Université d’ORAN · 2015-05-05 · Remerciement Je tiens d’abord à adresser toute ma gratitude au Professeur Bellahcene M. sans lequel ce travail n’aurait pu aboutir, je

اىجمسح اىجضائشح اىذمقشاطح اىشعثح

اىعيمصاسج اىرعيم اىعاى اىثذس

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la recherche scientifique

Université d’ORAN

Faculté des Sciences

Département de Biotechnologie

Mémoire de MAGISTER

En Biotechnologie

Option: Intérêt des microorganismes

en Agriculture et en Agro-alimentaire

Présentée par

TLEMSANI MOKHTARIA

Intitulé

Contribution à l'étude du flétrissement vasculaire du pois

chiche (Cicer arietinum L.) causé par Fusarium oxysporum

Schelcht. Emend. Snyd. & Hans. f. sp. ciceri (Padwick):

caractérisation, lutte biologique et comportement variétal

Soutenu le /11/2010 devant la commission d’examination :

Président:

Examinateurs:

Rapporteur:

Mme

Fortas Z.

M. Djibaoui R.

M. Kacem M.

M. Bellahcene M.

Professeur

Maitre de conférences

Maitre de conférences

Professeur

Université d'Oran

Université de Mostaganem

Université d'Oran

Université de Mostaganem

Dédicace

A mes parents pour les efforts et les sacrifices faits pour que je puisse réaliser ce

travail.

A ma sœur et mes frères: Fatiha, Mohammed, Nabil, Hocine en témoignage de leur

soutien et leurs encouragements incessants.

Pour les moments extraordinaires passés ensemble je tiens à remercier mes amis et mes

collègues: Gabed Noujoud, Kébayli Hakima, Bouslama Nabila, Fatima Zitouni, Fatima

Taharia, Sidhoum Warda, Harir Mohamed pour leur fidèle soutien pendant les années

d’études et pour tous les excellents souvenirs.

A tous ce que j’ai oubliés, mais qui se reconnaîtront ici.

Tlemsani Mokhtaria

Remerciement

Je tiens d’abord à adresser toute ma gratitude au Professeur Bellahcene M. sans

lequel ce travail n’aurait pu aboutir, je le remercie pour sa gentillesse, son soutien et pour le

fait de m’avoir fait partager son expérience, je lui adresse toute ma reconnaissance pour sa

patience, sa disponibilité et sa participation active lors de la rédaction de mémoire.

Je remercie vivement Madame le Professeur Fortas Z., chef d'équipe au laboratoire de

Biologie des Microorganismes et Biotechnologie à l'université d'Oran Es- Sénia, pour le fait

de m’avoir accueilli dans son équipe de laboratoire et pour ses conseils toujours pertinents et

son soutien moral et professionnel pendant le mémoire mais aussi pendant toutes les années

d’études.

Mes remerciements vont également à Monsieur Djibaoui R., Maitre de conférences à

l'université de Mostaganem et Monsieur Kacem M., Maitre de conférences à l'université

d'Oran Es- Sénia, qui ont acceptés d’examiner ce travail avec bienveillance.

J’exprime également mes remerciements et ma reconnaissance à Monsieur Labdi A.,

directeur de l'INRA de Sidi Bél-Abbès et Monsieur Zénai R., directeur de l'ITGC de Saida

pour m'avoir offert le matériel végétal nécessaire pour ce travail.

Je remercie également Monsieur Bekkar A. A., enseignant à l'université de Mascara,

de m'avoir aidé dans la réalisation de l'étude statistique.

Je remercie M. Bensehla, Professeur à l'université d'Oran, de m'avoir accueilli dans

son laboratoire, pendant la réalisation de l'étude biométrique.

Un grand merci pour Monsieur Miloudi, enseignant au département de chimie,

université d'Oran, qui m’a appris les méthodes d’analyse chimique de laboratoire nécessaires

pour ce travail, je leur adresse tout mon respect pour sa disponibilité et sa gentillesse.

Je tien à remercie M. Abdi Y, sous directeur de la station météorologique d'Oran, pour

m'avoir facilité l'obtention des données climatiques.

Je remercie vivement M. Djibaoui R. Maitre de conferences à l'université de

Mostaganem m'avoir aidé dans l'identification des actinommycètes.

Je leur serai toujours reconnaissante pour leur aide et leurs conseils et je pense

spécialement à Mmes

Bouchentouf L, Dib S, Mejdoub H, Tahri A, Tahari F, Kébayli H.

Enfin, que tous ceux, de prés ou de loin, dont l'assistance ou les conseils m'ont permis

de mener à bien ce travail, trouvent ici l'expression de ma profonde gratitude.

Résumé

Au cours des prospections, nous avons constaté que les attaques du flétrissement du

pois chiche dû à l’agent causal Fusarium oxysporum f. sp. ciceri dans 03 régions (Tlemcen,

Ain Temouchent et Mostaganem) peuvent prendre une grande ampleur lorsque les conditions

climatiques sont favorables. Ainsi, l'incidence et la gravité déterminées dans ce présent travail

sont élevées surtout dans les localités d’Ain Témouchent et Tlemcen. Les symptômes

manifestés ont consistés en un jaunissement tardif qui s'exprime sous forme d'un jaunissement

vasculaire progressif de la plante du bas en haut.

Parallèlement, les diverses techniques d’isolement et d’identification employées ont

permis d’élucider certains aspects morphologiques: culturales et biométriques chez 17 isolats

de FOC (Fusarium oxysporum f. sp. ciceri). L’étude des caractéristiques morphologiques a

permis de distinguer 03 morphotypes sauvages différents: cotonneux, ras muqueux, duveteux

et une variabilité dans l'aspect et la pigmentation entre les cultures jeunes et âgées. Ainsi

l'étude biométrique a révélée des variabilités dans la longueur et la largeur des microconidies

(5.55 - 8.44 x 2.28 -2.78 µm) et des macroconidies (18.2-29.64 x 2.81- 4.03 µm). L'étude

physiologique de 17 isolats de FOC nous a permis de déterminer que le milieu le plus

favorable pour la croissance de FOC est le milieu pois chiche et que la température optimale

pour ce parasite est autour de 30°C et un pH de 5.5 est le plus favorable. Nous avons

démontré aussi que l'obscurité apparait adéquate pour le FOC que l'incubation sous lumière

continue et ceci induit la pigmentation. Concernant la détermination de la source de carbone

nous avons remarqué que le glucose est la meilleur source, en revanche la peptone s'est révèle

être la meilleur source d'azote.

Le test de confrontation directe nous a permis de selectionner 06 souches

d'actinomycètes antagonistes vis-à-vis 03 isolats de FOC. Ainsi les tests de filtrats de culture

nous ont permis de confirmer la production des antibiotiques par ces isolats antagonistes.

L'identification microscopique et culturale nous a permis de les classer dans le groupe des

Streptomyces. L'isolat de Streptomyces ACT2 qui a présenté des pourcentages d'inhibition

non négligeables contre les 03 isolats de FOC en boite de Petri a été retenu pour des tests in

vivo. Ce test a été conduit sous serre en vue de lutter contre la fusariose du pois chiche en

utilisant 03 variétés (ILC-482, Col-27, PPC-25).

Les résultats obtenus par ce dernier test ont montré la capacité de l'isolat Streptomyces

ACT2 de réduire le degré de la maladie de la fusariose du pois chiche chez ces 03 variétés en

comparaison avec les témoins inoculés utilisés.

Le test de l'agressivité nous a permis d'identifier des indices de la maladie sur ILC-482

(variété connue par sa sensibilité au FOC) variaient entre (32.33 et 92.12%). Suite à ce

résultat nous avons classé: 06 isolats comme peu agressifs, 02 moyennement agressifs, 07

agressifs et 02 uniquement ont été classés comme très agressifs.

L'étude du comportement variétal de 11 variétés du pois chiche vis à vis le FOC a

révélée un comportement variable et a permis de sélectionner 04 variétés tolérantes qui sont:

F7-43, F10-13, Fedjoj, 2G-03.

Mots clés : Cicer arietinum L., Fusarium oxysporum f. sp. ciceri, flétrissement vasculaire,

Antagonisme, Actinomycètes, agressivité.

Liste des Tableaux

Tableau 1: Principaux pays producteurs du pois chiche dans le monde, campagne 2007-

2008…………………………………………………………………………………………….8

Tableau 2: Répartition géographique de la culture du pois chiche dans le monde………........9

Tableau 3: Rendement et production mondiale du pois chiche en comparaison avec d'autres

cultures, campagne 2004-2005………………………………………………………………10

Tableau4: Composition chimique des grains du pois chiche en comparaison avec quelques

légumineuses alimentaires et le blé ………………......................................................................10

Tableau 5: Composition chimique de pois chiche…………………………………………...11

Tableau6:Principales maladies cryptogamiques chez le pois chiche dans le monde………..12

Tableau7: Légumineuses alimentaires cultivées en Algérie, superficies, production,

rendements 'moyenne 1993-2002)……………………………………………………………14

Tableau 8: Evolution de la superficie, de la production et du rendement et semences du pois

chiche en Algérie durant la compagne 1998-2008de la culture du pois chiche………………15

Tableau9: Quelques publications sur l'utilisation des actinomycètes en lutte biologique contre

les pathogènes telluriques…………………………………………………………………….33

Tableau 10: Résistance multiple chez Cicer sp……………………………………………...42

Tableau11: Principales espèces de Cicer utilisées dans les programmes d'amélioration de la

résistance du pois chiche contre le flétrissement vasculaire………………………………….43

Tableau 12: Températures en degrés °C et pluviométrie en mm mensuelles des chefs lieux

des wilayas d'étude en 2009…………………………………………………………………..45

Tableau13: Parcelles prospectées des 03 régions choisies…………………………………..46

Tableau14: Répartition des isolats de FOC isolés à partie de tiges du pois chiche………….49

Tableau15: Sites d'échantillonnage des sols pour l'isolement des actinomycètes…………...56

Tableau16: Incidence et gravité du flétrissement vasculaire dans les parcelles de la culture de

pois chiche prospectées……………………………………………….....................................67

Tableau 17. Nombres des isolats obtenus par région et par partie de plantes infectés

………………………………………………………………………………………………...69

Tableau 18: Caractéristiques culturales des morphotypes sauvages de 17 isolats de

FOC…………………………………………………………………………………………...78

Tableau 19: Mensurations en µm des conidies……………………………………................82

Tableau 20: Nombre des souches d'actinomycètes isolés sur milieu ISP2………................120

Tableau 21: Pourcentages d'isolement des actinomycètes à partir des deux dilutions

effectuées……………………………………………………………………………………121

Tableau 22: Pourcentages d'inhibition de 06 isolats d'actinomycètes sur les 03 FOC……..124

Tableau 23: Diamètres d'inhibition de FOC par les filtrats………………………………...126

Tableau 24: Caractères culturaux des souches d'actinomycètes après 14 jours

d'incubation………………………………………………………………………………….134

Tableau 25. Degrés de suppression de la maladie par la souche ACT2 en utilisant 03 variétés

du pois chiche………………………………………………………………………………..139

Tableau 26: Classification de 17 isolats de FOC selon leur agressivité…………................151

Tableau 27: Réponse des cultivars du pois chiche vis à vis de FOC………………………152

Tableau 28: Résultats du test de réisolement des 03 FOC…………………………………154

Tableau29: Répartition des isolats de FOC en fonction des morphotypes, la pigmentation du

thalle, la croissance mycélienne, les mensurations des conidies et le degré d'agressivité…..156

Tableau 30: Matrice de corrélation calculée sur huit paramètres étudiés……......................157

Liste des figures

Figure 1: Plante du pois chiche……………..............................................................................5

Figure 2: Champ du pois chiche……………………………………………............................5

Figure 3: Description de la plante du pois chiche……………………………………………..5

Figure 4: Cycle infectieux de Fusarium oxysporum................................................................23

Figure 5: Distribution typique de plante du pois chiche infestés par le FOC………………..26

Figure 6: Symptôme de la fusariose du pois chiche………………………............................27

Figure 7: Observation microscopique des actinomycètes…....................................................30

Figure 8: Localisation des sites de prélèvement des isolats de FOC………………………...47

Figure 9:Cultures du pois chiche présentant des foyers malades…………………................65

Figure 10: Plants du pois chiche présentant une attaque de la fusariose…….. ……………..66

Figure11: Réduction des ramifications secondaires sur le système racinaire des plantes

malades du pois chiche par apport aux racines des plantes saines…………............................66

Figure 12. Colonies de Fusarium oxysporum f. sp. ciceri…………………………...............68

Figure 13. Histogrammes présentant la répartition des isolats de FOC par région et par partie

de plante…………………………………………………………………................................72

Figure 14: Morphotype du thalle de FOC cotonneux………………………………………..78

Figure 15: Morphotype du thalle de FOC duveteux sauvage………………………………..79

Figure 16: Morphotype du thalle de FOC ras muqueux……………………………………..79

Figure 17: Morphotype du thalle de FOC ras sénescent……………………………………..81

Figure 18: Observation microscopique de FOC……………………………………………..81

Figure 19: Observation microscopique des chlamydospores colorée au bleu de cotton sous

microscope optique x 2000…………………………………………………………………...81

Figure 20: Estimation de la croissance mycélienne en cm sur milieu de culture PDA (FOC1,

FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6)………………………………………............................95


FOC8, FOC9, FOC10, FOC11, FOC12)…………………………………..............................96


FOC14, FOC15, FOC16, FOC17)……………………………………………………………97

Figure 23: Influence de la température sur la croissance mycélienne des isolats de FOC

(FOC1, FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6)………………………………………………...98


(FOC7, FOC8, FOC9, FOC10, FOC11, FOC12)…………………………………………….99


(FOC13, FOC14, FOC15, FOC16, FOC17)………………………………………………...100

Figure 26: Influence du pH sur la croissance mycélienne de FOC (FOC1, FOC2, FOC3,

FOC4, FOC5, FOC6)………………………………………………………………………..101


FOC10, FOC11, FOC12)…………………………………………………............................102


FOC16, FOC17)…………………………………………………………..............................103

Figure 29: Influence de la lumière et de l'obscurité sur la croissance mycélienne de FOC

(FOC1, FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6)……………………………………………….104


(FOC7, FOC8, FOC9, FOC10, FOC11, FOC12)…………………………………………...105


(FOC13, FOC14, FOC15, FOC16, FOC17)………………………………………………...106

Figure 32: Influence de la source d'azote sur la croissance mycélienne de FOC (FOC1,

FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6)………………………………………………………..107


FOC8, FOC9, FOC10, FOC11, FOC12)…………………………………............................108


FOC14, FOC15, FOC16, FOC17)…………………………………………………………..109

Figure 35: Influence de la source de carbone sur la croissance mycélienne de FOC (FOC1,

FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6)………………………………………………………..110




FOC14, FOC15, FOC16, FOC17)…………………………………………………………..112

Figure 38: Influence des milieux de culture sur la croissance mycélienne de FOC (FOC1,

FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6)…………………………………..................................113




FOC14, FOC15, FOC16, FOC17)…………………………………………………………..115

Figure 41: Diversité des actinomycètes isolés à partir des sols arides du sud

algérien………………………………………………………………………………………122

Figure 42: Pourcentages d'inhibition par série de couleurs d'actinomycètes ……................125

Figure 43: Résultats du test de confrontation entre les isolats de FOC et les souches

d'actinomycètes…...................................................................................................................125

Figure 44: Résultats du test de filtrat entre les isolats de FOC et les actinomycètes………127

Figure 45: Résultats du test de puits entre les isolats de FOC et les actinomycètes………..127

Figure 46: Résultats du test des disques imbibés entre les isolats de FOC et la souche

ACT2………………………………………………………………………………………...128

Figure 47: Coloration Gram+ de la souche ACT2 observée au microscope optique………132

Figure 48: Observation microscopique des colonies d'actinomycètes à l'aide du microscope

optique……………………………………………………………………………………….135

Figure 49: Résultat de la séparation de la molécule antibiotique…………………………..138

Figure 50: Résultats de l'effet protectif de la souche ACT2 chez le cultivar ILC-482 …….141

Figure 51: Résultats de l'effet protectif de la souche ACT2 chez le cultivar Col27 ……….142

Figure 52: Résultats de l'effet protectif de la souche ACT2 chez le cultivar PPC-25 ……..143

Figure 53: Résultats du test d'agressivités des isolats testés de FOC………………………150

Figure 54: Résultats du test de la résistance variétale, montrant 02 variétés tolérantes …...152

Figure 55:Test de la résistance variétale montrant symptôme de la fusariose chez la variété

ILC-482…...............................................................................................................................153

Figure 56: Photo de réisolement de FOC à partir des fragments de plants du pois

chiche………………..............................................................................................................153

Liste des abréviations

Cm: Centimètre

f. sp. : Forme spécialisée.

FOC: Fusarium oxysporum f. sp. Ciceri.

ICARDA: International Center for Agricultural in the Dry Areas.

Ha: Hectare.

ILC: International Legume Cicer.

ITGC: Institue Technique des Grande Culture.

INRA: Institut National de Recherches Agronomique

Mm: Millimètre.

Mt: Millions de tonnes.

µm: micromètre.

pH: Potentiel d'hydrogène.

Qx: Quintaux.

°C: Degré Celsius.

T: Témoin.

JC: Jésus Christ.

FAO: Food Agriculture Organisation.

Mg: Milligramme.

Gr: Gramme.

Prod.: production.

ADN: Acide Désoxyribonucléique.

G: Guanine.

C: Cytosine

IAA: Indole-3-Acétique Acide

R: Résistante

S: Sensible

Table des Matières

Introduction…………………………………………………………………………………...1

Première partie: Synthèse bibliographique

1. Plante hôte: pois chiche (Cicer arietinum L.)

1.1. Origine et Historique de pois chiche……………………………………………................4

1.2. Description de la plante de pois chiche…………………………………………................4

1.3. Cycle et saison de culture de pois chiche………………………………………………….5

1.4. Type de cultivars chez le pois chiche……………………………………………………...6

1.4.1. Macrosperma……………………………………………………………................6

1.4.2. Microsperma……………………………………………………………………….6

1.5. Classification et Taxonomie de Cicer arietinum L………………………..........................6

1.6. Caractéristiques agronomiques……………………………………………………………7

1.6.1. Les exigences climatiques…………………………………………………………..7

1.6.1.1. La température……………………………………………………………..7

1.6.1.2. La pluviométrie…………………………………………………………….7

1.6.1.3. La lumière………………………………………………………………….7

1.6.2. Les exigences édaphiques………………………………………………………….8

1.6.2.1. Type du sol………………………………………………………................8

1.6.2.2. Humidité…………………………………………………………................8

1.6.2.3. Nutrition minérale………………………………………………………….8

1.6.2.3. pH du sol………………………………………………………...................8

1.7. Répartition géographique, aire de culture et production de pois chiche dans le monde…..8

1.8. Intérêts de pois chiche

1.8.1. Intérêt économique………………………………………………………………….9

1.8.2. Intérêt agronomique……………………………………………….........................10

1.8.3. Intérêt nutritionnelles……………………………………………………………...10

1.9. Le stress biotique chez le pois chiche…………………………………………………...11

1.10. Situation de pois chiche en Algérie……………………………………..........................12

1.10.1. Intérêt culturale et importance des légumineuses en Algérie…………................13

1.10.2. Aire de culture et production de pois chiche en Algérie………………...............14

1.10.3. Problème phytosanitaire de pois chiche en Algérie……………………………...15

1.10.3.1. L'anthracnose…………………………………………………..................15

1.10.3.2. Pourriture racinaires……………………………………………................16

1.10.3.3. Complexe de flétrissement………………………………………………..16

2. Agent pathogène: Fusarium oxysporum f. sp. ciceri

2.1. Généralité sur le genre Fusarium………………………………………………………...17

2.2. Généralité sur Fusarium oxysporum……………………………………..........................17

2.3. Fusarium oxysporum f. sp. ciceri (FOC)………………………………………………...18

2.3.1. Historique de FOC………………………………………………………………….18

2.3.2. Présentation de FOC………………………………………………………………..19

2.3.3. Description et clés d'identification de FOC………………………...........................19

2.3.4. Classification, biologie et cycle de reproduction du champignon………………….20

2.3.5. Mécanismes d'infection et de colonisation

2.3.5.1. Mode d'infection…………………………………………….......................21

2.3.5.2. Mode de colonisation……………………………………………................21

2.3.6. Inoculum primaire, mode de survie et de transmission de FOC…………………...22

2.3.7. Gamme d'hôte……………………………………………………………...............24

2.3.8. Races physiologiques et pathotypes de FOC……………………............................24

2.3.9. Distribution de la maladie et des races pathologiques dans le monde……………..25

2.3.10. Spécialisation et résistance chez le FOC…………………………........................25

2.3.11. Origine de FOC et source de variabilité………………………………………….25

2.4. La maladie de la fusariose de pois chiche…………………………………......................26

2.4.1. Dégâts causés par la fusariose de pois chiche……………………………………..26

2.4.2. Description des symptômes de la fusariose de pois chiche……….........................27

2.4.3. Localisation de la fusariose de pois chiche………………………..........................28

2.4.4. Répartition géographique et importance économique du flétrissement en

Algérie………………………………………………………………………………………...28

2.4.5. Facteurs influençant la maladie du flétrissement………………………................28

3. L'agent antagoniste (les actinomycètes)

3.1. Les actinomycètes

3.1.1. Présentation et caractéristiques des actinomycètes………………………………..30

3.1.2. Ecologie des actinomycètes……………………………………………………….30

3.1.3. Importance économiques des actinomycètes……………………………………...31

3.1.4. Taxonomie des actinomycètes…………………………………………………….32

3.1.5. Utilisation des actinomycètes en lutte biologique………………………................32

3.1.6. Mode d'action des actinomycètes…………………………………….....................34

3.1.7. Possibilité d'utilisation des actinomycètes contre le FOC………………………...34

3.2. Le genre Streptomyces

3.2.1. Caractéristiques du genre Streptomyces…………………………………………...35

3.2.2. Cycle de différentiation des Streptomyces………………………………………...35

3.2.4. Classification des Streptomyces…………………………………………………...36

3.2.5. Les avantages de l'utilisation des Streptomyces en lutte biologique……................36

4. Moyens de lutte

4.1. Pratiques culturales……………………………………………………………................38

4.2. Méthodes chimiques……………………………………………………………………..39

4.3. Méthodes biologiques…………………………………………………………................39

4.3.1. Utilisation des microorganismes…………………………………………………..40

4.3.2. Méthodes génétiques

4.3.2.1. La résistance variétale……………………………………………………..40

4.3.2.2. Méthodes de défense naturelle…………………………………………….41

4.3.2.3. Résistance induite…………………………………………………………42

4.3.2.4. Utilisation des espèces sauvages de Cicer sp……………………………...42

4.3.3. La lutte intégrée………………………………………………………...................44

4.4. Application du phénomène d'antagonisme et ses limites………………………………...44

Deuxième Partie: Matériels et méthode

1. Caractérisation des symptômes de la fusariose et identification de l'agent causal

(FOC)

1.1. Les

prospections…………………………………………………………………………………..45

1.2. Estimation de l'indice et de la gravité de la maladie…………………………..................46

1.3. Obtention du matériel fongique……………………………………………….................47

1.3.1. Isolement de l'agent causal………………………………………………................48

1.3.2. Purification et conservation de l'agent pathogène………………………................48

1.4. Détermination de la forme spéciale ciceri…………………………………….................49

1.4.1. Préparation du matériel fongique………………………………………................50

1.4.2. Préparation du matériel végétal…………………………………………………...50

1.4.3. Technique d'inoculation des plantules du pois chiche…………………................50

1.4.4. Notation des symptômes………………………………………………………….51

1.5. Caractérisation morphologique de l'agent pathogène……………………………………51

1.5.1. Caractérisation culturale et description des morphotypes………………………...51

1.5.2. Etude biométrique des conidies…………………………………………………..52

1.6. Etude physiologique des isolats de FOC………………………………………...............52

1.6.1. Recherches des conditions optimales de croissance mycélienne des isolats……..52

1.6.1.1. Estimation de la croissance de FOC………………………………………52

1.6.1.2. Effet de l'obscurité et la lumière sur le FOC…………………………….53

1.6.1.3. Effet de la température………………………………..................53

1.6.1.4. Effet du pH……………………………………………................53

1.6.2. Influence des facteurs nutritionnels sur la croissance de FOC…………………...53

1.6.2.1. Effet des milieux de cultures………………………………….................54

1.6.2.2. Influence de la source de carbone sur le FOC…………………………….54

1.6.2.3. Influence de la source d'azote sur le FOC………………………………...55

1.7. Répétition et traitement statistique…………………………………………….................55

2. Recherche de moyens de lutte

2.1. Obtention des bactéries actinomycètes………………………………………..................55

2.1.1. Prélèvement des échantillons du sol……………………………………………….56

2.1.2. Isolement, purification et conservation des actinomycètes………………………...56

2.1.2.1. Isolement……………………………………………………........................56

2.1.2.2. Purification des isolats d'actinomycètes……………………......................56

2.1.2.3. Conservation des isolats d'actinomycètes………………………................57

2.2. Etude du phénomène d'antagonisme FOC/ Actinomycètes……………………………...57

2.2.1. Méthode de confrontation directe………………………………………………….57

2.2.2. Mise en évidence de l'action des métabolites d'actinomycètes…………………….58

2.2.2.1. Test de filtrat de culture…………………………………………………….58

2.2.2.1.1. Préparation des filtrats de culture d'actinomycètes………………..58

2.2.2.1.2. Incorporation des filtrats de culture d'actinomycètes……………...59

2.2.2.2. Technique de puits………………………………………………………….59

2.2.2.3. Technique des disques du papier Wattman…………… …….......................59

2.2.2.3.1. Préparation des filtrats de culture d'actinomycètes….......................59

2.2.2.3.2. Extraction de la molécule antifongique……………………………60

2.2.2.3.3. Test de l'activité de l'extrait………………………….......................60

2.3. Identification des isolats d'actinomycètes antagonistes………………………………...60

2.3.1. Etude macroscopique……………………………………………………………….61

2.3.2. Etude microscopique………………………………………………………………..61

2.4. Essai d'extraction et de séparation de la molécule antifongique………………................61

2.4.1. Préparation des filtrats de culture des actinomycètes……………………………...61

2.4.2. Extraction liquide-liquide…………………………………………….....................61

2.4.3. Chromatographie sur couche mince……………………………………..................61

2.5. Test de lutte biologique in vivo………………………………………………................62

2.5.1. Préparation de l'inoculum…………………………………………………………..62

2.5.2. Obtention des plantules du pois chiche…………………………………………….62

2.5.3. L'estimation des symptômes………………………………………………………63

3. Détermination de l'agressivité et du comportement variétal

3.1. Détermination de l'agressivité…………………………………………………………..63

3.2. Etude du comportement variétal………………………………………………………..63

3.2.1. Estimation des symptômes………………………………………….......................64

3.2.2. Réisolument du champignon pathogène……………………………......................64

Troisième Partie: Résultats et discussions

1. Caractérisation des symptômes de la fusariose et identification de l'agent causal

(FOC)

1.1. Importance du flétrissement du pois chiche dans les 03 régions d'études

1.1.1. Résultats

1.1.1.1. Observation des symptômes au champ…………………………………….65

1.1.1.2. Etude de l'indice et de la gravité de la maladie…………………………….67

1.1.1.3. Détection et isolement de l'agent pathogène……………………………….68

1.1.1.4. Détermination de la forme spéciale ciceri…………………………………70

1.1.2. Discussion

1.1.2.1. Observation des symptômes………………………………………………..70

1.1.2.2. Indice et gravité de la maladie……………………………………………..72

1.2.2.3. Détection et isolement de l'agent pathogène……………………………….74

1.1.2.4. Détermination de la forme spéciale ciceri…………………………………75

1.2. Etude morphologique de FOC

1.2.1. Résultats

1.2.1.1. Caractérisation physique…………………………………………………...77

1.2.1.1.1. Caractéristiques culturales…………………………......................77

1.2.1.1.1.1. Description des morphotypes rencontrés……………..77

1.2.1.1.1.2. Pigmentation du thalle………………………………..80

1.2.1.1.2. Caractéristiques microscopiques et biométriques des spores…….80

1.2.1.2.1.1. Etude microscopique de FOC…………......................80

1.2.1.2.1.2. Etude biométrique……………....................................82

1.2.2. Discussion

1.2.2.1. Caractérisation physique……………………………………………….83

1.2.2.1.1. Caractéristiques culturales…………………………...............83

1.2.2.1.2. Etude microscopique et biométrique

1.2.2.1.2.1. Etude microscopique……………………………..87

1.2.2.1.2.2. Etude biométrique………………………………..89

1.2.1.2. Résultats de la caractérisation physiologique………………………….91

1.2.1.2.1. Recherche des conditions optimales………………………….91

1.2.1.2.1.1. Estimation de la croissance mycélienne de 17

FOC…………………………………………………………………………………...91

1.2.1.2.1.2. Effet de la température…………………………….92

1.2.1.2.1.3. Effet du pH…………………...................................92

1.2.1.2.1. 3.Effet de la lumière et de l'obscurité……………......93

1.2.1.2.2. Influence des facteurs nutritionnelle sur la croissance de

FOC…………………………………………………………………………………...93

1.2.1.2.2.1. Effet du milieu de culture………………………..93

1.2.1.2.2.2. Effet de la source de carbone……………………93

1.2.1.2.2.3. Effet de la source d'azote………………………...94

1.2.1.3. Discussion des résultats de la caractérisation physiologique

1.2.1.3.1. Recherche des conditions optimales…………………………116

1.2.1.3.1.1. Estimation de la croissance mycélienne…………..116

1.2.1.3.2. Effet de la température…………................116

1.2.1.3.3. Effet du pH………………………………..117

1.2.1.3.4. Effet de l'action de la lumière et de

l'obscurité……………………………………………………………………………………118

1.2.1.3.2. Influence des facteurs nutritionnels sur la croissance du

FOC………………………………………………………………………………………….118

1.2.1.3.2.1. Effet des milieux de cultures…………................118

1.2.1.3.2.2. Effet de la source de carbone……………………118

1.2.1.3.2.3. Effet de la source d'azote………………………...119

2. Recherche de moyens de lutte biologique

2.1. Isolement et étude de la diversité des actinomycètes

2.1.1. Résultats

2.1.1.1. Isolement des actinomycètes…………………………………………….125

2.1.1.2. Caractéristiques des actinomycètes isolés…………………………..126

2.1.2. Discussion

Etude d'antagonisme FOC/ Actinomycète

2.2.1. Résultats

2.2.1.1. Tests de confrontation directe……………………………................129

2.2.1.2. Test des filtrats……………………………………………………...131

2.2.2.3. Test des puits……………………………………………………….132

2.2.1.4. Test des disques imbibés…………………………………................132

2.2.2. Discussion

2.2.2.1. Tests de confrontation directe………………………………………..133

2.2.2.2. Test des filtrats……………………………………………………….136

2.2.2.3. Test des disques imbibés…………………………………..................137

2.3. Identification des actinomycètes présélectionnés

2.3.1. Résultats

2.3.1.1. Etude des caractères culturaux……………………………………….138

2.3.1.2. Observations microscopiques………………………………………..141

2.3.2. Discussion

2.3.2.1. Etude des caractères culturaux………………………………………..141

2.3.2.1. Observation microscopique…………………………………………...142

2.4. Essai d'extraction de la molécule antibiotique………………………………............144

2.5. Essai d'antagonisme sous serre……………………………………………………….146

2.5.1. Résultats

2.5.2. Discussion

3. Etude de l'agressivité des isolats de FOC et du comportement variétal……………..159

3.1. Résultats

3.1.1. Etude de l'agressivité…………………………………………………………………159

3.1.2. Etude du comportement variétal……………………………………………...............162

3.2. Discussion

3.2.1. Détermination de l'agressivité ………………………………………………………..165

3.2.2. Etude du comportement variétal……………………………………………...............165

4. Relation entre l'agressivité, les morphotypes, la pigmentation du thalle, le diamètre de

la croissance mycélienne, les mensurations des conidies………………………………...121

4.1. Résultats

4.1.1. Relation entre l'agressivité, la morphologie et la pigmentation du thalle…………….121

4.1.2. Relation entre l'agressivité et le diamètre de croissance du thalle……........................122

4.1.3. Relation entre l'agressivité et les mensurations des conidies…………........................122

4.2. Discussion

Conclusion et perspectives………………………………………………………................166

Références bibliographiques

Annexes

Introduction

Introduction

Introduction

Les légumineuses alimentaires représentent de part la superficie qu'elles occupent, une

place importante dans le système agraire et l'agroéconomie de nombreux pays du monde, en

raison des caractéristiques biologiques des racines dans la fixation de l'azote atmosphérique

par les nodosités bactériennes (Bacha et Ounane, 2003) et leur capacité d'adaptation à des

conditions pédoclimatiques difficiles, ainsi que leur faible exigence culturale. Du point de vue

nutritionnel, la richesse des légumineuses en protéines permet de corriger dans une certaine

mesure les carences en protéines animales, ainsi que le déséquilibre alimentaire des

populations qui ont tendance à ce nourrir exclusivement de céréales. Selon Obaton, (1980), un

hectare de légumineuses alimentaires produit un tonne de protéines, soit 10 fois plus qu'une

production d'un élevage à viande sur la même surface.

Les légumineuses alimentaires regroupent plusieurs espèces, parmi celles-ci, nous

avons le pois chiche (Cicer arietinum L.), dont la production et l’exploitation répondent à

divers fonctions, telles que : la consommation humaine, l’alimentation animale et la

fertilisation des sols notamment dans les pays en voie de développement. L'intérêt du pois

chiche réside dans leur teneur élevée en protéines, de sa haute valeur nutritive en complément

celle des céréales. Le pois chiche joue aussi un rôle important dans les systèmes de cultures

en contribuant à l'amélioration de la fertilité du sol par les reliquats d'azote qu'ils laissent et en

font ainsi un excellent précédent cultural (Bacha et Ounane, 2003).

L’Algérie, comme beaucoup de pays en voie de développement attribue une place de

choix à cette culture dotée d’une bonne valeur nutritive, les légumes secs telles que le pois

chiche, la lentille et le petit pois se placent après les céréales. Malgré les efforts déployés, la

production nationale reste encore très insuffisante. Cette insuffisance est liée à

l’accroissement démographique, à une stagnation des superficies de culture et aux problèmes

phytosanitaires (Toulaiti, 1988). De ce fait, chaque année l’Algérie à recours aux importations

pour satisfaire les besoins de la population.

Le pois chiche souffre de nombreuses difficultés, en dehors des conditions

d’environnement et le non maitrise des techniques culturales qui sont des causes non

négligeables de la faiblesse de la production, il semble que le problème majeur reste celui de

l’aspect phytosanitaire souvent attribué à des maladies fongiques telles que l’anthracnose, les

pourritures racinaires et le flétrissement.

Introduction

Ces différents problèmes associés à l'immense besoin en protéines dans l'alimentation

humaine ont amené les chercheurs à s'intéresser à cette légumineuse alimentaire.

Il est donc clair que l’amélioration des rendements est liée à une bonne connaissance

de ces maladies et leurs agents causals. Actuellement, les producteurs sont confrontés à une

recrudescence de problèmes pathologiques associés à la présence de Fusarium oxysporum.

Mais des doutes quant à la caractérisation des symptômes n’ont pas permis d’identifier la

forme spéciale impliquée dans le développement de cette épidémie affectant l’ensemble des

régions productrices en Algérie. Cette maladie constitue une énorme contrainte pour la

culture, cela dans de nombreuses régions où elle est pratiquée. Néanmoins, on connait peu

d’informations sur l’étiologie et l’importance de cette maladie en Algérie. Seuls des

observations préliminaires et fragmentaires ont suggéré qu’il peut s’agir d’un complexe

semblable à celui du flétrissement et de la pourriture racinaire, qui réduit sévèrement la

production du pois chiche dans la majorité des régions où cette culture est pratiquée.

Dans le cadre de notre étude, étant donné de nombreuses lacunes dans les

connaissances à la fois de l'agent pathogène, des processus pathologiques qu'il induit lors de

l'attaque du pois chiche ainsi que les moyens de lutte, nos nous somme intéressé au parasite,

sous un triple aspect: son caractérisation morphologique et physiologique, les moyens de lutte

et l'étude du comportement variétal.

Le premier chapitre de notre travail correspond à une mise au point bibliographique

sur le pois chiche, l’agent causal du flétrissement (Fusarium. oxysporum f. sp. ciceri), l'agent

antagoniste (Les actinomycètes) et les moyens de lutte contre cette maladie. Le deuxième

chapitre correspond à notre étude expérimentale, l'étape initiale a consisté à regrouper, une

collection d'isolats afin qu'elle puisse, raisonnablement, être considéré comme représentative

de la diversité. La collection de FOC, nous a servira de support à l'ensemble de nos

recherches que nous avons structurées de la manière suivante:

1. Caractérisation morphologique, biométrique et physiologique

Après avoir observé une attaque de ce champignon dans différentes régions où cette

culture est bien développée, nous nous sommes efforcés d’apporter une contribution à la

connaissance de la maladie.

Au cours des prospections effectuées, nous nous sommes intéressés à l’estimation de

l’importance de la maladie dans différentes régions où la culture du pois chiche est pratiquée

Introduction

et une identification de l’agent pathogène par un biotest sur plantule d'une variété sensible en

conditions contrôlées à fin de vérifier le Postulat de Koch.

Cette approche nous a conduits également à déterminer quelques caractéristiques

morphologiques (morphotype et pigmentation du thalle), biométriques (mensurations des

conidies produites en culture) de FOC et sa croissance mycélienne en boite de Petri en jouant

sur différents facteurs afin de rechercher les conditions optimales qui favorisent sa croissance

et son développement.

2. Etude du phénomène d'antagonisme entre FOC/Actinomycètes

Nous avons réalisé des essais de confrontations in vitro entre l’agent causal et des

espèces d’actinomycètes isolées des milieux extrêmes, dans le but de sélectionner quelques

germes antagonistes. Un autre test réalisé in vivo entre l'agent pathogène et une souche

d'actinomycète antagoniste dans le but d'évaluer le degré protectif des plantes du pois chiche

par cette souche antagoniste.

3. Etude du comportement variétal

Dans ce chapitre, nous nous sommes intéressés à l'étude du comportement de 17

isolats de FOC vis–à-vis une variété sensible afin de déterminer l'agressivité de nos isolats, en

suite nous avons procédé à l'étude du comportement variétal de 11 variétés du pois chiche vis-

à-vis le FOC dans le but de sélectionner quelques cultivars tolérants.

Chapitre 1: Synthèse bibliographique

Synthèse bibliographique

17

1. Plante hôte : Pois chiche (Cicer arietinum L.)

1.1. Origine et Historique du pois chiche (Cicer arietinum)

le pois chiche (Cicer arietinum L.) est originaire du Sud Est de la Turquie

(Ladisinsky, 1975) et le Nord Est de la Syrie (Staginnus et al., 1999). Il a été cultivé

pour la première fois à environ 7000 - 8000 avant JC (Sharma et Muehlbauer, 2007;

Staginnus et al., 1999). Le nom Cicer est originaire du latin, dérivé du mot grec

« Kikus » qui désigne fort ou solide (Singh et Diwakar, 1995). Duschak, (1871) a

signalé que l’origine du mot Cicer est Hébreu « Kirkes », où le mot « Kikar » désigne

rond. Le mot « arietinum » est aussi latin, traduit du mot grec « Krios », une allusion

de la forme des grains qui ressemblent à la tête de bélier (Van Der Maesen, 1987). Le

pois chiche est appelé garbenzo en espagnol, Kichar ou Chicher en allemand, chana

en Hindi et chickpea, gram ou bengal gram en anglais (Singh et Diwakar, 1995), il est

appelé « nakhut » ou « nohut» en Turquie, Romanie, Bulgarie et Afghanistan (Van

Der Maesen, 1987).

Le pois chiche a été utilisé en alimentation et en médicine par Homer dans

l’Iliade (1000-800 avant JC) à Rome, en Inde et dans la littérature européenne du

moyen âge (Van Der Maesen, 1972). La culture a été propagée avec le groupe

fondateur de l'agriculture de croissant fertile vers l’Europe et l’Asie de l'Ouest depuis

5500 avant JC (Harris, 1998; Harlan, 1992). Le pois chiche a été disséminé depuis ce

temps pour devenir une culture importante des environnements subtropicaux et la

région méditerranéenne (Muehlbauer et Rajesh, 2008; Kumar et Abbo, 2001; Zohary

et Hopf, 2000). Les pois chiches de types Kabuli ont été transféré vers l’Inde depuis la

région méditerranéenne dans le 18ème

siècle et les types Desi ont été importé au Kenya

par les émigrés indiens durant le 19eme

siècle (Van Der Maesen, 1972). Le pois chiche

a été transféré vers les deux Amériques par les espagnoles et les portugais

(Muehlbauer et Rajesh, 2008).


18

1.2. Description de la plante du pois chiche (Cicer arietinum L.)

Le pois chiche est une plante annuelle, herbacée avec des branches diffusées et

propagées (Muehlbauer et Rajesh, 2008; Yadav et al., 2007; Staginnus et al., 1999;

Labdi et al., 1996).

Figure 1. Plante de pois chiche (Patankar, 2000) Figure 2. Champ de pois chiche (Patankar, 2000)

Figure 3. Description de la plante du pois chiche (Singh et Diwakar, 1995)

Bourgeon de

fleur

Feuilles

Gousse

Pédoncule

Pédicelle

Branches I aires

Tige

Nodules

Racines


19

1.3. Cycle et saison de la culture du pois chiche

Dans le bassin méditerranéen, le pois chiche est considéré comme une

culture du printemps. La plante se développe vigoureusement et complète son cycle

évolutif en 04 mois (El-Aoufir, 2001). La pollinisation chez le pois chiche est

complétée dans le stade de la formation des bourgeons des fleurs, avant que les

abeilles visitent les fleurs ouvertes aux champs (Van Der Maesen, 1972).

