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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
MARIA APARECIDA MATEUS VIEIRA GOMES DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE OOCISTOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP.
E CISTOS DE GIARDIA SPP. EM AMOSTRAS DE ÁGUA BRUTA E
TRATADA, DESTINADA AO ABASTECIMENTO PÚBLICO NO MUNICÍPIO
DE CANAVIEIRAS, BAHIA.
ILHÉUS – BAHIA
2017
MARIA APARECIDA MATEUS VIEIRA GOMES DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE OOCISTOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP.
E CISTOS DE GIARDIA SPP. EM AMOSTRAS DE ÁGUA BRUTA E
TRATADA, DESTINADA AO ABASTECIMENTO PÚBLICO NO MUNICÍPIO
DE CANAVIEIRAS, BAHIA.
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, como parte das
exigências para obtenção do título de Mestre em
Ciência Animal.
Área de concentração: Ciência Animal.
Orientador: Prof. Dr. George Rêgo
Albuquerque.
ILHÉUS – BAHIA
2017
II
O48 Oliveira, Maria Aparecida Mateus Vieira Gomes de.
Avaliação da presença de oocistos de Cryptospo-
ridium spp. e cistos de Giardia spp. em amostras de
água bruta e tratada, destinada ao abastecimento
público no município de Canavieiras, Bahia / Maria
Aparecida Mateus Vieira Gomes de Oliveira. –
Ilhéus, BA: UESC, 2017.
xii, 62 f. : il.
Orientador: George Rêgo Albuquerque.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual
de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em
Ciência Animal.
Referências: f. 53-62.
1. Protozoário. 2. Cryptosporidium. 3. Água – Aná-
lise. 4. Controle de qualidade da água. 5. Água potá-
vel – Contaminação. 6. Saúde pública. I. Título.
CDD 579.4
MARIA APARECIDA MATEUS VIEIRA GOMES DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE OOCISTOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP.
E CISTOS DE GIARDIA SPP. EM AMOSTRAS DE ÁGUA BRUTA E
TRATADA, DESTINADA AO ABASTECIMENTO PÚBLICO NO MUNICÍPIO
DE CANAVIEIRAS, BAHIA.
Ilhéus-BA. 22/02/2017.
__________________________________
George Rego Albuquerque – DSc
UESC/DCAA
(Orientador)
____________________________________
Amauri Arias Wenceslau– DSc
UESC/DCAA
___________________________________
Aristeu Vieira da Silva – DSc
UEFS
ILHÉUS – BAHIA
2017
III
AGRADECIMENTOS
A Deus acima de tudo pela graça da vida e a Nossa Senhora Aparecida por estar
presente em todos os momentos de meus dias.
Aos meus pais amados, Osvaldo Dias Vieira (in memoriam) e Joana Ferraz
Mateus, pelo amor, exemplo, apoio e incentivo na minha formação.
Ao meu esposo Marcos Bessa Gomes de Oliveira e a minha filha Laura Vieira
Gomes de Oliveira pela compreensão e paciência nos momentos necessários e o
verdadeiro amor que nos uni.
A todos de minha família pelo incentivo e apoio durante esse trabalho.
Ao professor Dr. George Rêgo Albuquerque pela indispensável e importante
orientação e condução das atividades com serenidade e compreensão nos momentos
decisivos para o sucesso desta pesquisa.
Ao professor Amauri Arias Wenceslau pelo apoio nos cálculos estatísticos e
informações técnicas.
À professora Dra. Regina Franco e o biólogo MSc Nilson Branco pelo
conhecimento prático e teórico para realização dessa pesquisa.
IV
Ao programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, pela oportunidade
concedida para a realização deste trabalho.
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Ciência Animal, pela
transmissão de conhecimentos e amizade.
Ao Professor Dr. Fábio Alan Carqueja Amorim por ceder as instalações do
laboratório de água.
Aos colegas do mestrado, Philipe Brito, Nina Gabriela e Jeane Martinha, que no
decorrer dessa caminhada mostraram a importância e a força do verdadeiro
companheirismo.
Aos colegas do laboratório de água pelo apoio e um agradecimento especial a
Luciano Nascimento Soledade pela colaboração no processamento das amostras.
A colega Hllychaikra Ferraz Fehlberg pelo apoio e colaboração na Reação em
Cadeia da Polimerase.
A colega Josiane Rocha pela colaboração nas análises microbiológicas e na
técnica de microscopia óptica.
Ao colega Pedro de Alcântara Brito Junior pela colaboração nas análises
estatísticas.
A Prefeitura Municipal de Canavieiras, em especial a equipe de Vigilância
Sanitária e Ambiental, pela colaboração e apoio.
A UESC pelo apoio na disponibilização das instalações, equipamentos e insumos
utilizados nesta pesquisa.
A todos vocês, minha eterna gratidão.
V
AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE OOCISTOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP.
E CISTOS DE GIARDIA SPP. EM AMOSTRAS DE ÁGUA BRUTA E
TRATADA, DESTINADA AO ABASTECIMENTO PÚBLICO NO MUNICÍPIO
DE CANAVIEIRAS, BAHIA-BRASIL.
RESUMO
As doenças de veiculação hídrica surgem como um dos principais problemas de Saúde
Pública no mundo, especialmente aquelas ocasionadas por protozoários intestinais.
Existe uma efetiva relação entre o acesso à água de boa qualidade e a saúde humana, o
que se faz necessário um enfrentamento pelas futuras gerações. Analisando os diferentes
grupos de patógenos de veiculação hídrica, os protozoários Cryptosporidium e Giardia
são os que oferecem formas de disseminação mais resistentes aos métodos de
desinfecção da água. O monitoramento destes protozoários é recomendado pela Portaria
nº 2.914 /2011/MS, pela possibilidade de ocasionar doenças diarreicas na população,
levando em consideração seu padrão de potabilidade. Objetivou-se avaliar a presença
de oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp. em amostras de água bruta
e tratada, destinada ao abastecimento público no município de Canavieiras/BA. As
coletas foram realizadas no período compreendido entre março e dezembro de 2016.
Para tanto, utilizou-se a técnica de filtração em membranas para concentração e
visualização pela Reação de Imunofluorescência direta. A extração de DNA foi
realizada, utilizando-se um kit comercial, e o DNA extraído foi submetido a uma reação
de Nested-PCR. Na Imunofluorescência Direta, Cryptosporidium spp. foi detectado em
30% (06/20) das amostras de água bruta e 5% (01/20) das amostras de água tratada.
Giardia spp. foi detectada em 50% (10/20) das amostras de água bruta e 20% (04/20)
das amostras de água tratada. Na Nested-PCR, 10% (02/20) foram consideradas
positivas para C. parvum em água bruta e nenhuma amostra positiva em água tratada.
Para G. duodenalis, 20% (04/20) foram consideradas positivas, tanto em água bruta
quanto em água tratada. A detecção empregando Nested-PCR é possível para quantificar
tanto patogênico C. parvum e G. duodenalis em amostras de água de grande volume. Na
água bruta, houve correlação fraca entre turbidez e pH e na água tratada, uma correlação
moderada entre turbidez e pH. A constatação desses protozoários nas amostras de água
constitui um risco potencial de transmissão de doença zoonótica para o município
estudado.
Palavras-chave: Doenças. Veiculação hídrica. Monitoramento. Potabilidade. Saúde
Pública.
VI
EVALUATION OF THE PRESENCE OF OOCYSTS OF CRYPTOSPORIDIUM
SPP. AND CYSTS DE GIARDIA SPP. IN GROSS AND TREATED WATER
SAMPLES, INTENDED FOR PUBLIC SUPPLY IN THE MUNICIPALITY OF
CANAVIEIRAS, BAHIA-BRAZIL.
ABSTRACT
Waterborne diseases appear as one of the main public health problems, especially those
caused by intestinal protozoa. There is an effective link between access to good quality
water and human health, which necessitates confrontation by future generations.
Analyzing the different groups of waterborne pathogens, the Cryptosporidium and
Giardia protozoa are the ones that offer more resistant forms of dissemination to water
disinfection methods. Monitoring of these protozoa is recommended by Ordinance No.
2.914 / 2011 / MS, for the possibility of causing diarrheal diseases in the population,
taking into account their portability standard. The objective was to evaluate the presence
of oocysts of Cryptosporidium spp. And cysts of Giardia spp. In samples of raw and
treated water, destined to the public supply in the municipality of Canavieiras/BA. The
collections were carried out between March and December 2016. For this purpose, the
membrane filtration technique was used for concentration and visualization by direct
immunofluorescence reaction. DNA extraction was performed using a commercial kit,
and the extracted DNA was subjected to a Nested-PCR reaction. In Direct
Immunofluorescence, Cryptosporidium spp. was detected in 30% (06/20) of the raw
water samples and 5% (01/20) of the treated water samples. Giardia spp. was detected
in 50% (10/20) of the raw water and 20% (04/20) samples of the treated water samples.
In Nested-PCR, 10% (02/20) were considered positive for C. parvum in raw water and
no positive sample in treated water. For G. duodenalis, 20% (04/20) were considered
positive in both raw and treated water. Detection employing Nested-PCR is possible to
quantify both pathogenic C. parvum and G. duodenalis in large volume water samples.
In crude water, there was a weak correlation between turbidity and pH and in treated
water, a moderate correlation between turbidity and pH. The detection of these protozoa
in the water samples constitutes a potential risk of transmission of zoonotic disease to
the studied municipality.
Key words: Diseases. Water transmission. Monitoring. Potability. Public Health.
