumo de proteínas. Atualmente, principalmente no ocidente, o consumo de
proteínas é em torno de 1,5 a 2 vezes maior do que o recomendado pelos órgãos
responsáveis (0,8 g/kg/dia, o que equivale a ~ 10% da energia calórica diária) (36,37).
Especialmente entre atletas de alta performance, há muitos anos que a ingestão de
quantidade excessiva de proteínas tornou-se popular. Como o turnover de proteínas
celulares é maior entre estes atletas, existem controvérsias se há necessidade de
maior ingesta de conteúdos proteicos neste grupo (38,39). Ainda não há, no entanto,
um valor definido e sim algumas recomendações de acordo com o tipo de exercício
e para melhor recuperação (40). Além disso, o consumo diário proteico também
aumentou muito entre indivíduos comuns devido à recente tendência no mundo
ocidental de dietas hiperproteicas como promessa de perda rápida de peso (41–43).
O consumo de dietas hiperproteicas pode trazer consequências para a saúde
sendo uma das preocupações mais comuns o impacto na função renal (44). Esta
relação entre o consumo de proteínas na dieta e a função renal já é foco de estudos
há mais de meio século. A Hipótese de Brenner é uma das referências mais citadas
neste tópico (24). Em 1987, Brenner e Anderson (45), ao estudarem o envelhecimento
e suas consequências nos rins, que estão entre os principais órgãos afetados com o
avanço da idade, demonstraram que entre os fatores que podem influenciar a
progressão do envelhecimento e deterioração renal está a manipulação da dieta,
especialmente a dieta proteica. Neste estudo os autores demonstraram que após uma
dieta com excesso de proteínas parte dos glomérulos ficavam sobrecarregados como
decorrência de uma maior pressão glomerular (hiperfiltração relativa) necessária para
atender ao aumento do fluxo resultante das exigências da dieta. Consequentemente,
pode ocorrer eventual esclerose dos glomérulos o que culmina com o
comprometimento ou até a perda total da função dos néfrons (45). Wakefield et al. em
2011 (46) realizaram experimentos com ratos como animal modelo com o objetivo de
observar se uma dieta hiperproteica seria segura para a saúde renal. Neste estudo os
70 ratos foram alimentados com proteínas de fonte vegetal e animal e aleatoriamente
distribuídos nos seguintes grupos de dieta: a) dieta proteica normal (NP: 15% de
energia proteica) e b) dieta hiperproteica (HP: 35% de energia proteica). Após 4, 8, 12
e 17 meses a função renal foi verificada pelo clearance de creatinina e pelos níveis de
30
proteína urinários e a patologia renal foi observada examinando-se a hipertrofia
glomerular, glomeruloesclerose e fibrose tubulointersticial. Os resultados foram que
os ratos em dieta HP tiveram 17% a mais de peso dos rins, apresentaram três vezes
mais proteinúria e um clearance de creatinina 27% maior do que os ratos que
consumiram NP. Ainda, os animais com dieta HP apresentaram glomérulos maiores
e GESF. Desta forma, os dados deste trabalho reforçaram o que já havia sido
analisado em outros estudos com o mesmo modelo animal e com outros mamíferos,
como porcos, por exemplo. Esse estudo concluiu que, com relação à análise de
alterações renais, ratos são modelos adequados e que a dieta hiperproteica causa
danos renais morfofisiológicos (46).
Se por um lado o consumo excessivo de proteínas na dieta aumenta a
sobrecarga renal e induz para progressão da DRC, estudos indicam que adultos com
doença renal crônica se beneficiam de uma dieta proteica de restrição ou de redução,
com retardo da progressão para insuficiência renal (47). No caso do DM, por exemplo,
a Associação Americana de Diabetes recomenda que no caso de indivíduos
diabéticos com função renal normal a ingesta proteica não seja maior do que 15 a
20% da energia calórica diária. No entanto, no caso dos indivíduos diabéticos que já
apresentam DRC, a ingesta proteica deve ser para menos de 0.8 g/kg/dia (<10%),
pois há maior chance de retardar a progressão da doença (48). Recentemente Piccoli
et al. (2016) (49) realizaram um estudo observacional no qual ofereceram dieta de
redução proteica para dois grupos: a) 149 pacientes diabéticos com nefropatia e b)
300 pacientes não diabéticos com nefropatia e não observaram diferença nos
resultados de função renal entre estes dois grupos, mostrando que ainda existem
dúvidas quando se trata de dieta proteica restritiva em diabéticos.
31
1.5. Proteínas e genes envolvidos com a barreira de filtração glomerular (BFG)
Na figura 7 estão ressaltadas as proteínas que foram objeto de estudo neste
trabalho.
Figura 7: Interação entre proteínas dos três domínios dos pedicelos dos
podócitos.Em destaque as proteínas utilizadas neste estudo: podocalixina (laranja),
nefrina (verde), podocina (azul) e o receptor transiente de canal de cálcio – TRPC6
(bege). Adaptado de PAVENSTADT, 2002 (50).
1.5.1 Gene NPHS1 e proteína nefrina
O gene NPHS1 (OMIM 602716) está localizado no cromossomo 19q13.1 e
apresenta 29 éxons distribuídos em 26kb. Codifica a proteína nefrina de 180 kDa, que
é uma proteína transmembrana da superfamília das imunoglobulinas (Ig) (51). Possui
8 módulos extracelulares de Ig e um de fibronectina do tipo III. Os domínios do tipo Ig
são do tipo C2, encontrados em proteínas que participam de interação entre células
(52). Nefrinas de pedicelos adjacentes interagem entre si numa estrutura porosa em
forma de zíper e formam a última camada da barreira de filtração, chamado diafragma
de fenda (53). A nefrina possui uma região de N-glicosilação que desempenha papel
fundamental no dobramento molecular da proteína, sendo importante para a sua
localização na membrana plasmática (54). Vários trabalhos sugerem que uma função
32
importante da nefrina seja a manutenção, tanto do contato célula a célula, quanto do
citoesqueleto dos podócitos e demonstram que a nefrina se liga à actina atuando como
um elo entre o citoesqueleto e as fendas do diafragma (55,56). Além da função
estrutural, a nefrina possui outros mecanismos de ação, tais como o reconhecimento
de superfície, envolvimento na resposta imune e sinalização celular (57). O domínio
intracelular da nefrina possui vários resíduos de tirosina que são fosforilados por
proteínas pertencentes à família das quinases Src (58–60). Assim, acredita-se que
oligômeros de nefrina se associem aos “rafts” de lipídios nas membranas das fendas
do diafragma (61), atuando como moléculas receptoras e transdutoras de sinal. A
nefrina possui um papel fundamental na manutenção da integridade das fendas de
diafragma. Algumas evidências que corroboram o papel crítico da nefrina na
manutenção da permeabilidade seletiva dos glomérulos são, por exemplo, a
expressão máxima que pode ser observada nos pedicelos na região das fendas do
diafragma (18); ou, o fato de que experimentos com camundongos knockout de nefrina
revelam o desenvolvimento de proteinúria intraútero e morte nas primeiras 24 horas
de vida (62). Desta forma, danos causados por mutações em genes que codificam
proteínas estruturais dessa região ou mesmo danos secundários a certas condições,
tais como Diabetes mellitus entre outros, têm como consequência a perda de
proteínas plasmáticas pela urina podendo resultar em proteinúria maciça (63).
1.5.2 Gene NPHS2 e a podocina
O gene NPHS2 localiza-se no cromossomo 1q25-q31 sendo composto por 8
éxons, expresso principalmente em podócitos, mas também em testículo humano
(64). Codifica a podocina, uma proteína integral da membrana (65). A podocina
compreende 383 aminoácidos, possui 42 kD, e apresenta estrutura semelhante às
proteínas tipo estomatina, consistindo em um domínio N-terminal, um transmembrana
(curto) e um C-terminal citosólico (66). Deste modo o domínio transmembrana forma
uma espécie de gancho (“hairpin”), característico das proteínas do tipo estomatina
(67). Em 2013, foi identificada uma isoforma menor da podocina, possuindo 315
aminoácidos, com ausência do éxon 5. Ela é traduzida no entanto fica retida no
retículo endoplasmático, sugerindo um papel fisiológico diferente para a isoforma,
talvez associada com o mecanismo de sequestro de componentes que possam
interagir com lipídios e proteínas no retículo (68). A interação da podocina com a
cauda citoplasmática da nefrina é fundamental para a formação do diafragma de
33
fenda. A podocina tem um papel importante de recrutamento de colesterol para a
região dos diafragmas de fenda. Este recrutamento só é possível pois a podocina
pertence a uma família com mais de 1300 proteínas conservadas ao longo da
evolução, que possui um domínio com aproximadamente 150 aminoácidos que
apresentam similaridade às proteínas mitocondriais proibitinas (PHB). É através do
domínio PHB e de dois domínios palmitoil hidrofóbicos adjacentes ao domínio PHB
que a podocina recruta o colesterol contribuindo para a criação de um supercomplexo
de proteínas e lipídios (69). Este supercomplexo é essencial para as interações que
a podocina exerce. Huber et al. 2001 (66) demonstraram que a podocina interage com
a cauda citoplasmática da nefrina e que esta interação induz e potencializa a ação de
sinalização celular exercida pela nefrina (66,70).
A podocina tem interação importante com o TRPC6, uma vez que já foi
demonstrado que esse gene é regulado pela podocina no diafragma de fenda,
especificamente nos “rafts” de lipídios, bem como tem papel na preferência pelo
mecanismo de ativação do TRPC6 (12,70).
1.5.3 Gene TRPC6 e o canal de cálcio receptor potencial transitório C
O gene TRPC6 localiza-se no cromossomo 11q22.1 sendo composto por 15
éxons, codifica um receptor de potencial dos canais de cálcio com 106 kDa e localiza-
se no complexo lipídico da membrana, juntamente com a podocina regulando a ação
mecânica no diafragma de fenda (71). É membro da superfamília de receptores
potenciais transitórios (TRP), sendo a subfamília TRPC (TRPC1-TRPC7) um grupo de
canais iônicos permeáveis ao cálcio que são importantes para o aumento intracelular
de Ca2+ (72). Sabe-se que com a ativação de receptores TRPC e o consequente
aumento do Ca2+ citoplasmático, ocorre fosforilação de proteínas de transdução de
sinal e de fatores de transcrição para a regulação da dinâmica do citoesqueleto (73).
A descoberta de que mutações de ganho de função no gene TRPC6 causavam GESF
hereditário, além de sua localização nos diafragmas de fenda, levaram a uma série de
questões sobre seu papel fisiológico e patofisiológico nos podócitos. Alguns
mecanismos de como a desregulação do TRPC6 possa causar GESF já foram
propostos, apesar de ainda não completamente compreendidos: o aumento de íons
Ca2+ parece modificar e interferir na modulação do citoesqueleto de actina dos
pedicelos o que pode alterar a filtração exercida pelos podócitos (74); o aumento de
34
íons Ca2+ parece estar associado a apoptose dos podócitos, desprendimento ou falta
de proliferação o que resultaria em GESF (50).
Mutações no gene TRPC6 são uma importante causa de GESF de início tardio
e com herança autossômica dominante. As mutações são de ganho de função, ou
seja, para várias mutações já testadas, houve aumento de amplitude de corrente e
aumento de influxo de cálcio em resposta a ativação dos canais. Reiser et al., em
2005, (72) foram um dos primeiros grupos a demonstrarem a expressão de TRPC6
em podócitos e estudo funcional das mutações com ganho de função neste gene.
No caso de estudos referentes a diminuição de expressão desse gene, muitos
relatam que essa redução estaria associada como um mecanismo de defesa e
recuperação do podócito, mecanismo muito utilizado por medicamentos. Deste modo
a inibição do TRPC6 mostra-se como um fator de proteção dos podócitos para
diversas afecções renais como por exemplo, a doença renal diabética, como
demonstrado por Spires et al, 2018, utilizando um modelo knock-out do TRPC6, para
verificar o potencial dessa condição de prevenir o desenvolvimento da doença renal
(75).
Curiosamente, mesmo em outro tecido, o ureter, também apresentou os
mesmos padrões de aumento ou diminuição da expressão do TRPC6. O estudo
relacionado a fibrose renal e uma forma de proteção contra sua progresso, obteve os
mesmos resultados dos estudos anteriores, de modo que a ativação do TRPC6
contribuiu para a patogênese da fibrose renal, ao passo que sua inibição, sendo por
deleção do gene ou bloqueio utilizando fármacos levou a uma melhora do fenótipo
(76).
1.5.4 Gene PODXL e a podocalixina
O gene PODXL localiza-se no cromossomo 7q32-q33 codifica a podocalixina
uma proteína importante no revestimento celular, situada na região do glicocálix
responsável pela regulação da adesão e da morfologia dos podócitos e essencial para
a manutenção dos diafragmas de fenda (77).
A podocalixina é uma glicosialoproteina transmembrana sulfatada, sendo seu
domínio extracelular rico em serina, treonina e prolina, fornecendo muitos sítios
potenciais de glicolisação (78). Alguns estudos demonstram que o domínio
citoplasmático da podocalixina está conectado ao citoesqueleto de actina sendo que
35
em modelos animais com nefrose induzida pela droga puromicina aminoglicosídeo
(PA) esta conexão da podocalixina com o citoesqueleto da actina é interrompida
(79,80). Um estudo avaliando a expressão de algumas moléculas em podócitos de
pacientes com doença renal adquirida evidenciaram uma diminuição da expressão da
podocalixina e a consequente obliteração dos pedicelos e proteinúria (81).
Além do seu papel nos podócitos, a podocalixina é expressa em diversos tipos
de tecidos e alguns estudos a detectaram em linhagens celulares malignas e
neoplasias, desde linhagens celulares de câncer de cólon, mama e próstata, como
carcinomas de mama, fígado, pâncreas, tireoide, rim e até em leucemia aguda (80,82–
84).
São poucos os estudos associado alterações genéticas no gene PODXL com
danos renais, no entanto em 2014 foi realizado um estudo propondo esse gene como
candidato para GESF em uma família com herança autossômica dominante, no
entanto por conta dos poucos estudos desse tipo de associação, não se sabe sobre o
efeito dessa alteração na função da proteína (85).
36
2. JUSTIFICATIVA
Já se sabe que indivíduos com proteinúria apresentam lesão podocitária. No
entanto existem controvérsias se as proteínas presentes no filtrado glomerular destes
indivíduos desencadeiam a lesão, ou se podem atuar como coadjuvante nas
podocitopatias.
Com respeito ao consumo de proteínas da dieta, existem estudos mostrando
efeito na hiperfiltração renal em indivíduos com doença renal pré-existente (86). Há
controvérsias porém, quanto ao risco do desenvolvimento de doença renal em
indivíduos saudáveis após consumo de suplementos proteicos ricos em albumina e
outras proteínas, ou se o risco só existe em indivíduos já portadores de patologia renal
(38).
Nos dois casos, ainda não são bem compreendidas as consequências
moleculares e seus mecanismos nos podócitos após a exposição ao excesso de
albumina no filtrado glomerular ainda.