Certains cultivars du pois chiche à maturité précoce peuvent compléter leur

cycle de vie dans 65 jours. Cependant les cultivars à maturité tardée demandent

environ 120 jours.

Les variétés du pois chiches cultivés en hiver peuvent demander plus que 180

jours de la date de plantation jusqu'à la maturité (Muehlbauer et Rajesh, 2008).

1.4. Type de cultivars chez le pois chiche

L’espèce Cicer arientinum L., présente une variabilité phénotypique et

génotypique, ce dernier se divise en 02 types: Kabuli et Desi (Singh, 1985). Les pois

chiches de types Desi sont cultivés dans le sud de l'Asie où il représente la majorité de

la production. Cependant les types Kabuli dominent la production dans la plupart des

autres régions et spécialement dans l'hémisphère de l'Ouest (Muehlbauer et Rajesh,

2008). Les deux types sont destinés à la consommation humaine (Malhotra et al.,

1987; Muehlbauer et Singh, 1987).

1.4.1. Macrosperma (Kabuli type)

Ce type est cultivé dans la région méditerranéenne (Ohri et Pal, 1991) et

couvre 15% de la surface réservée au pois chiche (Babar et al., 2009; Muehlbauer et

Rajesh, 2008; Singh et Jauhar, 2005; Singh et Diwakar, 1995).

1.4.2. Microsperma (Desi type)

Il est cultivé principalement dans le subcontinent Indien (Ohri et Pal, 1991) et

compte environ 85% de la surface du pois chiche, il a souvent une petite forme (Erler

et al., 2009; Babar et al., 2009; Singh et Jauhar, 2005; Iruela et al., 2002; Singh et

Diwakar, 1995 ; Singh, 1985). Quelques auteurs ajoutent un troisième type qui est le


20

type Culabi qui se caractérise par des graines lisses, de couleur claire, ressemblant au

pois, mais avec un bec caractéristique (Braun et al., 1988).

1.5. Classification et Taxonomie de Cicer arietinum L.

La famille des Fabacae comptant plus que 700 genres et 1800 espèces (Polhill

et Raven, 1981). Le genre Cicer L. comptant 44 espèces (Yadav et al., 2007), 9

espèces annuelles et 35 espèces pérennes. Ces espèces sont divisées en 04 sections:

Monocicer, Chamaecicer, polycicer et Acanthocicer (Van Der Maesen, 1987;

Valcilova et al., 2002). Le pois chiche (Cicer arietinum L.) appartient au genre Cicer

à la classe des Dicotylédones, à la sous-classe des Dialypétales, l’ordre des rosales,

famille de Fabaceae, la sous-famille des Papilionaceae, Régne : Plantae et à la

section Monocicer (Bock, 2009; Yadav et al., 2007; Staginnus et al., 1999; Singh et

Diwakar, 1995; Moreno et Cubero, 1978).

1.6. Caractéristiques agronomiques

1.6.1. Les exigences climatiques: le pois chiche se cultive entre 20°N et 40°N dans

l'hémisphère nord, et à petit échelle entre 10°N et 20°N, ces environnements diffèrent

dans la photopériode, la température et les précipitations (Singh et Diwakar, 1995).

1.6.1.1. La température: Les graines du pois chiche germent à une température

optimum entre 28 à 33°C (Singh et Diwakar, 1995; Covelle et al., 1986), mais elles

peuvent germer entre 10 et 45°C (Singh et Diwakar, 1995). Le pois chiche est une

plante à climat intermédiaire, la température optimale exigée varie entre 18°C et 29°C

le jour et 20°C la nuit (Girrard, 1985; Verret, 1982). Le pois chiche souffre dans les

environnements chauds (35°C-18°C jour/nuit) (Lopez-Bellido et al., 2004). Selon

Nielson, (2001), des températures plus de 32°C limitent le rendement en grains du

pois chiche en accélérant sa maturité. De même, les températures élevées de la

floraison à la maturité des variétés à semi retardées conduit à la réduction de la taille

des graines et du rendement (Lopez- Bellido et al., 2004).

1.6.1.2. La pluviométrie: Peu de besoins en eau, résistant assez bien au stress

hydrique, le pois chiche ne demande qu’une pluviométrie moyenne (Singh et

Diwakar, 1995; Singh et Bushan, 1979). Sa consommation en eau a été estimée entre

110 et 240 mm par an pour produire des rendements en grains allant de 9 à 30 qx / ha


21

(Singh et Bushan, 1979). Le pois chiche est cultivé principalement comme culture de

précipitation (en hiver dans les climats subtropicaux et en printemps dans la région

méditerranéenne et les climats tempérés).

1.6.1.3. La lumière: Le pois chiche est une plante de jour long, mais fleuri dans

toutes les photopériodes (Smith-son et al., 1985; Summerfield et al., 1979). La plus

part des légumineuses à grains sont des plantes qui préfèrent le soleil et réagissent à

l’ensoleillement en fournissant un grand rendement (Vincent et Gregory, 1974). Il a

été aussi rapporté que l'intensité de la lumière et la durée d'éclairement sont des

facteurs importants pour la nodulation et la fixation de l'azote (Lie, 1971).

1.6.2. Exigences édaphiques

1.6.2.1. Type du sol: Le pois chiche se cultive dans différents types de sols (Khan et

al., 2009; Babar et al., 2009; Yusuf et al., 2002), mais il semble qu'il préfère les sols

meubles, profonds, plus ou moins argileux avec une bonne capacité de rétention

(Singh et Diwakar, 1995; Moolani et Chandra, 1970) ou des sols limoneux profond

qui lui fournit des sels solubles (Moolani et Chandra, 1970). Ces sols retiennent plus

de 200 mm d'humidité sur une longueur d’environ 1m (Saxena, 1987).

1.6.2.2. Humidité du sol: Les graines du pois chiche germent à un niveau d’humidité

de 15% pendant 5 à 6 jours (Singh et Diwakar, 1995).

1.6.2.3. Nutrition minérale: Le pois chiche exige plusieurs éléments minéraux tels

que le nitrogène (N), le phosphore (P), le soufre (S) et le zinc (Zn). Le pois chiche

montre une sensibilité vis-à-vis de la déficience en Zn (Khan et al., 1998; Ahlawat,

1990; Sakal et al., 1988).

1.6.2.4. pH du sol: Le pH optimum du sol pour que le maximum des nutriments soit

assimilable est entre 5.7 et 9 (Singh et Diwakar, 1995; Mahler et al., 1988; Braun et

al., 1988).


22

1.7. Répartition géographique, aire de culture et de production du pois chiche

dans le monde

Le pois chiche est cultivé dans 49 pays (Chakraborti et al., 2006) et dans les

05 continents ce qui le rend la 2ème

légume sec dans le monde (17.1% du total) après

le petits pois (Pisum sativum L.) (Berger et al., 2003). Il se cultive dans les régions

semi aride et tropicales (Staginnus et al., 1999).

Tableau 1. Principaux pays producteurs du pois chiche dans le monde, campagne 2007-2008 (FAO,

2010)

Pays Production (tonnes) Pays Production (tonnes)

Inde 5, 970,000 Myanmar 225,000

Pakistan 842,000 Canada 215,000

Turquie 523,553 Ethiopie 190,000

Australie 313,000 Mexique 165,000

Iran 310,000 Iraq 85,000

Total : 9, 313,043

La superficie de la culture du pois chiche dans le monde est de 11.67 millions

d’hectares et sa production totale avoisine 9.31 millions tonnes avec un rendement

moyen de 800 kg/ ha (FAO, 2007). L’Asie est le continent le plus important dans la

production du pois chiche avec plus de 90% de la surface totale et de la production

mondiale (Babar et al., 2009). L'Inde représente le plus grand pays producteur avec

une production estimée à 6.0 millions de tonnes par an et recouvre plus de la moitié de

la production mondiale (Muehlbauer et Rajesh, 2008).

Tableau 2. Répartition géographique de la culture du pois chiche dans le monde

Continents Régions Pays Références bibliographiques

Asie Sud Est de l'Asie Inde – Pakistan -

Myanmar

(Rekha et Thiruvengadam, 2009; Muehlbauer

et Rajesh, 2008; Yadav et al., 2007; Ram et

Prem, 2005; Flandez - Galvez et al., 2003;

Valcilova et al., 2002; Staginnus et al.,

1999).

Centre et Ouest de

l'Asie

Turquie – Iran –

Iraq - Syrie

Afrique Nord de l'Afrique Maroc - Tunisie (Ben Mbarek et al., 2009; Rekha et

Thiruvengadam, 2009; Muehlbauer et

Rajesh, 2008; Yadav et al., 2007; Valcilova

et al., 2002; Staginnus et al., 1999;

Ladizinsky et Adler, 1976).

Est de l'Afrique Ethiopie - Malawi-

Tanzanie

Amériques Amérique du nord Canada - USA. (Rekha et Thiruvengadam, 2009; Muehlbauer

et Rajesh, 2008; Yadav et al., 2007; Flandez Amérique du sud Mexique


23

- Galvez et al., 2003; Valcilova et al., 2002;

Staginnus et al., 1999).

Australie Australie Australie (Rekha et Thiruvengadam, 2009; Muehlbauer

et Rajesh, 2008; Valcilova et al., 2002;

Staginnus et al., 1999)

Europe Sud de l'Europe Espagne (Rekha et Thiruvengadam, 2009; Muehlbauer

et Rajesh, 2008; Yadav et al., 2007;

Valcilova et al., 2002; Staginnus et al., 1999;

Singh, 1985; Ladizinsky et Adler, 1976).

1.8. Intérêts du pois chiche

1.8.1. Intérêt économique: Les légumineuses alimentaires constituent un composant

important du régime alimentaire, spécialement dans les pays sous développés où elles

représentent environ 90% de la consommation globale (Hassan, 2006).

Tableau 3. Rendement et production mondiale du pois chiche en comparaison avec d’autres cultures

(campagne 2004-2005) (FAO, 2005)

Cultures Rendements

(Kg/ha)

Production (Mt)

Maïs 4.707 692.034.184

Blé 2.898 626.466.585

Riz 4.004 614.654.895

Soja 2.292 209.531.558

Arachides 1.447 36.492.147

Haricots 0.709 25.419.286

Petits pois 1.757 20.721.735

Pois chiche 0.818 9.172.530

Lentille 1.007 4.031.837

1.8.2. Intérêts agronomiques: La capacité symbiotique que possède le pois chiche

d’utiliser l’azote atmosphérique pour sa croissance, leur rend comme culture

préférable de l’agriculture durable en réduisant la dépendance au fertilisant azoté

(Babar et al., 2009; Khan et al., 2009; Hassan, 2006; Flandez-Galvez et al., 2003). Il a

été également rapporté que cette culture réduit l'inoculum potentiel des maladies

racinaires d’origine tellurique (Flandez-Galvez et al., 2003).

1.8.3. Intérêts nutritionnels: Le pois chiche a une importance économique

significative. Ces pailles ont une valeur de fourrage en comparaison avec les autres

pailles communément utilisées pour l’alimentation du bétail (Rekha et

Thiruvengadam, 2009; Malhotra et al., 2000). Le pois chiche constitue une source très

importante de protéines végétales qui peuvent corriger le déficit en protéines animales


24

(Ben Mbarek et al., 2009; Rekha et Thiruvengadam, 2009; Chérif et al., 2007;

Hassan, 2006; Singh et Singh, 1992).

Tableau 4. Composition chimique des grains du pois chiche en comparaison avec quelques

légumineuses alimentaires et le blé (pour 100 g de MS) (Aykroyd et Doughty, 1982)

Blé Pois Pois chiche Lentille Fève Espèces

370 330 358 346 343 Calories (g)

13 22.2 20.1 24.2 23.4 Protéines (g)

2 1.4 4.5 1.8 2 Matière grasse (g)

68 60.1 61.5 60.8 60.2 Glucides (g)

2.5 2.7 2.5 3.1 7.8 Cellulose (g)

60 70 149 56 90 Calcium(g)

1 4.3 7 6.1 3.6 Fer (mg)

0.13 0.72 0.4 0.5 0.54 Thiamine (mg)

0.04 0.15 0.18 0.21 0.29 Riboflavine (mg)

------ 4 5 3 4 Vit C (mg)

Le pois chiche est une bonne source de carbohydrates et de protéines qui

constituent ensemble environs 80% du poids sec de la graine. L’amidon est le

principal carbohydrate chez le pois chiche, il contient aussi une quantité considérable

en acide gras. Les triglycérides et les phospholipides sont les composants prédominant

des lipides chez le pois chiche (Singh, 1985). Les acides gras majeurs chez le pois

chiche sont les acides: linoléique, oléique et palmitique (Ling et Robinson, 1976).

Tableau 5. Composition chimique du pois chiche (Singh et Jauhar, 2005; Williams et Singh, 1987)

Eléments gr ou mg/100g

Protéines digestibles (gr) 23

Carbohydrates (gr) 64

Amidon (gr) 47

lipide (Ac. Linoleique et oléique) (gr) 5

Fibres bruts (gr) 6

Sucres solubles (gr) 6

Cendre (mg) 3

Phosphore (mg) 343

Calcium (mg) 186

Magnésium (mg) 141

Fer (mg) 7

Zinc (mg) 3


25

I. 9. Le stress biotique chez le pois chiche

Le facteur primordial dans la réduction du rendement du pois chiche reste

l’aspect phytosanitaire attribué souvent à des agents pathogènes, dont les plus

importants sont les agents telluriques (Jimenez-Diaz et al., 1989). Parmi les nombreux

organismes nuisibles qui réduisent la croissance et la production du pois chiche,

l’agent de l’anthracnose, de la pourriture racinaire et du flétrissement (Rekha et

Thiruvengadam, 2009; Flandez-Galvez et al., 2003).

Tableau 6. Principales maladies cryptogamiques chez le pois chiche dans le monde

Maladies Agents responsables Références

anthracnose Ascochyta rabiei (Pass) Labr (Merzoug et al., 2009; Chérif et al., 2007; Mazur et

al., 2004; Singh et al., 1998; Singh et al., 1994;

Susanne et Wolfgang, 1990; Singh, 1990; Haware et

al.,1986).

Pourriture

sèche

Rhizoctonia sp. (Merzoug et al., 2009; Mazur et al., 2004; Rouibah,

1989; Trapero-Casas et Jimenez-Diaz, 1985; Singh et

Mehrotra, 1980).

Pourriture noire Fusarium oxysporum f. sp. Pisi (Merzoug et al., 2009; Mazur et al., 2004; Trapero-

Casas et Jimenez-Diaz, 1985).

Flétrissement

vasculaire

Fusarium oxysporum f. sp.

ciceri

(Merzoug et al., 2009; Chérif et al., 2007; Mazur et

al., 2004; Singh et al., 1998; Singh et al., 1994;

Trapero-Casas et Jimenez-Diaz, 1985; Mani et Sethi,

1984).

Pourriture

racinaire noire

Fusarium solani (Mart.) Sacc. (Merzoug et al., 2009; Mazur et al., 2004; Trapero-

Casas et Jimenez-Diaz, 1985; Mani et Sethi, 1984).

Pourriture du

collet

Sclerotium rolfsii Sacc. Chérif et al., (2007).

Fonte de semi Pythium debaryanum Hesse,

Pythium irregulare Buisman,

Pythium ultimum Trow

(Kainer et Hannan, 1983; Trapero Casas et al., 1990).

Pouriture

racinaire

F.acuminatum,F.

arthrosporioides, F. avenaceu ,

F. solani .f. sp. Eumartii

Merzoug et al., (2009).

Complexe du

flétrissement

F. oxysporum f.sp. ciceri, F.

solani, Verticillium albo-atrum,

Rhizoctonia bataticola et R.

solani

(Fahim et al., 1987; Trapero et Jimez-Diaz, 1985;

Grewal, 1982).

1. 10. Situation du pois chiche en Algérie

En Algérie les espèces de légumineuses alimentaires les plus cultivées sont la

lentille (Lens culinaris L.), le pois chiche (Cicer arietinum L), le pois (Pisum sativum

L), la fève (Vicia faba L.) et l'haricot (Phasiolus L.). Les légumineuses alimentaires

ont reçu beaucoup d’attention de la part des services agricoles pour augmenter les


26

superficies et améliorer les niveaux de rendements. Cependant les résultats obtenus

n’ont pas été à la hauteur des efforts consentis (Bouzerzour et al., 2003).

Le pois chiche (Cicer arietinum) en Algérie, vient en seconde place après

l'haricot avec une superficie de 14.6% et occupe la troisième place en production

environ 15.6%. Cependant, les productions n'ont pas évalué au contraire ils sont

régressé pour atteindre les niveaux les plus faibles dans le monde (4qx/ha) (Mahrez et

al., 2010; Abdelguerfi et al., 2001).

Compte tenu des problèmes que pose la culture du pois chiche en Algérie,

particulièrement du point de vue comportement variétal vis-à-vis des facteurs

biotiques (champignons, insectes, virus) et abiotiques (sécheresse, gelées, froids). La

collecte et l'évaluation adéquate des ressources génétiques locales devient

indispensable pour pouvoir créer des variétés nouvelles ayant un bon rendement,

adaptées aux variations climatiques et résistantes aux maladies (Abdelgherfi et al.,

2000).

L’Algérie porte peu de variabilité pour le pois chiche. Les variétés ou

populations cultivées méritent, cependant, des études sérieuses pour en déterminer les

caractéristiques qui font qu’elles soient encore appréciées par les agriculteurs

(Bouzerzour et al., 2003). Parmi les caractéristiques utilisables immédiatement, et qui

sont successibles d’exister dans le germoplasme local il y a la capacité de la fixation

symbiotique de l’azote de l’air, la hauteur de la plante, la résistance à l’égrenage, la

résistance aux maladies cryptogamiques et la tolérance aux stress abiotiques (Singh et

al., 1998).

Malheureusement, peut d'intérêt est porté à la variabilité qui caractérise le

pois chiche. Les instituts de recherche ont sélectionné 20 cultivars du pois chiche dont

9 sont en multiplication (Bouzerour et al., 2003). Compte tenu du fait que l’Algérie ne

fait pas partie de l’aire de distribution du genre Cicer, on définit le pois chiche local

comme tous cultivars ou variétés introduits par de nombreuses civilisations, au fil du

temps ces cultivars se sont adaptés à certaines conditions édapho-climatiques.

Contrairement au pois chiche local qui est très hétérogène, à caractères génétiques

inconnus et peu utilisé, celui introduit est généralement homogène, à caractères


27

génétiques connus et commercialisés à grande échelle (Abdelgherfi et al., 2000).

Parmi les variétés les plus cultivées en Algérie on trouve les variétés ILC-3279

(Chetoui1) et ILC-482 (Cehtoui 2) introduites par l'ICARDA en 1988.

1.10.1. Intérêt cultural et importance des légumineuses en Algérie

L’espèce Cicer arietinum L. est connue en Algérie depuis des milliaires

(Labdi, 1990), elle occupe une grande place dans les habitudes alimentaires de la

population algérienne (soupes, sauces, plats, …) (Abdelgherfi et al., 2001). Avec

l'augmentation de la demande, les autorités nationales ont recours à l'importation

(Labdi, 1990). En Algérie, les espèces cultivées de légumineuses alimentaires ont

bénéficié de peu d’intérêt dans le domaine des ressources phylogénétiques, les

espèces du pois chiche, lentille, haricot sec et pois sec locaux en Algérie présentent

des intérêts non négligeables (Abdelgherfi et al., 2001).

En Algérie, les légumineuses alimentaires sont utilisées dans la rotation avec

les céréales car elles enrichissent le sol en azote, ils sont aussi cultivées parce qu'elles

constituent une importante source protéique susceptible de remplacer les protéines

animales difficilement accessibles pour une large couche de la population algérienne

(Melakhssou, 2007). La place des légumineuses alimentaires dans le système agraire

n'a pas toujours été importante, leur superficie totale entre 1993 -2002 avoisine 82 301

hectares. Les espèces les plus cultivées par ordre d'importance sont: la fève et les

féveroles, le pois chiche et le pois sec. Les rendements moyens enregistrés pour ces

trois espèces sont très faibles, de l'ordre de 3 à 5 qx /ha entre 1993-2002.

Tableau 7. Légumineuses alimentaires cultivées en Algérie, superficie, production et rendement

(Moyenne 1993-2002)

Cultures Superficies Production Rendement

(Qx/Ha) Ha % Qx %

Fève/Féverole 40299 48.96 207042 50.27 5.13

Pois chiche 30487 37.04 161799 39.28 5.30

Pois sec 8627 10.48 29793 7.23 3.45

Lentilles 1271 1.54 5021 1.22 3.95

Haricot sec 1240 1.50 6480 1.57 5.22

Gesse 377 0.46 1732 0.42 4.59

Total 82301 100 411867 100 5.00


28

1.10.2. Aire de culture et production du pois chiche en Algérie

On connait quatre zones principales de culture de pois chiche en Algérie

(Benzohra, 2009):

Pleines littorales et sublittorales (pluviométrie, plus de 600 mm/an).

Plaines d’altitude 700 à 900 m (pluviométrie plus de 600 mm/an).

Hautes plaines telliennes (pluviométrie entre 400 et 600 mm/an).

Plaines basses telliennes (pluviométrie entre 400 et 500 mm/an).

Tableau 8. Evolution des superficies, productions, rendement et semences du pois chiche en Algérie

durant la campagne 1998-2008 (FAO, 2010).

Années Superficie

(Ha)

Production

(tonnes)

Rendement

(Hg/Ha)

Semence

(tonnes)

1998 29550 18143 6139 1386

1999 27720 13070 4715 974

2000 19480 6661 3419 964

2001 19290 12312 6382 966

2002 19330 14971 7744 1142

2003 22850

19102 8359 1153

2004 23079 16367 7091 1167

2005 23348 13727 5879 1062

2006 21252 12706 5978 1034

2007 20681 14294 6911 1000

2008 20000 15000 7500 1000

1.10.3. Problèmes phytosanitaires du pois chiche en Algérie

Le pois chiche peut être attaqué par de nombreux parasites. Cependant, tous ne

sévissent pas en Algérie et tous n’ont pas le même impact sur la culture. Nous allons

donner un rapide aperçu de ceux que l’on rencontre fréquemment dans les cultures en

Algérie. Parmi les principales maladies du pois chiche, on rencontre l’anthracnose, la

pourriture racinaire et le flétrissement (Ben Freha et al., 2010; Merzoug et al., 2009;

Zaim, 2007; Bekkar, 2007; Pande et al., 2007; Labdi, 1990).

1.10.3.1. L’anthracnose

Cette maladie est causée par Ascochyta rabiei, ce champignon est transmis par

les semences (Haware et al., 1986), mais peut se maintenir pendant deux ans dans les


29

résidus de culture si les conditions climatiques lui sont favorables (température allant

de 9 à 29°C et fortes hygrométries) (Pande et al., 2005).

La maladie peut en quelques jours détruire entièrement une culture réalisée

avec une variété sensible (Chen et al., 2004; Haware et al., 1981). La pratique du

semis précoce, selon plusieurs auteurs impose l’utilisation d’une variété tolérante à

l’anthracnose, ainsi que le traitement de semences avec des produits adéquats (Pande

et al., 2005; Muehlbauer et Kaiser, 1994 ; Reddy et al., 1980). Selon Nene et Reddy,

(1987), les symptômes caractéristiques sont la présence de tâches brunâtres à

rougeâtres avec un halo clair au centre, présentant des points noirs de taille variables

sur feuilles, même les tiges et les gousses peuvent être atteintes en présentant les

mêmes symptômes (Markell et al., 2008; Haware et al., 1986).

1.10.3.2. Pourritures racinaires

On distingue deux types de pourritures: sèche et noire.

Pourriture sèche : elle fut citée la première fois en Inde, dont l’agent causal est le

genre Rhizoctonia spp. Selon Nene et al., (1981), d’autres espèces sont responsables

des pourritures. Cependant, ces dernières années, ces espèces sont beaucoup moins

fréquentes par rapport au genre Rhizoctonia. D’après Rouibah, (1989), cette maladie

débute par un dessèchement brusque de la plante, qui évolue du bas vers le haut, les

feuilles prennent une couleur jaune palle, alors que les racines se dessèchent et

deviennent facilement cassables.

Pourriture noire : Selon, Nene et Reddy, (1987) et Trapero et Jimez-Diaz, (1985), ce

genre de pourriture est causé par le Fusarium oxysporum f. sp. pisi. Cette maladie se

caractérise par des symptômes au niveau des organes aériens, similaires à ceux du

flétrissement, tandis qu’au niveau des organes souterrains on distingue une pourriture

noire sans décoloration du système vasculaire (Alvarez et Briner, 1987). D’après

Trapero et Jimez-Diaz, (1985), l’importance du jaunissement foliaire est directement

liée avec la sévérité des attaques de la partie souterraine. Selon toujours ces mêmes

auteurs, ce pathogène cause aussi la détérioration des semences et la mort des

plantules en post émergence.


30

1.10.3.3. Complexe du flétrissement

Le flétrissement est un complexe de plusieurs agents pathogènes du pois

chiche, plusieurs auteurs signalent notamment le F. oxysporum f.sp. ciceri, F. solani,

Verticillium albo-atrum, Rhizoctonia bataticola et R. solani (Labdi, 1990; Fahim et

al., 1987; Trapero et Jimez-Diaz, 1985; Grewal, 1982).

Plusieurs auteurs tels que Alvarez et Moreno, (1984); Allen, (1983); Nene et

al., (1981) et Haware, (1990) ont signalés que le terme « complexe du flétrissement »

définit deux maladies bien distinctes, le flétrissement et les pourritures racinaires.

Selon Jimenez-Diaz et al., (1989), les pertes annuelles dues à ces deux types de

maladies sont estimées à environ 10 millions de dollars. En Tunisie, le flétrissement a

entrainé la destruction de la moitié de la campagne 1982 – 1983 (Rouibah, 1989).

2. L’agent pathogène (Fusarium oxysporum f. sp. ciceri)

2.1. Généralités sur le genre Fusarium

Le genre Fusarium comptant principalement des espèces phytopathogènes

(Agrios, 2005; Pieckova et Jesenska, 1999), nécrotrophiques, d'origine tellurique

causants des maladies sérieuses chez les plantes dans le monde (Agrios, 2005).

Cependant, ce genre regroupe des espèces appartenant à des agents causants des

mycoses chez l'être humain (Pieckova et Jesenska, 1999). La production de

mycotoxine est un phénomène très commun chez ce genre (trichothcenes, zearalenon,

fumonisins) (Pieckova et Jesenska, 1999). Les espèces de F. oxysporum causent

principalement le flétrissement vasculaire de plusieurs espèces de plantes en causant

des pertes de rendement importantes (Agrios, 2005; Schouten et al., 2004). Cependant

plusieurs espèces du genre Fusarium, spécialement F. solani cause la pourriture des

racines et des tiges et même des semences, cette pourriture est accompagnée par une

production de mycotoxines (Agrios, 2005).


31

2.2. Généralités sur le Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum Schlecht est un champignon d'origine tellurique

cosmopolite, présente une très grande diversité génétique et écologique (Jimenez -

Gasco et al., 2004; Di-Pietro et al., 2003; Di-Pietro, 1998; Beckman, 1987;

Armstrong et Armstrong, 1981; Booth, 1971). Cette espèce inclut plus d’une centaine

de formes spéciales et races qui sont chacune spécifique d’une plante hôte, souvent

des espèces végétales d’intérêt horticole, maraîcher ou agronomique. F. oxysporum

inclut également des populations non pathogènes pour lesquelles aucune plante hôte

n’a été identifiée à ce jour (Barik et al., 2010; Arroyo et al., 2003).

Parmi cette population, on rencontre des parasites opportunistes et des agents

antagonistes (Summerbell et Schroers, 2002). Cette espèce est présente dans la

plupart des sols cultivés dans le monde (Odds et al., 1998; Boutati et Anaissie, 1997).

Les espèces phytopathogènes de F. oxysporum causent des maladies sérieuses sur les

cultures, en causant spécialement le flétrissement vasculaire (Di-Pietro, 1998; Tello et

Lacasa, 1990).

Cette maladie attaque plusieurs plantes pérennes et annuelles, aussi bien dans

les zones tempérées que dans les zones tropicales causant leur jaunissement et leur

flétrissement (Di-Pietro et al., 2003; Di-Pietro, 1998; Namiki et al., 1994; Beckman,

1987).

Le champignon produit trois types de spores: les chlamydospores, les

macroconidies et les microconidies (Booth, 1971). Le haut niveau de spécificité des

souches pathogéniques dans F. oxysporum a conduit au développement des formes

spéciales conçu pour permettre une bonne différentiation de ces souches similaires

morphologiquement (Cunnington et al., 2009). Les souches qui ont une gamme

d'hôtes identiques sont assignées dans un groupe intraspécifique, nommé formae

speciales (Armstrong et Armstrong, 1981; Snyder et Hansen, 1940), créer par Snyder

et Hansen (Agrios, 2005). Les formae speciales sont distinguables par leur capacité à

causer les symptômes du flétrissement sur une gamme d'hôte de plante limité

taxonomiquement (Armstrong et Armstrong, 1981; Snyder et Hansen, 1940).


32

Actuellement, cette espèce se compose de plus de 120 formes spéciales correspondant

aux hôtes qu'elles infectent (Agrios, 2005), chacune de ces formes peut être divisé en

races physiologiques et chaque race physiologique montre un modèle caractéristique

de virulence sur des variétés différentielle dans la même espèce de plante hôtes

(Agrios, 2005; Armstrong et Armstrong, 1981).

2.3. Fusarium oxysporum f. sp. ciceri (FOC)

2.3.1. Historique

Fusarium oxysporum a été décrit pour la première fois par Matuo et Ishigami

en (1958) à partir d'une plante soufrant du flétrissement vasculaire S. melongena

(Solanaceae). Tel que cité par plusieurs auteurs, l’agent causal responsable du

flétrissement du pois chiche est Fusarium oxysporum (Schliecht) f. sp. ciceri (Hans.)

Snyd et Hansen (Cabrera et al., 1985; Halila et al., 1984; Sharma et Gupta, 1983;

Nene et al., 1978), signalé depuis 1910 (Erwin, 1958). Le diagnostique de cette

maladie n’a été complété qu’en 1940 par Padwick (Padwick, 1940). La maladie a été

signalée en premier lieu dans seulement 14 pays.

Les premières recherches sur cette maladie ont débuté en Inde et Myanmar

dans les années 1920 puis en Mexique, des confusions dans l'identification du

flétrissement du pois chiche ont été très répandue, jusqu'à que Nene et al., (1981) ont

clarifié l'identification de FOC (Singh, 1987). Actuellement, cette maladie a été

rapporté dans au moins 33 pays (Singh et al., 2002).

2.3.2. Présentation de FOC

Le filament mycélien de Fusarium oxysporum Schlecht f. sp. ciceri (Hanz)

Snyd. et Hansen est hyalin, septé et uninuclé (Dickinson, 1932), il provoque des

dégâts systémiques par pénétration dans les racines de la plante du pois chiche et

obstruction des vaisseaux. Il bloque ou réduit le passage de l'eau et des éléments

nutritifs vers les feuilles et cause le flétrissement vasculaire (Sharma et Muehlbauer,

2007), ainsi le F. oxysporum ciceri est inféodé au genre Cicer (Kraiser, 1994). Le

FOC se transmis par semence et par le sol (Kraft et al., 1994; Pande et al., 2007),


33

survie à travers les chlamydospores dans les grains et les débris des plantes mortes

(Haware et al., 1978) et par conséquent il est difficile de le contrôler par l'utilisation

des produits chimiques et la rotation des cultures (Shah et al., 2009). Le pathogène

peut rester en survie dans le sol en absence de son hôte pendant au moins 6 ans

(Stevenson et al., 1995; Haware et al., 1996). L’instabilité morphologique de

Fusarium oxysporum f. sp. ciceri sur milieu de culture est un phénomène très

commun (Nelson et al., 1983; Haware et al., 1978).

2.3.3. Description et clés d'identification de FOC

Le genre Fusarium oxysporum peut être définit par les critères

morphologiques, incluant la forme de la microconidie et macroconidie, la structure du

conidiophore (fausse tète sur des phialides courts formés sur l'hyphe) et la formation

de chlamydospores. Sur le milieu CLA (Carnation Leaf-piece Agar), les

macroconidies de Fusarium oxysporum ciceri sont formées en sporodochie orange

pale qui naissent à partir de monophialides sur des conidiophores branchés et parfois

sur des monophialides sur l'hyphe. La longueur des macroconidies est courte à

moyenne, courbée à légèrement droite, à paroi épaisse et présentant souvent 03

septations.

Les microconidies sont formés abondamment en fausse tête sur des

monophialides courtes, ils peuvent être ovales, elliptiques ou réniformes et sont

souvent sans septation (Leslie et Summerell, 2006).

Chez la plupart des isolats, les chlamydospores sont formées abondamment et

rapidement (2 à 4 semaines), mais elle peut être lente (4 à 6 semaines) et parfois

n'existe pas chez certains isolats. Les chlamydospores sont souvent unique ou en

paires, mais peuvent être en groupe ou en petite chaine. Ils peuvent être terminaux ou

intercalaire. Sur milieu PDA, la morphologie des colonies varie largement. Fusarium

oxysporum produit un pigment sur agar-agar, qui varie de claire au violet foncé, mais

quelques isolats ne le produisent pas. Le mycélium peut être cotonneux, épars ou

abondant, et varie de la couleur blanchâtre au violet. Les macroconidies sont produites


34

en abondance. Des sclérotes marron claire à bleu foncé ou violette peuvent être

produite en abondance chez quelques isolas (Leslie et Summerell, 2006).

Fusarium oxysporum peut être distingué de F. solani, par la formation des

microconidies en fausses tète sur des monophialides longues, et se distingue de F.

subglutinans par des microconidies sur des polyphialides et ne forme pas de

chlamydospores (Leslie et Summerell, 2006). Cette identification morphologique pose

un problème à cause de la diversité des isolats non pathogéniques et saprophytiques

dans le sol, et aussi ne diffère pas les races de FOC, c'est pourquoi des méthodes

moléculaires ont été mise au point pour surmonter ce problème (Jimenez-Gasco et

Jimenez-Diaz, 2003).

2.3.4. Classification, biologie et cycle de reproduction du champignon

Fusarium oxysporum (Schlecht.) emend. Snyder et Hansen, se distingue des

autres espèces de Fusarium par la production abondante de microconidies,

rassemblées en fausse tète à partir de monophialides courtes. Seule la reproduction

asexuée est connue chez cette espèce (Jimenez-Gasco et al., 2004), ce qui la place

dans le groupe des Deutéromycètes. En fait, F. oxysporum est un Deutéromycètes

telluriques appartenant à la sous classe des Hyphomycètes et à la famille des

Tuberculariacées, il fait partie de la section Elegans (Nelson et al., 1983; Messiaen et

Cassini, 1968; Booth, 1971).

2.3.5. Mécanismes d'infection et de colonisation

2.3.5.1. Mode d’infection

Le champignon peut survivre dans le sol sous forme de mycélium ou spore en

absence de son hôte (Agrios, 2005). La chlamydospore est la forme dormante dans les

tissus en décomposition. Le cycle de vie de Fusarium oxysporum (Figure 4.)

commence dans le sol en présence de l'hôte. Le stimulus de la germination serait les

racines de la plante hôte, en le contactant avec des débris non colonisés de la plante

fraîche (Delgado-Jarana, 2005). Le tube germinatif des spores ou du mycélium

pénètre dans les racines de plantes saines cultivées dans un sol contaminé. L'entrée


35

est soit directe, à travers les parois ou opportuniste (Cunnington et al., 2009; Agrios,

2005; Aboul-Soud et al., 2004). Le mycélium prend un chemin intercellulaire à

travers le cortex, et entre dans les vaisseaux du xylème, dans lequel il se multiplie en

causant les symptômes du flétrissement (Agrios, 2005; Aboul-Soud et al., 2004).

2.3.5.2. Mode de colonisation

Après infection des racines de l'hôte, le champignon traverse le cortex et entre

dans les tissues du xylème (Cunnington et al., 2009). Généralement, le mycélium

migre à travers la partie inférieure de la plante vers la tige et la couronne (Aboul-Soud

et al.., 2004), ensuite le pathogène se branche aux vaisseaux du xylème où le

mycélium produit des microconidies (Cunnington et al., 2009; Halila et al., 2009;

Aboul-Soud et al., 2004), les microconidies se détachent et se transportent dans le

système vasculaire (sève) via le flux de transpiration (Aboul-Soud et al., 2004). A ce

stade les microconidies germent et le mycélium pénètre dans la paroi du vaisseau

adjacent et il devient systémique dans les tissues de l'hôte (Cunnington et al., 2009).

L'économie de l'eau des plants infectés est éventuellement compromis

sévèrement par le blocage des vaisseaux conductrices par la germination des

microconidies, le résultat est la clôture des stomates, flétrissement et mort des feuilles,

suivie par la mort de la plante entière (Halila et al., 2009; Cunnington et al., 2009;

Aboul-Soud et al., 2004).

2.3.6. Inoculum primaire, mode de survie et de transmission de FOC

Le FOC est un pathogène d'origine tellurique, cependant quelques rapport

indiquent que ce pathogène peut être transmit par les graines (Richerdson, 1990;

Haware et al., 1986). Cela suppose que l'augmentation de la densité de l'inoculum de

FOC dans le sol est aussi contribuée par le mélange des graines infectées avec les

graines saines utilisées pendant le semis (Pande et al., 2007). La dissémination du

champignon peut se produire selon différentes formes: les résidus de plants infectés

(racines, tiges, feuilles), le sol et les graines. Les spores peuvent être disséminées par

le vent et la pluie (Cunnington et al., 2009; Booth, 1971).


36

Le FOC est fréquemment considéré comme agent de maladies monocycliques

gouvernées fortement par la densité et la distribution de l’inoculum primaire. C'est

pour cela, le but principal d'une stratégie de contrôle est de réduire la quantité de cet

inoculum (Rekha et al., 2000).

Les champignons du sol ont, quant à eux, des rayons de disséminations très

faibles. Ils évoluent par le développement de leur mycélium, attiré par les sécrétions

racinaires des plantes. Ils bénéficient néanmoins d’autres atouts: des formes de

conservation performantes qui peuvent rester viables plusieurs années dans le sol et

passer ainsi le cap de rotations longues. Ils peuvent en outre être disséminés d’une

parcelle à l’autre par le biais du matériel de travail du sol (Cunnington et al., 2009;

Gwata et al., 2006).

L’homme est en effet lui aussi un vecteur, notamment par le transport

de semences contaminées, ou du fait d’échanges commerciaux de matières premières

végétales. Par ces différents vecteurs, les maladies peuvent être transportées sur des

grandes distances, d’une parcelle à l’autre mais aussi d’un pays à l’autre (Cunnington

et al., 2009; Gwata et al., 2006).


37

Figure 4. Cycle infectieux de Fusarium oxysporum, d'aprés Agrios, (2005)

Anneau des vaisseaux

décolorés d'un xylème

secondaire

Mycélium et

conidies

dans des

vaisseaux

Des vaisseaux de

xylème chez une tige

ou un pétiole sains

Des vaisseaux détruits chez

une tige ou pétiole infectés

Pénétration à travers les

blessures- le mycélium

entre dans les vaisseaux

Les conidies

forment des

sporodochies sur

les feuilles mortes

Mycélium ou tubes

germinatifs

attaquent les racines

Spore en germination

Microconidies

Macroconidies Chlamydospore

s

Mycélium

Spores formées par le mycélium dans le sol Plant entièrement flétris et mort

Les branches basses

commencent à flétrir Tous les stades sont présents dans les tissues et les sols infectés

Pénétration à travers les

cassures formées par

racines latérales

Mycélium dans les

vaisseaux

Le mycélium

bouche les

vaisseaux


30

2.3.7. Gamme d'hôte

L'hôte principale de FOC est le genre Cicer (Jimenez-Gasco et al., 2004; Nene

et al., 1996; Haware et al., 1986), mais quelques auteurs ont signalé que ce

champignon peut attaquer d’autres espèces de plantes, telles que: Cajanus cajan (Pois

de pigeon), Lens culinaris ssp. (Lentille) et Pisum sativum (petits pois) (Haware et

Nene, 1982).

2.3.8. Races physiologiques et pathotypes de FOC

Actuellement , 08 races du pathogène (race 0, 1A,1B/C, 2, 3, 4, 5 et 6) ont été

identifié par la réaction sur 10 lignées du pois chiche (Cunnington et al., 2009; Sharma

et Muehalbauer, 2007; Ansari et al., 2001; Garcia- Pedrajas et al., 1999; Jimenez-Diaz

et al., 1993; Jimenez- Diaz, 1989; Cabrera De La Colina et al., 1985; Haware et Nene,

1982). Haware et Nene, (1982) sont les premiers qui ont identifiés les races 1, 2, 3 et

4 de F. oxysporum f. sp. ciceri en Inde. 03 races du pathogène ont été ensuite

identifiées dans le sud de l’Espagne: 0, 5, et 6 (Jiménez-Díaz et al., 1989). La race 1 a

été subdivisé en deux races, nommées race 1A en Inde et la race 1B/C en Espagne,

basée sur la variation dans la réaction aux lignées des plantes hôtes différentielles

(Jimenez-Diaz et al., 1993; Trapero-Casas et Jimenez-Diaz, 1985). Rahman et al.,

(1998) ont suggéré l'occurrence de deux races additionnelle en Inde et cette suggestion

a été appuyée par une autre étude faite par le même auteur.