VII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Localização do município de Canavieiras– BA. .......................... 27
Figura 2. Ponto de captação da companhia de saneamento de água do
município de Canavieiras. ............................................................ 28
Figura 3. Localização dos pontos de coleta: ponto de captação da
companhia de saneamento de água do município de Canavieiras
e hidrômetro. ................................................................................ 29
Figura 4. Localização do Hidrômetro do ponto de coleta: Rua Almir
Nonato/centro, Canavieiras, BA. .................................................. 29
Figura 5. a) medidor de pH e b) turbidímetro .............................................. 31
Figura 6. Após constatado crescimento em LST, as amostras eram
inoculadas nos meios CVB e, posteriormente, CEC..................... 32
Figura 7. Itens utilizados na etapa de filtração em membranas: a) bomba de
pressão e porta filtro; b) Membranas de ésteres de celulose, com
47 mm de diâmetro e porosidade nominal de 3,0 μm. ......... 33
Figura 8. a) Aspecto das membranas utilizadas. B) Sedimento recuperado
após lavagem das membranas. ..................................................... 33
Figura 9. kit comercial Merifluor para a detecção simultânea de
Cryptosporidium / Giardia. .......................................................... 34
Figura 10. Preparação das lâminas de microscopia no método de
Imunofluorescência. ..................................................................... 35
Figura 11. Oocisto de Cryptosporidium spp. e cisto de Giardia spp./RID/
Amostra controle positiva – 03/11/2016 (20X). ........................... 44
Figura 12. Fragmento de DNA correspondente ao gene rRNA 18S por
Nested/PCR, fotodocumentado em gel de agarose a 1% com sybr
safe. (M) Marcador Molecular; (N) Controle negativo; 1 e 2 –
fragmentos amplificados de 825 pb. ....................................... 46
Figura 13. Fragmento de DNA correspondente ao gene rRNA 16S por
Nested/PCR, fotodocumentado em gel de agarose a 1% com sybr
safe. (M) Marcador Molecular; (N) Controle negativo; 1 a 8 –
fragmentos amplificados de 297 pb. ....................................... 46
VIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Análises físico–químicas (pH e turbidez da água) realizadas nas
amostras de água bruta e tratada coletadas em Canavieiras, BA em
2016. ......................................................................................... 41
Tabela 2. Análises microbiológica (coliformes totais e coliformes
termotolerantes) realizadas nas amostras de água bruta e tratada
coletadas, Canavieiras, BA em 2016. ............................................. 42
Tabela 3. Análise da Reação de Imunofluorescência direta em amostras de
água bruta e água tratada no município de Canavieiras, BA em
2016. ............................................................................................... 43
Tabela 4. Analise da Nested PCR em amostras de água bruta e água tratada
no município de Canavieiras, BA em 2016. ................................... 45
Tabela 5. Ocorrência de Cryptosporidium spp., Giardia spp., Coliformes
fecais e E. coli de acordo com o tratamento da água no município
de Canavieiras, BA em 2016. ......................................................... 47
IX
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..................................................................................... 12
2. OBJETIVOS.......................................................................................... 14
2.1. Geral........................................................................................................ 14
2.2. Objetivos Específicos.............................................................................. 14
3. REVISÃO DE LITERATURA............................................................ 15
3.1. Gênero Giardia....................................................................................... 15
3.1.1. Histórico.................................................................................................. 15
3.1.2. Taxonomia............................................................................................... 15
3.1.3. Morfologia............................................................................................... 16
3.1.4. Ciclo Biológico....................................................................................... 16
3.1.5. Transmissão............................................................................................ 17
3.1.6. Sinais Clínicos........................................................................................ 17
3.1.7. Características epidemiológicas............................................................. 18
3.2. Gênero Cryptosporidium........................................................................ 18
3.2.1. Histórico................................................................................................. 18
3.2.2. Taxonomia.............................................................................................. 19
3.2.3. Morfologia.............................................................................................. 20
3.2.4. Ciclo Biológico....................................................................................... 21
3.2.5. Transmissão............................................................................................ 21
3.2.6. Sinais Clínicos........................................................................................ 22
3.2.7. Características epidemiológicas............................................................. 22
3.3. Ocorrência de Cryptosporidium spp e Giardia spp. em água............... 23
3.4. Vigilância da qualidade da água destinada ao consumo humano.......... 25
3.5. Métodos de detecção de oocistos de Cryptosporidium spp e Giardia spp
em amostras de água.........................................................................
26
4. METODOLOGIA................................................................................. 27
4.1. Município de coleta das amostras de água.......................................... 27
4.2. Local de coleta das amostras de água.................................................. 28
4.2.1. Ponto de captação – Rio cipó................................................................ 28
4.2.2. Hidrômetro............................................................................................ 29
4.3. Coleta das amostras de água................................................................ 30
4.4. Processamento das amostras de água.................................................. 30
4.4.1. Análise física – química da água.......................................................... 31
4.4.2. Análise microbiológica da água........................................................... 31
4.4.3. Análise parasitológica da água................................................................ 32
X
4.4.3.1. Filtração e Eluição................................................................................... 32
4.4.3.2. Reação de Imunofluorescência Direta (RID).......................................... 34
4.4.3.3. Quantificação dos oocistos ou cistos nas amostras ................................ 35
4.5. Análises Moleculares ............................................................................. 35
4.5.1. Extração de DNA ................................................................................... 36
4.5.2. Reação em Cadeia da Polimerase para detecção de DNA de
Cryptosporidium spp. .............................................................................
38
4.5.3. Reação em Cadeia da Polimerase para detecção de DNA de Giardia
spp. ......................................................................................................... 38
4.6. Parâmetro climático................................................................................ 39
4.7. Análises dos dados.................................................................................. 40
5. RESULTADOS...................................................................................... 41
5.1. Análises físico – química da água........................................................... 41
5.2. Análises microbiológica.......................................................................... 42
5.3. Identificação de Cryptosporidium e Giardia pela Imunofluorescência
direta........................................................................................................
43
5.4. Identificação de Cryptosporidium e Giardia pela Nested- PCR............ 44
6. DISCUSSÃO.......................................................................................... 48
7. CONCLUSÃO....................................................................................... 52
8. REFERÊNCIAS.................................................................................... 53
XI
12
1. INTRODUÇÃO
A falta de acesso a água de boa qualidade, adequadamente tratada, pode afetar a
saúde humana e animal. As doenças de veiculação hídrica, especialmente as diarréias,
podem ser ocasionadas por diversos agentes patogênicos; em meio a estes,
Cryptosporidium spp. e Giardia spp. destacam-se. A diarréia é a segunda maior causa
de morte em crianças até cinco anos de idade no mundo, provoca a morte de 20 em cada
1.000 crianças nascidas vivas (ONU, 2016).
Os protozoários patogênicos Cryptosporidium spp. e Giardia spp são parasitas
intestinais, que atualmente, destacam-se como um dos mais importantes contaminantes
veiculados por água. Elementos do gênero Cryptosporidium ocasionam infecções em
diversas espécies animal e no homem. A criptosporidiose apresenta-se agressiva
especialmente em idosos, diabéticos, crianças e em indivíduos imunocomprometidos.
Giardia é um protozoário flagelado, apontado hoje em dia, como um agente infeccioso
re-emergente, em consequência do aumento de sua ocorrência entre crianças. Ambos os
protozoários são transmitidos através de oocistos e cistos eliminados nas fezes dos
hospedeiros e provocam casos de diarréias agressivas que podem estar acompanhadas
de desnutrição e desidratação e levar o indivíduo a morte.
Nas últimas décadas, surtos de criptosporidiose e giardíase veiculados por água
tem sido relatado em diversos países. Várias causas podem ser responsáveis pelas
numerosas ocorrências, como o consumo de água superficial não tratada, um sistema de
saneamento básico inadequado, uma gestão de água ineficiente e até mesmo, águas para
consumo que não atendem aos padrões de potabilidade estabelecidos pela legislação
especifica.
Alguns fatores colaboram para a disseminação dos cistos de Giardia e dos
oocistos de Cryptosporidium, além da resistência às condições ambientais e o tempo que
permanecem infectante, a situação referida se agrava pela resistência destes protozoários
aos sistemas convencionais de tratamentos de água, como a filtração e cloração. Estas
observações têm grande relevância para Saúde Pública, pois o número de pessoas em
risco atinge grandes proporções.
13
No Brasil, a investigação destes protozoários foi recomendada pelo Ministério da
Saúde no ano 2000, através da Portaria nº 1469. Contudo até o momento a mesma ainda
não foi implantada no Laboratório Central de Saúde Pública Profº Gonçalo Moniz
(LACEN-BA), mesmo com as várias revisões que foram realizadas ao longo dos anos
para normatizar o padrão de potabilidade da água. Embora seja de importância em Saúde
Pública, os sistemas de tratamento de água no estado da Bahia, não monitoram ainda
esses patógenos em seus pontos de captação e na água final distribuída a população.
O município de Canavieiras se destaca por cercar-se de um número significativo
de rios, como: Rio Pardo, Patipe, Cipó e Salsa, cujas margens são cercadas por fazendas
que cultivam o cacau. No entanto, o aumento da população e a falta de políticas de
gestão ambiental, sobretudo no que concerne ao esgotamento sanitário, tem corroborado
para a contínua degradação dos rios e lençóis freáticos dos municípios.
Diante do exposto, os estudos relacionados a ocorrência desses protozoários em
água é de fundamental importância, pois os resultados obtidos, podem implantar ou
implementar ações que visem proteger a saúde da população.
14
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Avaliar a presença de oocistos Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp. em
amostras de água bruta e tratada, destinada ao abastecimento público no município de
Canavieiras, Bahia.
2.2. Objetivos Específicos
Identificar a presença dos protozoários, através da análise parasitológica das
amostras coletadas, por meio de filtração, eluição e Reação de
Imunofluorescência Direta (RID);
Identificar a presença de DNA dos protozoários através da Nested – PCR (Reação
em Cadeia da Polimerase), a partir de amostras extraídas;
Verificar a qualidade físico-química e microbiológica das amostras coletadas e
relacionar os parâmetros com a eventual presença dos parasitas;
Relacionar o parâmetro climático (ausência ou presença de chuva) com
resultados das analise físico- química e microbiológica com a presença do
oocistos e cistos.
15
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Gênero Giardia
3.1.1. Histórico
Antony van Leeuwenhoek no ano de 1661, observou pela primeira vez, o
protozoário Giardia, mas apenas em 1859, Vilem Lambl, descreveu detalhes sobre sua
morfologia (MEYER, 1990). Kunstler em 1882, revelou o gênero Giardia pela primeira
vez e Blanchard em 1888, sugere a denominação Lamblia intestinalis. Em 1902, o nome
Lamblia intestinalis é alterada para Giardia duodenalis, por Stiles (ADAM, 2001). Em
1952, Filice, considerando particularidades morfológicas como desenho dos corpos
medianos, o formato e o comprimento dos trofozoítos, indica três espécies Giardia
duodenalis, G. agilis e G. muris (MONIS et al., 1999). Com o uso do microscópio
eletrônico, posteriormente, outras três espécies de Giardia foram identificadas: G.
psittaci, G.microti e G. ardeae (ERLANDSEN et al., 1996).