Ressalta-se a importância de estudos moleculares preliminares em modelos
celulares adequados – tais como a cultura celular de podócitos utilizada neste estudo
– de forma que os resultados possam ser utilizados no direcionamento de estudos
futuros em modelo animal. Justifica-se a escolha das proteínas alvo estudadas
principalmente pela sua importância na função, localização nos diafragmas de fenda
e na dinâmica do citoesqueleto dos podócitos.
Desta forma, além de complementar os estudos fisiológicos existentes até o
momento, o conhecimento científico nesta área será fundamental para que os órgãos
responsáveis possam estabelecer valores diários de consumo proteico na dieta, já
que a conclusão do relatório de 2002 do Instituto de Medicina DRI foi a de que não
existem dados científicos suficientes para recomendações do limite superior de
ingesta de proteínas (36).
37
3. HIPÓTESE
A hipótese deste estudo é de que o consumo excessivo de proteínas na dieta
deve alterar a expressão dos genes e proteínas envolvidos com a atividade dos
podócitos na filtração glomerular, escolhidos para o estudo, tanto no grupo de
podócitos saudáveis, como naqueles nos quais foi induzido dano com puromicina
aminoglicosídeo (PA).
Sendo assim consideramos:
1) Hipótese nula (H0) – sem diferença de expressão.
2) Hipótese alternativa (H1) – com diferença de expressão.
38
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Avaliar se há diferença de expressão e de localização celular de proteínas
presentes nos pedicelos dos podócitos frente à suplementação progressiva de
albumina em cultura de podócitos normais e em podócitos após a exposição com a
droga PA.
4.2 Objetivos específicos
1) Avaliar se há diferença de expressão dos genes NPHS2, NPHS1,
PODXL e TRPC6 e das proteínas codificadas por estes genes: podocina,
nefrina, podocalixina e receptor potencial transitório de íons cálcio,
respectivamente, em cultura celular de podócitos, frente às seguintes
condições:
(1) Suplementação progressiva de albumina em podócitos normais.
(2) Suplementação progressiva de albumina em podócitos após dano com
a droga puromicina aminoglicosídeo (PA).
2) Comparar os diferentes níveis de expressão dentro dos grupos de
tratamento (1) e (2) utilizando testes estatísticos apropriados
3) Observar se há diferença de localização das proteínas nos podócitos nos
grupos de tratamento (1) e (2).
39
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Genes e proteínas utilizadas como controle nos estudos
Para os estudos de expressão foram utilizados alguns genes e proteínas para
controle de alguns experimentos e padronizações.
5.1.1. RPLP0 e GAPDH
O gene RPLP0 localiza-se no cromossomo 12q24.23 sendo composto por 8
éxons e codifica a subunidade 60S ribossômica. O RPLP0 é frequentemente escolhido
como gene de referência em experimentos de RT-PCR pois, alem de ser um gene
conservado ao longo da evolução, é um gene “housekeeping”, ou seja, necessário
para as funções basais celulares, sendo expresso em todas as células e com
expressão contínua, ou seja, constitutiva. Já o gene GAPDH localiza-se no
cromossomo 12p13.31 sendo composto por 10 éxons e codifica um membro da família
de proteínas de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. A proteína catalisa um
importante passo de produção de energia no metabolismo de carboidratos, a
fosforilação oxidativa reversível sendo o GAPDH um gene conservado “housekeeping”
e constitutivo (87–89).
5.1.2. Sinaptopodina
A Sinaptopodina é uma proteína expressa pelo gene SYNPO que se localiza
no cromossomo 5q33.1 sendo composto por 10 éxons, que associada à actina pode
desempenhar papel na forma e motilidade das células. (90). É uma proteína de alta
expressão citoplasmática em podócitos diferenciados e por esse motivo muito
utilizada como controle de diferenciação em cultura de podócitos.
5.2. Cultura Celular
Os podócitos adultos são células terminalmente diferenciadas, ou seja, estas
células não sofrem mitose, não se proliferam. Isto dificultava os estudos in vitro, mas
Saleem et al., em 2002, (91) estabeleceram o cultivo de podócitos condicionais
imortalizados, o que facilitou muito a vida dos pesquisadores da área. Esta linhagem
celular foi obtida por meio da transfecção com o gene o com promotor SV-40 sensível
à temperatura. Desta forma, esta linhagem celular de podócitos prolifera à
40
temperatura permissiva (33ºC), quando então as células possuem um formato de
poliedro (do inglês “coblestone”) e são indiferenciadas. Na temperatura não-
permissiva (37ºC), as células entram num estado de quiescência e começam a
expressar marcadores de diferenciação de podócitos in vivo tais como a nefrina,
podocina e sinaptopodina. Para o presente estudo foi utilizada a linhagem celular de
podócitos condicionais imortalizados da linhagem AB8/13 - doação do Prof. Dr. Moin
Salem, Bristol University, UK. AB faz referência ao anonimato do paciente; 8 à
construção tsSV40; 13 ao gene da enzima transcriptase reversa da telomerase,
hTERT.
Os podócitos foram armazenados no nitrogênio líquido, em tubos criogênicos
devidamente identificados. Foram utilizadas células entre as passagens 14 a 22.
5.2.1 Descongelamento
Os tubos foram descongelados por 2 minutos em TA e posteriormente
colocados em garrafa de cultura celular com meio RPMI 1640 + 10% soro fetal bovino
(FBS) (Sigma) e incubados em estufa a 33°C e 5% CO2 por 24 h. Após esse período
o meio foi descartado e foi adicionado meio novo. A cada dois dias o meio foi trocado
até que as células atingissem 90 % de confluência. Nesse momento foram transferidas
para uma garrafa maior (repique/passagem). Para desprender as células que estavam
aderidas ao fundo da garrafa foi utilizada tripsina (Sigma) por 5 minutos a 33°C e sua
inativação foi feita com RPMI 1640 + 10% FBS, sendo feita então centrifugação da
solução por 5 minutos a 1200 rpm em TA. O meio foi retirado e o pellet ressuspendido
em de meio RPMI 1640 + 10% FBS, de acordo com o volume da nova garrafa e então
as células foram repassadas para nova garrafa.
5.2.2. Plaqueamento
Plaqueou-se 5x104 células/mL, em placas de 6 poços. Para contagem das
células, após tripsinização e centrifugação, ressuspendeu-se as células em 1ml de
meio RPMI 1640 + 10% FBS. Foi realizada uma diluição de 1:10, totalizando 20 µl
dessa solução para contagem das células em câmara de Neubauer. Foram contados
os 4 quadrantes e realizada a média para saber o total de células em 1ml, para
posterior diluição para o plaqueamento referido acima. As células excedentes foram
sempre congeladas após a etapa de repique e centrifugação, sendo o pellet
ressuspendido em meio de congelamento (RPMI + 10% FBS + 10% DMSO). Cada
41
tubo criogênico contendo 1 mL de meio com células ficou por 24 h em suporte com
isopropanol gelado em -80°C. Posteriormente foi armazenado em nitrogênio líquido.
Quando as células plaqueadas atingiram 40% de confluência poço
(aproximadamente 48h após o plaqueamento) a temperatura da estufa foi alterada
para 37°C para que então as células iniciassem a diferenciação durante 10-14 dias.
Sendo que nos primeiros dias elas ainda proliferam, atingindo assim 60% de
confluência necessária para os experimentos seguintes.
5.3. Testes para padronização dos experimentos
Foram realizados alguns testes para padronização dos experimentos e avaliação da
viabilidade das células: a) validação dos podócitos diferenciados com proteínas
marcadoras de diferenciação por imunocitoquímica indireta (ICI); b) viabilidade celular
após suplementação de albumina por testes de MTT e Calceína-AM; c) time-course
após exposição com a droga PA por ICI e faloidina; d) avaliação de marcadores de
autofagia após carenciamento de soro no meio de cultura, por ICI e por Western Blot
e por expressão relativa de PODXL; Estes experimentos serão descritos
detalhadamente nos subitens 5.3.1 (a), 5.3.2 (b), 5.3.3 (c) e 5.3.4 (d) a seguir.
5.3.1. Comparação entre podócitos indiferenciados e diferenciados por
imunocitoquímica indireta (ICI)
Para este experimento, foi utilizado o protocolo de cultivo celular descrito no
item 5.2, com a única diferença de que foi colocada uma lamínula de vidro em cada
poço (sendo todo o experimento realizado em triplicata técnica). Desta forma, as
células cultivadas aderiram à superfície das lamínulas. Estes experimentos foram
realizados em duas etapas: 1) primeiramente foi realizada a ICI do grupo dos
podócitos indiferenciados; 2) posteriormente foi realizada a ICI do grupo de podócitos
diferenciados.
1) ICI para podócitos indiferenciados: as células foram cultivadas a 33°C e
então foi realizado o protocolo de ICI com anticorpos policlonais primários para as
proteínas citoplasmáticas nefrina, podocina e sinaptopodina (Bios antibodies) e
anticorpo secundário goat anti-rabbit – FITC (Proteintech), e marcação do núcleo com
DAPI (Cell Signaling).
42
2) ICI para podócitos diferenciados: novas células foram cultivadas sendo que
desta vez estas foram levadas para diferenciar a 37°C por 10 dias e novamente
realizou-se ICI para as mesmas proteínas e marcação com DAPI.
Protocolo de ICI:
- Após o período do cultivo o meio foi retirado e as células aderidas na lamínula foram
lavadas por 3 vezes com PBS 1X.
- Para fixação dos podócitos foi utilizado paraformaldeído 3,7% por 15 minutos, em
seguida foi feita lavagem com PBS 1X.
- As células foram bloqueadas e permeabilizadas com solução de BSA 3% + triton
0,6% em PBS 1X, por 1 hora. Novamente foi realizada lavagem com PBS 1X.
- Para exposição ao anticorpo primário 1:200, as lamínulas: foram colocadas em uma
câmara úmida e incubadas com 150 µL do anticorpo primário diluído em BSA 1% em
PBS 1X overnight a 4°C.
- No dia seguinte foram realizadas 3 lavagens com PBS 1X e as lamínulas foram
novamente incubadas, agora com 150 µL de anticorpo secundário diluído 1:200 :em
BSA 1% em PBS, por 2 horas a 4°C no escuro; por fim foi realizada nova lavagem por
3 vezes com PBS 1X.
À lâmina previamente identificada foi adicionada 1 gota de meio de montagem
com DAPI e a lamínula foi colocada sobre essa gota de modo que a face com as
células fixadas entrasse em contato com o DAPI com fluoroshield. (Sigma)
Após secagem do meio de montagem as lâminas foram levadas, sempre
protegidas da luz, para leitura e visualização no microscópio de florescência Zeiss em
que foi gerada uma imagem para cada comprimento de onda correspondente ao
fluoróforo ligado ao anticorpo secundário e ao DAPI com fluoroshield. (Sigma).
Após experimentos de ICI somente os podócitos diferenciados, expressaram
as proteínas citoplasmáticas que são marcadores de diferenciação de podócitos:
nefrina, podocina e sinaptopodina (anexo III: figuras 1 a 3, respectivamente),
viabilizando o seu uso nos experimentos com os podócitos (91).
43
5.3.2. Viabilidade por Calceína AM (acetometoxi de calceína) e MTT (sal
tetrazólico).
O objetivo destes experimentos foi avaliar: (a) por quanto tempo pelo menos
50% das células suportam uma dose inicial de suplementação de albumina no meio
de cultura; (b) qual a maior concentração de albumina (das usadas no estudo) na qual
as células permanecem viáveis de modo semelhante ao controle (sem albumina) pelo
tempo máximo estabelecido em (a). Ambos os ensaios utilizam a atividade metabólica
de células viáveis para determinar o efeito componente externo. Com relação ao
ensaio de calceína-AM, este identifica as células viáveis uma vez que estas
transportam a calceína via membrana realizando endocitose, desse modo o radical
acetoximetil é removido pelas esterases intracelulares e a molécula liga-se ao cálcio
no interior celular, emitindo fluorescência visível no espectro verde. Já com relação ao
ensaio de MTT, as células viáveis fazem endocitose do MTT e ele é acumulado nas
mitocôndrias que reduzem o anel tetrazólico do sal formando cristais de formazan,
que se acumulam em compartimentos endossomais ou em lisossomos.
Desta forma, em um primeiro momento foi avaliado qual o maior tempo que as
células suportariam uma dose média de albumina de 12 mg/mL em placas de 96
poços. Os seguintes tempos de exposição foram utilizados: 24, 12, 6, 3 e zero horas.
Em um segundo momento, com o tempo máximo já pré-estabelecido, foram
testadas as seguintes concentrações de albumina: 0, 18, 20, 30 e 40 mg/mL. Sendo
ambos os experimentos realizados em triplicata técnica.
Deste modo estabeleceu-se o tempo máximo de exposição à albumina de 24
horas, sendo que todas as concentrações propostas para o estudo apresentaram
viabilidade semelhante ao controle (sem albumina), permitindo o uso dessas
concentrações. O valor mínimo de concentração de albumina foi 3 mg/mL, que
corresponde à microalbuminúria; o valor máximo foi 40 mg/mL, que corresponde à
concentração de albumina no plasma sanguíneo (~ 4g/dl). O valor zero foi utilizado
como controle negativo.
5.3.2.1. Viabilidade com Calceína AM
Após cultivo em diferentes tempos de exposição e diferentes concentrações de
albumina como previamente explicado, foi realizado o seguinte protocolo:
44
- Removeu-se o meio de cultura e as células foram lavadas 3 vezes com PBS 1X.
- Foi adicionada a solução de 500µL de PBS 1x e 2µL de Calceína AM para cada poço.
- As células ficaram durante 30 minutos com a solução na estufa à temperatura de
37°C.
- As células foram observadas em microscópio de fluorescência com comprimento de
onda de 488 nm.
As imagens do poço foram fotografadas e foi contado o número de células com
o auxílio do programa ImageJ. As análises de células viáveis foi foram feitas com o
programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS).
5.3.2.2. Viabilidade com MTT
Após o cultivo descrito anteriormente, e após a exposição à albumina em
diferentes períodos e concentrações, foi realizado o seguinte protocolo:
- Removeu-se o meio de cultura e as células foram lavadas 3 vezes com PBS 1x.
- As células foram incubadas em solução de 10µL de solução de MTT (12mM)
acrescidos de 100µL de DMEM sem soro por 4 horas à 37°C.
- O meio foi retirado e as células foram lavadas 1 vez com PBS 1x.
- As células foram incubadas “overnight” à 37ºC para solubilização dos cristais de
formazan com duas diferentes estratégias independentes:
1) 100 µL de 10% SDS + 0,01M HCl;
2) 100 µL DMSO.
- No dia seguinte foi realizada a leitura da absorbância com equipamento ELISA
430nm (HCl) e 570nm (DMSO).
As análises de células viáveis foram feitas com o programa SPSS.