Les 8 races ont une distribution géographique distincte (Honnaredy et Dubey,

2006; Jimenez-Gasco et al., 2004). La maladie est caractérisée par deux types de

symptômes, nommée: flétrissement vasculaire et jaunissement (Dubey et al., 2007;

Kelly et al., 1994; Jimenez-Diaz et al., 1989). Bien que la caractérisation des races est

importante, la distinction initiale la plus crucial est entre les pathotypes associés

flétrissement - jaunissement (Garcia-Pedrajas et al., 1999) en se basant sur les

symptômes de la maladie qu'il induit dans les tests pathologiques (Trapero-Casas et

Jimenez-Diaz, 1985). Les deux symptômes sont le résultat des infections vasculaires et

les travaux ont montré que le pathotype jaunissement (Yellowing) de FOC est moins

agressive que le pathotype flétrissement (Wilting) (Jimenez-Gasco et al., 2004).


31

2.3.9. Distribution de la maladie et des races pathologiques dans le monde

La maladie est largement propagée dans les régions de culture du pois chiche

dans le monde, elle a été rapporté dans au moins 33 pays (Singh et al., 2002). Nene et

Reddy, (1987) ont rapporté que la maladie couvre le nord de l'Amérique, l’Europe, le

Moyen orient et le Sud Est de l'Asie. La distribution globale est corrélée avec la

présence des races de FOC. La fusariose a été rapporté dans la plupart des régions de

culture du pois chiche: le subcontinent Indien, L'Iran, le Pérou, la Syrie, l'Ethiopie, le

Mexique, l’Espagne, la Tunisie, la Turquie, USA (Halila et Strange, 1996; Jalali et

Chand, 1992; Haware, 1990; Nene et al., 1989; Nene et Reddy, 1987; Westerlund et

al., 1974) et l'Algérie (Mehrez et al., 2010; Ben Freha et al., 2010; Bekkar, 2007).

2.3.10. Spécialisation chez le FOC et résistance variétale

La résistance race spécifique chez le pois chiche est gouvernée par plusieurs

gènes qui contrôlent la reconnaissance race de FOC/variété du pois chiche. Plusieurs

sources de la résistance race spécifique ont été identifiées (Sharma et al., 2005) et

quelques unes ont été exploitées pour l'amélioration des cultivars du pois chiche

résistant au flétrissement (Singh et Jimenèz-Diaz, 1996). La résistance à la fusariose

du pois chiche peut être exprimé avant que le FOC gagne l'entrée dans le xylème des

plantes ou même avant (Farooq et al., 2005).

2.3.11. Origine de FOC et source de variabilité

Le génome de FOC entier est lié, et se transmettre en unité d'une génération à

la génération suivante, et leurs populations naturelles devraient être clonale dans la

nature. La reproduction forcée chez le Fusarium oxysporum interdit toute

recombinaison régulière, et la variation génétique doit résulter principalement de

l'accumulation des mutations (Jimenez-Gasco et al., 2004). Les isolats de la même

forme spéciale qui partagent le même hôte partagent des similarités génétiques plus

que les autres de différente spécialisation. L'interprétation évolutionnaire de ce

concept est que les formes spéciales sont monophylétique et que les isolats qui

partagent le même hôte sont tous dérivés d'un seul génotype pathologique. Les races

peuvent être dérivé de mutations ponctuelles dans ce génotype sélectionné par la


32

pression sélective imposée par la culture de variétés à gènes résistants (Arroyo et al.,

2003).

Cette clonalité chez le Fusarium oxysporum a été associée avec la

compatibilité végétative (VCG): capacité des isolats fongiques d'établir des

hétérokayons stables par anastomose entre les hyphes homokaryotiques adjacents (Di

Primo et al., 2001; Klein et Correll, 2001; Gordon et Martyn, 1997).

2.4. La maladie de la fusariose du pois chiche

Le flétrissement vasculaire causé par le FOC (Padwick) Matuo et Sato, est

une des majeurs facteurs limitant la production du pois chiche dans le monde (Sharma

et al., 2009; Pande et al., 2007; Jalali et Chande, 1992). Malgré qu'il existe un nombre

de facteurs biotiques et abiotiques qui participe dans l'abaissement de la production,

cette maladie reste une des épidémies les plus importantes (Farooq et al., 2005).

2.4.1. Dégâts causés par la fusariose du pois chiche

Le flétrissement vasculaire, causé par le Fusarium oxysporum Schlechtend.

Fr. f.sp. ciceri (Padwick) Matuo et Sato, cause des pertes annuelles de rendement

estimées entre 10 à 90% (Navas-Cortés et al., 1998; Jalali et Chand, 1992; Singh et

Reddy, 1991; Jimenez-Diaz et al., 1989; Trapero-Casas et Jimenez-Diaz, 1985) et

peut aller jusqu’à 100% de perte quand les conditions sont favorables (Sharma et

Muehlbauer, 2007; Navas-Cortés et al., 2000; Halila et Strange, 1996; Haware, 1990;

Haware et al., 1990; Haware et Nene, 1980). Les pertes annuelles du pois chiche dû

au flétrissement vasculaire ont été estimées à 10% en Inde (Singh et Dahiya, 1973),

50% au Pakistan (Ikramul et Farhat, 1992) et en Espagne (Trapero-Casas et Jiménez-

Díaz, 1985) et à 40% en Tunisie (Bouslama, 1980). La maladie peut apparaitre durant

tous les stades de la croissance du pois chiche (Navas-Cortés et al., 1998).


33

2.4.2. Description des symptômes de la fusariose du pois chiche

Le flétrissement précoce causé par le FOC peut être observé sur les génotypes

sensibles 25 jours après le semis (Shah et al., 2009; Raju et al., 2008; Pande et al.,

2007; Navas-Cortés et al., 1998; Nene et al., 1978) et comme tardif au stade de

remplissage de gousses (Pande et al., 2007; Navas-Cortés et al., 1998). Le

flétrissement précoce cause plus de perte que le flétrissement tardif. Les jeunes

plantules infectées par le flétrissement vasculaire s'écroulent, s'aplaties et s'allongent

sur terre et gardent leur couleur verte sombre (Pande et al., 2007). Cependant, les

plantes adultes montrent des symptômes du flétrissement typique, par conséquent le

plant entier montre un abaissement soudain des feuilles (Shah et al., 2009; Raju et al.,

2008; Dubey et Singh, 2004), une couleur pale par rapport aux plantes saines (Shah et

al., 2009) et une décoloration du xylème de la tige (Raju et al., 2008), ensuite le plant

meurt. Les plantes du pois chiche attaquées par le FOC ne montre pas une pourriture

externe et apparaissent saines, lorsqu'on coupe verticalement la partie inférieur de la

région du collet, cette région montre une coloration marron des tissues internes (Shah

et al., 2009; Dubey et Singh, 2004; Nene et al., 1991). Certains auteurs rapportent la

présence d'une pourriture racinaire (Raju et al., 2008), cependant d’autres signalent

l'absence de cette pourriture (Dubey et Singh, 2004; Nene et al., 1991). Les gousses

des plantes du pois chiche malades apparaissent normales, mais les graines sont

généralement plus petites, froissées (pliées) et décolorées (Pande et al., 2007; Haware

et Nene, 1980).

Figure 5. Distribution typique de plantes du pois chiche infestées par le FOC

(Cunnington, 2009)


34

2.4.3. Localisation de la fusariose du pois chiche

Le flétrissement vasculaire du pois chiche est répandu dans les pays tropicaux

et tempérés chauds en culture sous serre où en une culture intensive en plein champs

(Arroyo et al., 2003). Le flétrissement a été rapporté dans plusieurs pays dans le

monde (Nene et al., 1984), mais cette maladie est plus importante entre l'altitude 30N°

et 30S° où la saison de la culture est sèche et chaude (Sharma et al., 2009; Pande et

al., 2007), que les altitudes hautes (30-40N°) (Pande et al., 2007).

2.4.4. Répartition géographique et importance économique du flétrissement

vasculaire du pois chiche en Algérie

En Algérie, le flétrissement du pois chiche n’est connu que par quelques

données fragmentaires. Depuis 1970, des isolements effectués à partir des plants du

pois chiche présentant des symptômes du flétrissement et du jaunissement ont montré

la prédominance de Fusarium oxysporum (Si-Hassen, 1990). Durant la campagne

1989 – 1990, une prospection réalisée avec la participation de plusieurs spécialistes de

différentes structures a porté sur les principales cultures de légumineuses (pois chiche,

lentille et fèves) a montré que les pertes dues au F. oxysporum peuvent atteindre 50 à

100 % sur la variété locale RABAT (Bouznad, 1989). D’autres travaux réalisés au

cours de ces quatre dernières années ont montré l’importance des dégâts occasionnés

Figure 6. Symptômes de la fusariose du pois chiche: A, sur plant entier; B, sur coupe

longitudinale de la tige (Cunnington, 2009)

A B


35

par F. oxysporum sur pois chiche (Mehrez et al., 2010; Ben Freha et al. 2010;

Merzoug, 2009; Zaim, 2007; Bekkar, 2007).

2.4.5. Facteurs influençant la maladie du flétrissement

Certains facteurs possèdent une très grande influence sur la croissance de

l’espèce fongique et principalement sur les possibilités de réalisation de l’interaction

hôte - parasite, parmi ces facteurs on distingue:

La température: le processus d'infection par le FOC est influencé par

l'environnement spécialement la température (Landa et al., 2001; Navas-Cortés et al.,

2000; Navas-Cortes et al., 1998; Gupta et al., 1987; Bhatti et Kraft, 1992; Westerlund

et al., 1974). Une température avoisinant 25°C est optimum pour le développement de

la fusariose du pois chiche (Sharma et Muehlbauer, 2007), et cela malgré une faible

densité d'inoculum initial du sol (Navàs-Cortès et al., 2000). Des observations de

l'incidence du flétrissement du pois chiche dans le champ ont montré que le facteur

chaleur augmente la sévérité de la maladie (Ben Freha et al., 2010; Trapero-Casas et

Jimenez-Diaz, 1985).

L’humidité: Des observations de l'incidence du flétrissement du pois chiche

dans le champ ont montré que les sols humides augmentent la sévérité de la maladie

(Trapero-Casas et Jimenez-Diaz, 1985).

Effet des exsudats racinaires: La majorité des interactions plante-pathogène

compte sur la libération des composés solubles ou volatiles à partir des grains ou des

racines qui stimulent la germination des propagules d'origine tellurique (Steinkllner et

al., 2005). La qualité et la quantité des substances libérées par les racines vers la

rhizosphère est conditionnées par les espèces de plantes, les conditions de croissance,

le stade de développement, les facteurs environnementales, les blessures mécaniques

ou dues aux bio-agresseurs et de l'activité microbienne (Curl et Truelove, 1986; Hale

et al., 1978). Ces substances peuvent être soit: des sucres, des acides aminées, des

acides organiques, des composés phénoliques, des flavonoïdes, des enzymes, des

acides gras, des régulateurs de croissance, des nucléotides, des tannins, des stéroïdes,

des terpenoides, des alcaloïdes, des poly acétylènes et des vitamines (Bertin et al.,

2003).


36

La densité de l'inoculum: La sévérité de la maladie dépend également de la

densité d'inoculum. Ce facteur est rapporté par certains auteurs qui ont observé que

l'augmentation de la charge de l'inoculum augmente la sévérité et la rapidité de la

maladie, par contre sa diminution supprime l'expression de la maladie (Navas-Cortes

et al., 2000; Sugha et al., 1994; Gupta et al., 1987; Westerlund et al., 1974).

La sensibilité des cultivars: l'incidence de la maladie peut être influencé par le

génotype du pois chiche cultivé, cette incidence augmente lors de l'utilisation de

génotypes sensibles (Navas-Cortes et al., 2000).

3. Agent antagoniste (Actinomycètes)

3.1. Les actinomycètes

3.1.1. Présentation et caractéristiques des actinomycètes

Les actinomycètes sont des bactéries dont la croissance donne lieu à des

colonies circulaires (Eunice et Prosser, 1983) constituées d'hyphes qui irradient par

croissance centrifuge tout autour du germe qui leur a donné naissance (Eunice et

Prosser, 1983; Lechevalier et Lechevalier, 1981; Gottlieb, 1973), cela explique leur

dénomination actinomycètes, du grec aktis (à rayon), mykes (champignon):

champignons à rayons (Pandey et al., 2003; Gottlieb, 1973). Les actinomycètes sont

des bactéries filamenteuses, à Gram positive (Arifuzzaman et al., 2010; Ningthoujam

et al., 2009; Pandey et al., 2003; Lo et al., 2002) sporulant avec un ADN riche en GC

(57% -75%) (Pandey et al., 2003; Lo et al., 2002). 70% de ces microorganismes sont

producteurs de métabolites secondaires, parmi eux 95% appartiennent au genre

Streptomyces sp. (Bastide et al., 1986).

Figure 7. Observation microscopique des actinomycètes, A: au microscope optique (coloration de

Gram x100) (Todar, 2009); B et C: au microscope électronique montrant des chaines de spores

spirales et des surfaces de spores lisses (Atta et al., 2009; Yamamoto et al.,1998).

B C A


37

Sur milieux solides, les actinomycètes forment en une semaine des colonies

souvent pigmentées (gris, vert, rouge, …) provenant de l'accumulation d'hyphes

ramifiés à contour lisse ou échancré à aspect compact, poudreux ou en chou-fleur

(Kitouni, 2007), quelques actinomycètes synthétisent des pigments foncées, la

mélanine ou mélanoide, qui est considéré comme un critère utile pour les études

taxonomiques (Venkatesan et al., 2008).

3.1.2. Ecologie des actinomycètes

Les actinomycètes sont le groupe de microorganismes le plus largement

répandu et distribué dans la nature (Oskay et al., 2004; Barakate et al., 2002).

Ils préfèrent un pH neutre ou peu alcalin, ils sont généralement mésophiles,

d'autres sont thermophiles tolérants à des températures allant jusqu'à 60°C (Omura,

1992). On retrouve les actinomycètes dans divers milieux écologiques, y compris les

sols désertiques et forestiers, des sols cultivés ou non cultivés, fertiles ou non fertiles

(Goodfellow et Simpson, 1987) et dans l'eau (Verma et al., 2009; Zitouni et al., 2005;

Sette et al., 2005; Lo et al., 2002). Les actinomycètes peuvent vivre à l'état libre ou

en association (Verma et al., 2009), les associations établies sont: la symbiose avec

les plantes non légumineuses comme le genre Frankia (fixation de l'azote

atmosphérique) (Benson et Silvester, 1993) ou l' endophytisme dans les tissus de

plantes où il stimulent leur croissance (Bradbury, 1986; Doumbou et al., 1998) ou

même dans les invertébrés marins (Salomon et al., 2004; Doumbou et al., 1998).

3.1.3. Importance des actinomycètes

La fonction majeure des actinomycètes est la décomposition des résidus

végétaux et animaux, à cause de leur diversité métabolique (Kang et al., 2010) et leurs

mécanismes spécifiques en rentrant dans les cycles de bio- remédiation (Sette et al.,

2005; Williams et Vickers, 1988). Les genres de la classe des actinomycètes et

spécialement Streptomyces spp. ont été reconnu depuis longtemps comme source

importante de métabolites bioactives utiles à grande valeur commerciale (Demain et

Sanchez, 2009; Zitouni et al., 2005; Berdy, 2005; Oskay et al., 2004; Sabaou et al.,

1998), comme les antibiotiques (Demain et Sanchez, 2009; Zitouni et al., 2005;


38

Berdy, 2005; Oskay et al., 2004; Sabaou et al., 1998) et autres métabolites bioactives

comme les herbicides, les pesticides, les anti-parasitiques et les enzymes (Zitouni et

al., 2005; Oskay et al., 2004). Depuis la découverte de l'actinomycine, les

actinomycètes ont fournit plusieurs composés bioactives et sont continué d'être

sélectionner pour des nouvelles substances bioactives (Barakate et al., 2002).

Cependant leur utilisation intensive a eu pour conséquence l’adaptation des bactéries à

ces substances (Boughachiche et al., 2005).

Dans le domaine de la thérapie humaine et vétérinaire, de nombreux composés

intéressants sont produits industriellement, comme les antibiotiques, les antifongiques

systémiques ou topiques, les vitamines, les enzymes, l’antihistaminiques, les

vasodilatateurs et les immuno- stimulants (Rattanaporn et al., 2004; Oskay et al.,

2004; Lo et al., 2002; Nolan et Cross, 1988; Bastide et al., 1986; Tiraby et Etienne,

1983). La majorité des actinomycètes représentent un groupe fort et utile dans le

domaine agronomique (Sabaou et al., 1998), ils sont utilisées pour la prévention des

maladies de plantes (PGPR) et dans le domaine de la lutte biologique (Oskay et al.,

2004; Bastide et al., 1986). Une autre importance des actinomycètes, est leur

utilisation dans la fertilisation des sols à travers leur pouvoir fixateur d'azote (Sabaou

et al., 1998). Les enzymes des actinomycètes sont aussi utilisées dans l’industrie

alimentaires (conservateurs) et en alimentation animale (Bastide et al., 1986).

3.1.4. Taxonomie des actinomycètes

Le groupe des actinomycètes comprend actuellement plus de 40 genres et

quelques centaines d’espèces, les propriétés chimiques, physiologiques et

immunologiques des actinomycètes les rangent parmi les procaryotes (Williams et al.,

1973), leur paroi cellulaire renferme une glycoprotéine contenant de la lysine ou de

l'acide diaminopémilique (Mariat et Sebald, 1990; Lechevalier et Lechevalier, 1985).

Le diamètre des hyphes est plus petit que celui des champignons (Gottlieb, 1973). Ces

caractères s'ajoutent à d'autres (existence d'espèces anaérobies strictes, sensibilité à

des actino-phages, …) confirment leur classification parmi les bactéries (Mariat et

Sebald, 1990; Demain et Solomon, 1985). Les actinomycètes se classent dans le règne


39

des procaryotes, à la division des Firmicutes, à la classe des Thalobacteria et l'ordre

des Actinomycetales (Bergey's, 1989).

3.1.5. Utilisation des actinomycètes en lutte biologique

Après Bacillus thuringiensis qui est le micro-organisme le plus utilisé comme

bipesticide, on rencontre des espèces appartenant au actinomycètes (Kavita et al.,

2010; El-Tarabily et al., 2006; Fourati- Ben Fguira et al., 2005; Doumbou et al.,

2002). Plusieurs travaux ont montré que ces derniers peuvent être utilisés dans ce

domaine. Ce groupe d’actinomycètes possède les principales propriétés d’un agent de

lutte biologique. Le tableau 9 résume quelques travaux publiés sur l'action antagoniste

des actinomycètes sur les champignons telluriques.

Tableau 9. Quelques publications sur l'utilisation des actinomycètes dans la lutte biologique contre les

pathogènes telluriques

Maladies Plantes Pathogènes Antagonistes Références

Fonte de

semi

Betterave

Concombre

Balsam

Pythium ultimum

Pythium

aphanidermatum

Phytophthora

aphanidermatum

Sclerotium rolfsii

Actinoplanes spp.-

Actinoplanes

Philippinensis -

Microbispara rosea-

Micromonospora chalcea-

Streptomyces sp.

(Khamna et al.,

2009; El-Tarabily,

2006; Khan et al.,

1997)

Pourriture

racinaire

Lupin

Banksia sp.

framboise

Plectosporium tabacinum

Phytophthora cinnamomi

Phytophthora fragariae

var. rubi

Actinoplanes spp.-

Missouriensis carbonacea-

Nocardioides sp.

(El-Tarabily,

2003; El-Tarabily

et al., 1996

;Valois et al.,

1996).

Cavity spot

Carottes

Pythium coloratum

Actinomadura rubra-

Actinoplanes

philippinensis- M.

carbonacea-

Streptosporangium

albidum -

Streptoverticillium

netropsis

(El-Tarabily et

al., 1997).

Piétin-

échandeage

Blé

Gaeumannomyces

graminis var. tritici

Streptomyces sp.-

Microbispara sp.

Micromonospora sp.-

Nocardioides sp.

(Coombs et al.,

2002 ; Coombs et

Franco., 2002).

Pourriture

grise

Vigne

Botrytis cinerea

Streptomyces analatus -

Micromonospora

flavogrisea- Streptomyces

sp.

(Loqman et al.,

2009).


40

Flétrissement

vasculaire

bananier

Pois chiche

Palmier

dattier

Fusarium oxysporum

Streptomyces griseus-

Streptomyces sp.-

Streptomyces roseoflavus

(Getha et al.,

2005; Fourati -

Ben Fguira et al.,

2005; Dhedhi et

al., 1990).

Sclérotiniose laitue Sclerotinia minor M. carbonacea (El -Tarabily et

al., 2000).

lagale

argentée

Pomme de

terre

Helminthosporium solani Nocardia globerula (Elson et al.,

1997).

Alternariose pommier Alternaria brassicicola Streptomyces sp. (Khamna et al.,

2009).

Pourriture

sèche

Pomme de

terre

Colletotrichum

gloeosporioides

Streptomyces sp. (Khamna et al.,

2009).

Pourriture

verte

Oranger Penicillium digitatum Streptomyces sp. (Khamna et al.,

2009).

3.1.6. Mode d'action des Actinomycètes

les mécanismes responsables de la suppression de la maladie par les

actinomycètes sont: la compétition saprophytique des nutriments sur ou au contacte

de la surface racinaire (Alabouvette et Couteaudier, 1992; Lemanceau, 1989;

Alabouvette, 1986), compétition parasitique de sites d'infection sur les racines

(Schneider, 1984) et induction de la résistance systémique chez l'hôte (Liu et al.,

1995; Matta, 1989; Ogawa et Komada, 1985). Mandeel et Baker, (1991) ont démontré

que ces 03 mécanismes peuvent être actifs dans un même isolat à la fois. Plusieurs

auteurs ont rapporté que l'effet protecteur exercer par les Streptomyces sp. augmente

par la capacité de ces isolats a secréter des chitinases (Taechowisan et al., 2004), IAA

(Martinez-Noel et al., 2001), et des sidérphores (Hamdi et al., 2008; Matthijs et al.,

2007; Errakhi et al., 2007; Cao et al., 2002).

3.1.7. Possibilité d’utilisation des actinomycètes contre le FOC

Quelques travaux ont montré l’action antagoniste des espèces d’actinomycètes

vis-à-vis le FOC, aussi bien au champ qu’au laboratoire. Zaim et al., (2010) ont

obtenu une réduction de 83% du flétrissement vasculaire in vitro en utilisant

Streptomyces sp. Dhedhi et al., (1990) ont rapporté la réduction totale du flétrissement

vasculaire chez le pois chiche au champ en utilisant Streptomyces sp.


41

3.2. Le genre Streptomyces

Vue l’importance du genre Streptomyces dans le domaine de la lutte

biologique, de plus, les souches bactériennes antagonistes de FOC isolées au

laboratoire responsables à la réduction du flétrissement vasculaire du pois chiche

appartient à ce genre d'actinomycètes, nous nous sommes efforcé d’apporter quelques

généralités sur ce groupe très particulier.

Plusieurs recherches ont montré que les Streptomyces sont des antagonistes

des champignons tellurique et ont la capacité de coloniser les racines de plantes hôtes

(El-Tarabily et Sivasithamparam, 2006; Cao et al., 2005; Xiao et al., 2002), ce qui

explique leur utilisation en agriculture, étant données que 60% des antimicrobiens

utilisé dans ce domaine sont isolées à partir de Streptomyces spp. (Ilic et al., 2007). La

plus part des composés issus des Streptomyces sp. utilisés en agriculture appartenant à

la famille des polyketides (Savic et Vasiljevic, 2006).

3.2.1. Caractéristiques du genre Streptomyces

Les Streptomyces ont pour niche écologique le sol (Pandey et al., 2003), la

majorité des Streptomyces jouent un rôle important dans la décomposition de

différents biopolymères et dans la minéralisation de la matière organique. Ces

bactéries saprophytes produisent diverses enzymes extracellulaires impliquées dans la

dégradation de nombreuses macromolécules issues des plantes et des animaux

(chitine, pectine, amidon, kératine, élastine, etc…) (Aghighi et al., 2004; Hirsh et

Christensen, 1983). Ce sont des eubactéries de l'ordre des Actinomycetales. Cette sous

division des bactéries à Gram+ (Lo et al., 2002; Sabaou et al., 1998) est caractérisée

notamment par leur haut pourcentage de bases guanine (G) et cytosine (C) dans leur

génome (Lo et al., 2002). Généralement, le pourcentage GC chez ces bactéries est de

72% contre 50% chez E. coli (Singh et al., 2006).

Les Streptomyces sont les actinomycètes les mieux connus. Ils sont très étudiés

pour leur propriété à synthétiser des antibiotiques (streptomycine, kanamycine,

chloramphénicol), des antifongiques (amphotéricine, candicine…), des antitumoraux

(mitomycine, actinomycine…), des antiparasitaires (hygromycine, salinomycine…),


42

des antiviraux (Ara -C, tunicamycine…), des insecticides (avermectine,

milbémycine…) et des herbicides (bialphos, phosphinothricine…) (Rattanaporn et al.,

2004; Oskay et al., 2004; Lo et al., 2002; Nolan et Cross, 1988; Bastide et al.,

1986;Tiraby et Etienne, 1983).

3.2.3. Cycle de différentiation des Streptomyces

Le genre Streptomyces représente plus de 90% des bactéries filamenteuses

(Kurylowicz et al., 1975). Les Streptomyces se distinguent des autres bactéries par

leur cycle de différentiation. Très souvent, on considère qu'une colonie bactérienne est

un ensemble de bactéries toutes identique entre elles (puisque qu'elles dérivent par

scissiparité d'un clone isolé). Dans le cas des Streptomyces, on observe des colonies

formées de cellules qui n'ont pas la même morphologie, elles sont pourtant issues du

même clone initiale. Cette particularité est le résultat d'une différentiation

morphologique par étapes successives (Serrano et Trujillo, 2005).

La germination d'une spore, sur milieu solide donne d'abord naissance à un

mycélium basal. Celui-ci s'incruste dans le milieu de croissance par action d'enzymes

hydrolytiques synthétisées par les cellules. Ensuite, selon les souches et les conditions

environnementales, on observe le développement d'un mycélium aérien. Les hyphes

qui le composent peuvent être de forme variable selon les souches (droite, spiralée,

branchée,…) (Keulen et al., 2005; Shirling et Gottlieb, 1966). C'est à ce stade que

certaines colonies synthétisent les pigments dont la couleur et l'intensité varient selon

les souches et le milieu de culture solide. Les hyphes, contenant plusieurs copies de

l'ADN génomique, donnent naissance à une cinquantaine de spores haploïdes après

septation régulière. Ce développement sous forme de mycélium ressemble beaucoup

à celui de différentiation des champignons d'où le suffixe –myces- (Desjardin, 2002).

3.2.4. Classification des Streptomyces

Le genre Streptomyces appartient à l'ordre des Actinomycetales, la famille des

Streptomycetaceae, les espèces les plus connues sont : S. coelicor, S. lividans, S.

griseus, S. ambofaciens, S. albus, S. thermocarboxydus (Desjardin, 2002).


43

3.2.5. Les avantages de l'utilisation des Streptomyces en lutte biologique

Notre choix des Streptomyces en vue d'une lutte biologique contre la fusariose

du pois chiche est basé essentiellement sur plusieurs propriétés associées au à ce genre

qui peuvent expliquer leur capacité d'agir comme agent de lutte biologique, ces

propriétés sont:

Leur adaptation écologique aux sols des régions arides leur attribuant une forte

compétitivité.

Leur capacité de coloniser la surface des plantes et les sites d'infections

(Dubey et al., 2007; Doumbou et al., 2002).

Leur capacité de produire différents types de métabolites secondaires et des

substances biologiquement actives d'une valeur hautement commerciale

comme les enzymes et les antibiotiques. Les enzymes dégradent directement

les parois des champignons et les phythotoxines (Lee et Hwang, 2002;

Doumbou et al., 2002; Grabley et Thiericke, 1999).

Les Streptomyces sont des contributeurs au tampon biologique des sols et ont

un rôle dans la décomposition de la matière organique (Lee et Hwang, 2002;

Grabley et Thiericke, 1999).

Certains Streptomyces améliorent la croissance des plantes (Merriman et al.,

1974; Brown., 1974).

Ce genre de microorganisme est bien adapté à la formulation et l'application

dans le champ (Landa et al., 1997).

Les produits issus des Streptomyces ne laissent pas des résidus toxiques à

l'opposition des produits chimiques (Dubey et al., 2007).

Cependant, plusieurs inconvénients sont associés à l'utilisation des

Streptommyces sp. en lutte biologique, parmi ces inconvénients plusieurs auteurs ont

rapporté que quelques composés antibiotiques produits par les Streptomyces sont

néfaste pour les microorganismes bénéfiques comme les Rizobium (Foo et verma,

1976; Mall, 1973; Von Schreven, 1964; Vintika et Rosa, 1961; Fravel, 1988).


44

4. Moyens de lutte contre la fusariose du pois chiche

La protection des plantes contre les maladies représente une part importante

des interventions phytosanitaires sur de nombreuses cultures, tant en fréquence

d’application qu’en volume de produits utilisés. La demande de méthodes alternatives

dans ce domaine est considérable et a suscité une forte augmentation des efforts de

recherche ces dernières années (Nicot, 2002). La plupart des moyens utilisés pour

lutter contre les maladies et les ravageurs ne sont pas durables, les moyens de contrôle

de F. oxysporum, hormis la résistance génétique, sont assez peu efficaces du fait que

ce champignon peut survivre de nombreuses années dans le sol en absence d’hôte (au

moins 06 ans sous forme de chlamydospores) sans prendre en compte les capacités

saprophytiques du champignon qui augmentent ces chances de survie. (Haware et al.,

1996; Nene, 1980), et cela rend son contrôle difficile (Sharma et Muehlbauer, 2007),

différents moyens de lutte ont été préconisés en vue de réduire les pertes dues à la

fusariose du pois chiche.

4.1. Pratiques culturales

L'utilisation des semences non infectées ou traitées pour prévenir l’infection

du pois chiche durant la saison de croissance (Chérif et al., 2007), la destruction des

débris de récolte des plantes fusariées et la rotation culturale du pois chiche de plus de

06 ans avec des cultures non hôtes (Chérif et al., 2007; Gupta, 1991; Haware et Nene,

1982), peuvent agir sur la densité de l'inoculum présent dans le sol, mais l'éradication

du champignon par ces techniques ne parait pas très efficace, car le Fusarium

oxysporum, même en absence de son hôte, peut survivre à l'état saprophytique dans

les débris végétaux et la rhizosphère des plantes non hôtes (Edel et al., 1995; Booth,

1971). Le contrôle du flétrissement vasculaire du pois chiche peut être atteint par

l'ajustement des dates de semis (Chérif et al., 2007; Landa et al., 2004; Navas-Cortés

et al., 2000; Jimenez-Diaz et al., 1998; Navas-Cortés et al., 1998; Jalali et Chand,

1992; Jimenez-Diaz et al., 1991), l'avancement de la date de semi du pois chiche du

début de printemps vers la fin de l’hiver empêche le développement épidémique du

flétrissement et minimise la sévérité de la maladie (Navas-Cortes et al., 1998).

Cependant, l'efficacité de ce contrôle est influencée par la sensibilité des cultivars du


45

pois chiche, la nature des races de FOC et sa densité d'inoculum (Navas-Cortes et al.,

2000).

L'ensoleillement des sols avant le semis pendant 06 semaines semble être

efficace pour réduire l'incidence de la fusariose du pois chiche (Mukerji et al., 2009).

4.2. Méthodes chimiques

Les produits chimiques sont efficaces pour lutter contre certaines maladies,

mais leur coût est trop élevé. En plus, de nombreuses études démontrent les risques

que représentent les pesticides sur la santé humaine et l’environnement (Ploetz, 2000;

Ploetz et al., 2003). L'inoculum de FOC présent dans les semences peut être éradiqué

par l'enrobage des graines à l’aide des fongicides tels que: Benlate -T, Benomyl 30%

+ Thiram 30% à 1.5% (Haware et al., 1978). Kaur et Mukhopadhyay, (1992) ont

signalé que le traitement des graines par les deux fongicides: Vitavax et Ziram réduit

l'incidence de la fusariose (Kaur et Mukhopadhyay, 1992). Pour lutter contre ce

parasite, les fongicides sont souvent d’un emploi facile mais ils présentent des

inconvénients: perte rapide d’efficacité, risque de résidus dans les plantes, coût

souvent trop élevé et aide à indiscriminé la microflore bénéfique du sol (Sharma et

Muehlbauer, 2007). En plus, l’utilisation de ces molécules chimiques est souvent

remise en cause en raison de ses impacts sur l’environnement et des problèmes de

santé humaine qu’elle entraîne (Ploetz et al., 2003; Ploetz, 2000). Face à une demande

croissante pour des alternatives à la lutte chimique, les efforts de la recherche ont

abouti à la mise sur le marché de plusieurs produits commerciaux à base de micro-

organismes. Ces produits représentent encore une très faible fraction du marché

mondial des fongicides, laissant entrevoir une marge confortable d’expansion. De ce

fait, la lutte biologique à l’aide d’agents biologiques (bio-pesticides) pourrait

représenter une solution alternative à la lutte chimique classique (Thakor, 2006).

4.3. Méthode biologique

Les systèmes de la lutte biologique n'élimine ni la pathogène ni la maladie

mais les mis en balance naturelle (Dhingra et Sinclair, 1995), cependant les avantages

sont la sécurité environnementale, le coût et le degré de protection (Dubey et al.,

2007).

mailto:30%[email protected]%25%20(Haware


46

4.3.1. Utilisation des microorganismes

La lutte biologique avec les antagonistes est devenue une des plus

prometteuses alternatives à la lutte chimique contre les maladies fongiques. Les

produits d’origine naturelle, sont plus respectueux de l’environnement et de la santé

des utilisateurs et des consommateurs, pourront être introduits dans des programmes

classiques pour permettre de diminuer l’apport d’intrants chimiques. Différents

microorganismes (Bactéries, champignons) ont été signalé par plusieurs auteurs pour

lutter contre la fusariose du pois chiche, tel que les bactéries appartenant aux genres

Bacillus (Duijff et al., 1999; Kumar, 1999; Hervas et al., 1998; Hervàs et al., 1997;

Landa et al., 1997; Lemanceau et Alabouvette, 1993), Pseudomonas (Landa et al.,

2004; Landa et al., 2001; Duijff et al., 1999; Kumar, 1999; Hervas et al., 1998;

Hervas et al., 1997; Lemanceau et Alabouvette, 1993), Burkholderia spp. et

Paenibacillus spp. (Duijff et al., 1999; Hervas et al., 1998; Lemanceau et

Alabouvette, 1993), Rhizobium (Chérif et al., 2007; Arfaoui et al., 2006) et des

souches de FOC non pathogènes (FOC avirulent) (Hervàs et al., 1997), des

actinomycètes (Dhedhi et al., 1990) et d'autres genres appartenant au groupe des

champignons, tel que le champignon mycorhizien, Glomus spp. (Rao et Krishnappa,

1995), Trichoderma harizianum et T. viride (Kaur et Mukhopadhyay, 1992) et

Gliocladium virens (Raju et al., 2008; Chérif et al., 2007; Landa et al., 2004; Landa

et al., 2001; Hervas et al., 1997; Singh et al., 1993).

4.3.2. Méthode génétique

4.3.2.1. La résistance variétale

Cette résistance est dite soit spécifique soit partielle, selon que l’on se trouve

en présence d’un ou plusieurs gènes de résistance variétale. Le choix variétal peut être

intégré au raisonnement de la lutte contre le flétrissement du pois chiche. Certaines

variétés sont tolérantes et parfois, dans certaines situations (modes de contamination,

semences et/ou sol) témoigner des résistances. Ces dernières peuvent être valorisées

en agriculture. L'utilisation des cultivars résistants est une des stratégies les plus

pratiques et la moins couteuse pour le contrôle de la fusariose du pois chiche, mais le

déploiement des variétés résistantes n'a pas été extensive à cause des caractères

agronomiques parfois indésirables (Upadhyaya et al., 2007).


47

En plus, leur résistance est non durable à cause de la présence des races

physiologiques de FOC (Sharma et Muehalbauer, 2007) et certains cultivars

présentent une sensibilité à d’autres maladies (Sharma et al., 2009; Jimenez-Gasco et

al., 2004; Ansari et al., 2001; Navas-Cortes et al., 2000; Singh et al., 1994; Singh et

al., 1994; Jalali et Chand, 1992; Nene et Reddy, 1987). Les variétés du pois de chiche

cultivées par les agriculteurs ont des niveaux de résistance très différents les unes des

autres. Cette résistance est fonction des gènes présents lors de la création de la variété.

Deux types de résistance sont mis en évidence au niveau du pois de chiche, la

résistance spécifique et la résistance partielle.

La résistance spécifique est déterminée par des gènes dominants aussi

appelés gènes R. Cinq de ces gènes ont été découverts à ce jour (R1 à R5) (Sharma et

al., 2009), ils déclenchent chez la plante une réaction d’hypersensibilité en présence

du parasite, ce qui limite l’extension du parasite aux tissus voisins. Cette voie de

résistance permet un retard du début de l’épidémie jusqu’à ce que la plante se trouve

en présence d’une race de fusariose possédant les gènes de virulence qui

correspondent à ses propres gènes d’hypersensibilité et peut alors se retrouver

rapidement détruite (Jimenez-Casco et al., 2004; Flor, 1971).

La résistance partielle est déterminée par un grand nombre de gènes.

Ce type de résistance va agir sur la pénétration, la dissémination du champignon dans

les tissus ou encore l’intensité de la sporulation. Cette complexité d’intervention rend

difficile les études sur ce type de résistance, mais la faible probabilité de son

contournement par le parasite en fait un support intéressant de recherche génétique

(Madrid et al., 2008).

4.3.2.2. Méthode de défense naturelle

La découverte de molécules secrétées par les micro-organismes ou présentes

dans leurs surfaces cellulaires appelées « éliciteurs », capables d’induire l’ensemble

des réactions de défense des plantes, a permis d’approfondir leur étude. Les gènes de

défense correspondants ont été isolés, ce qui a conduit à montrer que leur expression

est précocement stimulée lors de l’incompatibilité, alors qu’elle est beaucoup plus


48

tardive en situation compatible c’est-à- dire lorsque les plantes sont sensibles (Adam,

2008).

L’acide salicylique et l’éthylène stimulent également la défense des plantes

(Chérif et al., 2007). Selon des voies dont l’importance relative reste à évaluer. L’état

actuel des connaissances permet d’apprécier la puissance et la diversité des

mécanismes d’adaptation des plantes aux agressions causées par les micro-organismes

pathogènes. Les gènes de résistances et de défense sont autant de cibles pour la

conception rationnelle de nouvelles approches de lutte contre les maladies parasitaires

(Adam, 2008).

4.3.2.3. Résistance induite

L’induction des mécanismes de défense chez le pois chiche par une

application des inducteurs biologiques est une nouvelle stratégie de protection des

plantes. Des études ont indiqué l'augmentation de la résistance contre la fusariose

dans les semences traitées par les composés naturels (acide salicylique, spermine) et le

FOC avirulent du pois chiche (Chérif et al., 2007). Les composés phénoliques

contribuent à l’amélioration de la force mécanique de la paroi cellulaire de la plante

hôte du pois chiche et peut aussi inhiber la croissance du champignon, car les

phénoliques sont de nature toxique vis-à-vis des champignons (Raju et al., 2008).

Plusieurs études ont révélé que la résistance induite à travers l’accumulation de

composés phénoliques et de phytoaléxines, ainsi que l’activation des peroxydases, des

polyphénol oxydases et des enzymes clés des voies des phénylpropanoides et des

isoflavonoides, peut jouer un rôle crucial dans la lutte biologique et la résistance du

pois chiche vis-à-vis des attaques pathogéniques (Chérif et al., 2007).

4.3.2.4. Utilisation des espèces sauvages de Cicer

42 espèces sauvages de Cicer rapportaient par (Van Der Maesan, 1987),

présentent des niveaux élevés de la résistance au flétrissement (Singh et al., 1998).

Ces espèces de Cicer ont montré également une multiple résistance aux stress biotique

et abiotique (Singh, 1990) (Tableau 11).


49

Tableau 10. Résistance multiple chez Cicer sp. (Singh, 1990).

Winter et al., (2000) ont rapporté l'utilité des espèces sauvages dans la

localisation des gènes de résistance au flétrissement vasculaire, après avoir hybridé C.

arietinum x C. reticulatum. Une autre utilité est d'obtenir des hybrides résistants au

flétrissement (Singh et Ocampo, 1997), à coté de l'utilisation des espèces sauvages

d'autres chercheurs s'intéressent de l'amélioration de la résistance en utilisant des

hybridations entre les variétés de C. arietinum (Sudupak, 2004; Winter et al., 2000;

Singh et Ocampo, 1997).

Tableau 11. Principales espèces de Cicer utilisées dans les programmes d'amélioration de la

résistance du pois chiche contre le flétrissement vasculaire

Espèces Références

C. arietinum (Rao et al., 2007; Sethy et al., 2006; Sudupak, 2004; Iruela et al., 2002;

Winter et al., 2000; Singh et al., 1998; Singh et Ocampo, 1997;

Ladizinsky, 1975).

C. bijugum RECH (Van Der Maesan et al., 2007; Sethy et al., 2006; Sudupak, 2004;

Iruela et al., 2002; Singh et al., 1998).

C. chorassanicum (Bunge)

M popov

(Sethy et al., 2006; Singh et al., 1998; Tayyar et Waines, 1996).

C. cuneatum HOCHST ex.

Rich

(Berger et al., 2003; Sethy et al., 2006; Iruela et al., 2002; Singh et al.,

1998).

C. echinospermum DAVIS (Sethy et al., 2006; Sudupak., 2004; Berger et al., 2003; Iruela et al.,

2002; Singh et al., 1998; Singh et Ocampo, 1997).

