UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR – STRASBOURG I · Ces interfaces nouvelles sont dites « bioactives ». Elles facilitent ou stimulent la réponse de l’hôte. Parmi les axes de recherche

UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR – STRASBOURG I

FACULTÉ DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

THÈSE

pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ STRASBOURG I

Discipline : Odontologie

présentée et soutenue publiquement

par

Olivier ETIENNE

DEVELOPPEMENT D’INTERFACES A PROPRIETES

ANTIMICROBIENNES PAR LA FONCTIONNALISATION

DE MULTICOUCHES DE POLYELECTROLYTES

Directeur de thèse : M. Christophe EGLES

JURY

M. H. TENENBAUM Rapporteur interne

M. HC. VAN DER MEI Rapporteur externe

M. P. MARIANI Rapporteur externe

M. H. PREISKEL Examinateur

M. C. EGLES Directeur de thèse

REMERCIEMENTS

A Céline

A ma famille

A mon grand-père là-haut

A mes amis

Qu’ils me pardonnent mon manque de disponibilité, mes absences, mes « mots ».

Que ce travail soit une part de ma reconnaissance envers vous.

Remerciements

Ce travail a été effectué dans le laboratoire de l'unité INSERM 595, Biomatériaux : processus

biophysiques et biologiques aux interfaces à Strasbourg. Je tiens tout particulièrement à

remercier son directeur Monsieur Jean-Claude Voegel de m'y avoir accueilli, ainsi que le

Doyen de la Faculté d’Odontologie de Strasbourg auquel le laboratoire est rattaché, Monsieur

le Professeur Youssef Haikel.

Je remercie chaleureusement mon Directeur de thèse, Christophe Egles, Professeur associé en

Biologie à l'Université Louis Pasteur (UFR Odontologie, Strasbourg I), sans qui rien ne serait

là aujourd’hui. Il a su faire découvrir au clinicien que je suis, le plaisir et la patience

nécessaire dans la recherche. Il a été présent dans mes débuts incertains, dans mes moments

de découragements ; il a su gérer mon stress sans jamais me faire part du sien.

Je remercie Madame Joelle Ogier, Professeur en Biologie à l'Université Louis Pasteur (UFR

Odontologie, Strasbourg I), qui a assuré la co-direction de ce travail durant les deux premières

années. Je la remercie de m’avoir fait confiance en me confiant ce projet de thèse.

Je suis très sensible à l'honneur que me font Messieurs Henri Tenenbaum, Professeur à

l'Université Louis Pasteur (UFR Odontologie, Strasbourg I), Paul Mariani, Professeur à

l’Université de la Méditerranée (UFR Odontologie, Marseille II) et Heynie Van der Mei,

Professeur de Microbiologie à l'Université de Groningen (Laboratoire d’ingénierie

biomédicale, Hollande) en acceptant d'être les rapporteurs de ce travail. Je leur adresse mes

sincères remerciements.

Je remercie également Monsieur Harold Preiskel, Professeur à l’Université de Londres

(Grande-Bretagne) qui me fait le grand honneur de faire partie du jury de cette thèse. Je

l'assure de ma profonde gratitude, ainsi que de ma sincère reconnaissance.

J'aimerais témoigner ma profonde reconnaissance à Madame Corinne Taddéi, Maître de

Conférence à l’Université Louis Pasteur (UFR Odontologie, Strasbourg I) qui m’a soutenue

dans la réalisation de ce travail et qui me fait l’honneur de faire partie de ce jury de thèse.

Cette étude est l'aboutissement d'un travail d'équipe. Aussi, je souhaite remercier tous les

intervenants directs ou non et plus particulièrement ceux qui m'ont encouragée et soutenue

durant la réalisation de ce travail, ainsi que pour les moments de détentes que nous avons

partagés ensemble. Je tiens à remercier tous les membres du laboratoire :

Catherine P. qui reste un modèle de capacité et de rigueur de travail pour moi.

Ludovic R. qui a toujours fait preuve d’une grande disponibilité et d’une gentillesse à toute

épreuve.

Anne-laure B. même si ce fut bref, ce fut avec plaisir.

Bernard S. qui a su me rendre (presque) clairs les équations et autres tests statistiques durant

ce travail.