5.3.3. Time Course para determinar dano após exposição à droga PA
A utilização de PA tem a finalidade de mimetizar dano glomerular, no caso, a
podocitopatia. Esta droga é nefrotóxica e utilizada há muito tempo em estudos com
modelos animais, para indução do dano renal. Tanto em ratos in vivo, como em cultura
45
de podócitos in vitro, já foi demonstrado que esta droga atua na via ERK (quinase
regulada por sinal extracelular), do grupo de proteínas quinase ativadas por mitógenos
(MAPK), proteínas que desempenham papel importante na sobrevivência celular ou
na mediação do processo de apoptose, regulando a estabilidade do citoesqueleto e,
no caso de dano com a droga PA, esta via é prejudicada.
As células cultivadas foram plaqueadas conforme protocolo de cultivo celular
descrito anteriormente. Foi realizada exposição dos podócitos diferenciados a quatro
concentrações de PA: 0, 5, 15 e 24 µg/mL em dois tempos de exposição: 12 e 24 h a
fim de se determinar as condições para o estudo de exposição à albumina. Estes
valores de PA foram baseados em experimento de Rigothier et. al., 2016 (92).
Seguiu-se com o seguinte protocolo:
- O meio foi retirado e as células foram lavadas 3 vezes com PBS 1X.
- Para fixação dos podócitos foi utilizado paraformaldeído 3,7% por 15 minutos, em
seguida foi feita lavagem com PBS 1X.
- As células foram bloqueadas e permeabilizadas com solução de BSA 3% + triton
0,6% em PBS 1X, por 1 hora. Novamente foi realizada lavagem com PBS 1X. Nesse
ponto foram seguidos dois protocolos de verificação da viabilidade celular: por ICI com
anticorpo primário nefrina (protocolo descrito no item 5.3.1) e com marcação com
faloidina para visualização do citoesqueleto das células. Ambos os experimentos
foram realizados em triplicata técnica.
O tempo de exposição à PA foi determinado em 12 horas com concentração de 15
µg/mL.
5.3.3.1. Marcação com faloidina
Foi realizada a marcação com faloidina por sua propriedade de ligar-se à
interface presente entre os monômeros de actina-F consecutivos em filamentos de
actina que compõem o citoesqueleto, deste modo permitindo sua marcação na célula.
Após fixação e bloqueio das células, estas foram incubadas com 200µl de
faloidina 488 (100nM) por 30 minutos TA, no escuro. Foram realizadas 3 lavagens
com PBS 1x e foi adicionada 1 gota de meio de montagem com DAPI no próprio poço.
Após secagem do meio de montagem as placas foram levadas, protegidas da luz,
46
para leitura e visualização no microscópio de florescência Zeiss em que foi gerada
uma imagem para cada comprimento de onda correspondente ao fluoróforo da
faloidina e ao do DAPI.
5.3.4. Avaliação de marcadores de autofagia após carenciamento de soro fetal
bovino no meio de cultura, por 24 horas.
Após 10-14 dias de diferenciação, as células foram submetidas à condição de
carenciamento de FBS e foram expostas apenas ao meio RPMI 1640 por 24 horas
para a avaliação dos marcadores de expressão de autofagia de LC3-II (ab48394) e
p62 (ab91526) e para avaliação de expressão relativa por Real Time PCR. No caso,
foi utilizado o PODXL como indicador de se a expressão estava alterada. O marcador
LC3-II foi avaliado por meio de ICI, de acordo com protocolo descrito no item 5.3.1 e
a proteína p62 por Western Blot.
Após os dois experimentos, verificou-se que a restrição de FBS não afetou os
marcadores de autofagia, já que ambos foram expressos de forma semelhante em
células com e sem carenciamento.
Para avaliar o processo de autofagia desencadeado pelo carenciamento
avaliamos LC3-II e p62, ambos já bem estabelecidos como marcadores do processo
de autofagia nas células. A proteína LC3-II atua como um "receptor" de moléculas que
devem ser eliminadas e é usada para estimar a abundância de autofagossomos na
via da autofagia. E o LC3-II interage com moléculas “adaptadoras”, tais como p62, que
é um elemento crucial para o processo de turnover e degradação de componentes
tóxico
5.4. Estudos de exposição à albumina em podócitos normais e após indução
com a PA
5.4.1. Avaliação da taxa de transcrito dos RNAs
Para avaliação da taxa de transcrito dos RNAs frente as diferentes
concentrações de albumina em podócitos com e sem tratamento com PA, foi realizada
a extração de RNA e sua quantificação utilizando Nanodrop 8000
Spectrophotometer (Thermo Electron, WI, USA), síntese de cDNA e PCR Real Time
conforme descrito a seguir, utilizando primers/probes: RPLP0 (Hs.PT.39a.22214824 -
IDT), NPHS1 (Hs00190446_m1 - ThermoFisher), NPHS2 (Hs00387817_m1-
47
ThermoFisher), TRPC6 (Hs00988479_m1 - ThermoFisher) e PODXL
(Hs.PT.58.24509981 - IDT).
5.4.1.1. Extração de RNA
A extração de RNA foi realizada utilizando protocolo com Trizol.
- O meio de cada poço foi retirado, e foram lavados 3 vezes com PBS 1X gelado.
- Após a remoção do PBS, as células foram lisadas direto no poço, em gelo, com a
adição de 500 µL de trizol em cada duplicata, resultando em 1 mL de trizol por
condição.
- As células foram raspadas e para lise mais eficiente foram passadas várias vezes
pela ponteira, sem fazer espuma.
- O lisado celular com trizol foi incubado por 5 minutos em TA e posteriormente foi
adicionado 200 µL de clorofórmio. Foi homogeneizado e transferido para um
eppendorf que foi então agitado por 30 segundos e incubado por 3 minutos a TA.
- As amostras foram centrifugadas a 12.000 G por 20 minutos a 4ºC. Nesse momento
foram formadas 3 fases, sendo a 1ª delas contendo RNA. Esta foi transferida para um
novo eppendorf e a precipitação foi realizada com a adição de 500 µL de álcool
isopropílico gelado com 10 minutos de incubação a TA.
- Foi então realizada nova centrifugação a 12.000 G por 20 minutos a 4°C e o
sobrenadante descartado por inversão.
- O RNA precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 75% gelado e centrifugado
novamente a 7.500 G por 5 minutos a 4°C.
- O sobrenadante foi descartado por inversão e a amostra ficou secando a TA por 15
minutos.
- O RNA foi ressuspendido em 20-30 µL de H2O DEPC autoclavada e ficou 30 minutos
no gelo.
Para análise do RNA extraído foi realizada eletroforese com gel de agarose 1%,
corado com brometo detídio; também foi realizada a quantificação em
espectofotômetro com comprimento de onda de 260 nm e a pureza do RNA foi
48
observada nas razões 260/280>1,8 e 260/230>200. As amostras foram armazenadas
a -80°C. Sendo todo o experimento realizado em triplicata técnica e biológica.
5.4.1.2 Síntese de cDNA
A reação de transcrição reversa ocorreu com kit High Capacity cDNA Reverse
Transcription (Thermofisher), conforme indicação do fabricante.
5.4.1.3. Análise de expressão por Real Time PCR
Foi realizada reação quantitativa de PCR Real Time utilizando 4 µL (20 ng) das
amostras de cDNA obtidas anteriormente, acrescidos de 6 µL do mix preparado
anteriormente. Em placa de 96 poços específica, seguindo protocolo do reagente
TaqMan™ Universal Master Mix II, with UNG (Applied Biosystems™), utilizando
probes/primers: probe = /56 – FAM/ CCGCTGCTG/ZEN/GTCCTTCCTCT/3IABkFQ/; primer 1
= AACCATTCTCCACTGTCTGC; primer 2 = CATCATCACCATCGTCTGCAT. Sendo o
RPLP0 controle endógeno.
Tabela 2: MIX da reação do Real Time PCR
MIX PCR REAL TIMEa
Master Mix 3µL
Primer 10x 0,25 µL
H2O 2,75 µL
a valores para 1 poço da placa de 96.
Figura 8: Ciclo da PCR Real – Time, utilizado nas reações desse estudo, no
equipamento – ABiPrism 7500 Fast Real – Time PCR System.
49
Figura 9: Gel de extração de RNA. É possível visualizar duas bandas
referentes ao RNA 28S e 18S (componentes das subunidades ribossomais).
5.4.2. Avaliação da expressão das proteínas
Para avaliação de expressão das proteínas frente as diferentes concentrações
de albumina em podócitos com e sem tratamento com PA, foi realizada a extração de
proteína, quantificação por BCA, Western Blot conforme descrito a seguir, utilizando
anticorpos primários para as proteínas de interesse: nefrina e podocina (Bioss
antibodies); podocalixina, canal de cálcio receptor de potencial transitório C
(ThermoFisher); e GAPDH como controle (ThermoFisher). O anticorpo secundário foi
(Proteintech).
5.4.2.1 Extração de proteína
A extração das proteínas totais foi realizada utilizando tampão RIPA (MERCK)
- O meio foi retirado e as células lavadas com PBS 1X por 3 vezes;
- Adicionou-se 500µL de tampão RIPA em cada duplicata, resultando em 1 mL de
tampão por condição.
- As células foram raspadas com auxílio de uma ponteira, a solução foi transferida
para um microtubo do tipo eppendorf e agitada em agitador tipo vórtex, sendo então
centrifugadas por 10 minutos a 12.000 G em 4°C.
- O sobrenadante, contendo a proteína total, foi transferido para novo microtubo do
tipo eppendorf e o pellet formado foi descartado. O armazenamento foi realizado em
biofreezer a -80°C.
50
5.4.2.2 Quantificação das proteínas totais por BCA
As proteínas totais extraídas dos podócitos foram quantificadas utilizando kit
BCA Protein Assay (ThermoFisher Scientific), conforme protocolo do fabricante. A
leitura foi feita utilizando Nanodrop 8000 espectrophotometer (ThermoFisher
Scientific), realizando primeiro uma curva padrão e depois as amostras foram
quantificadas.
5.4.2.3 Western Blot
Para a análise das proteínas estudadas foi empregada a técnica de Western
Blot, de modo que foi possível quantificar e comparar o tamanho da proteína de
interesse nas diversas condições de estudo.
5.4.2.3.1 SDS-PAGE
As amostras de proteína total extraídas foram diluídas de modo que a
concentração final (Tabela 3) para aplicar no poço do gel fosse 20µL, sendo que o
conteúdo aplicado consistia em 10 µl de amostra + 10µl de tampão de amostra 2X
(anexo II). O gel de corrida das amostras assim como todo o processo seguiu o
protocolo Laemmli (1970) (93) (anexo II), com gel de separação com concentração de
15%. Foi utilizado 2µl Ladder Odyssey® One-Color Protein Molecular Weight Marker,
para verificar o tamanho das proteínas estudadas. A corrida do gel foi realizada a 60
V até que as amostras chegassem próximas ao final do gel. Todo o experimento foi
realizado em triplicata técnica e biológica.
Tabela 3: Condições utilizadas para cada proteína no SDS-PAGE
ProteínaConcentração
utilizada (mg/µL)
Gel de
Separação (%)
Podocina 30 15
Nefrina 50 10
Canal de cálcio receptor de
potencial transitório C30 12
Podocalixina 30 12
Condições para o SDS - PAGE
51
5.4.2.3.2 Transferência para a membrana
Para realizar a transferência das proteínas foi utilizada membrana de PVDF que
foi preparada sendo exposta por 15 segundos em metanol, posteriormente por 2
minutos em H2O destilada e por fim 2 minutos no tampão de transferência. Preparada
a membrana iniciou-se a montagem do aparato de transferência, sendo todos os
componentes umedecidos com o tampão de transferência. A transferência foi
realizada durante 2 horas, a 200 mA em cuba adequada para transferência sob
suporte de gelo.
5.4.2.3.3 Teste com Ponceau S
Para determinar se a transferência foi efetiva realizamos um teste rápido com
Ponceau S. A membrana foi retirada do aparato de transferência e colocada na
solução sob agitação por 15 minutos e posteriormente lavada com TBS-T para retirar
o excesso do reagente e verificar as bandas de proteína transferidas.
5.4.2.3.4 Imunorreação
- Após o teste com Ponceau S, a membrana foi lavada 5 vezes com TBS - T,
com agitação, durante 5 minutos por lavagem.
- Posteriormente a membrana foi incubada com TBS-T + BSA 6% por 2 horas,
para bloqueio.
- Novamente a membrana foi lavada, 5 vezes com TBS - T, com agitação,
durante 5 minutos por lavagem.
- Nesse momento a membrana foi incubada com o anticorpo primário diluído
1:1000 em TBS - T + BSA 3% (para a proteína de interesse p62 e para o GAPDH, ao
mesmo tempo, uma vez que foram utilizados anticorpos de origens diferentes, anti-
rabbit e anti-mouse, respectivamente), sob agitação, em baixa temperatura por 18h.
- A membrana foi lavada 3 vezes com TBS - T, com agitação, durante 5 minutos.
- Foi incubada então, no escuro, com anticorpo secundário 1:1000 diluído em
TBS - T + BSA 3% (para a proteína de interesse e para o GAPDH, ao mesmo tempo,
uma vez que foram utilizados anticorpos de origens diferentes conjugados com
fluoróforos de comprimentos de onda diferentes 800 e 700 nm, respectivamente), sob
agitação, em baixa temperatura por 3h.
52
- Por fim a membrana foi lavada 3 vezes com TBS - T com agitação, durante 5
minutos, e uma vez durante 30 minutos e levada para revelação em suporte sem
contato com a luz.
- A revelação da membrana foi feita utilizando o equipamento Odyssey CLX Li-
Cor. A análise foi realizada utilizando o programa ImageJ.
5.4.3. Imunocitoquímica para localização das proteínas alteradas
Para as proteínas cuja expressão for identificada alterada foram realizados
experimentos de localização celular por ICI. Os protocolos de cultivo celular e de ICI
foram realizados conforme descritos anteriormente, utilizando os mesmos anticorpos
primários das proteínas de interesse utilizados no Western Blot, com anticorpo
secundário conjugado com FITC.
5.4.4. Montagem das imagens
Todas as imagens de microscopia de florescência foram montadas por
sobreposição de imagens feitas da mesma lâmina (com a mesma amostra celular),
para que fosse possível destacar núcleo e proteínas citoplasmáticas. Esse processo
foi realizado utilizando o programa ImageJ. As bandas resultantes dos experimentos
de Western Blot foram quantificadas e analisadas com o auxílio do mesmo programa.
5.5. Análise estatística
Os resultados numéricos foram expressos e comparados utilizando as médias
± erro padrão da média (ER). Os grupos foram comparados com teste t de Student
não pareado (quando dois grupos apenas), e ANOVA e teste a posteriori de Turkey
(para comparação múltipla de médias). Em todos os casos, o nível de significância foi
de p<0,05. A hipótese nula (H0) foi validada quando p≥0,05 e rejeitada quando p<0,05
e neste momento admite-se a hipótese alternativa (H1). Todas as análises estatísticas
foram realizadas com o programa SPSS.