C. judaicum BOISS (Sethy et al., 2006; Sudupak., 2004; Iruela et al., 2002; Singh et al.,

1998; Tayyar et Waines, 1996; Ladizinsky, 1975).

C. pinnatifidum JAUB et

SPACH

(Sethy et al., 2006; Sudupak., 2004; Iruela et al., 2002; Singh et al.,

1998; Tayyar et Waines, 1996).

C. reticulatum LADIZ (Rao et al., 2007; Sethy et al., 2006; Sudupak, 2004; Iruela et al.,

2002; Winter et al., 2000; Singh et al., 1998; Singh et Ocampo, 1997;

Ladizinsky, 1975).

C. yamashitae KIT (Sethy et al., 2006; Berger et al., 2003; Iruela et al., 2002; Singh et al.,

1998).

C. anatolicum (Sudupak, 2004; Iruela et al., 2002; Choumane et al., 2000; Kazan et

Cicer sp. anthracnose flétrissement Nématode cyst Froid

C. bijugum R R R R

C. echinospermum S R S R

C. judaicum S R S S

C. reticulatum S R S R

C. pinnatifidum S NI R R


50

Muehlbauer, 1991).

C. incisum K. Maly Sudupak, 2004.

C. Multijugum Iruela et al., 2002.

C. macracanthum Iruela et al., 2002.

C. microphylum Iruela et al., 2002.

C. canariense Iruela et al., 2002.

C. oxydon Iruela et al., 2002.

4.4. La lutte intégrée

Selon Singh et al., (1993), le traitement des grains du pois chiche par une

suspension sporale d'un agent de lutte biologique Gliocladium virens et Foltaf à 2g/Kg

réduit considérablement le flétrissement vasculaire. D’autres auteurs, comme

Mukhopadhyay et al., (1992) ont proposé la Carboxine avec le même agent de lutte

biologique. La solarisation des sols pendant 6 semaines combinée avec l'inoculation

des mycorrhizes (Glomus fasciculatum) suivi d’un traitement avec du Carbosulfan

peuvent réduire le flétrissement du pois chiche (Mukerji et al., 2009). Enfin, d’autres

travaux ont montré que l'application de T. harizianum avec des traitements fongicides

(Vitavax et Ziram) sur des graines, réduit l'incidence de la fusariose (Kaur et

Mukhopadhyay, 1992).

4.5. Application du phénomène d’antagonisme et ses limites

La description des nombreux mécanismes d’antagonismes existant dans la nature

permet d’envisager des applications pratiques dans le cadre de la lutte biologique.

Cependant, il faut bien constater que l’application dirigée des antagonistes ne soit que

de très loin les résultats de la recherche car, pour passer de la démonstration de

l’existence d’antagonisme au laboratoire ou dans une parcelle expérimentale à

l’emploi à grande échelle en lutte biologique, l’antagoniste doit posséder certaines

propriétés.

Aptitude à la colonisation de la rhizosphère et à la conservation dans les sols

(Dubey et al., 2007).

Propriété technologique: multiplication de l’antagoniste, formulation simple à

l’emploi (Hjeljord et al., 2000; Collin et Jacobsen, 2003).


51

propriété toxicologique: indemne de pathogénie pour l’homme, les animaux et

les végétaux traités, pas de risque lors de la fabrication (Ploetz et al., 2003).

propriété agronomique: l’apport doit pouvoir s’inscrire dans un itinéraire

technique souvent les meilleures stratégies visant à associer la lutte

biologique à une lutte chimique ou à une amélioration des plantes.

problème économique et psychologique: pas de perturbation importante de

l’organisation de la production, protection moins complète que la lutte

chimique d’où utilisation dans les cas où aucun moyen chimique n'existe.

30

Chapitre 2: Matériel et Méthodes

Matériel et méthodes

45

1. Caractérisation des symptômes de la fusariose et identification de l'agent

causal (FOC)

1.1. Les prospections

Les prospections ont été effectuées afin de caractériser les symptômes de la

fusariose du pois chiche au champ et déterminer l’importance de la maladie dans les

trois régions de culture du pois chiche. Il s’agit des régions de Mostaganem, Tlemcen

et Ain Témouchent. Les plantes présentant les symptômes de la maladie sont

prélevées pour être analysé au laboratoire. Le matériel fongique utilisé provient des

échantillons de plantes infectées, récoltées durant la campagne 2008-2009 entre les

mois de mai et juin (Stade post-floraison et formation de gousses). Les

caractéristiques des parcelles de la culture et les dates de prospections sont indiquées

dans le tableau 14. Ces régions ont été choisies en raison de l’importance des

superficies cultivées du pois chiche. Ces prospections avaient comme objectif:

Localiser les foyers du flétrissement du pois chiche.

Evaluer l’importance de la maladie et identifier les espèces responsables

ensuite évaluer la fréquence de leur répartition.

Confirmer l’identité de l’agent causal responsable de la fusariose

vasculaire de pois chiche sur la base des symptômes de la maladie et des

caractéristiques morphologiques des souches isolées à partir des

échantillons infectés.

Tableau 12. Températures en °C et pluviométries en mm mensuelles des chefs-lieux des

wilayas d’étude en 2009

Mois Tlemcen Ain Témouchent Mostaganem

T° min T° max T° moy Pluv. T° min T° max T° moy Pluv. T° min T° max T° moy Pluv.

Fév. 5.8 16.5 11.15 37 9.9 16.4 13.15 13 5.8 17 11.4 15

Mars 8.5 19.1 13.8 24 11.6 17.8 14.7 34 9.2 19.3 14.25 36

Avr. 8.1 21.6 9.9 42 12.9 20.2 16.55 35 9.6 19.5 14.55 48

Mai 12.7 26.9 19.8 6 16.4 23.8 20.1 5 14.1 26.4 20.25 20

Juin 16.7 31.2 23.95 2 20.1 27.7 23.9 00 17.6 29.3 23.45 1

T° min: Température minimale; T° max: Température maximale; Pluv. : Pluviométri

1.2. Estimation de l’incidence et de la gravité de la maladie au champ


46

Pendant la compagne agricole 2008/2009 et lors de chaque prospection,

l’incidence et la gravité de la maladie ont été évaluées selon le protocole utilisé par

Trapero-Casas, (1983).

L’incidence de la maladie nécessite uniquement le comptage du nombre

d’unités malades qui peut être exprimé par un pourcentage du nombre total d’unités.

Pour l’évaluation de l’incidence du flétrissement, nous nous sommes basés sur le

protocole adopté par Trapero-Casas, (1983). Ce protocole est le suivant: au niveau de

chaque parcelle, trois rangées d’environ 10 mètres de long chacune, ont été choisies

arbitrairement, les plantes de chaque rangée ont été examinées et le nombre de plantes

présentant des symptômes du flétrissement vasculaire a été relevé. L’incidence de la

maladie (IC) a été ensuite exprimée par le pourcentage de plantes infectées, comptées

dans les trois rangées par rapport au nombre total de plantes qui varie suivant

l’espacement entre les plantes adoptées par l’agriculteur (80 à 130 plantes par rangée).

L’estimation de cet indice a été évaluée selon l’échelle ci-dessous (Trapero-

Casas, 1983): 0 (nulle), 0.1 à 5% (peu élevée), 5.1 à 20% (moyennement élevée), 20.1

à 50% (élevée), > 50% (très élevée).

Tableau 13. Parcelles prospectées des 03 régions choisies: Tlemcen, Ain Témouchent et Mostaganem

Régions N° de la

parcelle

Sites

prospectées

Stade végétatif Date de

prospection

Mostaganem P1 Sidi Lakhdar Floraison 24 Mai 2009

P2 Ouled Bouziane Remplissage des gousses

P3 Zerefa Post floraison

Ain

Témouchent

P1 Terga Remplissage des gousses 02 juin 2009

P2 Ain el Tolba Remplissage des gousses

P3 Ain el Kihel Remplissage des gousses

P4 Ain el Kihel Remplissage des gousses

Tlemcen P1 Remchi Remplissage des gousses

P2 Hennaya Remplissage des gousses

P3 Hennaya Remplissage des gousses

P4 Sabaa chioukh Remplissage des gousses

La gravité de la maladie a été estimée en se basant sur l’évaluation visuelle de

la proportion des parties de la plante atteinte par le flétrissement ou le jaunissement.

Sur une superficie de 03 rangées, les plantes affectées ont été examinées et un indice

IC (%) = Nombre de plantes malades/nombre total de plantes x 100


47

de gravité leur a été attribué en fonction de l’importance des symptômes (Trapero-

Casas, 1983):

0: pas de symptômes, 1: jaunissement ou flétrissement du 1/3 de la plante,

2 : même symptômes mais affectant les 2/3 de la plante, 3: symptômes identiques affectant la

plante entière, 4: plante morte.

1.3. Obtention du matériel fongique

Le matériel fongique utilisé provient des échantillons de plantes infectées

présentant des symptômes caractéristiques de la maladie. Il s’agit d’échantillons de

tiges, du collet et de racines. Au niveau de chaque site prospecté, les différents

symptômes sont décrits ainsi que le stade végétatif. A partir de chaque champ, 10

plants malades âgés de 4 mois environ ont été entièrement arrachées puis mise dans

des sachets en plastique afin d’être analysés au laboratoire.

1.3.1. Isolement de l’agent causal

La technique d’isolement utilisée est celle décrite par Rapilly, (1968). Elle

consiste à préparer des petits fragments de tiges et de racines d’environ 0,6 cm. Les

fragments sont ensuite soigneusement désinfectés soit à l’aide d’hypochlorite de

Figure 8. Localisation des sites de prélèvement des isolats de FOC


48

sodium à 8%, soit à l’aide d’alcool à 95% pendant 03 minutes. Ils sont ensuite rincés

trois fois dans trois bains d’eau distillée stérile.

Après séchage entre deux papiers filtres stériles, les fragments de tiges, de

racines et des collets sont déposés dans des boites de Petri contenant du milieu PDA

gélosé (annexe 1) à raison de 6 fragments par boite. Les boites sont ensuite incubées à

l’obscurité et à 28 °C pendant 5 à 6 jours.

1.3.2. Purification et conservation de l’agent pathogène

Les champignons isolés sont fréquemment contaminés par des germes

bactériens ou des espèces fongiques indésirables. Pour éviter les risques de

contamination, des repiquages successifs de manière aseptique sont effectués par

prélèvement des explants choisis au niveau de la zone périphérique des thalles

correspondants à l’espèce Fusarium oxysporum. Selon plusieurs auteurs, le genre

Fusarium oxysporum se distingue nettement des autres champignons par la production

des microconidies et des macroconidies, structures caractéristiques de ce champignon.

Après purification et obtention des cultures monospores, les isolats obtenus et

identifiés selon leur aspect macroscopique et microscopique sont conservés à 4°C

dans des tubes à essai contenant du milieu PDA incliné, afin de constituer une

collection d'isolats qui devrait servir aux études ultérieures.

Préparation des cultures monospores

Le principe de cette méthode est d’obtenir des souches génétiquement

homogènes, afin d’éviter toute variation possible des souches. Selon Booth, (1971),

les cultures monospores sont obtenues de la manière suivante: une suspension de

microconidies est diluée dans de l'eau distillée stérile, de façon à obtenir une faible

concentration environ (100 microconidies / ml).

Cette concentration est ajustée à l’aide de la cellule de Malassez. Une goutte

de la suspension est déposée à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, puis étalée en stries

à l’aide d’une anse à la surface d'une couche fine d'eau gélosée en boite de Petri.

Après 24h d'incubation à l'obscurité et à 25°C, les tubes germinatifs issus d'une

microconidie unique sont d'abord repérés au fort grossissement de la loupe


49

binoculaire, puis prélevés stérilement et déposés séparément sur milieu PDA en boite

de Petri. Pour chaque souche, 10 jeunes thalles issus chacun d’une seule conidie sont

repiqués.

Le comportement de chaque thalle issu de la germination des microconidies

est observé (croissance, aspect du mycélium et pigmentation). Si tous les thalles

présentent des caractères morphologiques identiques entre eux et à ceux de la culture

mère, un seul est choisi pour constituer le clone représentatif de l'isolat de départ.

En revanche, si différents types morphologiques apparaissent dans les clones

issus d'un même isolat, ils sont tous conservés comme tête de clone, chacun étant

représentatif d'une morphologie donnée et d'une éventuelle diversité génétique de la

souche de départ.

Tableau 14 .Répartition des isolats de FOC isolés à partir de tiges du pois chiche présentant les

symptômes du flétrissement vasculaire

1.4. Détermination de la forme spéciale ciceri

Le matériel végétal nécessaire à l’expérimentation nous a été aimablement

fourni par l'ITGC de Saida (Institut Technologique des Grandes Cultures). Dans le but

de confirmer la forme spéciale ciceri de 17 isolats de Fusarium oxysporum, isolées

des segments de la tige du pois chiche, ces isolats ont été testés sur la variété (ILC-

482) reconnue pour sa sensibilité au flétrissement (Harrabi et al., 1985).

1.4.1. Préparation du matériel fongique (l’inoculum)

Pour obtenir un mode d’inoculation qui puisse être valable, nous avons

employé une technique couramment utilisée pour tester les champignons du sol

(Rouhani, 1978). Pour cela, nous avons préparé l’inoculum constitué par 17 isolats de

F. oxysporum ciceri provenant chacun d’une région d’étude. Les isolats ont été

ensemencés chacun dans des boîtes de Petri contenant 15 ml de milieu PDA. Les

Régions Isolats

Tlemcen FOC1- FOC2- FOC3- FOC4- FOC5 -FOC6- FOC7- FOC8- FOC9- FOC10

Mostaganem FOC11- FOC12- FOC13- FOC14

Ain Témouchent FOC15- FOC16- FOC17


50

boites sont mises à incuber à 25°C pendant une semaine. Au bout de 08 jours, les

champignons ayant suffisamment poussé pour envahir toute la boîte.

L'inoculum est préparé de la manière suivante: le contenu de la boite de Petri

est mis en suspension dans de l’eau stérile, le tout étant ensuite bien agité. L’inoculum

est obtenu par lavage de la surface de culture avec de l’eau distillée stérile. Cette

suspension est recueillie, et la concentration de l’inoculum est ajustée à 106 spores par

millilitre après comptage à l’aide de la cellule de Malassez. L’inoculum est prêt à être

utilisé. D’après certains auteurs (Sharma et Muehlbauer, 2007; Westerlund et al.,

1974), cette concentration est suffisante pour reproduire les mêmes symptômes

observés au champ.

1.4.2. Préparation du matériel végétal

Les graines de la variété du pois chiche ILC-482 sont tout d’abord

désinfectées à l’aide d’une solution d’hypochloride de sodium à 12% pendant 2 à 3

minutes afin d’éliminer toutes traces d’infections superficielles préexistantes. Les

graines sont ensuite mises à germé pendant 4 à 5 jours à 25°C dans des boites de Petri

stériles sur papier filtre humidifié avec de l’eau stérile. Après germination, les graines

sont placées dans des petits pots en matière plastique, percés de quelques trous, afin

d’éviter des engorgements lors des arrosages. Ces pots ont un volume d’environ 100

ml et contenant du terreau. Ces pots sont espacés de 5cm environ, et sont laissées en

chambre de culture pendant 08 jours (température: 24 à 26°C, humidité relative: 90

%, photopériode: 12 heures). Les plantules sont arrosées 2 à 3 fois par semaine. Au

bout 8 jours, les jeunes plantules atteignant le stade de deux feuilles.

Ces jeunes plantules ont été soigneusement prélevées, leurs racines sont

ensuite délicatement sectionnées puis inoculées par une suspension sporale des 17

isolats de FOC. Ce test nous a servi comme test d'identification de la forme spéciale

ciceri.

1.4.3. Technique d’inoculation des plantules du pois de chiche

Les plantules du pois chiche, âgées de 8 jours sont inoculées par trempage des

racines dans une suspension conidienne (106

spores/ml) (El-Aoufir, 2001; Trapero-


51

Casas, 1983; Westerlund et al., 1974; Erwin, 1958). Les plantules sont délicatement

arrachées, leurs racines sont nettoyées par lavage à l’eau stérile et sectionnées puis

trempées pendant 30 minutes dans une suspension conidienne de FOC. Les plantules

témoins sont traitées de la même manière à l’exception qu’elles sont trempées dans de

l’eau stérile. Après inoculation, les plantules sont repiquées dans les mêmes pots à

raison de 3 par pot. Les pots sont placés dans une serre (environ 25°C et 90 %

d’humidité relative). Un arrosage régulier est effectué par la suite en veillant à ce que

de l’eau soit toujours présente dans la soucoupe. Les expérimentations en petits pots

offrent l’avantage d’être facilement manipulables.

1.4.4. Notation des symptômes

Les plantes inoculées correspondant à la variété ILC-482 ont été examinées au

bout de 40 jours. La sensibilité des plantules du pois chiche est appréciée par des

notations effectuées en cours de la végétation. L’efficacité est mesurée par des

comptages de plantes atteintes. L’étude est complétée par une observation de

noircissements des vaisseaux du xylème, après une coupe longitudinale de la tige. Ces

noircissements témoignent de la réaction de la plante à l’infection du champignon.

1.5. Caractérisation morphologique de l’agent pathogène

1.5.1. Caractérisation culturale et description des différents morphotypes

Après obtention d’une culture pure de l’agent causal, l’identification a été

réalisée par une étude macroscopique et microscopique (Rapilly, 1968), en se référant

à la clé d’identification des champignons (Peres, 1985).

Les cultures de 17 isolats pris de la collection sont effectuées sur milieu PDA.

Ce milieu est communément utilisé pour caractériser les Fusarium (Liddell et

Burgess, 1983; Tousson et Nelson, 1976). Pour chaque isolat, l'ensemencement a été

effectué au moyen d'un disque de 0.8 cm de diamètre prélevé aseptiquement à l’aide

d’un emporte-pièce stérile à partir d’une culture de FOC. Après une semaine

d’incubation à 25°C, l’étude macroscopique est basée sur les caractères suivants:

aspect de la colonie, couleur et pigmentation, développement du mycélium. La

variabilité de la morphologie est appréciée entre divers isolats obtenus. Les différents


52

morphotypes obtenus de l’agent causal sont ensemencés en déposant un fragment

mycélien dans des tubes à essai ou en boite de Petri sur milieu PDA. Après 5 jours

d’incubation à 25°C, les colonies sont photographiées. Ces cultures ont permis de

décrire les différents types morphologiques rencontrés chez F. pxysporum f. sp. ciceri.

L’étude microscopique a été basée sur l’aspect du mycélium coloré au bleu de

cotton, la forme et la taille des conidiophores, des phialides et enfin, les types de

conidies et leur position sur les conidiophores (Leslie et Summerell, 2006).

L’identification du genre Fusarium ne pose aucun problème, car il se distingue

nettement des autres champignons par ses macroconidies fusiformes, pointues aux

deux extrémités avec des cellules basales en forme de pied (Booth, 1971).

L’identification de l’espèce a été effectuée selon des clés de détermination établies par

Messiaen, (1959).

1.5.2. Etude biométrique des conidies

La caractérisation des 17 isolats retenus pour cette étude a été également

effectuée par une étude biométrique basée sur la mensuration des spores après 6 à 10

jours de culture. L’examen direct au microscope photonique mené d'un micromètre

permet donc d’effectuer ses mensurations (longueur et largeur) des macroconidies,

microconidies et la présence ou l'absence des chlamydospores.

En général, les observations microscopiques ont porté sur 40 conidies

(microconidies et macroconidies) par isolat. Toutes les observations ont été effectuées

au grossissement x100. Des observations microscopiques complémentaires sur le type

de conidies, la forme et le nombre de cloison ainsi que l’absence ou la présence des

chlamydospores permettent une meilleure caractérisation des isolats.

1.6. Etude physiologique des isolats de FOC

1.6.1 Recherches des conditions optimales de croissance mycélienne des isolats

1.6.1.1. Estimation de la croissance de FOC

La technique utilisée est celle décrite par (Kherbanda et Brewer, 1980;

Leach, 1962; Brewer, 1960). La mesure de la croissance mycélienne du champignon


53

consiste à ensemencer un explant d’environ 08 mm de diamètre du champignon sur

milieu PDA. La croissance mycélienne a été évaluée tous les deux jours par la mesure

de deux diamètres perpendiculaires de chaque colonie pendant 8 jours.

La croissance (moyenne de toutes les valeurs) a été ensuite déduite par

soustraction du diamètre de l’explant initial à partir des valeurs relevées, ainsi la

croissance mycélienne est déterminée selon la formule suivante:

L: croissance mycélienne ; D: diamètre de la colonie ; d: diamètre de l'explant.

1.6. 1.2. Effet de l’obscurité et la lumière sur le FOC

Pour l’étude de l’effet de la lumière et de l’obscurité sur la croissance, les

17 isolats ont été cultivés sur milieu PDA (pH= 5.6) pendant 8 jours, sous les deux

conditions suivantes:

A l’obscurité et à la température de 25°C.

Sous une lumière continue et à la température de 25°C.

1.6.1.3. Effet de la température

La détermination de la température optimale de la croissance mycélienne

de 17 isolats de FOC a été étudiée sur une gamme allant de 10 à 35°C, avec un

intervalle de 5°C. Pour cette expérience, nous avons utilisé le milieu PDA ajusté à un

pH= 5.6. L'incubation est réalisée à l'obscurité. La croissance mycélienne a été

évaluée tous les deux jours par la mesure de deux diamètres perpendiculaires de

chaque colonie pendant 8 jours.

1.6.1.4. Effet du pH

Dans le but d’apprécier l’action du pH sur la croissance mycélienne de 17

isolats de FOC, nous avons utilisé comme milieu de culture le PDA avec une gamme

du pH tamponnée afin d'éviter toute variation lors de la dégradation des éléments

nutritifs par le champignon. La gamme du pH choisie se situe entre 4.5 et 7.5. Les

tampons ont été préparés selon la méthode de Geigy, (1990). Pour réaliser ce test,

L= (D-d) /2


54

nous avons utilisé le milieu PDA en lui ajoutant des tampons décrits dans le tableau

en annexe 2. Chaque pH obtenu est contrôlé à l’aide d’un pH mètre pour une

éventuelle correction. Après autoclavage, les milieux de culture tamponnés sont

coulés dans des boites de Petri puis ensemencés à l’aide d’un explant mycélien de 8

mm de diamètre, déposé au centre des boites. Les boites sont incubées à 25°C et à

l’obscurité. L’action du pH est évaluée selon la méthode précédemment citée.

1.6.2. Influence des facteurs nutritionnels sur la croissance mycélienne de FOC

Les champignons ont besoin pour assurer leur croissance de composés

organiques notamment des sources carbonées comme source d’énergie et des sources

azotées pour la synthèse des protéines.

Afin de rechercher les sources de carbone et d’azote donnant la meilleure croissance

de FOC, nous avons étudié tout d’abord l’effet de quelques milieux de culture sur la

croissance mycélienne. Nous avons ensuite évalué l’action de quelques sources de

carbone et d’azote.

1.6.2.1. Effet des milieux de culture

Pour toutes les espèces fongiques, le choix d’un milieu de culture dépend

des exigences nutritionnelles du champignon (Bouznad, 1989). Ainsi pour toutes les

espèces de Fusarium spp. le problème se pose différemment puisqu’elles peuvent se

développer sur une large gamme de milieux de cultures qui peuvent être organiques,

minéraux ou semi organiques. Dans cette étude, un certain nombre de milieux de

culture communément utilisés en phytopathologie ont été étudiés:

03 milieux organiques: Malt, PDA, Pois chiche.

02 milieux minéraux: Richard et Czapeck.

02 milieux semi organiques: Sach et Waksman.

La composition respective de chacun de ces milieux est présentées en

annexe1, les cultures de FOC (sous forme d’un explant de 8 mm de diamètre) sont

ensemencées sur les différents milieux de culture puis incubées à 25°C et à l’obscurité


55

pendant 8 jours. La croissance mycélienne a été évaluée tous les deux jours par la

mesure de deux diamètres perpendiculaires de chaque colonie.

1.6.2.2. Influence de la source de carbone sur la croissance de FOC

Dans le but d’apprécier l’influence de la source de carbone sur la

croissance mycélienne de 17 isolats de FOC, nous avons utilisé comme milieu de

culture du Czapeck dox en modifiant la source de carbone pour chaque test. 03

sources de carbone ont été utilisées: Saccharose, glucose et galactose. Les cultures de

FOC ensemencées sur différentes sources de carbone ont été incubées à une

température de 25°C et à l’obscurité, pendant 8 jours. La croissance mycélienne a été

évaluée tous les deux jours par la mesure de deux diamètres perpendiculaires de

chaque colonie.

1.6.2.3. Influence de la source d'azote sur la croissance de FOC

Dans le but d’apprécier l’influence de la source d’azote sur la croissance

mycélienne des 17 isolats de FOC, nous avons utilisé le milieu Czapeck dox en

modifiant la source d'azote pour chaque test. 03 sources d'azote ont été utilisées:

KNO3, Peptone et NaNO3. Les cultures de FOC ensemencées sous forme d’un explant

de 08 mm de diamètre sur les différentes sources d’azote ont été ensuite incubées à

une température de 25°C et à l’obscurité, pendant 8 jours. La croissance mycélienne a

été évaluée tous les deux jours par la mesure de deux diamètres perpendiculaires de

chaque colonie.

1.7. Répétition et traitement statistique

03 répétitions sont retenues pour chaque paramètre étudié. L'analyse de la

variance des mensurations des isolats et l'étude physiologique de FOC a été réalisée à

l'aide du test de Newman et Keuls à 5 %. La méthode de Newman et Keuls est basée

sur la comparaison des amplitudes observées pour les groupes de deux, trois, ect…,p,

avec l'amplitude maximale attendue à un niveau de signification donnée (Newman,

1939; Keuls, 1952).


56

2. Recherches de moyens de lutte biologique

2.1. Obtention des bactéries actinomycétales

2.1.1. Prélèvement des échantillons du sol

Les prélèvements du sol ont été effectués en mars 2009, dans deux régions du

sud Algérien: Béchar et Timimoune. Les prélèvements ont été effectués à l’aide d’une

spatule stérile sur une profondeur de 5 à 10 cm. Le sol ainsi récolté est mis dans des

sachets en plastiques. Chaque échantillon est muni d’une étiquette indiquant la date, le

lieu et la profondeur. Les échantillons du sol ont été ensuite acheminés vers le

laboratoire où ils ont été séchés puis tamisés afin de procéder à leur analyse

microbiologique. Le tableau 15 présente les régions et les sites de prélèvement.

Tableau 15. Sites d'échantillonnage des sols pour l'isolement des actinomycètes

Régions Sites de prélèvement Nombre

d'échantillons

Béchar Wakda (à 2km de Béchar) 2

Knadssa (à 22 Km de Béchar) 5

Béni Abbés 1

Timimoune Kali 1

Massine 1

2.1.2. Isolement, purification et conservation des actinomycètes

2.1.2.1. Isolement

Après séchage des échantillons du sol, 50g ont été tamisés pour éliminer les

débris végétaux indésirables. Les échantillons ont été ensuite broyés dans un mortier

stérile. Après homogénéisation, 5g de chaque échantillon sont pesés puis introduits

dans un erlenmeyer contenant 50ml d’eau distillée stérile. Après agitation de la

solution pendant 10 min, une série de dilution allant de 10-1

à 10-4

a été préparée, en

prélevant à chaque opération 1 ml. Ainsi, les deux dernières dilutions (10-3

et 10-4

) ont

servit pour l’isolement des actinomycètes sur milieu ISP2. Pour réaliser cette

opération, nous avons utilisé deux méthodes d'ensemencement: en masse et en

surface.


57

Ensemencement en masse: Cette méthode consiste à déposer tout d’abord 0.1 ml de la

dilution 10-3

ou 10-4

dans une boite de Petri, puis coulé environ 15 ml de milieu ISP2

en surfusion. Les boites sont agitées par un mouvement circulaire lent, afin

d’homogénéiser le contenu des boites. Les boites sont ensuite incubées pendant 07

jours à 30°C.

Ensemencement en surface : Cette méthode consiste à déposer 0.1 ml de chaque

échantillon correspondant soit à la dilution 10-3

ou 10-4

à la surface du milieu de

culture ISP2 gélosé, puis étalé à l’aide d’un étaloir stérile. Les boites sont incubées

pendant 7 jours à 30°C.

2.1.2.2. Purification des isolats d’actinomycètes

Après une semaine d’incubation, les colonies d’actinomycètes apparues et

observées à l’aide d’un microscope photonique sont repérées d’après leur aspect

macroscopique et microscopique caractéristique. Ces colonies sont en générale des

colonies ronde parfois bombées présentant souvent des traits circulaires

concentriques, difficile à les prélever, présentant différentes couleurs, avec une odeur

caractéristique: la géosmine (odeur de la terre fraichement remuée). Enfin, en général,

toute colonie présentant des filaments courts autour d’elle est retenue, puis purifiée

sur milieu ISP2. Les colonies suspectées d’être des actinomycètes sont reprises

séparément sur boite de Petri contenant le même milieu de culture, elles sont ensuite

purifiées par repiquages en strie. L’étude macroscopique et microscopique a permis

de révéler plusieurs morphotypes d’actinomycètes.

2.1.2.3. Conservation des isolats d’actinomycètes

Après isolement et purification des actinomycètes sur milieu ISP2. Ces

dernières sont ensemencées dans des tubes contenant du milieu GLM incliné

(annexe1). Les tubes sont ensuite incubés pendant une semaine à 30°C puis conservés

à 4°C. Les souches d’actinomycètes sont repiquées régulièrement (tous les 03 mois).

2.2. Etude du phénomène d’antagonisme : F. oxysporum – actinomycètes in vitro

Le choix d’actinomycètes comme agent de lutte biologique contre la fusariose

du pois chiche est basé essentiellement sur deux arguments:


58

Leur adaptation écologique aux sols des régions arides ou semi-arides leur

attribuant une forte compétitivité.

Leur aptitude bien connue à produire des antibiotiques à large spectre d’action.

L’utilisation des souches d’actinomycètes comme agent de lutte biologique

contre les champignons phytopathogènes du sol, constitue une première étape, elle

permet d’apprécier l’aptitude de ces micro-organismes à inhiber ou à réduire la

croissance de FOC. Pour évaluer l’action antagoniste des isolats d’actinomycètes,

deux méthodes ont été choisies: méthode de confrontation directe et action des

métabolites secondaires.

2.2.1. Méthode de confrontation directe

Le but de cette méthode est de sélectionner des souches d’actinomycètes

capables d’inhiber ou de réduire la croissance mycélienne de 03 isolats de Fusarium

oxysporum ciceri, représentative de chaque région (Tlemcen, Ain Temouchent et

Mostaganem). Ce test est un critère de sélection important, il a été effectué in vitro,

par confrontation directe.

Dans des boites de Petri stériles contenant du milieu PDA (annexe1), un

explant de 8mm de diamètre d’une culture de F. oxysporum f .sp ciceri âgée de 7

jours est déposé, la souche d’actinomycète est ensuite ensemencée à l’aide d’un

écouvillon stérile sous forme d’un trait en tenant compte d’une distance d’environ

2.5cm entre les deux protagonistes.

Les boites sont ensuite incubées à 30 °C, la zone d’inhibition est mesurée

après 8 jours d’incubation. L’évaluation de l’inhibition exercée par les 03 souches

d'actinomycètes présélectionnées est estimée par le calcul du pourcentage d’inhibition

de la croissance mycélienne selon la formule de Wang et al., (2001).

Pourcentage d'inhibition= Diamètre de témoin – Diamètre de l'isolat testé/ Diamètre de témoin


59

2.2.2. Mise en évidence de l’action des métabolites d’actinomycètes

Cet essai, permet de mettre en évidence le pouvoir inhibiteur des filtrats de

culture des souches d’actinomycètes en inhibant ou en réduisant la croissance

mycélienne de FOC.

2.2.2.1. Test de filtrat de culture: Le but de ce test est de sélectionner les souches

dont les métabolites sécrétés sont les moins favorables à la croissance mycélienne de

FOC.

2.2.2.1.1. Préparation des filtrats de culture d’actinomycètes

Cette méthode consiste à ensemencer les souches d’actinomycètes

présélectionnées suite à la méthode de confrontation directe dans des erlenmeyers

contenant 50ml de milieu ISP2 liquide (annexe1). Les erlenmeyers sont incubés à

30°C. Après 8 jours d’incubation, 25 ml a été prélevés puis centrifugées pendant

10min à 4000 t/mn. Le surnageant a été récupéré à l’aide d’une seringue stérile puis

filtré par passage sur un filtre millipore de 0.20µm de diamètre. Le surnageant obtenu

est utilisé pour ce test.

2.2.2.1.2. Incorporation des filtrats de culture d’actinomycètes au milieu

Dans des boites de Petri, les filtrats de culture stériles sont incorporés volume

à volume (V/V) à un milieu de culture gélosé PDA à double concentration d’agar-agar

maintenu en surfusion à 45°C. Après homogénéisation et refroidissement du milieu,

un explant de 08mm de diamètre est déposé au centre de la boite.

Une boite contenant de l’eau distillée stérile et le même milieu de culture sert

de témoin. Les boites sont incubées à température ambiante pendant 6 jours. Après

incubation, les diamètres des colonies de Fusarium oxysporum ciceri en présence des

filtrats de culture sont mesurés et comparés aux diamètres des colonies des boites

témoins.

2.2.2.2. Technique de puits

Dans des boites de Petri contenant du milieu PDA semi solide (0.7%), 04 puits

ont été creusés à l’aide d’une cloche de Durham stérile. Dans chaque puit, 100µl de


60

filtrat stérile sont ensuite déposés. Un disque de 8 mm du champignon de FOC est

déposé au centre de la boite.

Les boites sont tout d’abord incubées à une température ambiante pendant 30

minutes, puis transférées dans une étuve réglée à 25°C pendant 5 jours. Le même

protocole a été adopté pour les boites témoins à l’exception des filtrats de culture qui

ont été remplacés par de l’eau distillée stérile. L’action des filtrats de culture sur la

croissance mycélienne de FOC est mesurée. Les deux diamètres perpendiculaires ont

été mesurés et comparé par rapport au témoin.

2.2.2.3. Technique des disques de papier Wattman

2.2.2.3.1. Préparation des filtrats de culture d’actinomycètes

Cette méthode consiste à ensemencer la souche d’actinomycète ACT2

présélectionnées après le test de confrontation directe, dans des erlenmeyers

contenant 50ml de milieu ISP2 liquide (annexe1). Les erlenmeyers sont incubés à

30°C. Après 8 jours d’incubation à température de 30°C, le milieu ensemencé a été

filtré à travers un papier filtre ordinaire.

2.2.2.3.2. Extraction de la molécule antifongique

Le surnageant filtré à travers le filtre ordinaire a fait l'objet d'une extraction

liquide - liquide à l'aide d'une ampoule à décanter, en utilisant le même volume du

solvant n-butanol qui est le meilleur extractant selon, Zitouni et al., (2005).le

surnageant filtré de la culture a été ensuite mélangé avec le n-Butanol volume à

volume. Aprés décantation du mélange 02 phases apparaissent, une phase organique

correspond au solvant organique et la molécule bioactive et une phase aqueuse

correspond au filtrat du milieu de culture ISP2. La couche organique formée a été

évaporé à l'aide d'un rotavapeur de marque BUCHI R-200. L'extrait obtenu sert par la

suite à imbiber les disques du papier Wattman stériles.

2.2.2.3.3. Test de l'activité de l'extrait

Dans des boites de Petri, contenant environ 15 ml de milieu PDA maintenu en

surfusion, 100µl d’une suspension sporale de FOC ajusté à une concentration de 106


61

conidies/ml sont déposés. Les boites sont ensuite agitées par des mouvements lents.

Après homogénéisation, 03 disques imprégnés préalablement d'extrait de la souche

ACT2 ont été déposés à raison de 03 disques par boite de Petri. Les boites ont été

ensuite incubées pendant 5 jours à 25°C.

L’évaluation de l’action de l’extrait brut de la souche d’actinomycète a été

estimée par la mesure des deux diamètres perpendiculaires de la zone d’inhibition

autour des disques.

2.3. Identification des isolats d'actinomycètes antagonistes

Dans le but d’identifier les 06 souches d’actinomycète isolées des différents

échantillons du sol, ces dernières sont soumises à une étude des différents caractères

morphologiques.

2.3.1. Etude macroscopique

Les caractères morphologiques et culturaux sont déterminés sur 03 milieux de

culture: ISP2, gélose nutritive et milieu Sabouraud (Shirling et Gottlieb, 1966). Les

milieux sont coulés dans des boites de Petri 36h avant leur utilisation afin de contrôler

leur stérilité. Ils sont ensuite ensemencés en stries à partir d'une goutte de suspension

d’actinomycète déposée en bordure de la gélose. L'étude de l’aspect macroscopique

est basée essentiellement sur l'importance de la croissance, le développement du

mycélium aérien, la couleur du mycélium aérien et de substrat ainsi que la production

de mélanine sur chaque milieu est observée après 15 jours d'incubation à 30°C.

2.3.2. Etude microscopique

Après 2 semaines d’incubation à 30°C, les cultures des différentes souches

d'actinomycètes antagonistes retenues après sélection ont été observées sous

microscope optique au grossissement (x100). Pour caractériser l'aspect des

sporophores, une observation in situ a été effectuée sur la morphologie des chaînes de

spores, le mycélium aérien et le mycélium de substrat.


62

2.4. Essai d'extraction et de séparation de la molécule bioactive

2.4.1. Préparation des filtrats de culture d’actinomycètes

Cette méthode consiste à ensemencer 2 L de milieu ISP2 liquide avec la

souche d’actinomycète présélectionnée. Les erlenmeyers sont incubés à 30°C, sous

agitation. Après 8 jours d’incubation, les cultures ont été prélevées puis centrifugées

pendant 10 min à 4000t/mn. Le surnageant est filtré à travers un disque de papier

filtre.

2.4.2. Extraction liquide - liquide: l'extraction à été faite dans une ampoule à

décanter, en utilisant le n-butanol (Zitouni et al., 2005) volume à volume. La phase

organique a été récupérée puis séché à l'aide d'un rotavapeur de marque BUCHI R-

200.

2.4.3. Chromatographie sur couche mince (CCM): Nous avons utilisé des

bandelettes d'une plaque de CCM de (2cm X 20cm). Le dépôt de l'extrait a été

réalisé sous forme de spot placé à 1cm du bord inférieur de la bandelette et au centre.

20µl de l'extrait utilisé a été déposés progressivement à l'aide d'une pipette pasteur, la

plaque ensuite était séchée sous courant d'air chaud. Dans des cuves en verre

contenant 50ml de système éluant et saturé préalablement par la vapeur du système

éluant utilisé n-butanol/acide acétique/eau (3:1:1) pendant 2h. La plaque de CCM a

été ensuite déposée. Après 15 cm de distance parcourue par le solvant à partir du point

de départ la chromatographie est arrêtée. Le solvant est éliminé.

La visualisation des spots de la plaque CCM a été faite par le révélateur

anisaldehyde /acide sulfurique (Fourati-Ben Fguira et al., 2005) puis à l'aide d'une

ampoule à UV.

2.5. Essai de la lutte biologique in vivo

D’après la littérature, très peu de travaux ont été consacrés à cette maladie et

au moyen de lutte, ce qui explique en partie l’inexistence de mesures de lutte

phytosanitaires efficaces et adéquates contre les attaques de cet agent pathogène. Pour

cette raison nous nous sommes intéressés à l’étude du comportement de F. oxysporum

ciceri en présence d’un agent de lutte biologique connu par ces propriétés


63

antagonistes, il s’agit d’une espèce appartenant au groupe des actinomycètes. Le

choix de la souche d’actinomycète ACT2 qui a fait l’objet de cette étude est basé sur

les résultats des tests in vitro.

2.5.1. Préparation de l'inoculum

L'actinomycète ACT2 sélectionnée a été ensemencé sur milieu ISP2 puis

incubée à 30°C, pendant 14 jours. 15 ml d'eau distillée stérile a été verser sur la

surface des colonies de l'actinomycète et à l'aide d'un cure dent stérile, les spores de

celle-ci ont été grattées et récupérées dans un tube stérile puis, ajustées à la

concentration 106 spores/ml.

La préparation de l'inoculum de l'agent pathogène a été obtenue par la

méthode décrite précédemment pour la détermination de la forme spéciale ciceri en

utilisant 03 isolats de FOC pris de la collection, il s'agit du FOC8, FOC13 et FOC 15

représentatives des 03 régions d'étude.

2.5.2. Obtention des plantules du pois chiche

L'obtention des plantules du pois chiche a été réalisée par la méthode décrite

prédemment pour la détermination de la forme spéciale ciceri. 03 variétés du pois

chiche ont été testées, une sensible (ILC-482) et les deux autres sont modérément

tolérantes (Col-27 et PPC-25). Au bout de 8 jours, les plantules arrivées au stade de

deux feuilles ont été inoculées par la suspension sporale de la souche d'actinomycète

ACT2, après 24h la suspension sporale de 03 isolats de FOC à été inoculés. Des

plantules non inoculées et d'autres inoculés uniquement par le champignon servent

comme témoin ont été ajoutées.

2.5.3. L'estimation des symptômes

Les plantes inoculées ont été examinées au bout de 40 jours et le nombre de

feuilles montrant des symptômes de jaunissement a été noté pour chaque plante. La

gravité de la maladie exprimé en indice de maladie (IM) a été évaluée par la formule

(Molot et Mas, 1975; Besri et al., 1984).

IM= Nombre de feuilles atteintes / nombre total de feuilles x 100


64

En comparant l'indice de la maladie chez les plantes du pois chiche inoculées

seulement par le champignon et ceux inoculées par le champignon et l'actinomycète

en déduit le degré de protection fournit par la souche d'actinomycète ACT2.