3.1.2. Taxonomia
A classificação taxonômica do gênero fundamenta-se nas características
morfológicas dos trofozoítos e cistos, em estudos filogenéticos moleculares e na
especificidade do hospedeiro (BRANCO, 2015). Taxonomicamente, sua classificação
segundo Levine et al. (1980): Sub-reino Protozoa, Filo Sarcomastigophora, Subfilo
Mastigophora, Classe Zoomastigophora, Ordem Diplomadida Wenyon, Subordem
Diplomonadina e Família Hexamitidae. A classificação de Levine et al. (1980),
atualmente, é a oficialmente adotada (FERNANDES, 2013).
O gênero Giardia inclui seis espécies: G. duodenalis, G. muris, G. agilis, G.
psittaci, G. ardeae, G. microti, sendo que os mamíferos e humanos são os principais
hospedeiros de G. duodenalis (THOMPSON, 2004). Em relação ao seu potencial
zoonótico, estudos moleculares demonstram que, apenas G. duodenalis é transmitida
para humanos e outros mamíferos (PAULINO, 2005). Na espécie G. duodenalis são
16
identificados oito grupos (A, B, C, D, E, F, G, H), dentre as quais os grupos A e B, são
os principais agentes a causar infecção em humanos, e os demais são, principalmente de
animais, porém alguns podem afetar humanos (FENG e XIAO, 2011).
3.1.3. Morfologia
Giardia é um protozoário flagelado de distribuição cosmopolita mais encontrado
nos exames fecais, pois parasita as classes de vertebrados: mamíferos, anfíbios, répteis
e aves. Segundo Thompson (2004), esse protozoário possui um organismo anaeróbio,
com uma organização celular simples, ausência de mitocôndrias e perixomos;
apresentando duas formas evolutivas: os cistos e os trofozoítos (ADAM, 1991).
Os cistos de Giardia são estruturas ovais, medem de 8-18 μm e são eliminados
infectantes através das fezes dos hospedeiros (USEPA, 2012). Possuem dois a quatro
núcleos, pequenos e circulares, dois pares de corpos medianos e axonemas. Apresenta
em sua estrutura uma membrana externa de 0,3 μm de espessura (FAUBERT, 2000).
O tamanho aproximado dos trofozoítos é de 12 a 15 μm de comprimento por 6 a
8 μm de largura. São móveis, possui simetria bilateral, superfície dorso convexo, dois
núcleos e quatro pares de flagelos. Em sua porção ventral, apresenta uma conformação
denominada disco adesivo ou ventral. Encontrado na parte superior do intestino delgado,
sendo esta forma responsável pelos sinais e sintomas próprio da giardíase
(THOMPSON, 2004).
3.1.4. Ciclo Biológico
O ciclo biológico inicia-se com a ingestão de cistos, sendo suficientes 10 a 25
cistos para causar infecção do hospedeiro (THOMPSON, 2004). No estômago o
processo de desencistamento se inicia, em meio ácido, completando–se no intestino
delgado, onde ocorre o rompimento e liberação dos trofozoítos. De cada cisto são
liberados dois trofozoítos, que por reprodução assexuada, propagam-se e habitam o
intestino. Estes se mantem preso ao intestino por meio do disco suctorial (MELO et al.,
2002). O encistamento acontece na parte final do intestino delgado, com a contração dos
17
trofozoítos; onde ocorre o encurtamento dos flagelos, redução do citoplasma e a
formação de uma membrana rígida. No interior dos cistos formados, ocorre à duplicação
das estruturas internas, o que origina cistos maduros tetranucleados (SCHMIDT e
ROBERTS, 1981). Posteriormente esses cistos são eliminados para o meio exterior nas
fezes do hospedeiro, reiniciando o ciclo (FAUBERT, 2000).
3.1.5. Transmissão
A transmissão de Giardia é por via fecal-oral pela ingestão de cistos, podendo
ser direta entre animais para as pessoas ou entre pessoa em ambientes onde as condições
de higiene são inadequadas; ou indireta com a ingestão de cistos em água ou alimentos
contaminados. Enquanto persiste a infecção, ocorre à transmissibilidade (BRASIL,
2010).
3.1.6. Sinais Clínicos
Os indivíduos infectados por Giardia, em sua maioria, cerca de 60% não
apresentam sintomas ou estes são inespecíficos (KATZ et al., 2006). Na maioria das
vezes apenas os indivíduos com os sintomas são submetidos ao tratamento, desta forma
os portadores assintomáticos oferecem grande significado para a saúde pública, pois
agem como fonte de contágio. Após um período de incubação de uma a duas semanas,
sintomas como vômitos, náuseas, diarréia, mal-estar, perda de peso e cólicas abdominais
podem ocorrer e prosseguirem durante duas a quatro semanas (KATZ et al., 2006).
Franco (2007), relata que as crianças são as mais afetadas pela infecção.
Em animais a giardíase é frequentemente assintomática, mas tem sido associada
à ocorrência de diarréia, vômito, apatia e perda de peso (THOMPSON, 2004).
A gravidade da doença está relacionada ao estado imunológico do hospedeiro e
a virulência do parasito (CACCIÒ e RYAN, 2008).
18
3.1.7. Características epidemiológicas
A giardíase é uma doença de ocorrência global, mais prevalente em países
subdesenvolvidos, ocasionando uma avaliação de 280 milhões de casos por ano, sendo
200 milhões na América, Ásia e África (CACCIÒ e RYAN, 2008; FENG e XIAO,
2011). É um patógeno que exibe altas taxa de novas infecções em todo o mundo
(GALLAS-LINDEMANNA et al., 2016). Estudos destacam fatores que executam
importantes papéis na alta prevalência da doença: pobreza, a falta de saneamento
adequado e má higiene pessoal (MAHDY et al., 2008). Podem ocorrer epidemias,
especialmente, em estabelecimentos que recebam crianças, pois é o grupo etário mais
acometido, entre 8 meses e 10 a 12 anos; em zonas endêmicas, a G. duodenalis e
identificada como um dos agentes etiológicos da “diarreia dos viajantes” (BRASIL,
2010). Somente nos Estados Unidos, há uma incidência considerada de 1,2 milhão de
casos de Giardia duodenalis, todos os anos (SCALLAN et al., 2011).
Em países desenvolvidos, as taxas de infecção por giardíase em seres humanos,
são na maioria das vezes, mais baixas, mostram-se entre 0,4 e 7,6%; em países em
desenvolvimento, foram relatadas taxas de infecção elevada, entre 8% e 30% na maioria
dos países. Foram observadas taxas de infecção em animais de criação entre 1,5 a 57,8%
e em animais de companhia, entre 2,0 a 64.3%, em países desenvolvidos como em
desenvolvimento (FENG e XIAO, 2011).
3.2. Gênero Cryptosporidium
3.2.1. Histórico
O parasitologista americano Ernest Edward Tyzzer em 1907, apresentou o
protozoário do gênero Cryptosporidium, o qual tinha sido encontrado em glândulas
gástricas de camundongos de laboratório (DUBEY et al., 1990). Em 1910, sugeriu
Cryptosporidium como gênero e nomeou C. muris como espécie (FAYER, 2004).
Tyzzer em 1912 apresentou mais um estudo denominando uma nova espécie, C.
parvum, onde foram notadas relações com a primeira espécie, da qual o
19
desenvolvimento acontecia no intestino delgado dos camundongos e os oocistos eram
menores do que C. muris (FAYER, 2010). Em 1955, Cryptosporidium foi associado
como a principal causa do surto de diarréia em aves, relacionado a uma nova espécie C.
meleagridis (FAYER, 1997). Entre os períodos de 1955 a 2002, espécies foram
apresentadas de acordo com a morfologia, critérios biológicos e de desenvolvimento
(XIAO et al., 2004).
Aconteceu em 1976, nos Estados Unidos da América, o primeiro relato da
criptosporidiose em humanos (NIME et al., 1976). Alguns anos depois em 1981, outros
foram relatados em diferentes cidades dos Estados Unidos; o que chamou a atenção dos
pesquisadores na época foram os fatores epidemiológicos comuns (FRANCO, 2007).
Segundo Franco, 2007, p.38:
Os indivíduos infectados eram jovens, aparentemente saudáveis,
relatavam comportamento homossexual masculino e apresentavam
infecção por diversos patógenos oportunistas; dentre eles, infecção por
um agente etiológico desconhecido que causava um quadro de diarréia
aquosa, severa e extremamente debilitante, conduzindo os pacientes ao
óbito.
De tal modo, depois 1981, Cryptosporidium surgiu como um patógeno
oportunista, com o advento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SODRÉ e
FRANCO, 2001). De acordo com Dillingham et al. (2002), a infecção por
Cryptosporidium foi referida em seis continentes e em mais de 40 países.
Em 1984 ocorreu o primeiro relato sobre surto de criptosporidiose em humanos
devido ao abastecimento de água, quando 2.006 casos de gastroenterite foram relatados,
na cidade de San Antonio, no Texas (Franco, 2007). Em relação à população infantil,
aproximadamente 17% dos casos de diarréia são associados com infecção por
Cryptosporidium (PEREIRA, 2002).
3.2.2. Taxonomia
A taxonomia do gênero Cryptosporidium permanece sendo oficialmente
classificada segundo Levine et al.(1980): Sub-reino Protozoa, Filo Apicomplexa, Classe
20
Sporozoea, Subclasse Coccidia, Ordem Eucoccidiorida, Subordem Eimeriorina e
Família Cryptosporiidae (GRECA, 2010).
O gênero Cryptosporidium apresenta 21 espécies, a saber: C. andersoni; C.
baileyi, C. bovis; C.canis; C.fayeri; C. fragile; C. felis; C. galli; C. hominis; C.
macropodum; C.meleagridis; C. molnari; C. muris; C. parvum; C. ryanae; C.
scophthalmi; C. serpentis; C.suis; C. varanii; C. xiaoi; C. wrairi (OSAKI, 2009). Sete
destas especies tem a capacidade de causar infecçao no ser humano: C. hominis, C.
parvum, C. meleagridis, C. felis, C. canis, C. suis e C. muris (CACCIÒ et al., 2005).
