Embed Size (px)
Citation preview
Universidade Federal de Sergipe – UFS
Pró-reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Atividade amebicida do óleo essencial de plantas do gênero Lippia (VERBENACEAE) frente a trofozoítos de
Acanthamoeba polyphaga
Israel Gomes de Amorim Santos
São Cristóvão/SE 2014
i
Israel Gomes de Amorim Santos
Atividade amebicida do óleo essencial de plantas do gênero Lippia (VERBENACEAE) frente a trofozoítos de
Acanthamoeba polyphaga
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária – PROBP, da área de Ciências Biológicas, sob orientação do Prof. Dr. Silvio Santana Dolabella.
São Cristóvão/SE 2014
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S237a
Santos, Israel Gomes de Amorim Atividade amebicida do óleo essencial de plantas do gênero
Lippia (Verbenaceae) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga / Israel Gomes de Amorim Santos ; orientador Silvio Santana Dolabella. – São Cristóvão, 2014.
42 f. : il.
Dissertação (mestrado em Biologia Parasitária)– Universidade Federal de Sergipe, 2014.
1. Acanthamoeba. 2. Plantas medicinais. 3. Óleos essenciais. 4. Lippia. I. Dolabella, Silvio Santana, orient. II. Título.
CDU 615.283.21
ii
Israel Gomes de Amorim Santos
Atividade amebicida do óleo essencial de plantas do gênero Lippia (VERBENACEAE) frente a trofozoítos de
Acanthamoeba polyphaga
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária pelo Programa de
Pós-Graduação em Biologia Parasitária – PROBP, da área de Ciências Biológicas.
Aprovado em 09 de maio de 2014
______________________________________________ Prof. Dr. Sílvio Santana Dolabella
Orientador – Universidade Federal de Sergipe
_______________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Scher
Universidade Federal de Sergipe
_______________________________________________
Prof. Dr. Evander de Jesus Oliveira Batista
Universidade Federal do Pará
São Cristóvão/SE 2014
iii
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação primeiramente a Deus por ter me dado coragem e aptidão para
os estudos.
Aos meus pais por terem me dado a oportunidade de freqüentar a escola e terem
cuidado tão bem de mim.
A minha nova família que a cada dia que passa me impulsiona a prosseguir com a
minha qualificação profissional.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para que eu chegasse a esse dia com
êxito.
iv
AGRADECIMENTOS
Aos meus familiares, pai, mãe, irmãos pela força dada durante toda a minha vida,
sobretudo durante os dois anos de mestrado.
A minha esposa Janadí da Conceição Silva Amorim por ter conseguido entender a
minha ausência durante o período em que passei distante; e por ter conseguido cuidar
tão bem do nosso pequeno Fernando Gabriel. A única frase de agradecimento que pode
sair de minha boca neste momento é EU TE AMO!
Ao meu grande orientador Prof. Silvio por ter aceitado me orientar durante essa jornada
e sem o qual eu jamais teria conseguido está nesse momento escrevendo estas palavras.
Muito obrigado PROFESSOR, serei eternamente grato a você!
A todos os professores do PROBP que me oportunizaram conhecimentos novos e
extremamente relevantes para os meus propósitos profissionais.
A minha colega de curso e de orientador Mariana pelos conselhos, ajuda e
descontrações; tenha certeza que este mestrado não teria sido o mesmo sem você, muito
obrigado por tudo!
A Ana Mércia pelas palavras amigas dadas no momento certo e na hora certa. Você
pode contar sempre comigo.
A Alda, Tiago, Ana Nery, Katily, Alan, Aline e Mônica por todos os momentos
agradáveis que passamos durante as aulas e os seus intervalos.
Ao pessoal da república onde morei por terem me acolhido na chegada à cidade.
Ao grupo do Cine Trash que me ensinaram uma forma diferente e divertida de se
assistir filmes.
Aos amigos do LEPAT pela companhia e colaboração.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a concretização deste sonho.
OBRIGADO A TODOS!
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Microsccopia de luz e eletrônica de trofozoítos e cistos de Acanthamoeba
3
Figura 2. Encefalite amebiana granulomatosa, apresentando necrose cortical e
subcortical
5
Figura 3. Ceratite amebiana ocasionada por Acanthamoeba sp.
5
Figura 4. Aspecto botânico de Lippia gracilis: folhas e flores
8
Figura 5. Aspecto botânico de Lippia Alba
9
Figura 6. Aspecto botânico de Lippia sidoides: folhas e flores
10
Figura 7. Aspecto botânico de L. pedunculosa: folhas e flores 11
vi
SANTOS, I. G. A. Atividade amebicida de espécies de Lippia (Verbenaceae) frente
a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. (Dissertação de mestrado apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária), 2014.
RESUMO
A ceratite amebiana e a encefalite amebiana granulomatosa são doenças causadas por
amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba. No caso da ceratite, o grande problema
é a recidiva da doença devido à resistência, especialmente da forma cística do
organismo, aos medicamentos utilizados. Óleos essenciais de plantas têm sido utilizados
como agentes potencialmente ativos contra este protista. Portanto, o objetivo deste
estudo foi determinar a atividade amebicida de óleos essenciais de plantas do gênero
Lippia frente à trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Para isto 8 x 104
trofozoítos
foram expostos durante 24 horas a concentrações crescentes dos óleos essenciais de
Lippia sidoides, Lippia gracilis, Lippia alba e Lippia pedunculosa, bem como de seus
compostos majoritários rotundifolona, carvona e carvacrol. Praticamente todas as
concentrações dos óleos e compostos apresentaram atividade amebicida. Diante destes
resultados, os óleos pesquisados neste estudo são candidatos em potencial para a
terapêutica complementar na ceratite amebiana e encefalite amebiana granulomatosa.
Palavras-chave: Acanthamoeba polyphaga; Lippia spp.; carvacrol; carvona;
rotundifolona; atividade amebicida.
vii
SANTOS, I. G. A.; DOLABELLA, S. S. Activity amoebicide species of Lippia (Verbenaceae) against trophozoites of Acanthamoeba polyphaga. (Dissertação de mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária), 2014.
ABSTRACT
Amebic keratitis and granulomatous amebic encephalitis are diseases caused by free-living amoebas of the Acanthamoeba type. In the case of keratitis, the great problem is the relapse of this disease because of its resistance to medicines used for it, especially the cystic form of the organism. Plant essential oils have been used as potentially active agents against this protist. Therefore, the objective of this study was to determine the amebacide activity of plant essential oils of Lippia type against Acanthamoeba polyphaga trophozoites. To do this, 8 x 104
trophozoites were exposed to increased concentrations of essential oils of Lippia sidoides, Lippia gracilis, Lippia alba and Lippia pedunculosa during 24 hours, as well as of their majority compounds rotundifolona, carvone and carvacrol. Practically all the oil and compound concentrations presented amebacide activity. Based on these results, the researched oils in this study are potential candidates for a complementary healing for amebic keratitis and granulomatous amebic encephalitis.
Key-words: Acanthamoeba polyphaga; Lippia spp.; carvacrol; carvone; rotundifolona; amebacide activity.
SUMÁRIO
FOLHA DE ROSTO i
FOLHA DE APROVAÇÃO ii
DEDICATÓRIA iii
AGRADECIMENTOS iv
LISTA DE FIGURAS v
RESUMO vi
ABSTRACT vii
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO DE LITERATURA 2
2.1 Acanthamoeba 2
2.2 Patogenia e fatores de risco 4
2.3 Plantas medicinais com atividade antiparasitária 6
2.3.1 Plantas do gênero Lippia 7
2.3.1.1 Lippia gracilis Schauer 7
2.3.1.2 Lippia alba (Mill.) N.E.Brown 8
2.3.1.3 Lippia sidoides Cham. 9
2.3.1.4 Lippia pedunculosa 10
2.4 Óleos essenciais 11
3 JUSTIFICATIVA 13
4 OBJETIVOS 15
4.1 Geral 15
4.2 Específicos 15
REFERÊNCIAS 16
ARTIGO 1
Atividade amebicida de óleos essenciais de Lippia spp. (Verbenaceae) frente a
trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga
21
ANEXOS
Anexo A – Normas para publicação na revista Experimental Parasitology
35
1
1 INTRODUÇÃO
Amebas de vida livre (AVL) são protistas de ampla dispersão ambiental
que não necessitam de um hospedeiro em seu ciclo vital, sendo as infecções
por elas causadas consideradas acidentais ou oportunistas.
Amebas do gênero Acanthamoeba são causadoras da encefalite
amebiana granulomatosa (EAG) - uma doença do sistema nervoso central de
prognóstico quase sempre fatal, e também da ceratite amebiana, doença ocular
que começou a ganhar importância epidemiológica com o aumento do número
de usuários de lentes de contato e que, se não tratada, pode acarretar perda
da visão. Outras patologias provocadas por este gênero de amebas são
infecções de pele e pulmonar.
A busca de novas substâncias que inibam a formação do cisto ou que
sejam efetivas em eliminar os trofozoítos tem se mostrado necessária,
especialmente nos casos de ceratite amebiana, onde pacientes sofrem
recidivas devido a resistência às drogas utilizadas. O óleo essencial extraído de
diversas partes de plantas é rico em compostos com atividades biológicas, tais
como: antiparasitária, antiinflamatória, antiespasmolítica, vasorrelaxante,
antibacteriana, antifúngica, calmante e sedativo, entre outras.
Muitos compostos de plantas são responsáveis por diversas atividades
biológicas, alguns outros são produzidos sinteticamente para estas finalidades,
dada a sua importância como agente terapêutico. Dentro deste contexto
destacam-se os vegetais da família Verbenaceae, que estão distribuídas na
América Central e do Sul e apresentam diversas propriedades biológicas
comprovadas. No estado de Sergipe é comum o registro das espécies Lippia
alba, Lippia gracilis, Lippia sidoides e Lippia pedunculosa.
A ação destas plantas sobre AVL ainda não está estabelecida e
pesquisas neste sentido são importantes dado o aumento dos casos de
infecção ocular e mesmo de doenças amebianas intestinais e/ou cerebrais
ocasionadas por amebas parasitas ou de vida livre, respectivamente.
2
2 REVISÃO DE LITERATURA
As amebas de vida livre (AVL) pertencem a um extenso grupo de
protozoários ubiqüitários, sendo encontradas em diferentes tipos de solo e
água, no ar, em ar-condicionado e esgotos (MARCIANO-CABRAL e CABRAL,
2003; SALAS et al., 2006; KHAN, 2006).
Via de regra, a alimentação destas amebas se baseia em
microorganismos como bactérias, outros protozoários, algas e leveduras
(MARCIANO-CABRAL e CABRAL, 2003; KHAN, 2006), evidenciando um modo
de vida que não traz perigo para a saúde humana e de outros seres vivos.
Porém, em condições ainda não bem esclarecidas, algumas espécies de AVL
dos gêneros Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia e Sappinia podem infectar
seres humanos e outros animais e ocasionar sérias patogenias nestes
hospedeiros (MARCIANO-CABRAL e CABRAL, 2003; SALAS et al., 2006;).
2.1 Acanthamoeba
O gênero Acanthamoeba abriga espécies que podem causar a encefalite
amebiana granulomatosa (EAG) e a ceratite amebiana. As espécies do gênero
apresentam duas formas evolutivas em seu ciclo de vida, a saber: 1. o
trofozoíto, forma móvel que se alimenta e se reproduz e 2. o cisto, forma de
resistência encontrada no meio ambiente, em diversas variações de
temperatura e pH (KHAN, 2008).
