UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - pos.uea.edu.br · O Virus varicela zoster (VZV) pertence a família Herpesviridae, que pode ser de origem selvgem (vírus VZV) ou vacinal (Oka vacina)

ESTUDO DE CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS VARICELA ZOSTER

EM MANAUS, AMAZONAS

DANIELE DE ARAÚJO SAMPAIO

MANAUS

2015

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DOUTOR. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

i



EM MANAUS, AMAZONAS

Dissertação apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropicalda Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador (a): Profª Dra. Maria Paula Gomes Mourão

Co-orientador (a): Dra. Michele de Souza Bastos

MANAUS 2015

ii

Ficha Catalográfica

S192 Sampaio, Daniele de Araújo.

Estudo de caracterização molecular do vírus varicela Zoster em Manaus,

Amazonas ./Daniele de Araújo Sampaio. -- Manaus : Universidade do Estado do

Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2015.

xiii, 53f. : il.

Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós- Graduação

em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas –

UEA/FMT, 2015.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Paula Gomes Mourão

Título em inglês: Molecular characterization study of varicella zoster virus

in Manaus Amazon.

1.VZV 2 Varicela. 3.Genótipo 4. Manaus Título.

CDU: 616.9(811.3)(043)

Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N Silva,lotada na Escola Superior de

Ciências da Saúde - UEA

iii


EM MANAUS, AMAZONAS


“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.

Banca Julgadora:

Maria Paula Gomes Mourão

Presidente

RajendranathRamasawmy

Membro

Felipe Gomes Naveca

Membro

iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por sua proteção e direcionamento para alcançar esta

conquista.

À minha família, pelo apoio e confiança para que eu concretizasse este

projeto. Minha mãe, meu pai e meus irmãos, por priorizarem minha educação acima

de tudo e por acreditarem em meus sonhos, entendendo-me nos momentos de

ausência, dando-me apoio e carinho.

Ao professor Dra. Maria Paula Gomes , minha orientadoar, por todos os

ensinamentos e paciência ao longo desses anos, contribuindo de maneira intensa no

meu aprendizado durante esta jornada.

À professora Dra. Michele Bastos, minha co-orientadora que me possibilitou

aprendizagens únicas, sempre me incentivando. Muito obrigada pela confiança e por

acreditar em meu potencial.

Ao professor Dr. RajendranathRamasawmy pela contribuição na construção deste

trabalho, incentivo e ensinamentos incansáveis.

Ao professor Dr. Felipe Naveca pela contribuição na construção deste

trabalho, incentivo e ensinamentos incansáveis.

A todos os professores Universidade do Estado do Amazonas/Programa de

Pós-graduação em Medicina Tropical, por todo aprendizado e atenção dispensado

no repasse dos conhecimentos durante as aulas e extra sala de aula.

À Fundação de Amparo à pesquisa di Amazonas(FAPEAM)pelo apoio

financeiro por meio de bolsa de estudo.

v

Aos membros da secretaria acadêmica da Pós-graduação em Medicina

Tropical e a todos os funcionários da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor

Vieira Dourado, pelo apoio e incentivo.

A todos os funcionários do da gerencia de virologia a Gerente Marcia

Castilhoe toda sua equipe, pela atenção e tempo disponibilizados.

Aos colegas da turma de Mestrado ano 2014, por todo aprendizado e

amizade, durante esta jornada de estudo.

Muito obrigada !

vi

RESUMO

O Virus varicela zoster (VZV) pertence a família Herpesviridae, sua espécie é conhecida como humano - 3 (HHV-3) e causa duas doenças distintas conhecidas: catapora (varicela) e herpes zoster. Na maioria dos países, entre 2 e 4% das crianças são hospitalizadas por complicações da varicela.O VZV pode causar algumas complicações no Sistema Nervoso Central (SNC), já em pacientes com AIDS existe um total de 71% dos casos, e na sua maioria causa encefalite.O VZV foi inicialmente classificado como neurotropico, mas experimentos ultilizando células T em animais mostra o tropismo para células T importantes para replicação e liberação de viriões.Epidemias são mais prevalentes em climas temperados, que ocorre na maioria das vezes durante o inverno e primavera. Isolante de varicela e HZ pode ser estudado em cinco genótipos distintos de VZV de áreas geográficas específicas, o domínio regional de genótipos específicos pode ter sido estabelecido pelo clima e outros fatores.O objetivo desse projeto é realizar estudo de caracterização molecular do vírus Varicela Zoster detectado em amostras clinica de pacientes atendidos em uma unidade terciaria de saúde no Amazonas. Foram incluidas 12 amostrasidentificadas no período de 2010 a 2014, na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), para a triagem foram aplificadas usando a região ORF8 e para o sequenciamento foi amplificado as regiões ORF22, 38 e 54. Todas as amostras foram sequenciadas e feito a análise filogenética . Seis amostras foram identificadas as cepas selvagem do VZV. Na região da ORF54 em umas das amostras foi observado mudanças na posição 95241 o que não descarta a possibilidade de mutações. E o clado 5 foi sugerido para duas amostras da região ORF22.

PalavrasChaves:VZV, varicela, genótipos, Manaus.

vii

ABSTRACT

VZV belongs to the Herpesviridae family, its kind is known as human - 3 (HHV-3) and causes two distinct diseases known: chicken pox (varicella) and shingles. In most countries, between 2 and 4% of children are hospitalized for complications of varicela.O VZV can cause some complications in the central nervous system (CNS), in AIDS patients there is a total of 71% of cases, and its Most cause encephalitis. The VZV was initially classified as a neurotropic but ultilizando T cell experiments on animals show tropism for T cells important for replication and release of virions. Epidemics are more prevalent in temperate climates, which occurs most often during the winter and spring. sample isolatedof chickenpox and HZ can be studied in five different genotypes of VZV specific geographic areas, the regional domain specific genotypes may have been set by the climate and other factors. The objective of this project is to conduct study of molecular characterization of the Varicella Zoster virus detected in clinical samples from patients treated in a tertiary health unit in the Amazon. Specifics are to identify the current VZV genotype in Manaus, make comparison study with viral strains from other regions and determine whether there is a relationship with severe disease according to genotype identify and differentiate the strains of wild-type and vaccine .Included were 12 samples, Included 12 samples were identified in the period 2010 to 2014 , at the Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado( FMT - HVD ) for screening DNA samples were amplified using the ORF8 region and the sequencing was amplified the regions Orf22 38 and 54. All samples were sequenced and made phylogenetic analysis. Six samples of the wild strains of VZV have been identified. In the region of ORF54 in one of the samples was observed changes in position 95241 which does not rule out the possibility of mutations. Clade 5 and has been suggested for the two samples ORF22 region.

Keywords:VZV , varicella , genotypes , Manaus.

viii

RESUMO LEIGO

O Virus varicela zoster (VZV) pertence a família Herpesviridae, que pode ser de origem selvgem (vírus VZV) ou vacinal (Oka vacina) humano - 3 (HHV-3) e causa duas doenças conhecidas como catapora e herpes zoster. Na maioria dos países, entre 2 e 4% das crianças são hospitalizadas por complicações da varicela. Esse vírus pode causar algumas complicações no Sistema Nervoso Central (SNC), sendo as mais comuns a inflamação e a infecção no cérebro. É um virus que apresenta propensão para infectar células que são importantes para processo de duplicação do DNA e liberação de outros vírus. Epidemias são mais prevalentes em lugares de clima temperados. O VZV pode ser estudado em cinco genótipos distintos, conforme as áreas geográficas específicas, o domínio regional de genótipo, que são os genes específicos, pode ter sido estabelecido pelo clima e outros fatores. O objetivo dessa dissertação foi realizar estudo de caracterização molecular do vírus Varicela Zoster detectado em amostras de vesíscula de pacientes atendidos em uma unidade terciaria de saúde no Amazonas. Foram incluidas 12 amostras identificadas no período de 2010 a 2014, na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado(FMT-HVD); para a triagem foi extraído o DNA e aplicadas técnica biomoleculares, e para o sequenciamento e feita análise filogenética. Em 6/12 (50%) das amostras identificou-se as cepas do vírus VZV. Na região da ORF54 em umas das amostras foi observado mudanças na posição 95241 o que evidencia a possibilidade de mutações. E duas amostras 5 e 7 da região ORF22 teve um agrupamento que inclui um ancestral comum classificado nos genótipos do VZV como clado 5.