Para padronizar a taxonomia e chegar a esses números, a aplicação de técnicas
moleculares tem sido de grande importância (XIAO e CAMA, 2006; OSAKI, 2009).
Algumas espécies de Cryptosporidium exibem alterações no diâmetro do oocisto,
auxiliando em sua diferenciação, mesmo possuindo características morfológicas
semelhantes (FAYER, 2004; SMITH et al.,2005).
3.2.3. Morfologia
Cryptosporidium, por possuir um complexo apical secretor, é classificado no filo
Apicomplexa (ABRAHAMSEN et al., 2004). Os oocistos das espécies de
Cryptosporidium possuem formato que variam de esféricos ou ovoides, medindo de 4 a
6 μm de diâmetro, apresentando quatro esporozoítos em seu interior (FAYER, 2004).
São parasitas entéricos, que apresentam em sua maioria uma parede cística dupla e
espessa e um percentual menor, que possui parede fina, que se rompe ainda dentro do
hospedeiro e liberam esporozoítos, responsáveis pela autoinfecção, que invadem células
epiteliais não infectadas e determinam um novo ciclo. (FAYER, 2004; BORGES et al.,
2007). As espécies de Cryptosporidium desenvolvem-se na superfície da
microvilosidade da célula epitelial de diversos vertebrados (FAYER, 2004).
O gênero possui uma importante configuração em sua estrutura, constituindo a
fundamental particularidade taxonômica para sua identificação: os oocistos maduros
possuem quatro esporozoítos que não estão inclusos no esporocisto (PEREIRA, 2007).
21
3.2.4. Ciclo Biológico
Cryptosporidium apresenta um ciclo de vida monóxeno, onde as fases, sexuada e
assexuada, ou seja, de desenvolvimento, ocorrem no mesmo hospedeiro. O ciclo começa
após a ingestão de oocistos infectados pelo hospedeiro, que se rompe no intestino
delgado e libera os esporozoitos infectantes, que invadem as células epiteliais do
intestino. Após o desencistamento, inicia-se a fase assexuada, onde o núcleo dos
esporozoitos divide-se várias vezes, realizando-se por meio de duas gerações sucessivas
de merogonia, com liberação de merozoítos. Estes merozoítos podem recomeçar outro
ciclo de reprodução assexuada ou dar início ao ciclo sexual com a formação do zigoto,
que se divide e forma o oocisto, completando o ciclo. (TZIPORI e WARD, 2002;
FAYER, 2004).
Cryptosporidium demonstra algumas particularidades que o diferencia de
qualquer outro coccídio. A invasão à célula hospedeira, onde as fases endógenas de
desenvolvimento estão restritas às superfícies apicais da célula, acontecem sem invasão
citoplasmática (RYAN e XIAO, 2014).
3.2.5. Transmissão
O modo de transmissão ocorre por via fecal-oral, de forma direta entre animais
para a pessoa ou entre pessoas e de forma indireta pelo consumo de água e alimentos
contaminados (FAYER et al., 2004).
Segundo Dillingham et al. (2002), a transmissão do protozoário Cryptosporidium
pode acontecer por outras fontes ambientais e vetores potenciais, como moscas e baratas
e de acordo Overgaauw et al. (2009) a transmissão pode ocorrer também através do ar.
O período de transmissão dura várias semanas, do começo dos sintomas e durante o
tempo que houver eliminação de oocistos nas fezes (BRASIL, 2010).
22
3.2.6. Sinais Clínicos
A doença é caracterizada por sintomas como diarréia aquosa prolongada de
coloração esverdeada ou incolor, acompanhada de dor abdominal, vômitos, náuseas,
febre e mal-estar (BRASIL, 2010). Em indivíduos imunocomprometidos, como
pacientes que estão sob tratamento de algum tipo de câncer ou transplantados, crianças
com deficiência nutricional, portadores do vírus da imunodeficiência adquirida (HIV),
entre outros, o desenvolvimento de diarréia crônica pode persistir por longos períodos,
podendo levar o paciente a morte (BONATTI, 2007).
Infecções por Cryptosporidium em animais, ocorre na maioria das vezes em
indivíduos jovens, em ruminantes particularmente. A diarréia líquida e abundante com
odor fétido e coloração amarelada é o sinal mais notado. Em alguns casos, a infecção
pode acontecer sem sinais aparentes e em estado de estresse, a eliminação do oocisto
acontece novamente. (FAYER e XIAO, 2008).
3.2.7. Características epidemiológicas
A infecção em seres humanos por Cryptosporidium spp. ocorre em todos os
continentes; de tal maneira em países desenvolvidos como em desenvolvimento e
atingem populações rurais e urbanas (MEINHARDT, 1996). Os países desenvolvidos
apresentam uma prevalência de 1% a 4,5% e nos países em desenvolvimento essa
estimativa pode chegar até 30%, sendo menores de 2 anos, o grupo mais atingido
(BRASIL, 2010). Segundo Miller et al. (1994), nos países em desenvolvimento a
criptosporidiose é endêmica, pois foi identificada em 30% de crianças com sintomas
clínicos.
O curso da contaminação zoonótica do Cryptosporidium é de fundamental
importância no estudo da espécie. Pesquisas diferenciam subespécies de C. parvum em
animais de fazenda, havendo evidências da prevalência dessas subespécies em humanos
(XIÃO, 2010).
23
3.3. Ocorrência de Cryptosporidium spp e Giardia spp. em água
Em virtude do relato de surtos de Giardia e Cyrptosporidium através da veiculação
hídrica, despertou-se um grande interesse em diversos países em desenvolver estudos
relacionados com a ocorrência desses protozoários em água. Essas pesquisas têm
objetivo de averiguar a presença desses microrganismos em amostras de água de
abastecimento público, pois os mesmos apresentam resistência ao tratamento
convencional, em águas superficiais brutas, subterrâneas, de esgoto e águas recreativas
(ELSAN et al., 2015; KHAN, 2016).
Karanis et al. (2007), relatam que, dos 325 surtos de veiculação hídrica ocasionada
por protozoários parasitas no mundo, 32% estavam relacionados à contaminação com
G. duodenalis e 23,7% associados à C. parvum ou Cryptosporidium spp. A alta
ocorrência foi justificada pelo inadequado tratamento da água, com espaços nas
barreiras de proteção e desinfecção ineficaz.
Baldursson e Karanis (2011), estudando surtos associados com doenças de
veiculação hídrica, registraram mundialmente 524 surtos atribuídas a protozoários
parasitas. Desses, 54,38% estavam relacionados à Cyrptosporidium e 34,58% à Giardia.
Xiao et al. (2013), estudando a ocorrência de Cryptosporidium e Giardia no
reservatório das Três Gargantas na China, notaram que as amostras positivas foram mais
frequentes no período de inundação, denotando uma relação sazonal. Foram coletadas
66 amostras, sendo 61 de águas superficiais provenientes de 23 locais de monitoramento
e 5 amostras de água tratada. Oocistos de Cryptosporidium foram encontrados em 86,4%
e cistos de Giardia em 65,2% das amostras coletadas.
No Sudeste Asiático, foi realizado um trabalho com amostras de água nas bacias
hídricas de quatro países, com objetivo de avaliar risco potencial de transmissão de
doenças zoonóticas na região. Do total de 221 amostras coletadas, 53 foram realizadas
na Malásia, 120 amostras da Tailândia, 33 amostras das Filipinas e 15 amostras do
Vietnã. Oocistos de Cryptosporidium foram detectados em amostras de água tratada das
Filipinas (10%) e amostras de água não tratada da Tailândia (26,9%), Malásia (38,6%)
e Filipinas (47,8%). Cistos de Giardia foram encontrados em amostras de água tratada,
24
derivados das Filipinas (10%) e em amostras de água não tratadas da Tailândia (21,5%),
Vietnã (50%), Malásia (50%) e Filipinas (69,6%) (KUMAR et al., 2016).
No Brasil, alguns estudos têm sido realizados com o objetivo de averiguar a
ocorrência destes protozoários em água: NEWMAN et al. (1994), em uma comunidade
urbana de Fortaleza, descreveram a ocorrência de Cryptosporidium em 22,2% em águas
de poços utilizados para consumo humano; FRANCO et al. (2001), em águas do Rio
Atibaia em Campinas, onde todas as amostras de água foram positivas para
Cryptosporidium e Giardia, apesar da alta turvação; CARTUSIO NETO e FRANCO
(2004), em pontos do processo de tratamento de água de Campinas, foram detectados
positividade para Giardia na água bruta de 90% a 100% e Cryptosporidium não foi
encontrado; HACHICH et al. (2004) em bacias hidrográficas em São Paulo, das 278
amostras coletadas 27% foram positivas para Giardia e 2,5% positivas para
Cryptosporidium.
COSTA et al. (2007), em estudo realizado sobre a identificação de patógenos
humanos nas águas que margeiam a cidade de Rio Grande/RS, oocistos de
Cryptosporidium foram verificados em 4,2% das 48 amostras coletadas e Giardia não
foi encontrada. DIAS et al.(2008), em Viçosa, Minas Gerais na bacia hidrográfica do
Ribeirão São Bartolomeu, foram encontrados uma média de 3,62 oocistos∕L de
Cryptosporidium e 3,93 cistos∕L de Giardia;
SATO et al. (2013), pesquisando 206 de água potável da rede pública em São
Paulo, identificaram Giardia em 102 amostras e 19 delas também foram positivos para
Cryptosporidium;
Almeida et al. (2015) na estação pública de tratamento de água no Paraná, 48
amostras de água foram coletadas, 24 tratada e 24 não tratada, Giardia foi detectada em
8,33% das amostras não tratada e ausente nas amostras tratadas e o Cryptosporidium
não foi detectado.
No Brasil, o monitoramento dos protozoários Cryptosporidium spp. e Giardia spp.,
nas águas empregadas para o abastecimento público, embora seja uma recomendação
do Ministério da Saúde, não acontece de forma rotineira nas Estações de Tratamento de
Água (STANCARI, 2010). De acordo com Stancari (2010), os problemas estão
25
relacionados aos recursos e deficiência de mão de obra habilitadas, além das questões
metodológicas.
Observa-se diante dessa situação, que são imprescindíveis métodos de detecção
rápidos e eficazes para estimar a ocorrência desses protozoários, tanto na água bruta,
como em amostras de água tratada usada para consumo humano. Essas avaliações
fornecem informações para adoção de mediadas que avalizem a garantia dos
suprimentos de água e a saúde da população.