Nos trofozoítos, forma ativa do parasita e que varia de 25 a 40µm,
podem ser encontradas todas as organelas de um eucarionte superior:
complexo de golgi, retículo endoplasmático, ribossomos livres, mitocôndrias,
microtúbulos, vacúolos digestivos, além de vacúolos contráteis que atuam na
osmorregulação (figura 1A). Esta forma evolutiva é composta por uma
membrana plasmática trilaminar que circunda todas as organelas
citoplasmáticas e estruturas em forma de espinho, que emergem da
membrana, denominadas de acantopódios (figura 1B) (MARCIANO-CABRAL &
CABRAL, 2003).
3
Por sua vez, o cisto é composto por dupla membrana, uma externa de
quitina e uma interna bilipídica (figuras 1C e 1D) que o diferencia em ectocisto
e endocisto. Esta forma evolutiva de Acanthamoeba varia de 13 a 20µm e
também de espécie a espécie. A formação do cisto ocorre devido a condições
adversas do ambiente, como privação de nutrientes, dessecação e mudanças
de temperatura e pH (MARCIANO-CABRAL & CABRAL, 2003).
Figura 1. Microscopia de luz (A e C) e eletrônica (B e D) de trofozoítos (A e B) e cistos (C e D) de Acanthamoeba. Em B (setas) podem ser observados os acantopódios e em D (setas) a
dupla parede do cisto. Adaptado de Marciano-Cabral e Cabral (2003).
Castellani, em 1930, detectou amebas em cultura de células eucariontes
e neste mesmo ano foi estabelecido o gênero Acanthamoeba (KHAN, 2006).
4
Durante muito tempo discutiu-se a classificação das espécies do gênero
e por cerca de três décadas desde a sua descoberta estas amebas foram
ignoradas pela comunidade científica. Por volta de 1950, as Acanthamoebas
foram redescobertas, desta vez como sendo contaminantes de culturas de
tecidos. Culbertson et al. (1958) demonstraram, pela primeira vez, que estes
organismos eram fatais por apresentarem efeito citopático em culturas de
células de macacos e por matar animais de laboratório. Apenas em 1972 e
1974 é que se identificou o primeiro caso humano de EAG e de ceratite
amebiana, respectivamente (KHAN, 2006).
As Acanthamoebas foram largamente agrupadas em 17 espécies a partir
de características como tamanho e morfologia do cisto. No entanto,
atualmente, essas amebas estão agrupadas em 12 diferentes linhagens (T1-
T12) de espécie única ou complexo de espécies baseado no seqüenciamento
do DNA ribossomal 18S. Dentro destas linhagens, as amebas da linhagem T4
são as que mais se encontram em isolados de casos de encefalite amebiana,
entre elas a Acanthamoeba castellani e Acanthamoeba polyphaga
(SCHUSTER & VISVESVARA, 2004; KHAN, 2006).
2.2 Patogenia e fatores de risco
Na encefalite amebiana granulomatosa são observados edemas,
necrose hemorrágica com irritações nas meninges e encefalite (Figura 2). Ao
microscópio são visualizados cistos de amebas, principalmente no espaço
perivascular do parênquima, indicando que os capilares cerebrais sejam a
porta de entrada das amebas no sistema nervoso central (SALAS et al., 2006;
KHAN e SIDDIQUI, 2009).
A ceratite amebiana, por sua vez, é uma infecção da superfície ocular
que pode resultar em dor intensa e ulceração da córnea (Figura 3). O uso de
lentes de contato contaminadas por Acanthamoeba e trauma da córnea
seguida pela colonização por estes protozoários constituem os principais
fatores de risco para a aquisição da doença (CLARKE e NIEDERKORH, 2006).
Da descoberta destas amebas como patógenos humanos em 1957 até o ano
5
2000 foram relatados cerca de 3000 casos mundiais de ceratite de etiologia
amebiana (CASTRILLON e OROZCO, 2013).
Figura 2. Encefalite amebiana granulomatosa, apresentando necrose cortical e subcortical. Fonte: Marciano-Cabral e Cabral (2008).
Figura 3. Ceratite amebiana ocasionada por Acanthamoeba sp. Fonte: Khan (2006)
Estudos têm demonstrado que trofozoítos patogênicos de
Acanthamoeba sp. expressam em sua membrana plasmática a proteína
ligadora de manose (MBP), responsável por grande parte do potencial
patogênico destas amebas. A MBP não é observada em cepas não
patogênicas do parasito (GARATE, 2004).
6
Em pacientes que apresentam ceratite amebiana, as espécies de
amebas comumente encontradas são A. castellani e A. polyphaga. Em muitos
destes pacientes, o grande problema é a recorrência da doença, a qual ocorre
devido à formação da forma cística do protozoário em resposta aos fármacos
utilizados na terapêutica (DART, SAW & KILVINGTON, 2009).
No geral, o tratamento das infecções causadas por amebas do gênero
Acanthamoeba é realizado com doses simples dos fármacos clorexidina,
neosporina, pentamidina, propamidina, itraconazol, polihexametileno biguanida
ou ainda a combinação de dois destes fármacos (GARATE, 2004). Sendo, em
muitos casos de ceratite amebiana, usado a biguanida tópica como a única
quimioterapia efetiva contra a forma cística do parasito (DART, SAW &
KILVINGTON, 2009).
2.3 Plantas medicinais com atividade antiparasitária
A população humana sempre teve estreita relação com os vegetais, seja
para consumo alimentar ou como fonte de princípios ativos para muitas de
suas enfermidades ou de seus animais (SILVA et al., 2013).
Dentro desta perspectiva, o uso de plantas medicinais aliada ao
tratamento convencional das diversas enfermidades parasitárias tem
aumentado significativamente nos últimos anos, sendo que os óleos essenciais
extraídos de plantas e/ou os seus princípios ativos podem ser utilizados como
forma alternativa de quimioterapia nestas morbidades (CHAGAS, 2004;
FURTADO, 2006; GITHIORI, ATHANASIADOU & THAMSBORG, 2006;
ATHANASIADOU, GUITHIORI & KYRIAZAKIS, 2007).
O Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal do mundo,
contando com mais de 55.000 mil espécies catalogadas de um total estimado
entre 350.000 e 550.000 (GUERRA & NODARI, 2007). Avalia-se que, no Brasil,
25% dos US$ 8 bilhões de faturamento da indústria farmacêutica nacional, em
1996, foram originados de medicamentos derivados de plantas (URIAS, 2006).
7
2.3.1 Plantas do gênero Lippia
Existem cerca de 200 espécies no gênero Lippia. Estas plantas são
utilizadas na medicina popular principalmente para o tratamento de desordens
respiratórias e gastrointestinais, sendo encontradas principalmente nas
Américas Central e do Sul e África (ESCOBAR et al., 2010).
2.3.1.1 Lippia gracilis Schauer
É um arbusto caducifólio, ramificado e de até dois metros de altura,
pertencente a família Verbenaceae e comum no Nordeste brasileiro, onde é
conhecida popularmente como “alecrim-da-chapada” (Figura 4). É utilizada na
medicina popular para tratar problemas respiratórios como gripes, tosse,
sinusite, bronquite, congestão nasal e também como tópico em casos de
afecções cutâneas como feridas e sarnas (LORENZI & MATOS, 2008).
Recentemente, as atividades antiinflamatória e antinociceptiva do óleo
essencial de L. gracilis foram demonstradas em um modelo murino de edema
de pata e peritonite (MENDES et al., 2010), além de ter sido comprovado,
também, efeitos leishmanicida e fungicida dos óleos e compostos majoritários
de alguns genótipos desta espécie (MELO et al., 2013).
8
2.3.1.2 Lippia alba (Mill.) N.E.Brown
É um subarbusto aromático que mede aproximadamente 1,70 metro de
altura e apresenta folhas do tipo membranosas e flores de coloração rosa
(Figura 5). É conhecida popularmente no Brasil como erva-cidreira e
amplamente distribuída desde o Sul dos Estados Unidos até a América do Sul.
A sua utilização na medicina popular se deve às propriedades calmante,
sedativa, antiespamódica e expectorante, atribuídas a seus óleos essenciais
(TAVARES, MOMENTE & NASCIMENTO, 2011).
O óleo essencial desta apresenta apresentou atividade antiparasitária
frente a epimastigotas de Trypanosoma cruzi e promastigotas de Leishmania
chagasi (ESCOBAR et al., 2010). Atividade antiviral (OCAZIONEZ, 2010) e
antimicrobiana (MESA-ARANGO et al., 2009) também já foram demonstradas
para o óleo essencial de L. alba.
Figura 4. Aspecto botânico de Lippia gracilis: folhas e flores.
FONTE: https://picasaweb.google.com/lh/photo/OVj3vUpscJ0rxsbUIolbHA
9
2.3.1.3 Lippia sidoides Cham.
É um arbusto caducifólio, com dois a três metros de altura, folhas com
forte cheiro picante e flores pequenas e esbranquiçadas (Figura 6). Conhecida
popularmente como alecrim-pimenta é uma planta muita utilizada na medicina
alternativa para tratamento de infecções da pele e membranas mucosas e
como antisséptico tópico (BOTELHO et al., 2007a; BOTELHO et al., 2007b). No
Brasil, ela é comumente encontrada na região Nordeste (MATOS, 2002 apud
GONÇALVES, 2012).
Já foi demonstrado que o óleo essencial desta planta apresenta
atividade leishmanicida (RONDON et al., 2012), tripanocida (BORGES et al.,
2012), larvicida (LIMA et al., 2013) e antimicrobiana (BOTELHO et al., 2007a).
Figura 5. Aspecto botânico de Lippia Alba. FONTE: Tavares, Momenté e Nascimento, 2011.
10
2.3.1.4 Lippia pedunculosa
É um subarbusto ou arbusto medindo entre 0,7 - 1,5 metro, folhas
decussadas, flores de cor lilás (Figura 7). No Brasil, esta espécie é encontrada
apenas nas Regiões Nordeste e Sudeste, nos estados de Alagoas, Sergipe e
São Paulo (SANTOS et al., 2009).
Figura 6. Aspecto botânico de Lippia sidoides: folhas e flores.
FONTE: http://www.geralforum.com/board/1955/502370/alecrim-pimenta.html
11
2.4 Óleos essenciais
Óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis,
lipofílicas, puramente odoríferas e líquidas. Sua principal característica é a
volatilidade. Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos, alcoóis simples,
terpinenos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos e
ácidos orgânicos até compostos com enxofre. São utilizados para fins
terapêuticos, perfumaria ou como material para síntese de outros compostos.
Enquanto agentes terapêuticos, os óleos essenciais são administrados via
inalação e oralmente, entre outras formas (EVANS, 2009).
Os óleos essenciais são obtidos principalmente por meio de destilação
por arraste a vapor. As folhas representam o principal órgão vegetal de onde se
extraem os óleos, embora outras partes como flores, cascas, rizomas e frutos
também possam ser utilizadas para este propósito (BIZZO, REZENDE &
HOVELL, 2009).
Figura 7. Aspecto botânico de L. pedunculosa: folhas e flores. Fonte: Menezes, 2012.