PalavrasChaves:VZV, varicela, genótipos, Manaus.

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estrutura do vírus Varicela............................................................................................ 17

Figura 2 Organização do genoma do vírus da varicela-zoster.................................................... 20 Figura 3

Sistema de nomenclatura do VZV, adotado em 25 de julho de 2008, Whitechapel, Londres, Reino Unido................................................................................................... 21

Figura 4 Árvore filogenética mostrando os cinco grandes clades VZV...................................... 22

Figura 5 Mapa da distribuição geográfica dos clades do VZV................................................... 28

Figura 6 Representação da patogênese do VZV....................................................................... 24

Figura 7 Imagem do gel de agarose dos fragmentos de 275 pb da região ORF8 do VZV........ 34

Figura 8

Imagem do gel de agarose dos fragmentos de 447, 350 e 222pb das egiões ORF22, 38 e 54 respectivamente do VZV................................................................... 34

Figura 9 Imagem do gel de agarose do resultado da purificação com Polietilenoglicol (PEG).......................................................................................................................... 35

Figura 10 Imagem do gel de agarose do resultado da purificação com KIT.............................. 35

Figura 11 Representação do resultados das sequencias das regiões ORF 22, 38 e 54 alinhadas com a cepaDumas...................................................................................................... 37

Figura 12 Representação do ORF38 analizadas pela enzima de restrição PstI........................ 38

Figura 13 Representação do ORF54 analizadas pela enzima de restrição BglII. O (Y) significa a presença de (C) ou (T )............................................................................................. 39

Figura 14 Arvore filogenética do VZV baseada na incluindo as amostras 05 e 07....................... 41

x

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1 Tabela de descrição taxonômica do VZV..................... 15

Tabela 2 Tabela de primers usados para PCR........................... 31

Tabela 3 Tabela de primers usados para PCR para genotigem. 31

Tabela 4 Tabela de analise de variações do genótipo do VZV.... 40

xi

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA

˚C Graus Celsius A Adenina AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida C Citosina CEP Comitê de Ética e Pesquisa CMV Citomegalovírus DNA Ácido desoxirribonucleico EBV Epstein-Barr EUA Única Região Curta FAPEAM Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas FMT-

HVD Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado G Guanina HHV Herpes Vírus Humano HIV Vírus da Imunodeficiência Humana HSV Herpes Simples Vírus HZ Herpes Zoster ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IRL Repetições Internas Longas IRS Repetições Internas Curtas KSHV Herpes Vírus Humano associado ao sarcoma de Kaposi Nm Nanômetro Nº Número ORF Open Reading Frame(Fase de leitura aberta) PCR Polymerase chain reaction (Reação em cadeia da polimerase) Pb Base-pair R Região RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNC Sistema Nervoso Central SNP Single Nucleotide Polymorphism T Timina (T) Triangulação TRL Terminais Longos TRS Terminais Curtos UL Região Longa VZV Vírus de Varicela Zoster Α Alfa Β Beta Γ Gama

xii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 14

1.1A família Herpesviridae.......................................................................................... 14

1.2 Varicela Zoster..................................................................................................... 15

1.2.1 Estrutura do virion VZV..................................................................................... 16

1.2.1.1 Proteínas do virion........................................................................................... 17

1.2.1.2 Tegumento....................................................................................................... 18

1.2.1.3 Capsídeo.......................................................................................................... 18

1.2.1.4 Envelope.......................................................................................................... 18

1.2.1.5 Core.................................................................................................................. 19

1.2.2 Genoma do VZV.................................................................................................. 19

1.2.2.1 Genes do VZV.................................................................................................. 20

1.2.2.2 Filogenia e Genótipos VZV.............................................................................. 21

1.3 Complicações no Sistema Nervoso Central (SNC) do VZV................................... 22 1.4 Tropismo..................................................................................................................

23 1.5 Vacina Contra Varicela............................................................................................

25 1.6 Epidemiologia..........................................................................................................

26 1.7 Epidemiologia Molecular.......................................................................................

26

2 OBJETIVOS............................................................................................................ 29 2.1 Geral ......................................................................................................................

29 2.2 Específicos ............................................................................................................ 29

3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................... 30

3.1 Modelo de Estudo................................................................................................... 37

3.2 Seleção das amostras........................................................................................... 37

3.3 Método de diagnóstico molecular.......................................................................... 30

3.3.1 Detecção do genoma viral da família Herpesviridae........................................... 30

3.3.1.1 Extração de DNA............................................................................................. 30

3.3.1.2 Amplificação do DNA PCR.............................................................................. 30

3.3.2 Sequenciamento de nucleotídeo....................................................................... 31

3.3.2.1 Amplificação do DNA PCR............................................................................... 31

3.3.2.1.1 Purificação do produto da PCR..................................................................... 32

xiii

3.3.3 Genotipagem do vírus VZV ................................................................................ 32

3.3.4 Sequeciamento e analise filogenética................................................................. 32

3.4 Aspectos éticos....................................................................................................... 33

3.5 Financiamento........................................................................................................ 33

4 RESULTADOS.......................................................................................................... 34

4.1 Seleção de amostra e identificação do VZV.......................................................... 34

4.2 Amplificação do DNA para sequenciamento ........................................................ 34

4.3 Cronograma de Execução.................................................................................... 35

5DISCUSSÃO............................................................................................................. 42

6CONCLUSÃO............................................................................................................ 44

7 REFERÊNCIAS......................................................................................................... 45

8 ANEXOS.................................................................................................................... 55

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 A FAMÍLIA Herpesviridae

Os virus já são patógenos claramente conhecidos e que estão relacionados com o

homem e outras espécies há mais de 200 milhões de anos1.Mais de 300 diferentes

herpesvírus foram descobertos até agora, alguns pela sua associação com doenças e

outros usando a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)8.

Existe um agrande variação de vírus, devido à ampla ocorrência e diversidade, de

acordo com o International Committee on Taxonomy of Viruses-ICTV2 (2015) a família

Herpesviridaeé classificadaem 3 subfamílias: Alphaherpesvirinae, Bethaherpesvirinae e

Gammaherpesvirinae10.Esses membros têm como hospedeiros os répteis, aves e

mamíferos13 (Tabela 1).

Dentro da família Herpesviridae existem 8 espécies de vírus que podem infectar o

ser humano. A subfamília Alphaherpesvirinaeque inclui os Herpesvírus Simples tipo I e

II(HSV-1 e HSV-2), responsáveis, respectivamente, pela infecção damucosa labial e

genital e são vulgarmente conhecidos como Herpes. Essasubfamília inclui também o

gênero Varicellovirus contendo a espécie Herpesvirus humano - 3 (HHV-3), que causam

duas doenças conhecidas como catapora e herpes zoster9-10 (Tabela 1).