3. Détermination de l'agressivité et du comportement variétal

3.1. Détermination de l'agressivité

La détermination de l'agressivité a été réalisée sur la variété sensible ILC-482

au FOC. Les techniques de préparation de l'inoculum, la préparation du matériel

végétal sont les mêmes que celles procédé pour la détermination de la forme spéciale

ciceri. L'inoculation a été réalisée sans avoir sectionné les racines des jeunes plantules

obtenues après 8 jours de semi.

L'estimation des symptômes a été évaluée par la formule de Molot et Mas,

(1975) et Besri et al., (1984).

3.2. Etude du comportement variétal

Cette étude a été réalisée sur une gamme de variétés du pois chiche (11

variétés). Les 11 variétés du pois chiche utilisées sont: ILC 3279, ILC-482, Col-27,

PPC-25, Fedjoj, Haddache, 39-96, 2G-03, F10-31, F10-13, F7-43 offrit aimablement

par INRA de Sidi Bel-Abbés et l'ITGC de Saida.

Les techniques de préparation de l'inoculum, la préparation du matériel

végétale et la technique d'inoculation sont les mêmes que celles procédé pour la

détermination de la forme spéciale ciceri.

3.2.1. Estimation des symptômes

Les plantes des 11 variétés du pois chiche inoculées ont été examinées au bout

de 40 jours et le nombre de feuilles montrant des symptômes de jaunissement et de

flétrissement a été noté pour chaque plante. L'estimation de la réaction des cultivars

du pois de chiche inoculés a été réalisée suivant l'échelle adoptée par Haware et Nene

(1982). Cette échelle est établie en fonction de la gravité des symptômes évalués par


65

le pourcentage des feuilles jaunies ou nécrosées par rapport au nombre total des

feuilles 40 jours après l'inoculation:

0 à 20%: la réaction est qualifiée de tolérance ; 21 à 50%: la réaction est une sensibilité modérée.

> 50% : la réaction est une sensibilité élevée.

3.2.2. Ré isolement du champignon pathogène

Pour confirmer l’identité de l'agent pathogène, les plantes des variétés

inoculées ont été récupérées en vue de réisoler l'agent pathogène (vérification du

Postula de Koch). Le réisolement a été fait par incubation des fragments de tige de

toutes les plantes après désinfection à l’eau de javel, sur le milieu PDA, à 25 C°. Les

cultures fongiques obtenues sont comparées à leurs cultures mères. Le pourcentage de

réisolement positif (%RP) est exprimé par la formule suivante:

Ce test permet de mettre en évidence si le champignon est présent, s’il est

vivant et s’il est capable de développer les mêmes symptômes observés dans la nature.

%RP= Nombre de fragments colonisés/Nombre de fragments testés x 100

IM= Nombre de feuilles atteintes / nombre total de feuilles x 100

45

Chapitre 3: Résultats et discussion

Résultats et discussion

91

1. Caractérisation des symptômes de la fusariose et identification de l'agent

causal (FOC)

1.1. Importance du flétrissement du pois chiche dans les 03 régions d'études

1.1.1. Résultats

1.1.1.1. Observation des symptômes au champ

Les différentes prospections effectuées au champ nous ont permis d’observer

les symptômes caractéristiques de la fusariose sur culture du pois de chiche. Les

symptômes du flétrissement sont souvent plus graves entre 18 et 25°C. Les

symptômes provoqués par F. oxysporum ciceri s’observent régulièrement à peu près

chaque année dans les régions du nord ouest d’Algérie (Figure 9). L’importance de

l’épidémie varie d’une année à l’autre et d’une région à une autre.

Les symptômes observés aux champs correspondent à un relâchement des

pétioles, un flétrissement rapide des feuilles avec une couleur vert-terne, suivi du

desséchement de la plante entière avant même le stade de floraison. Pour d'autres

plantes, les symptômes se sont manifestés plus tard sous forme d'un jaunissement

vasculaire caractéristique, soit unilatéraux (Figure 10A), soit généralisés (Figure

10B). Le flétrissement du feuillage atteigne tout d’abord, les feuilles les plus basses et

progressent ensuite vers le haut (Figure 11). Ce dernier cas était le plus fréquent

observé dans les parcelles prospectées.

Figure 9. A: une culture du pois chiche à Ain Temouchent présentant un foyer malade; B: culture du

pois chiche présentant plusieurs foyer malades à Mostaganem.

A B


92

Dans les deux manifestations pathologiques, une coupe longitudinale suivant

l'axe de la plante avait révélé un brunissement des tissus internes des tiges,

témoignant de leur colonisation par l'agent pathogène (Figure 10 C).

Le système racinaire des plantes malades présente une réduction des racines

secondaires (Figure 11). L'examen à l’œil nu des graines issues de plantes malades a

montré une réduction de leur taille par rapport aux graines saines, en plus leur couleur

était plus foncé que les graines normales.

Dans les parcelles de Mostaganem, la maladie ne s'est déclarée que

tardivement en post floraison, la manifestation pathologique observée était du type

jaunissement vasculaire caractéristique du flétrissement tardif. Dans la région de

Tlemcen et Ain Temouchent et surtout à Tlemcen, nous avons remarqué la présence

de jeunes plantules entièrement sèches à stade pré-floraison correspondant au

flétrissement précoce.

Figure 10. A: Plants du pois chiche, présentant une attaque de fusariose unilatérale observée en moi de mai;

B: Plants de pois chiche, présentant une attaque de fusariose généralisée; C: coupe longitudinale d'une tige

du pois chiche présentant un noircissement du xylème, observée dans une parcelle à Tlemcen.

A B C


93

A l’exception de ces sujets présentant les manifestations épidémiques

précitées, dans l’ensemble les cultures étaient saines et indemnes de tous symptômes

de maladie.

1.1.1.2. Etude de l'incidence et de la gravité de la maladie

Les prospections effectuées dans les trois régions du nord ouest d’Algérie ont

permis d’observer les symptômes caractéristiques de la fusariose. La distribution de la

maladie varie d’une région à l’autre. Dans les régions d'Ain Témouchent et Tlemcen,

les prospections ont permis de constater que, dans plusieurs champs de culture du pois

chiche, la maladie était présente et a entraîné des dégâts importants. En revanche,

dans la région de Mostaganem, la maladie était rarement observée et parfois absente.

Les valeurs d'estimation de l'incidence et de la gravité de la maladie de la

fusariose du pois chiche sont présentées dans le Tableau 16. Ces deux paramètres ont

été évalués par analyse des racines des plantes d'apparence saines et qui montrent des

symptômes du flétrissement.

Figure 11. Une réduction des ramifications secondaires sur le système racinaire

des plantes malades de pois chiche par rapport aux racines des plantes saines

Bas

Plante

malade

Plante

saine

Haut


94

Tableau 16. Incidence (I) et gravité (S) du flétrissement vasculaire dans les parcelles de culture du pois

chiche prospectées.

Régions Les parcelles Moyenne Intervalle Total

Incidence ou

gravité

P1 P2 P3 P4

Mostaganem Incidence% 24.33 21.28 7.43 --- 17.68 7.43-24.33 I=

53.90 Gravité 1.06 1.02 0.18 --- 0.75 0.18-1.06

Ain

Temouchent

Incidence% 65.89 66.66 30.76 84.61 61.98 30.76-84.61

Gravité 0.61 1.45 0.40 2.30 1.19 0.40-2.30 S= 1.82

Tlemcen Incidence% 92.30 94.87 74.35 66.66 82.04 66.66-94.87

Gravité 2.64 1.91 1.51 1.98 2.01 1.51-2.64

Incidence (I): est exprimée en % ; elle est nulle (0), peu élevée (0-1.5), moyennement élevée (5.1-20),

élevée (20.1-50), très élevée (>50). Gravité (S): la maladie est peu grave (0<S<1), moyennement grave

(1<S<2), grave (2<S<3), très grave (3<S<4).

L'incidence de la maladie varie de 7.4 à 94.87% avec une moyenne de 53.90%

pour toutes les parcelles prospectées, ainsi que, pour la gravité de la maladie, qui varie

de 0.18 à 2.64 avec une moyenne de 1.82 (Tableau 16).

A Mostaganem, les 03 parcelles prospectées ont montré un pourcentage de

plantes malades faible par rapport aux deux autres régions prospectées. Il est

d’environ 7.68% et un indice de gravité de 0.75.

A Ain Témouchent, les 04 parcelles prospectées montrent un pourcentage de

plantes infectées plus important par rapport à la région de Mostaganem, alors qu’il est

moins élevé que la région de Tlemcen. L'incidence de la maladie dans cette région est

de l'ordre de 61.98%, alors que, la gravité est à environ 1.19. Au niveau des plaines

intérieures, les 04 sites agricoles de la région de Tlemcen montrent des plantes

malades dont l'incidence et la gravité avoisine 82.04% et 2.02 respectivement.

Au niveau des régions prospectées, l'incidence de la maladie a témoigné une

gravité élevée de cette épidémie, les deux paramètres étudiés (l'incidence et la gravité


95

de la maladie) induite par le FOC, s'avère augmenté au fur et à mesure du

développement de la culture.

1.1.1.3. Détection et isolement de l’agent pathogène

A travers les différentes prospections, plus d’une vingtaine d’échantillons ont

été analysés au laboratoire, ces échantillons ont pour la plupart été prélevés au hasard

pendant nos prospections. Des fragments d’organes (tiges, collets ou racines)

présentant des symptômes sont déposés sur milieu de culture dans des boîtes de Petri

puis incubées à 25°C pendant 4 à 5 jours.

Les analyses réalisées au laboratoire ont révélé la présence régulière de F.

oxysporum, champignon de la famille des Moliniacées. Suite aux différentes

caractéristiques des isolats et en tenant compte de la plante hôte, nous pouvons

supposer que cette espèce correspond à la forme spéciale F. oxysporum ciceri. Donc,

cette dernière est impliquée dans le développement de cette épidémie affectant

l’ensemble des régions productrices dans l’ouest algériens.

Néanmoins, il reste à tester son agressivité sur une variété du pois chiche

sensible, afin de pouvoir déclarer que cette espèce est strictement inféodée à ce

matériel végétal (vérifier le Postulat de Koch) et que cette dernière est bien pathogène

et responsable des symptômes sur culture du pois chiche observés au champ.

Figure 12. Colonies de F. oxysporum ciceri obtenues sur boite de Petri, contenant le milieu PDA

A: Face inférieure ; B: Face supérieure.

A B


96

Tableau 17. Nombre des isolats obtenus par région et par partie de plantes infectées

Région Racines Collet Tige Total Nombre Total

Tlemcen 12 21 10 43

65 Mostaganem 03 03 04 10

Ain Temouchent 04 05 03 12

Les résultats de l'analyse au laboratoire ont permis d’isoler l’agent causal de

cette maladie. Les figures 12A et 12B représentent les colonies de F. oxysporum f. sp.

ciceri obtenues sur milieu PDA. Le champignon est facilement reconnaissable grâce à

son thalle souvent blanchâtre. La détection de ce parasite est donc aisé, même lorsque

les fragments sont contaminés par des bactéries, des champignons saprophytes ou

parasites de faiblesse comme les Alternaria, les Aspergillus ou les Penicillium. En ce

qui concerne l’isolement, c’est-à-dire l’obtention de F. oxysporum ciceri en culture

pure, il ne pose aucun problème particulier. En effet, la croissance initiale est très

rapide et il suffit donc d’opérer les prélèvements aussi tôt que possible. L’aspect de la

fusariose du pois chiche s’est révélé assez homogène d’un plant à un autre et d’une

région de culture à une autre.

Nom

bre d

es isolats

Figure 13. Histogrammes présentant la répartition des isolats de

FOC par région et par partie de plante.


97

Au total une collection de 65 isolats de FOC, a été obtenue après isolement et

purification, dont 26.15 % à partir de tige, 44.61% à partir du collet et 29.23% à partir

des racines. La répartition du nombre d'isolats de la collection obtenus de FOC par

région est représentée par la Figure 13.

Parmi les 65 isolats de FOC obtenus à partir des différents échantillons

analysés, 43 ont été obtenus de la région de Tlemcen, 12 de la région d'Ain-

Temouchent et 10 provenant de la région de Mostaganem. Les résultats d’isolement

de l’agent pathogène ont montré que le pourcentage d’isolement était beaucoup plus

élevé à partir des fragments du collet par apport à ceux des tiges et de racines.

Le pourcentage de réussite d’isolement de F. oxysporum ciceri a varié de 60 à

80%, selon les fragments mis en culture sur milieu PDA.

1.1.1.4. Détermination de la forme spéciale ciceri

Les plantes du pois chiche de la variété ILC-482 connue par sa sensibilité au

flétrissement vasculaire ont été inoculées par 17 isolats de FOC (après blessure des

racines), en vue de déterminer la forme spéciale ciceri. Tous les isolats ont provoqués

les symptômes typiques de la fusariose similaires aux celles observés aux champs.

Ces symptômes ont été observés deux semaines après inoculation chez certains isolats

et ont progressé très rapidement en entrainant la destruction totale des plantules après

30 jours. Les plantes témoins maintenues dans les mêmes conditions n'ont manifesté

aucun symptôme. En tenant compte de ces résultats, nous pouvons conclure que nos

isolats testés appartiennent à la forme spéciale ciceri.

1.1.2. Discussion

1.1.2.1. Observation des symptômes

Le flétrissement vasculaire peut être accompagné d'une pourriture racinaire

(Raju et al., 2008) quand il est induit par F. solani (Rhrib, 1990; Westerlund et al.,

1974; Kraft, 1969) ou de nécroses des racines et du collet quand il est associé à

certains biotypes de l'espèce Fusarium oxysporum (Rhrib, 1990; Jimenez-Diaz et

Trapero-Casas, 1988).


98

Dans d'autres cas les racines gardent une apparence saine et ne montrent ni

pourriture, ni dessèchement, un tel symptôme a été décrit comme étant la conséquence

de l'infection par le FOC (Shah et al., 2009; Cunnington et al., 2009; Dubey et Singh,

2004; Nene et al., 1991; Haware, 1988; Nene et Reddy, 1987). Les plantules du pois

chiche détruites par la maladie du flétrissement peuvent être confondues avec d’autres

maladies du complexe du flétrissement si on ne les examine pas avec précaution

(Pande et al., 2007). L'examen des racines des plants infectés peut différencier entre

le flétrissement vasculaire (la fusariose) et les autres maladies du complexe du

flétrissement chez le pois chiche. Les symptômes des deux maladies sont souvent

identiques mais la différence réside au niveau des racines.

Fusarium oxysporum f. sp. ciceri provoque d’abord un flétrissement du

feuillage progressant du bas de la plante vers le haut avec une ramification des racines

secondaire. Il pénètre dans les racines par des blessures et développe le plus souvent

un mycélium blanc. Les premiers symptômes de contamination par F. oxysporum f.

sp. ciceri sont des jaunissements et flétrissements unilatéraux des feuilles. On observe

également sur les tiges des stries longitudinales brunes. Ces symptômes du

flétrissement vasculaire observés dans les parcelles prospectées sont similaires à ceux

rapportés par Westerlund et al., (1974) en Californie, par Nene et Reddy, (1987) et

Haware, (1988) en Inde, par Jimenez-Diaz et Trapero-Casas, (1988) et Trapero-Casas

et Jimenez-Diaz, (1985) en Espagne, par El-Aoufir, (2001) au Maroc, par Halila et

Strange, (1996) en Tunisie et par Bekkar, (2007) en Algérie.

Le symptôme le plus fréquemment observé dans les champs prospectés était

le jaunissement vasculaire induit par le FOC tel qu'il a été rapporté en Espagne

(Trapero-Casas et Jimenez-Diaz, 1985) et qui correspond au flétrissement tardif décrit

par Nene et al., (1979). Etant donnée que les prospections effectuées ont été réalisé au

stade post floraison et remplissage de gousses, nous n’avons pas pu montré la

présence du flétrissement précoce qui correspond au Wilt décrit par divers auteurs (El

Aoufir, 2001; Haware, 1988; Trapero-Casas et Jimenez-Diaz, 1985; Nene et al., 1979;

Erwin, 1958). Cependant, nous avons remarqué la présence de jeunes plantules morte

(stade pré- floraison), ce type du flétrissement qui apparait au stade préfloraison et qui


99

abouti à la mort des plantes avant qu'elles n'atteignent le stade floraison, cause plus de

pertes que le jaunissement vasculaire progressif qui apparaissant plus tardivement.

Le flétrissement précoce causé par le FOC peut être observé chez les

génotypes sensibles 25 jours après le semis (Shah et al., 2009; Raju et al., 2008 ;

Pande et al., 2007; Navas-Cortés et al., 1998 ; Nene et al., 1978), alors que le

flétrissement tardif s’observe au stade de remplissage des gousses (Pande et al.,

2007 ; Navas-Cortés et al., 1998).

D'après les observations faites par Pande et al., (2007), les jeunes plantules

infectées par le flétrissement vasculaire précoce s'écroulent, s'aplaties et s'allongent

sur terre en gardant leur couleur verte sombre. Cependant, les plantes adultes qui

montrent des symptômes du flétrissement tardif, se caractérise par un flétrissement

soudain des feuilles et un affaissement des pétioles, de rachis et de folioles, avec la

présence d’une couleur pale par rapport aux plantes saines et une décoloration du

xylème de la tige (Shah et al., 2009 ; Raju et al., 2008 ; Pande et al., 2007; Dubey et

Singh., 2004). La manifestation de ces deux types de symptômes avec une fréquence

plus grande du jaunissement vasculaire a été rapportée en Algérie par (Bekkar, 2007).

Néanmoins, l'observation de gousses avait souvent révélé la présence de graines

atrophiées, ce qui est en accord avec l'observation de Haware et Nene (1980).

Dans les 03 régions, les conditions de semis du printemps relatives à la

température et à l’humidité du sol sont souvent réunies pour que les spores et les

chlamydospores germent et pénètrent à l’intérieur des vaisseaux de la plante. Lorsque

l’infection est réalisée, le cryptogame se multiplie et progresse à l’intérieur des tissus

de la plante en direction de la partie aérienne. En effet, l’intensité d’une attaque du

flétrissement est en rapport avec l’importance du taux de contamination des variétés

du pois chiche qui peuvent être plus ou moins résistantes et également les diverses

races de la fusariose dont la virulence est plus ou moins importante (Bouznad, 1989).

Cette maladie est toujours prête à reprendre son extension si l’intérêt que l’on peut lui

accordé se relâche.


100

1.1.2.2. Incidence et gravité de la maladie

En Algérie les études réalisées sur les pathogènes du pois chiche ont surtout

porté sur l'anthracnose provoqué par l'agent Aschochyta rabiei, véritable obstacle à la

culture auquel s'ajoute actuellement le complexe du flétrissement et de pourriture

radiculaire appelé syndrome du flétrissement (Rhrib, 1990).

Le flétrissement vasculaire s'est manifesté principalement par un jaunissement

dans toutes les parcelles de culture de printemps. Toutefois la comparaison des

résultats de la présente étude a montré, que les niveaux d'attaque étaient beaucoup

plus élevés (Incidence>50%) dans les parcelles de production du pois chiche

printanier à Tlemcen et à Ain Temouchent. On peut préjuger à ces niveaux d'attaque,

que les rendements seront considérablement réduits par cette maladie.

L'évaluation de l'incidence (pourcentage de plantes infestées) et de la gravité

(proportion de tissu infesté) habituellement employée dans l'étude des maladies

causées par les agents pathogènes telluriques (Campbell et Powel, 1990), a permis

l'estimation de la fréquence de la maladie au niveau des 03 régions prospectées. Son

importance en termes d'incidence et de gravité a varié entre ces régions et d’une

parcelle à une autre dans une même région. Les résultats de l'incidence et la gravité

obtenus par cette étude sont en accord avec autres recherches réalisées dans le nord

ouest de l'Algérie. Ben Freha et al., (2010) ont permis d'identifier une incidence de la

maladie de la fusariose du pois chiche allant de 37.7 à 100% et une gravité entre 1 et

2.79. Selon Mehrez et al., (2010) la moyenne de l'incidence est d’environ 63.77%,

avec une gravité avoisinant 2.97%.

Cette situation peut être la conséquence de certains facteurs qui possèdent une

très grande influence sur la croissance de l’espèce fongique et principalement sur les

possibilités de réalisation de l’interaction hôte – parasite, pour expliquer cette

situation, plusieurs facteurs entre en jeux. Parmi ces facteurs on distingue : les

conditions d'aménagement des parcelles, leur histoire, et surtout les conditions

environnementales: certains auteurs ont rapporté que la température joue un rôle clé

dans le processus d'infection (Landa et al., 2006; Landa et al., 2001; Navas-Cortés et


101

al., 2000; Navas-Cortes et al., 1998; Bhatti et Kraft, 1992; Gupta et al., 1987;

Westerlund et al., 1974).

Plusieurs auteurs ont rapporté que la température affecte le processus

métabolique, la virulence et le développement de la plante, une température entre 20

et 30°C est favorable pour le développement de cette maladie (Sharma et Muehlbauer,

2007; Landa et al., 2006 ; Trapero-Casas et Jimenez-Diaz, 1985). Ce qui est le cas

dans ces régions étant donné que la température avoisine les 25°C pendant cette

saison (Tableau 12).

La température peut affecter les moyens de défense liés la résistance de

certains cultivars aux races de FOC sous les conditions naturelles (Landa et al., 2006).

D’autres observations ont montré que les sols secs durant cette saison, augmente la

sévérité de la maladie (Landa et al., 2004 ; Sugha et al., 1994; Bhatti et Kraft,

1992; Trapero-Casas et Jimenez-Diaz, 1985), ce qui corrèlent avec nos observations

qui indiquent que l'incidence et la sévérité de la fusariose a été maximale en post

floraison et pendant le remplissage des gousses. L'incidence de la maladie peut être

aussi influencé par le génotype du pois chiche cultivé, cette incidence augmente lors

de l'utilisation de génotypes sensibles (Shah et al., 2009; Raju et al., 2008; Pande et

al., 2007; Navas-Cortes et al., 2000; Navas-Cortés et al., 1998; Nene et al., 1978).

La sévérité dépend aussi de la densité d'inoculum (Navas-Cortes et al., 2000;

Sugha et al., 1994; Gupta et al., 1987; Westerlund et al., 1974). Ces derniers auteurs

ont observé que l'augmentation de la charge de l'inoculum augmente la sévérité et la

rapidité de la maladie, par contre sa diminution supprime l'expression de la maladie.

La sévérité élevée de la maladie à Tlemcen et à Ain Temouchent peut être due

probablement au système des monocultures. L'incidence peut être affectée aussi par

les sols infestés par les nématodes du genre Meloidogyne spp. et Pratylenchus

thornei. Les blessures provoquées par certains nématodes prédisposent les racines de

pois chiche à l'attaque par le FOC (Castillo et al., 1998; Uma Maheswari et al., 1997).

Autre facteur déterminant, est les races physiologiques de FOC (Navas-Cortes et al.,

1998), en Algérie, Bekkar, (2007) a proposé la présence de la race 5, considérée

comme la race la plus virulente.


102

1.1.2.3. Détection et isolement de l’agent pathogène

Dans les conditions d'isolement sur milieu gélosé PDA, le FOC a été isolé à

partir des échantillons flétris et/ou jaunis, récoltés lors des prospections. Il est

probable que la fréquence d'isolement soit le résultat d'une augmentation avec l'âge et

de la sensibilité de la plante vis-à-vis de Fusarium telle qu'elle a été démontrée par

certains auteurs (Van Rheenen et al., 1989; Gupta et al., 1987).

Certains échantillons ayant fait l'objet de cette étude n'ont montré aucun

développement du champignon alors qu'au champ, ils avaient manifesté des

symptômes du flétrissement.

Ceci ne peut pas être dû au milieu de croissance qui était adéquat pour révéler

le Fusarium car le PDA est le milieu considéré d'être riche en nutriment comme les

carbohydrates. De plus, le PDA est principalement utilisé pour l'identification des

cultures de Fusarium car il induit la pigmentation et il est utilisé pour observer les

taux de croissance du champignon qui est un caractère important pour l'identification

des espèces (Summerell et al., 2003; Nelson et al., 1983). En effet, il est connu que

les symptômes peuvent se manifester avant l'installation de l'agent pathogène dans

l'organe. Ce cas a été rapporté pour Fusarium oxysporum f. sp. pisi (Winstead et

Walker, 1954) et le FOC (Farooq et al., 2005). Ces agents agissent à distance par

l'émission de métabolites (substances enzymatiques ou toxines). Ce résultat peut être

également expliqué par une absence de certains conditions d’incubation, étant donnée

que les cultures sont souvent maintenues à une température de 25°C jour/20°C la nuit

et incubées sous lumière journalière (Nelson et al., 1983) et n'ont pas à une obscurité

totale. D'autres facteurs indéterminés pourraient être impliqués dans le phénomène

car, il est connu que les affections causées par d'autres agents comme le Verticilium

dahliae (Haware, 1988), les symptômes sont difficilement discernables de ceux

induits par le FOC.

Le flétrissement pourrait aussi résulter de l'obstruction du système vasculaire

des racines qui constitue la voie de pénétration du Fusarium oxysporum dans la

plante, ce qui explique le pourcentage élevé de l'isolement de FOC à partir de racines

et de collet par rapport à la tige.


103

Ce pathogène est donc le plus présent et a été déjà largement incriminé dans

les études antérieures (Ben Freha et al., 2010; Mehrez et al., 2010; Bekkar, 2007).

Cette espèce semble être implantée dans l’ensemble des zones prospectées ou cette

culture est pratiquée. En effet, le F. oxysporum isolé du sol ou à partir du végétal ne

peut pas être classé dans une forme spéciale qu’après inoculation artificielle sur l’hôte

sensible (Laterrot et al., 1978).

1.1.2.4. Détermination de la forme spéciale

Cette expérimentation a pour objectif de reproduire les symptômes du

flétrissement sur la plante du pois chiche en conditions de contamination artificielle.

Le résultat de l’inoculation a été positif sur la variété sensible du pois chiche.

Donc, cette espèce de Fusarium oxysporum est bien pathogène et responsable des

symptômes observés au champ. Cette expérimentation a permis de vérifier le test de

Postulat de Koch. La rapidité d'apparition des symptômes pour ce test est due

probablement aux blessures que nos avons provoquées sur les racines.

L'étude menée sur le comportement des isolats sur la variété sensible du pois

chiche, nous a permis de reproduire les symptômes. Ces symptômes causés par le

FOC sont en effet ceux décrits par plusieurs auteurs (Bekkar, 2007; Honnareddy et

Dubey, 2006; Jimenez-Gasco et al., 2004; Jimenez-Gasco et Jimenez-Diaz, 2003; El-

Aoufir, 2001; Navas-Cortes et al., 1998), il s'agit d'un flétrissement et d'un

jaunissement accompagné d'une décoloration vasculaire au niveau des tiges.

1.2. Etude morphologique de FOC

L'identification morphologique est basée sur les similarités des caractères

morphologiques observables physiques et physiologiques (Leslie et al., 2001). Les

caractères physiques correspondent à la forme et la taille des conidies, cependant les

caractères physiologiques correspondent aux taux de croissance (Taylor et al., 2000;

Leslie et al., 2001) et la sécrétion des métabolites primaires (Desjardins et al., 1992;

Nelson et al., 1983; Torp et Langseth, 1999; Thrane, 2001; Rheeder et al., 2002).

Pour la taxonomie du genre Fusarium la forme des macroconidies est le premier

caractère important pour l'identification des espèces (Gerlach et Nirenberg, 1982;


104

Nelson et al., 1983; Summerell et al., 2003; Leslie et Summerell, 2006). Autres

caractères morphologiques comme les microconidies, les conidiophores et les

chlamydospores sont aussi important dans l'identification des espèces (Booth, 1971;

Gerlach et Nirenberg 1982; Nelson et al., 1983).

1.2.1. Résultats

1.2.1.1. Caractérisation physique

1.2.1.1.1. Caractéristiques culturales

L'étude des caractéristiques culturales de 17 isolats de FOC isolés à partir de

la tige a porté sur l'aspect du mycélium aérien et la pigmentation du thalle et de

mycélium. Dans le cadre de ce travail, l'évolution phénotypique de quelques isolats

de FOC a été suivie dans le but de préciser la part des caractéristiques culturales dans

l'identification de cet agent fongique à partir des cultures jeunes et âgées. Les

conditions d'incubation étaient stables et similaires. Le tableau 18 résume les

morphotypes et les pigments rencontrés chez les isolats de FOC.

1.2.1.1.1.1. Description des morphotypes rencontrés

Notons que l'aspect général d'une colonie, est déterminé par la couleur de la

colonie et sa texture. Sur milieu PDA gélosé le thalle de la plupart des isolats de F.

oxysporum f. sp. ciceri était formé de mycélium dense, aérien et d’aspect plus ou

moins cotonneux. Après 5 à 7 jours de culture, le thalle de certaines souches vire de la

couleur blanchâtre au violet, en raison de la production des pigments.

L’étude des caractéristiques des isolats issue d’une culture monospore,

prélevée sous la loupe binoculaire après étalement d’une suspension convenablement

diluée sur de l’eau gélosée en boîte de Petri de Fusarium oxysporum a révélé une

variabilité morphotypique (Tableau 18).


105

Tableau 18. Caractéristiques culturales des morphotypes sauvages de 17 isolats de FOC

Isolats Morphotypes Pigments

FOC1 Ras muqueux Violet

FOC2 Duveteux Blanc

FOC3 Duveteux Blanc

FOC4 Duveteux Blanc

FOC5 Cotonneux Blanc

FOC6 Ras muqueux Blanc

FOC7 Ras muqueux Violet

FOC8 Duveteux Violet

FOC9 Duveteux Blanc




FOC13 Duveteux Blanc



FOC16 Cotonneux Blanc

FOC17 Duveteux Blanc

Dans les essais réalisés seuls les morphotypes mycéliens ont été rencontrés,

nous n'avons pas trouvé dans les cultures des d'organes de fructification tels que les

sporodochies et les pinnotes ou d'organe massifs tels que des sclérotes. Ainsi, 04 types

de thalles mycéliens ont été décrits dans l'ensemble des essais:

Figure 14. Morphotype du thalle de FOC ; A: Morphotype blanc cotonneux sauvage; B: Sous

morphotype bouclé; C: Sous morphotype en mèche.

A B C


106

Type cotonneux: le mycélium aérien est très abondant épais et dense, sa couleur

blanche (ou violette) est, du fait de l'abondance du mycélium, beaucoup plus franche

que dans le type duveteux. Ce mycélium cotonneux est très peu sporifère et ne produit

que des microconidies, tardivement et en faible quantité.

Le nombre d'isolats portant ce type est: 2. Après vieillissement de la culture (après 10

mois de conservation et de repiquage successifs), ce morphotype cotonneux a présenté

deux sous types, le premier sous type bouclé (Figure 14B), le second, le mycélium se

réunit en mèches (Figure 14C).

Type duveteux: il est représenté par un mycélium aérien assez court, mais dense,

portant de très nombreuses microconidies, les chlamydospores et les macroconidies se

forment tardivement. Le mycélium et le milieu peuvent être coloré ou non. Le nombre

d'isolats portant ce type est: 7. Après vieillissement de la culture (10 mois de

conservation et de repiquage successifs), le morphotype duveteux a présenté un sous

type bouclé.

Morphotype ras muqueux: la rareté ou l'absence totale de mycélium aérien donne à la

culture un aspect muqueux comme si elle était envahie par des bactéries (Figure 16A

et 16B). Les microconidies sont très abondantes, les macroconidies rares, les

chlamydospores abondantes, mais tardives, le nombre des isolats portant ce type est 8.

Après vieillissement de la culture (10 mois de conservation et de repiquage

successifs), le morphotype muqueux présente un sous type d'aspect arbusculeux

(Figure 16C).

Figure 15. Morphotype du thalle de FOC:

morphotype duveteux sauvage


107

Morphotype ras sénescent: l'aspect du thalle est à peu prés le même que celui du ras

muqueux, mais la croissance radiale est faible et le front de croissance irrégulier et

festonné (Figure 17A). La culture est en général très fortement colorée (Figure 17B),

ce type a été rencontré uniquement chez les cultures âgées.

1.2.1.1.1.2. Pigmentation du thalle

A travers l'ensemble de 17 FOC, nous avons pu révéler une pigmentation très

diversifiée sur le milieu PDA. Après 06 jours d'incubation, le mycélium présente des

pigmentations blanchâtres et violettes. La pigmentation chez les isolats sauvages est

blanche chez la plupart et elle représente un pourcentage de 82,35 %. Elle est violette

chez uniquement 03 isolats avec un pourcentage à environ 17.65% (Tableau 18).

Il semble que la morphologie du thalle et la pigmentation, chez cette forme

spéciale, ne caractérisent pas l'origine géographique des isolats puisque la plupart des

morphotypes et des pigments ont été rencontrés quelle que soit l'origine géographique

des isolats.

Figure 16. Morphotype du thalle de FOC ras muqueux : A: Morphotype ras muqueux coloré en violet;

B: Morphotype ras muqueux coloré en orange; C: Sous morphotype arbusculeux

Figure 17. Morphotype du thalle de FOC ras Sénescent, A: Morphotype

ras sénescent blanc; B: Morphotype ras sénescent rose

C B A

A B


108

1.2.1.1.2. Caractéristiques microscopiques et biométriques des spores

1.2.1.1.2.1. Etude microscopique de FOC

Les observations au microscope photonique ont montré la présence d’un

mycélium cloisonné et ramifié, des conidiophores très courtes ainsi que des

macroconidies et des microconidies caractéristiques du genre Fusarium (Figure18 A

et 18B).

Les microconidies sont produite en fausse tète sur des monophialides chez

quelques isolats mais chez la plupart, le mycélium produit une seule microconidie par

phialide collé à ce dernier. Tous les isolats produisent les microconidies en

abondance sauf l'isolat FOC5 et FOC16. Des macroconidies épaisses sont dispersées

et leur nombre varie de moyen à très faible.

Nous avons observé également la présence des chlamydospores (Figure19),

produit par certains FOC après 15 jours de culture. Alors que d'autres isolats les

produisent après 21 jours ou même après un mois. Les chlamydospores sont

généralement formés en position terminale ou intercalaire. Ils sont menés d'une paroi

rigide. Elles sont arrondies, en ballonnet, avec une double paroi très caractéristique.

Aucune structure de sclérotes n'a été produite par les 17 isolats de FOC après 15 jours

de culture sur PDA.

Figure 18. Observation microscopique du FOC; A: Observation microscopique au bleu de Cotton sous

microscope optique x2000 montrant des monophialides portant des conidies regroupées en fausse; B:

Observation microscopique d'une culture sur lame coloré au bleu de Cotton montrant des microconidies et

des macroconidies x2000.

B A


109

L'identification morphologique des isolats a confirmé la vérification de

Postula de Kock.

1.2.1.1.2.2. Etude biométrique

Les mensurations des conidies varient d'un isolat à un autre, la longueur des

microconidies varie de 5.55 à 8.44µm et la largeur entre 2.28 à 2.72µm. De même,

pour les macroconidies, la longueur varie de 18.2 à 29.64µm et la largeur entre 2.81 et

4.03µm. Le tableau 19 présente les résultats obtenus des mensurations pour chaque

isolat.

Tableau 19. Mensurations (µm) des macroconidies et des microconidies de 17 isolats de FOC

Isolats Microconidies Macroconidies Chlamydo

spores longueur Largeur Longueur Largeur

FOC1 6.97µm 2.36µm 24.68µm 3.75µm -

FOC2 8.44µm 2.6µm 18.97µm 3.29µm +

FOC3 5.82µm 2.35µm 23.75µm 3.76µm -

FOC4 6.07µm 2.31µm 25.2µm 3.38µm -

FOC5 8.35µm 2.41µm 23.36m 2.81µm -

FOC6 8.27µm 2.72µm 20.32µm 4.03µm +

FOC7 6.4µm 2.27µm 26.75µm 3.77µm -

FOC8 5.93µm 2.47µm 21.2µm 3.58µm +

FOC9 7.36µm 2.65µm 23.92µm 3.00µm -

FOC10 6.03µm 2.44µm 21.42µm 2.89µm +

Figure 19. Observation microscopique des

chlamydospores colorés au bleu de cotton sous

microscope optique x2000


110

FOC11 5.55µm 2.4µm 29.64µm 3.56µm +

FOC12 6.5µm 2.38µm 25.1µm 3.68µm -

FOC13 5.68µm 2.28µm 23.2µm 3.55µm +

FOC14 6.06µm 2.44µm 23.15µm 3.24µm +

FOC15 6.94µm 2.38µm 18.2µm 3.6µm +

FOC16 6.5µm 2.32µm 20.72µm 3.13µm +

FOC17 6.52µm 2.36µm 25.12µm 3.77µm +

Moyenne 6.67µm 2.42µm 23.21µm 3.45µm

L'analyse statistique portant sur la longueur, ainsi que sur la largeur, des

microconidies ont montré qu'il n'y a pas des différences significatives entre les 17

isolats de FOC. Cette homogénéité a donné de corrélation de r=0.636 entre les

mensurations de la largeur et de la longueur des microconidies de 17 isolats à origine

géographique différente. Les résultats de l'analyse statistique des mensurations de la

longueur et la largeur des macroconidies montrent des différences significatives. Cette

étude montre donc que les mensurations en longueur et largeur des macroconidies

sont hétérogènes.

L'étude statistique nous a permis de regrouper les 17 isolats de FOC dans 04

groupes:

Groupe a: comprend les deux isolats FOC 15 et FOC2.

Groupe b: comprend les isolats: FOC6, FOC16, FOC8, FOC10, FOC14, FOC13 et

FOC5.

Groupe c: comprend FOC3, FOC9, FOC12, FOC1, FOC17.

Groupe d: comprend FOC4, FOC7, FOC11.

1.2.2. Discussion

1.2.2.1. Caractérisation physique

1.2.2.1.1. Caractéristiques culturales

L’étude d’un organisme pathogène implique de maîtriser son identification, de

plus, dans un souci d’exactitude, il faut pouvoir vérifier l’identité du champignon


111

utilisé tout au long des expériences. L’identification correcte d’un pathogène est

également un élément clé dans le suivi des épidémies sur le terrain (Hatsh, 2004).

Les variations morphologiques sont portées sur des caractères culturaux, des

organes fructifères qui leur donnent éventuellement naissance (sporodochies et

pinnotes) et enfin sur la présence ou l'absence de sclérotes. Les morphotypes dits

sporodochial, sclérotial et pinnotal sont caractérisés par la présence d'organes massifs

respectivement sporodochies, sclérotes et pinnotes, lorsqu'ils sont absent, on définit

les morphotypes mycéliens du thalle qui sont constitué d'un mycélium dont l'aspect

est duveteux, cotonneux et ras muqueux (Henni et al., 1994).

Certains champignons phytopathogènes présentent en culture pure des

caractères typiques relativement stables qui permettent leur identification (Waite et

Stover, 1960). Certaines formes spéciales de Fusarium oxysporum ainsi que des races

peuvent être identifiées par l'aspect morphologique des cultures (Snyder et Smith,

1972; Awam et Lorbeer, 1986; Wong, 1988), c'est le cas de la forme spéciale

albedinis qui se distingue par son aspect arbustif et sporodochial stable (Djerbi et al.,

1985; Cherrab, 1989). La variabilité morphologique a été étudiée dans différentes

formes specialisées du Fusarium oxysporum f. sp. appi race2 (Awuah et Lorbeer,

1988), f. sp. capae (Abawi et Lorbeer, 1965;1971), f. sp. cubense (Waite et Stover,

1960; Follin et Laville, 1966) f. sp. lycopercisi (Wellman et Blaidell, 1941; Henni et

al., 1994) f. sp. melonis (Miller, 1945;1946), f. sp. lentis (Belabid, 2003), f. sp. ciceri

(Bekkar, 2007).

Etant donné que les champignons montrent rarement tous les aspects

morphologiques nécessaires à leur identification sous microscope, il est nécessaire de

les cultiver. La culture des champignons sur milieu de culture sert alors à induire des

phénotypes recherchés (Hatsh, 2004). Le PDA est principalement utilisé pour

l'identification des cultures de Fusarium car il induit la pigmentation (Nelson et al.,

1983; Summerell et al., 2003), cependant les cultures des champignons sur PDA ne

complète pas l'identification des espèces de Fusarium, à cause de ces concentrations

élevées en nutriment induisant ainsi des mutations morphologiques chez les isolats de


112

Fusarium (Leslie et Summerell., 2006). Ces résultats sont en accord avec nos isolats

de FOC après vieillissement de ces dernières.

Les résultats obtenus lors de cette étude, montrent en général une variabilité

importante de la morphologie de FOC et l'observation des caractères morphologiques

de 17 FOC ont révélé une hétérogénéité au sein de la forme spéciale ciceri, ce qui

rapproche nos résultats à ceux décrit par Chabasse et al., (2002) et Haware, (1990) qui

indiquent que la croissance de FOC sur PDA à 25°C et à l'obscurité montre des

colonies qui sont duveteuses à cotonneuse, blanches à pourpres. Ces colonies

deviennent ridées en culture âgée. 04 morphotypes sauvages mycéliens différents ont

été rencontrés, tels qu'ils sont décrits par Waite et Stover (1960); Messiaen et Cassini

(1968); Henni et al., (1994). El Aoufir, (2001) n'a observé aucune formation de

sporodochies chez le FOC, ce qui est en accord avec nos résultats étant donné que nos

n'avons pas observé le morphotype sporodochial chez cette forme spéciale. Cette

structure a été rapportée chez le FOC par Bekkar, (2007). De même, pour les autres

formes spéciales cubense (Waite et Stover, 1960) et albedinis (Sedra, 1985; Cherrab,

1989) et lycopersici (Henni et al., 1994) et lentis (Belabid, 2003). La variabilité de la

morphologie mycélienne a été également démontrée chez d'autres espèces fongiques

telles que Colletoricum graminicola, agent de l'anthracnose du sorgho (Kaboré et al.,

2001).