12
Alguns óleos essenciais já foram testados contra amebas e seu efeito
demonstrado por alguns pesquisadores (Samie et al., 2009, Sauter et al., 2011;
Vunda et al. 2012). Estes dados demonstram o potencial que alguns produtos
naturais possuem como alternativa no tratamento de doenças provocadas por
amebas sejam elas intestinais ou patógenas oportunistas.
13
3 JUSTIFICATIVA
Acanthamoeba sp. é uma ameba de vida livre encontrada amplamente
distribuída pela natureza. Muitas destas amebas já foram encontradas em
botijões de água mineral, em estações de lavagem dos olhos, em lente de
contato, no ambiente hospitalar, sobretudo em UTIs.
Enquanto ameba de vida livre, não há problemas quanto a sua ampla
dispersão. Contudo, algumas espécies são capazes de produzir em seres
humanos a encefalite amebiana granulomatosa, de prognóstico quase sempre
fatal, e a ceratite amebiana, que se não tratada pode resultar em perda da
visão.
Esta condição se tornou epidêmica a partir dos anos 70, quando o uso
de lentes de contato passou a ser frequente. Até então, casos desta doença
eram raros e, desde então, mais de 3000 casos de ceratite amebiana foram
registrados, o que a torna um problema oftálmico importante e merecedor de
investigações científicas quanto a drogas eficazes na eliminação do patógeno e
cura do paciente (SCHUSTER e VISVESVARA, 2004).
No caso da ceratite, o grande problema é a recorrência da doença, que
ocorre devido ao encistamento do trofozoíto em resposta ao medicamento
utilizado no tratamento. Portanto, a busca por novas drogas que possam evitar
esse encistamento por meio de efeito amebicida ou amebistático é de grande
necessidade e urgência.
Com este propósito, a busca por produtos naturais que possam agir em
tais funções se faz necessária, uma vez que diversas pesquisas tem
demonstrado que o óleo essencial de muitas plantas possui atividade biológica
frente a uma gama de patógenos e doenças não infecciosas humanas:
Trypanosoma cruzi, Leishmania sp., amebas intestinais, células tumorais, dor e
inflamação, entre outros.
Dentre estas plantas destaca-se o gênero Lippia, amplamente distribuído
no Nordeste e que apresentou, em trabalhos apresentados pela comunidade
científica, grande atividade biológica contra alguns patógenos e doenças não
14
infecciosas. Porém, seu potencial amebicida ainda permanece desconhecido, o
que reforça a necessidade de estudos nesta linha de pesquisa.
15
4 OBJETIVOS
4.1 Geral
Avaliar a atividade amebicida dos óleos essenciais de L. gracilis
genótipo LG110, L. alba genótipo LA57, L. sidoides genótipo LS104, L.
pedunculosa e seus componentes majoritários sobre trofozoítos de A.
polyphaga.
4.2 Específicos
Determinar a IC50 dos óleos essenciais e dos compostos majoritários de
L. gracilis LG110, L. alba LA57, L. sidoides LS104 e L. pedunculosa
sobre os trofozoítos de A. polyphaga.
Verificar a citotoxicidade dos óleos essenciais de Lippia spp. em cultura
de células de mamífero.
16
REFERÊNCIAS
ATHANASIADOU, S.; GUITHIORI, J.; KYRIAZAKIS, I. Medicinal plants for
helminthes parasite control: facts and fiction. Animal, 1(9): 1392-1400, 2007.
BIZZO, H.R.; REZENDE, C.M.; HOVELL, A.M.C. Óleos essenciais no Brasil:
aspectos gerais, desenvolvimento e perspectivas. Quím. Nova, 32(3): 588-94,
2009.
BOTELHO, M.A.; BEZERRA FILHO, J.G.; CORREA, L.L., FONSECA, S.G.;
MONTENEGRO, D.; GAPSKI, R.; BRITO, G.A.; HEUKELBACH, J. Effect of a
novel essential oil mouthrinse without alcohol on gingivitis: a double-blinded
randomized controlled trial. J. Appl. Oral Sci., 15(3): 175-180, 2007a.
BOTELHO, M.A.; NOGUEIRA, N.A.; BASTOS, G.M.; FONSECA, S.G.; LEMOS,
T.L.; MATOS, F.J.; MONTENEGRO, D.; HEUKELBACH, J.; RAO, V.S.; BRITO,
G.A. Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol
and thymol against oral pathogens. Braz. J. Med. Biol. Res., 40(3): 349-56,
2007b.
CASTRILLÓN, J.C.; OROZCO, L.P. Acanthamoeba spp. como parásitos
patógenos y oportunistas. Rev. Chil. Infectol., 30(2): 147-155, 2013.
CHAGAS, A.C.S. Controle de parasitas utilizando extratos vegetais. Rev. Bras.
Parasitol. Vet., 13(Supl. 1): 156-160, 2004.
CLARKE, D.W.; NIEDERKORN, J.Y. The pathophysiology of Acanthamoeba
keratitis. Trends Parasitol., 22(4): 175-80, 2006.
CULBERTSON, C.G.; SMITH, J.W.; MINER, J.R. Acanthamoeba observation
on animal pathogenicity. Science, 127: 1506, 1958.
DART, J.K.G.; SAW, V.P.J.; KILVINGTON, S. Acanthamoeba keratitis:
diagnosis e treatment update 2009. Am. J. Ophtalmol., 148(4): 487-99, 2009.
17
ESCOBAR, P.; LEA, S.M.; HERRERA, L.V.; MARTINEZ, J.R.; STASHENKO,
E. Chemical composition and antiprotozoal activities of Colombian Lippia spp
essential oils and their major components. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 105(2):
184-90, 2010.
EVANS, W.C. Trease and Evans pharmacognosy. 16. ed. Toronto, Elsevier:
2009.
FARIAS-JUNIOR, P.A.; RIOS, M.C.; MOURA, T.A.; ALMEIDA, R.P.; ALVES,
P.B.; FLANK, A.F.; FERNANDES, R.P.M.; SCHER, R. Leishmanicidal activity of
carvacrol-rich essential oil from Lippia sidoides Cham. Biol. Res., 45(4): 399-
402, 2012.
FURTADO, S.K. Alternativas fitoterápicas para o controle da verminose
ovina no Estado do Paraná: testes in vitro e in vivo. Tese (Doutorado em
Ciências) – Curso de Pós-graduação em Agronomia, Universidade Federal do
Paraná, 2006.
GARATE, M.; CAO, Z.; BATEMAN, E.; PANJWANI, N. Cloning and
characterization of a novel mannose-binding protein of Acanthamoeba. J. Biol.
Chem., 279(28): 29849-56, 2004.
GITHIORI, J.B.; ATHANASIADOU, S.; THAMSBORG, S.M. Use of plants in
novel approaches for control of gastrointestinal helminths in livestock with
emphasis on small ruminants. Vet. Parasitol., 139(4): 308-320, 2006.
GONÇALVES, A.H. Atividade fungitóxica dos óleos essenciais de Lippia
sidoides Cham. e de Cymbopogon citratus (D.C.) Staff no controle de
fitopatógenos do feijoeiro comum. (Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal
do Tocantins), 2012.
GUERRA, M.P.; NODARI, R.O. Biodiversidade: aspectos biológicos,
geográficos, legais e éticos. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.;
GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. (org.)
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3. ed. Porto
18
Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/ Editora da UFSC, Capítulo 1, p. 13-
26, 2007.
KHAN, N.A. Acanthamoeba biology and increasing importance in human health.
FEMS Microbiol. Rev., 30(4): 564-595, 2006.
______. Acanthamoeba and the blood-brain barrier: the breakthrough. J. Med.
Microbiol., 57(9): 1051-1057, 2008.
KHAN, N.A.; SIDDIQUI, R. Acanthamoeba affects the integrity of human brain
microvascular endothelial cells and degrades the tight junction protein. Int. J.
Parasitol., 39(14): 1611-1616, 2009.
LIMA, G.P.G.; SOUZA, T.M.; FREIRE, G.P.; FARIAS, D.F.; CUNHA, A.P.;
RICARDO, N.M.P.S.; MORAIS, S.M.; CARVALHO, A.F.U. Further insecticidal
activities of essential oils from Lippia sidoides and Croton species against
Aedes aegypti L. Parasitol. Res., 112(5): 1953-1958, 2013.
LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil: Nativas e
Exóticas. 2 ed. Instituto Plantarum, Nova Odessa, 2008.
MARCIANO-CABRAL, F.; CABRAL. G. Acanthamoeba spp. as agents of
disease in humans. Clin. Microbiol. Rev., 16(2): 273–307, 2003.
MELO, J.O.; BITENCOURT, T.A.; FACHIN, A.L.; CRUZ, E.M.O.; JESUS, H.;
ALVES, P.; ARRIGONI-BLANK, M.F.; FRANCA, S.C.; BELEBONI, R.O.;
FERNANDES, R.P.M.; BLANK, A.F.; SCHER, R. Antidermatophytic and
antileishmanial activities of essential oils from Lippia gracilis schauer
genotypes. Acta Trop., 128(1): 110-115, 2013.
MENDES, S.S.; BOMFIM, R.R.; JESUS, H.C.R.; ALVES, P.B.; BLANK, A.F.;
ESTEVAM, C.S.; ANTONIOLLI, A.R.; THOMAZZI, S.M. Evaluation of the
analgesic and anti-inflammatory effects of the essential oil of Lippia gracillis
leaves. J. Ethnopharmacol., 129(3): 391-397, 2010.
MESA-ARANGO, A.C.; MONTIEL-RAMOS, J.; ZAPATA, B.; DURAN, C.
BETANCUR-GALVIS, L.; STASHENKO, E. Citral and carvone chemotytes from
19
the essential oils of Colombian Lippia Alba (Mill.) N.E. Brown: composition,
cytotoxicity and antifungal activity. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 104(6): 878-84,
2009.
OCAZIONEZ, R.E.; MENESES, R.; TORRES, F.A.; STASHENKO, E. Virucidal
activity of Colombian Lippia essential oils on dengue vírus replication in vitro.
Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 105(3): 304-309, 2010.
RONDON, F.C.; BEVILAQUA, C.M.; ACCIOLY, M.P.; MORAIS, S.M.;
ANDRADE-JUNIOR, H.F.; CARVALHO, C.A.; LIMA, J.C.; MAGALHAES, C.R.
In vitro efficacy of Coriandrum sativum, Lippia sidoides and Copaifera reticulata
against Leishmania chagasi. Rev. Bras. Parasitol. Vet., 21(3): 185-191, 2012.
SAMIE, A.; HOUSEIN, A.; LALL, N.; MEYER, J.J. Crudes extracts of, and
purified compounds from, Pterocarpus angolensis, and the essential oil of
Lippia javanica: their in-vitro cytotoxicities and activities against selected
bacteria and Entamoeba histolytica. Ann. Trop. Med. Parasitol., 103(5): 427-
439, 2009.
SALAS, M.S.; LUNA, J.S.S.; TSUTSUMI, V. Amibas de vida libre. In: FLISSER,
A.; TAMAYO, R. P.. Aprendizaje de la parasitologia basado em problemas.
México, D.F.: ETM, p. 481-502, 2006.
SANTOS, J.S.; MELO, J.I.M.; ABREU, M.C.; SALES, M.F. Verbenaceae Sensu
Stricto na região de Xingó: Alagoas e Sergipe, Brasil. Rodriguésia, 60(4): 985-
998, 2009.
SCHUSTER, F.L.; VISVESVARA, G.S. Amebae and ciliated protozoa as causal
agents of waterborne zoonotic disease. Vet. Parasitol., 126(1-2), 91-120, 2004.