3.4. Vigilância da qualidade da água destinada ao consumo humano
A vigilância da qualidade da água para consumo humano é uma atribuição do setor
da saúde instituída desde 1977, com a publicação do Decreto Federal nº 79.367, de 9 de
março de 1977, o qual concede ao Ministério da Saúde a responsabilidade para legislar
sobre as normas e o padrão de potabilidade da água para consumo humano
(NASCIMENTO, 2009). Em consequência do Decreto, a primeira legislação nacional
para que estabelece o padrão de potabilidade brasileira foi assinada, a Portaria BSB nº
56, de 14 de março de 1977. Várias revisões foram efetivadas ao longo dos anos para
normatizar o padrão de potabilidade da água, a saber: Portaria GM n.º 36/1990, Portaria
MS n.º 1469 de 29 de dezembro de 2000, Portaria MS n° 518, de 25 de março de 2004
e Portaria nº 2.914 de 14 de dezembro de 2011 (BRASIL, 2016).
Atualmente, no Brasil, o controle e vigilância da água para consumo humano,
assim como o padrão de potabilidade está estabelecido pela Portaria nº 2.914, publicada
em 14 de dezembro de 2011 (BRASIL, 2011). A investigação da análise de protozoários
patogênicos no monitoramento de amostras ambientais, avalia a presença dos
protozoários Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em água destinada ao consumo
humano, o que configura um crescimento ao estabelecer o uso das águas para
abastecimento e determinar parâmetros de qualidade como prioridade (BRASIL, 2013).
A legislação brasileira apresentou um grande avanço ao priorizar a qualidade dos
recursos hídricos para a água de abastecimento público (FRANCO et al., 2012). Contudo
não há informações que descrevam a real ocorrência de Cryptosporidium e Giardia em
fontes de abastecimento de água (ALMEIDA, 2015). Desta forma, a vigilância da
26
qualidade da água para consumo humano intensifica ações para assegurar a qualidade
da água consumida pela população até o seu monitoramento, fundamentado em uma
perspectiva preventiva de risco (BRASIL, 2013).
3.5. Métodos de detecção de oocistos de Cryptosporidium spp e cistos de
Giardia spp. em amostras de água
Os métodos empregados para detecção de oocistos e cistos fundamentam-se na
concentração das amostras e na detecção. Essas técnicas foram normalizadas em países
como Estados Unidos, Austrália e Canadá, com legislações que priorizam a degradação
dos mananciais (BRASIL, 2013). As metodologias usuais utilizadas na detecção de
Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em amostras de água possuem três etapas:
concentração, purificação e detecção (ANCENO et al., 2007).
A metodologia de referência, o método 1623, desenvolvido pela Agência de
Proteção Ambiental dos Estados Unidos, consiste de filtração, separação
imunomagnética e microscopia de Imunofluorescência (USEPA, 2005). Essa
metodologia está refém a limitações como: necessidade de importação de insumos,
custos altos e exigência de mão de obra especializada, além do que, o método não
identificar a espécie de protozoário (BRASIL, 2013).
Há uma exigência da legislação brasileira da análise periódica de cistos de
Giardia e oocistos de Cryptosporidium nos pontos de captação dos mananciais de água
superficial, que apresentem resultado de E. coli, acima de 1.000 /100 mL, considerando
uma média geométrica anual. Essa abordagem mostra a importância em preservar os
mananciais como solicitado nos planos de segurança da água na legislação supracitada
(BRASIL, 2011).
A técnica de Imunofluorescência continua sendo um dos métodos mais
recomendado para pesquisa de Cryptosporidium e Giardia, apesar do grande número de
metodologias requintadas estarem sendo avaliadas, como “Enzyme Linked
ImmunonoSorbent Assay” (ELISA), Reação em Cadeia da Polimerase (PCR),
Citometria de fluxo, cultura de células entre outros (FAYER, 2004).
27
4. METODOLOGIA
4.1. Município de coleta das amostras de água
O Estado da Bahia localiza-se na região Nordeste do Brasil. Possui 14.016.906
habitantes, uma área de 564.733,177 Km² e 417 municípios. O município de Canavieiras
está localizado geograficamente no sul da Bahia (Figura 1), limitando-se ao norte com
o município de Una; ao sul com Belmonte; a leste com o Oceano Atlântico e a oeste
com Santa Luzia e Mascote. À distância para Salvador, capital do Estado da Bahia é de
596 km e de 110 km para Ilhéus-Ba, sua extensão territorial é de aproximadamente 1.381
Km². O clima é quente e úmido e possui 33. 130 habitantes, segundo o Instituto
Brasileiro de Geografia e Estatística (BRASIL, 2016).
FIGURA 1 – Localização do município de Canavieiras– BA. FONTE: Google Earth (2017).
28
4.2. Local de coleta das amostras de água
4.2.1. Ponto de captação - Rio cipó
A Bacia hidrográfica do Rio Pardo compõe o principal manancial para
abastecimento público no município de Canavieiras, que tem como principal afluente o
rio cipó. A distância entre o ponto de captação (Figura 2), até a estação de tratamento
de água (ETA) é de 5,3 km aproximadamente (Figura 3). A capacidade de captação, no
Rio Cipó, é de 61 litros por segundo (l/s) e o volume nominal de tratamento do sistema
é de 80 litros por segundo (l/s). O regime de operação é de 13 horas por dia em
funcionando e a estação tem a capacidade de produzir em média 3083 m3/dia. Os
produtos químicos são comuns e globalmente empregados (RAIC, 2013).
A B
FIGURA 2 – A e B: Ponto de captação da companhia de saneamento de água do
município de Canavieiras. FONTE: Arquivo pessoal
29
FIGURA 3 – Localização dos pontos de coleta: ponto de captação da companhia de
saneamento de água do município de Canavieiras e hidrômetro. FONTE: Google Earth, 2017.
4.2.2. Hidrômetro
Estrategicamente foi escolhido o hidrômetro que fica localizado a Rua Almir
Nonato – centro, devido à proximidade com a estação de tratamento de água (ETA)
(Figura 4). A distância entre o hidrômetro e a ETA é de aproximadamente 600 metros.
A B
FIGURA 4 – A e B: Localização do Hidrômetro do ponto de coleta. Canavieiras, BA. FONTE: Arquivo pessoal
30
4.3. Coleta das amostras de água
Foram realizadas quatro coletas mensais, duas por quinzena, em dois pontos já
relatados: no ponto de captação (água bruta) e no hidrômetro (água tratada), no período
de março a dezembro de 2016.
Para pesquisa parasitológica, foram coletados 2 L de água bruta e 20 L de água
tratada. Totalizando 40 litros de água bruta e 400 litros de água tratada em todo o
trabalho (FRANCO e BRANCO, 2015).
As amostras foram coletadas em dois recipientes plásticos de vinte litros e dois
litros. Estes foram lavados antecipadamente com solução de eluição (1 ml de Tween 80
e 1000 ml de água destilada), internamente eram friccionados através da agitação
manual durante 50 vezes, posteriormente secavam a temperatura ambiente e ficavam
vedados com filme plástico até o seu uso (FRANCO e BRANCO, 2015).
Para as análises bacteriológicas, as amostras foram coletadas em dois frascos de
polipropileno estéreis com capacidade para 500 mL. O frasco de água tratada continha
tiossulfato de sódio a 10% (BRASIL, 2013).
Para as análises físico-químicas, também foram utilizados dois frascos de
polipropileno estéreis com capacidade 500 mL.
O transporte das amostras do local das coletas até o laboratório foi realizado sob
refrigeração, armazenadas em caixas isotérmicas identificadas. O tempo entre a coleta
da amostra no campo e o processamento em laboratório, não ultrapassou 12 horas.
4.4. Processamento das amostras de água
Para a realização do estudo, a análise das amostras de água foi dividida em duas
fases. A primeira parte foram realizadas as análises físico-químicas, microbiológicas e
parasitológicas, empregando procedimentos eletrométricos, bioquímicos e de
microscopia óptica. Estas analises foram realizadas no Laboratório de Água da
Universidade Estadual de Santa Cruz- UESC, Ilhéus -BA. Técnicas de biologia
molecular, foram realizadas na segunda parte para conferir a sensibilidade dos métodos
31
utilizados na microscopia óptica. Estas foram realizadas no Laboratório de Parasitologia
Veterinária do Hospital Veterinário da UESC.
4.4.1. Análise física – química da água
A determinação do pH da água foi realizada através do medidor de pHMB 10 de
Calibração Automática (Marte balanças e aparelhos de precisão Ltda). Para a
determinação da turbidez da água foi empregado um turbidímetro (Solar, modelo SL
2K) (Figura 5).
A B
FIGURA 5 – A: medidor de pH e B: turbidímetro. FONTE: Arquivo pessoal
4.4.2. Análise microbiológica da água
Para a contagem de Coliformes totais, foram utilizadas alíquotas de 100mL de
cada amostra de água bruta e tratada, diluídas em água peptonada tamponada no mesmo
volume. Em seguida a inoculação, a amostra foi colocada em temperatura de 37°C,
durante 3 horas. Posteriormente, foram realizadas diluições seriadas 10-¹, 10-²,10-³, em
9mL do meio lauril sulfato de triptose (LST), deixando à 35°C durante 48 horas para
observar turbidez e produção de gás (Figura 6). Após a detecção de crescimento neste
meio, as amostras foram inoculadas com auxílio de alça de platina de 2-3mm diâmetro
e calibre 24 – 26, em caldo verde brilhante (CVB) e posteriormente em caldo
32
Escherichia coli (CEC) em banho-maria, durante 48 horas, nas temperaturas de 37°C e
45°C, respectivamente (BRANDÃO et al., 2012).