Une importante variabilité se manifeste chez les isolats de FOC, les

morphotypes rencontrés en début d'expérimentation sont constitués en majorité de

morphotypes (cotonneux et duveteux), après vieillissement des cultures le

morphotype ras muqueux domine.

Quelques soit la morphologie d'origine de l'isolat, nous avons observé en

culture âgées, une tendance très nette à l'apparition ou au maintien du morphotype ras

muqueux. Ce résultat est similaire a celui signalé par Henni et al., (1994) en utilisant

la forme spécial lycopercisi.

Les isolements pratiqués à partir du matériel naturellement infectés produisent

le plus souvent des morphotypes duveteux et cotonneux que l'on peut considérer

comme représentant le phénotype sauvage (Abawi et Lorbeer, 1965;1971; Messian et


113

Cassini, 1981; Nelson, 1981; Awuah et Lorbeer, 1988). Le maintien en culture de ces

isolats conduit en général à des variations se manifestant par la raréfaction du

mycélium aérien (évolution vers le type ras) (Wellman et Blaisdell, 1941; Abawi et

Lorbeer, 1965; 1971; Awuah et Lorbeer, 1988), ce qui a été observé après

vieillissement des cultures obtenues dans cette étude. Cependant le type sauvage de

départ peut dans la plupart du temps être maintenu en culture dépourvu de repiquages

soient fait à partir de microconidies prélevées dans des thalles jeunes (Follin et

Laville, 1966). Par ailleurs certains morphotypes sont considérés comme

particulièrement stables et notamment le morphotype ras (Wellman et Blaisdell, 1941;

Miller, 1946).

Les résultats obtenus lors de cette étude montrent une variabilité importante de

la pigmentation de FOC, ces résultats se rapprochent de ceux obtenus par Bekkar,

(2007) ; Dubey et al., (2009) sur les isolats de FOC et chez d'autres formes spéciales

comme Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (Assigbetsé, 1989), Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici (Henni et al., 1994) et Fusarium oxysporum f. sp. lentis

(Belabid, 2003). La pigmentation est un critère clé dans la détermination des

Fusarium élaborée par Messiaen et Cassini (1968; 1981). Cependant, si elle constitue

un critère d'identification au niveau de certaines espèces, elle ne permet pas de

distinguer les formes spéciales de Fusarium oxysporum, car plusieurs d'entre elles

peuvent manifester une même coloration comme chez les formes lycopersici, lini,

pisi (Cherrab, 1989). Si au sein de ces dernières et des formes spéciales albidinis et

elaeides peu de variabilité a été rapportée, il apparait que ce ne soit pas le cas chez le

FOC puisque les différents isolats incubés sur un même milieu et dans les mêmes

conditions, ont manifesté une gamme de coloration, blanche, violette, rose, orange ce

qui concorde avec l'hypothèse définie par Messiaen et Cassini (1968; 1981) chez le

Fusarium oxysporum.

L'idée qu'il convient de tirer est que la morphologie des isolats étudiés de FOC

est très instable. La variabilité se manifeste aussi bien entre les différents isolats que

chez la descendance issus du même clone, dans les morphotypes et la pigmentation.

Ce résultat est en accord avec celui obtenu par Henni et al., (1994) sur la forme

spéciale lycopersici. ces variations portées sur des caractères culturaux (aspect du


114

mycélium aérien, pigmentation du thalle) et des organes fructifères (sporodochies)

créent des difficultés de maintien en culture du phénotype sauvage des isolats de

FOC. Cette diversité reste jusqu'à ce jour sans explication. D'après, Jimenez-Gasco et

al., (2002) la diversité phénotypique observée chez le FOC, suggère leur possibilité

d'être polyphylétique, mais la réalité est que le FOC est monophylétique. Selon

Messiaen et Cassini, (1968), la pigmentation s'exprime en fonction des conditions du

milieu et sa disparition se produit fréquemment au cours du vieillissement de la

culture (Henni et al., 1994).

Taylor et al., (1999) ont rapporté que le FOC et comme tous les champignons

à reproduction asexuée ne subit pas une recombinaison régulière et la variation

génétique résulte principalement de l'accumulation des mutations. Par conséquent, le

génome entier est lié et se transmettre en une seule unité d'une génération à une autre.

La variabilité phénotypique serait due probablement à des phénomènes de mutations

(d'origine cytoplasmique ou d'origine nucléaire) (Burnett, 1984). Par la suite, la

redistribution de cette variabilité serait faite au sein des individus et des populations

par des mécanismes de reproduction asexuée et de compatibilité végétative. La

variabilité liée à des mécanismes de compatibilité végétative est bien connue chez les

champignons à reproduction asexuée (Fusarium oxysporum).

Henni et al., (1994) ont rapporté que la variabilité chez la descendance de

même clone se manifeste dans des cultures âgées et n'ont pas dans des cultures jeunes,

ce qui a été observé au cours de notre expérimentation. Selon le même auteur du point

de vue morphologique, la culture est en quelques sortes constituées d'une mosaïque de

cellules ayant des potentialités différentes et c'est une propriété non constitutive qui se

développe au cours du vieillissement du thalle. Le thalle issu d'une microconidie est

homogène et donne naissance à des microconidies ayant toutes les mêmes

potentialités au niveau morphologique. Mais au cours du vieillissement, la

différentiation affecte différemment les cellules de sorte qu'une hétérogénéité peut

être détectée chez les thalles âgés.

La variabilité des espèces de Fusarium de produire plusieurs caractères

morphologiques signifie que chez les espèces oxysporum, les caractères


115

morphologiques traditionnelles épanchés dans les systèmes taxonomiques ne sont pas

suffisante pour établir une identification de cette espèce (Leslie et Summerell, 2006).

D’une manière générale, on peut se demander pourquoi les phytopathologistes

s’intéressent d’aussi près à des variations morphologiques qui se produisent en

cultures essentiellement à partir des thalles âgés. La réponse est à rechercher dans

l’existence possible de relations entre le morphotype d’un isolat et son pouvoir

pathogène, elle varie selon les auteurs et les organismes étudiés. D’ailleurs, selon

Djerbi et al., (1986), la forme spécialisée albedinis, agent du bayoud du palmier

dattier en Afrique du nord, présente un aspect morphologique caractéristique par

rapport aux autres formes spécialisées et par rapport aux F. oxysporum saprophytes du

sol. Ce parasitisme serait lié dans ce cas précis, à un type morphologique. Wellman et

Blaisdell, (1941) ont montré que le pouvoir pathogène des F. oxysporum f. sp.

lycopersici est lié à la morphologie: le morphotype duveteux serait très pathogène

alors que le pathotype ras muqueux serait peu pathogène.

1.2.2.2. Caractéristiques microscopiques et biométriques

1.2.2.2.1. Etude microscopique

Nos observations microscopiques montrent que l'ensemble des isolats de FOC

produisent 03 types de spores asexuées: des microconidies, des macroconidies et des

chlamydospores portés sur des monophialides courtes en fausse tète. Cette

observation est en accord avec la description faite par plusieurs auteurs pour cette

espèce (Chabasse et al., 2002; Leslie et Summerell, 2006; Nelson et al., 1983;

Haware, 1990). Les monophialides de Fusarium oxysporum sont plus courts en

comparaison avec ceux produite par Fusarium moniliforme et Fusarium solani

(Mart.) Appel et Wollenn. Emend. Synd. &Hans. (Burgess et al., 1989).

L'observation des microconidies a révélé qu'ils se naissent sur des

conidiophores simples et courts et qui apparaissent latéralement sur l'hyphe. Ils sont

nombreuses, plus petite dans la taille que les macroconidies, d'aspect ellipsoïdales ou

cylindrique, droite ou légèrement courbées et uninuclées correspondent au

observations faite par Chabasse et al., (2002); Henni et al., (1994); Booth, (1971);


116

Nelson et al., (1983); Gurro et al., (1999); Nelson et al., (1994); Buxton, (1956); El-

Ani, (1968). Henni et al., (1994) ont signalé que les noyaux uninuclée des

microconidies observées chez le Fusarium oxysporum provient tous d'un unique

noyau au départ.

L'observation des macroconidies a montré qui ils sont moins nombreuses que

les microconidies, discrètement incurvées avec une cellule basale en forme de pied

distinctive, et une cellule apicale accrochée. Ils sont multinucliées et ont plusieurs

septales transversales environs 3 à 7 septations (Chabasse et al., 2002, Nelson et al.,

1983, Burgess et al., 1989, Booth, 1971; Dubey et al., 2009).

Nous avons observé aussi de nombreuses chlamydospores isolées ou en paires,

mais occasionnellement en chaines courts ou en touffe, avec des parois épaisse. Ce

résultat est similaire à celui apporté par plusieurs auteurs (Booth, 1971; Nelson et al.,

1983; Gurro et al., 1999; Nelson et al.,1994; Chabasse et al., 2002). Les

chlamydospores sont des conidies d'accessoires qui servent principalement comme

structure de survie dans l'environnement (Booth, 1971; Nelson et al., 1983; Gurro et

al., 1999; Nelson et al.,1994).

Un autre groupe de champignon filamenteux, les Coelomycetes à

reproduction asexuée en formant des conidies sur les bourgeons des fruits et ces

conidies sont similaires en morphologie au macroconidies produites par Fusarium,

par exemple: Botrycerea, Heteropatella, Cylindrocarpon et Pycnofusarium (Seifert,

2001). Cependant le genre Cylindrocarpon à des ressemblances très étroites avec le

genre Fusarium (Seifert et Gams, 2001). Il est très important de différencier les

macroconidies produites par ces champignons avec ceux du genre Fusarium, la

cellule basale de forme de pied des macroconidies de Fusarium est le caractère

morphologique le plus important pour séparer le genre Cylindrocarpon de Fusarium

(Seifert, 2001; Seifert et Gams, 2001).

1.2.2.2.2. Etude biométrique

Les résultats présentés dans le tableau19 montrent une homogénéité de la

longueur et de la largeur des microconidies de FOC. Ce résultat est en contradiction


117

avec ceux obtenus par Abbas, (1995) en Syrie chez le Fusarium oxysporum f. sp.

lentis. Par contre, les mensurations en longueur et largeur des macroconidies sont

héterogènes. Des travaux sur les dimensions des conidies de Fusarium oxysporum f.

sp. melonis races 1, 2, et 3 présentent des variations importantes, même à l'intérieur de

cette forme spéciale ou à l'échelle d'une race (Messiaen et Cassini, 1968).

D'après les résultats obtenus nous avons trouvé que la taille des microconidies

varie de (5.55-8.44 x 2.28-2.78µm), ces résultats se rapprochent à d'autres obtenues

par plusieurs auteurs (Dubey et al., 2009; Haware, 1990; Chabasse et al., 2002). Les

tailles des macroconidies obtenues au cours de cette étude varient entre (18.2-29.64 x

2.81-4.03µm). Ce résultat se rapproche avec celui trouvé par Chabasse et al., (2002);

Dubey et al., (2009); Haware, (1990).

Les différences dans les résultats obtenus au cours de cette étude et autres

travaux faite par plusieurs auteurs sont probablement les conséquences de la variation

dans les conditions de cultures, d'incubation et de l'âge des cultures. Généralement,

les mensurations des macroconidies, des microconidies, des conidiophores et les

chlamydospores sont mesurés sur milieu CLA (Carnation leaf Agar). De même, pour

les conditions d'incubation, les cultures sont souvent maintenu en une température de

25°C jour/20°C la nuit et incubées sous lumière journalière (Nelson et al., 1983). Le

milieu CLA favorise la sporulation que la croissance mycélienne des cultures de

Fusarium. Ce milieu a gagné cette popularité pour les espèces de Fusarium après que

Fisher et al., (1982) ont montré que ce dernier est favorable à la croissance et préserve

les cultures de Fusarium pendant une longue période. La capacité des espèces de

Fusarium à sporuler mieux sur CLA est attribuée à sa composition pauvre en

carbohydrate et a la présence des feuilles d'œillet, qui fournit le même complexe

naturel des substances comme dans l'environnement naturel (Leslie et Summerell,

2006), ce qui n'a pas été respecté dans cette étude, étant donné que nous avons utilisé

le PDA.

L'identification biométrique a des inconvénients chez le genre Fusarium,

étant donné que les similarités et les différences observées des macroconidies des

espèces de Fusarium dépendent des conditions de croissance et peuvent être difficile


118

à décerner (Thrane et Seifert, 2000; Summerell et al., 2003; Lesli et Summerell,

2006). En plus, la croissance dépend des caractères morphologiques, les isolats qui

devrait être regroupé comme des espèces différents peuvent appartenir à la même

espèce, cette male identification et cette hétérogénéité a été observé chez F.

oxysporum (Snyder et Hansen, 1940; 1941).

Le nombre restreint des macroconidies en culture est due principalement au

milieu utilisé qui est le PDA. En effet le milieu communément utilisé pour la

production de macroconidies est le CLA utiliser par plusieurs auteurs (Ciamp et al.,

2008).

1.2.1.2. Résultats de la caractérisation physiologique

1.2.1.2.1. Recherche des conditions optimales

Comme tout micro-organisme, la croissance fongique est dépendante d’un

certain nombre de paramètres intrinsèques et extrinsèques du milieu (Tubac, 2007).

Certains facteurs possèdent une très grande influence sur la croissance de l’espèce

fongique et principalement sur les possibilités de réalisation de l’interaction hôte –

parasite, parmi ces facteurs on distingue les facteurs biotiques (interactions avec

d'autres organismes) et les facteurs abiotiques (température, pH,…). Les facteurs

abiotiques les plus importants sont la température et l'humidité (Landa et al., 2007;

Farooq et al. ,2005; Magan et Lacey, 1984).

1.2.1.2.1.1. Estimation de la croissance mycélienne de 17 FOC sur PDA

Les résultats de la croissance mycélienne sur milieu PDA de 17 isolats de

FOC sont présentés par les courbes regroupées dans les figures (20, 21, 22). D'après

les résultats obtenus la vitesse de croissance mycélienne est variable.

Les résultats de l'étude de la variance de cette croissance ont montré qu'il

existe des différences hautement significatives et sont regrouper dans 04 groupes

homogènes:

Groupe a: FOC8, FOC15, FOC1, FOC5.

Groupe b: FOC 6, FOC 4, FOC 7, FOC 9, FOC 3.

Groupe c: FOC10, FOC12, FOC16, FOC 2.

Groupe d: FOC13, FOC 17, FOC 11, FOC14.


119

La croissance mycélienne est comprise entre 9.93cm et 9.46cm chez 04

souches (groupe a), soit 23.52% de la population. Ce groupe est caractérisé par une

vitesse de croissance très rapide. La croissance est par contre, faible chez 04 souches

(groupe b), soit 23.52% de la population. Les 9 souches restantes constituent deux

groupes intermédiaires dont la croissance est comprise entre 8.74 et 7.12 cm.

Toutes les souches originaires de Tlemcen ont le diamètre de croissance le

plus élevé (03 souches dans le groupe a, 5 souches dans le groupe b et 2 souches dans

le groupe c), aucune souche appartenant à cette région n'a été classée dans le groupe d

(diamètre de croissance faible).

Par contre, 75% de souches de Mostaganem ont été classée dans le groupe d

(groupe de croissance faible). Les 03 souches d'Ain Témouchent ont des vitesses de

croissance variables allant de plus élevées (groupe a) au plus faibles (Groupe d).

1.2.1.2.1.2. Effet de la température

Les résultats de l’expérience sont représentés par les figures (23, 24, 25), le FOC se

développe aux températures comprises entre 10 et 30°C, la température optimale est de

30°C, les températures inférieures à 10°C ralentissent la croissance mycélienne. A la

température 35°C, la croissance est considérablement ralentie voir inhibée. En revanche,

l'exposition des isolats à des températures de 10 et 35°C, ne s'avère pas létale, car le

champignon reste vivant en formant des chlamydospores. Si on l'expose à nouveau à une

température optimale, celui-ci reprend sa croissance normale.

L'analyse de la variance de la croissance mycélienne, a montré qu'il ya des

différences hautement significatives entre les températures étudiées et le

comportement des isolats de FOC (annexe 3). Les températures sont classées selon

l'ordre suivant, de l'ambiante à la défavorable: 30°C>25°C>20°C >15°C>35°C>10°C.

Le test de Newman-Keuls, nous a permis de classer les isolats en 03 groupes distincts:

Groupe a: composé de FOC 10, FOC15, FOC1, FOC3 et FOC4.

Groupe b: composé de FOC6, FOC11, FOC 5, FOC7, FOC13, FOC2.

Groupe c: composé de FOC9, FOC8, FOC17, FOC14, FOC12, FOC16.


120

1.2.1.2.1.3. Effet du pH

Les résultats de l’expérience sont représentés par les figures (26, 27, 28), le pH

optimal est de 5.5. L'analyse de la variance de la croissance mycélienne des isolats, a

montré qu'il a des différences hautement significatives entre les pH étudiés et les

isolats de FOC (annexe 3). Les pH sont classés selon l'ordre suivant, du propice au

défavorable à la croissance mycélienne des 17 FOC: 5.5 > 6.5 > 4.5 > 7.5.

Ainsi le test de Newman-Keuls nous a révélé la présence de 03 groupes

homogènes:

Groupe a: composé de FOC6, FOC3, FOC7, FOC5, FOC9.

Groupe b: composé de FOC8, FOC11, FOC15, FOC4, FOC10, FOC12, FOC16.

Groupe c: composé de FOC2, FOC1, FOC13, FOC14, FOC17.

1.2.1.2.1.4. Effet de la lumière et de l'obscurité

Les résultats dans nos essais sont exprimées dans les figures (29, 30, 31).

D'après ces résultats la croissance du champignon montre une indifférence à la

lumière et à l'obscurité. Toutefois, la lumière semble influencer le type de production

de spores. Ainsi, elle semble favoriser la production des macroconidies, alors que leur

production en obscurité est faible.

1.2.1.2.2. Influence des facteurs nutritionnels sur la croissance de FOC

Les champignons ont besoin pour assurer leur croissance de composés organiques

notamment des sources carbonées comme source d’énergie et des sources azotées pour la

synthèse des protéines. Pour rechercher les sources de carbone et d’azote donnant la

meilleure croissance de FOC, nous avons étudié l’effet de quelques sources de carbone et

d’azote.

1.2.1.2.2.1. Effet du milieu de culture

Les résultats rapportés dans les figures (38, 39, 40) font apparaitre des

différences du comportement de 17 isolats de FOC sur les différents milieux de

culture. Après 8 jours d'incubation, un maximum de croissance mycélienne est obtenu

sur le milieu pois chiche. Quant aux milieux Richard, Malt et Sach, ils se sont montrés


121

défavorables à la croissance de FOC. Le test de Newman-Keuls, nous a permis de

classer les milieux de culture selon l'ordre suivant: Pois chiche>PDA>Waksman>

Czapeck >Malt>Sach>Richards.

L'analyse de la variance de la croissance mycélienne, a montré qu'il y a des

différences hautement significatives entre le comportement des isolats vis à vis les

milieux de cultures étudiés (annexe3). Concernant le classement des différents isolats,

le test de Newman-Keuls nous a permis de les regrouper en 03 groupes homogènes:

Groupe a: composé de FOC8, FOC15, FOC5, FOC1, FOC6.

Groupe b: composé de FOC4, FOC9, FOC7, FOC3, FOC16, FOC10, FOC12.

Groupe c: composé de FOC2, FOC13, FOC11, FOC17, FOC14.

1.2.1.2.2.2. Effet de la source de carbone

Les résultats de ce test sont exprimés dans les figures (32, 33, 34). L'analyse de la

variance a montré qu'il y a des différences hautement significatives du comportement des

isolats vis à vis les sources de carbones testés (annexe 3).

Le test de Newman-Keuls nous a permis de classer les sources de carbone selon

l'ordre suivant: Glucose > Galactose> Saccharose. Cette étude statistique nous a permis

aussi, de regrouper les isolats testés dans 03 groupes:

Groupe a: FOC11, FOC15, FOC3, FOC4, FOC8, FOC10, FOC1, FOC7.

Groupe b: FOC13, FOC6, FOC16, FOC9, FOC12, FOC17.

Groupe c:FOC2, FOC5, FOC14.

1.2.1.2.2.3. Effet de la source d'azote

Les résultats de ce test sont exprimés dans les figures (35, 36, 37). L'analyse de la

variance a montré qu'il y a des différences hautement significatives du comportement des

isolats étudiés vis à vis les sources de carbones testés (annexe 3). Le test de Newman-

Keuls nous a permis de classer les sources d'azote selon l'ordre suivant: peptone > NaNO3>

KNO3. Cette étude statistique nous a permis aussi de regrouper les isolats testés dans 03

groupes:


122

Groupe a: FOC6, FOC1, FOC8, FOC3, FOC9.

Groupe b: FOC15, FOC5, FOC7, FOC11, FOC2, FOC4, FOC16, FOC13.

Groupe c: FOC12, FOC14, FOC10, FOC17.


123

Figure 20. Estimation de la croissance mycélienne en cm sur le milieu de culture des isolats (FOC1, FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6) de

Fusarium oxysporum f. sp. ciceri

Croissance mycélienne en cm de FOC1 sur milieu

PDA de culture

Croissance mycélienne en cm de FOC2 sur milieu de

culture PDA Croissance mycélienne en cm de FOC3 sur milieu de

culture PDA


de culture PDA


de culture PDA Croissance mycélienne en cm de FOC6 sur les7

milieu de culture PDA

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

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ycélien

ne en

cm


124

Figure 21. Estimation de la croissance mycélienne en cm sur le milieu de culture des isolats (FOC7, FOC8, FOC9, FOC10, FOC11, FOC12) de



PDA de culture


PDA de culture


PDA de culture


PDA de culture


PDA de culture


PDA de culture

Cro

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ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

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ycélien

ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


125

Figure 22. Estimation de la croissance mycélienne en cm sur le milieu de culture des isolats (FOC13, FOC14, FOC15, FOC16, FOC17) de



PDA de culture


PDA de culture


PDA de culture


PDA de culture


PDA de culture

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

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ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


126

Croissance mycélienne en cm de FOC1 sur la gamme

de température

Croissance mycélienne en cm de FOC2sur la

gamme de température

Croissance mycélienne en cm de FOC3sur la


Croissance mycélienne en cm de FOC4 sur la gamme de

température

Croissance mycélienne en cm de FOC5sur la gamme de

température

Croissance mycélienne en cm de FOC6sur la gamme

de température

Figure 23. Influence de la température sur la croissance mycélienne des isolats (FOC1, FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6) de Fusarium

oxysporum f. sp. ciceri

Cro

issance m

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ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

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ycélien

ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

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ycélien

ne en

cm


127

Croissance mycélienne en cm de FOC7sur la gamme de

température

Croissance mycélienne en cm de FOC8 sur la


Croissance mycélienne en cm deFOC9sur la



de température







Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


128








de température





Cro

issance m

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ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


129

Croissance mycélienne en cm de FOC1 sur les 04

différents PH du milieu PDA. Croissance mycélienne en cm deFOC2 sur les différents

PH du milieu PDA.

Croissance mycélienne en cm de FOC3 sur les

différents PH du milieu PDA.

Croissance mycélienne en de FOC 5 sur les différents

PH du milieu PDA. Croissance mycélienne en cm de FOC6 sur les


Croissance mycélienne en de FOC 4 sur les différents PH

du milieu PDA.

Figure 26. Influence du pH sur la croissance mycélienne des isolats (FOC1, FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6) de Fusarium oxysporum f. sp.

ciceri

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

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ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

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ycélien

ne en

cm

Cro

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ycélien

ne en

cm


130

Croissance mycélienne de FOC8 sur les différents PH du

milieu PDA.


milieu PDA.


différents PH du milieu PDA. Croissance mycélienne en cm de FOC12 sur les


Figure 27. Influence du pH sur la croissance mycélienne des isolats (FOC7, FOC8, FOC9, FOC10, FOC11, FOC12) de Fusarium oxysporum f. sp.

ciceri

Croissance mycélienne de FOC7 sur les différents PH

du milieu PDA.


du milieu PDA.

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

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ycélien

ne en

cm

Cro

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ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


131


milieu PDA.


du milieu PDA. Croissance mycélienne en cm de FOC15 sur les



du milieu PDA. Croissance mycélienne de FOC17 sur les différents PH

du milieu PDA.

Figure 28. Influence du pH sur la croissance mycélienne des isolats (FOC13, FOC14, FOC15, FOC16, FOC17) de Fusarium oxysporum f. sp.

ciceri.

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

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ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


132

Croissance mycélienne en cm de FOC1 sous lumière et

obscurité.

Croissance mycélienne en cm de FOC2 sous lumière

et Obscurité.

Croissance mycélienne en cm de FOC3 sous

Lumière et Obscurité.

Croissance mycélienne de FOC4 sous Lumière et

Obscurité.

Croissance mycélienne en cm de FOC5 sous Lumière

et Obscurité

Croissance mycélienne en cm de FOC6 sous Lumière

et Obscurité.

Figure 29. Influence de la lumière et de l'obscurité sur la croissance mycélienne des isolats (FOC1, FOC2, FOC3, FOC4, FOC5 et FOC6) de Fusarium

oxysporum f. sp. ciceri.

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


133


Obscurité.

Croissance mycélienne en cm de FOC8 sous lumière

et Obscurité.


Obscurité.


Obscurité.


Obscurité.


Obscurité

Figure 30. Influence de la lumière et de l'obscurité sur la croissance mycélienne des isolats (FOC7, FOC8, FOC9, FOC10, FOC11 et FOC12) de Fusarium

oxysporum f. sp. ciceri.

Cro

issance m

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ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

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ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


134


Obscurité.


Obscurité.


Obscurité.

Croissance mycélienne en cm de FOC16 sous

Lumière et Obscurité. Croissance mycélienne de FOC17 sous Lumière et

Obscurité.

Figure 31. Influence de la lumière et de l'obscurité sur la croissance mycélienne des isolats (FOC13, FOC14, FOC15, FOC17) de Fusarium oxysporum f.

sp. ciceri.

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


135

Croissance mycélienne en cm de FOC1 sur

différents source d'azote.



Croissance mycélienne en cm de FOC3 sur différents

source d'azote.


différentes sources d’azote.



Figure 32. Influence de la source d'azote sur la croissance mycélienne des isolats (FOC1, FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6) de Fusarium



différentes sources d’azote.

Cro

issance m

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ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


136

Croissance mycélienne en cm de FOC 9 sur

différents source d'azotes.

Croissance mycélienne en cm de FOC 10 sur différents

sources d'azote.

Croissance mycélienne en cm de FOC11 sur différents

sources d'azote.

Croissance mycélienne de FOC12 sur différents source

d'azote.

Figure 33. Influence de la source d'azote sur la croissance mycélienne des isolats (FOC7, FOC8, FOC9, FOC10, FOC11, FOC12) de Fusarium


Croissance mycélienne en cm de FOC 7 sur

différents source d'azotes.

Croissance mycélienne en cm de FOC 8 sur différents

source d'azotes.

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

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cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


137

Croissance mycélienne de FOC13 sur différents

sources d'azote.


différents sources d'azote.


différents sources d'azotes.


source d'azote.


différents sources d'azote.

Figure 34. Influence de la source d'azote sur la croissance mycélienne des isolats (FOC13, FOC14, FOC15, FOC16, FOC17) de Fusarium oxysporum

f. sp. ciceri

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


138

Croissance mycélienne de FOC1 sur différents source de

carbone.


de carbone. Croissance mycélienne de FOC3 sur différents source

de carbone.


carbone.


source de carbone.


source de carbone.

Figure 35. Influence de la source de carbone sur la croissance mycélienne des isolats (FOC1, FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6) de Fusarium


Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


139


carbone.


de carbone.


de carbone.


carbone.


de carbone.


de carbone.

Figure 36. Influence de la source de carbone sur la croissance mycélienne des isolats (FOC7, FOC8, FOC9, FOC10, FOC11, FOC12) de Fusarium

oxysporum f. sp. ciceri C

roissan

ce mycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


140


source de carbone.


source de carbone.


source de carbone.


source de carbone.


source de carbone.

Figure 37. Influence de la source de carbone sur la croissance mycélienne des isolats (FOC13, FOC14, FOC15, FOC16, FOC17) de Fusarium oxysporum

f. sp. ciceris

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


141


07différents milieux de culture testés.


différents milieux de culture testés.







Croissance mycélienne en cm de FOC6 sur les7


Figure 38. Influence des milieux de culture sur la croissance mycélienne des isolats (FOC1, FOC2, FOC3, FOC4, FOC5, FOC6) de Fusarium


Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


142

Figure 39. Influence des milieux de culture sur la croissance mycélienne des isolats (FOC7, FOC8, FOC9, FOC10, FOC11, FOC12) de Fusarium




Croissance mycélienne de FOC8 sur les 7 différents

milieux de culture testés.









Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm


143

Croissance mycélienne en cm de FOC 13 sur les 7


Croissance mycélienne de FOC14 sur les 7




Figure 40. Influence des milieux de culture sur la croissance mycélienne des isolats (FOC13, FOC14, FOC15, FOC16, FOC17) de Fusarium






Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Cro

issance m

ycélien

ne en

cm

Résultats et discussion Moyens de lutte

124

1.2.1.3. Discussion des résultats de la caractérisation physiologique

La première observation qui convient de faire à cette étude physiologique est

que le comportement in vitro de 17 isolats étudiés de FOC, est très variable et

instable. La variabilité et l'instabilité se manifeste aussi entre les isolats provenant

d'une même région. L'observation du comportement des 17 FOC étudiés aux

différents facteurs a révélé une hétérogénéité au sein de cette forme spéciale.

1.2.1.3.1. Recherche des conditions optimales

1.2.1.3.1.1. Estimation de la croissance mycélienne

A cause de la richesse du milieu PDA en carbohydrates, ce milieu favorise la

croissance mycélienne que la sporulation (Leslie et Summerell, 2006), c'est pour cette

raison qu'il est utilisé pour l'observation des taux de croissance qui est un caractère

secondaire important pour l'identification des espèces (Nelson et al., 1983; Summerell

et al., 2003).

D'après les résultats obtenus la croissance mycélienne des isolats est

hétérogène, elle varie d'un isolat à un autre. Cette vitesse de croissance semble être

dépendante de la région géographique. Des résultats similaires ont été rapporté par

Belabid, (2003) sur Fusarium oxysporum lentis.

1.2.1.3.1.2. Effet de la température

Nos résultats obtenus au laboratoire indiquent que la température optimale de

17 FOC testé est à environ 30°C. Ce résultat se rapproche beaucoup aux travaux de

plusieurs auteurs qui ont rapporté qu'en boite de Pétri et sur milieu gélosé, la

croissance mycélienne de FOC est optimale à un intervalle de 25°C à 30°C (Walker,

1965; Molot et Mas, 1975; Molot et al., 1990; Bekkar.,2007; Farooq et al.,2005). Ces

mêmes auteurs ont montré que ce champignon ne se développe pas aux températures

voisines de 4°C et 36°C, ce qui confirme nos résultats. Gupta et al., 1986 ont rapporté

des résultats similaires en ce qui concerne la température demandée par le FOC. La

relation de la température du sol a indiqué que la température adéquate pour le


125

développement du flétrissement vasculaire chez le pois chiche se situe entre 25 à

30C° (Chauhan, 1965).

Plusieurs auteurs ont signalé que la croissance de FOC est influencé par la

température (Bhatti et Kraft, 1992; Navas-Cortes et al., 1998; Navas-Cortés et al.,

2000; Landa et al., 2001; Gupta et al., 1987; Westerlund et al., 1974), une

température au tour de 25°C est optimal pour le développement de ce dernier (Sharma

et Muehlbauer, 2007) et à cette intervalle la quantité maximale de la maladie peut être

atteinte malgré une petite densité d'inoculum initial du sol (Navàs-Cortès et al., 2000).

De même, Molot et Mas, 1975, ont rapportés que le pouvoir pathogène était stimulé

par des températures moyennes (22°C).

De plus, le pois chiche est une plante à climat intermédiaire, et le

développement de cette plante a besoin d’une température minimale de 10°C et une

température maximale de 35 °C, au delà de 35 et 10°C sa croissance est ralentie

(Verret, 1982; Girrard, 1985). L’apparition des températures extrêmes entraine des

dégâts irréversibles sur cette culture. Les températures supérieures à 30C°qui se

manifestent durant une période de 3 à 4 jours occasionnent de lourdes pertes du

rendement (Ben Mbarek et al., 2009). Ceci est en parfaite concordance avec les

températures de croissance des souches de FOC isolées. Un climat intermédiaire et

une température au tour de 25°C, souvent le cas pendant le printemps en Algérie,

favorise fortement le développement des plantes des cultures printanières du pois

chiche et l'installation de la maladie de la fusariose. Donc la sélection des variétés

tardives parait judicieuse, ou encore mieux la sélection des variétés résistantes au

froid et à l'anthracnose pour un semi d'hiver.

1.2.1.3.1.3. Effet du pH

Le second facteur abiotique étudié, l'effet du pH s'est révélé comme un facteur

de grande importance pour le développement du champignon. La croissance de FOC

a été obtenue sur tous les niveaux du pH testés, mais elle est maximale sur le PH 5.5.

Ce résultat est en contradiction avec celui signalé par Farooq et al., (2005) qui a

trouvé un pH optimum à environ 7. Les résultats de cette présente étude est en accord


126

avec autres faite par Hayes, (1978). Shaikh, (1974) a signalé que le FOC peut tolérer

une gamme du PH entre 5-6.5.

En (1997), Keller a étudié l’effet du pH sur la croissance de Fusarium

proliferatum, la croissance du champignon était maximale à un PH=5,6.

1.2.1.3.1.4. Effet de l'action de la lumière et de l'obscurité

Contrairement à certaines espèces très exigeantes en lumière pour la

sporulation (Leach, 1962), tous les résultats obtenus montrent que le FOC peut

pousser indifféremment en présence ou en absence de la lumière. La lumière favorise

la maturation des conidies et la germination des spores (Pfohl-Leszkowicz, 2001).

Carlile en (1956) a démontré que la lumière favorise la formation d'un pigment orange

et les microconidies. Cependant l'obscurité favorise la production des pigments rouges

et violettes et les chlamydospores chez les cultures âgées.

1.2.1.3.2. Influence des facteurs nutritionnels sur la croissance de FOC

1.2.1.3.2.1. Effet des milieux de culture

Les champignons sont des microorganismes ubiquistes qui peuvent se

développer sur une grande variété de substrats (Tabac, 2007). Des milieux de cultures

différentes synthétiques et non synthétiques, ont une influence profonde sur les

caractéristiques culturales et morphologiques des champignons (Shaikh, 1974).

Le premier facteur étudié est le milieu de culture, d'après nos résultats le

meilleur milieu de culture est le milieu pois chiche. Des résultats de l'expérimentation

faite par Farooq et al., (2005) ont révélé que le milieu solide Czapeck dox et CSMA

sont les meilleurs pour la croissance radiale de FOC. Khanzada et al., (2003) ont

aussi rapporté des résultats similaires avec M. phaseolina. Bekkar, (2007) a observé

que le milieu le plus favorable pour la croissance de FOC est le PDA alors que, le

milieu Richard semble être le moins favorable. Haware et al., 1986 ont modifié le

milieu Cape Do Agar en ajoutant PCNB, la streptomycine et le vert de malachite, ce

milieu est hautement effectif pour la croissance de Fusarium oxysporum.


127

1.2.1.3.2.2. Effet de la source de carbone

D'après les résultats, le glucose semble être la meilleure source de carbone.

Des résultats faits par Farooq et al., (2005) ont montré que toutes les sources de

carbones testés (glucose, amidon, saccharose) sont convenables pour la croissance du

champignon.

Cependant le glucose semble être la meilleure pour la croissance du

champignon. Le FOC peut convertir certains forme de composé de carbone complexe

vers une forme simple, qui peut être prêt a être métabolisé (Bais et al., 1970).

1.2.1.3.2.3. Efffet de la source d'azote

La peptone était trouvée la meilleur source d'azote pour Fusarium oxysporum

f. sp. ciceri. Farooq et al., (2005) ont obtenu un résultat similaire. Tariq et al., (2003)

ont obtenus une croissance maximale de Botrytis glaiolorum lorsqu'ils ont utilisé le

glucose et le nitrate de potassium. Farooq et al., (2005) ont indiqué que le rôle du

ration C:N est très important. Le FOC colonise les substances organiques dans le sol.

L'augmentation de l'inoculum potentielle et la sévérité de la maladie corrèle

positivement avec la base d'alimentation des substances organiques. Les débris

végétaux servent comme base d'alimentation et peuvent aussi servir comme un pont

d'infection.

2. Recherche de moyens de lutte biologique

2.1. Isolement et étude de la diversité des actinomycètes

2.1.1. Résultats

2.1.1.1. Isolement des actinomycètes

Dans cette étude, les actinomycètes ont été isolés à partir de 10 échantillons

des sols provenant des régions arides du sud algérien.


128

Tableau 20. Nombre des souches d'actinomycètes isolés sur milieu ISP2.

Les souches obtenues ont été isolé sur milieu ISP2 sans antibiotique

(Yamamura et al., 2007; Shirlling et Gottlieb, 1966). Après 7 jours d'incubation à

30°C Les actinomycètes apparaissent et se développent lentement. Elles sont repérées

d'après leur aspect macroscopique caractéristique, puis purifiées afin d'obtenir des

cultures pures pour la conservation. L'isolement des actinomycètes à partir des

échantillons de sols arides sur milieu ISP2 a conduit aux résultats rapportés dans le

Tableau 20. Les résultats présentés font apparaitre que le nombre total de colonies

d'actinomycètes isolés est de 61 souches dont, le plus grand nombre d'actinomycètes a

été isolé à partir de l’échantillon de sol provenant de la région de Knadssa " sol S4 ".

Le tableau 21 résume les pourcentages de l'isolement des actinomycètes à

partir des deux dilutions effectuées 10-3

et 10-4

.

Echantillons Lieu de

prélèvement

Nombre de souches

d'actinomycètes

isolées

Nombre

d'actinomycètes à

activité antifongique

1 Wakda " S11 " 02 00

2 Wakda " S10 " 05 00

3 Knadssa " S4 " 14 09

4 Knadssa " S5 " 02 01

5 Knadssa " S6 " 19 06

6 Knadssa " S7 " 02 00

7 Knadssa " S8 " 01 00

8 Béni-Abbés "S1" 08 02

9 Kali "S2 " 03 00

10 Massine " S3 " 05 00

Total 61 18


129

Tableau 21. Pourcentages d'isolement des actinomycètes à partir des deux dilutions effectuées

Echantillons Régions Dilutions Nombre de

souches isolées

Total

1 Wakda" S11" 10-3

02 02

10-4

00

2 Wakda "S10" 10-3

04 05

10-4

01

3 Knadssa "S4" 10-3

12 14

10-4

02

4 Knadssa "S5" 10-3

02 02

10-4

00

5 Knadssa "S6" 10-3

11 19

10-4

08

6 Knadssa "S7" 10-3

02 02

10-4

00

7 Knadssa "S8" 10-3

01 01

10-4

00

8 Béni-Abbès

"S1"

10-3

08 08

10-4

00

9 Kali "S2" 10-3

02 03

10-4

01

10 Massine "S3" 10-3

04 05

10-4

01

D'après les résultats du tableau 21, le plus grand nombre des souches a été

isolé à partir de la dilution 10-3

environ 78.68 % des souches. Le reste des souches a

été isolé à partir de la dilution 10-4

.


130

2.1.1.2. Caractéristiques des actinomycètes isolés

Les souches d'actinomycètes isolées présentent des caractéristiques

macroscopiques différentes: couleur des colonies, couleur du dos de la boite et aspect

des colonies (Figure 41). Ce résultat indique que les sols arides du sud algérien, bien

qu'étant sous l'influence d'un climat sec et aride, sont loin d'être des sols pauvres en

microorganismes et sont une source riche en actinomycète quantitativement et

qualitativement.

2.1.2. Discussion

Le résultat obtenu par cette étude qui montre que le plus grand nombre

d'actinomycètes a été isolé à partir de la dilution 10-3

est en accord avec celui obtenu

par Kitouni, (2007) lors de ces travaux sur la diversité des actinomycètes isolés à

partir des sols arides du sud algérien.

Figure 41. Quelques aspects des actinomycètes isolés à partir des sols arides du sud algérien

(Bechar et Timimoune)


131

Des travaux de recherches ont été réalisés à partir du sol de Béni Abbès, prise

comme modèle d'étude, mais aussi, au niveau de plusieurs autres régions du sud

algérien ont montré la diversité et la richesse de cette région en actinomycètes

antagonistes, ces dernières sont stimulées par la rhizosphère du palmier dattier

(Sabaou et al., 1998). De même, Khamna et al., (2009) ont rapporté qu'il est possible

que les exsudats des plantes améliorent la croissance des Streptomyces sp., qui à leur

tour synthétisent des composés antimicrobiennes. Germida et al., (1998) ont rapporté

que la diversité d’une communauté microbienne dans un environnement spécifique

dépend des espèces des plantes trouvées.

D’autres facteurs importants ont été également cités par d’autres chercheurs

contrôlant ainsi l'abondance et l'activité des actinomycètes dans un sol. Parmi ces

facteurs, la disponibilité des éléments nutritifs, la nature et l'abondance de la matière

organique, la salinité, la composition en humidité relative, la température, le pH et la

végétation du sol (Goodfellow et Williams, 1983; McCarthy et Williams, 1990). Xu et

al., (1996) ont trouvé que la population des actinomycètes présents dans les régions

froides de la Chine est constituée de plus de 83% du nombre total de la microflore du

sol. Le nombre des actinomycètes a été relié au type du sol et aux conditions

édaphiques (Barakate et al., 2002). En effet, Crawford et al., (1993) ont rapporté que

les sols rhizosphériques présentent une population d’actinomycètes supérieure deux à

trois fois que celle des sols non rhizosphérique.