SILVA, W. M. O.; SOUZA, G. F. X. T.; VIEIRA, P. B.; SANAVRIA, A. Uso
popular de plantas medicinais na promoção da saúde animal em
assentamentos rurais de Seropédica – RJ. R. bras. Ci. Vet., 20(1): 32-36,
2013.
20
URIAS, E.M.P. As mudanças recentes nas estratégias produtivas e
tecnológicas dos laboratórios farmacêuticos instalados no Brasil: uma análise a
partir dos impactos originados pela regulamentação dos medicamentos
genéricos (Monografia – Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho),
2006.
TAVARES, I.B.; MOMENTÉ, V.G.; NASCIMENTO, I.R. Lippia alba: estudos
químicos, etnofarmacológicos e agronômicos. Pesq. Apl. Agrotecnol. , 4(1):
204-220, 2011.
21
Artigo 1 - Atividade amebicida de óleos essenciais de Lippia spp. (Verbenaceae) frente a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Artigo em preparação para a revista Experimental Parasitology.
22
Atividade amebicida de óleos essenciais de Lippia spp. (Verbenaceae) frente a
trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga
Israel Gomes de Amorim Santosa, Leociley Rocha Menezes
b, Marilise Brittes Rott
c,
Ricardo Scherd, Emanoel Vilaça Costa
b, Sócrates Cabral de Holanda Cavalcanti
e,
Jaciana dos Santos Aguiarf, Teresinha Gonçalves da Silva
f, Silvio Santana Dolabella
a,*
a
Departamento de Morfologia, Laboratório de Entomologia e Parasitologia Tropical, Universidade
Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brasil b Departamento de Química, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brasil
c Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil d Departamento de Morfologia, Laboratório de Biologia Molecular de Bioagentes Patogênicos,
Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, Sergipe, Brasil e Departamento de Farmácia, Laboratório de Química Farmacêutica, Universidade Federal de Sergipe,
São Cristóvão, Sergipe, Brasil fDepartamento de Antibióticos, Laboratório de Bioensaios para Pesquisa de Fármacos, Universidade
Federal de Pernambuco, Recife, Brasil
* Endereço para correspondência: Departamento de Morfologia, Laboratório de Entomologia e
Parasitologia Tropical, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon, s/n, Roza Elze,
CEP 49100-000, SE – Brasil.
Telefone: +55 79 21056626. Endereço de email: [email protected] (S. S. Dolabella)
Resumo
A ceratite amebiana e a encefalite amebiana granulomatosa são doenças
causadas por amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba. No caso da ceratite, o
grande problema é a recidiva da doença devido à resistência, especialmente da forma
cística do organismo, aos medicamentos utilizados. Óleos essenciais de plantas têm sido
utilizados como agentes potencialmente ativos contra este protista. Portanto, o objetivo
deste estudo foi determinar a atividade amebicida de óleos essenciais de plantas do
gênero Lippia frente à trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Para isto 8 x 104
trofozoítos foram expostos durante 24 horas a concentrações crescentes dos óleos
essenciais de Lippia sidoides, Lippia gracilis, Lippia alba e Lippia pedunculosa, bem
como de seus compostos majoritários rotundifolona, carvona e carvacrol. Praticamente
todas as concentrações dos óleos e compostos apresentaram atividade amebicida. Diante
destes resultados, os óleos pesquisados neste estudo são candidatos em potencial para a
terapêutica complementar na ceratite amebiana e encefalite amebiana granulomatosa.
23
PALAVRAS-CHAVE: Acanthamoeba polyphaga; Lippia spp.; carvacrol; carvona;
rotundifolona; atividade amebicida.
1. Introdução
Acanthamoeba é um gênero que inclui patógenos oportunistas distribuídos
mundialmente. Tais patógenos são agentes etiológicos de duas enfermidades que
acometem o ser humano: a encefalite amebiana granulomatosa, uma infecção
geralmente fatal do sistema nervoso central (VISVESVARA, 2008; KHAN &
SIDDIQUI, 2009), e a ceratite amebiana, uma doença da córnea que, quando não
tratada, pode levar a perda da visão (CLARKE &NIEDERKORH, 2006; ROBSON et
al., 2014).
O tratamento da encefalite amebiana granulomatosa tem sido realizado com a
combinação de diversos agentes farmacológicos, incluindo isotionato de pentamidina,
sulfadiazina, flucitosina e fluconazol ou itraconazol. Contudo, a maioria dos casos tem
tido mau prognóstico devido a diversos fatores, incluindo a ausência de sinais e
sintomas patognomônicos para a doença. Na ceratite amebiana, as amebas apresentam
resistência aos medicamentos atualmente utilizados, levando à recidiva da doença e à
necessidade urgente de novas drogas que inibam este fenômeno (DART et al., 2009).
Desta forma, a investigação de plantas utilizadas pela tradição popular é uma estratégia
para encontrar alternativas ao tratamento convencional.
Plantas do gênero Lippia são utilizadas na medicina alternativa para o tratamento
de diversas enfermidades, tais como desordens respiratórias e gastrointestinais. Existem
cerca de 200 espécies de plantas deste gênero, grande parte encontrada nas Américas
Central e do Sul e África (ESCOBAR et al., 2010).
Atividades leishmanicida, fungicida, tripanocida, antiviral, larvicida e
antimicrobiana já foram demonstradas para plantas do gênero Lippia (BOTELHO et al.,
2007; ESCOBAR et al., 2010; OCAZIONEZ, 2010; FARIAS-JUNIOR et al., 2012;
LIMA et al., 2013; MELO et al., 2013). Contudo, a atividade amebicida dos óleos
essenciais destas espécies frente a amebas de vida livre ainda não foi relatada pela
comunidade científica, o que torna de grande relevância trabalhos que visem elucidar
essa lacuna no conhecimento científico sobre agentes terapêuticos e anti-amebianos
frente a trofozoítos de Acanthamoeba spp.
24
Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade amebicida e citotóxica
do óleo essencial das plantas Lippia alba, L. sidoides, L. gracilis eL. pedunculosa frente
a trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga.
2. Material e Métodos
2.1. Amebas
Foram utilizados trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga (ATCC 30872)
obtidos da American Type Culture Collection e mantidos no Laboratório de
Entomologia e Parasitologia Tropical (LEPaT), da Universidade Federal de Sergipe, em
meio PYG (2% de proteose peptona, 0,2% de extrato de levedo e 1,8% de glicose) à
temperatura ambiente.
2.2. Plantas
Foram utilizadas neste estudo as espécies L. alba (LA57), L. sidoides (LS104),
L. gracilis (LG110) e L. pedunculosa (LP). Estas plantas foram coletadas nos estados de
Sergipe e Bahia (Brasil) e exsicatas depositadas no Herbário da Universidade Federal de
Sergipe (Tabela 1).
Tabela 1 – Procedência dos genótipos de Lippia utilizados neste estudo.
Código Nome científico Local de origem Dados geográficos N
o Exsicata
Herbário UFS
LG110 Lippia gracilis Tomar do Geru - SE 11° 19' 21,1" S; 37° 55' 14,9" W 14732
LS104 Lippia sidoides Poço Redondo - SE 9° 58' 09,2'' S; 37° 51' 50,3'' W 8226
LA57 Lippia alba Rio Real - BA 11° 0' 52,9" S; 37° 12' 23,0" W 13469
LP Lippia pedunculosa Poço Redondo - SE 9° 40' 46,1'' S; 37° 39' 41,4'' W 23159 FONTE: FARIAS-JUNIOR et al., 2012.
2.3. Óleos essenciais e compostos majoritários
As folhas secas e pulverizadas (75 g) foram submetidas à hidrodestilação em um
aparelho do tipo Clevenger durante 2 horas. Ao final de cada destilação os óleos foram
coletados e mantidos a -18°C até sua avaliação. As composições do óleo essencial das
25
espécies de Lippia avaliadas foram previamente relatadas na literatura (MAYNARD et
al., 2011 ; FARIAS-JUNIOR et al., 2012; MELO et al., 2013).
Os óleos foram solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) à concentração de
100mg/mL e testados nas seguintes concentrações finais: L. alba: 10, 20, 30, 40, 50 e
100μg/mL; L. sidoides e L. gracilis: 5, 10, 20, 30, 40 e 50μg/mL e L. pedunculosa: 25,
50, 100, 200, 300 e 400μg/mL.
Os compostos majoritários carvacrol (99.9%) e carvona (99%) foram obtidos da
Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Rotundifulona foi obtida de acordo
Santos et al. (2014). De modo similar, os compostos majoritários foram diluídos a partir
da concentração estoque de 100mg/mL e avaliados nas seguintes concentrações:
rotundifolona e carvona:10, 20, 30, 75 e 100μg/mL e carvacrol:10, 25, 50,75 e
100μg/mL.
2.4. Determinação da atividade amebicida
Para determinar o potencial amebicida, 8 x 104 trofozoítos de A. polyphaga em
fase logarítmica de crescimento (48 a 72 horas de cultivo) foram distribuídos em placas
de cultivo celular de 24 poços (TPP®) contendo 2 mL de meio de cultivo PYG por poço
e expostos às diversas concentrações dos óleos utilizados neste estudo e de seus
compostos majoritários. Cada concentração foi avaliada em triplicata e todos os
experimentos foram realizados duas vezes.
Após 24 horas de tratamento, as placas foram submetidas a banho de gelo por 20
minutos para que os trofozoítos se desprendessem de sua superfície e, após
homogeneização, uma alíquota de 10μl foi analisada em câmara de Neubauer para a
contagem das amebas.
Para o cálculo da concentração do óleo essencial que resultou em inibição de
50% do crescimento das amebas (IC50), foi usado o programa Excel por meio de uma
regressão não-linear, utilizando as porcentagens de viabilidade celular e inibição do
crescimento calculadas a partir dos resultados da contagem em câmara de Neubauer.
Foi realizada a análise de variância e comparação entre as médias pelo teste T,
tendo os resultados significância estatística quando p < 0,05.
26
2.5. Citotoxicidade dos óleos essenciais sobre cultura de células de mamífero
A atividade citotóxica dos óleos essenciais foi realizada por meio do ensaio de
MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). Foi utilizada a
linhagem NCI-H292 (carcinoma mucoepidermoide de pulmão humano) mantida em
meio de cultura DMEM, suplementada com 10% de soro fetal bovino e 1% de
antibióticos (penicilina e estreptomicina, GIBCO®). As células (1 x 10
5células totais)
foram plaqueadas em placas de 96 poços e mantidas a 37oC em atmosfera de 5% de
CO2. Depois de 24h, 10µL dos óleos essenciais foram adicionados a cada poço na
concentração final de 50µg/mL. O fármaco doxorrubicina (5µg/mL) foi utilizado como
controle positivo. Após 72 horas, 25µL da solução de MTT (5mg/mL) foi adicionado a
cada poço e a mistura incubada por mais 3h. Ao fim deste tempo, o meio de cultura com
excesso de MTT foi aspirado e 100µL de DMSO foram adicionados a cada poço para
interromper a reação e solubilizar os cristais de formazan. A densidade ótica (DO) dos
poços foi medida a 560nm.E como foi calculada a viabilidade?