A segunda subfamília Bethaherpesvíruscompreendeao gêneroCytomegalovirus

ouCytomegalovirus Humanoque tem como espécie Herpesvirus humano-5 (HHV-5), que

na infecção primária está associada à síndrome da mononucleose. E nessa mesma

subfamília inclui o gênero Roseolovirus com a espécieHerpesvirus Humano-6A, 6B e 7

(HHV6, 6B e 7), responsáveis pela doença infantil infecciosa roséola9-10,3 (Tabela 1).

2

A subfamília Gammaherpesvirinae apresenta o gêneroLymphocryptoviruse sua

espécieé o Herpesvirus Humano-4 também conhecido comoEpstein-Barr (EBV), agente

etiológico da infecção popularmente conhecida como doença do beijo ou mononucleose

infecciosa, além de estar envolvido na patogênese de alguns tumores, como o linfoma de

Burkitt e o carcinoma nasofaringeal, eo gênero Rhadinovirustem, a espécie Herpesvirus

Humano-8 (HHV-8 ou KSHV), associado ao sarcoma de Kaposi 9-10(Tabela 1).

Tabela1 –Tabela de descrição taxonômica do VZV2

Fonte: www.ictvonline.org (2015).

1.2 Varicela Zoster

O Vírus Varicela Zoster (VZV) causa duas doenças distintas conhecidas:

varicela (catapora) e herpes zoster. A nomenclatura aprovada pelo ICTV2 é

Herpesvirus humano - 3 (HHV-3).

Não se sabe ao certo a origem da palavra catapora, mas uma possível

derivação do termo catapora é do antigo Inglês “gican” designando-os pox "coceira"

para diferenciá-lo de doenças como a varíola. As palavras zoster e herpes são

derivadas do grego e latin, que significa, respectivamente, um cinto ou cinta, e é,

obviamente, uma característica relacionada distribuição das erupções no corpo do

hospedeiro1.

Família Subfamília Gêneros Espécies

Herpesviridae

Alphaherpesvirinae

Simplexvirus Human herpesvirus 1 Human herpesvirus 2

Varicellovirus Human herpesvirus 3

Bethaherpesvirinae

Cytomegalovirus Human herpesvirus 5

Roseolovirus

Human herpesvirus 6A Human herpesvirus 6B Human herpesvirus 7

Gammaherpesvirinae Lymphocryptovirus Human herpesvirus 4

http://www.ictvonline.org/

3

Historicamente, a relação entre as etiologias de varicelae herpes zoster foi

sugerida pela primeira vez por von Bo'kay em1892, a partir de observação em

crianças que após a exposição a um adulto com Herpes Zoster desenvolveram a

Varicela14.

A varicela (catapora) é a manifestação da infecção primária com VZV e é

mundialmente umas das doenças mais conhecidas1, frequente na infância associada

à febre euma erupção vesicular, e estabelece latência nas células dos gânglios da

raiz dorsal, após a infecção primária4. O VZV é o único entre os herpes vírus

humano queinfecta através da lesão cutânea de pessoas infectadas e atinge o trato

respiratório por inalação de partículas virais,causando diversas complicações e risco

a vida do hospedeiro5-7.Estudos em crianças com varicela e que desenvolveram

trombocitopenia mostram que é consequência da destruição das plaquetas através

da resposta imune. Trombocitopenia durante varicela aguda está associada com

sangramento em lesões de pele, petéquias, púrpura, epistaxe, hematúria e

hemorragia gastrointestinal4,81.

Herpes zoster é uma manifestação de reativação do vírus VZVque antes

estava latente no sistema nevos central e, embora seja uma doença que raramente

ameaça a vida, a maior preocupaçãoda população épor causa da dor que ela causa,

não só devido à lesão aguda, mas também aneuralgia pós-herpética, a qual pode

ser muito debilitante e é notoriamente difícil de tratar1.

O vírus quando reativado pode se espalhar com um padrão centrípeto (ou

seja, em direção à medula espinhal ou o cérebro), um padrão centrífugo (isto é, em

direção à pele), ou ambos. A detecção do vírus em neurônios, oligodendrócitos,

células meníngeas, células ependimais, ou na parede do vaso sanguíneo exige

muitas vezes uma combinação de características morfológicas, imuno-histoquímica,

hibridação in situ, e PCR. A análise de PCR do líquido cefalorraquidiano continua a

ser o esteio para o diagnóstico das complicações neurológicas de VZV durante a

vida59.

4

1.2.1 Estrutura do virion VZV

A morfologia do virion de VZV pode ser vista usando microscopia eletrônica

tradicional, contendo um diâmetro médio de 150-200 nanômetros1,11.O virion é

formado por quatro elementos essenciais: umenvelope lipídico esférico que

apresenta glicoproteínas embutido, com o número de triangulação simetria

icosaédrica (T) igual a 16 icosahedral proteína do capsídeo, um núcleo (core)que

contém o DNA genômico de fita dupla linear, umcápsideque consiste em 162

capsômeros e um tegumento amorfo que rodea o capsídeo. As glicoproteínas

complexas são incorporados no envelope lipídico11,17. (Figura 1).

Figura 1. Estrutura do vírus Varicela. Fonte: Adaptado de Quinlivan;Breuer, 200563.

1.2.1.1 Proteínas do vírion

O VZV induz as células a produzirem cinco ou mais glicoproteínas, que são

conhecidas como gB (gp II), gC (gp IV), gE (gp I), gH (gp III) e gL, elas envolve o

envelope lipídico e durante a replicação viral são expressas nas membranas da

célula, permitindo que o vírus possa interagir com o seu ambiente.1,20

O grupo das glicoproteínas gB (gp II), induzem a artuculação do sistema

complemento dependente e independente de anticorpos neutralizantes, além de ser

a segunda glicoproteína mais abundante e imunogênicas do envelope do VZV21-25.

http://www.expasy.org/viralzone/all_by_protein/807.html

5

As glicoproteínas gC (gp IV), são reativadas com anticorpos anti-peptideos.

Os genes para estas pequenas glicoproteínas estão localizado na região Us com 39

kDa ORF no centro da região do VZV31.

As glicoproteínas gE (gp I), são as mais freqüentes do envelope do VZV25-26.

Elas provocam a fativação dosistema complemento-dependente neutralizando

anticorpos21, 27-30.

O grupo das glicoproteínas gH (gp III), também induz na formação do sistema

complemento22,28-29, sendo é a terceira mais abundante das glicoproteínas do

envelope do VZV23.

As propriedades que já são conhecidas das glicoproteínas do VZV se

assemelham com as dos HSV e pode fornecer uma visão mais aprofundada dentro

das funções biológicas dos imunógenos20.

1.2.1.2 Tegumento

É uma estrutura amorfa localizada entre o capsídeo e o envelope do vírus.

Apresentaum complexo de massa proteica e contém enzimas que controlam a

replicação do vírus e regulação da função celular1.Os tegumentos de

alphaherpesviruses contem mais de 20 proteínas codificadas pelo vírus32-33.

Essas proteínas do tegumento têm amplas funçõesincluindo a regulação viral,

expressão do gene da célula hospedeira durante a replicação, transporte de viriões

para o núcleo pelo recrutamento de células motores durante sua entrada e saída, e

montagem da partícula viral infecciosa34.

1.2.1.3 Capsídeo

6

Existem três formas: A (nulo), B (intermediário) e C (maduro). Proteínas de

montagem presentes na forma B são perdidas durante a inserção de DNA para

produzir o C1.

Caracteristicamente, a cápside detodos vírus herpes têm um diâmetro de 100-

110 nm. Os 150 capsômeros hexaméricas são 9,5 x 12,5 nm na seção longitudinal,

um canal aberto de 4 nm de diâmetro corre via superfície ao longo do eixo longo36.