Cette diversité a été rapportée par plusieurs auteurs qui ont travaillé sur cette

région (Sabaou et al., 1980, 1992 et 1998; Kitouni, 2007; Zitouni et al., 2005).

D’ailleurs, Zitouni et al., (2005) ont rapporté que les sols de sud algérien sont exposés

a un climat aride et représente de ce fait un écosystème particulier. Ce type

d’écosystème peut représenter un réservoir important en microflore d’intérêt

biotechnologique. Sabaou et al., (1998) ont rapporté que les sols sahariens d’Algérie

constituent un écosystème assez particulier en raison de l'environnement aride et

mériteraient d'être exploités dans le domaine de la recherche des micro-organismes

capables d’être utilisé comme agents de lutte biologique contre les maladies fongiques


132

des plantes, notamment contre l'agent responsable de la fusariose du palmier dattier

(Sabaou et Bounaga, 1987).

Des genres d’actinomycètes parfois assez rares dans le monde, ont été isolés

en nombre important et dont plusieurs sont producteurs d'antifongiques à large spectre

d'action (Boudjella, 1994; Zitouni, 1995). D’après, cette contribution ainsi que les

travaux de certains équipes algériennes, Il semble que l'Algérie présente beaucoup

d'environnement non exploités, comme la rhizosphère des plantes endémiques, les

sols de déserts, les sols des montagnes, l'eau de mer et l'eau de la sebkha.

2.2. Etude du phénomène d'antagonisme FOC/Actinomycètes

2.2.1. Résultats

2.2.1.1. Test de confrontation directe

L'ensemble de la collection d'actinomycètes a été testé afin de mettre en

évidence l'activité antifongique des souches isolées vis-à-vis de FOC, par la technique

de confrontation directe, cette technique est une méthode de diffusion en milieu

gélosé et elle a été choisie pour une première sélection car elle est plus simple et

rapide que le test de cylindre d'agar ou autres. Elle nous a permis de détecter l'effet

inhibiteur de toute la collection d'actinomycètes obtenue (61 souches) vis-à-vis des 03

isolats de FOC représentatives de 03 régions qui sont Tlemcen (FOC8), Ain

Temouchent (FOC15) et Mostaganem (FOC13).

Les souches d'actinomycètes qui n'ont pas présentées une activité antifongique

vis-à-vis le FOC et dont le pourcentage d'inhibition est inferieur à 20% ont été

éliminées. Les autres ont été retenues pour calculer le taux d'inhibition. Seulement 06

souches d'actinomycètes ont présenté un pourcentage d'inhibition non négligeable.

Ces dernières ont été retenues pour des tests ultérieurs. Il en ressort des résultats de

tableau 20 que sur les 61 isolats d'actinomycètes, seules 18 actinomycètes soit 29.50%

sont actives sur au moins un des isolats de FOC étudié. 70.5% des actinomycètes

isolés n'ont montré aucunes activités antifongiques vis-à-vis les 03 isolats de FOC en

utilisant le milieu gélosé PDA comme milieu de production.


133

Tableau 22. Pourcentage d'inhibition des 06 isolats d'actinomycètes sur les 03 FOC

Souche Région Pourcentage d'inhibition en % Moy.

FOC15 FOC13 FOC8

ACT1 Knadssa "S4" 32.4% 37.5% 22.95% 30.95%

ACT2 Béni Abbés "S1" 46.66% 58% 21% 41.88%

ACT3 Knadssa "S4" 24% 56% 15.55% 31.85%

ACT4 Knadssa "S4" 33.33% 20% 11.11% 21.48%

ACT5 Knadssa "S4" 35.2% 20% 30.37% 28.52%

ACT6 Knadssa "S4" 58.1% 19.2% 18% 31.76%

D'après les résultats du tableau 22, la souche ACT6 isolée du sol de Knadssa

"S4" a montré une activité contre un seul isolat de FOC (FOC15). Les souches ACT3

et ACT4 isolées du sol de Knadssa S4 inhibent seulement 02 FOC (FOC13 et

FOC15).

Par contre les 03 souches ACT1 et ACT5 isolées du sol de Knadssa S4 et la

souche ACT2 isolée à partir du sol de Béni-Abbès S1 inhibent les 03 isolats de FOC

testés. La moyenne la plus grande du taux d'inhibition a été produite par la souche

ACT1 (58.1%). Cependant la moyenne la plus faible a été produite par la souche

ACT4 (11.11%).

Figure 42. Pourcentages d'inhibition par série de couleurs d'actinomycètes.

40%

30%

20%

10%

00%


134

Les données présentées par la figure 42 montrent aussi que les pourcentages

d'inhibition par série de couleur sont presque égale, il est de 31.35% pour la série des

blanches, de 26.66% pour la série des grises et de 35.2% pour la série des beiges. Les

isolats qui ont des taux d'inhibition élevés sont les séries de beige suivi par la série des

blanches, ensuite la série des grises. En effet nous avons remarqué que les souches de

la même série présentent des pourcentages d'inhibition très différents

L'activité antagoniste des actinomycètes testés vis-à-vis des 03 isolats de FOC

est différente, nous avons observé une inhibition des 02 isolats de FOC provenant de

Mostaganem et de Ain Témouchent (FOC13 et FOC15), par contre, nous avons

observé une tolérance de l'isolat FOC8 provenant de la région de Tlemcen.

2.2.1.2. Test des filtrats

L'implication des composés antifongiques produits par les actinomycètes dans

l'inhibition in vitro de la croissance mycélienne de FOC (Fusarium oxysporum f. sp.

ciceri) a été confirmée ensuite par l'action des filtrats de culture et la technique des

puits. Les deux techniques nous ont permis de détecter l'effet inhibiteur des souches

testées vis-à-vis des 03 isolats de Fusarium oxysporum f. sp. ciceri utilisés.

Les 06 souches présentant les meilleurs taux d'inhibition, ont été ensuite

soumises au test de filtrat. Cette technique a été introduite dans ce screening afin de

rechercher l'action des filtrats des souches pré-sélectionnées sur l'inhibition des

isolats de FOC par les antifongiques élaborés par les actinomycètes du sol.

L'incorporation des filtrats dans le milieu PDA a pour but d'essayer de distinguer entre

les filtrats actifs et non actifs.

FOC13

ACT5

ACT6 FOC15 FOC8 ACT2

Figure 43. Résultats du test de confrontation entre les isolats de FOC et les souches d'actinomycètes :

A: FOC13/ACT5; B: FOC15/ACT6; C: FOC8/ACT2.

A B C


135

Tableau 23. Diamètre d'inhibition de FOC par les filtrats des 06 actinomycètes sélectionnés

Diamètre en mm

du témoin

Diamètres en

mm de FOC15

Diamètres en mm

de FOC13

Diamètres en mm

de FOC8

5 5.1 6.2

ACT1 2.5 3.7 4.5

ACT2 2.8 3.5 4.1

ACT3 2.8 4 4.3

ACT4 2.8 4.2 4.3

ACT5 3.2 4.2 4.4

ACT6 2.4 4.3 3.9

Le tableau 23 montre que tout les filtrats inhibent la croissance des conidies

des 03 isolats de FOC ce qui n'est pas le cas pour le premier test. Les diamètres

varient de 2.4mm à 3.2mm pour FOC15 et de 3.5mm à 4.3mm pour FOC13 et de 3.9

mm à 4.5 mm pour FOC8 (figure 44).

L'ensemencement d'un inoculum d'un isolat de FOC inhibé par les filtrats de

culture des actinomycètes dans une autre boite contenant du PDA stérile, a montré

que l'isolat s'est développé normalement. Ce test nous a indiqué que la substance

diffusible a une action fongistatique.

ACT5 FOC13 FOC15 ACT4 ACT1 FOC8

Figure 44. Résultats du test de filtrat entre les isolats de FOC et les souches d'actinomycètes : A:

FOC13/ACT5; B: FOC15/ACT4; C: FOC8/ACT1.

A B C


136

2.2.1.3. Test de puits

Cette technique est une méthode de diffusion en milieu gélosé. Les résultats

de l'inhibition sont regroupés dans la figure 46. L'emploi du test des puits n'ayant pas

donné une entière satisfaction, sauf quelques inhibitions après de dizaines de

répétions. Il a été nécessaire d'introduire une autre technique basée sur l'étude de

l'activité de l'extrait obtenue par la souche ACT2.

2.2.1.4. Test des disques

L'étude de l'extrait préparé après culture sur milieu liquide ISP2 de la souche

d'actinomycète ACT2 s'est révélée fiable. Il est préférable, en ce qui concerne

l'analyse des extraits et des surnageant, d'enregistré le pH et l'effet du solvant utilisé

afin d'éliminer les interférences dues au pH et au solvant. Les résultats sont présentés

par la figure 46.

L'extrait de filtrat inhibe les 03 isolats de FOC. Le diamètre d'inhibition varie

du 1.1cm pour l'isolat FOC13, de 1.2cm pour l'isolat FOC15 et de 0.9cm pour l'isolat

FOC8.

ACT3 FOC13 FOC15 ACT1 ACT6 FOC8

Figure 45. Résultats du test des puits entre les isolats de FOC et les 06 souches d'actinomycètes : A: FOC13/ACT1; B:

FOC15/ACT2; C: FOC8/ACT3.

A B C


45

2.2.2. Discussion

2.2.2.1. Test de confrontation

Le pourcentage des souches d'actinomycètes inhibant le champignon est

confirmé par plusieurs auteurs qui ont trouvées des pourcentages presque égale a

celui cité par cette étude (Saadoun et Al-Momani, 1997; Ndonde et Semu, 2000;

Barakate et al., 2002), cependant autres auteurs ont trouvé des pourcentages moins

élevées (Rovasz, 1986; Saadoun et al., 1998). Les souches d'actinomycètes qui n'ont

pas montré une activité vis-à-vis le FOC, il est probable qu'elles produisent d'autres

composés notamment antibactériennes contre d'autres microorganismes non testés

(Barakate et al., 2002). En effet, Porter, (1971) a signalé que probablement tout les

Streptomyces possèdent des propriétés antibactérienne si leur conditions sont prise en

considération durant la culture des ces microorganismes. Dans la plupart des cas la

capacité antagoniste des bactéries utilisées dans la lutte est déterminé juste contre un

ou quelques isolats du pathogène (Landa et al., 1997).

Les pourcentages d'inhibition trouvé sur milieu PDA sont élevés, ce qui rend

le milieu PDA un milieu favorable pour la production et la diffusion d'antifongique

produit (Jayasinghe et Parkinson, 2008).

Les Streptomyces appartenant à la même série de couleur peuvent être de

même espèce mais produisent des molécules bioactives différentes ou bien sont des

espèces différentes (Barakate et al., 2002).

Dans cette présente étude les différences dans la réponse des isolats de FOC

aux produits élaborés par les actinomycètes sont similaires à ceux trouvé par Landa et

Figure 46. Résultats du test des disques imbibés entre les 03 isolats de FOC et la souche ACT2 d'actinomycète :

A: ACT2/FOC13; B: ACT2/FOC15; C: ACT2/FOC8

FOC8 FOC15 FOC13

ACT2 ACT2 ACT2

C

B

A


46

al., (1997) en utilisant des bactéries Pseudomonas et des Bacillus et ils ont expliqué

ce résultat par la différence dans les races de FOC.

La tolérance de l'isolat de Tlemcen (FOC8) aux antifongiques des 06

actinomycètes testés semble être la cause de la virulence élevée de cet isolat. Des

résultats similaires ont été obtenus par Dubey et al., (2007) en utilisant Trichoderma

sp. contre le FOC race 5, cette race est la plus virulente de FOC et résiste à la plupart

des antifongiques (Hervas et al., 1995) ou peut être à cause de la croissance rapide de

cette isolat. Jayasinghe et Parkinson en 2008 ont signalé que les genres du

champignon qui ont une croissance rapide sont plus tolérants aux actinomycètes que

les lentes. Les actinomycètes sont généralement à croissance lente et les champignons

à croissance rapide peuvent bloquer l'inhibition (Jayasinghe et Parkinson, 2008). En

plus les champignons à croissance rapide et qui sont antagonistes développent une

résistance élevée pour se protégé de l'autolyse et cela peu expliquer leur résistance.

Les métabolites de différentes espèces d'actinomycètes ont été rapportés d'être

active contre le Fusarium spp. et autres phytopathogènes (Kavitha et al., 2010). Des

résultats in vitro ont indiqué que les actinomycètes inhibent la croissance du

champignon en utilisant des composés antifongiques ou par l'hyper parasitisme

(Jayasinghe et Parkinson, 2008) ou par la production de siderophores qui sont

impliqué dans la suppression de plusieurs formae speciales de F. oxysporum (Scher et

Baker, 1980;1982; Sneh et al., 1984; Elad et Baker, 1985; Kumar et Dube, 1992;

Duijff et al., 1993; Kumar,1990; 1996; 1998), ou à travers la production des enzymes

qui dégradent la paroi cellulaire du champignon (El-tarabily et al., 2000; Errakhi et

al., 2007; Getha et al., 2005; Goodfellow et Williams, 1983).

Ces résultats indiquent que peut être une production d'un antifongique seul est

impliquée dans l'inhibition de la croissance mycélienne de FOC ou peut être un des

mécanismes contrôlant ce pathogène, en se basant sur les arguments suivant:

- Pour les 06 souches sélectionnées aucun contact direct n'a été établi entre le

mycélium fongique et les colonies bactériennes des actinomycètes, donc


47

l'inhibition de la croissance mycélienne de FOC a été à travers une substance

qui diffuse dans l'agar du milieu.

- Le milieu PDA utilisé dans ce test est riche en nutriment et une compétition

des nutriments est à exclure.

- L'antibiose est un mode très connus d'antagonisme observé chez les

Streptomyces.

Si on affirme suite aux arguments cités précédemment que les souches testées

cultivées sur PDA libèrent un métabolite extracellulaire qui inhibent la croissance des

03 isolats de FOC, le potentiel antagoniste, implique la production des composés

antifongiques, cette production d'antifongique a été rapporté par plusieurs auteurs

(Crawford et al., 1993; Ouhdouche et al., 2001). Yuan et Crawford , (1995) ont

rapporté l'activité antifongique in vitro de Streptomyces lydicus contre Pythium

ultimum et Rhizoctonia solani, Anitha et Rebeeth, (2009) ont rapporté l'inhibition des

pathogène: Fusarium oxysporum, Fusarium solani, et Rhizoctonia solani et Alternaria

alternata in vitro par Streptomyces griseus. Les Streptomyces inhibent le Fusarium

sp. (F. oxysporum et F. solani) (Sacramento et al., 2004). Paul et Banerjee, (1986) ont

montré que les antibiotiques solubles produits par Streptomyces galbus peuvent

inhiber la germination de Alternaria solani, Aspergillus niger, Curvularia pallescens,

Helminthosporium oryzae. De plus, la croissance mycélienne de C. eragrostides et C.

gloeosporioides a été aussi inhibé par les cultures d'actinomycètes lorsqu'elles se

développent en parallèle sur PDA (Soares et al., 2006). Autres résultats présentés par

Kathiresan et al., (2005) ont indiqué l'efficacité des souches d'actinomycètes marine

in vitro notamment du genre Streptomyces sur l'inhibition de Pyricularis oryzae qui

attaque le Riz. De même Landa et al., 1997 ont montré qu'environs 32% de bactéries

isolées à partir de la rhizosphère du pois chiche inhibent in vitro la croissance de

FOC.

Il existe plusieurs hypothèses qui peuvent expliquer la production

d'antibiotique, mais la plus acceptée est que la molécule antimicrobienne aide

l'organisme à la compétition avec d'autres vis à vis des nutriments dans le sol en

réduisant la compétition (Aghighi et al., 2004).


48

2.2.2.2. Test des filtrats de culture

Les filtrats inhibent la croissance des conidies des 03 isolats de FOC ce qui

n'est pas le cas pour le premier test de confrontation. Cela peut être due à la

composition du milieu utilisé pour l'extraction qui est le ISP2 pour ce test qui a peut

être favorisé la production de métabolite.

les résultats de l'inhibition de FOC par les filtrats de culture sont similaires à

ceux trouvé par Landa et al., (1997) en utilisant des Pseudomonas et des Bacillus. Ces

résultats sont aussi en accord avec d'autres (Yang et al., 2007), qui ont étudié la

capacité in vitro des filtrats de culture de Penicillium oxalicum souche PY- dans le

contrôle de l'infection par Scertinia sclertiorum sur les plantes de Colza, et Khamna et

al., (2009) qui ont étudié la capacité in vitro des filtrats de Streptomyces sp. CMU-PA

dans le contrôle de l'infection par Alternaria porri.

D'après les résultats obtenus du test de filtrat et des puits les 06 souches

d'actinomycètes produisent des molécules bioactives sur le milieu ISP2, qui diffère du

PDA dans la composition en nutriment (PDA milieu naturelle/ ISP2 milieu

synthétique) et la contenance en agar (PDA gélosé, ISP2 liquide). Les résultats de ce

test montrent des différences dans l'activité par rapport au test de confrontation, cela

peut être à cause de la différence dans la composition et la période d'incubation et la

densité d'inoculum et la technique. Des résultats obtenus par plusieurs auteurs ont

indiqué que la composition en nutriments a un effet sur les activités des

microorganismes à cribler (Sivasithamparam et Parker, 1980; Whipps, 1987). Singh et

al., 2006 ont indiqué que quelques souches d'actinomycètes n'ont aucune activité

lorsqu'elles sont transférées du milieu gélosé vers un milieu liquide.

2.2.2.3. Test des disques

Le résultat du test de l'activité de l'extrait brut est similaire avec celui trouvé

par Khamna et al en (2009) qui ont rapporté que l'extrait brut de Streptomyces sp.

CMU-PA a la capacité d'inhiber la croissance mycélienne de Aspergillus porri .


49

2.3. Identification des actinomycètes pré sélectionnées

2.3.1. Résultats

2.3.1.1. Etude des caractères culturaux

Les critères généraux utilisés pour l'identification des actinomycètes sont: la

morphologie du mycélium aérien et de substrat, la morphologie des spores, la

production des pigments diffusibles, la production de la mélanine et l'utilisation des

sources de carbone et d'azote (Simon et al., 1999).

Après ensemencement sur 03 milieux de culture différents (Sabouraud, ISP2

et gélose nutritive), les colonies des souches ACT1, ACT2, ACT3, ACT4, ACT5,

ACT6 apparaissent au bout de 4 jours d'incubation à 30°C et se développent sur les

trois milieux gélosés. Tous les isolats se développent sur les milieux de culture

gélosés montrant ainsi des morphologies typiques des Streptomyces. Ces souches sont

des bactéries à Gram+ (Figure 47), aérobies, rondes à contour irrégulier, opaque,

pliées et à croissance lente, à bonne sporulation, à grande compacité. Les colonies

adhèrent fermement au milieu de culture où elles forment une légère dépression et

sont difficiles à prélever et à mettre en suspension. Ils sont menées d'un mycélium

aérien et de substrat de couleurs différentes et sont d'aspect corné et de surface

poudreuse, en plus toutes les colonies possèdent une odeur de terre, fraîchement

remuée correspondant probablement à la géosmine, et sont productrices

d'antibiotiques. Les caractéristiques culturales, et morphologiques de différentes

souches de Streptomyces sont présentées dans le Tableau 24.

Figure 47. Coloration de Gram+

de la souche

ACT2 Observée au microscope optique x1800


50

Toutes les souches se développent sur les 03 milieux de cultures utilisés avec

différents degrés de croissance, allant d'une croissance faible à une croissance

abondante. La couleur du mycélium de substrat et aérienne varie selon les isolats :

l'isolat ACT2 produit un pigment marron sur Sabouraud et ISP2. La croissance la plus

abondante, pour les 06 souches étudiées a été observée sur le milieu (ISP2), elle est

moyenne sur le milieu (sabouraud). Le milieu (GN) est le milieu le moins favorable

pour la croissance des 06 souches d'actinomycètes.

Sur le milieu ISP2, la souche Streptomyces ACT1 est de contour irrégulier, la

surface des colonies est poudreuse, de couleur blanche ce qui nous a permis de la

classer dans la série des blanches, proposée par Shirling et Gotlieb, (1966). L'envers

des colonies est beige sur milieu ISP2 et absence de production de pigments

diffusibles.

La souche Streptomyces ACT2 montre une croissance moyenne sur ISP2 et

GN, et une croissance faible sur Sabouraud. Elle est d'aspect bosselées, compactées et

très sèche. La couleur du mycélium aérien apparait beige sur ISP2, ce qui nous a

permis de la classer dans la série des beiges, proposée par Shirling et Gotlieb, (1966).

Cependant, le mycélium de substrat est vert olive, la souche produit un pigment

marron diffusible sur ISP2. Cette souche se développe très lentement sur milieu ISP2

par rapport aux autres souches (5 à 6 jours) après ensemencement.

Les colonies de la souche Streptomyces ACT3 sont à croissance importante

sur les milieux ISP2 et Sabouraud, avec des colonies très petites, elles se développent

sous forme de colonies détachables, opaques. Le mycélium de substrat est abondant,

bien développé de couleur grise au centre à blanche de côté, ce qui nous a permis de

la rattacher à la série des grises proposée par Shirling et Gotlieb, (1966). La couleur

de mycélium de substrat est vert olive sur milieu ISP2, absence de production de

pigments diffusibles.

Les colonies de la souche Streptomyces ACT4 sont compacte non détachables,

à croissance abondante sur ISP2 et GN, la couleur du mycélium aérien est grise, ce

qui nous a permis de la classer dans la série des grise proposée par Shirling et Gotlieb,


51

(1966), et de substrat vert olive sur ISP2, absence de production de pigments

diffusibles.

Les colonies de la souche Streptomyces ACT5 sont des colonies petites

détachables, à croissance importante sur ISP2 et sabouraud, le mycélium aérien est de

couleur blanche, ce qui nous a permis de la classer dans la série des blanches proposée

par Shirling et Gotlieb, 1966; cependant le mycélium de substrat est de couleur beige

sur ISP2, absence de production de pigments diffusibles.

Tableau 24. Caractères culturaux des souches: ACT1, ACT2, ACT3, ACT5 et ACT6 après 14 jours

d'incubation à 30°C.

Milieux /Souches ACT1 ACT2 ACT3 ACT4 ACT5 ACT6

GN

Croissance moyenne faible moyenne abondante moyenne abondante

Couleur de

mycélium

aérien

Blanc beige gris gris beige blanc

Couleur de

mycélium

de substrat

beige beige Vert olive Vert olive beige blanc

Mélanine - - - - - -

Sab.

Croissance moyenne faible abondante moyenne abondante abondante

Couleur de

mycélium

aérien

beige beige gris beige blanc blanc

Couleur de

mycélium

de substrat

beige beige Vert olive beige Blanc blanc

Mélanine - + - - - -

ISP2

Croissance abondante moyenne abondante abondante abondante abondante

Couleur de

mycélium

aérien

blanche beige Gris et

blanc de

côté

gris blanc beige

Couleur de

mycélium

de substrat

beige beige Vert olive beige beige beige


52

Mélanine - + - - - -

Type de sporophore crochet droit spirale spirale spirale spirale

La souche Streptomyces ACT6 est à croissance importante sur les 03 milieux

ISP2, Sabouraud et GN, elle présente des colonies très petites, non détachables,

opaques. Le mycélium de substrat est abondant, la couleur du mycélium aérien et de

substrat est beige et absence de production de pigments diffusibles, ce qui nous a

permis de la classer dans la série des beiges proposée par Shirling et Gotlieb, (1966).

Les isolats de Streptomyces sont reconnue par 05 séries de couleurs (Blanc,

gris, rouge, bleu, variable: du violet-orange ou rose). Selon la couleur du mycélium

aérien sporulé et mature (Shirling et Gottlieb, 1966).

Dans ce présent travail, les 06 isolats de Streptomyces ont été distribués en

séries selon la couleur de leur mycélium aérien mature. 02 isolats ont été trouvé

appartenant à la série des grises (ACT3 et ACT4), 02 isolats autres appartiennent à la

série des blanches (ACT1 et ACT5), et enfin les souches ACT2 et ACT6

appartiennent à la série des beiges.

2.3.1.2. Observations microscopiques

L'examen microscopique au microscope optique (x10) des 06 souches retenues

révèle l'appartenance des 06 souches à la famille des Streptomyceraceae. La

morphologie de sporophores des souches ACT3, ACT4, ACT5 et ACT6 (figure 48)

est de type spirale, ce qui les place dans le groupe des spires de la famille des

Streptomycetaceae et le genre de Streptomyces. La morphologie des sporophores de la

souche ACT1 est en crochet alors que le type de sporophore de la souche ACT2 est

droit (figure 48).


53

2.3.2. Discussion

2.3.2.1. Etude des caractères culturaux

les caractéristiques culturales observées sur les 03 milieux de cultures sont les

mêmes décrits par plusieurs auteurs caractérisant le genre Streptomyces (Anderson et

Wellington, 2001; Locci, 1989; Wendisch et Kutzner, 1991; Williams et al., 1989; Lo

et al., 2002).

D'après les résultats du tableau 24, les 06 isolats présentent les mêmes

caractéristiques décrit par plusieurs auteurs (Shirlling et Gottlieb, 1966; Williams et

al., 1989) (Williams et al., 1983). Les différences de couleur du mycélium aérien des

isolats et la production ou non des pigments est une indication de la diversité des

Streptomyces isolées. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Barakate et

al., (2002).

La production du mélanine est conditionnée par la composition en éléments

nutritifs dans le milieu notamment, la source de carbone et d'azote (Venkatesan et al.,

2008). Parfois, il est difficile de déterminer ce pigment surtout quand il s’agit d’un

milieu organique complexe (Venkatesan et al., 2008; Dasger et al., 2006). La

pigmentation chez les Streptomyces permet une distinction entre les différentes

espèces de ce genre (Dasger et al., 2006).

2.3.2.2. Observation microscopique

Les résultats de l'observation microscopiques des sporophores se rapprochent

de ceux observés par (Pridham et al., 1958; Williams et al., 1983; Anderson et

C

Figure 48. Observation microscopique des colonies d'actinomycète à l'aide du microscope optique:

A: observation microscopique d'une colonie de Streptomyces (x250) montrant des filaments courts à

la surface des colonies; B: un sporophore de type droit (x250); C: des sporophores de type spirale

x250.

B A


54

Wellington, 2001; Locci, 1989; Wendish et Kutzner, 1991; Williams et al., 1989;

Oskay et al., 2004). L’absence des autres genres d’actinomycètes dans nos isolements

est probablement due au milieu de culture utilisé, qui est le milieu ISP2, connue pour

leur utilisation pour l'isolement des Streptomyces (Shirling et Gotlieb, 1966). De plus,

selon la littérature disponible, la composition en espèces d'actinomycètes dans la

rhizosphère des plantes est principalement déterminée par les paramètres des

échantillons de sol. Cependant, l'abondance des espèces particulières dépend

largement des espèces de plantes (Kalakutskii et Sharaya, 1990). De même, plusieurs

auteurs ont rapporté que le genre Streptomyces compte environ 95% des

actinomycètes du sol (Lacey, 1973; Elander, 1987). Sabaou et al., (1998), ont

constaté que le genre Streptomyces prédomine dans la majorité des sols du sud

algérien (80 à 90% du total). De plus, les 06 souches sélectionnées ont été isolées en

utilisant des dilutions correspondant 10-3

et 10-4

, ce qui augmente les chances d'isoler

les espèces de Streptomyces (Preobrazhenskaya et al., 1978; Cross, 1982).

Il est possible que les excrétions des racines des plantes du site de

prélèvements des échantillons du sol ont induit la présence des Streptomyces

producteurs d'antibiotique, car différents espèces et variétés des plantes produisent

différents types d'exsudats cellulaires, qui peuvent stimuler l'activité des

microorganismes pour la production des antifongiques (Lemanceau et al., 1995;

Wiehle et al., 1996).

Les méthodes traditionnelles utilisées pour l'identification des actinomycètes

aérobies filamenteux est laborieuse, nécessite du temps et demandent souvent des

séries de tests spécialisés (Steingrube et al., 1995;1997; Wilson et al., 1998; Harvey et

al., 2001), en plus, cette détermination ne peut pas identifier le genre précis de l'isolat

(Lechevalier, 1989).

2.4. Essai d'extraction et de séparation de la molécule antibiotique produite par

la souche ACT2

2.4.1. Résultats

Le métabolite active a été extrait par le n-butanol qui apparait d'être le

meilleur extractant selon plusieurs auteurs (Gupte et Naik, 1999; Lazaro et al., 2002;


55

Atta et al., 2009; Khamna et al., 2009; Boudjella et al., 2006). La phase organique a

été collectée et évaporé en utilisant un rotavapeur à 50°C. La séparation de l'agent

antimicrobien en composé individuelle a été réalisée par CCM, 05 taches ont été

apparues. Le rendement de l'extraction est de 0.683 gr à partir de 2.5l du milieu ISP2

liquide, et il est de couleur marron jaunâtre. Ce rendement est très faible pour séparer

la molécule par colonne.

2.4.2. Discussion

En effet, Kavitha et al., (2010) ont obtenue un rendement de 1.8 gr, en

utilisant (25l) du milieu de culture ce rendement est très faible en comparaison avec

celui obtenue par cette étude. Cependant, Khamna et al., (2009) ont obtenue 0.781g

en utilisant 500ml du milieu de culture, ce rendement apparait d'être plus élevé que

celui obtenue par la souche ACT2. Ce faible rendement est due peut être à la souche

elle-même qui ne produit pas beaucoup d'antibiotique, ou bien au milieu utilisé pour

la fermentation qui est le ISP2. En effet, plusieurs auteurs ont utilisé autres milieux

(Khamna et al., 2009; Ouhdouche et al., 2001). Ouhdouche et al., (2001) ont rapporté

que le milieu benett's est le plus approprié à la production de molécules bioactives par

les Streptomyces. Plusieurs auteurs ont rapporté que la température de croissance chez

les Streptomyces diffère de la température du production de métabolites (Iwai et

Omura, 1992; Hussain et al., 1986). Il nous reste a démontré la nature des 05 taches

obtenues si elles correspondent au 05 composés actives contre le FOC ou seulement

un ou plus sont actives.

Figure 49. Résultat de la séparation de l'extrait brut de

l'isolat ACT2


56

2.5. Essai de la lutte biologique sous serre

2.5.1. Résultats

Les résultats obtenus après 40jours de l'inoculation de 03 cultivars (ILC-482,

Col-27 et PPC-25) par la souche Streptomyces ACT2, suivi par l'inoculation de 03

isolats de FOC (FOC8, FOC13 et FOC15) après 48h de la première inoculation sont

présentés dans le tableau 25. Les figures50, 51 et 52 montrent la réduction des

symptômes observés chez les 03 cultivars sous serre en utilisant la souche

Streptomyces ACT2 en comparaison avec les témoins inoculés uniquement par le

pathogène et les témoins non inoculés.

Tableau 25. Degrés de suppression de la maladie par la souche ACT2 en utilisant les 3 variétés du pois

chiche

Variétés du pois chiche

ILC-482 Col-27 PPC-25

T

inoculé

FOC

+ACT2

DSM

(%)

T

inoculé

FOC

+ACT2

DSM

(%)

T

inoculé

FOC+

ACT2

DSM

(%)

FOC8 74.95% 69.81% 05.14 39.49% 11.97% 27.78 38.70% 14.15% 24.55

FOC13 82.75% 61.55% 21.20 34.16% 36.30% 00 52.32% 39.74% 12.58

FOC15 38.76% 41.21% 00 51% 37.72% 13.28 31.38% 12.16% 19.22

DSM: Degré de la suppression de la maladie par la souche Streptomyces ACT2.

D'après les résultats obtenus, le degré de la suppression de la maladie par

ACT2 varie d'un cultivar à un autre et d'un isolat de FOC à un autre. Il varie de 00 à

21.2% chez le cultivar ILC- 482, de 00 à 27.78% chez le cultivar Col-27et de 12.58%

à 24.55% chez le cultivar PPC-25. Le maximum de la suppression de la maladie a été

obtenu chez le cultivar Col-27 en utilisant l'isolat FOC8. La souche ACT2 a présenté

des degrés de suppression de la maladie plus élevés chez les deux cultivars Col-27

(13.68%) et PPC-25 (18.78%) modérément sensibles que le cultivar sensible ILC-482

(8.76%). Le degré de la suppression de la maladie par isolat de FOC varie, il est de

19.15% pour FOC8, 11.26% pour FOC13 et 10.83% pour FOC15.


57

2.5.2. Discussion

La lutte biologique est une alternative appropriée surtout pour le contrôle des

phytopathogènes d'origine tellurique comme le FOC (Dubey et al., 2007). Landa et

al., (1997) ont rapporté que le flétrissement vasculaire du pois chiche est mieux

contrôlé par l'utilisation des cultivars résistant race – spécifique.

L'efficacité de cette méthode de lutte contre les races virulentes du pathogène

de FOC peut être amélioré par l'utilisation des microorganismes antagoniste. Le but

de ce travail est de savoir si l'isolat Streptomyces ACT2 sélectionné suite à la

première étape de sélection in vitro est capable d'éliminer ou de réduire le

flétrissement vasculaire chez les 03 cultivars du pois chiche sensibles et modérément

sensibles envers 03 isolats de FOC testés sous les conditions de la serre (in vivo = in

planta). La suppression des maladies telluriques par les microorganismes antagonistes

(champignons, bactéries) in vivo a été rapporté par pusieurs recherches qui ont

confirmé l'efficacité de cette méthode de lutte dans la protection des culture à

importance économique.

A titre d'exemple des champignons utilisés en lutte biologique comme:

Talaromyces flavus, Ghocladum sp., Trichoderma spp., Aspergillus giganteus,

Penicillium chrysogenum et des bactéries comme: Bacillus subtilis, Pseudomonas

spp. et les Streptomyces sp. ont montré une activité contre plusieurs phytopathogènes

(De Boer et al., 2003; Whipps, 2001), notamment contre les flétrissements vasculaires

causés par les différentes formae speciale de Fusarium oxysporum . Kumar, (1999) a

étudié la suppression de FOC en utilisant deux isolats: Pseudomonas fluerescens

RBT13 productrice de siderophores et Bacillus subtilis AF1 productrice

d'antibiotique. De même, Kaur et al., (2007) ont montré que les Pseudomonas isolées

à partir de la rhizosphère d'une culture du pois chiche saine sont tous antagonistes de

FOC. Dijksterhuis et al., (1999) ont montré que Paenibacillus polymyxa est capable

de supprimer le Fusarium oxysporum sous serre. Da Silva et al., (2005) ont indiqué

l'efficacité du contrôle du flétrissement vasculaire de la tomate par l'utilisation de F.

oxysporum non pathogène contre le F. o. f. sp. lycopersici race 2. Saravanan et al.,

(2004) ont étudié l'effet de Pseudomonas fluorescens isolées de la rhizosphère du

bananier sur la réduction du flétrissement vasculaire chez le bananier causé par F. o. f.

sp. cubens. En effet, Irum, (2007) a signalé que les résultats de la suppression du


58

flétrissement vasculaire du pois chiche en utilisant les microorganismes sont plus

efficaces qu'en utilisant le carbendazim ou le bénomyl, qui sont deux produits

chimiques très efficaces contre le Fusarium oxysporum f. sp. ciceri.


141

FOC13+ACT2 T non inoculé T inoculé par

FOC13

Figure 50. Résultats de l'effet protectif de la souche Streptomyces ACT2 chez le cultivar ILC-482 inoculé par l'isolat FOC13.


142

FOC8+ACT2 T inoculé par

FOC8 T non inoculé

Figure 51. Résultats de l'effet protectif de la souche Streptomyces ACT2 chez le cultivar Col-27 inoculé par l'isolat FOC8.


143

FOC15+ACT2 T inoculé par

FOC15 T non inoculé

Figure 52. Résultats de l'effet protectif de la souche Streptomyces ACT2 chez le cultivar PPC-25 inoculé par l'isolat FOC15.


1

Si on compare nos résultats de l'antagonisme de la souche Streptomyces ACT2

sur la réduction des symptômes causés par le FOC sous serre nous avons observé que

nos résultats obtenus des degrés de suppression sont moins élevés que ceux obtenues

par plusieurs auteurs sur autres plantes attaquées par le flétrissement vasculaire.

Khavitha et al., (2010) ont trouvé que le degré de la suppression du flétrissement

vasculaire chez Sorghum biocolor en utilisant la souche Streptomyces sp TK-VL-333

a réduit l'incidence de la maladie de plus de 53.3% en comparaison avec le témoin. De

même, dans l'étude de Sudrez-Estrella et al., (2007) ont obtenus une réduction du

flétrissement de Fusarium oxysporum f. sp. melonis plus de 90% in vivo en utilisant

Aspergillus fumigatus en comparaison avec le témoin de T. harizanum. Kaur et al.,

(2007) ont obtenu une réduction de maladie du flétrissement vasculaire du pois chiche

à 100% (plante non malade) après 30 jours d'inoculation en utilisant une combinaison

un d'isolat de FOC non pathogène et une souche Pseudomonas flueorescens. La

réduction du flétrissement vasculaire chez les tomates a été entre 30-65% en utilisant

des bactéries et 40-66% en utilisant des champignons (Fusarium sp.; Trichoderma sp.

et Gliocladium spp.) (Larkin et fravel, 1998). Zaim et al., (2010) ont obtenu une

réduction de 83% de FOC en utilisant 03 isolats de microorganismes (Bacillus,

Streptomyces et Trichoderma harizanum).

Plusieurs travaux ont rapportés que des études in vivo ont donné des résultats

satisfaisantes en utilisant des Streptomyces contre quelques pathogènes d'origine

tellurique (Aghighi et al., 2004; Doumbou et al., 2002; Mohammadi et Lahdenpera,

1992). Tahvonen, (1982a; 1982b) et Tahvonen et Avikainen, (1987) ont signalé

l'utilisation de Streptomyces griseoviridis contre plusieurs phytopathogènes:

Alternaria brassicola, Botrytis cinerea, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum,

Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, Pythium debaryanum, Phomopsis sclerotiodes,

Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclertiorum. De même, en chine Valois et al., (1996)

ont utilisé Streptomyces sp. (5406) pour protéger les cultures du coton contre les

phytopathogènes telluriques. Autres études ont rapporté l'activité antifongique in vivo

de Streptomyces rimosus contre Verticillium dahliae et V. albo-atrum (Chi et Hanson,

1965).


2

Bressan et al., (2003) ont étudié la lutte biologique des champignons affectant

le maïs par l'utilisation des Streptomyces spp. Ils ont rapporté que ces isolats sont

efficaces dans la suppression du développement de Aspergillus spp., Curvularia

lunata et Drechslera maydis et réduisent l'incidence de Fusarium subglutinans et

Cephalosporium acremonium.

Singh et Mehrotra, 1980 ont étudié l'effet de 06 Streptomyces spp. sur la

réduction des symptômes causés par Rhizoctonia bataticola sur pois chiche, ils ont

observé que les souches de Streptomyces sp. réduisent les symptômes de la maladie et

améliorent la croissance et la production de la matière sèche chez le pois chiche. Il

existe aussi des rapports sur le contrôle des champignons pathogènes racinaires en

utilisant Streptomyces sp. (Tahvonen et Avikainen., 1987). Le produit commerciale

Mycostop, basé sur la souche K61 de Streptomyces griseoviridis et S. lydicus

WYEC108 est utilisé contre quelques maladies racinaires et le flétrissement causés

par Pythium spp., Fusarium spp., Rhizoctonia spp. et phytophthora spp. (Mahadevan

et Crawford, 1997). Streptomyces sp. présente le même potentiel à supprimer l'attaque

de la vigne causée par B. cinerea in planta en réduisant l'extension de la colonisation

du champignon dans les tissues de la plante (Loqman et al., 2009).

Le degré de suppression de la maladie est plus prononcé chez les cultivars

modérément tolérant (Col-27 et PPC-25) que le cultivar sensible (ILC-482). Ce

résultat est similaire à celui obtenu par Landa et al., (2001). En effet, les plantes

possèdent leurs propres mécanismes de résistance (Franceschi et al., 2005), mais les

microorganisme du sol peuvent contribuer à cette résistance en excrétant des

substances limitant la croissance des champignons phytopathogènes (Vassilev et al.,

2006; Jain et Jain, 2007) ou stimulant les défenses des plantes (PGPR) (Prévost et al.,

2006; Lehr et al., 2008).

L'observation d'un faible degré de suppression de la maladie du flétrissement

vasculaire par la souche ACT2 chez les 03 cultivars du pois chiche sous serre présenté

par cette étude peut être le résultat de plusieurs facteurs biotiques et abiotiques dans le

pathosystème cités par plusieurs auteurs (Kazmar et al., 2000; Raaijmakers et al.,

1995; Schisler et al., 1997; Smith et al., 1999).


3

Parmi ces facteurs: les facteurs liés au pathogène (inoculation des isolats très

virulents, la concentration de la race 5 du FOC), les facteurs liés aux conditions de

l'environnement (température et pH) et les facteurs liés à l'agent de lutte biologiques

(température optimale, pH).

Les facteurs liés au pathogène: Landa et al., (1997); Harvas et al., (1995); Navas-

Cortes et al., (2000) ont montré que l'incidence et la sévérité du flétrissement du pois

chiche est influencée par la l'inoculation des isolats très virulents du FOC de la race 5.

Cette race est capable de présenter le même degré de la maladie provoqué par une

autre race même à faible quantité.