Constant V., Dominique V., Stéphanie M., Fouzia B., Pascale S., Vincent B., Philippe L.,

Nadia J., Csilla G. et Frédéric C., Christine A., Géraldine K., Eric H., Florent M., Marina K,

Youri A. Agi C., Amal N., Joseph H., René E., pour toutes vos attentions lors de mon travail,

vos réponses et votre aide.

Aurore, Géraldine, Marion, Monica, les dernières arrivées…pleines de bonne humeur

Sophie et peggy mes « supporters » de tous les jours au cabinet.

Pierre K., Céline K., Mélanie, Ludovic et tous les étudiants stagiaires pour les bons moments

que nous avons partagés.

Table des Matières

TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS................................................................................................................. 2

TABLE DES MATIERES......................................................................................................... 7

ABREVIATIONS ET SYMBOLES .......................................................................................... 9

INTRODUCTION ................................................................................................................... 11

DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ...................................................................................... 15

Chapitre 1 : Les biofilms bactériens et fongiques .................................................................. 161.1 : Les biofilms bactériens ........................................................................................................... 16

1.1.1. Développement du biofilm bactérien................................................................................................. 171.1.2. Résistance aux antibiotiques.............................................................................................................. 18

1.2 : Les biofilms fongiques ............................................................................................................ 201.2.1. Développement du biofilm candidal.................................................................................................. 20

1.2.1.1. Une forme clinique : la stomatite sous-prothétique ................................................................... 221.2.2. La résistance aux antifongiques......................................................................................................... 24

Chapitre 2 : Les traitements antimicrobiens de surface des biomatériaux........................... 252.1 : Les traitements physico-chimiques ....................................................................................... 26

2.1.1. La mouillabilité de surface ................................................................................................................ 262.1.2. La charge de surface .......................................................................................................................... 272.1.3. La topographie et la rugosité de surface ............................................................................................ 28

2.2 : Les traitements par incorporation d’agents antimicrobiens .............................................. 282.2.1. Les recouvrements à l’héparine ......................................................................................................... 292.2.2. L’imprégnation par des antiseptiques ................................................................................................ 292.2.3. L’imprégnation par des agents antibiotiques ..................................................................................... 312.2.4. Les nouveaux axes de recherche........................................................................................................ 34

Chapitre 3 : Les films en multicouche de polyélectrolytes..................................................... 363.1 : Aspects physico-chimiques des films en multicouche .......................................................... 36

3.1.1. Principe du dépôt couche par couche ................................................................................................ 363.1.2. Nature du substrat.............................................................................................................................. 393.1.3. Croissance du film en multicouches .................................................................................................. 40

3.1.3.1. Les films à croissance linéaire ................................................................................................... 413.1.3.2. Les films à croissance exponentielle.......................................................................................... 41

3.2 : Fonctionnalisation des films en multicouche........................................................................ 433.2.1. Fonctionnalisation par insertion de peptides ou de molécules libres ................................................. 443.2.2. Fonctionnalisation par couplage de peptides ou de molécules .......................................................... 453.2.3. Fonctionnalisation par les propriétés propres des polyélectrolytes.................................................... 46

Chapitre 4 : Les peptides antimicrobiens ............................................................................... 494.1 : Deux systèmes de défense immunitaire................................................................................. 49

4.1.1. La reconnaissance de I’infection par le système immunitaire inné ................................................... 504.1.2. Les mécanismes effecteurs de la réponse innée................................................................................. 52

4.2 : Les peptides antimicrobiens................................................................................................... 534.2.1. Structure et diversité des peptides antimicrobiens............................................................................. 53

Table des Matières

4.2.2. Mécanismes d’action ......................................................................................................................... 554.2.2.1. Spécificité d’action .................................................................................................................... 554.2.2.2. Mode d’action ............................................................................................................................ 584.2.2.3. Mécanismes de la mort cellulaire............................................................................................... 654.2.2.4. La synergie d’action................................................................................................................... 66

4.2.3. Résistance des micro-organismes ...................................................................................................... 67

MATERIELS ET METHODES ............................................................................................. 69

Chapitre 1 : Matériel ............................................................................................................... 701.1 : Polyélectrolytes ....................................................................................................................... 70