1.2.1.4 Envelope

O VZV é um vírus envelopado. Uma estrutura membranosa complexa

derivada de porções de membranas celulares alteradas1. O envelope doherpesvírus

tem uma aparência típica trilaminar37.

1.2.1.5 Core

O Core do VZV contém DNA genômico de fita dupla linear17, que tem uma

forma toróide38-39.A baixa frequência de virions que apresentam essa morfologia

pode-se considerar suaconfiguração espacial do core no interior docapsídeo15.O

core pode também explicar a variação na forma do núcleo eminúmeros estudos40-41.

1.2.2 Genoma do VZV

A sequência completa do DNA do VZV foi publicada pela primeira vez em

1986 por Davison e Scott e em uma revisão geral da biologia molecular do VZVque é

dada por Davison em 19911.

Como todos os herpesvírus, oVZV tem um DNA linear de fita dupla, o genoma

é de tamanho variável, mas a sequência que foi obtida compreende 124.884 pb e

7

contem pelo menos 72 estrutura de leituras abertas (open reading frame ORF) que

contém 70 genes distribuídos igualmente entre as duas cadeias de DNA12,.

As estimativas de densidade flutuante, bem como de dados de sequências,

mostra um conteúdo de guanina (G) +citosina (C) de 46%, o que é muito mais baixa

do que a maioria das herpesviroses como 67% em herpes simples 1 (HSV) e 58%

no DNA de citomegalovírus (CMV). Dentro do genoma existem, porém, regiões ricas

em (G+ C), notavelmente as regiões de repetição1,18.

O genoma consiste em umaregião única longa (UL) delimitada por terminais

longos (TRL), repetições internas longas(IRL),e uma região única curta (EUA)

delimitada por curto interno (IRS) e repetições de terminais curtos (TRS)12(Figura 2).

O mesmo tem cinco regiões de repetição. A região 1 (R1) está localizado na

fase de leitura aberta (ORF) 11, a R2 está localizado na ORF14 (glicoproteína C),a

R3 em ORF22, a R4 entre ORF62 e a origem de replicação viral, e R5 entre o

ORF60 e 61. O comprimento das regiões de repetição varia entre as diferentes

estirpes de VZV e tem sido utilizada para distinguir-las12.

Figura 2. Organização do genoma do vírus da varicela-zoste. Fonte: Quinlivan;Breuer, 200563.

Apesar da motivação para estudar este vírusde importância médica, o

conhecimento da biologia molecular do VZV é rudimentar em comparação com o dos

outros quatro vírus de herpes que infectam os seres humanos: vírus herpes simplex

tipo 1 (HSV-1) e tipo 2 (HSV-2 ), citomegalovírus e vírus de Epstein-Barr (EBV)12.

8

1.2.2.1 Genes doVZV

A partir da descrição do genoma referente ao VZV, sabe-se que codifica pelo

menos 70 genes, três (ORF62, 63, 64) estão presentes em ambas as regiões de

repetição curtas. As funções de muitas das proteínas que eles codificam já foram

caracterizadas e estão localizados no tegumento do virione regulam a transcrição

viral12.19.

Os genes que foram identificados, em sua maioria, por analogia com o HSV1,

encontram-se listados com todos os 70 genes35. Apêndice A.

Em comum com outras herpesviroses, a síntese de proteínas do VZV envolve

amplamente três fases designadas: início imediato (α) que estão localizados no

tegumento do virion e regulam a transcrição do vírus, inícial (β) e tardio (γ).

1.2.2.2 Filogenia e Genótipos VZV

Apesar da homogeneidade do genoma de VZV, estirpes deste virus foram

distinguidas por meio de análise de vários tipos de mutações que dão origem ou

eliminam os fragmentos de polimorfismode restrição estável (RFLPs), ou resulta em

alterações na composição das regiões de repetição variáveis. A identificação de

polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) também permitiu a classificação das

cepas VZV geograficamente relacionadas em distintos genótipos ou clados42.

Uma vez que a nomenclatura do VZV em clados-genótipos foi baseada em

diferentes métodos de tipagem molecular, uma nova nomenclatura universal foi

introduzida mais recentemente, separando os genótipos em cinco clades principais

(1-5) com dois clades provisórios (VI e VII)43(Figura 3).

9

Figura 3- Sistema de nomenclatura do VZV, adotado em 25 de julho de 2008, Whitechapel, Londres, Reino Unido.Fonte: Adaptado de JUDITH BREUER et al.,201043.

Isolados de varicela zoster e HZ podem ser estudado em cinco genótipo

distinto de VZV de áreas geográficas específicas: Clado 1, o genótipo C (E1 / A);

Clado 2, genótipo J (B); Clado 3, genótipo B (E2 A / D); Clado 4, J2 genótipo (M2 /

B); Clado 5, genótipo A1 (M1)45.

Usando esta nova nomenclatura, a rede filogenética de cepas VZV ilustra as

relações evolutivas entre diferentes clados. Para verificar a diversidade genética do

VZV, osdiferentes termosgenótipode clado têm sido utilizados na literatura. Embora

a definição de genótipo refere-se a determinados alelos em loci especificados, e

clado significa um único “ramo” na árvore filogenética,44 e essa rede de filogenia do

VZV é baseada nas sequencias completas já identificadas (Figura 4).

Até o presente momento, a maioria dos dados de genotipagem foram na

análise deapenas alguns loci no genoma de VZV, e apenas 23 sequências do

genoma completotêm sido relatadas44.Referências de Genotipagem do VZV

foramfornecidas por vários países,o que estabeleceu de uma nomenclatura comum

que facilitará o intercâmbio de informações43.

10

Figura 4– Árvore filogenética mostrando os cinco grandes clades VZV.Arvore filogenética do VZV

baseada em sequencias completas. Clado 1 Incluem 10 cepas: referencia Dumas (NC001348), Netherlands; BC(AY548171), British Columbia, Canada; 36 (DQ479958), New Brunswick, Canada;49 (DQ479959), New Brunswick, Canada; referencia cepa MSP (AY548170),Minnesota, EUA; 32p5 (DQ479961), Texas, EUA; Kel (DQ479954), Iowa, EUA; SD(DQ479953), South Dakota, EUA; NH293 (DQ674250), EUA; SVETA (EU154348),Russia; clado 3 incluem 4 cepas: referencia 03-500 (DQ479957), Alberta,Canada; 11 (DQ47995), New Brunswick, Canada; 22 (DQ479956), New Brunswick,Canada; reference strain HJO (AJ871403), Germany; clado 2 incluem um cepa: referencia strain pOka (AB097933), Japão; clado 5 incluem 5 cepas referência CA123strain (DQ457052), California, USA; clado4 incluem 2 cepas: referencia 8(DQ479960), New Brunswick,

Canada and referencia DR (DQ452050), EUA.Fonte: JONAS SCHMIDT-CHANASIT et al.,201144.

1.3 Complicações no Sistema Nervoso Central (SNC) causado pelo VZV

O vírus varicela zoster pode causar algumas complicações no Sistema

Nervoso Central (SNC) que incluem: ataxia cerebelar, meningoencefalite, mielite

transversa e meningite asséptica, em crianças são raras, ocorrem em menos de 1%,

devido aos programas de vacinação em todo o mundo14.Sintomas causados pelo

VZV mais comuns são manifestados em meningite asséptica, meningoencefalite e

encefalite49,61.Quadro 1.

Os seres humanos são os únicos reservatórios para esses vírus.

Epidemiologicamente, HHV pode causar infecçõesem lactentes, crianças ou

adultos55. Em indivíduos comSíndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS)

quando o vírus da imunodeficiência humana (HIV)já danificou o sistema imune

celular o herpesvírus no período latente pode ser reativado e afetar posteriormente a

progressão da doença e sobrevidacausando uma doença oportunista58.