53
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. Estudos de exposição à albumina em podócitos normais e após indução
com a PA
6.1.1. Avaliação da expressão relativa de PODXL, NPHS1, NPHS2 e TRPC6
Para verificar as condições de expressão relativa diante apenas do tratamento
com PA, foram analisados os resultados obtidos por Real-Time PCR para as
condições sem albumina. Deste modo foram comparadas as condições sem albumina,
com e sem PA verificando sua expressão por meio de análise estatística com teste t.
Com relação ao gene TRPC6 houve diferença estatística entre os dois grupos
(p<0,0001), já o PODXL não apresentou alteração de expressão (p=0,85829).
Tabela 4: Comparação dos tratamentos com PA, para análise de expressão
dos RNAs
6.2 Genes NPHS1 e NPHS2 - proteínas nefrina e podocina.
6.2.1. Nefrina e o gene NPHS1
Para todas as condições de albumina com e sem tratamento com PA não houve
produto detectado, mesmo havendo diversas tentativas com condições diferentes:
maior e menor concentração de cDNA, de primer, de ciclos na reação e de buffer.
Albumina PA
NPHS1 0 Não ND ND
NPHS1 0 Sim ND ND
NPHS2 0 Não ND ND
NPHS2 0 Sim ND ND
TRPC6 0 Não 0,000025 1
TRPC6 0 Sim 0,74229 29691,6
PODXL 0 Não 0,002402 1
PODXL 0 Sim 0,002529 1,052872606
ND = nenhum protudo específico detectado
Comparação de expressão frente a exposição a PA
GeneCondição
Média 2ΔCT Média Corrigida
54
Tabela 5: Expressão da proteína Nefrina
Albumina PA
NPHS1 0 Não 1,351 1
NPHS1 3 Não 1,739 1,287
NPHS1 6 Não 1,23 0,91
NPHS1 9 Não 0,643 0,476
NPHS1 12 Não 0,738 0,546
NPHS1 15 Não 1,026 0,759
NPHS1 18 Não 1,039 0,768
NPHS1 20 Não 0,858 0,634
NPHS1 30 Não 1,467 1,086
NPHS1 40 Não 0,958 0,709
NPHS1 0 Sim 0,978 1
NPHS1 3 Sim 0,857 0,877
NPHS1 6 Sim 0,887 0,907
NPHS1 9 Sim 1,372 1,403
NPHS1 12 Sim 1,065 1,098
NPHS1 15 Sim 0,813 0,949
NPHS1 18 Sim 1,312 1,341
NPHS1 20 Sim 1,049 1,073
NPHS1 30 Sim 1,652 1,689
NPHS1 40 Sim 0,985 1,007
CondiçãoGene Média (interesse/GAPDH) Média Corrigida
55
Figura 10: Western Blot com maração de anticorpo para nefrina após exposição à
albumina. A: imagens dos resultados da revelação das membranas de Western Blot.
Visualiza-se as bandas correspondentes à proteina alvo nefrina, (180 kDa) e ao
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, controle endógeno (38 kDa); as concentrações de
albumina foram: 1:0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15
mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8: 20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL; B: Histograma representa
a expressão após quantificação das bandas. Os valores são média ± EP, n = 3. Sem
diferença estatística (teste ANOVA no software IBM SPSS Statistic).
56
Figura 11: Western Blot com marcação com anticorpo para nefrina após exposição
à PA e à albumina. A: imagens dos resultados da revelação das membranas de Western
Blot. Visualiza-se as bandas correspondentes à proteína alvo nefrina, (180 kDa) e ao
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), controle endógeno (38 kDa); as
concentrações de albumina foram: 1:0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5:
12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8: 20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL; B:
Histograma representa a expressão após quantificação das bandas. Os valores são média
± EP, n = 3. Sem diferença estatística (teste ANOVA no software IBM SPSS Statistic).
57
Figura 12: ICI com nefrina de podócitos diferenciados sem exposição à PA tratados com diferentes concentrações de albumina.
1: 0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8: 20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL;
Citoesqueleto marcado em vermelho (rodamina-faloidina). Nefrina marcada em verde (FITC); núcleo visto em azul (DAPI). Aumento de
400X.
58
Figura 13: ICI com nefrina de podócitos diferenciados com exposição à 15 g/mL de PA tratados com diferentes concentrações
de albumina. 1: 0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8: 20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10:
40 mg/mL; Citoesqueleto marcado em vermelho (rodamina-faloidina). Nefrina marcada em verde (FITC); núcleo visto em azul (DAPI).
Aumento de 400X.
59
6.2.2. Podocina e o gene NPHS2
Para todas as condições de albumina com e sem tratamento com PA não houve
produto detectado, mesmo havendo diversas tentativas com condições diferentes:
maior e menor concentração de cDNA, de primer, de ciclos na reação e de buffer.
Tabela 6: Expressão da proteína Podocina
Albumina PA
NPHS2 0 Não 0,782 1
NPHS2 3 Não 0,987 1,262
NPHS2 6 Não 1,079 1,380
NPHS2 9 Não 1,138 1,455
NPHS2 12 Não 0,93 1,189
NPHS2 15 Não 0,936 1,197
NPHS2 18 Não 1,056 1,350
NPHS2 20 Não 1,263 1,615
NPHS2 30 Não 0,873 1,116
NPHS2 40 Não 1,088 1,391
NPHS2 0 Sim 1,203 1
NPHS2 3 Sim 1,139 0,946799667
NPHS2 6 Sim 1,284 1,067331671
NPHS2 9 Sim 1,106 0,919368246
NPHS2 12 Sim 0,652 0,541978387
NPHS2 15 Sim ND ND
NPHS2 18 Sim ND ND
NPHS2 20 Sim ND ND
NPHS2 30 Sim ND ND
NPHS2 40 Sim ND ND
ND = nenhum produto detectado.
GeneCondição
Média (interesse/GAPDH) Média Corrigida
60
Figura 14: Western Blot com marcação com anticorpo para podocina após
exposição à albumina. A: imagens dos resultados da revelação das membranas de
Western Blot, identificando as bandas referentes à proteína de interesse, podocina, de 42
kDa e a proteína utilizada como controle endógeno, o gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase (GAPDH), de 38 kDa; as concentrações de albumina foram: 1: 0 mg/mL;
2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8: 20
mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL; B: Histograma representa a expressão após
quantificação das bandas. Os valores são média ± EP, n = 3. Sem diferença estatística
(teste ANOVA no software IBM SPSS Statistic).
61
Figura 15: Western Blot com marcação com anticorpo para podocina após
exposição à PA e a albumina. A: imagens dos resultados da revelação das
membranas de Western Blot, identificando as bandas referentes à proteína de
interesse podocina, de 42 kDa. e a proteína utilizada como controle endógeno, o
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), de 38 kDa; as concentrações de
albumina foram: 1: 0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; A
partir da concentração de 15 mg/mL não foi mais possível visualizar em gel e
quantificar a banda B: Imagem de membrana de Western Blot da condição de 20
mg/mL de albumina, representando as condições onde não houve possibilidade de
verificar a proteína de interesse, a seta em branco destaca as bandas do GAPDH; C:
Histograma representa a expressão após quantificação das bandas. Os valores são
média ± EP, n = 3. Sem diferença estatística (teste ANOVA no software IBM SPSS
Statistic).
62
Figura 16: ICI com podocina de podócitos diferenciados sem exposição à PA tratados com diferentes concentrações
de albumina. 1: 0 mg/mL 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8: 20 mg/mL; 9: 30
mg/mL; 10: 40 mg/mL; Citoesqueleto marcado em vermelho (rodamina-faloidina). Nefrina marcada em verde (FITC); núcleo
visto em azul (DAPI). Aumento de 400X.
63
Figura 17: ICI com podocina de podócitos diferenciados com exposição à 15 g/mL de PA tratados com diferentes
concentrações de albumina. 1: 0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8:
20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL; Citoesqueleto marcado em vermelho (rodamina-faloidina). Nefrina marcada em verde
(FITC); núcleo visto em azul (DAPI). Aumento de 400X.
64
Os resultados desse estudo apontaram que a expressão tanto da nefrina
como da podocina, em podócitos sem e com dano induzido por PA, não foram
influenciadas pela exposição a diferentes concentrações de albumina (figuras
10, 11, 14 e 15, respectivamente). É importante ressaltar que, no caso da
quantificação da expressão relativa do NPHS1 e do NPHS2 por PCR real-time,
não houve produto identificado, isso possivelmente pelo baixo nível de
expressão dessas proteínas em cultura in vitro como observado por Chittiprol, et
al; 2011 (94). Com relação às imagens de localização por ICI elas apresentaram
mesmo padrão, não demonstrando alteração de localização e nem de expressão
o que foi confirmado com os resultados de Western Blot, para os quais foi muito
difícil conseguir boas imagens devido à baixa expressão proteica.
Nefrinas de pedicelos adjacentes interagem entre si, e a podocina realiza
ancoragem da nefrina na membrana dos pedicelos, de forma que esta estrutura
atua na manutenção do citoesqueleto e na BFG formando o diafragma de fenda.
Como o diafragma de fenda não é formado na cultura de podócitos in vitro, que
é um modelo celular de duas dimensões, pode ser que o aumento de
concentração de albumina não tenha influência direta nessa interação. A nefrina
tem papel primordial na manutenção do contato entre as células e do
citoesqueleto, e devido a sua localização no diafragma de fenda, esta molécula
é exposta diretamente ao filtrado urinário sendo submetida a pressão da filtração
glomerular. Logo, o esperado seria que fosse afetada pela exposição ao insulto
da maior concentração de albumina no meio. Desta forma, devido à baixa
expressão dessas proteínas em cultura celular é possível que os resultados
sejam diferentes em experimentos de sobrecarga proteica em modelo in vivo.
65
6.3. Canal de Cálcio receptor potencial transitório C e o gene TRPC6.
Tabela 7: Expressão relativa do gene TRPC6.
Albumina mg/ml PA Gene MÉDIA 2ΔCT Média corrigida
0 Não TRPC6 0,74229 1
3 Não TRPC6 0,00236 * 0,003188 *
6 Não TRPC6 0,0025 * 0,00338 *
9 Não TRPC6 0,00117 * 0,00157 *
12 Não TRPC6 0,00095 * 0,00128 *
15 Não TRPC6 0,00068 * 0,00092 *
18 Não TRPC6 0,00107 * 0,00145 *
20 Não TRPC6 0,00126 * 0,0017 *
30 Não TRPC6 0,00078 * 0,00106 *
40 Não TRPC6 0,0002 * 0,00027 *
0 Sim TRPC6 0,000025 1
3 Sim TRPC6 0,000172 6,80847
6 Sim TRPC6 0,000093 3,70238
9 Sim TRPC6 0,000103 4,09959
12 Sim TRPC6 ND ND
15 Sim TRPC6 0,000081 3,21994
18 Sim TRPC6 0,000068 2,72406
20 Sim TRPC6 0,000088 3,4986
30 Sim TRPC6 0,000089 3,5563
40 Sim TRPC6 0,000281 * 11,1297 *
ND = nenhum produto específico detectado
* p < 0,05 - rejeição do H0
66
Figura 18: Avaliação da expressão relativa de TRPC6 (TRPC6/RPLP0) após
exposição à albumina. Os valores são média ± EP, n = 3. Nas condições
destacadas (*) foi observada diferença estatística (p<0,0001) (teste ANOVA no
software IBM SPSS Statistic).
67
Figura 19: Avaliação da expressão relativa de TRPC6 (TRPC6/RPLP0) após
exposição à PA e albumina. Os valores são média ± EP, n = 3. Apenas na condição
destacada (*) foi observada diferença estatística (p<0,0001) (teste ANOVA no
software IBM SPSS Statistic).
68
Tabela 8: Expressão do Canal de cálcio receptor potencial transitório C
Albumina PA
TRPC6 0 Não 0,931 1
TRPC6 3 Não 1,121 1,204
TRPC6 6 Não 1,334 1,433
TRPC6 9 Não ND ND
TRPC6 12 Não ND ND
TRPC6 15 Não ND ND
TRPC6 18 Não ND ND
TRPC6 20 Não ND ND
TRPC6 30 Não ND ND
TRPC6 40 Não ND ND
TRPC6 0 Sim 0,892 1
TRPC6 3 Sim 1,231 1,380
TRPC6 6 Sim 1,133 1,270
TRPC6 9 Sim 0,807 0,905
TRPC6 12 Sim 1,034 1,159
TRPC6 15 Sim 0,954 1,070
TRPC6 18 Sim 1,09 1,222
TRPC6 20 Sim 1,107 1,241
TRPC6 30 Sim 1,479 1,658
TRPC6 40 Sim 0,956 1,072
ND = nenhum produto detectado.
GeneCondição
Média (interesse/GAPDH) Média Corrigida
69
Figura 20: Western Blot com marcação com anticorpo para canal de cálcio
receptor de potencial transitório C após exposição à albumina. A: imagens
dos resultados da revelação das membranas de Western Blot, identificando as
bandas referentes à proteína de interesse canal de cálcio de 106 kDa e a
proteína utilizada como controle endógeno, o gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase (GAPDH), de 38 kDa; as concentrações de albumina
apresentadas aqui são: 1: 0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL. A partir da
concentração de 9 mg/mL não foi mais possível visualizar em gel e quantificar a
banda. B: Imagem de membrana de Western Blot ilustrando a condição de 12
mg/mL de albumina, uma das condições na qual não foi possível verificar a
proteína de interesse. A seta em branco destaca as bandas do GAPDH; C:
Histograma representa a expressão após quantificação das bandas. Os valores
são média ± EP, n = 3. Sem diferença estatística (teste ANOVA no software IBM
SPSS Statistic).
70
Figura 21: Western Blot com imunomarcação de cálcio receptor de
potencial transitório C após exposição à PA e à albumina. A: imagens dos
resultados da revelação das membranas de Western Blot, identificando as
bandas referentes à proteína de interesse canal de cálcio, de 106 kDa, e a
proteína utilizada como controle endógeno, a gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase (GAPDH), de 38 kDa; as concentrações de albumina foram: 1: 0
mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18
mg/mL; 8: 20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL; B: Histograma representa a
expressão após quantificação das bandas. Os valores são média ± EP, n = 3.
Sem diferença estatística (teste ANOVA no software IBM SPSS Statistic).
71
Figura 22: ICI com canal de cálcio receptor de potencial transitório C de podócitos diferenciados sem exposição à PA
tratados com diferentes concentrações de albumina. 1: 0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15
mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8: 20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL; Citoesqueleto marcado em vermelho (rodamina-faloidina).
Nefrina marcada em verde (FITC); núcleo visto em azul (DAPI). Aumento de 400X.
72
Figura 23: ICI com canal de cálcio receptor de potencial transitório C de podócitos diferenciados com exposição à 15
g/mL de PA tratados com diferentes concentrações de albumina. 1: 0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12
mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8: 20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL; Citoesqueleto marcado em vermelho (rodamina-
faloidina). Nefrina marcada em verde (FITC); núcleo visto em azul (DAPI). Aumento de 400X.