3. Resultados
3.1. Atividade amebicida dos óleos essenciais e de seus compostos majoritários
A inibição do crescimento dos trofozoítos de A. polyphagapelo tratamento com
os óleos essenciais das quatro espécies avaliadas foi concentração dependente. Como
pode ser observado na Figura 1, os óleos essenciais de L. gracilis e L. sidoides
apresentaram melhores efeitos inibitórios, uma vez que na concentração de 40 μg/mL
ambos os óleos eliminaram 100% dos trofozoítos. Por outro lado, efeito semelhante só
foi observado nos tratamentos com as concentrações mais altas dos óleos essenciais de
L. alba (100 μg/mL) e L. pedunculosa (400 μg/mL) (Figura 2). Este padrão reflete os
valores das IC50 encontradas que foram 10,08 μg/mL e 18,19 μg/mL para L. gracilis e L.
sidoides, respectivamente e 31,79 μg/mL para L. alba e 71,47μg/mL para L.
pedunculosa.
27
Estudos prévios de caracterização química dos óleos essenciais de L. sidoides e
L. gracilis demonstraram que os mesmos apresentam como composto majoritário o
carvacrol (43.69% e 48.92%, respectivamente), seguido por p-cimeno (17.8% e
12.87%) e γ-terpineno (16.6% e 11.81%) (FARIAS-JUNIOR et al., 2012; MELO et al.,
2013). O óleo essencial de L. alba, por sua vez, apresenta em sua composição carvona
(61.66%) e limoneno (29.28%) como principais compostos (FARIAS-JUNIOR et al.,
2012), enquanto que o óleo essencial de L. pedunculosa é constituído principalmente
por rotundifolona (52,94%) e limoneno (38,62%) (MENEZES et al., 2014).
Via
bili
dad
e (
%)
Concentrações (µg/mL)L. sidoides L. gracilis L. alba
Via
bili
dad
e (
%)
Concentrações (µg/mL)25 50 100 200 300 400
Figura 1. Viabilidade celular de trofozoítos de A. polyphaga após 24 horas de
exposição a diversas concentrações do óleo essencial de L. gracilis, L. sidoides e L.
alba.
Figura 2. Viabilidade celular de trofozoítos de A. polyphaga após 24 horas de
exposição a diversas concentrações do óleo essencial de L. pedunculosa.
28
Deste modo, a atividade amebicida dos compostos majoritários do óleo essencial
das quatro espécies de Lippia também foi avaliada (Figura 3). Assim como demonstrado
para os óleos essenciais de L. gracilis e L. sidoides, seu componente majoritário
carvacrol apresentou melhor efeito amebicida, sendo capaz de eliminar 100 % dos
trofozoítos na concentração de 75 μg/mL, ao passo que este efeito só foi observado na
concentração de 100 μg/mL de rotundifolona, componente majoritário do óleo essencial
de L. pedunculosa. Por outro lado, mesmo na maior concentração testada, a carvona,
principal composto do óleo essencial de L. alba, reduziu a viabilidade celular em cerca
de 70%. Os valores de IC50 obtidos foram 24,74μg/mL para a rotundifulona,
18,98μg/mL para carvacrol e 43,62μg/mL para carvona.
3.2. Ensaio de citotoxicidade dos óleos essenciais sobre células de mamíferos
Para a avaliação da atividade citotóxica dos óleos essenciais foi utilizada uma
escala de intensidade proposta por Rodrigues et. al. (2014), pela qual o óleo é
considerado sem atividade se seu potencial de inibição estiver entre 1 e 20%, com pouca
atividade se estiver entre 20 e 50%, com atividade moderada se estiver entre 50 e 70% e
com muita atividade se seu potencial de inibição for superior a 70%. Com base nestes
parâmetros, pode-se observar que o óleo essencial de L. alba apresenta uma forte
citotoxicidade frente à linhagem celular avaliada, sendo capaz de inibir em mais de 90%
Via
bili
dad
e (
%)
Concentrações (µg/mL)Rotundifolona Carvona Carvacrol
Figura 3. Viabilidade celular de trofozoítos de A. polyphaga após 24 horas de
exposição a diversas concentrações dos monoterpenos rotundifolona, carvona e
cravacrol.
29
a viabilidade da mesma. Com relação aos óleos essenciais das demais espécies
avaliadas, todos apresentaram pouca atividade sobre a linhagem NCI-H292.
Tabela 2– Porcentagem de inibição do crescimento em linhagem de células NCI-H292
exposta ao óleo essencial de L. alba, L. sidoides, L. gracilis e L. pedunculosa.
Produtos teste
% de inibição
NCI-H292 SEM
Lippia gracilis 110 35.68 2.22
Lippia pedunculosa 45.14 0.36
Lippia alba 57 94.98 3.73
Lippia sidoides 104 47.22 2.29
Doxorrubicina 94.15 1.99
SEM: Erro médio padrão. Os experimentos foram repetidos 2 vezes em triplicata.
4. Discussão
Poucos são os trabalhos na literatura com o objetivo de encontrar produtos
naturais com ação sobre amebas de vida livre. Uma subfração do extrato metanólico de
Allium sativum foi identificada como amebicida para cistos e trofozoítos de
Acanthamoeba castellanii em um mecanismo dose e tempo dependente, sendo a eficácia
máxima encontrada na concentração de 3,9mg/mL (POLAT et al., 2008). O extrato
metanólico de Origanum syriacum e Origanum laevigatum na concentração de
32mg/mL eliminou todos os trofozoítos de A.castellanii após um período de incubação
de 3 horas, tendo estes extratos um efeito cisticida após 24 horas de exposição
(DEGERLI et al., 2012).
Especificamente contra A. polyphaga, o óleo essencial de Pterocaulon
polystachyum apresentou efeito amebicida nas concentrações de 10 e 20mg/mL. Para
Piper hispidinervum, Sauter et al.,(2012) determinaram em 500µg/mL a concentração
de seu óleo essencial que eliminava 100% dos trofozoítos desta ameba. Por sua vez,
Vunda et al., (2012) determinaram em 500µg/mL a concentração capaz de matar 87%
dos trofozoítos deste protozoário quando exposto ao óleo essencial de Croton ericoides.
Tais resultados demonstram que os óleos utilizados neste estudo foram mais efetivos
30
que os usados por Sauter et al. e Vunda et al., uma vez que as concentrações efetivas
encontradas foram menores, sendo que os óleos essenciais de L. gracilis e L. sidoides
eliminaram 100% dos trofozoítos a uma concentração de 40µg/mL.
Diferentemente dos óleos essenciais das plantas P. polystachyum e C. ericoides,
que tem como compostos majoritários o acetato de E-sesquilavandulil e germacreno D,
respectivamente, os óleos essenciais das plantas utilizadas neste trabalho são
constituídas principalmente de carvacrol (L. sidoides e L. gracilis), carvona (L. alba) e
rotundifolona (L. pedunculosa). A ação amebicida de alguns destes compostos também
foi determinada. Novamente, praticamente todas as concentrações testadas foram
significativamente inibitórias para o crescimento amebiano e a IC50 determinada como
18,98µg/mL, 43,62µg/mL, 24,74µg/mL para os compostos rotundifolona, carvona e
carvacrol, respectivamente.
As espécies de plantas e os compostos majoritários utilizados neste trabalho já
foram alvos de investigação de sua atividade biológica contra alguns protozoários. L.
sidoides já teve a sua atividade leishmanicida e tripanocida comprovada (ESCOBAR et
al., 2010; MELO et al., 2013). A IC50 de 86,32µg/mL para a atividade leishmanicida
encontrada por Melo et al. (2013) foi superior à encontrada neste trabalho para a
atividade amebicida deste óleo, o que demonstra que possivelmente estas amebas sejam
mais susceptíveis à atividade citotóxica dos óleos analisados aqui.
O principal composto dos óleos essenciais de L. gracilis e L. sidoides, carvacrol,
exibiu IC50 de 10,08 µg/mL. Desta forma, este composto é provavelmente o princípio
ativo responsável pela ação amebicida apresentado por estes óleos essenciais.
Independentemente do fato de p-cimeno e γ-terpineno serem encontrados no óleo
essencial de L. sidoides em pequena quantidade (12,8% e 11,8%, respectivamente), sua
atividade amebicida (dado não mostrado) sugere a existência de atividade sinérgica
entre os compostos e tende a explicar os menores valores de IC50 apresentados por L.
sidoides e L. gracilis.
Este foi o primeiro relato de avaliação da atividade amebicida de espécies do
gênero Lippia frente a amebas de vida livre. Apesar de todas as concentrações dos óleos
testados terem apresentado boa atividade amebicida frente a trofozoitos de A.
polyphaga, novos testes deverão ser realizados, a fim de viabilizar sua utilização na
terapêutica clínica.
31
Agradecimentos
Os autores agradecem ao apoio da CAPES pelo auxílio financeiro para realização da
pesquisa.
Referências
BOTELHO, M. A.; NOGUEIRA, N. A.; BASTOS, G. M.; FONSECA, S. G.; LEMOS,
T. L.; MATOS, F. J.; MONTENEGRO, D.; HEUKELBACH, J.; RAO, V. S.; BRITO,
G. A. Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and
thymol against oral pathogens. Brazilian Journal Medical Biology Resource, p. 349-
356, 2007.
CLARKE, D. W.; NIEDERKORN, J. Y. The pathophysiology of Acanthamoeba
keratitis. Trends in Parasitology, 2006.
DART, J. K. G.; SAW, V. P. J.; KILVINGTON, S. Acanthamoeba keratitis: diagnosis e
treatment update 2009. American Journal of Ophtalmology, 2009.
DEGERLI, S.; TEPE, B.; CELIKSOZ, A.; BERK, S.; MALATYALI, E. In vitro
amoebicidal activity or Origanum syriacum and Origanum laevigatum on
Acanthamoeba castellani cysts and trophozoites. Experimental Parasitology, 2012).
ESCOBAR, P.; LEA, S. M.; HERRERA, L. V.; MARTINEZ, J. R.; STASHENKO, E.
Chemical composition and antiprotozoal activities of Colombian Lippia spp essential
oils and their major components. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2010.
FARIAS JÚNIOR, P. A.; RIOS, M. C.; MOURA, T. A.; ALMEIDA, R. P.; ALVES, P.
B.; BLANK, A. S.; FERNANDES, R. P. M.; SCHER, R. Leishmanicidal activity of
carvacrol-rich essential oil from Lippia sidoides Cham. Biological Research, v. 45, p.
399-402, 2012.
32
KHAN, N. A.; SIDDIQUI, R. Acanthamoeba affects the integrity of human brain
microvascular endothelial cells and degrades the tight junction protein. Internacional
Journal of Parasitology, p.1611–1616, 2009.
LIMA, G. P. G.; SOUZA, T. M.; FREIRE, G. P.; FARIAS, D. F.; CUNHA, A. P.;
RICARDO, N. M. P. S.; MORAIS, S. M.; CARVALHO, A. F.U. Further insecticidal
activities of essential oils from Lippia sidoides and Croton species against Aedes
aegypti L. Parasitology Research, 2013.
MELO, J. O.; BITENCOURT, T. A.; FACHIN, A. L.; CRUZ, E. M. O.; JESUS, H.; C.;
R.; ALVES, P.; B.; ARRIGONI-BLANK, M. F.; FRANCA, S. C.; BELEBONI, R. O.;
FERNANDES, R.; P.; M.; BLANK, A.; F.; SCHER, R. Antidermatophytic and
antileishmanial activities of essential oils from Lippia gracilis schauer genotypes. Acta
Tropica, 2013.