1.1.1. Construction des films multicouches de polyélectrolytes.................................................................. 71

1.2 : Peptides antimicrobiens ......................................................................................................... 721.2.1. La Défensine...................................................................................................................................... 721.2.2. La Chromofungine............................................................................................................................. 73

1.3 : Synthèse du copolymère de l'acide poly(L-glutamique) / poly(éthylène glycol)................ 73

Chapitre 2 : Méthodes ............................................................................................................. 762.1 : Analyses physico-chimiques................................................................................................... 76

2.1.1. Spectroscopie optique par guide d’onde............................................................................................ 762.1.1.1. Principe et description de la technique ...................................................................................... 762.1.1.2. Protocole expérimental .............................................................................................................. 782.1.1.3. Traitement du signal .................................................................................................................. 79

2.1.2. Microbalance à cristal de quartz ........................................................................................................ 802.1.2.1. Principe ...................................................................................................................................... 802.1.2.2. Protocole expérimental .............................................................................................................. 82

2.1.3. Mesure du potentiel d’écoulement..................................................................................................... 832.1.3.1. Dispositif expérimental.............................................................................................................. 852.1.3.2. Procédure de mesure.................................................................................................................. 86

2.1.4. Microscopie de fluorescence ............................................................................................................. 872.1.5. Microscopie à épi-fluorescence ......................................................................................................... 872.1.6. Microscopie confocale....................................................................................................................... 882.1.7. Microscopie électronique à balayage................................................................................................. 90

2.2 : Analyses Biologiques .............................................................................................................. 942.2.1. Cultures cellulaires ............................................................................................................................ 94

2.2.1.1. Cultures bactériennes................................................................................................................. 942.2.1.2. Culture de Candida albicans ...................................................................................................... 952.2.1.3. Culture des fibroblastes.............................................................................................................. 952.2.1.4. Culture des cellules épithéliales................................................................................................. 95

2.2.2. Modification génétique des souches E. coli....................................................................................... 962.2.3. Adhésion bactérienne ........................................................................................................................ 972.2.4. Dosage de l’activité anti-microbienne par microtitration .................................................................. 97

RESULTATS: FONCTIONNALISATION DES MULTICOUCHES .................................. 99

Fonctionnalisation par le poly(éthylène-glycol) .................................................................. 100

Fonctionnalisation par la Défensine .................................................................................... 103

Applications aux matériaux prothétiques oraux.................................................................. 107

Films de polysaccharides dégradables.................................................................................. 127

Fonctionnalisation par la Chromofungine .......................................................................... 156

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................................. 178

BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................ 186

Abréviations et symboles

ABREVIATIONS ET

SYMBOLES

Polymères:

CHI: chitosan

HA: hyaluronane ou acide hyaluronique

PAA acide poly(acrylique)

PAH: poly(allylamine hydrochloryde)

PDADMAC poly(diallyldimethylammonium)

PEG: poly(éthylène glycol)

PEI: poly(éthylène imine)

PGA: acide poly(L-glutamique)

PLL: poly(L-lysine)

PMMA polyméthacrylate de méthyle

PSS: poly(styrène sulfonate)

PTFE poly(tetra-fluoro-éthane)

PVS: polyvinyl siloxane ou silicone

Protéines et enzymes

α-MSH: α-mélanocortine : “alpha-melanocyte stimulating hormone”

BMP : protéine morphogénique osseuse : (bone morphogenic protein)

CL cardiolipine

GFP: protéine fluorescente verte : “ green fluorescence protein”

HSA: albumine sérique humaine : “ human serum albumin”

IgG: immunoglobuline G

Abréviations et symboles

PC phosphatidylcholine

PE phosphatidyléthanolamine

PG phosphatidylglycérol

PS phosphatidylsérine

SM sphyngomyéline

RGD : Arginine - Glycine - Asparagine

TNFα: facteur de nécrose de tumeurs : ” tumoral necrose factor “

Réactifs et solvants utilisés :

EDC: 1-Ethyl-3-(3-diméthylamino-propyl) carbodiimide

HCl acide chlorhydrique

NaOH Hypochlorite de sodium

FITC : fluorescéine isothiocyanate

Sulfo-NHS: N-hydroxysulfo succinimide

TR : rouge Texas

Molécules thérapeutiques :