73
Quando as células foram expostas somente à PA, foi possível verificar
que a exposição a esta droga alterou a expressão do gene TRPC6 (tabela 7), o
que corrobora com o que foi demonstrado pelo estudo de Moller et al, 2007 (74).
Segundo este estudo existe uma relação positiva entre doenças renais não
genéticas e o aumento de expressão do TRPC6. Deste modo, a indução do dano
com PA parece ter seguido o mesmo padrão. Quando as células foram expostas
às diferentes concentrações de albumina, em células sem dano com PA houve
redução da taxa de transcrito em todas as condições avaliadas (Figura 18).
Curiosamente, quando expostas aos dois insultos, albumina e PA, foi observado
o oposto, houve aumento de expressão do gene TRPC6, principalmente na
maior dose de exposição à albumina, de 40 mg/mL (figura 19). Esta maior
expressão no grupo com dano pode ser explicada pelo fato de que o dano pode
estar causando o aumento do TRPC6, tal como acontece somente quando as
células são expostas somente à PA, se sobressaindo ao insulto da albumina que
é de diminuição da expressão.
A diminuição drástica da expressão relativa de TRPC6 no grupo de
podócitos sem dano, pode ser explicada, pelo fato de que o excesso de albumina
esteja afetando sua produção, reduzindo sua expressão. Ou ainda, seria um
mecanismo de defesa das células, que diminuem a produção desta proteína
exatamente com o objetivo de evitar o dano, uma vez que esse padrão de menor
expressão está associado à regressão, e portanto, prevenção de dano (95).
Na análise por Western Blot (tabela 8) é possível notar que na condição
sem exposição à PA (figura 20), a partir da condição de 9 mg/mL de albumina
não foi possível analisar as bandas correspondentes às proteínas de interesse,
logo pode-se supor que isso condiz com os resultados previamente encontrados
na análise de expressão relativa por PCR real-time. Já nas células que sofreram
dano pela exposição à PA (figura 21) não houve diferença estatística na
expressão do canal de cálcio receptor potencial transitório C, o que diverge dos
resultados obtidos por PCR real-time, uma vez que na condição de 40 mg/mL foi
encontrada diferença estatística de expressão do TRPC6. Existem duas
74
possibilidades para estes resultados discrepantes, ou não conseguimos precisão
no ensaio de Western Blot já que a expressão estava muito baixa, o que dificultou
a leitura das bandas pois havia muito background, o que pode ter impossibilitado
a análise precisa da expressão da proteína; ou há um aumento de expressão a
nível de mRNA mas este aumento não é suficiente para que haja diferença
significativa ao nível da proteína.
Com relação à localização da proteína canal de cálcio receptor potencial
transitório C nos podócitos, tanto sem PA (Figura 22) como com PA (figura 23)
observamos os mesmos padrões encontrados na expressão relativa por PCR
real-time: baixa marcação do TRPC6 no grupo sem PA e marcação semelhante
ao controle (0 mg/mL de albumina) no grupo com PA. No entanto, na condição
de 40 mg/mL de albumina, que mostrou alteração na análise por PCR real-time,
não apresentou diferença de localização, mas leve marcação elevada em
comparação ao controle.
O canal de cálcio receptor potencial transitório C realiza a regulação
mecânica do diafragma de fenda, existindo uma forte interação entre a
passagem de íons de Ca2+ e a modulação do citoesqueleto do podócito. Moller
et al, 2007 (74), verificaram exatamente esse mecanismo de modulação em
decorrência de maior expressão dessa proteína em podócitos com dano e
verificaram que existe reorganização do citoesqueleto. Foi demonstrado também
que drogas utilizadas no dia-a-dia do tratamento das doenças renais com
proteinúria, tais como inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA) e
bloqueadores de receptores de angiotensina, reduzem a expressão de TRPC6
em podócitos com dano e em animais modelos para doença renal. Desta forma,
aumento da atividade e/ou expressão de TRPC6 parece mediar dano aos
podócitos e aos glomérulos, ao passo que sua diminuição pode estar associada
com melhora da perda de proteínas e redução de dano. Além destas drogas mais
conhecidas, recentemente novas terapias antiproteinúria vêm surgido, entre elas
análogos da vitamina D. A vitamina D3 é convertida em 25-hidroxivitamina D3
pelo fígado e logo em seguida em 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25-D3) pelo
túbulo proximal do rim. A 1,25-D3 é definida classicamente como a forma ativa
da vitamina D e que possui um papel fundamental no metabolismo de Ca+2 e de
75
PO34. Foi demonstrado que, a deficiência da vitamina 1,25-D3 não é somente
uma consequência da doença renal, mas que o inverso pode acontecer: a
deficiência da vitamina 1,25-D3 pode causar doença renal. Desta forma, a
reposição com 1,25-D3 reduz proteinúria. Estudos futuros com sobrecarga
proteica em modelo animal serão fundamentais para confirmação deste padrão
de diminuição da expressão de TRPC6 após exposição de albumina. Isto pois
pode ser uma via similar a da vitamina 1,25-D3, na qual pode ser identificado
uma nova via potencial para o tratamento da proteinúria causada por danos no
TRPC6.
Chen et al, 2011 (96), avaliaram o efeito de altas concentrações de
albumina em podócitos saudáveis, apontando que essa condição aumenta a
entrada de íons de cálcio, por regulação positiva do TRPC6, bem como induziu
a expressão de GRP78 do retículo endoplasmático, ativando a caspase-12 e por
fim desencadeando um processo de apoptose. Em comparação com o que foi
encontrado, ao observarmos também aumento de TRPC6 após a exposição à
albumina podemos inferir que essa alteração aumenta o influxo de cálcio levando
a processos de reorganização celular bem como de possível apoptose,
agravando o quadro de dano presente nos podócitos, uma vez que o aumento
de expressão se deu apenas no grupo com dano por PA. Com relação a redução
de expressão desse gene foi descrito que sua inibição preveniu a ruptura do
citoesqueleto, logo, comparando com nossos resultados, podemos prever um
efeito preventivo de dano, ou de regressão no que diz respeito ao grupo que
apresentou diminuição de TRPC6. Este, sem dano, possivelmente reduziu a
expressão do gene como forma de evitar alterações no citoesqueleto.
Estudos anteriores a este focam em podócitos expostos a grandes
concentrações de albumina, em condições sem dano prévio, no entanto o que
demonstramos aqui é o efeito dessa exposição em células com dano prévio por
PA, apontando o TRPC6 não só como uma proteína pró-lesão, mas mostrando
que o dano podocitário se associou ao seu aumento.
Comparando nossos resultados com os de estudos com alterações
genéticas no TRPC6, observa-se ganho de função em pacientes com proteinúria
76
em decorrência de formas hereditárias de GESF, como no caso das famílias
estudas por Reiser et al, 2006 (72), que mostraram alteração tanto no influxo de
cálcio, por alterações estruturais e funcionais da proteína, possibilitando um
maior influxo de cálcio nesses casos, mesmo fenótipo proposto pelo resultado
encontrado pelo excesso de albumina em podócitos com dano.
6.4. Podocalixina e o gene PODXL
Tabela 9: Expressão relativa do gene PODXL
Albumina mg/ml PA Gene MÉDIA 2ΔCT Média corrigida
0 Não PODXL 0,00240955 1
3 Não PODXL 0,00318786 1,32664
6 Não PODXL 0,00266767 1,11016
9 Não PODXL 0,00257093 1,06993
12 Não PODXL 0,00279947 1,16501
15 Não PODXL 0,00249097 1,03663
18 Não PODXL 0,00499327 2,07792
20 Não PODXL 0,0431294 17,94848
30 Não PODXL 0,06068118 * 25,25273 *
40 Não PODXL 0,13008439 * 54,13517 *
0 Sim PODXL 0,00252961 1
3 Sim PODXL 0,03603757 14,24626
6 Sim PODXL 0,04038903 15,96647
9 Sim PODXL 0,07764583 30,69472
12 Sim PODXL ND ND
15 Sim PODXL 0,12615364 * 49,87069 *
18 Sim PODXL 0,140950120 * 55,71999 *
20 Sim PODXL 0,14470074 * 57,20267 *
30 Sim PODXL 0,16588945 * 65,57893 *
40 Sim PODXL 0,17235957 * 68,13668 *
ND = nenhum produto específico detectado
* p < 0,05 - rejeição do H0
77
Figura 24: Avaliação da expressão relativa de PODXL (PODXL/RPLP0) após
exposição à albumina. Os valores são média ± EP, n = 3. Nas condições
destacadas (*) foi observada diferença estatística (p<0,0001) (teste ANOVA no
software IBM SPSS Statistic).
78
Figura 25: Avaliação da expressão relativa de PODXL (PODXL/RPLP0) após
exposição à PA e albumina. Os valores são média ± EP, n = 3. Nas condições
destacadas (*) foi observada diferença estatística (p<0,0001) (teste ANOVA no
software IBM SPSS Statistic).
Tabela 10: Expressão da proteína podocalixina
Albumina PA
PODXL 0 Não 0,806 1
PODXL 3 Não 0,962 1,194
PODXL 6 Não 0,843 1,046
PODXL 9 Não 1,595 1,979
PODXL 12 Não 0,453 0,562
PODXL 15 Não 0,601 0,746
PODXL 18 Não 1,006 1,248
PODXL 20 Não 1,136 1,409
PODXL 30 Não 0,773 0,959
PODXL 40 Não 0,954 1,184
PODXL 0 Sim 1,027 1
PODXL 3 Sim 0,832 0,810
PODXL 6 Sim 1,305 1,271
PODXL 9 Sim 0,582 0,567
PODXL 12 Sim 0,73 0,711
PODXL 15 Sim 1,821 1,773
PODXL 18 Sim 1,566 1,525
PODXL 20 Sim 1,064 1,036
PODXL 30 Sim 0,954 0,929
PODXL 40 Sim 0,705 0,686
GeneCondição
Média (interesse/GAPDH) Média Corrigida
79
Figura 26: Western Blot com imunomarcação de podocalixina após exposição
à albumina. A: imagens dos resultados da revelação das membranas de Western
Blot, identificando as bandas referentes à proteína de interesse podocalixina de, 160
kDa e a proteína utilizada como controle endógeno, a gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase (GAPDH), de 38 kDa; as concentrações de albumina foram: 1: 0
mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18
mg/mL; 8: 20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL; B: Histograma representa a
expressão após quantificação das bandas. Os valores são média ± EP, n = 3. Sem
diferença estatística (teste ANOVA no software IBM SPSS Statistic).
80
Figura 27: Western Blot com imunomarcação de podocalixina após
exposição à PA e à albumina. A: imagens dos resultados da revelação das
membranas de Western Blot, identificando as bandas referentes à proteína de
interesse podocalixina, de 160 kDa, e a proteína utilizada como controle
endógeno a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), de 38 kDa; as
concentrações de albumina foram: 1: 0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9
mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8: 20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10:
40 mg/mL; B: Histograma representa a expressão após quantificação das
bandas. Os valores são média ± EP, n = 3. Sem diferença estatística (teste
ANOVA no software IBM SPSS Statistic).
81
Figura 28: ICI com podocalixina de podócitos diferenciados sem exposição à PA tratados com diferentes
concentrações de albumina. 1: 0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8:
20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL; Citoesqueleto marcado em vermelho (rodamina-faloidina). Nefrina marcada em verde
(FITC); núcleo visto em azul (DAPI). Aumento de 400X.
82
Figura 29: ICI com podocalixina de podócitos diferenciados com exposição à 15 g/mL de PA tratados com diferentes
concentrações de albumina. 1: 0 mg/mL; 2: 3 mg/mL; 3: 6 mg/mL; 4: 9 mg/mL; 5: 12 mg/mL; 6: 15 mg/mL; 7: 18 mg/mL; 8:
20 mg/mL; 9: 30 mg/mL; 10: 40 mg/mL; Citoesqueleto marcado em vermelho (rodamina-faloidina). Nefrina marcada em verde
(FITC); núcleo visto em azul (DAPI). Aumento de 400X.
83
Quando as células foram expostas somente à PA, foi possível verificar
que a exposição a esta droga não alterou a expressão do gene (tabela 4), o que
pode indicar que no dano renal por PA o PODXL pode não ser o primeiro alvo
afetado, pelo menos no que diz respeito a sua expressão. Quando as células
foram expostas à albumina sem dano prévio com PA, a partir de 20 mg/mL a
taxa de transcrito do gene PODXL começou a aumentar, no entanto apenas nas
condições de 30 e 40 mg/mL de albumina a expressão foi estatisticamente
significativa (Tabela 9 e Figura 24). Já no grupo de tratamento com PA o
aumento de expressão iniciou-se com concentrações menores de albumina,
sendo o PODXL mais expresso a partir da concentração de 15 mg/mL (Figura
25). Desta forma, tanto nas células sem dano como nas com dano, a
suplementação de albumina mostrou-se um fator na ativação da expressão da
podocalixina. Na análise por Western Blot (tabela 10), tanto para o grupo de
podócitos sem dano (figura 26) como no com dano (figura 27) não houve
alteração da expressão que fosse estatisticamente significante, o que pode ser
explicado pelos mesmos dois fatores propostos no caso da proteína do canal de
cálcio explicados no item anterior.
Com relação a ICI de localização dos podócitos sem PA (Figura 28) e
podócitos com PA (figura 29) observamos os mesmos padrões encontrados na
expressão relativa por PCR real-time, ou seja, aumento de expressão. Não foi
possível observar diferença na localização da proteína nas células, nem
diferença no padrão de sua distribuição no citoplasma.
É possível que a maior expressão de alguns genes esteja envolvida na
resposta adaptativa de podócitos após stress, sendo possíveis mecanismos para
escape de um insulto ou dano. Desta forma, uma vez que a podocalixina se
localiza na membrana dos podócitos, principalmente na região apical, e atua na
manutenção do espaçamento do diafragma de fenda e do citoesqueleto de
actina, o aumento de expressão poderia significar uma forma de defesa, na
tentativa de estabilizar o citoesqueleto de actina e manter as condições de
filtração (81).
84
Estudos têm mostrado uma relação positiva entre a superexpressão do
gene PODXL com um potencial invasivo e migratório, bem como a fenótipo de
tumor mais agressivo, provavelmente devido a metaloproteases de matriz e à
indução de ativação de proteínas quinase ativadas por mitógenos (MAPK)
(80,83,97). Já foi demonstrado que a podocalixina modula o citoesqueleto por
meio da via da MAPK (79), Deste modo, é fundamental que se faça futuramente
experimentos de sobrecarga proteica e dano molecular em modelo in vivo, pois
pode ser que haja uma relação de interação entre a suplementação proteica com
processos de invasão e migração celular, o que poderia indicar uma relação
desse tipo de dieta com o desenvolvimento de tumores renais.
85
7. CONCLUSÕES
Os resultados desse estudo indicaram que o insulto de suplementação
progressiva de albumina em podócitos sem e com dano com a droga PA não
influenciou na expressão dos genes NPHS1 e NPHS2, nem a nível de
transcrição, nem a nível de expressão proteica, bem como de sua localização
celular. Isto pode estar relacionado à baixa expressão destes genes em
podócitos in vitro.