11

As manifestações neurológicas predominantesdo VZV em pacientes com

AIDS são concomitantecom a erupção por herpes zoster em 71% dos casos,

encefalite (37%), mielite(24%), radiculite (21%), meningite (17%), enecrose aguda de

retina (12%)60.

Os herpesvírus apresentam tropismo pelo sistema nervoso central, seja por

disseminação hematogênica ou transmissão neuronal56.A característica mais

importante do HHV é sua latência no tecido neuronal antes de serem reativado por

algum estímulo57. A maioria dos pacientes que têm varicela, mesmo aquelescom

complicações neurológicas, recuperam-se da doença16.

1.4 Tropismo

A resposta adquirida é importante durante a infecção do VZV, mas a resposta

inata que faz o controle da replicação viral, contribui significativamente na

persistencia do virus na população83.

A resposta celular inata faz parte da regulação patogênica da pele. Na

infecção do VZV é formada lesões na pele ao longo de 10 – 21 dias, considerado o

período de incubação da varicela82.

O VZV foi inicialmente classificado como neurotropico, mas experimentos

ultilizando células T em animais mostra o tropismo para células T importantes para

replicação e liberação de viriões84-66.

O VZV Infecta o hospedeiro atingindo a mucosa. A replicação local é seguida

de propagação nas amídalas onde o VZV ganha acesso as células T. As células T

infectadas seguem aos locais cutâneos de replicação. O VZV estabelece latência

nos glânglios sensoriais. A reativação da latência permite a segunda faze da

replicação ocorrendo na pele83.

12

Figura 6.Representação da patogênese do VZV.

Alguns estudos com xenoenxertos mostram a característica importante do

tropismo do VZV. As células T infectadas não se unem as células T não infectadas,

por isse motivo elas formam viriões completos e liberam os virus infecciosos87,88.

O VZV tem a habilidade em infectar células T de memória sem interromper

seu fluxo normal, por isso as lesões são desenolvidas, assim essas células são

consideradas células associadas a viremia89-91(Figura 6).

Em geral compreender o princípio da patogenese do VZV ao nível molecular

tem um potencial para produzir novas estratégias para tratar e previnir a infecçãodo

VZV83.

1.5 Vacina Contra Varicela

Takahashi et. al. em 1970 foi o primeiro a desenvolver e testar a vacina contra

varicela a partir de vírus atenuados de estirpes Oka de VZV. Essa reprodução foi

feita a partir do métodopadrão da época:o víru foi isolado e passado em fibroblastos

13

de embrião de porco-da-índia e expandido para produção de vacinas em células

WI384,68-69.

A vacina contra a varicela é a primeira contra hepesvirus que foi aprovada

para uso clínico em vários países70. Os primeiros a serem vacindados no Japão

foram pessoas saudáveis, em seguida foram crianças imunodeprimidas incluindo as

que tinham leucemia e tiveram bons resultados68, 70.

Em 1980 ensaios clínicos da vacina foram iniciados nos Estados Unidos

levando asua aprovação pelo Food and Drug Administration em 199571,72. Antes da

vacina contra varicela existiam 4 milhões de casos de varicela por ano no USA, após

ser licenciada consequentemente o índice de varicela reduziu para 76-87% no

período de 1995 a 200073.

Antes de desenvolver a vacina houve muitos questionamentos, um deles era

a possibilidade de que o vírus da vacina iria se tornar latente, possivelmente

resultando no desenvolvimento posterior de HZ, já que a vacina contem o vírus

infeccioso74.

Já existem estudos que mostram a reativação do vírus em crianças

leucêmicas imunizadas, porém a gravidade do herpes zoster nessas crianças

vacinadas foi significativamente menor do que nas crianças leucêmicas com

infecção natural do VZV75. Em um adulto saudável que recebeu a vacina, mesmo

após exposição ao vírus, não apresentou sintomas, porém mais tarde teve um

episódio de herpes zoster causado pelo tipo selvagem VZV77. Atualmente, para

melhor diferenciar o vírus atenuado (Oka) do vírus infeccioso da varicela, técnicas de

PCR utilizando RFLPs são desenvolvidas, e sãoconsideradas muito importantes em

estudos epdemiológicos66.

Pesquisas apontam que a eficácia da vacina não diminui substancialmente ao

longo do tempo, alcança 97% no primeiro ano e 84% oito anos após a vacinação78.

Em relação àproteção ela é modesta contra a infecção, moderada contra doença

clínica e muito bem contra a doença grava79. Indicações e contraindicações para a

14

administração de vacina têm sidoestabelecidas pela American Academy of

Pediatrics80.

1.6 Epidemiologia

A varicela é uma das doenças transmissíveis mais comuns, é

predominantemente uma doença da infância, acomete principalmente a faixa de

idade de 4 – 10 anos1.

O VZV tem uma ampla distribuição geográfica, pode ser detectada em

qualquer um dos cinco continentes. É o únicovírus dentre a família Herpesviridae

que causa doença em humanos, que podeser transmitido através da via aérea,

apresenta um padrão de sazonalidade, e suas epidemias anuais são mais

prevalentes em climas temperados, e ocorrem na maioria das vezes durante o

inverno e a primavera,45.

VZV pode ser transmitido diretamente após contato com as lesões na pele de

pessoas infectadas, o vírus propaga-se rapidamente a outros indivíduos

susceptíveis. O índice de HZ aumenta com a idade, apontando com uma idade por

volta de 50 anos o índice é de aproximadamente 3 casos / 1000 pessoa-ano. Com

80 anos de idade o índice alcança 10 casos / 1000 pessoa-ano4,45.

Pessoas de climas tropicais são grupos considerados de alto risco para

adquirir a varicela quando emigram para os países de alta endemicidade do VZV,

influenciando sua epidemiologia. A varicela não é uma doença de notificação

obrigatória no Brasil, o que torna sua prevalência difícil de ser estimada. A

epidemiologia do VZV pode ser medida a partir de estudos de soro prevalência ou

de casos notificados em geral50-52.

1.7 Epidemiologia Molecular

15

Muitos laboratórios desenvolveram metodologias de reação em cadeia da

polimerase (PCR)para melhor compreender a patogênese do VZV45.

Algunsdemonstram a detecção do VZV na saliva e outros no sangue46-47. Em

alguns estudos iniciais, o DNA do VZV foi caracterizado pelo RFLP, que analisou

variações de cepas entre o tipo selvagem e o tipo vacina. Os marcadores RFLP de

VZV são os ORF 38 (PstI), 54 (BglII) e 62 (Smal) são considerados para vacinas e

estudos epidemiológicos44.

A maioria dos estudos mostram que as cepas do tipo selvagem na América

do Norte eEuropa foram caracterizadoscomo PstI+ BglI-, Cepas africanas e asiáticas

foram BglI+, Japonês Oka-likecepas do tipo selvagem PstI+/ PstI-BglI+Smal-e a

cepavacinal OkaPstI-BglI+Smal+66,92.

Estudos de pesquisa genômica do VZV levaram à identificação de vários

genótipos, que circulam de forma estável estabelecendo distribuição global, e

analisando esse fluxo a observação é que esta distribuição está em fluxo em alguns

países devido a imigração44.

Esses estudos de genotipagem do VZV vêm sendo realizados para verificar

os seus genótipos e em que área geográfica estão localizados. Em um estudo

recente feito por Jonas Schmidt-Chanasit em 201144 mostra a distribuição dos

clados de acordo com a nomenclatura universal (Figura 5).