Chx Chlorhexidine

Min Minocycline

Rif Rifampicine

SAg Sulfate d’argent

Appareils et techniques utilisés :

OWLS: spectroscopie optique par guide d'onde

QCM-D : microbalance à cristal de quartz avec étude de la dissipation

CLSM : microscopie confocale

FRAP : mesure de fluorescence après photo-blanchiment

AFM: microscopie à force atomique

FTIR: spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

Introduction

INTRODUCTION

Introduction

Introduction

Les matériaux utilisés en odontologie ont évolué progressivement au gré des

connaissances technologiques et biologiques. Depuis les tout premiers temps et l’utilisation

« mimétique » de l’ivoire animal, l’amélioration et la maîtrise des procédés de fabrication ont

permis l’utilisation d’éléments synthétiques variés. La dernière génération de matériaux a

notamment pour but d’agir sur la réponse de l’hôte en cherchant à favoriser une intégration

maximum aux tissus environnants. Les diverses applications des hydroxyapatites, en

parodontologie comme en implantologie en sont la concrétisation clinique. Les protéines

morphogénétiques osseuses recombinées par génie génétique et associées à des matériaux de

comblement confirment également l’apport de la biologie moléculaire à l’élaboration des

biomatériaux de demain.

Ces interfaces nouvelles sont dites « bioactives ». Elles facilitent ou stimulent la

réponse de l’hôte. Parmi les axes de recherche engagés en matière de bioactivité à l’interface

matériau/tissu, la protection antimicrobienne répond à une attente dans de nombreux

domaines médicaux où l’infection post-opératoire est redoutée. Ainsi les systèmes

implantables temporaires tels les drains et les cathéters, ou permanents comme les stents

vasculaires ou les valves cardiaques sont des surfaces dont la colonisation par un biofilm

microbien peut avoir des conséquences catastrophiques. La constitution de ce biofilm à la

surface des matériaux se fait en trois temps bien définis: l'attachement, la colonisation et

l'accroissement. Une fois le biofilm constitué, la résistance de cette structure aux antibiotiques

explique la persistance des infections chroniques malgré les traitements systémiques déployés.

En odontologie, l’application d’une protection antimicrobienne à l’interface du

matériau trouve aussi de nombreuses indications potentielles. Parmi celles-ci, la protection

des résines acryliques, largement utilisées dans les domaines prothétiques, est une indication

de premier ordre. En effet, la surface de la résine acrylique est très rapidement envahie par la

flore commensale de la bouche. Les porosités de surface contribuent largement à créer ces

niches écologiques. Les dépôts bactériens et fongiques ainsi établis sont des réservoirs

infectieux alimentant en permanence les biofilms des surfaces dentaires et de la muqueuse

buccale.

Elles participent ainsi à l’aggravation des pathologies carieuses, parodontales, voire

parfois à l’établissement d’une stomatite candidosique sous-prothétique. Cette dernière

Introduction

constitue la forme de candidose la plus fréquente en bouche, impliquant principalement

Candida albicans associé à d’autres micro-organismes. Elle s’observe presque exclusivement

au maxillaire où la prothèse isole plus efficacement la muqueuse palatine de la salive et de ses

agents antimicrobiens. Les diverses études épidémiologiques rapportent des taux moyens

d’environ 50% des porteurs de prothèses amovibles présentant, à des stades d’évolution

divers, une stomatite sous-prothétique.

Le projet de cette thèse repose sur l’exploitation d’un procédé de recouvrement de

surface original : le film de polyélectrolytes en multicouches, et sur sa fonctionnalisation par

des peptides antimicrobiens. L’auto-assemblage de polyélectrolytes de charges alternées,

décrit par G. DECHER, permet la formation d’un film nanométrique au sein duquel peuvent

être incorporés divers éléments organiques ou inorganiques. Parmi les éléments

potentiellement incorporables, les peptides antimicrobiens constituent un axe de recherche

intéressant face à l’accroissement des phénomènes de résistance aux antibiotiques. On les

retrouve dans de nombreuses espèces comme les amphibiens, les insectes et les humains.