Com relação ao TRPC6, o insulto da concentração progressiva de
albumina causou resultados opostos, já que no grupo sem dano houve redução
significativa da transcrição e da expressão proteica, e no grupo com dano houve
aumento da expressão, principalmente em doses maiores de exposição à
albumina. No caso do grupo com dano o aumento da expressão do TRPC6
resultante do excesso de albumina pode resultar em maior influxo de íons de Ca,
aumento de apoptose com consequente agravamento da lesão em indivíduos
com albuminúria.
No caso do PODXL, houve aumento significativo de sua expressão a nível
de RNA e proteína, maior expressão na visualização por ICI, mas não houve
diferença de localização celular, tanto nas condições com e sem dano induzido
por PA. O aumento de expressão de PODXL também pode indicar um
mecanismo de defesa dos podócitos na tentativa de manter a filtração
glomerular.
Sendo assim o presente estudo é um passo inicial para o entendimento
dos mecanismos moleculares associados aos danos fisiológicos decorrentes de
dieta hiperproteica e estudos in vivo são uma possibilidade para futura
compreensão de tais mecanismos, bem como de outros fatores que possam ser
analisados por conta das alterações moleculares nos podócitos.
86
8. LIMITAÇÕES DO ESTUDO.
As proteínas nefrina e podocina possuem baixa expressão em podócitos
in vitro, portanto a escolha dos genes NPHS1 e NPHS2 não foi a ideal para este
estudo. Além disto, por razões alheias a nossa vontade, não foi possível fazer
um tamanho amostral maior, o que poderia ter aumentado nossas chances de
obter resultados com êxito para estas proteínas com baixa expressão.
87
9. REFERÊNCIAS
1. Kim J-H, Xie J, Hwang K-H, Wu Y-L, Oliver N, Eom M, et al. Klotho May
Ameliorate Proteinuria by Targeting TRPC6 Channels in Podocytes. J Am
Soc Nephrol [Internet]. 2017;28(1):140–51. Available from:
http://www.jasn.org/lookup/doi/10.1681/ASN.2015080888
2. Food and Nutrition Board I of M. Macronutrient and Healthful Diets. In
Dietary Reference Intakes for Energy, Carbo- hydrate, Fiber, Fat, Fatty
Acids, Cholesterol, Protein, and Amino Acids (Macronutrients).
Washington, D.C.; 2005.
3. Mcmahon AP. Development of the Mammalian Kidney. 2016;1–29.
4. Marieb EN, Hoehn K. Human Anatomy & Physiology. 8th ed. 2010.
5. http://danielemalikoski.blogspot.com.br/2013/11/sistema-urinario.html.
6. McCance K, Huether S. Pathophysiology: the basis for disease in adults
and children. 6th ed. 2010. 1349 p.
7. Jaakko Patrakka. Nephrin - Role in human glomerulogenesis and
nephrotic disorders. University of Helsinki, Helsinki, Finland; 2001.
8. Ballermann BJ, Stan R V. Resolved: capillary endothelium is a major
contributor to the glomerular filtration barrier. J Am Soc Nephrol. 2007
Sep;18(9):2432–8.
9. Mundel P, Kriz W. Structure and function of podocytes: an update. Anat
Embryol (Berl). 1995 Nov;192(5):385–97.
10. Kerjaschki D. Caught flat-footed: podocyte damage and the molecular
bases of focal glomerulosclerosis. J Clin Invest. 2001 Dec;108(11):1583–
7.
11. George B, Holzman LB. Signaling from the podocyte intercellular junction
to the actin cytoskeleton. Semin Nephrol. 2012 Jul;32(4):307–18.
88
12. Joshi S, Andersen R, Jespersen B, Rittig S. Genetics of steroid-resistant
nephrotic syndrome: a review of mutation spectrum and suggested
approach for genetic testing. Acta Paediatr (Oslo, Norw ). 2013
Jun;102(9):549–56.
13. Greka A, Mundel P. Cell biology and pathology of podocytes. Annu Rev
Physiol. 2012 Jan;74:299–323.
14. Drenckhahn D, Franke RP. Ultrastructural organization of contractile and
cytoskeletal proteins in glomerular podocytes of chicken, rat, and man.
Lab Invest. 1988 Nov;59(5):673–82.
15. Sadowski CE, Lovric S, Ashraf S, Pabst WL, Gee HY, Kohl S, et al. A
Single-Gene Cause in 29.5% of Cases of Steroid-Resistant Nephrotic
Syndrome. J Am Soc Nephrol [Internet]. 2015;26(6):1279–89. Available
from: http://www.jasn.org/cgi/doi/10.1681/ASN.2014050489
16. Grahammer F, Schell C, Huber TB. The podocyte slit diaphragm—from a
thin grey line to a complex signalling hub. Nat Rev Nephrol. 2013
Sep;9(10):587–98.
17. Of C, Proteinuria N, Glomerular POF, Protein LOF. Causes of nephrotic
proteinuria. N Engl J Med. 1998;
18. Ruotsalainen V, Ljungberg P, Wartiovaara J, Lenkkeri U, Kestila M,
Jalanko H, et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of
glomerular podocytes. Proc Natl Acad Sci [Internet]. 1999;96(14):7962–7.
Available from: http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.96.14.7962
19. Shankland SJ. The podocyte’s response to injury: Role in proteinuria and
glomerulosclerosis. Kidney Int [Internet]. 2006;69(12):2131–47. Available
from: http://dx.doi.org/10.1038/sj.ki.5000410
20. Kaplan JM, Kim SH, North KN, Rennke H, Correia L a, Tong HQ, et al.
Mutations in ACTN4, encoding alpha-actinin-4, cause familial focal
segmental glomerulosclerosis. Nat Genet. 2000;24(3):251–6.
89
21. Ross MJ, Klotman PE. Recent progress in HIV-associated nephropathy. J
Am Soc Nephrol. 2002;13(12):2997–3004.
22. Pagtalunan ME, Miller PL, Jumping-Eagle S, Nelson RG, Myers BD,
Rennke HG, et al. Podocyte loss and progressive glomerular injury in type
II diabetes. J Clin Invest. 1997 Jan;99(2):342–8.
23. Durvasula R V., Petermann AT, Hiromura K, Blonski M, Pippin J, Mundel
P, et al. Activation of a local tissue angiotensin system in podocytes by
mechanical strain. Kidney Int. 2004;65(1):30–9.
24. Brenner BM, Meyer TW, Hostetter TH. Dietary protein intake and the
progressive nature of kidney disease: the role of hemodynamically
mediated glomerular injury in the pathogenesis of progressive glomerular
sclerosis in aging, renal ablation, and intrinsic renal disease. N Engl J
Med. 1982 Sep;307(11):652–9.
25. Francisco S, Hay H, Foundation W, Doctoral P, Fellow R. (From the
Department of Pathology, University of California School of Medicine, San
Francisco, and the Pediatric Research Laboratories of the Variety Club
Heart Hospital, University of Minnesota). Lupus. 1957;(34).
26. Drumond MC, Kristal B, Myers BD, Deen WM. Structural basis for
reduced glomerular filtration capacity in nephrotic humans. J Clin Invest.
1994;94(3):1187–95.
27. Okamura K, Dummer P, Kopp J, Qiu L, Levi M, Faubel S, et al.
Endocytosis of Albumin by Podocytes Elicits an Inflammatory Response
and Induces Apoptotic Cell Death. PLoS One. 2013;8(1).
28. Of OJOS, Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) CKD
Work Group. KDIGO 2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation
and Management of Chronic Kidney Disease. Kidney Int Suppl [Internet].
2013;3(1):4–4. Available from:
http://www.kdigo.org/clinical_practice_guidelines/pdf/CKD/KDIGO CKD-
90
MBD GL KI Suppl
113.pdf%5Cnhttp://www.nature.com/doifinder/10.1038/kisup.2012.73%5C
nhttp://www.nature.com/doifinder/10.1038/kisup.2012.76
29. Ilatovskaya D V., Levchenko V, Lowing A, Shuyskiy LS, Palygin O,
Staruschenko A. Podocyte injury in diabetic nephropathy: implications of
angiotensin II – dependent activation of TRPC channels. Sci Rep. 2015
Dec;5:17637.
30. Cui F, Gao Y, Zhao W, Zou D, Zhu Z, Wu X, et al. Effect of Tongxinluo on
Podocyte Apoptosis via Inhibition of Oxidative Stress and P38 Pathway in
Diabetic Rats. Evidence-Based Complement Altern Med. 2016;2016:1–
10.
31. Jha V, Garcia-Garcia G, Iseki K, Li Z, Naicker S, Plattner B, et al. Chronic
kidney disease: Global dimension and perspectives. Lancet [Internet].
2013;382(9888):260–72. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0140-
6736(13)60687-X
32. Tarver-Carr ME, Powe NR, Eberhardt MS, Laveist TA, Kington RS,
Coresh J, et al. Excess risk of chronic kidney disease among African-
American versus white subjects in the United States: A population-based
study of potential explanatory factors. J Am Soc Nephrol.
2002;13(9):2363–70.
33. Zhou BF, Wu XG, Tao SQ, Yang J, Cao TX, Zheng RP, Tian XZ, Lu CQ,
Miao HY, Ye FM et al. Dietary patterns in 10 groups and the relationship
with blood pressure. Collaborative Study Group for Cardiovascular
Diseases and Their Risk Factors. Chin Med J (Engl). 1989;102.
34. He J1, Klag MJ, Whelton PK, Chen JY, Qian MC HG. Dietary
macronutrients and blood pressure in southwestern China. J Hypertens
[Internet]. 1995;13(11):1267–74. Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8984124
91
35. Teunissen-Beekman KFM, Dopheide J, Geleijnse JM, Bakker SJL, Brink
EJ, De Leeuw PW, et al. Differential effects of proteins and carbohydrates
on postprandial blood pressure-related responses. Br J Nutr.
2014;112(4):600–8.
36. DIETARY REFERENCE INTAKES FOR Energy, Carbohydrate, Fiber,
Fat, Fatty Acids, Cholesterol, Protein, and Amino Acids. Available from:
http://nationalacademies.org/HMD/Activities/Nutrition/SummaryDRIs/DRI-
Tables.aspx
37. Energy and protein requirements. Report of a joint FAO/WHO/UNU
Expert Consultation. World Health Organ Tech Rep Ser. 1985 Jan;724:1–
206.
38. Lemon PW. Is increased dietary protein necessary or beneficial for
individuals with a physically active lifestyle? Nutr Rev. 1996 Apr;54(4 Pt
2):S169-75.
39. Phillips SM. Protein requirements and supplementation in strength sports.
Nutrition. Jan;20(7–8):689–95.
40. Phillips SM, van Loon LJC. Dietary protein for athletes: From
requirements to optimum adaptation. J Sports Sci. 2011;29(SUPPL. 1).
41. Alves C, Lima RVB. Dietary supplement use by adolescents. J Pediatr
(Rio J). 2009 Jul;85(4):287–94.
42. Luscombe ND, Clifton PM, Noakes M, Farnsworth E, Wittert G. Effect of a
high-protein, energy-restricted diet on weight loss and energy expenditure
after weight stabilization in hyperinsulinemic subjects. Int J Obes Relat
Metab Disord. 2003 May;27(5):582–90.
43. Brinkworth GD, Noakes M, Keogh JB, Luscombe ND, Wittert GA, Clifton
PM. Long-term effects of a high-protein, low-carbohydrate diet on weight
control and cardiovascular risk markers in obese hyperinsulinemic
subjects. Int J Obes Relat Metab Disord. 2004 May;28(5):661–70.
92
44. Martin WF, Armstrong LE, Rodriguez NR. Dietary protein intake and renal
function. Nutr Metab (Lond). 2005 Sep;2:25.
45. Anderson S, Brenner BM. The aging kidney: structure, function,
mechanisms, and therapeutic implications. J Am Geriatr Soc. 1987
Jun;35(6):590–3.
46. Wakefield AP, House JD, Ogborn MR, Weiler HA, Aukema HM. A diet
with 35 % of energy from protein leads to kidney damage in female
Sprague–Dawley rats. Br J Nutr. 2011 Sep;106(05):656–63.
47. Fouque D, Mitch WE. Low-protein diets in chronic kidney disease: are we
finally reaching a consensus? Nephrol Dial Transplant. 2015 Jan;30(1):6–
8.
48. Nutrition Recommendations and Interventions for Diabetes: A position
statement of the American Diabetes Association. Diabetes Care. 2008
Jan;31(Supplement 1):S61–78.
49. Piccoli G, Ventrella F, Capizzi I, Vigotti F, Mongilardi E, Grassi G, et al.
Low-Protein Diets in Diabetic Chronic Kidney Disease (CKD) Patients:
Are They Feasible and Worth the Effort? Nutrients. 2016 Oct;8(10):649.
50. Pavenstadt H, Kriz W, Kretzler M. Cell Biology of the Glomerular
Podocyte. Physiol Rev [Internet]. 2003;83(1):253–307. Available from:
http://physrev.physiology.org/cgi/doi/10.1152/physrev.00020.2002
51. Lenkkeri U, Ma M, Lamerdin J, Mccready P, Putaala H, Ruotsalainen V,
et al. Positionally Cloned Gene for a Novel Glomerular Protein — Nephrin
— Is Mutated in Congenital Nephrotic Syndrome. 1998;1:575–82.
52. Chothia C, Jones EY. The Molecular Structure of Cell Adhesion
Molecules. Annu Rev Biochem. 1997;66:823–62.
53. Tryggvason K. Unraveling the Mechanisms of Glomerular Ultrafiltration :
Nephrin , a Key Component of the Slit Diaphragm. 1999;2440–5.
93
54. Rodewald R. POROUS SUBSTRUCTURE OF THE GLOMERULAR SLIT
DIAPHRAGM IN THE RAT AND MOUSE. 1974;60(4):423–33.
55. Lehtonen S, Zhao F, Lehtonen E. CD2-associated protein directly
interacts with the actin cytoskeleton. Am J Physiol Renal Physiol
[Internet]. 2002;283(4):F734-43. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12217865
56. Shi NY, Li J, Cotran R, Mundel P, Miner JH, Shaw AS. CD2AP localizes
to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.
Am J Pathol. 2001;159(6):2303–8.
57. Benzing T. Signaling at the slit diaphragm. J Am Soc Nephrol.
2004;15(6):1382–91.
58. Lahdenperä J, Kilpeläinen P, Liu XL, Pikkarainen T, Reponen P,
Ruotsalainen V, et al. Clustering-induced tyrosine phosphorylation of
nephrin by Src family kinases. Kidney Int. 2003;64(2):404–13.
59. Qin X-S, Tsukaguchi H, Shono A, Yamamoto A, Kurihara H, Doi T.
Phosphorylation of Nephrin Triggers Its Internalization by Raft-Mediated
Endocytosis. J Am Soc Nephrol [Internet]. 2009;20(12):2534–45.
Available from: http://www.jasn.org/cgi/doi/10.1681/ASN.2009010011
60. New LA, Chahi AK, Jones N. Direct regulation of nephrin tyrosine
phosphorylation by Nck adaptor proteins. J Biol Chem.