Nos países da Europa foi observado a presença do clade 1 em 50% das

amostras e 37% para o clade 3. Em conjunto,os clades 1 e 3 representaram 87%

das cepas circulantes de VZV na Europa44. Na África o mais abundante encontrado

foi o clade 5 com 100%, No entanto, deve considerar-se que apenas alguns vírus

foram avaliados a partir de apenas quatro países africanos44.

Por causa da longa história de colonização europeia os clades 1e 3, foram

detectadas com um total de 74%na Oceania. Esses mesmos clades são dominante

nas Américas com 87% incluindo estudos realizados no Canadá, México e Reino

Unido44.

16

Ao contráriode todos os outros continentes, o clade 2 do VZV

representadominância na Ásia. De um total de 134 amostras analisadas, 99 (74%)

pertencem ao clade já mencionado44.

Figura 5 - Mapa da distribuição geográfica dos clades do VZV. Fonte: JONAS SCHMIDT-CHANASIT et al.,201144.

Um genótipo recombinante proposto no Brasil,53é provavelmente uma cepa do

genótipo M. Dos 10 isolados obtidos no Brasil testados em laboratório, 8 foram

considerados da linhagens do genótipo M e tinham padrões semelhantes as dos

SNP´s descritos por Muir et ai54.

A análise genotípica poderia levar àidentificação de fatores de virulência e,

consequentemente, para a melhoria dacompreensão da biologia do VZV104. Outra

questão importanteque pode ser solucionado usando esta abordagem é a avaliação

do direcionamento e predisposição da filogenia do VZV na população vacinada e

não vacinada54.

Em princípio, o domínio regional de claodos específicos do VZV pode ser

dependente de fatores ambientais, condições evolutivas, interações e ou importação

do vírusatravés da imigração ou de viagens. As abordagens inovadoras para a

vigilância global de clados VZV são ferramentas importantes para resolver estas

perguntas.

17

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Realizar estudo de caracterização molecular do vírus Varicela Zoster

detectado em amostras clinicas de pacientes atendidos em uma unidade terciaria de

saúde no Amazonas.

2.2 Específicos

Identificar o genótipo do VZV circulante em Manaus.

Identificar e diferenciar as cepas dos tipode selvagem e vacinal.

Realizar estudo de comparação com cepas virais de outras regiões e com a

vacinal, com a finalidade de identificar mutações no genoma.

18

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Modelo de Estudo

Estudo descritivo de caracterização molecular dos casos de VZV identificados

no período de 2010 a 2014, na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira

Dourado(FMT-HVD).

3.2 Seleção das amostras

Toda amostra clínica de vesículas de pele sugestivas de catapora e/ou herpes

zoster, que foram confirmadas por PCR para o vírus VZV, selecionadas no período

de janeiro de 2010 a dezembro de 2014, foram incluídas no estudo de

caracterização molecular.

3.3 Método de diagnóstico molecular

3.3.1 Detecção do genoma viral da família Herpesviridae

3.3.1.1Extração de DNA.

O DNA viral foi extraído utilizando QIAamp Viral DNA Mini Kit (QIAamp Blood

DNA Mini Kit, Qiagen), seguindo-se as instruções do fabricante.

3.3.1.2 Amplificação do DNA PCR

A amplificação gênica foi realizada pela técnica de PCR, e permitiu identificar

o vírus a partir da região ORF8 do VZV, utilizando os primers VP22, VM20, descritos

por MARKOULATOS, et al. (2001)65. Tabela 2.

19

Tabela 2–Tabela de primers usados para PCR65

Primers Sequências (5'→ 3' ) Vírus Região do Posição Comprimento

Genoma Amplificado do Primer do Amplímero(bp)

VP22 CACACGATAATGCCTGATCGG VZV ORF 8

9796–9816 275

VM20 TGCTGATATTTCCACGGTACAGC 10049–10071

A detecção do produto da PCR foi realizada através de eletroforese em gel de

agarose 2% corado com brometo de etídio, sendo registrado em sistema de foto

documentação digital.

3.3.2Sequenciamento de nucleotídeo

3.3.2.1 Amplificação do DNA PCR

A PCR foi otimizada, ultilizando seis pares de primer´s para amplificar

osfraguimentos das regiões conservadas do VZV, como anteriormente já descrito

54(Tabela 3).Para os pares de prime´s Nla/Fok e PstA/B foi realizado dez ciclo de

amplificação a 95°C por 30 segundos e 63°C por 1 minuto, trinta ciclos a 95°C por

30 segundos, 60°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos, seguido por um ciclo

de 72°C durante 10 minutos, usando o termocicladoreppendorf (Marstercycler

gradiente).E para o primer p22R1f/p22R1r foi realizado vinte e cinco ciclo de

amplificação a 95°C por 1 minuto, 50°C por 1 minuto e 72°C por 3 minutos, seguido

por um ciclo de 72°C durante 10 minutos, usando o termociclador(Applied

Biosystens).

Tabela 3–Tabela de primers usados para PCR para genotigem54

PRIMER

Nome sequencia (5`→ 3`) fraguimentos ORF

Nla GGAACCCCTGCACCATTAAA 222 54

Fok TCCCTTCATGCCCGTTACAT

Pst A TTGAA CAATCACGAACCGTT 350 38

Pst B CGGGTGAACCGTATTCTG AG

p22R1f GGG TTT TGT ATG AGC GTT GG 447 22

p22R1r CCC CCG AGG TTC GTA ATA TC

20

Foi realizado eletroforese em gel de agarose 1,8% corado com brometo de

etídio, para a detecção dos fraguimentos, sendo registrado em sistema de foto

documentação digital.

3.3.2.1.1 Purificação do produto da PCR

O produto amplificado foi purificado de acordo com os fraguimentos das

regiões conservadas do VZV escolhodas. Para os fraguimentos de tamanho 447 pb

e 350 pb foi realizado o método de precipitação de produto da PCR com

Polietilenoglicol (PEG),e os fraguimnetos de tanho 222 pb foi realizado pelo

kit.Confirmado pela eletrofose em gel de aragose 1,8%. Após a purificação foram

quantificadas usando NanoDrop 200 (thermo scintifo)e diluídas para uma

concentração de 10ng/µl devido ao tamanho do produto obtido para fazer o

sequenciamento.

3.3.3 Genotipagem do vírus VZV

3.3.4Sequeciamento e analise filogenética

O sequenciamento do DNA foi realizado pelo sequnciador (3130xl Genetic

analyzer), a reação de sequenciamnto dos produtos da PCR purificados foi usado o

BigDye Terminator, version 3.1. De cada primer (5 pmol/µl) foi usado 0,5µl, 10ng de

produto do DNA purificado e 2µl de Tampão. E iniciando o sequenciamento

utilizando no termociclador(Applied Biosystens).com 25 ciclos de 95°C de 10 s, 50°C

de 5 s, 60°C de 4 s e 1 ciclo com 4 min em ∞. E antes de ir para o sequenciador foi

feita uma precipitação com HIDI e incubada por 95°C por 3 min no gelo.

Todas as sequencias foram alinhadas e comparadas com a cepa Dumas

(GenBank numero de acesso X04370), usando o programa (Geneious 7.1.9).A

arvore filogenética foi do tipo concatenada sequenciadas as 3 ORF escolhidas.

Metodo de referência BAYESIANA com 1 milhão de geração e variação com sítio

invariável e analizado a cada 1000 gerações, modelo de substituição HKY85

21

ultilizando o programa (Model test 2.1.7), metodo AIC para escolher o modelo.

3.4 Aspectos éticos

Este projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em

Seres Humanos (CEP) da FMTAM (Processo Nº 2891, de 5 de dezembro de 2007) e

está de acordo com as normas previstas na resolução Nº196/96, do Conselho

Nacional de Saúde.