A B C
FIGURA 6 - Após constatado crescimento bacteriano em LST (A), as amostras eram
inoculadas nos meios CVB (B) e, posteriormente CEC (C). FONTE: Arquivo pessoal
4.4.3. Análise parasitológica da água
4.4.3.1. Filtração e Eluição
Para pesquisa de oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp.as
amostras inicialmente foram filtradas em membranas de ésteres de celulose, com 47 mm
de diâmetro e porosidade nominal de 3,0 μm. A filtração ocorreu com bomba de pressão,
em um fluxo de filtração aproximado de 4 litros por minuto, sendo as membranas
trocadas a cada 250 mL, aproximadamente, (Figura 7). Após a filtração, as membranas
eram retiradas da bomba com o auxílio de uma pinça e colocada em uma placa de Petri
e identificada. A eluição por extração mecânica acontece com a raspagem e lavagem da
superfície da membrana. Neste caso foi acrescentado 1 ml de solução de eluição (1 ml
de Tween 80 e 1000 ml de água destilada) e feita a raspagem com o auxílio de alças
plásticas durante 20 minutos. Todo líquido resultante desta etapa foi recolhido em um
tubo de centrifuga com volume de 12 - 15 ml (Figura 8) e centrifugado a 1500xg durante
15 minutos. Posteriormente se desprezou o sobrenadante, deixando 3 ml de sedimento
33
no tubo da centrifuga, ressuspendeu o sedimento com pipeta de Pasteur e completa o
volume com 15 ml de água destilada e repetiu a centrifugação nas mesmas condições.
Em seguida, retirou-se o sobrenadante, ressuspendeu-se o pellet com 1 ml de água
destilada e armazenou-se em microtubos previamente identificados (FRANCO e
BRANCO, 2015).
A B FIGURA 7- Itens utilizados na etapa de filtração em membranas: A - Bomba de pressão e porta
filtro; B - Membranas de ésteres de celulose, com 47 mm de diâmetro e porosidade nominal de
3,0 μm. FONTE: Arquivo pessoal
A B FIGURA 8 – A: Membrana esquerda antes da raspagem; direita após a raspagem. B: Sedimento
recuperado após lavagem das membranas. FONTE: Arquivo pessoal
34
4.4.3.2. Reação de Imunofluorescência Direta (RID)
Para visualização e quantificação dos protozoários a técnica usada foi a Reação
de Imunofluorescência Direta (RID), para tanto, foi utilização o kit comercial Merifluor
(Meridian Bioscience) para a detecção simultânea de Cryptosporidium / Giardia
conforme as instruções do fabricante (Figura 9).
FIGURA 9 - kit comercial Merifluor para a detecção
simultânea de Cryptosporidium / Giardia. FONTE: Arquivo pessoal
Inicialmente alíquotas de 10 ul da suspensão do controle positivo e controle
negativo e da amostra de água a ser analisada, foram distribuídas em cada poço da
lâmina de Imunofluorescência de forma homogênea (Figura 10). Posteriormente as
lâminas foram secas em temperatura ambiente por 30 minutos. Após uma gota do
reagente de detecção e uma gota do contraste foi distribuída em cada poço, misturados
e foram bem distribuídos por todo poço da lamina com o auxílio de um aplicador.
35
As lâminas então foram incubadas em câmara úmida durante 30 minutos em
temperatura ambiente e logo após esse período o excesso dos reagentes foi removido
com o auxílio da solução tampão disponibilizada no kit. Uma gota do meio de montagem
foi distribuída em cada poço e posteriormente lamínulas foram aplicadas.
As lâminas então foram examinadas em microscópio de epifluorescência
Olympus BX51, equipado com um sistema simultâneo de Contraste Interferêncial
Diferencial (DIC), com ampliação de 100-200X. Este sistema foi utilizado na
observação do campo claro de luz transmitida para separar e recombinar trajetos, dando
a espécie uma aparência tridimensional.
Foram consideradas como positivas as amostras que tinham um tamanho e
formato compatíveis: cistos de Giardia spp entre 8-18 μm em tamanho e forma oval e
oocistos de Cryptosporidium spp entre 4 - 6 μm em tamanho e uma forma esférica. A
intensidade de fluorescência em cor verde-maçã brilhante, sendo dominante na parede
dos cistos e oocistos (REDLINGER et al., 2002).
O uso do Contraste Interferencial Diferencial, permitiu visualizar detalhes da
imagem, levando em consideração critérios de positividade das amostras: tamanho e
formato dos cistos e oocistos presentes na amostra controle e presença de sutura nos
oocistos; visualização das características morfológicas como, número e presença de
esporozoítos nos oocistos e axonemas, corpos medianos e núcleos para cistos (USEPA,
2012).
FIGURA 10 - Preparação das lâminas de
microscopia no método de Imunofluorescência. FONTE: Arquivo pessoal
36
4.4.3.3. Quantificação dos oocistos ou cistos nas amostras
Para estimar o número de cistos ou oocistos por litro (x) nas amostras analisadas,
uma fórmula proposta por Franco e Branco (2015) foi utilizada.
X = Número de organismos/litro
Onde:
X= {Nº DE OO/CISTOS visual.}
x {VOL. PELLET OBTIDO ml}
VOL. PELLET/WELL ul VOL. AMOSTRA FILTR. L
4.5. Análises Moleculares
4.5.1. Extração de DNA
Para extração de DNA genômico, foi utilizado Kit DNA Stool Mini Kit, Qiagen,
EUA (QIAGENTM) e adaptado de acordo com Greca (2010) e Ribeiro (2013). Após a
adição de 1,4ml do tampão de lise (ASL), as amostras passaram por um choque térmico
com 5 ciclos de aquecimento (96ºC) por 3 minutos e 5 ciclos de resfriamento (-196ºC)
por 5 minutos. Logo após as amostras foram agitadas em um vórtex por cinco minutos
com 0,25g de pérolas de vidro (0,5mm). A finalidade dessa fase é romper a parede dos
protozoários e melhorar a ação do Kit. Em seguida a vortequização, as amostras foram
aquecidas por cinco minutos a 96°C e em seguida homogeneizada no Vortex por 15
segundos; logo apos foi centrifugada em velocidade máxima durante 1 minuto para
formação do pellet.
Após essas etapas, foi pipetado 1,2 mL do sobrenadante para um tubo de 2mL da
microcentrífuga e o pellet foi descartado. Foram colocados aos tubos 1 Tablete de
InhibitEX e posteriormente homogeneizou-se no vortex por 1 minuto ou até que o
Tablete fosse completamente suspenso.
37
Em seguida os tubos foram incubados por 1 minuto em temperatura ambiente e
centrifugadas com velocidade máxima por 3 minutos, para que ocorra absorção dos
inibidores e para que os pellets dos inibidores fossem ligados a inhibitex matriz.
Novamente foi pipetado todo o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de
1,5mL e o pellet descartado. As amostras foram então centrifugadas a velocidade
máxima por 3 minutos.
Depois dessa fase, foi pipetado 15µL da proteinase K em um novo tubo de
microcentrífuga de 1,5 mL, em seguida acrescentado mais 200µL do sobrenadante da
etapa anterior. Após os tubos foram completados com 200µL de tampão AL,
homogeneizados no Vortex por 15 segundos e em seguida incubadas a 70ºC por 10
minutos, sendo adicionado 200µL de álcool absoluto e misturados em um vortex
posteriormente.
Tubos de QIAamp foram identificados e em seguida o lisado foi colocado na
coluna despin QIAamp. Após, foram centrifugadas em velocidade máxima durante um
minuto. O material resultante da centrifugação foi posto em um novo tubo de 2 ml. Em
seguida foi adicionado 500µL da solução tampão AW1 a coluna QIAamp e novamente
foi centrifugada em velocidade máxima por um minuto.
A coluna QIAamp foi colocada em um novo tubo de 2 ml e em seguida
adicionado 500µL de solução tampão AW2. Em seguida foi centrifugada novamente em
velocidade máxima por 3 minutos e após o tubo de coleta contendo o filtrado foi
descartado. Então a coluna rodada QIAamp foi transferida para um novo tubo de
microcentrífuga e identificado.
Foram então pipetados 30µL da solução tampão AE sobre a membrana
do QIAamp. Em seguida QIAamp foi incubado por um minuto à temperatura ambiente
e após foi centrifugado a velocidade máxima durante 2 minutos. O material eluído foi
armazenado no freezer a – 20 °C.
38
4.5.2. Reação em Cadeia da Polimerase para detecção de DNA de
Cryptosporidium spp.
Nested-PCR foi realizado para detectar a presença de Cryptosporidium spp. Para
a amplificação de DNA de Cryptosporidium spp. foi realizada a reação em cadeia da
polimerase (PCR) do gene 18S rRNA. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados foram
Cry-P1 (5'-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3') e Cry-P2 (5'-
CCCTAATCCTTCGAAACAGGA-3'), que amplificou o produto em 1325 pb. (XIAO
et al., 1999). Os segundos iniciadores de reação foram Cry-P3 (5'-
GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3') e Cry-P4 (5'-
AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3'), que amplificou o fragmento entre 819-825bp
(XIAO et al., 1999).
Para condições de amplificação empregadas na reação foram utilizadas na
preparação de 50μL de solução: 5,0μL de tampão, 1,5 μL MgCl2, 1,0 μL de dNTP,0,5U
de Taq Platinum DNA polimerase, 1,0 μL de cada oligonucleotídeo e 3,0μL de DNA
alvo, tanto para reação primária quanto para secundaria (XIAO et al., 1999).
As amostras foram submetidas à desnaturação inicial a 94ºC por três minutos,
seguida de 35 ciclos, cada um constituindo em desnaturação a 94ºC por 45 segundos,
55ºC por 45 segundos de anelamento e 72ºC por 1 minuto de extensão, com extensão
final a 72ºC por sete minutos.
A identificação dos produtos das reações foi feita por eletroforese em gel de
agarose a 1,5%, utilizando-se 60 W por 40 minutos. Após a eletroforese, o gel de agarose
foi corado com 5 μL de Safe DNA gel stain (Invitrogen) e posteriormente visualizado
em um transluminador (Loccus).
4.5.3. Reação em Cadeia da Polimerase para detecção de DNA de Giardia
spp.
Nested-PCR foi realizado para detectar a presença de Giardia spp. Para
amplificação do DNA de Giardia spp. foi utilizado um par de oligonucleotídeos
iniciadores Gia-P1 (5'-AAGTGTGGTGCAGACGGACTC-3') e Gia-P2 (5'-
39
CTGCTGCCGTCCTTGGATGT-3'), que permitiu à amplificação do gene 16S rRNA,
gerando um produto de 497 pares de base (APPELBEE et al., 2003). Um segundo par
de oligonucleotídeos iniciadores foram utilizados, Gia-P3 (5'-
CATCCGGTCGATCCTGCC-3') e Gia-P4 (5'-
GTCGAACCCTGATTCTCCGCCAGG-3'), amplificando o fragmento com tamanho
entre 292 a 297 pb (HOPKINS et al., 1997).