MAYNARD, L. G.; SANTOS, K. C.; CUNHA, P. S.; BARRETO, A. S.; PEIXOTO, M.
G.; BLANK, A. F.; ARRIGONI-BLANK, F. A.; BONJARDIN, L. R.; SANTOS,
M.R.V. Chemical composition and vasorelaxant effect induced by the essential oil of
Lippia alba (Mill.) N.E. Brown. (Verbenaceae) in rat mesenteric artery. Indian Journal
of Pharmacology, v. 43, p. 694-698, 2011.
MENEZES, L. R. A.; SANTOS, N. N.; MEIRA, C. S.; DOS SANTOS, J. A. F.;
GUIMARAES, E. T.; SOARES, M. B. P.; NEPEL, A.; BARISON, A.; COSTA, E. V.,
A new source of (R)-limonene and rotundifolone from leaves of Lippia pedunculosa
(Verbenaceae) and their trypanocidal properties, Natural Product
Communications (2014), 9(6), 737-739.
OCAZIONEZ, R. E.; MENESES, R.; TORRES, F. A.; STASHENKO, E. Virucidal
activity of Colombian Lippia essential oils on dengue vírus replication in vitro. Mem.
Inst. Osw. Cruz, 2010.
33
POLAT, Z. A.; VURAL, A.; OZAN, F.; TEPE, B.; ÖZCELIK, S.; CETIN, A. In Vitro
Evaluation of the Amoebicidal Activity of Garlic (Allium sativum) Extract on
Acanthamoeba castellaniiand its Cytotoxic Potential on Corneal Cells.
ROBSON, J.; NOURSE, C.; GERARD, J. BYRNE, S. Free living amoebic infection
causing CNS disease – diagnostic techniques. Pathology, 2014.
RODRIGUES, F. A. R.; BOMFIM IDA, S.; CAVALCANTE, B. C.; PESSOA, C.;
GONÇALVES, R. S.; WARDELL, J. L.; WARDELL, S. M.; DE SOUZA, M. V.
Mefloquine–Oxazolidine Derivatives: A New Class of Anticancer Agents. ChemBiol
Drug Des, v. 83, p. 126–131, 2014.
SAUTER, I. P.; SANTOS, I. C.; APEL, M. A.; CIBULSKI, S. P.; ROEHE, P. M.; Von
POSER, G. L.; ROTT, M. B. Amoebicidal activity and chemical composition of
Pterocaulon polystachyum (Asteraceae) essential oil. Parasitology research, 2011.
SAUTER, I. P.; ROSSA, G. E.; LUCAS, A. M.; CIBULSKI, S. P.; ROEHE, P. M.;
SILVA, L. A. A.; ROTT, M. B.; VARGAS, R. M. F.; CASSEL, E.; Von POSER, G. L.;
Chemical composition and amoebicidal activity of Piper hispidinervum (Piperaceae)
essential oil. Industrial Crops and Products, 2012.
SLAMENOVÁ, D.; HORVÁTHOVÁ, E.; SRAMKOVÁ, M.; MARSÁLKOVÁ, L.
DNA-protective effects of two components of essential plant oils carvacrol and thymol
on mammalian cells cultured in vitro. Neoplasma, 2007.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application
to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunological Methods, v. 65, n. 1-2, p.
55–63, 1983.
VISVESVARA, G. S.; SCHUSTER, F. L. Opportunistic Free-living Amebae, Part I.
Clinical Microbiology Newsletter, 2008.
34
VUNDA, S. L. L.; SAUTER, I. P.; CIBULSKI, S. P.; ROEHE, P. M.; BORDIGNON,
S. A. L.; ROTT, M. B.; APEL, M. A.; Von POSER, G. L. chemical composition and
amoebicidal activity of Croton pallidulus, Croton ericoides, and Croton isabelli
(Euphorbiaceae) essential oils. Parasitology research, 2012.
ANEXOS
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 1
EXPERIMENTAL PARASITOLOGY
AUTHOR INFORMATION PACK
TABLE OF CONTENTS.
XXX.
• Description• Audience• Abstracting and Indexing• Editorial Board• Guide for Authors
p.1p.1p.1p.2p.3
ISSN: 0014-4894
DESCRIPTION.
Experimental Parasitology emphasizes modern approaches to parasitology, including molecularbiology and immunology. The journal features original research papers on the physiological,metabolic, immunologic, biochemical, nutritional, and chemotherapeutic aspects of parasites andhost-parasite relationships.
Most downloaded papers
Benefits to authorsWe also provide many author benefits, such as free PDFs, a liberal copyright policy, special discountson Elsevier publications and much more. Please click here for more information on our author services .
Please see our Guide for Authors for information on article submission. If you require any furtherinformation or help, please visit our support pages: http://support.elsevier.com
AUDIENCE.
Parasitologists, microbiologists, molecular biologists and biochemists working with parasites as amodel
ABSTRACTING AND INDEXING.
Abstracts in Hygiene and Communicable DiseasesBIOSISElsevier BIOBASEChemical AbstractsCurrent Contents/Life SciencesMEDLINE®EMBASEHelminthological AbstractsPascal et Francis (INST-CNRS)Protozoological AbstractsReference UpdateTropical Diseases BulletinScopus
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 2
EDITORIAL BOARD.
Co Editors-in-Chief:
Anton Aebischer, Berlin, Germany, Email: [email protected] Kalinna, Parkville, Victoria, Australia, Email: [email protected]
Editorial Board:
J. Cable, Cardiff, UKP. Craig, Manchester, UKW. de Souza, Rio de Janeiro, BrazilR. Docampo, Athens, Georgia, USAM. Doenhoff, Nottingham, UKE. Dumonteil, Yucatán, MexicoH. Garcia, Urb. Ingeneria, S.M.P, PeruP. Geldhof, Merelbeke, BelgiumG.N. Gobert, Brisbane, Queensland, AustraliaS.B. Gould, Düsseldorf, GermanyE. Grisard, Florianópolis, BrazilM.-J. Gubbels, ,A. Hemphill, Bern, SwitzerlandJ. Horton,M. Hu, Wuhan, ChinaA. Klion, Bethesda, Maryland, USAJ. Kurtz, Münster, GermanyM. Lalle, Roma, ItalyK. Matuschewski, Berlin, GermanyS. Moreno, Athens, Georgia, USAA.J. Nisbet, Edinburgh, Scotland, UKN.C. Peters, Bethesda, Maryland, USAM. Riscoe, Portland, Oregon, USAL. Robertson, Oslo, NorwayM.H. Rodriguez López, Curernavaca, MexicoU. Ryan, Murdoch, Western Australia, AustraliaB. Sinden, London, UKF. Villalta, Nashville, Tennessee, USAJ Walochnik, Vienna, AustriaM. Wiese, Glasgow, Scotland, UKL. Xiao, Atlanta, Georgia, USAX.Q. Zhu, Lanzhou, Gansu, China
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 3
GUIDE FOR AUTHORS.
Your Paper Your Wayypyw-gfa-banner.gifyour paper your way
INTRODUCTIONExperimental Parasitology emphasizes modern approaches to parasitology, including molecularbiology and immunology. The journal features original research papers on the physiological, metabolic,immunologic, biochemical, nutritional, and chemotherapeutic aspects of parasites and host-parasiterelationships.
Authors of studies on anti–microbial properties of natural substances are strongly encouraged tosubmit their work to other, more appropriate journals unless the studies have a strong focus on anti–parasitic activity and address the following points: the chemical characterization of the compoundslikely implicated to a reasonable degree controls for the effects of vehicles and solvents if an animalmodel is not investigated or not available, in vitro activity studies that include at least comparativecytotoxicity data using host cells or tissues to show selective anti–parasitic activity at a level thatcould indicate a realistic prospect for translation. some investigation into the potential mode of actionor effects on likely molecular targets in parasites
BEFORE YOU BEGINEthics in publishingFor information on Ethics in publishing and Ethical guidelines for journal publication seehttp://www.elsevier.com/publishingethics and http://www.elsevier.com/journal-authors/ethics.
Conflict of interestAll authors are requested to disclose any actual or potential conflict of interest including any financial,personal or other relationships with other people or organizations within three years of beginning thesubmitted work that could inappropriately influence, or be perceived to influence, their work. Seealso http://www.elsevier.com/conflictsofinterest. Further information and an example of a Conflict ofInterest form can be found at: http://help.elsevier.com/app/answers/detail/a_id/286/p/7923.
Submission declarationSubmission of an article implies that the work described has not been published previously (exceptin the form of an abstract or as part of a published lecture or academic thesis or as an electronicpreprint, see http://www.elsevier.com/postingpolicy), that it is not under consideration for publicationelsewhere, that its publication is approved by all authors and tacitly or explicitly by the responsibleauthorities where the work was carried out, and that, if accepted, it will not be published elsewhereincluding electronically in the same form, in English or in any other language, without the writtenconsent of the copyright-holder.
Changes to authorshipThis policy concerns the addition, deletion, or rearrangement of author names in the authorship ofaccepted manuscripts:Before the accepted manuscript is published in an online issue: Requests to add or remove an author,or to rearrange the author names, must be sent to the Journal Manager from the corresponding authorof the accepted manuscript and must include: (a) the reason the name should be added or removed,or the author names rearranged and (b) written confirmation (e-mail, fax, letter) from all authors thatthey agree with the addition, removal or rearrangement. In the case of addition or removal of authors,this includes confirmation from the author being added or removed. Requests that are not sent bythe corresponding author will be forwarded by the Journal Manager to the corresponding author, whomust follow the procedure as described above. Note that: (1) Journal Managers will inform the JournalEditors of any such requests and (2) publication of the accepted manuscript in an online issue issuspended until authorship has been agreed.After the accepted manuscript is published in an online issue: Any requests to add, delete, or rearrangeauthor names in an article published in an online issue will follow the same policies as noted aboveand result in a corrigendum.
CopyrightThis journal offers authors a choice in publishing their research: Open Access and Subscription.
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 4
For Subscription articlesUpon acceptance of an article, authors will be asked to complete a 'Journal Publishing Agreement' (formore information on this and copyright, see http://www.elsevier.com/copyright). An e-mail will besent to the corresponding author confirming receipt of the manuscript together with a 'JournalPublishing Agreement' form or a link to the online version of this agreement.Subscribers may reproduce tables of contents or prepare lists of articles including abstracts for internalcirculation within their institutions. Permission of the Publisher is required for resale or distributionoutside the institution and for all other derivative works, including compilations and translations(please consult http://www.elsevier.com/permissions). If excerpts from other copyrighted works areincluded, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and credit thesource(s) in the article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in these cases: please consulthttp://www.elsevier.com/permissions.
For Open Access articlesUpon acceptance of an article, authors will be asked to complete an 'Exclusive LicenseAgreement' (for more information see http://www.elsevier.com/OAauthoragreement). Permittedreuse of open access articles is determined by the author's choice of user license (seehttp://www.elsevier.com/openaccesslicenses).
Retained author rightsAs an author you (or your employer or institution) retain certain rights. For more information onauthor rights for:Subscription articles please seehttp://www.elsevier.com/journal-authors/author-rights-and-responsibilities.Open access articles please see http://www.elsevier.com/OAauthoragreement.
Role of the funding sourceYou are requested to identify who provided financial support for the conduct of the research and/orpreparation of the article and to briefly describe the role of the sponsor(s), if any, in study design; inthe collection, analysis and interpretation of data; in the writing of the report; and in the decision tosubmit the article for publication. If the funding source(s) had no such involvement then this shouldbe stated.