Les facteurs liés aux conditions de l'environnement: Etant donné que les conditions

de la serre où nous avons lancé le test n'était pas contrôlé. Landa et al., (1997);

Boland, (1997); Bull et al., (1991); Hannusch et Boland, (1996), Hervas et al., (1997);

Johnson, (1994); Kazmar et al., (2000); Larkin et Fravell, (1999); Montesinos et

Bonaterra, (1996); Raaijmakers et al., (1995); Schisier et al., (1997); Smith et al.,

(1999) ont rapporté que les conditions environnementales optimales pour le

développement de la maladie réduisent l'effet protecteur des antagonistes. Des études

sur la pourriture grise, la fonte de semi et le flétrissement vasculaire du pois chiche

ont étudiées cette effet (Landa et al., 2001; Ben –Yephet et Nelson, 1999; Harris et

al., 1997; Mukherjee et Raghu, 1997; Tedla et Stanghellini, 1992).

La température: est un facteur important influençant la réussite d'un agent de lutte

biologique (Landa et al., 2001), et la sévérité du flétrissement vasculaire est modulée

par la température (Gupta et al., 1987 ; Navas-Cortes et Jimenez-Diaz., 1998), mais

l'effet exacte de la température sur le développement de la maladie du flétrissement

vasculaire n'est pas encore connu (Landa et al., 2001). Plusieurs possibilités peuvent

expliquer l'effet de la température sur la suppression du flétrissement vasculaire du

pois chiche par les bactéries antagonistes. La première possibilité et que l'inoculum du

pathogène à 25°C est plus élevé à être neutraliser par l'agent de la lutte biologique, à

cause que la maladie se développe mieux à 25°C en comparaison avec 20°C et 30°C

(Landa et al., 2001), même si une densité plus petite a été inoculé, car à 25°C le

potentiel de la maladie apparait saturé.


4

Landa et al., (2001) ont rapporté qu'en absence de l'agent de lutte biologique, des

nombres élevés de sites d'infections sont nécessaires à 20 et 30°C en comparaison

avec 25°C pour que le flétrissement vasculaire chez le pois chiche se développe tôt,

rapide et sévèrement. L'effet de la température sur la modulation de la suppression de

la fusariose du pois chiche par les bactéries introduites peut aussi résulter de

l'influence de la température sur leurs activités (Landa et al., 2001). Beaucoup de

travaux ont indiqué que l'efficacité d'un agent de lutte dans la suppression de la

maladie se réduit lorsque les conditions deviennent plus favorables au développement

de la maladie (Boland, 1997; Kazmar et al., 2000). Ben-yephet et Nelson, 1999 ont

trouvé que le degré de suppression de la maladie de la fonte de semi causée par

Pythium spp. et traiteé par les composts dépend de la température d'incubation, ils ont

suggéré que cet effet peut être due au différents niveau de l'activité microbienne dans

les différents composts à différentes températures d'incubation, ce type de réponse à la

température a été aussi observé dans la lutte biologique contre Pythium

aphanidermtum sur la canne à sucre par les rhizobactéries (Tedla et Stanghellini,

1992). Dans cette dernière étude la suppression du pathogène a été exprimé à 20°C

mais non pas à 27°C et cette effet a été directement corrélé avec l'activité des

bactéries dans la rhizosphère. Une colonisation rapide et persistante dans la

rhizosphère des agents de lutte biologiques est importante dans le contrôle biologique

des fusarioses à cause des infections motiles courtes dans ces maladies (Baker et

Paulitz, 1996). Parce que plusieurs bouts de racines se développent durant la

croissance racinaire, il y a une probabilité élevée des infections qui réussit sur eux aux

conditions optimum de la maladie, ainsi, la température adéquate pour une

suppression efficiente de la maladie doit réduire l'efficacité de l'inoculum du

pathogène et encore permettre aux rhizobactéries introduite de faire face avec la

croissance racinaire pour protéger le terrain de l'infection (Landa et al., 2001).

Hussain et al., (1986) ont rapporté que la température d'incubation des actinomycètes

joue un rôle important dans la détermination du composé d'antibiotique produit. En

effet une souche est capable de produire un antibiotique inhibant un pathogène à 25°C

produit un autre antibiotique qui inhibe un autre pathogène à 35°C sans aucun effet

sur le premier et le milieu de culture aussi joue un rôle important dans la

détermination du composé secrété et sa quantité.


5

Les facteurs liés à la nature de l'agent de lutte biologique et la dose appliquée: la

quantité finale des bactéries qui ont adhéré aux racines et à la rhizosphère de la plante

hôte (pois chiche) joue un rôle essentiel dans la suppression de la maladie (Landa et

al., 1997). En effet, la quantité adhérée aux racines dépend de la nature du

microorganisme antagoniste (Hervas et al., 1997; Landa et al., 1997) et son intensité

de la colonisation (Colonisation partielle ou complète) (Jayasinghe et Parkinson,

2008),la dose appliquée de l'agent de lutte (Boland, 1997; Bull et al., 1991; Hannusch

et Boland, 1996, Hervas et al., 1997; Johnson, 1994; Kazmar et al., 2000; Larkin et

Fravell, 1999; Montesinos et Bonaterra, 1996; Raaijmakers et al., 1995; Schisier et

al., 1997; Smith et al., 1999) et la période d'incubation dans le sol (Jayasinghe et

Parkinson, 2008). Jayasinghe et Parkinson, (2008) ont montré que les plantules de

céréales inoculées après 5 jours de croissance dans le sol par les Streptomyces sont

complètement colonisées par plusieurs champignons. Cependant les plantules de

céréales inoculées par les phytopthogènes 14 jours après une inoculation par les

Streptomyces ont montré une absence totale des champignons phytopathogènes. Le

besoin de séparer la première inoculation avec le non pathogène par au moins

quelques jours (6 jours) de la deuxième inoculation avec le pathogène a été indiqué

par plusieurs auteurs chez plusieurs formae speciales du flétrissement vasculaire

(Matta, 1989; Hervas et al., 1997). La période du temps demandée entre la première

et la deuxième inoculation doit être nécessaire pour que l'antagoniste colonise

complètement les racines des plantes avant d'être attaquées (Hervas et al., 1997).

Simon et Sivasithamparam, 1989 ont démontré que la période d'incubation est

nécessaire pour une lutte efficace, elle joue un rôle dans la production d'antibiotiques

(Kathiresan et al., 2005).

Les facteurs liés au génotype de la plante hôte: Plusieurs auteurs ont signalé

que le génotype des plantes influence le degré de la suppression de la maladie (Landa

et al., 1997; Kazmar et al., 2000; Raaijmakers et al., 1995; Smith et al., 1999). Harvas

et al., (1995); Hervas et al., (1997) et Navas-Cortes et al., (2000) ont étudié cet effet

sur le pois chiche et ils ont constaté que les génotypes modérément sensibles sont

mieux protégés par les agents de lutte que les génotypes sensibles. Van Peer et al.,

(1991) ont signalé que la souche P. fluerecens WCS417 supprime le flétrissement


6

vasculaire chez un cultivar modérément résistant de l'œillet (cv. Bllas) plus efficient

que chez le cultivar sensible (cv. Lena).

L'influence des génotypes du pois chiche sur la protection de la maladie n'est

pas attribuée aux différences dans la capacité de cette isolat à coloniser la rhizosphère

des cultivars testés (Hervas et al., 1997).

La méthode d'inoculation de l'agent de lutte biologique: le traitement des semences

par les antagonistes montre une efficacité plus élevé que le traitement du sol ou de

racine (Kaur et al., 2007). Nos résultats indiquent que le traitement des racines par les

Streptomyces réduit la maladie, mais il ne la supprime pas et que ce traitement n'est

pas suffisant. La recherche d'autres méthodes d'inoculation est mieux comme le

traitement des semences ou bien traitement du sol ou bien les deux combinés. Ce

résultat est similaire à celui obtenue par Landa et al., (1997) en utilisant des Bacillus

et des Pseudomonas contre le FOC (Landa et al., 1997).

Des résultats positifs du premier screening in vitro indiquent la production de

substances diffusibles dans le milieu n'indiquent pas que cette Streptomyces ACT2

protège les plantes du pois chiche par la production d'antibiotiques. Malgré que cette

production ait été observée in vitro contre le champignon aucune preuve n'indique

que la réduction de la maladie sous serre était par l'antibiose. Le mécanisme

spécifique d'action de la souche ACT 2 sur les 03 cultivars du pois chiche responsable

à la réduction de la croissance de FOC sous les conditions de la serre (sol,

température,…) reste inconnue (antibiose, compétition, hyper parasitisme,…)

(Jayasinghe et Parkinson, 2008).

3. Etude du comportement variétal

3.1. Résultats

3.1.1. Etude de l'agressivité

L'agressivité de 17 FOC choisis en fonction de l'organe d'isolement (tiges) et

de la région d’étude vis-à-vis du cultivar ILC-482 connu par sa sensibilité envers le

FOC (Jimenez-Diaz et al., 1988; Rhrib, 1990) a été également évaluée. Les résultats

présentés dans le Tableau 26, indiquent que l'ensemble des isolats inoculés à la variété


7

ILC-482 ont provoqué des symptômes typiques de la fusariose vasculaire du pois

chiche. Les altérations foliaires des plantules inoculées ont débuté par un

jaunissement et une nécrose soudaine des folioles de la base. Ce jaunissement se

développe pour atteindre la totalité des feuilles.

Les premiers symptômes ont été apparus 17 jours après inoculation pour

quelques isolats, mais pour la plupart les premiers symptômes ont été apparus 23 jours

après inoculation. D'autres isolats ont provoqué les symptômes en 30 jours. Durant

toute la durée de l'essai, les plantes témoins maintenues dans les mêmes conditions

que les plantes inoculées, n'avaient manifesté aucun symptôme.

L'indice de la maladie (IM) a été calculé 40 jours après inoculation. Les degrés

d'agressivité des isolats sont regroupés en 5 classes: 0-20% (très peu agressif), 21-

40% (peu agressif), 41-60% (moyennement agressifs), 61-80% (agressifs), 81-100%

(très agressif).

Sur la base de cette échelle, les 17 isolats ont montré une variabilité de

l'agressivité (Tableau 26). Les indices de la maladie (IM) ont varié de 32.60% à

92.12%. Parmi ces isolats de FOC: 06 isolats se sont révélés peu agressif, 02

moyennement agressifs, 07 agressifs et 02 très agressifs.

Figure 53. Résultats des tests d'agressivité des isolats testés de FOC.


8

Tableau 26. Classification des 17 isolats selon leur agressivité

Les résultats obtenus montrent que la population analysée, isolée de plants du

pois chiche cultivés dans les régions de Tlemcen, Ain Temouchent et Mostaganem,

sont variables, puisque le test de l'agressivité a montré une réaction hétérogène de

l'ensemble des isolats inoculés à la variété ILC-482.

3.1.2. Etude du comportement variétal vis-à-vis de FOC

Les réactions des 11 cultivars du pois chiche vis-à-vis des cultures

monosporées de 03 isolats testés sont résumées dans le tableau 27. Nous avons

constaté que tous les isolats testés ont manifesté une virulence vis – à- vis de ces 11

génotypes. Les résultats apportés par cette étude permettent d’effectuer un classement

Isolats IM (%) Evaluation de l'agressivité

FOC1 61.36 Agressif.

FOC2 92.12 Très agressif.

FOC3 39.44 Peu agressif.




FOC7 89.29 Très agressif.


FOC9 48.92 Moyennement agressif.





FOC14 55.07 Moyennement agressif.





9

des variétés en fonction de leur résistance au flétrissement selon trois catégories

(tolérantes, intermédiaires et sensibles). Les résultats obtenus nous ont permis

d’identifier une tolérance pour les variétés F7-43, F10-13 et 2G-03 pour les 03 isolats

de FOC. Une tolérance pour 02 isolats de FOC exprimée par les variétés ILC-2379,

Fedjoj, F10-31et seulement une variété tolérante à un seul isolat de FOC.

Le reste des génotypes présentent des réactions intermédiaires ou sensibles

vis-à-vis les trois FOC testés.

Les résultats de cet essai qui représente un effectif de 11 variétés, mettent en

évidence des niveaux de sensibilité différents et nous permettent d’établir un

classement en prenant compte des trois origines d’inoculum. Ce classement présente

une valeur supplémentaire, car il permet de donner une idée sur les gènes impliqués

dans la résistance ou la tolérance des variétés testées du pois de chiche.

Figure 54. Test de la résistance variétale montrant 02 variétés

tolérantes F10-31 et 2G-03.


10

Tableau 27. Réponse des cultivars de pois chiche vis-à-vis de FOC

Variétés FOC15 FOC8 FOC 13

ILC-482 38.76% 74.95% 82.75%

ILC-2379 14.02% 26.4% 17.39%

39-96 45,55% 39,58% 27,67%

F7-43 00% 00% 00%

F10-13 00% 00% 00%

Fedjoj 4.10% 21.87% 1.91%

PPC-25 31.38% 38.70% 52.32%

Col-27 51% 39.49% 34.16%

haddache 48.53% 17.12% 56.05%

2G-03 19.86% 4.97% 9.12%

F10-31 34.15% 18.75% 12.43%

IM= nombre de feuilles atteintes/nombre de feuilles total

Chez tous les cultivars inoculés par les 03 isolats, les symptômes exprimés ont

consisté en un jaunissement vasculaire progressif (flétrissement tardif) qui s'est

développé dès le 23éme

jour après inoculation, en affectant d'abord les feuilles les plus

basses. Enfin les témoins, lots de cultivars non inoculés, non pas manifesté les

symptômes du flétrissement vasculaire.

Figure 55. Test de la résistance variétale montrant des symptômes de la

fusariose chez la variété sensible ILC-482

FOC15 T

ILC-482


11

L'analyse statistique a montré qu'il ya des différences hautement significatives

dans le comportement de ces variétés testées. Ce test nous a permis de classer les

variétés du sensibles au tolérantes, comme suit: ILC-482>Col-27>PPC-25> Haddache

>39-96>F10-31>ILC-3279>2G-03>Fedjoj>F7-43>F10-13.Après l'évaluation de la

réaction des lignées du pois chiche, des réisolements ont été effectués dans le but de

confirmer la nature des symptômes et de préciser si le pourcentage de réisolement

positif (%RP), à partir des plantes hôtes inoculées, est corrélé à leur réaction de

sensibilité ou de tolérance.

Le tableau 28 présente les pourcentages de réisolement positif (%RP) du

pathogène à partir de fragments de ces cultivars 40 jours après l'inoculation.

L'analyse des résultats a montré que ce dernier (RP%) peut être élevé quand

l'indice de la maladie est faible (réaction de tolérance), c'est le cas pour les cultivars

2G-03 et F10-13. Ceci témoigne de la colonisation de la plante hôte même quand

celle ci est tolérante à l'infection.

Figure 56. Photo de ré isolement du FOC à partir des

fragments de plantes de pois chiche


12

Tableau 28. Résultats du test de ré isolement des 03 FOC

NT: Non testée

Le FOC a été fortement réisolé à partir des variétés exprimant une sensibilité.

Par contre le pourcentage de réisolement peut être faible quand l'indice de la maladie

est élevé, c'est le cas des cultivars Haddache et Col-27. De plus, le pathogène n'a pas

été obtenu à partir des plantes témoins. Le réisolement de FOC à partir des lignées

tolérantes à l'infection, témoigne de leur colonisation par l'agent pathogène.

3.2. Discussion

3.2.1. Etude de l'agressivité:

Les degrés de l'agressivité obtenue par cette étude montrent que les isolats de

la population étudiée présentent différents degrés. Ce résultat se rapproche des

résultats d'El Aoufir, (2001); Jimenez-Casco et al., (2004); Bekkar , (2007) sur le

FOC et Belabid,2003 sur FOL.

FOC13 FOC8 FOC15 Variétés

NT NT NT ILC-482

NT NT NT ILC-2379

32.5% 33.45% 55.60% 39-96

4.54% 1.02% 2.66% F7-43

8.51% 3.44% 4.76% F10-13

40.17% 51.69% 55.76% Fedjoj

48.73% 59.84% 53.47% PPC-25

21.14% 59.84% 50.34% Col-27

21.14% 59.84% 29.34% haddache

46.21 11.31% 4.76% 2G-03

3.19% 10.89% 5.48% F10-31


13

3.2.2. Etude du comportement variétal

Cette étude a permis de mettre en évidence que, parmi les variétés du pois

chiche, des tolérances variétales ainsi que des sensibilités à la fusariose ont été

observé.

La prise en compte par l’agriculteur de ce moyen alternatif de lutte par

l’utilisation de variétés ciblées obtenues par ce test peut permette de répondre de

façon préventive au risque potentiel de la présence de cette maladie sur son

exploitation. En raison de la grande disparité variétale observée, même si aujourd’hui

les 02 variétés testées (F7-43 et F10-13) ne sont pas utilisées malgré leur bon

comportement vis-à-vis du cryptogame étudié, d’autres variétés se sont montrées

intéressantes comme (ILC-2379, Fedjoj, F10-31). Une bonne connaissance de la

tolérance variétale est un élément déterminant dans une logique de lutte raisonnée

contre F. oxysporum ciceri, elle permet ainsi d’adapter les seuils de déclenchement

des modèles épidémiologiques. Il faut cependant garder à l’esprit que les tolérances

sont en constante évolution et sont vouées, à plus ou moins long terme, à être

contournées par l’agent causal. L’évaluation du comportement variétal, présente un

double intérêt:

Elle permet de connaître le niveau de résistance de ces variétés, pour pouvoir

ensuite les intégrer dans les stratégies de lutte raisonnée.

Elle permet de remettre à jour le classement des sensibilités variétales établis

les années précédentes.

L’apport de la résistance variétale dans la lutte contre le flétrissement

vasculaire du pois chiche peut être pris en compte. Nous avons observé des

différences entre les différentes variétés du pois chiche tant au niveau de la précocité

des attaques que de leur sensibilité à la maladie. En effet, un décalage d’au moins 1 à

2 semaines est observé au niveau des attaques entre les variétés sensibles et tolérantes.

La variété sensible ILC-482 a été touchée par la maladie plus rapidement que la

variété tolérante 2G-03. Enfin, Il apparait clairement que le critère tolérance variétale

doit être pris en compte dans la mise en place d’un programme de lutte intégrée. Les

informations issues de ce test variétal permettent de mieux utiliser le potentiel de


14

chaque variété dans la mise en œuvre du raisonnement de la protection fongicide. Des

recherches doivent être poursuivies en utilisant le maximum de variétés cultivées en

Algérie dans le but de faire un screening des variétés résistantes ou tolérantes au

flétrissement. De même, l’identification des races physiologiques existantes a son

importance sur le comportement variétal.

Depuis longtemps dans de nombreux pays, des gènes de résistance au

flétrissement ont été sélectionnés (Muehlbauer et Rajesh., 2008; Gowda et al., 2009;

Halila et al., 2009), cette sélection se heurte malheureusement au grand potentiel

adaptatif de l’agent causal FOC, qui se manifeste par une sélection de races

virulentes, ce qui ruine assez rapidement les résistances incorporées aux cultivars.

4. Etude de la relation entre l'agressivité, les morphotypes, la pigmentation des

thalles, le diamètre de la croissance mycélienne, les mensurations des conidies

4.1. Résultats

Le tableau 29 représente la répartition des isolats de FOC en fonction des

morphotypes, la pigmentation du thalle, la croissance mycélienne, la mensuration des

conidies et le degré de l'agressivité. Le tableau 30, présente une matrice de corrélation

entre l'ensemble des paramètres étudiée.

Tableau 29. Répartition des isolats de FOC en fonction des morphotypes, la pigmentation du thalle, la

croissance mycélienne, la mensuration des conidies et le degré d'agressivité.

Degré d'agressivité Total

Peu

agressif

Moyennement

agressif

Agressif Très

agressif

Morphotype

Cotonneux

Duveteux

Ras muqueux

0

2

4

0

1

1

2

3

2

0

1

1

17

Pigmentation

Blanc

6

2

5

1

17


15

Les groupes établis selon le groupement des isolats effectués par le test de Newman et Keuls à 5%.

4.1.1. Relation entre l'agressivité, la morphologie et la pigmentation du thalle

L'analyse des résultats de la morphologie des thalles de FOC n'a pas donné de

corrélation entre ce caractère et le degré d'agressivité des isolats (r=0.225) (Tableau

30). Il semble que la morphologie du thalle, chez cette forme spéciale, ne caractérise

pas le degré d'agressivité des isolats puisque la plus part des morphotypes ont été

rencontrée, à des pourcentages prés, quel que soit leur niveau d'agressivité.

Le coefficient de corrélation obtenu entre l'agressivité / pigmentation (r=-

0.203) est faible et qui démontre l'absence de corrélation. Ce résultat montre, chez le

FOC, que la pigmentation ne caractérise pas le degré de l'agressivité des 17 isolats.

4.1.2. Relation entre l'agressivité et le diamètre de croissance du thalle

Les résultats de diamètre de croissance du thalle n'ont pas donné une

corrélation entre ce caractère et le degré d'agressivité des isolats (r=0.23). La

variabilité de la croissance n'est pas associée à l'agressivité.

Violet 0 0 2 1

Croissance

Groupe a

Groupe b

Groupe c

Groupe d

1

2

1

2

0

1

0

1

3

1

2

1

0

1

1

0

17

Mensuration des

conidies

Groupe a

Groupe b

Groupe c

Groupe d

1

1

3

1

0

1

1

0

0

5

1

1

1

0

0

1

17


16

4.1.3. Relation entre l'agressivité et la mensuration des macroconidies et des

microconidies

Les résultats des mensurations en largeur et la longueur des macroconidies

montrent qu'il n'existe pas de corrélation entre ces deux caractères et le degré

d'agressivité des isolats (r=-0.315 et -0.128) respectivement. Les deux caractères:

degré d'agressivité des isolats et la longueur des microconidies n'ont pas montré une

corrélation (r=0.144). De même, pour le degré d'agressivité et la largeur des

microconidies (r=-0.128) (Tableau 30). D'après les résultats du tableau 30, une

corrélation a été établie entre la longueur des microconidies et la largeur des

microconidies (r=0.636).

Tableau 30. Matrice de corrélation calculée sur 8 paramètres étudiés

A B C D E F G H

A 1

B 0.053 1

C -0.023 -0.485 1

D 0.05 0.088 0.361 1

E -0.084 0.025 0.112 0.636 1

F -0.192 0.028 -0.337 -0.456 -0.38 1

G -0.131 -0.219 0.233 -0.025 -0.062 0.121 1

H 0.225 -0.203 0.23 0.144 -0.128 -0.128 -0.315 1

A: Morphotype, B: Pigmentation, C: Diamètre de croissance mycélienne, D: Longueur des

microconidies, E: Largeur des microconidies, F: Longueur des macroconidies, G: Largeur des

macroconidies, H: Agressivité.

4.2. Discussion

Les résultats obtenus lors de cette étude montrent qu'il n'existe pas de

corrélation entre les morphotypes et les degrés d'agressivité. Des résultats similaires

ont été montrés par El-Aoufir, (2001).


17

Nos résultats concordent aussi avec ceux de Follin et Laville, (1996) chez

Fusarium oxysporum f. sp. cubens, d'Assigbeste (1989) chez F. oxysporum

vasinfectum, de Henni et al., 1994 chez F. o. f. sp. lycopersici, de Belabid, (2003)

chez F. o f. sp. lentis et de Bekkar, (2007) chez le FOC. Par contre plusieurs auteurs

ont trouvés une corrélation entre le morphotype et le degré de l'agressivité (Chauhan,

1992; Claudius et Mehrotra, 1973; Abbas, 1995).

L'étude de la corrélation entre l'agressivité et les mensurations de la longueur

et de la largeur des microconidies et des macroconidies a montré qu'il n'existe pas de

corrélation entre eux. Ce résultat est en contradiction avec le résultat obtenu par

Bekkar, (2007) sur le FOC et Belabid, 2003 sur le FOL. Ces caractéristiques ont été

associées aux isolats agressifs et moyennement agressifs. Par contre, les résultats de

Abbas, (1995), sur la forme spéciale lentis, ont montré une corrélation entre le degré

d'agressivité et la largeur des microconidies seulement.

Une corrélation a été établie entre la longueur et la largeur des microconidies

(r=0.636), ce résultat est en accord avec celui obtenu par Bekkar, (2007) chez le FOC.

45

Conclusion et perspectives

Conclusions et perspectives

45

Conclusion générale et perspectives

En Algérie, la culture du pois chiche occupe une place importante parmi les

légumineuses alimentaires. Cette culture occupait en 2002 une superficie avoisinant

les 550 ha. En plus de son utilisation comme source de protéines, le pois chiche

participe à l’amélioration de la fertilisation du sol grâce à sa capacité à fixer l’azote

atmosphérique. Cependant, cette culture est exposée aux infections naturelles pouvant

conduire rapidement à la dégradation de la qualité sanitaire originelle. Parmi les

pathogènes les plus redoutables et qui méritent donc une attention particulière, le

flétrissement vasculaire du pois chiche, qui constitue une énorme contrainte pour la

culture, cela dans de nombreuses régions où elle est pratiquée. Cette maladie est

causée par un agent pathogène appelé F. oxysporum f.sp. ciceri. elle constitue une

menace autant plus grave que l’anthracnose, pour la culture du pois chiche, en raison

de son développement rapide et les dégâts qu’il occasionne.

Au cours des prospections effectuées dans les régions de Tlemcen, Ain

Temouchent et Mostaganem, nous avons constaté que les attaques du flétrissement du

pois chiche dû à l’agent causal FOC peuvent prendre une grande ampleur durant

certaines saisons lorsque l’apparition de la maladie est précoce et les conditions

climatiques sont favorables. Les symptômes du flétrissement vasculaire manifestés au

champ sont similaires à ceux rapportés dans d'autres pays, il s'agit soit d'un

flétrissement précoce entrainant la mort de la plante avant le stade de la floraison, soit

d'un jaunissement vasculaire progressif accompagné d'un brunissement vasculaire et

qui correspond au flétrissement tardif, qui a été le plus répandu.

La fusariose du pois chiche reste une maladie grave en attaque précoce et le

rendement peut être fortement diminué. En attaque tardive, c’est la qualité de la

récolte qui est mise en cause. De plus, le producteur doit faire face à de nouvelles

races du flétrissement dont l’agressivité semble plus forte. Cette évolution de

l’agressivité est d’ailleurs démontrée par diverses études. D’autres travaux se

rejoignent pour confirmer l’évolution du comportement des races physiologiques de

F. oxysporum. Leur agressivité, la précocité des attaques, la rapidité d’extension des

dégâts expriment cette évolution.


46

Au terme de cette étude, les différents essais mis en place ont permis de

dégager les constatations suivantes: le Fusarium oxysporum est le genre le plus

dominant des isolements effectués à partir des fragments de tiges et de racines des

plantes infectées. Ce constat, nous a permis de supposer que le FOC, est l’agent

responsable du flétrissement observé sur culture du pois chiche dans les régions

prospectées. Nos observations laissent apparaître qu’il est indispensable de

sensibiliser les agriculteurs sur l’étiologie de cette maladie cryptogamique pour qu’ils

appliquent les mesures prophylactiques au moment opportun et d’encourager les

études sur la dynamique des populations de ce pathogène ainsi que sa relation avec la

plante-hôte. Au cours de ce travail, nous avons maîtrisé la technique d’isolement et de

caractérisation de l’agent causal, nous avons ainsi obtenu une collection de 65 isolats

de FOC. Cette étude a permis une meilleure connaissance de la dynamique de

population de F. oxysporum ciceri et a mis en évidence la présence de plusieurs

morphotypes de l’agent causal.

Il en ressort de l'étude physiologique que le milieu le plus favorable pour la

croissance de FOC est le milieu pois chiche, et que la température optimale pour ce

parasite est autour de 30°C et un pH de 5.5 est le plus favorable. Nous avons

démontré aussi que l'obscurité apparait adéquate pour le FOC que l'incubation sous

lumière continue et ceci induit la pigmentation. Concernant la détermination de la

source de carbone nous avons remarqué que le glucose est la meilleur source, en

revanche la peptone s'est révèle être la meilleur source d'azote.

Les diverses méthodes utilisées pour tester le phénomène d’antagonisme entre

Fusarium oxysporum ciceri et espèces d’actinomycète retenues pour cette étude, nous

a permis de conclure que les souches d’actinomycètes testées exercent une action

antibiotique contre F. oxysporum ciceri, celle-ci a été mise en évidence lors du test de

confrontation direct. L’action des métabolites diffusibles dans le milieu a montré une

réduction importante de la croissance mycélienne de F. oxysporum ciceri par rapport

au témoin. Les résultats de l’effet protecteur ont montré que le traitement des racines

avec des souches d’actinomycètes retardaient le début des symptômes et réduisaient

l’incidence de la maladie comparé avec les contrôles non traités. Ces résultats


47

indiquent que le traitement des racines de plants du pois chiche modérément tolérants

avec les isolats d’actinomycètes sélectionnées peut aider dans le bio-contrôle de FOC.

Cette étude préliminaire basée sur ces techniques de base offre la possibilité

d’obtenir et de sélectionner un agent de bio-contrôle contre cet agent pathogène. Elle

mérite également d’être encouragée, développée et poursuivie dans le but de

sélectionner une ou plusieurs souches performantes. Il serait opportun de prévoir

d’une part, l’analyse des métabolites des souches d’actinomycètes performantes afin

d’identifier la nature chimique des substances antibiotiques mises en jeu dans le

phénomène d’antibiose et d’autre, pour mieux maîtriser leur dosage.

Les résultats des tests du comportement variétal a permis de bien montrer

l’intérêt que pourrait avoir l’intégration de la résistance variétale dans la lutte

raisonnée contre F. oxysporum ciceri. Sa prise en compte dans des systèmes d’aide à

la décision est particulièrement appropriée, car elle permet d’adapter au mieux la date

de premier traitement et les rythmes d’applications pendant la saison. Rappelons

cependant que cette résistance est susceptible d’évoluer d’année en année. Pour mettre

en évidence cette évolution, il est intéressant d’effectuer des essais et de comparer les

résultats obtenus avec ceux des années précédentes. Il faut noter que les résistances

variétales sont vouées, à plus ou moins long terme, à être contournées par l’agent de

flétrissement. Il est donc nécessaire de remettre à jour régulièrement les classements

de sensibilité en renouvelant les essais d’étude de la résistance variétale.

Compte tenu de l’évolution des populations de l’agent pathogène et des systèmes

de production agricole, il faut poursuivre les recherches afin de mettre au point de

nouvelles variétés du pois chiche possédant une résistance au champignon. Cette

résistance est importante pour les producteurs de cette culture. L’évaluation du niveau

de risque et le choix de mesures de prévention appropriées sont tributaires d’une

information précise et actuelle sur les lieux où le pathogène est présent. Vue la

mobilité du pathogène, cela suppose des programmes et des activités à la ferme et à

l’échelle du territoire. De plus, pour pouvoir empêcher la propagation du pathogène, il

faut poursuivre la recherche sur le dépistage de ces organes de résistance dans le sol et

dans les tissus végétaux. Enfin, une meilleure connaissance des populations de FOC,


48

permettrait de mieux évaluer le risque du flétrissement, de choisir des mesures de

prévention judicieuses et de réduire au minimum l’usage de fongicides chimiques.

En conclusion, l’exploitation des capacités antagonistes des actinomycètes

dans une lutte biologique contre la fusariose du pois chiche semble prometteuse. La

mise au point d’une telle lutte est cependant difficile; nombreux sont les problèmes

qui se posent encore. A la fin de notre étude, nous pouvons conclure que le

flétrissement, dont l’agent causal est F. oxysporum f.sp ciceri constitue une menace

autant plus grave que l’anthracnose pour la culture du pois chiche.

Cette étude a été réalisée afin de mieux connaître le champignon, de savoir

l’identifier, pour ensuite envisager des études de physiopathologie (interaction hôte –

parasite) pour arriver à éliminer ou prévenir la maladie. Pour limiter les problèmes de

flétrissement, il faut éviter les implantations de culture du pois chiche en conditions

limites. Du fait des capacités de conservation de F. oxysporum ciceri et de son survie

dans le sol (chlamydospores en particulier), il existe différentes sources potentielles

de contamination. Or, la pratique d’une rotation ne peut malheureusement pas être le

garant de l’absence de la maladie. Face à des moyens de protection chimique assez

peu efficaces, il apparaît important de connaître le niveau de risques des parcelles

afin, d’éviter d’utiliser des variétés sensibles, si possible d’employer des variétés

résistantes ou tolérantes. Il est important d’éviter d’introduire ce pathogène dans les

sols encore indemnes. Un point important pour les plantations est l’utilisation de

plants sains. Compte tenu de son caractère épidémique, il est souhaitable de ne jamais

laisser ce parasite pénétrer dans les parcelles.

Des mesures prophylactiques s’imposent pour réduire l’inoculum primaire

présent dans le sol:

Réduire au maximum les sources d’infection primaire en détruisant les débris

végétaux, ces mesures prophylactiques sont essentielles.

Adopter une gestion correcte des déchets et des débris végétaux: aucun

déchets ou débris végétaux et même les résidus de cultures ne doit se trouver à

proximité de la parcelle cultivée, car ces résidus se présentent comme une

source majeure d’inoculum.


49

Utiliser des plants du pois chiche sains.

Veiller à réaliser une implantation correcte et éviter de planter dans des

parcelles historiquement connues par la maladie.

Ce travail a fait l’objet d’une présentation scientifique lors d’un séminaire national en

phytopathologie, qui s’est déroulé en mai 2010 à Khemis Miliana.

45


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45

Annexes

Annexes

45

Annexe 1

Composition des milieux de cultures utilisés

Milieu PDA

Extrait de pomme de terre……………………………………………………........200g

Glucose………………………………………………………………………...........20g

Agar-agar……………………………………………………………………………15g

Eau distillée……………………………………………………………………..1000ml

pH……………………………………………………………………………………5.6

Milieu pois chiche

Extrait de pois chiche……………………………………………………………….70g

Saccharose…………………………………………………………………………..20g

Agar-agar……………………………………………………………………............20g

Eau distillée……………………………………………………………………..1000ml

pH……………………………………………………………………………............5.6

Gélose nutritive

Extrait de viande………………………………………………………………...........1g

Extrait de levure………………………………………………………………...........2g

Peptone……………………………………………………………………………….5g

Chlorure de sodium…………………………………………………………………..5g

Agar-agar……………………………………………………………………………15g

pH……………………………………………………………………………………7.4

Milieu TSP2

Extrait de malt………………………………………………………………………10g

Extrait de levure………………………………………………………………...........4g

Glucose……………………………………………………………………………….4g

Annexes

46

Agar-agar……………………………………………………………………............20g

Eau distillée…………………………………………………………………......1000ml

pH……………………………………………………………………………………7.3

Milieu Malt

Extrait de malt………………………………………………………………………20g

Agar-agar……………………………………………………………………………20g

Eau distillée……………………………………………………………………..1000ml

pH……………………………………………………………………………………5.6

Milieu Czapeck

NaNO3………………………………………………………………………….........2g

K2HPO…………………………………………………………………………..........1g

KCL………………………………………………………………………………...0.5g

MgSO4, 7H2O………………………………………………………………………0.5g

FeSO4, 7H2O……………………………………………………………………...0.01g

Saccharose…………………………………………………………………………..30g

Agar-agar………………………………………………………………....................15g

Eau distillée……………………………………………………………..............1000ml

pH……………………………………………………………………………………5.6

Milieu Richards

KH2PO4………………………………………………………………………………1g

MgSO4, 7 H2O……………………………………………………………………...0.5g

FeSO4, 7H2O……………………………………………………………….........0.005g

ZnSO4……………………………………………………………………………0.005g

MnCl2 …………………………………………………………………………...0.002g

Galactose……………………………………………………………………………20g

Annexes

47

Glycocolle……………………………………………………………………….2.250g

Agar-agar……………………………………………………………………………20g

Eau distillée……………………………………………………………………..1000ml

pH……………………………………………………………………………………5.6

Milieu Sabouraud

Dextrose…………………………………………………………………………….40g

Peptone……………………………………………………………………………...10g

Agar…………………………………………………………………………………20g

Eau distillée……………………………………………………………………..1000ml

pH……………………………………………………………………………………5.6

Milieu GLM

Extrait de levure……………………………………………………………………...3g

Extrait de malt………………………………………………………………………..3g

Peptone……………………………………………………………………………….5g

Glucose……………………………………………………………………………...10g

Agar…………………………………………………………………………………15g

Eau distillée………………………………………………………………………100ml

pH……………………………………………………………………………………7.2

Annexe 2

Préparation des tampons pour le test de la détermination du pH (selon Geigy, 1990)

pH Solutions-stocks Composition du

tampon A B

4.5 Citrate disodique 0.1M HCl 0.1M 74.9 ml A+ 25.1 ml B

5.5 Citrate disodique 0.1M NaNOH 0.1M 70.3 ml A+ 29.7 ml B

Annexes

48

6.5 Citrate disodique 0.1M NaNOH 0.1M 53.2 ml A+ 46.8 ml B

7.5 Phosphate

monopotassique 1/15 M

Phosphate disodique 1/15

M

12.8 ml A+ 87.2 ml B

Annexe 3

Résultats de l'analyse statistique

Analyse de la variance des mensurations (longueurs et les largeurs des conidies)

SCE ddl SCE/ddl Fc=Var f/Var r

Var. total 4796.11 19 252.42 918.73

Var. factorielle 4768.28 3 1589.42

Var. résiduelle 27.83 16 1.73

Analyse de la variance de la croissance mycélienne des 17 isolats de FOC sur PDA


Var. total 129.84 17 7.63 138.52



Analyse de la variance de l'influence de la température sur la croissance mycélienne

des 17 isolats de FOC


Var. total 460.51 21 21.92 65.52



Annexes

49

Analyse de la variance de l'influence du pH sur la croissance mycélienne des 17

isolats de FOC


Var. total 58.45 19 3.07 4.5



Analyse de la variance de l'influence de milieux de cultures sur la croissance

mycélienne des 17 isolats de FOC


Var. total 131.421 22 5.97 11.53



Analyse de la variance de l'influence de la source de carbone sur la croissance

mycélienne de 17 isolats de FOC


Var. total 28.96 18 1.60 1.12



Annexes

50

Analyse de la variance de l'influence de la source d'azote sur la croissance mycélienne

de 17 isolats de FOC


Var. total 52.46 18 2.91 8.07



Analyse de la variance du comportement variétal de 11 cultivars de pois chiche vis-à-

vis 03 isolats de FOC


Var. total 12835.65 12 1069.63 9868.55



45

اىميخص

- عه ذمشىد- ذيمغان )مه خاله اىمغخ اىذقي ىمضاسع اىذمص ف اىشماه اىغشت ىيجضائش

نن مصش االورشاس عىذ ذفش اىمىار FOCاعرىرجىا أن مشض اىزته اىعائ اىزي غثث اىفطش (مغرغاوم

أعشاض . إر جذوا أن شذج اىمشض خطسذ مشذفعح خصصا ف مىطقح عه ذمشىد ذيمغان .ياىمالئم ه

اىمشض اىر شاذواا ف اىذقو ذمصيد ف اصفشاس مرأخش ظش عيى شنو اصفشاس عائ رطس مه األعفو

. إىى األعيى

عضه اىرعشف عيى زا اىفطش مخثشا أظشخ ىىا ها هاف وفظ اىقد،اىرقىاخ اىمخريفح اىر اعرمذن

دساعح اىممضاخ اىمسفىجح أظشخ جد . FOC عالىح مه اىفطش 17تعط اىماصفاخ اىمشفىجح ىــ

شالز أشناه اخرالفاخ اظذح ف اىشنو اىصثغح ته اىفطشاخ اىافعح اىثاىغح مزىل اىذساعح اىثمرشح

. أظشخ اخرالفاخ اظذح ته أتعاد اىجشاشم اىنوذح

تعذ أن أجشىا اخرثاس مخثشاStreptomyces تعذ أن اعرطعىا اخراس اىرعشف عيى عرح عالالخ مه

Streptomyces ، اىغالىح FOCقذسج زي اىغالالخ سشاداذا عيى ذصثط وم شالز عالالخ مه اىفطش

ACT2ف اىثد اىثالعرن ىذماح شالز ا اىر أظشخ وغة مؤح معرثشج ف ذصثط اىفطش اخرثشواا مجذد

اىىرائج اىمذصو عيا أظشخ قذسج زي PPC-25, Col27, ILC-482, :أصىاف مه وثاخ اىذمص

. FO شالز عالالخ مه اىـب دقىم األصىاف اىصالشح مه مشض اىزته اىعائ تعذدماحاىغالىح عيى

منىىا مه اىذصه عيى وغة ILC-482 اخرثاس اىششاعح عيى صىف مه اىذمص شذذ اىذغاعح

عالالخ قييح 06: ىيفطش إىى 17 عيى زا األعاط قغمىا اىغالالخ اىـ 92.12% إىى32.33% ذرشاح ته

. فقط شذذج اىششاعح02 ششعح 07, اىششاعح ، عالىره مرعطح اىششاعح

04 ىىا تاخراس عمخ FOC مهعالالخ 03صىف مه وثاخ اىذمص عىذ إصاتر تـ 11 دساعح عيك

-F7-43, F10-13, Fedjoj, 2G: مشض اىزته اىعائ م عيى اىراىهأصىاف مه وثاخ اىذمص مقامح

03 .

,’Fusarium oxysporum f. sp. ciceri’ اىرعاد’ اىششاعح’ مشض اىزته اىعائ:الكلمات المفتاحية

Actinomycètes, Cicer arietinum L.

46

Documents

Université d’ORAN · 2015-05-05 · Remerciement Je tiens d’abord à adresser toute ma gratitude au Professeur Bellahcene M. sans lequel ce travail n’aurait pu aboutir, je