Para condições de amplificação empregadas na reação foram utilizadas na
preparação de 50μL de solução: 6,0μL de tampão, 3,0μL MgCl2, 2,4 μL de dNTP,0,25U
de Taq Platinum DNA polimerase, 1,2 μL de cada oligonucleotídeo e 3,0μL de DNA
alvo, tanto para reação primária quanto para secundaria (APPELBEE et al., 2003).
As amostras foram submetidas à desnaturação inicial a 96ºC por quatro minutos,
seguida de 35 ciclos, cada um constituindo em desnaturação a 96ºC por 45 segundos,
55ºC por 30 segundos de anelamento e 72ºC por 45 segundos de extensão, com extensão
final a 72ºC por quatro minutos (APPELBEE et al., 2003).
A identificação dos produtos das reações foi feita por eletroforese em gel de
agarose a 1,5%, utilizando-se uma voltagem de 60 por 40 minutos. Após a eletroforese,
o gel de agarose foi corado com 5 μL de Safe DNA gel stain (Invitrogen) e
posteriormente visualizado em um transluminador (Loccus).
Para cada reação de PCR foi utilizado um controle positivo, que foi extraído de
amostras de fezes sabidamente positivas e um controle negativo utilizando água ultra
pura.
4.6. Parâmetro climático
Dados relacionados a ocorrência de chuva nas 48 horas que antecederam as
coletas, foram registrados para correlacionar os resultados das analise físico- química e
microbiológica das amostras de água bruta e tratada, com a presença do oocistos e cistos
dos protozoários estudados (BRASIL,2017).
40
4.7. Análises dos dados
Neste estudo para verificar a ocorrência de Cryptosporidium spp., e Giardia spp.,
Coliformes fecais e E. coli de acordo com o tratamento da água, foi utilizado o teste
Exato de Fisher. O Coeficiente de Correlação de Pearson (r), foi utilizado para verificar
correlação entre variáveis quantitativas, nesse caso, pH e turbidez; a correlação varia
entre 0 e 1, onde r = 0 é fraca associação e r = 1 é uma forte associação. O pacote
estatístico utilizado foi Epi Info 7.2.0.1(SAMPAIO, 1998).
41
5. RESULTADOS
5.1. Análises físico – química da água
As amostras de água bruta (AB) tiveram um pH menor e uma turbidez mais
elevada que da água tratada (AT), com uma média de pH 4,9 ± 1,55 (AB) e 5,4 ± 1,06
(AT) e uma turbidez média de 10,9 ± 8,62 (AB) e 5,9 ± 2,87 (AT) (Tabela 1).
Os maiores valores de turbidez e pH foram apresentados nas datas com ausência
de chuva nas 48 horas que antecederam as coletas (Tabela 1).
TABELA 01: Análises físico–químicas (pH e turbidez da água) realizadas nas amostras
de água bruta e tratada coletadas em Canavieiras, BA em 2016.
Nº Data da coleta Chuva 48h. PH Turbidez (UT)
A. B. A. T A. B. A. T.
1 17/03/2016 Sim 3,82 4,23 5,46 3,92
2 28/03/2016 Sim 3,44 4,02 4,32 3,45
3 07/04/2016 Não 8,62 4,58 18,9 3,43
4 28/04/2016 Não 6,2 7 10,8 14,9
5 05/05/2016 Sim 5,61 3,9 9,6 6,07
6 19/05/2016 Sim 4,1 5,65 7.91 10,4
7 12/06/2016 Sim 6,44 7,03 12,6 6,29
8 30/06/2016 Sim 3,77 4,57 6,48 4,61
9 10/07/2016 Sim 3,53 5,52 37 4,07
10 24/07/2016 Sim 3,6 5,72 3,82 4,27
11 11/08/2016 Não 3,82 5,68 22,5 9,13
12 31/08/2016 Sim 4,48 6,15 8,9 2,91
13 18/09/2016 Sim 6,21 6,73 5,3 7,76
14 30/09/2016 Sim 3,34 6,37 4,35 5,93
15 17/10/2016 Sim 2,51 5,01 13,5 3,64
16 31/10/2016 Não 5,79 6,12 6,83 6,48
17 10/11/2016 Sim 6,28 4,64 20,4 5,09
18 21/11/2016 Não 4,3 4,42 10,6 5,02
19 08/12/2016 Não 5,6 4,52 6,62 4,85
20 18/12/2016 Sim 6,89 7,04 6,93 6,28
MÉDIAS 4,95 5,44 10,94 5,92
Legenda: P= Positivo, N= Negativo; AB = Água Bruta; AT = Água Tratada; UT= Unidade de turbidez
42
5.2. Análises microbiológica
A presença de Coliformes totais foi detectada em 80% (16/20) de água bruta e
em 5% (01/20) de água tratada. A presença de coliformes termotolerantes foi detectada
em 75% (15/20) de água bruta e foi ausente em água tratada. Não ocorreu nenhuma
relação do parâmetro climático com presença de Coliformes totais e Coliformes
termotolerantes (Tabela 2).
TABELA 02: Análise microbiológica de coliformes totais e coliformes termotolerantes
realizadas nas amostras de água bruta e tratada coletadas em Canavieiras, BA
em 2016.
Nº Data da coleta Chuva 48h. Coliformes totais
Coliformes
termotolerantes
A. B. A. T A. B. A. T.
1 17/03/2016 Sim P A P A
2 28/03/2016 Sim P A P A
3 07/04/2016 Não P A P A
4 28/04/2016 Não A A A A
5 05/05/2016 Sim A A A A
6 19/05/2016 Sim A A A A
7 12/06/2016 Sim P A P A
8 30/06/2016 Sim A A A A
9 10/07/2016 Sim P A P A
10 24/07/2016 Sim P A A A
11 11/08/2016 Não P A P A
12 31/08/2016 Sim P A P A
13 18/09/2016 Sim P A P A
14 30/09/2016 Sim P P P A
15 17/10/2016 Sim P A P A
16 31/10/2016 Não P A P A
17 10/11/2016 Sim P A P A
18 21/11/2016 Não P A P A
19 08/12/2016 Não P A P A
20 18/12/2016 Sim P A P A
Legenda: P= Presença, A= Ausência; AB = Água Bruta; AT = Água Tratada;
43
5.3. Identificação de Cryptosporidium e Giardia pela Imunofluorescência
direta
Analisando os resultados da imunofluorescência direta, foi detectado a presença
de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em amostras de água bruta e em amostras de
água tratada. Cryptosporidium spp. foi detectado em 30% (06/20) das amostras de água
bruta e 5% (01/20) das amostras de água tratada. Giardia spp. foi detectada em 50%
(10/20) das amostras de água bruta e 20% (04/20) das amostras de água tratada (Tabela
3). Para Cryptosporidium spp. as concentrações foram de 0,04 oocistos por litro em água
tratada e 0,6 em água bruta. Giardia foram registradas concentrações de 0,05 cisto por
litro em água tratada e 1,1 por litro em água bruta.
Tabela 03: Análise da Reação de imunofluorescência direta em amostras de água bruta e água
tratada no município de Canavieiras, BA em 2016.
Nº Data da coleta Chuva 48h. Cryptosporidium Giardia
A. B. A. T A. B. A. T.
1 17/03/2016 Sim A A P A
2 28/03/2016 Sim P A P A
3 07/04/2016 Não P A P A
4 28/04/2016 Não A A P P
5 05/05/2016 Sim A A A A
6 19/05/2016 Sim P A P P
7 12/06/2016 Sim P A P A
8 30/06/2016 Sim A A A A
9 10/07/2016 Sim A A A A
10 24/07/2016 Sim A A A A
11 11/08/2016 Não P A A A
12 31/08/2016 Sim P A P P
13 18/09/2016 Sim A A P A
14 30/09/2016 Sim A A A A
15 17/10/2016 Sim A P P A
16 31/10/2016 Não A A P P
17 10/11/2016 Sim A A A A
18 21/11/2016 Não A A A A
19 08/12/2016 Não A A A A
20 18/12/2016 Sim A A A A
Legenda: P= Presença, A= Ausência
44
Os oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia visualizados nas amostras
positivas atenderam aos critérios de positividade quanto a fluorescência, forma, tamanho
e contraste de fases (Figura 11).
5.4. Identificação de Cryptosporidium e Giardia pela Nested- PCR
Das 40 amostras submetidas à Nested PCR, 10% (02/20) foram consideradas
positivas para C. parvum em água bruta e nenhuma amostra em água tratada (Figura
12). Para G. duodenalis, 20% (04/20) foram consideradas positivas, tanto em água bruta
quanto em água tratada (Figura 13) (Tabela 4).
FIGURA 11: A – Cisto de Giardia spp.; B -
Oocisto de Cryptosporidium spp /RID/ Amostra
controle positivo – (20X).
45
Tabela 04: Análise da Nested PCR em amostras de água bruta e água tratada no município de
Canavieiras, BA em 2016.
Nº Data da coleta Cryptosporidium Giardia
A. B. A. T A. B. A. T.
1 17/03/2016 N N P N
2 28/03/2016 N N N N
3 07/04/2016 N N P N
4 28/04/2016 N N N P
5 05/05/2016 N N P N
6 19/05/2016 P N P N
7 12/06/2016 N N N P
8 30/06/2016 P N N N
9 10/07/2016 N N N N
10 24/07/2016 N N N P
11 11/08/2016 N N N P
12 31/08/2016 N N N N
13 18/09/2016 N N N N
14 30/09/2016 N N N N
15 17/10/2016 N N N N
16 31/10/2016 N N N N
17 10/11/2016 N N N N
18 21/11/2016 N N N N
19 08/12/2016 N N N N
20 18/12/2016 N N N N
Legenda: P= Positivo, N= Negativo
46
Foram encontradas correlações entre pH e turbidez em água bruta (r= 0,06 >
correlação fraca) e entre pH e turbidez em água tratada (r= 0,5 > Correlação moderada).