Funding body agreements and policiesElsevier has established agreements and developed policies to allow authors whose articles appear injournals published by Elsevier, to comply with potential manuscript archiving requirements as specifiedas conditions of their grant awards. To learn more about existing agreements and policies please visithttp://www.elsevier.com/fundingbodies.
Open accessThis journal offers authors a choice in publishing their research:
Open Access• Articles are freely available to both subscribers and the wider public with permitted reuse• An Open Access publication fee is payable by authors or their research funderSubscription• Articles are made available to subscribers as well as developing countries and patient groups throughour access programs (http://www.elsevier.com/access)• No Open Access publication fee
All articles published Open Access will be immediately and permanently free for everyone to readand download. Permitted reuse is defined by your choice of one of the following Creative Commonsuser licenses:Creative Commons Attribution (CC BY): lets others distribute and copy the article, to createextracts, abstracts, and other revised versions, adaptations or derivative works of or from an article(such as a translation), to include in a collective work (such as an anthology), to text or data minethe article, even for commercial purposes, as long as they credit the author(s), do not represent theauthor as endorsing their adaptation of the article, and do not modify the article in such a way asto damage the author's honor or reputation.
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 5
Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike (CC BY-NC-SA): for non-commercial purposes, lets others distribute and copy the article, to create extracts, abstracts andother revised versions, adaptations or derivative works of or from an article (such as a translation),to include in a collective work (such as an anthology), to text and data mine the article, as long asthey credit the author(s), do not represent the author as endorsing their adaptation of the article, donot modify the article in such a way as to damage the author's honor or reputation, and license theirnew adaptations or creations under identical terms (CC BY-NC-SA).Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs (CC BY-NC-ND): for non-commercial purposes, lets others distribute and copy the article, and to include in a collective work(such as an anthology), as long as they credit the author(s) and provided they do not alter or modifythe article.
To provide Open Access, this journal has a publication fee which needs to be met by the authors ortheir research funders for each article published Open Access.Your publication choice will have no effect on the peer review process or acceptance of submittedarticles.
The publication fee for this journal is $2200, excluding taxes. Learn more about Elsevier's pricingpolicy: http://www.elsevier.com/openaccesspricing.
Language (usage and editing services)Please write your text in good English (American or British usage is accepted, but not amixture of these). Authors who feel their English language manuscript may require editingto eliminate possible grammatical or spelling errors and to conform to correct scientificEnglish may wish to use the English Language Editing service available from Elsevier'sWebShop (http://webshop.elsevier.com/languageediting/) or visit our customer support site(http://support.elsevier.com) for more information.
SubmissionSubmission to this journal proceeds totally online and you will be guided stepwise through the creationand uploading of your files. The system automatically converts source files to a single PDF file of thearticle, which is used in the peer-review process. Please note that even though manuscript sourcefiles are converted to PDF files at submission for the review process, these source files are needed forfurther processing after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's decisionand requests for revision, takes place by e-mail removing the need for a paper trail.
PREPARATIONNEW SUBMISSIONSSubmission to this journal proceeds totally online and you will be guided stepwise through the creationand uploading of your files. The system automatically converts your files to a single PDF file, whichis used in the peer-review process.As part of the Your Paper Your Way service, you may choose to submit your manuscript as a single fileto be used in the refereeing process. This can be a PDF file or a Word document, in any format or lay-out that can be used by referees to evaluate your manuscript. It should contain high enough qualityfigures for refereeing. If you prefer to do so, you may still provide all or some of the source files atthe initial submission. Please note that individual figure files larger than 10 MB must be uploadedseparately.
ReferencesThere are no strict requirements on reference formatting at submission. References can be in any styleor format as long as the style is consistent. Where applicable, author(s) name(s), journal title/booktitle, chapter title/article title, year of publication, volume number/book chapter and the paginationmust be present. Use of DOI is highly encouraged. The reference style used by the journal will beapplied to the accepted article by Elsevier at the proof stage. Note that missing data will be highlightedat proof stage for the author to correct.
Formatting requirementsThere are no strict formatting requirements but all manuscripts must contain the essential elementsneeded to convey your manuscript, for example Abstract, Keywords, Introduction, Materials andMethods, Results, Conclusions, Artwork and Tables with Captions.If your article includes any Videos and/or other Supplementary material, this should be included inyour initial submission for peer review purposes.
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 6
Divide the article into clearly defined sections.
Figures and tables embedded in textPlease ensure the figures and the tables included in the single file are placed next to the relevant textin the manuscript, rather than at the bottom or the top of the file.
REVISED SUBMISSIONSUse of word processing softwareRegardless of the file format of the original submission, at revision you must provide us with aneditable file of the entire article. Keep the layout of the text as simple as possible. Most formattingcodes will be removed and replaced on processing the article. The electronic text should be prepared ina way very similar to that of conventional manuscripts (see also the Guide to Publishing with Elsevier:http://www.elsevier.com/guidepublication). See also the section on Electronic artwork.To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the 'spell-check' and 'grammar-check'functions of your word processor.
Article structureSubdivision - numbered sectionsDivide your article into clearly defined and numbered sections. Subsections should be numbered1.1 (then 1.1.1, 1.1.2, ...), 1.2, etc. (the abstract is not included in section numbering). Use thisnumbering also for internal cross-referencing: do not just refer to 'the text'. Any subsection may begiven a brief heading. Each heading should appear on its own separate line.
IntroductionState the objectives of the work and provide an adequate background, avoiding a detailed literaturesurvey or a summary of the results.
Material and methodsProvide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already published should beindicated by a reference: only relevant modifications should be described.
ExperimentalProvide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already published should beindicated by a reference: only relevant modifications should be described.
Theory/calculationA Theory section should extend, not repeat, the background to the article already dealt with in theIntroduction and lay the foundation for further work. In contrast, a Calculation section represents apractical development from a theoretical basis.
ResultsResults should be clear and concise.
DiscussionThis should explore the significance of the results of the work, not repeat them. A combined Resultsand Discussion section is often appropriate. Avoid extensive citations and discussion of publishedliterature.
ConclusionsThe main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section, which may standalone or form a subsection of a Discussion or Results and Discussion section.
AppendicesIf there is more than one appendix, they should be identified as A, B, etc. Formulae and equations inappendices should be given separate numbering: Eq. (A.1), Eq. (A.2), etc.; in a subsequent appendix,Eq. (B.1) and so on. Similarly for tables and figures: Table A.1; Fig. A.1, etc.
Vitae - no photosInclude in the manuscript a short (maximum 100 words) biography of each author, along with apassport-type photograph accompanying the other figures.
Essential title page information• Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems. Avoidabbreviations and formulae where possible.
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 7
• Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a double name),please indicate this clearly. Present the authors' affiliation addresses (where the actual work wasdone) below the names. Indicate all affiliations with a lower-case superscript letter immediately afterthe author's name and in front of the appropriate address. Provide the full postal address of eachaffiliation, including the country name and, if available, the e-mail address of each author.• Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at all stages of refereeingand publication, also post-publication. Ensure that phone numbers (with country and areacode) are provided in addition to the e-mail address and the complete postal address.Contact details must be kept up to date by the corresponding author.• Present/permanent address. If an author has moved since the work described in the article wasdone, or was visiting at the time, a 'Present address' (or 'Permanent address') may be indicated asa footnote to that author's name. The address at which the author actually did the work must beretained as the main, affiliation address. Superscript Arabic numerals are used for such footnotes.
AbstractA concise and factual abstract is required. The abstract should state briefly the purpose of theresearch, the principal results and major conclusions. An abstract is often presented separately fromthe article, so it must be able to stand alone. For this reason, References should be avoided, but ifessential, then cite the author(s) and year(s). Also, non-standard or uncommon abbreviations shouldbe avoided, but if essential they must be defined at their first mention in the abstract itself.
Graphical abstractA Graphical abstract is mandatory for this journal. It should summarize the contents of the article ina concise, pictorial form designed to capture the attention of a wide readership online. Authors mustprovide images that clearly represent the work described in the article. Graphical abstracts should besubmitted as a separate file in the online submission system. Image size: please provide an imagewith a minimum of 531 × 1328 pixels (h × w) or proportionally more. The image should be readableat a size of 5 × 13 cm using a regular screen resolution of 96 dpi. Preferred file types: TIFF, EPS, PDFor MS Office files. See http://www.elsevier.com/graphicalabstracts for examples.Authors can make use of Elsevier's Illustration and Enhancement service to ensure the bestpresentation of their images also in accordance with all technical requirements: Illustration Service.
HighlightsHighlights are mandatory for this journal. They consist of a short collection of bullet points that conveythe core findings of the article and should be submitted in a separate file in the online submissionsystem. Please use 'Highlights' in the file name and include 3 to 5 bullet points (maximum 85characters, including spaces, per bullet point). See http://www.elsevier.com/highlights for examples.
KeywordsImmediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using American spelling andavoiding general and plural terms and multiple concepts (avoid, for example, 'and', 'of'). Be sparingwith abbreviations: only abbreviations firmly established in the field may be eligible. These keywordswill be used for indexing purposes.
AbbreviationsDefine abbreviations that are not standard in this field in a footnote to be placed on the first pageof the article. Such abbreviations that are unavoidable in the abstract must be defined at their firstmention there, as well as in the footnote. Ensure consistency of abbreviations throughout the article.
AcknowledgementsCollate acknowledgements in a separate section at the end of the article before the references and donot, therefore, include them on the title page, as a footnote to the title or otherwise. List here thoseindividuals who provided help during the research (e.g., providing language help, writing assistanceor proof reading the article, etc.).
Database linkingElsevier encourages authors to connect articles with external databases, giving their readers one-click access to relevant databases that help to build a better understanding of the described research.Please refer to relevant database identifiers using the following format in your article: Database: xxxx(e.g., TAIR: AT1G01020; CCDC: 734053; PDB: 1XFN). See http://www.elsevier.com/databaselinkingfor more information and a full list of supported databases.
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 8
Math formulaePresent simple formulae in the line of normal text where possible and use the solidus (/) instead ofa horizontal line for small fractional terms, e.g., X/Y. In principle, variables are to be presented initalics. Powers of e are often more conveniently denoted by exp. Number consecutively any equationsthat have to be displayed separately from the text (if referred to explicitly in the text).
FootnotesFootnotes should be used sparingly. Number them consecutively throughout the article. Manywordprocessors build footnotes into the text, and this feature may be used. Should this not be thecase, indicate the position of footnotes in the text and present the footnotes themselves separatelyat the end of the article. Do not include footnotes in the Reference list.Table footnotesIndicate each footnote in a table with a superscript lowercase letter.
ArtworkImage manipulationWhilst it is accepted that authors sometimes need to manipulate images for clarity, manipulation forpurposes of deception or fraud will be seen as scientific ethical abuse and will be dealt with accordingly.For graphical images, this journal is applying the following policy: no specific feature within an imagemay be enhanced, obscured, moved, removed, or introduced. Adjustments of brightness, contrast,or color balance are acceptable if and as long as they do not obscure or eliminate any informationpresent in the original. Nonlinear adjustments (e.g. changes to gamma settings) must be disclosedin the figure legend.