2013;288(3):1500–10.
61. Kreidberg JA. Podocyte differentiation and glomerulogenesis. J Am Soc
Nephrol. 2003;14(3):806–14.
62. Putaala H1, Soininen R, Kilpeläinen P, Wartiovaara J TK. The murine
nephrin gene is specifically expressed in kidney, brain and pancreas:
inactivation of the gene leads to massive proteinuria and neonatal death.
Hum Mol Genet. 2001;
94
63. Snyers L, Umlauf E, Prohaska R. Oligomeric Nature of the Integral
Membrane Protein Stomatin *. 1998;273(27):17221–6.
64. Relle M, Cash H, Brochhausen C, Strand D, Menke J, Galle PR, et al.
New perspectives on the renal slit diaphragm protein podocin. Mod Pathol
[Internet]. 2011;24(8):1101–10. Available from:
http://dx.doi.org/10.1038/modpathol.2011.58
65. Boute N, Gribouval O, Roselli S, Benessy F, Lee H, Fuchshuber a, et al.
NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in
autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nat Genet.
2000;24(4):349–54.
66. Huber TB, Köttgen M, Schilling B, Walz G, Benzing T. Interaction with
Podocin Facilitates Nephrin Signaling. J Biol Chem. 2001;276(45):41543–
6.
67. Salzer U, Ahorn H, Prohaska R. Identification of the phosphorylation site
on human erythrocyte band 7 integral membrane protein : implications for
a monotopic protein structure. 1993;1151:149–52.
68. Völker LA, Schurek EM, Rinschen MM, Tax J, Schutte BA, Lamkemeyer
T, et al. Characterization of a short isoform of the kidney protein podocin
in human kidney. BMC Nephrol. 2013;14(1):1–8.
69. T. HTB · SB · B. Podocin Organizes Ion Channel-Lipid Supercomplexes:
Implications for Mechanosensation at the Slit Diaphragm. Nephron Exp
Nephrol. 2007;
70. Huber TB, Schermer B, Müller RU, Höhne M, Bartram M, Calixto A, et al.
Podocin and MEC-2 bind cholesterol to regulate the activity of associated
ion channels. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2006;103(46):17079–
86. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1859892&tool=
pmcentrez&rendertype=abstract
95
71. Montell C. The TRP superfamily of cation channels. Sci STKE [Internet].
2005; Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15728426/
72. Reiser J, Polu KR, Möller CC, Kenlan P, Altintas MM, Wei C, et al.
TRPC6 is a glomerular slit diaphragm-associated channel Required for
Normal Renal Function. 2006;37(7):739–44.
73. Li Y1, Jia YC, Cui K, Li N, Zheng ZY, Wang YZ YX. Essential role of
TRPC channels in the guidance of nerve growth cones by brain-derived
neurotrophic factor. Nature. 2005;
74. Moller CC, Wei C, Altintas MM, Li J, Greka A, Ohse T, et al. Induction of
TRPC6 Channel in Acquired Forms of Proteinuric Kidney Disease. J Am
Soc Nephrol [Internet]. 2007;18(1):29–36. Available from:
http://www.jasn.org/cgi/doi/10.1681/ASN.2006091010
75. Spires D, Ilatovskaya D V, Levchenko V, North PE, Geurts AM, Palygin
O, et al. The protective role of Trpc6 knockout in the progression of
diabetic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol [Internet].
2018;(414). Available from:
http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29923767
76. Wu Y-L, Xie J, An S-W, Oliver N, Barrezueta NX, Lin M-H, et al. Inhibition
of TRPC6 channels ameliorates renal fibrosis and contributes to renal
protection by soluble klotho Yueh-Lin. Kidney Int [Internet].
2018;91(4):830–41. Available from:
http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29923767
77. Kerjaschki D, Sharkey DJ, Farquhar MG. Identification and
characterization of podocalyxin--the major sialoprotein of the renal
glomerular epithelial cell. J Cell Biol [Internet]. 1984;98(4):1591–6.
Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2113206&tool=
pmcentrez&rendertype=abstract
96
78. Takeda T, Go WY, Orlando RA, Farquhar MG. Expression of podocalyxin
inhibits cell-cell adhesion and modifies junctional properties in Madin-
Darby canine kidney cells. Mol Biol Cell [Internet]. 2000;11(9):3219–32.
Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=14987&tool=p
mcentrez&rendertype=abstract
79. Schmieder S, Nagai M, Orlando RA, Takeda T, Farquhar MG.
Podocalyxin activates RhoA and induces actin reorganization through
NHERF1 and Ezrin in MDCK cells. J Am Soc Nephrol. 2004;15(9):2289–
98.
80. Sizemore S, Cicek M, Sizemore N, Kwok PN, Casey G. Podocalyxin
increases the aggressive phenotype of breast and prostate cancer cells in
vitro through its interaction with ezrin. Cancer Res. 2007;67(13):6183–91.
81. Koop K, Eikmans M, Baelde HJ, Kawachi H, De Heer E, Paul LC, et al.
Expression of podocyte-associated molecules in acquired human kidney
diseases. J Am Soc Nephrol. 2003;14(8):2063–71.
82. Casey G, Neville PJ, Liu X, Plummer SJ, Cicek MS, Krumroy LM, et al.
Podocalyxin variants and risk of prostate cancer and tumor
aggressiveness. Hum Mol Genet. 2006;15(5):735–41.
83. Kelley TW, Huntsman D, McNagny KM, Roskelley CD, Hsix ED.
Podocalyxin. Am J Clin Pathol [Internet]. 2005;124(1):134–42. Available
from: https://academic.oup.com/ajcp/article-
lookup/doi/10.1309/7BHLAHHU0N4MHT7Q
84. Yasuoka H, Tsujimoto M, Hirokawa M, Tori M, Nakahara M, Miyauchi A,
et al. Podocalyxin expression in undifferentiated thyroid carcinomas. J
Clin Pathol. 2008;61(11):1228–9.
85. Barua M, Shieh E, Schlondorff J, Genovese G, Kaplan BS, Pollak MR.
Exome sequencing and in vitro studies identified podocalyxin as a
97
candidate gene for focal and segmental glomerulosclerosis. Kidney Int.
2014;85(1):124–33.
86. Lentine K, Wrone EM. New insights into protein intake and progression of
renal disease. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2004 May;13(3):333–6.
87. Kozera B, Rapacz M. Reference genes in real-time PCR. J Appl Genet.
2013;54(4):391–406.
88. Eisenberg E, Levanon EY. Corrigendum to : Human housekeeping genes
,. Trends Genet [Internet]. 2013;30(3):119–20. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.tig.2014.02.001
89. Nakayama T, Okada N, Yoshikawa M, Asaka D, Kuboki A, Kojima H, et
al. Assessment of suitable reference genes for RT–qPCR studies in
chronic rhinosinusitis. Sci Rep [Internet]. 2018;8(1):1568. Available from:
http://www.nature.com/articles/s41598-018-19834-9
90. Mundel P, Heid HW, Mundel TM, Krüger M, Reiser J, Kriz W.
Synaptopodin: An actin-associated protein in telencephalic dendrites and
renal podocytes. J Cell Biol. 1997;139(1):193–204.
91. Saleem MA, O’Hare MJ, Reiser J, Coward RJ, Inward CD, Farren T, et al.
A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating
nephrin and podocin expression. J Am Soc Nephrol [Internet].
2002;13(3):630–8. Available from:
http://jasn.asnjournals.org/content/13/3/630.abstract
92. Rigothier C, Saleem MA, Bourget C, Mathieson PW, Combe C, Welsh GI.
Nuclear translocation of IQGAP1 protein upon exposure to puromycin
aminonucleoside in cultured human podocytes: ERK pathway
involvement. Cell Signal. 2016;28(10):1470–8.
93. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature. 1970;15:680–5.
98
94. Chittiprol S, Chen P, Petrovic-djergovic D, Eichler T, Ransom RF. Marker
expression , behaviors , and responses vary in different lines of
conditionally immortalized cultured podocytes. 2018;660–71.
95. Sonneveld R, Ferrè S, Hoenderop JGJ, Dijkman HB, Berden JHM,
Bindels RJM, et al. Vitamin D down-regulates TRPC6 expression in
podocyte injury and proteinuric glomerular disease. Am J Pathol
[Internet]. 2013;182(4):1196–204. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.ajpath.2012.12.011
96. Chen S, He FF, Wang H, Fang Z, Shao N, Tian XJ, et al. Calcium entry
via TRPC6 mediates albumin overload-induced endoplasmic reticulum
stress and apoptosis in podocytes. Cell Calcium. 2011;50(6):523–9.
97. Koshikawa M. Role of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Activation in
Podocyte Injury and Proteinuria in Experimental Nephrotic Syndrome. J
Am Soc Nephrol [Internet]. 2005;16(9):2690–701. Available from:
http://www.jasn.org/cgi/doi/10.1681/ASN.2004121084
98. Jing B, Christopher DP, Krendel M. Visualization of cytoskeletal dynamics
in podocytes using adenoviral vectors. North [Internet].
2008;29(10):1883–9. Available from:
https://academic.oup.com/ajcp/article-
lookup/doi/10.1309/7BHLAHHU0N4MHT7Q
99. Kaplan B, Drummond K. Effects of aminonucleoside, daunomycin, and
adriamycin on carbon oxidation by glomeruli. J Tech methods Pathol.
1976;34(2):174–8.
100. Liu S, Ding J, Fan Q, Zhang H. The activation of extracellular signal-
regulated kinase is responsible for podocyte injury. Mol Biol Rep.
2010;37(5):2477–84.
101. Rigothier C, Auguste P, Welsh GI, Lepreux S, Deminière C, Mathieson
PW, et al. IQGAP1 interacts with components of the slit diaphragm
99
complex in podocytes and is involved in podocyte migration and
permeability in vitro. PLoS One. 2012;7(5).
102. Delezay O, He Z, Hodin S, Saleem MA, Mismetti P, Perek N, et al.
Glomerular filtration drug injury: In vitro evaluation of functional and
morphological podocyte perturbations. Exp Cell Res. 2017;361(2):300–7.
103. Itakura E, Mizushima N. p62 targeting to the autophagosome formation
site requires self-oligomerization but not LC3 binding. J Cell Biol.
2011;192(1):17–27.
104. Jorge M, Maria T. D-M. p62 at the Crossroads of Autophagy, Apoptosis,
and Cancer Jorge. Cell. 2009;137(6):1001–4.
105. Glick D, Barth S, Macleod KF. Autophagy : cellular and molecular
mechanisms. J Pathol. 2010;221(1):3–12.
106. Murrow L, Debnath J. Autophagy As A Stress Response And Quality
Control Mechanism—Implications for Cell Injury and Human Disease.
Annu Rev Pathol [Internet]. 2013;(2):105–37. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3971121/
100
10. ANEXOS
10.1. Anexo I: Termo comitê de ética
101
102
103
104
105
106
10.2. Anexo II: protocolo das soluções
BIS – ACRILAMIDA 1: 29
MEIO DE CONGELAMENTO
PBS 1X
PONCEAU S
SOLUÇÃO DE BLOQUEIO E PERMEABILIZAÇÃO DAS
CÉLULAS
1 g Bis - acrilamida
29 g acrilamida
100 ml H2O
Manter em frasco escuro
FBS 10%
DMSO 10%
Suspenção de células com RPMI 1640 0,8 ml
Para cada tubo criogênico com 1 ml
NaCl 8 g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,44 g
KH2PO4 0,24 g
*autoclavar
Para preparar 1 L
Completar com H2O
Ponceau S 1 g
Ácido acético 50 mL
Armazenar a 4°C
Para preparar 1 L
Completar com H2O
107
SOLUÇÃO PARA DILUIÇÃO DE ANTICORPO PARA ICI
TAMPÃO AMOSTRA 2X (LAEMMILI)
TAMPÃO DE CORRIDA SDS – PAGE 10X
TAMPÃO DE TRANSFERÊNCIA pH 8,3
TBS – T
TBS-T + 3% BSA
BSA 3%
Triton 0,06%
Armazenar a 4°C
Para preperar 100 mL
Completar com PBS 1X
BSA 1%
Completar com PBS 1X
Para preparar 50 mL
250 mM Tris - Base pH 8,8
2,5 M Glicina
1% SDS
Para preparo de 1 L
Completar com H2O
48mM Tris - Base pH 8,8
39mM Glicina
0,037% SDS
20% Metanol
Para preparo de 1 L
Completar com H2O
1 ml tween - 20
5 ml Tris - HCl pH 7,5 (1M)
30 ml NaCl (5M)
Para preparo de 1 L
Completar com H2O
108
TBS – T + 6% BSA
TRIS – HCl pH 6,8 1M
TRIS – HCl pH 8,8 1,5M
TRIS – HCL pH7,5 1M
TRIS – HCl pH8,8 1M
6 g BSA
1 ml Tris - HCl pH 7,5 (1M)
200 µl tween - 20
6 ml NaCl (5M)
Completar com H2O
para preparar 200ml
12 g BSA
1 ml Tris - HCl pH 7,5 (1M)
200 µl tween - 20
6 ml NaCl (5M)
Completar com H2O
para preparar 200ml
Tris ultra puro 12,14 g
*autoclavar
Para preparar 100 mL
Completar com H2O
Acertar o pH com HCl
Tris ultra puro 18,171 g
*autoclavar
Para preparar 100 mL
Completar com H2O
Acertar o pH com HCl
Tris ultra puro 12,14 g
*autoclavar
Para preparar 100 mL
Completar com H2O
Acertar o pH com HCl
109
Tris ultra puro 60,555 g
*autoclavar
Para preparar 500 mL
Completar com H2O
Acertar o pH com HCl
110
10. 3 Anexo III – Resultados e discussão protocolos de padronização
1. Confirmação diferenciação dos podócitos por imunocitoquímica indireta
(ICI)
Após experimentos de ICI somente os podócitos diferenciados,
expressaram as proteínas citoplasmáticas que são marcadores de diferenciação
de podócitos: nefrina, podocina e sinaptopodina (figuras 1 a 4, respectivamente),
viabilizando o seu uso nos experimentos com os podócitos (91).
Figura 1: Comparação de podócitos indiferenciados e diferenciado. As
imagens são representativas de podócitos indiferenciados (A) e diferenciados
(B). A: nesta figura o citoplasma está reduzido, o que indica células proliferativas
indiferenciadas; seta branca mostra uma célula em divisão; não há expressão de
nefrina; B: citoplasma mais proeminente com células diferenciadas exibindo
extensões mais longas; observa-se no citoplasma nefrina em verde, marcada
com anticorpo conjugado com FITC-green. Em A e B visualiza-se o citoesqueleto
corado em vermelho, marcado com rodamina-faloidina e, em azul, coloração
nuclear com DAPI. (Ampliação de 400x).