FIGURA 12 - Cryptosporidium:
fragmento de DNA correspondente ao
gene rRNA 18S por Nested/PCR,
fotodocumentado em gel de agarose a 1%
com sybr safe. (M) Marcador Molecular;
(N) Controle negativo; 1 e 2 - fragmentos
amplificados de 825 pb.
FIGURA 13- Giardia: fragmento de DNA correspondente
ao gene rRNA 16S por Nested/PCR, fotodocumentado em
gel de agarose a 1% com sybr safe. (M) Marcador
Molecular; (N) Controle negativo; 1 a 8 - fragmentos
amplificados de 297 pb.
47
Quanto a contaminação bacteriana e parasitária e o tipo de água, houve uma
diferença significativa entre a presença de coliformes fecais e E. coli na água bruta que
na água tratada. Não houve alteração significativa para ocorrência de Cryptosporidium
spp. e Giardia spp., de acordo com o tipo de água (Tabela 05).
Tabela 05. Ocorrência de Cryptosporidium spp., Giardia spp., Coliformes totais e E.
coli de acordo com o tratamento da água no município de Canavieiras, BA
em 2016.
Água Bruta Água Tratada
% (Positivo/Total) % (Positivo/Total)
Cryptosporidium spp. 30,0 (6/20) 5,0 (1/20)
Valor de p 0,09
OR 8,14
IC 95% 0,87 - 75,47
Giardia spp. 50,0 (10/20) 20,0 (4/20)
Valor de p 0,95
OR 4
IC 95% 0.98 - 16,27
Coliformes totais 80,0 (16/20) 5,0 (1/20)
Valor de p 0.000002*
OR 76
IC 95% 7,69-750,4
E. coli 75,0 (15/20) 0 (0/20)
Valor de p 0.0000007*
OR Indefinido
IC 95% NA
OR: chances de ocorrer (odds ratio); IC 95%: intervalo de confiança de 95%. Valor de p para o nível
de significância (α) de 5% pelo teste exato de Fisher não se aplica; *Estatisticamente significativo.
48
6. DISCUSSÃO
A pesquisa de ocorrência de Cryptosporidium e Giardia em amostras de águas
superficiais de mananciais e em fontes de abastecimento de água tem sido relatada em
diferentes regiões ao redor do mundo. A qualidade da água usada para consumo humano,
seja para beber ou na preparação de alimentos deve ser elemento de maior e mais rígido
controle de qualidade, pois está relacionada a adequadas condições de saúde e
diminuição da taxa de mortalidade infantil (REBOUÇAS, 2002; BRANCO, 2015).
Cryptosporidium e Giardia, oferecem difícil identificação e enumeração com
precisão pelas técnicas empregadas rotineiramente, assim como a maioria dos agentes
veiculados por água. A dificuldade procede, das baixas concentrações das formas
infectantes encontradas na água. Entretanto, elevar a sensibilidade é possível,
aumentando o número de coletas e de amostras (FERNANDES, 2013), e utilizando mais
de uma técnica de diagnóstico. Neste estudo foi utilizado a reação de
imunofluorescência direta, que apresenta uma alta sensibilidade e especificidade
(ARROWOOD e STERLING, 1989) com técnicas moleculares (ADAMSKA, 2015;
EHSAN et al., 2015; GALLAS-LINDEMANN et al., 2016; MARANGI, 2015) também
bastante utilizadas para esses protozoários.
Com o uso da imunofluorescência direta, foi possível detectar Giardia em 50%
em água bruta e 20% em água tratada. Esses resultados foram semelhantes aos
encontrados por OLIVEIRA (2005); SATO et al. (2013) e BRANCO (2015) e
divergente ao de COSTA et al. (2007). Cryptosporidium foi detectado em 30% das
amostras de água bruta e 5% das amostras de água tratada. Esses resultados foram
semelhantes aos encontrados por FRANCO et al. (2001); DIAS et al. (2008) e divergente
ao de CARTUSIO NETO e FRANCO (2004).
A contaminação alta proveniente da água bruta pode ser devido à falta ou a não
utilização de instalações sanitárias da população ribeirinha, na forma de preservação
desse manancial ou na presença de animais de criação e selvagens na região. Ambos
protozoários são resistentes aos tratamentos convencionais utilizados nas estações de
tratamento de água, o que pode justificar a contaminação na água tratada (KARANIS et
al., 2007).
49
O monitoramento de água bruta deve ser um indispensável instrumento para o
controle de qualidade e monitoramento da água tratada, pois elevadas concentrações de
Cryptosporidium e de Giardia em amostras de água bruta foram relacionadas com altas
concentrações ou repetidas detecções na água tratada (HELLER et al., 2004).
O tratamento adequado da água captada dos mananciais e controle efetivo da
água tratada por intermédio da realização de exames físico químicos e microbiológico,
são exigências estabelecidas pela legislação. Determinação do pH é um elemento
essencial no controle da decomposição e no tratamento dos esgotos e despejos
industriais (BRASIL, 2014). A turbidez é um parâmetro de aceitação ou rejeição do
produto pela presença de material em suspensão na água. As partículas de turbidez
conduzem matéria orgânica concentrada que podem originar sabor e odor. (BRASIL,
2011).
Os resultados das análises físico-químicas realizadas nas amostras de águas do
município de Canavieiras apresentaram média do parâmetro pH em 4,9 para água bruta
e 5,4 para água tratada, as quais não estão de acordo com a Portaria nº 2.914/2011, que
recomenda uma faixa de 6,0 a 9,5. As médias de turbidez apresentaram-se superiores ao
estabelecido na portaria, onde o limite máximo para qualquer amostra pontual deve ser
de 5,0 uT. As médias na água bruta e água tratada foram 10,9 e 5,9, respectivamente
(BRASIL, 2011).
A presença de turbidez elevada no manancial, pode ter sido provocada por algas,
areia, argila, detritos orgânicos, despejos domésticos e pela ausência de chuva (BRASIL,
2014), pois os maiores valores de turbidez foram apresentados nas datas com ausência
de chuva nas 48 horas que antecederam as coletas.
Os parâmetros físico-químicos podem ser relacionados com a deterioração da
qualidade da água, Kumar et al, (2016) encontraram correlação positiva entre esses
parâmetros com a presença de Cryptosporidium e Giardia. Porém, Stancari e Correia
(2010) não conseguiram associar alterações nos parâmetros físico-químcos com a
ocorrências dos protozoários.
O controle da qualidade microbiológica é monitorado pela verificação da
presença/ausência de bactérias do grupo coliformes totais e termotolerantes
(CARTUSIO NETO e FRANCO, 2004). O grupo dos coliformes totais compreende
50
bactérias que não são apenas de origem fecal, podendo decorrer da água, do solo e das
plantas, (OMS, 1995). A presença de coliformes termotolerantes, que tem como sua
principal representante a Escherichia coli, é um importante indicador de contaminação,
seja em água bruta ou tratada.
As análises microbiológicas mostraram que 80% das amostras de água bruta
não atendem a legislação. Da mesma forma, em 75% das amostras de água bruta foram
encontrados coliformes termotolerantes, indicando contaminação fecal. Na água tratada
a presença de Coliformes totais foi detectada em 5% das amostras coletadas e a presença
de coliformes termotolerantes não foram detectadas. Com o resultado positivo para
coliformes totais, de acordo com a legislação em vigor, ações corretivas devem ser
adotadas no controle da qualidade da água.
Os altos índices de indicadores bacteriólogos de origem fecal no presente
estudo, confirmam a contaminação da água bruta por esgotos sanitários ou fezes de
animal. Este resultado pode estar sofrendo influência dos efluentes da estação de
tratamento de esgoto, através das alterações de maré e também as questões sanitárias já
comentadas.
Indicadores bacteriológicos de contaminação fecal, foram detectadas em um
estudo de Ehsan (2015), em todas as amostras de água bruta; e em amostras de água
tratada apresentou números mais baixos (3/63). Neste trabalho não foi observada uma
correlação significativa entre as concentrações de indicadores e a presença dos
protozoários.
No resultado das amostras submetidas à Nested-PCR, foi possível detectar G.
duodenalis em 20% em água bruta e 20% em água tratada. C. parvum foi detectado em
10% em água bruta. Esses resultados foram semelhantes ao de Almeida et al. (2015),
que encontraram C. parvum e de G. duodenalis, utilizando a técnica de
Imunofluorescência Direta e de Nested-PCR, em amostras de água no Paraná.
Gallas-Lindemann et al. (2016), apresentaram um trabalho comparativo para
detecção Giardia e Cryptosporidium em água, utilizando, além da Imunofluorescência
Direta e Nested-PCR, à Amplificação Isotérmica. De acordo com os dados apresentados,
os métodos de detecção são complementares para o monitoramento dos protozoários em
águas ambientais.
51
Analisando as técnicas empregadas nesse estudo para detecção dos
protozoários, ambas apresentaram positividade para Giardia em três amostras de água
bruta e uma amostra de água tratada e para Cryptosporidium, em uma amostra de água
bruta.
As técnicas empregadas para identificação de oocistos de Cryptosporidium e
cistos de Giardia, neste estudo em amostras de água, foram eficientes na detecção dos
protozoários. No diagnóstico microscópico, os oocistos e cistos detectados nas amostras
positivas atenderam aos critérios de positividade quanto à cor e intensidade de
fluorescência, tamanho e forma. No que diz respeito aos métodos moleculares, os
benefícios estão na ótima sensibilidade e especificidade, na oportunidade de realizar um
estudo com um volume grande de amostras e na rapidez de seus resultados
(THOMPSON, 2004).
Desta forma, não há um método padrão para a detecção dos protozoários
pesquisados. A escolha da técnica adequada que será utilizada, deve levar em
consideração alguns fatores importantes, como as características e volume da água que
será analisada, a viabilidade na aplicação das metodologias de coleta, procedimentos e
identificação do material no laboratório (APHA,2005).
52
7. CONCLUSÃO
As informações aqui descritas representam a primeira avaliação sobre a presença
dos protozoários Cryptosporidium e Giardia em água bruta e água tratada do
Estado da Bahia.
Os parâmetros físico-químicos e microbiológico podem ser utilizados para obter
dados sobre a qualidade da água e como isso associar com a presença de oocistos
e cistos.
A ocorrência de C. parvum e G. duodenalis em amostras de água no município
de Canavieiras podem resultar em risco de transmissão de doenças zoonóticas na
região.
53
8. REFERÊNCIAS
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