3.5 Financiamento

Projeto aprovado no Edital 021/2011 Universal/FAPEAM

22

4 RESULTADOS

4.1 Seleção de amostra e identificação do VZV

Foram incluídas 12 amostras de vesículas de pele sugestivas de catapora

e/ou herpes zoster. Tiveram o DNA amplificados de acordo com região específica

do VZV ORF 8 (Figura 7).

1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 B

275 pb

Figura 7- Imagem do gel de agarose dos fragmentosde 275 pb da região ORF8 do VZV.

4.2Amplificação do DNA para sequenciamento

Todas as 12 amostras amplificadas para os fraguimento de 350 e 222 pb e

10 amostraspara os fraguimentos de 477 pb região ORF 22, 48 e 54 (Figura 8). As

mesmas foram purificadas usando a metodologia de acordo com o tamanho de seu

fraguimento como anteriormente mencionado (Figura 9 e10).

1 2 3 4 B 1 2 3 4 B M 1 2 3 4 B

447 pb 350 pb 222pb

Figura 8- Imagem do gel de agarose para os fragmentosde 447, 350 e 222pb das regiões ORF22, 38 e 54 respectivamente do VZV.

23

5 6 7 8 9 10 11 12 B M 5 6 7 8 9 10 11 12 B M

350 pb 222 pb

Figura 9- Imagem do gel de agarose do resultado da purificação com Polietilenoglicol (PEG).

5 6 7 8 9 10 11 12 B M

447 pb

Figura 10- Imagem do gel de agarose do resultado da purificação com KIT.

4.3 Sequenciamento e análise filogenética

Das 10 amostras sequenciadas para a região ORF 22 apenas 3 obtiveram

boas sequencias , para região ORF 38 froram sequenciadas 12 amostras, mas 8

foram consideradas e para a região ORF 54 também foram sequenciadas 12

amostras e todas as amostras foram aproveitadas. As amostra aproveitadas foram

alinhas com a cepa Dumas (Figura 11).

Para a identificação dos SNPs o sequenciamento direto é mais preciso e

informativo, que é usado para diferenciar as cepas dos VZV. As amostras

sequenciadas para a ORF 38 (PstI), 54 (BglII) foram analizadas por enzimas de

restrições para identificar de cepas entre o tipo selvagem e o tipo vacinal. Houve

uma mudança de C para T na posição 95241 nas amostras 01, 02, 03, 08, 10 e 12 o

que conduz à eliminaçãode um local de enzima de restrição Bgll ORF54 em que se

24

encontra em todas as cepas japonesas e que está ausente na maioria dos VZV

isolado no EUA (Figura 12 e 13).

Foram analizandas as amostras sequenciadas das ORF38 (PstI), 54 (BglII)

para a diferenciação das cepas selvagens das cepas vacinal, as amostras 01, 03,

04, 05, 07, 09 e 10 foram designadas tipo selvagem wt (wild-type), sendo que as

amostras 01, 03 e 10 são mais comuns na America Norte e Europa (Tabela 4).

A analise das variações do genótios usando dados da ORF54 mostra qua as

amostras 01, 02, 03, 08, 10 e 12 apresentão variações comuns para os clades 1, 3 e

VI (provisório). As amostras 05, 06, 07, 09 e 11 tem variações comuns para o clade

2, 4 e 5 (Tabela 4).

25

Figura 11- Representação do resultados das sequencias das regiões ORF 22, 38 e 54 alinhadas com a cepa Dumas12.

26

Figura 12. Representação da ORF38 analizadas pela enzima de restrição PstI.

27

Figura 13.Representação daORF54 analizadas pela enzima de restrição BglII. O (Y) significa a presença de (C) ou (T ).

28

Amostra

ORF22 (37857-38263*) ORF38 (69270-69579*) ORF54 (95129-95310*)

ORF38 ORF54 Designação de cepas (Região) Clade

38081 69424 95241 95300

1 - G T (1,3,VI) C PstI+ BglI- wt(America Norte/Europa) N/D

2 - - T (1,3,VI) C - BglI- N/D N/D

3 - G T (1,3,VI) C PstI+ BglI- wt (America Norte/Europa) N/D

4 - G Y Y PstI+ BglI+/BglI- N/D N/D

5 C (2,4,5,VI,VII) G C (2,4,5) T PstI+ BglI+ wt 5

6 A (1,3) - C (2,4,5) T - BglI+ N/D N/D

7 C (2,4,5,VI,VII) A C (2,4,5) T PstI+ BglI+ wt 5

8 - - T (1,3,VI) C - BglI- N/D N/D

9 - G C (2,4,5) T PstI+ BglI+ wt N/D

10 - G T (1,3,VI) C PstI+ BglI- WT (America Norte/Europa) N/D

11 - - C (2,4,5) - - BglI+ N/D N/D

12 - - T (1,3,VI) C - BglI-

N/D N/D

* Posições na região indicada. () indica os clades proposto. – amostras não analizadas por motivo de sequencias fracas. wt (wild-type) cepa selvagem. N/D não determinada. Na

ORF54 em verde indica variações comuns para o clade 1, 3 e VI, em amarelo indica variações comuns para o clade 2, 4 e 5, em vermelho significa (C) ou (T) podendo ter mais de um genótipo ou uma mutação. Na ORF22 em verde indicas variações comuns para o clade 1 e 3 e em amarero indicações momuns para o clade 2, 4, 5, VI e VII.

Tabela. 4. Tabela de analise de variações do genótipo do VZV

29

Na ORF22 algumas variablilidades foram aparentes para apenas para um

clade. Amostra 06 apresenta variação comum para os clades 1 e 3, e as amostras

05 e 07 a proncípio apresentam variações comuns para os clades 2, 4, 5, VI e VII

esses dois ultimos considerados provisórios, porém, as mesmas amostras aprentam

todas as variações indicativa para o clade 5 (Tabela 4).

A arvore filogenética foi construída usando cepas referencia de sequências

(BLAST) limitando apenas na ORF22, indicando que a amostra 05 e 07

apresentaram a tendência para o clado 5 (Figura 14).

Figura 14.Arvore filogenética do VZV baseada na incluindo as amostras 05 e 07. Clado 1 Incluem 10 cepas:

referencia Dumas (NC001348), Netherlands; BC (AY548171), British Columbia, Canada; 36 (DQ479958), New Brunswick, Canada; 49 (DQ479959), New Brunswick, Canada; referencia cepa MSP (AY548170), Minnesota, EUA; 32p5 (DQ479961), Texas, EUA; Kel (DQ479954), Iowa, EUA; SD (DQ479953), South Dakota, EUA; NH293 (DQ674250), EUA; SVETA (EU154348), Russia; clado 3 incluem 4 cepas: referencia 03-500 (DQ479957), Alberta, Canada; 11 (DQ47995), New Brunswick, Canada; 22 (DQ479956), New Brunswick, Canada; reference strain HJO (AJ871403), Germany; clado 2 incluem 4 cepas: referencia strain pOka (AB097933), Japão, VariVax (DQ008355), VariVax (DQ008354), Oka, sustrain pOka (AB097932); clado 5 incluem 1 cepa referência CA123

strain (DQ457052), California, USA; clado 4 incluem 2 cepas: referencia 8 (DQ479960), New Brunswick, Canada and referencia DR (DQ452050), EUA.

30

5 DISCUSSÃO

A genotipagem é uma ferramenta epidemiológica útil para muitos humana

herpesvírus, embora não tenha geralmente levado a correlações entre variação de

sequência e patologia vírus95-99.