Electronic artworkGeneral points• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork.• Preferred fonts: Arial (or Helvetica), Times New Roman (or Times), Symbol, Courier.• Number the illustrations according to their sequence in the text.• Use a logical naming convention for your artwork files.• Indicate per figure if it is a single, 1.5 or 2-column fitting image.• For Word submissions only, you may still provide figures and their captions, and tables within asingle file at the revision stage.• Please note that individual figure files larger than 10 MB must be provided in separate source files.A detailed guide on electronic artwork is available on our website:http://www.elsevier.com/artworkinstructions.You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given here.FormatsRegardless of the application used, when your electronic artwork is finalized, please 'save as' orconvert the images to one of the following formats (note the resolution requirements for line drawings,halftones, and line/halftone combinations given below):EPS (or PDF): Vector drawings. Embed the font or save the text as 'graphics'.TIFF (or JPG): Color or grayscale photographs (halftones): always use a minimum of 300 dpi.TIFF (or JPG): Bitmapped line drawings: use a minimum of 1000 dpi.TIFF (or JPG): Combinations bitmapped line/half-tone (color or grayscale): a minimum of 500 dpiis required.Please do not:• Supply files that are optimized for screen use (e.g., GIF, BMP, PICT, WPG); the resolution is too low.• Supply files that are too low in resolution.• Submit graphics that are disproportionately large for the content.
Color artworkPlease make sure that artwork files are in an acceptable format (TIFF (or JPEG), EPS (or PDF), orMS Office files) and with the correct resolution. If, together with your accepted article, you submitusable color figures then Elsevier will ensure, at no additional charge, that these figures will appear incolor on the Web (e.g., ScienceDirect and other sites) regardless of whether or not these illustrationsare reproduced in color in the printed version. For color reproduction in print, you will receiveinformation regarding the costs from Elsevier after receipt of your accepted article. Pleaseindicate your preference for color: in print or on the Web only. For further information on thepreparation of electronic artwork, please see http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 9
Please note: Because of technical complications which can arise by converting color figures to 'grayscale' (for the printed version should you not opt for color in print) please submit in addition usableblack and white versions of all the color illustrations.
Illustration servicesElsevier's WebShop (http://webshop.elsevier.com/illustrationservices) offers Illustration Servicesto authors preparing to submit a manuscript but concerned about the quality of the imagesaccompanying their article. Elsevier's expert illustrators can produce scientific, technical and medical-style images, as well as a full range of charts, tables and graphs. Image 'polishing' is also available,where our illustrators take your image(s) and improve them to a professional standard. Please visitthe website to find out more.
Figure captionsEnsure that each illustration has a caption. A caption should comprise a brief title (not on the figureitself) and a description of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum butexplain all symbols and abbreviations used.
TablesNumber tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place footnotes to tablesbelow the table body and indicate them with superscript lowercase letters. Avoid vertical rules. Besparing in the use of tables and ensure that the data presented in tables do not duplicate resultsdescribed elsewhere in the article.
ReferencesCitation in textPlease ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list (and viceversa). Any references cited in the abstract must be given in full. Unpublished results and personalcommunications are not recommended in the reference list, but may be mentioned in the text. If thesereferences are included in the reference list they should follow the standard reference style of thejournal and should include a substitution of the publication date with either 'Unpublished results' or'Personal communication'. Citation of a reference as 'in press' implies that the item has been acceptedfor publication.
Reference linksIncreased discoverability of research and high quality peer review are ensured by online links tothe sources cited. In order to allow us to create links to abstracting and indexing services, such asScopus, CrossRef and PubMed, please ensure that data provided in the references are correct. Pleasenote that incorrect surnames, journal/book titles, publication year and pagination may prevent linkcreation. When copying references, please be careful as they may already contain errors. Use of theDOI is encouraged.
Web referencesAs a minimum, the full URL should be given and the date when the reference was last accessed. Anyfurther information, if known (DOI, author names, dates, reference to a source publication, etc.),should also be given. Web references can be listed separately (e.g., after the reference list) under adifferent heading if desired, or can be included in the reference list.
References in a special issuePlease ensure that the words 'this issue' are added to any references in the list (and any citations inthe text) to other articles in the same Special Issue.
Reference formattingThere are no strict requirements on reference formatting at submission. References can be in any styleor format as long as the style is consistent. Where applicable, author(s) name(s), journal title/booktitle, chapter title/article title, year of publication, volume number/book chapter and the paginationmust be present. Use of DOI is highly encouraged. The reference style used by the journal will beapplied to the accepted article by Elsevier at the proof stage. Note that missing data will be highlightedat proof stage for the author to correct. If you do wish to format the references yourself they shouldbe arranged according to the following examples:
Reference styleText: All citations in the text should refer to:1. Single author: the author's name (without initials, unless there is ambiguity) and the year ofpublication;2. Two authors: both authors' names and the year of publication;
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 10
3. Three or more authors: first author's name followed by 'et al.' and the year of publication.Citations may be made directly (or parenthetically). Groups of references should be listed firstalphabetically, then chronologically.Examples: 'as demonstrated (Allan, 2000a, 2000b, 1999; Allan and Jones, 1999). Kramer et al.(2010) have recently shown ....'List: References should be arranged first alphabetically and then further sorted chronologically ifnecessary. More than one reference from the same author(s) in the same year must be identified bythe letters 'a', 'b', 'c', etc., placed after the year of publication.Examples:Reference to a journal publication:Van der Geer, J., Hanraads, J.A.J., Lupton, R.A., 2010. The art of writing a scientific article. J. Sci.Commun. 163, 51–59.Reference to a book:Strunk Jr., W., White, E.B., 2000. The Elements of Style, fourth ed. Longman, New York.Reference to a chapter in an edited book:Mettam, G.R., Adams, L.B., 2009. How to prepare an electronic version of your article, in: Jones, B.S.,Smith , R.Z. (Eds.), Introduction to the Electronic Age. E-Publishing Inc., New York, pp. 281–304.
Journal abbreviations sourceJournal names should be abbreviated according to the List of Title Word Abbreviations:http://www.issn.org/services/online-services/access-to-the-ltwa/.
Video dataElsevier accepts video material and animation sequences to support and enhance your scientificresearch. Authors who have video or animation files that they wish to submit with their article arestrongly encouraged to include links to these within the body of the article. This can be done in thesame way as a figure or table by referring to the video or animation content and noting in the bodytext where it should be placed. All submitted files should be properly labeled so that they directlyrelate to the video file's content. In order to ensure that your video or animation material is directlyusable, please provide the files in one of our recommended file formats with a preferred maximumsize of 50 MB. Video and animation files supplied will be published online in the electronic versionof your article in Elsevier Web products, including ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com.Please supply 'stills' with your files: you can choose any frame from the video or animation ormake a separate image. These will be used instead of standard icons and will personalize thelink to your video data. For more detailed instructions please visit our video instruction pages athttp://www.elsevier.com/artworkinstructions. Note: since video and animation cannot be embeddedin the print version of the journal, please provide text for both the electronic and the print versionfor the portions of the article that refer to this content.
AudioSlidesThe journal encourages authors to create an AudioSlides presentation with their published article.AudioSlides are brief, webinar-style presentations that are shown next to the online article onScienceDirect. This gives authors the opportunity to summarize their research in their own words andto help readers understand what the paper is about. More information and examples are available athttp://www.elsevier.com/audioslides. Authors of this journal will automatically receive an invitatione-mail to create an AudioSlides presentation after acceptance of their paper.
Supplementary dataElsevier accepts electronic supplementary material to support and enhance your scientific research.Supplementary files offer the author additional possibilities to publish supporting applications, high-resolution images, background datasets, sound clips and more. Supplementary files supplied will bepublished online alongside the electronic version of your article in Elsevier Web products, includingScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. In order to ensure that your submitted material isdirectly usable, please provide the data in one of our recommended file formats. Authors shouldsubmit the material in electronic format together with the article and supply a concise and descriptivecaption for each file. For more detailed instructions please visit our artwork instruction pages athttp://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Submission checklistThe following list will be useful during the final checking of an article prior to sending it to the journalfor review. Please consult this Guide for Authors for further details of any item.Ensure that the following items are present:
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 11
One author has been designated as the corresponding author with contact details:• E-mail address• Full postal address• TelephoneAll necessary files have been uploaded, and contain:• Keywords• All figure captions• All tables (including title, description, footnotes)Further considerations• Manuscript has been 'spell-checked' and 'grammar-checked'• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources (including the Web)• Color figures are clearly marked as being intended for color reproduction on the Web (free of charge)and in print, or to be reproduced in color on the Web (free of charge) and in black-and-white in print• If only color on the Web is required, black-and-white versions of the figures are also supplied forprinting purposesFor any further information please visit our customer support site at http://support.elsevier.com.
AFTER ACCEPTANCEUse of the Digital Object IdentifierThe Digital Object Identifier (DOI) may be used to cite and link to electronic documents. The DOIconsists of a unique alpha-numeric character string which is assigned to a document by the publisherupon the initial electronic publication. The assigned DOI never changes. Therefore, it is an idealmedium for citing a document, particularly 'Articles in press' because they have not yet received theirfull bibliographic information. Example of a correctly given DOI (in URL format; here an article in thejournal Physics Letters B):http://dx.doi.org/10.1016/j.physletb.2010.09.059When you use a DOI to create links to documents on the web, the DOIs are guaranteed never tochange.
Online proof correctionCorresponding authors will receive an e-mail with a link to our online proofing system, allowingannotation and correction of proofs online. The environment is similar to MS Word: in addition toediting text, you can also comment on figures/tables and answer questions from the Copy Editor.Web-based proofing provides a faster and less error-prone process by allowing you to directly typeyour corrections, eliminating the potential introduction of errors.If preferred, you can still choose to annotate and upload your edits on the PDF version. All instructionsfor proofing will be given in the e-mail we send to authors, including alternative methods to the onlineversion and PDF.We will do everything possible to get your article published quickly and accurately - please uploadall of your corrections within 48 hours. It is important to ensure that all corrections are sent backto us in one communication. Please check carefully before replying, as inclusion of any subsequentcorrections cannot be guaranteed. Proofreading is solely your responsibility. Note that Elsevier mayproceed with the publication of your article if no response is received.
OffprintsThe corresponding author, at no cost, will be provided with a PDF file of the article via e-mail (the PDF file is a watermarked version of the published article and includes a cover sheetwith the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use). Foran extra charge, paper offprints can be ordered via the offprint order form which is sent oncethe article is accepted for publication. Both corresponding and co-authors may order offprintsat any time via Elsevier's WebShop (http://webshop.elsevier.com/myarticleservices/offprints).Authors requiring printed copies of multiple articles may use Elsevier WebShop's'Create Your Own Book' service to collate multiple articles within a single cover(http://webshop.elsevier.com/myarticleservices/offprints/myarticlesservices/booklets).
AUTHOR INQUIRIESFor inquiries relating to the submission of articles (including electronic submission) please visitthis journal's homepage. For detailed instructions on the preparation of electronic artwork,please visit http://www.elsevier.com/artworkinstructions. Contact details for questions arising afteracceptance of an article, especially those relating to proofs, will be provided by the publisher.
AUTHOR INFORMATION PACK 23 Mar 2014 www.elsevier.com/locate/yexpr 12
You can track accepted articles at http://www.elsevier.com/trackarticle. You can also checkour Author FAQs at http://www.elsevier.com/authorFAQ and/or contact Customer Support viahttp://support.elsevier.com.
© Copyright 2012 Elsevier | http://www.elsevier.com