111
Figura 2: Comparação de células indiferenciadas (A) e diferenciadas (B) marcadas com ICI para nefrina; 1 – Células
sem fluorescência; 2 - marcação nefrina no citoplasma, visualizada com FITC (em verde); 3 – Marcação do núcleo celular com
DAPI (em azul); 4 – sobreposição das imagens 1,2 e 3 de cada uma das condições (visualizando em verde o citoplasma e em
azul o núcleo) (Aumento de 20x).
112
Figura 3: Comparação de células indiferenciadas (A) e diferenciadas (B) marcadas com ICI para podocina. 1 – Células
sem fluorescência; 2 - marcação nefrina no citoplasma, visualizada com FITC (em verde); 3 – Marcação do núcleo celular com
DAPI (em azul); 4 – sobreposição das imagens 1,2 e 3 de cada uma das condições (visualizando em verde o citoplasma e em
azul o núcleo). (Aumento de 10x).
113
Figura 4: Comparação de células indiferenciadas (A) e diferenciadas (B) marcadas com ICI para sinaptopodina; 1 –
Células sem florescência; 2 - marcação sinaptopodina no citoplasma, visualizada com FITC (em verde); 3 – marcação do núcleo
celular com DAPI (em azul); 4 – sobreposição das imagens 1,2 e 3 de cada uma das condições (visualizando em verde o
citoplasma e em azul o núcleo) (Aumento de 20x).
114
2. Viabilidade celular por ensaios de Calceína AM e MTT
De acordo com o que foi estabelecido no item 5.3.2 dos métodos, foram
avaliados (a): por quanto tempo pelo menos 50% das células suportam uma dose
inicial de suplementação de albumina no meio de cultura e (b): qual a maior
concentração de albumina na qual as células permanecem viáveis pelo tempo
máximo estabelecido em (a).
2.1. Teste de tempo de exposição (a)
O tempo de exposição à albumina foi escolhido expondo-se os podócitos
a uma condição inicial de albumina e observando-se o tempo máximo em que
pelo menos 50% de células permanecessem viáveis (5 e tabela 1 do anexo 3)
Figura 5: Ensaio de MTT para determinar o tempo de exposição à albumina.
Podócitos diferenciados tratados com 12 mg/mL de albumina em diferentes
tempos de exposição. Leitura ELISA 430 nm.
A partir da leitura em equipamento de ELISA com comprimento de onda
de 430 nm, foi obtida uma tabela de absorbância para as triplicatas realizadas.
Tabela 1: Absorbância do ensaio de MTT com 12mg/mL de albumina nos
diferentes tempos de exposição
24h 12h 6h 3h 0
0,192 0,217 0,237 0,343 0,337
0,229 0,205 0,306 0,383 0,367
0,211 0,276 0,304 0,324 0,23
Absorbância 430nm - tempo de exposição
115
Do mesmo modo, foi realizado o experimento de calceína-AM e as células
viáveis (figura 6) foram contadas com o auxílio do programa ImageJ, resultando
na tabela 2 do anexo.
Figura 6: Marcação de podócitos viáveis com calceína em diferentes
tempos de exposição a 12mg/mL de albumina. A (1-3): sem exposição, B (1-
3) 3h de exposição, C (1-3) 6h de exposição, D (1-3) 12h de exposição, E (1-3)
24h de exposição. (leitura GFP – 488 nm).
116
Tabela 2: Contagem de células viáveis com ensaio de calceína-AM com
diferentes tempos de exposição à albumina com concentração de 12mg/ml.
Deste modo com os dados obtidos foi possível analisar a viabilidade
celular e determinar qual o tempo de exposição à albumina que atenderia o
critério pré-estabelecido para o cultivo celular (Figura 7).
117
Figura 7: Análise de viabilidade dos podócitos frente a diferentes tempos
de exposição a 12 mg/ml de albumina. A: Gráfico de viabilidade após
experimento com MTT; B: gráfico de viabilidade após experimento com
Calceína-AM
118
Diante das análises o tempo máximo de 24 horas apresentou cerca de
50% das células ainda viáveis, em ambos os ensaios, tanto em triplicata quanto
em análise de duplicata. Portanto, esse tempo de 24 horas foi utilizado nos
experimentos de exposição às diferentes concentrações de albumina.
2.2. Teste de concentração de albumina (b)
Uma vez estabelecido o tempo de 24 horas quando expostos à 12 mg/mL
de albumina, decidiu-se expor os podócitos a concentrações mais elevadas do
que o valor já testado.
Figura 8: Ensaio de MTT para determinação de viabilidade celular diante
das maiores concentrações de albumina. Podócitos diferenciados tratados
com diferentes concentrações de albumina (0, 18, 20, 30, 40 mg/mL) em 24
horas de exposição. Leitura em placa ELISA no comprimento de onda de 430
nm.
A partir da leitura em equipamento de ELISA com comprimento de onda
de 430 nm, foi obtida uma tabela de absorbância para as triplicatas realizadas.
Tabela 4: Absorbância do ensaio de MTT. 24 horas de exposição a
diferentes concentrações de albumina.
0 18 20 30 40
0,045 0,046 0,055 0,057 0,059
0,047 0,061 0,069 0,06 0,064
0,052 0,06 0,058 0,078 0,082
Absorbância 430nm - MTT para [albumina]
119
Figura 9: Marcação de podócitos viáveis com calceína-AM em diferentes
concentrações de albumina, com 24h de exposição. A (1-3): 0, B (1-3) 18
mg/mL, C (1-3) 20 mg/mL, D (1-3) 30 mg/mL, E (1-3) 40 mg/mL. (leitura GFP
488nm).
120
Tabela 5: Contagem de células viáveis com ensaio de calceína AM com 24 h de
exposição a diferentes concentrações (0, 18, 20, 30 e 40 mg/mL) de albumina.
121
Figura 10: Análise de viabilidade dos podócitos frente à exposição a
diferentes concentrações de albumina (0, 18, 20, 30 e 40 mg/mL) por 24
horas. A: Gráfico de viabilidade analisada por MTT; B: gráfico de viabilidade
analisada por Calceína-AM.
122
Observou-se que as concentrações testadas apresentaram viabilidade
percentualmente semelhantes ao controle (grupo sem albumina).
Com relação a viabilidade dos podócitos frente à exposição de albumina,
ambos os ensaios utilizam a atividade metabólica de células viáveis para
determinar se o componente externo, seja ele algum reagente ou tempo de
exposição a ele interferem na atividade e, portanto, na viabilidade das células.
Com relação ao ensaio de calceína-AM, este identifica as células viáveis uma
vez que estas transportam a calceína via membrana realizando endocitose,
desse modo o radical acetoximetil é removido pelas esterases intracelulares e a
molécula liga-se ao cálcio no interior celular, emitindo fluorescência visível no
espectro verde. Como as células inviáveis e mortas não tem essa capacidade de
atividade das esterases elas não são marcadas (98). Já com relação ao ensaio
de MTT, as células viáveis fazem endocitose do MTT e ele é acumulado nas
mitocôndrias que reduzem o anel tetrazólico do sal formando cristais de
formazan, que se acumulam em compartimentos endossomais ou em
lisossomos. A solução de HCL dissolve esses cristais e permite que seja possível
a leitura da absorbância, logo, quanto mais células viáveis, maior será a
absorbância. Desta forma, após análises, o tempo máximo de 24 horas
apresentou cerca de 50% das células ainda viáveis, em ambos os ensaios, tanto
em triplicata quanto em análise de duplicata. Portanto, esse tempo de 24 horas
foi utilizado nos experimentos de exposição às diferentes concentrações de
albumina. Uma vez estabelecido o tempo de 24 horas quando expostos à 12
mg/mL de albumina, decidiu-se expor os podócitos a concentrações mais
elevadas do que o valor já testado. Isto foi realizado para verificar qual seria a
maior concentração de albumina (dentre as utilizadas nesse estudo) na qual as
células apresentariam a mesma viabilidade que as sem albumina pelo tempo
máximo estabelecido no ensaio anterior. Deste modo todas as concentrações
testadas puderam ser utilizadas nos ensaios seguintes, uma vez que o tempo de
exposição de 24 horas, bem como as concentrações máximas analisadas, não
interferem na viabilidade. Importante mencionar que a viabilidade constante
entre as diferentes concentrações foi um fator primordial para os próximos
ensaios, de modo a não ser um viés nas análises de expressão.
123
3. Time Course para exposição à PA
3.1 Imunocitoquímica Indireta (ICI)
Os resultados de ICI com nefrina diante das concentrações e tempo de
exposição à PA (figura 20) indicaram melhores condições celulares na condição
de 15 µg/mL de PA durante 12 horas, uma vez que foi o maior tempo de
exposição com a maior concentração de PA analisada.
124
Figura 20: Imagem de ICI com nefrina ressaltando a viabilidade dos podócitos após exposição à PA. Em verde é possível
visualizar a porção citoplasmática marcada para nefrina (FITC); em azul, marcado com DAPI, nota-se o núcleo. É possível
observar a redução do citoplasma na imagem de exposição à PA durante 24 horas, o que pode estar indicando o início do
processo de apoptose. Em destaque encontra-se a condição escolhida para o estudo.
125
6.1.3.2. Marcação com faloidina
Os resultados da marcação com faloidina diante das concentrações e
tempo de exposição à PA (figura 21) indicaram que: após 12 horas de exposição
a concentrações progressivas de PA, as células aparentam estar encolhendo o
citoplasma, o que pode ser um indício podem de apoptose, em concentrações
superiores a 15 µg/mL (notado pelo citoplasma reduzido na imagem). Já os
resultados após 24 horas de exposição à PA, o tempo maior parece mais
agressivo como pode ser observado pela diminuição do tamanho do citoplasma
já a partir de 5 µg/mL de PA. Sendo assim foi escolhida a condição de 15 µg/mL
de PA durante 12 horas.
126
Figura 21: Imagem de marcação com faloidina ressaltando a viabilidade dos podócitos após exposição à PA. Em verde
é possível a visualização da porção citoplasmática do podócito (GFP); em azul, marcado com DAPI, nota-se o núcleo. É possível
observar na imagem que exposição à PA durante 24 horas parece provocar redução do citoplasma, o que indicaria um início
de apoptose. Em destaque encontra-se a condição escolhida para o estudo.
127
Com relação à droga PA, esta já é utilizada há muito tempo em estudos
com modelos animais, para indução do dano renal (99). Tanto em ratos in vivo,
como em cultura de podócitos in vitro, já foi demonstrado que esta droga atua na
via ERK (quinase regulada por sinal extracelular), do grupo de proteínas quinase
ativadas por mitógenos (MAPK) (100). Estas proteínas desempenham papel
importante na sobrevivência celular ou na mediação do processo de apoptose,
regulando a estabilidade do citoesqueleto (97), e, no caso de dano com a droga
PA, esta via é prejudicada. No caso dos podócitos in vitro, já se sabe que doses
elevadas de PA podem desencadear um processo de apoptose dos mesmos.
Deste modo foi utilizado o inibidor U0126 da via ERK. Deste modo foi possível
simular dano renal com doses de PA já estabelecidas em outros estudos
(92,101).
Diante dos resultados de ICI para nefrina e de marcação do citoesqueleto
com faloidina, foi estabelecida a dose de 15 µg/mL de PA durante 12 horas,
doses estas não prejudiciais para as células e que permitiram o estudo frente à
exposição de albumina. Nosso resultados condizem com o apresentado em
estudo recente que apresentou mesmo padrão de alteração de expressão da
nefrina, além de outro marcador citoplasmático o ZO-1 (proteína junção de
oclusão) (102).
128
4. Avaliação de marcadores de autofagia após carenciamento de soro fetal
bovino por 24 horas
4.1 Marcadores LC3-II e p62
As Figuras 22 e 23 ilustram os resultados de ICI e Western Blot para os
marcadores de autofagia LC3-II e p62, respectivamente. Após os dois
experimentos, verifica-se que a restrição de FBS não afetou os marcadores de
autofagia, já que ambos foram expressos de forma semelhante em células com
e sem carenciamento.
Figura 22: ICI do marcador de autofagia LC3-II em podócitos. Cultura celular
com meio RPMI 1640 + 10% de FBS (A e B). Cultura celular com meio RPMI
1640 isento de FBS (C e D). A ICI para LC3II foi realizada após 24 horas das
células em cultura. Em A e C: citoesqueleto marcado em vermelho (rodamina-
faloidina); núcleo é visto em azul (DAPI); Em B e D mostra-se apenas o marcador
de autofagia LC3-II em verde (FITC); (Ampliação de 400X).
Na figura 23 pode ser visualizado o resultado do Western Blot das
proteínas totais extraídas de podócitos, marcadas com anticorpo primário p62
(vermelho-rodamina) e normalizado por GAPDH (verde-FITC). A intensidade das
129
bandas foi avaliada com o software ImageJ e os dados podem ser observados
no histograma.
Figura 23: Western Blot com marcador de autofagia p62 em podócitos.
Cinza claro = condição sem PA; cinza escuro = com PA. Valores são média ±
EP, n = 3. Em ambas as condições, com e sem PA, não houve diferença
estatística após o carenciamento de FBS (teste t de Student: p = 0,0764 e p =
0,16029, respectivamente).
4.2 Taxa de transcrito do PODXL
130
Figura 24: Avaliação da expressão relativa de PODXL (PODXL/RPLP0) após
exposição à PA e carenciamento de FBS. Os valores são média ± EP, n = 3.
Nenhuma diferença estatística foi observada sem PA (p = 0,093) em comparação
com a exposição à PA (p = 0,423) (teste ANOVA no software IBM SPSS Statistic).
Antes de iniciar experimentos de exposição à albumina, cultivamos os
podócitos em meio sem soro por 24 horas. Assim, para avaliar se o
carenciamento estava desencadeando a autofagia, avaliamos as proteínas LC3-
II e p62, ambos já bem estabelecidos como marcadores do processo de
autofagia nas células. Dos dois marcadores avaliados, a proteína LC3-II é atua
como um "receptor" de moléculas que devem ser eliminadas e é usada para
estimar a abundância de autofagossomos na via da autofagia. Assim, o LC3-II
interage com moléculas “adaptadoras”, tais como p62, que é um elemento crucial
para o processo de turnover e degradação de componentes tóxicos (103–106).
Neste estudo, após as 24 horas de carenciamento, após ICI com LC3-II não
notamos aumento da coloração do marcador de autofagia, o que indica que o
processo basal do mecanismo de autofagia provavelmente não foi afetado. O
mesmo padrão foi observado no resultado de Western Blot para p62, após a
quantificação das bandas, e, embora o marcador de autofagia p62 estivesse
ligeiramente aumentado (com e sem PA) após a depleção sérica, não houve
diferença estatística (p = 0,093, sem exposição à PA; p = 0,423, com exposição
ao PA).
131
Analisamos também a quantidade relativa de transcrito do gene PODXL
em relação ao controle RPLP0 endógeno, por qPCR, após o carenciamento com
e sem exposição à PA. Em modelos animais com PA induzida por nefrose, a
conexão da podocalixina com o citoesqueleto é interrompida (79,80). De acordo
com nossos resultados, não houve diferença no nível de transcrição de mRNA
do PODXL após a depleção sérica, com ou sem exposição à PA.