Protocolos de genotipagem destinados ao laboratório foram desenvolvido

para simples execução. Eles também devem ser capazes de produzir resultados a

partir da quantidade limitada de DNA tipicamente recuperado a partir de amostras

clínicas , por exemplo , vesicular. As amotras de vesicula mostrou que mantem rica

em DNA conservado, e a otmização do PCR anteriormente já descrito, amplificaram

as amostras de acordo com seus respectivos fragmentos, o que indica uma boa

reprodução do protocolo54.

O sistema de nomenclatura do VZV, adotado em 25 de julho de 2008,

também foi ultilizado neste trabalho para padronizar e melhor compreenção das

classificações dos clados. Nesse estudo com as regiões definidas ORF22, 54 e 38,

nas amostras em geral foi possível identificar variações importantes para todos os

clados

Eu executei alvo ORF de sequenciamento para uma variedade de isolados

distribuídos globalmente , começando com uma comparação entre o sítio PstI em

ORF38 e site da BglI em ORF54 . Análise com enzimas de restrição são importante

para a determinação das cepas do VZV, na diferenciação da cepa vacinal com a

cepa selvagem ultilizando as ORF´s 38 (PstI) e 54(BgtI). As cepas selvagem wt na

América do Norte e Europa é comum encontrar PstI+ BglI-, na África e Ásia BglI+, no

Japão PstI+/- BglI- Smal+ eavacinal PstI- BglI+Smal+62,92.

Em todas as amotras foram encontradas a presença do sítio PstI o que

evidencia a ausencia da cepa vacival entre as amostras, apresentando apenas a

cepa selvagem algumas encontradas nas Américas e Europa. Outros estudos

mostram que 70% de numeros de cepas analizadas foram observadas na Europa

para o clado 544. A presença dessas cepas pode ser explicada pelos principais

31

países de origem de imigrantes do Brasil, mostrando que entre 2015 a 2010, 25%

são dos Estados Unidos e 6% do Reino Unido105.

A região da ORF54(BgtI) pode ser ultilizado para diferenciar cepas da região

européia e América do Norte das japonesas, porem EstadosUnidos, Canadá, grande

parte da Europa , Austrália oriental e América do Sul, onde as cepas doVZV para os

clados 2, 4 e 5 não são tão encontrados.Por tanto a ORF54 apresentou apenas

algumas variações comuns encontradas em quase todos os clados e tambem houve

uma mudança de bases na região 95241 da amostra 04 podendo ser uma mutação

ou outros genótipos.

Este marcardor ORF22 derivado de 447 pb resolve genótipos distintos

que se correlacionam com a nossa compreensão da variabilidade VZV54. Para fazer

o mapeamento dos genótipos foi utilizado o protocolo de genotipagemdefinido por

outros estudos54,43. E duas amostras correspondente a região da ORF22 apresentou

uma linhagem que é definida para o clado 5. A presença desse clado provavelmente

é explicado pela questão das imigracões no Brasil nos ultimos anos.

Uma observação foi a descoberta de domínio geográfico de cepas do

genótipo M (clado 5) em áreas tropicais e subtropicais, como África (RDC, República

do Tchad,Marrocos) e na Ásia (Índia, Bangladesh, Nepal e China). E cepas mais

recentemente obtida a partir de Brasil, Argentina, CoteD'Ivoire, Etiópia, Zimbábue,

África do Sul, Tailândia, Vietnã,norte da China, Grã-Bretanha, Tajiquistão,

Cazaquistão, Uzbequistão,Quirguistão, Turcomenistão e Azerbaijão54.Outra

evidencia baseadas nessas mesmas amostras foi a árvore filigenética, que

apresentou a tendencia de linhagem também para o clado 5.

A origem de cepas do VZV poderia refletir a imunogenética do local da

população humana em que originalmente evoluiu.Referente a distribuição do

genótipo tambem reflete as qualidades demograficas.Além disso , foi sugerido que

os eventos de recombinação podeter influenciado a evolução dos diferentes clados

já existentes do VZV100-103.

32

6 CONCLUSÃO

De todas as amostras analizadas apenas nas 5 e 7 froram observadas

possível linhagem para o clado 5. A ávore filigenética mostra a mesma linhagem

para o clado 5.

Nesse estudo foi isolado o DNA do VZV para análises genéticas e

caracterização de cepas do VZV, e seis amostras encontradas foram consideradas

cepas selvagem o que evidencia a ausência de cepas vacinais Oka Vacina, entre as

amostras estudadas em Manaus.

Todas as amostras foram alinhadas e comparadas com a cepa Dumas, para

identificar os SNP´s que possa determinar os clados, mas apenas duas amostras 5 e

7 foram consideradas mais próximas do clado 5, e as mesmas foram comparadas

com outras cepas inclusive a vacinal, porém limitadas pela região ORF22 o que

possibilitou a formação da árvore filigenética.

Algumas amostras apresentaram alterações indeterminadas em algumas

posições, mas para defini-las é necessário refazer as sequências e analizar outras

vezes.

33

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43

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8 ANEXOS GENES VZV

VZV gene products

VZV gene

HSV-1 homolog

VZV protein function

1 None Membrane protein

2 None

3 UL 55

4 UL 54 Transactivator, tegument protein, expressed in latency

5 UL 53 gK

6 UL 52

7 UL 51

8 UL 50 Deoxyuridine triphosphatase

9 UL 49 Tegument protein

9ª UL 49 Syncytia formation, putative Gn

10 UL 48 Transactivator, tegument protein

11 UL 47

12 UL 46

13 None Thymidylate synthetase

14 UL 44 Gc

15 UL 43

16 UL 42 Putative small subunit of viral DNA polymerase

17 UL 41 Induces RNA cleavage

18 UL 40 Ribonucleotide reductase, small subunit

19 UL 39 Ribonucleotide reductase, large subunit

20 UL 38

44

21 UL 37 Nucleocapsid protein, expressed in latency

22 UL 36

23 UL 35 Capsid assembly

24 UL 34

25 UL 33

26 UL 32

27 UL 31

28 UL 30 DNA polymerase

29 UL 29 ssDNA binding protein, expressed in latency

30 UL 28

31 UL 27 Gb

32 None Probable substrate for ORF47 kinase

33 UL 26 Protease

33.5 UL 26.5 Assembly protein

34 UL 25

35 UL 24 Cell-to-cell fusion

36 UL 23 Thymidine kinase

37 UL 22 Gh

38 UL 21

39 UL 20

40 UL 19 Major nucleocapsid protein

41 UL 18

42/45 UL 15

43 UL 17

44 UL 16

46 UL 14

47 UL 13 Protein kinase, tegument protein

48 UL 12 Putative Dnase

49 UL 11 Virion protein

50 UL 10 Gm

51 UL 9 Origin binding protein

52 UL 8

53 UL 7

54 UL 6 Putative portal protein

55 UL 5

56 UL 4

57 None Cytoplasmic protein

58 UL 3

59 UL 2 Uracil-DNA glycosylase

60 UL 1 Gl, chaperone for Gh

61 ICP 0 Transactivator, transrepressor

62,71 ICP4 Transactivator, tegument protein, expressed in latency

63,7 US1 (ICP22) Tegument protein, transrepressor, inhibits interferon- alpha, expressed in latency

64,69 US10

65 US9 Virion protein

66 US3 Protein kinase, expressed in latency

45

67 US7 (Gi) Gi

68 US8 (Ge) Ge

S/L None Cytoplasmic protein (also referred to as ORF0)

Fonte: ANDREW J. DAVISON et al.,1986.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - pos.uea.edu.br · O Virus varicela zoster (VZV) pertence a família Herpesviridae, que pode ser de origem selvgem (vírus VZV) ou vacinal (Oka vacina)