Cette particularité de conservation phylogénétique caractérise des mécanismes d’action

généralement basiques bien qu’essentiels. Leur mode d’action, encore mal connu, repose le

plus souvent sur une déstabilisation membranaire, ce qui leur confère des perspectives

médicales intéressantes dans la mesure où les risques de résistance sont faibles. Cette

immunité innée a été progressivement supplantée chez l’homme par l’immunité acquise, mais

la présence dans de nombreux fluides ou tissus organiques de peptides antimicrobiens

confirme leur rôle toujours actuel comme barrière de défense précoce de l’organisme. Cette

spécificité permet un traitement ciblé et limite les risques de déstabilisation de l’équilibre de

la flore buccale.

Deux axes d’activité antimicrobienne ont été envisagés : le premier consiste à conférer

des propriétés anti-adhésives purement physico-chimiques à ce film multicouches de

polyélectrolytes afin d’empêcher le stade initial de développement du biofilm; le deuxième

exploite les propriétés des peptides antimicrobiens incorporés dans le film.

Dans un premier temps, l’utilisation d’un polyanion (acide polyglutamique) couplé à

des molécules de poly(éthylène-glycol) dans l’assemblage du film en multicouches, nous a

permis d’obtenir une réduction de plus de 90% de l’adhésion à court terme de bactéries

Escherichia coli sur des surfaces de verre. (article 1)

Introduction

Dans un deuxième temps, nous avons cherché à caractériser l’incorporation d’un

peptide antimicrobien, la Défensine d’Anopheles gambiae, au sein de ce film en multicouches

de polyélectrolytes. Nous avons pu démontrer l’activité antimicrobienne de l’architecture

obtenue sur deux souches bactériennes (E. coli D22 et Micrococcus luteus). (article 2)

Dans l’optique d’une application orale, nous nous sommes alors intéressés à la

dégradation de ces films dans des conditions in vitro simulant l’environnement buccal et dans

des conditions in vivo sur un modèle animal. Deux catégories de films en multicouches ont été

étudiées, l’une construite à base de polyélectrolytes (l’acide poly(L-glutamique) et la poly(L-

lysine)), l’autre à base de polysaccharides naturels (le chitosan et l’acide hyaluronique). Ces

deux types de films ont montré des profils de dégradation très différents, laissant envisager

une exploitation comme outil de relargage contrôlé pour les films à base de polysaccharides et

une exploitation de protection à moyen terme pour les films à base de polyélectrolytes.

(articles 3&4)

Enfin, afin d’envisager une application à la protection de matériau contre l’infection

candidosique, nous avons étudié l’activité de films de polyélectrolytes incorporant un peptide

antimicrobien dont l’activité anti-candidale avait été démontrée : la Chromofungine. La

pénétration du peptide dans les C. albicans cultivés à la surface du film a été objectivée, et un

modèle de candidose orale chez le rat wistar nous a permis de confirmer l’interêt

antimicrobien de notre revêtement in vivo. (article 5)

Données bibliographiques

DONNEES

BIBLIOGRAPHIQUES

Données bibliographiques Chapitre 1 – Les biofilms bactériens et fongiques

1Chapitre 1 : Les biofilms bactériens et fongiques

1.1 : Les biofilms bactériens

La grande majorité des micro-organismes se développe préférentiellement à l’état

sessile, fixés sur un support, plutôt qu’à l’état planctonique, libres et isolés dans le milieu

environnemental. Ce mode de vie permet à la population microbienne de s’installer et de

coloniser un environnement. L’état sessile ne se réduit cependant pas à l’attachement sur

une surface, mais constitue une réelle stratégie de survie, par la mise en place et le

développement d’une communauté véritablement organisée, à laquelle W. Costerton a

donné le nom de « biofilm » dès 1978 (Costerton, Geesey et al. 1978). Ces biofilms ont

été décrits dans un premier temps à travers les conséquences macroscopiques qu’ils

pouvaient avoir sur le recouvrement et la corrosion des canalisations ou bien encore des

coques de bateaux. Depuis quelques années, leur importance dans le domaine de

l’infectiologie médicale apparaît capitale, puisqu’on estime à près de 65% le nombre

d’infections bactériennes chez l’homme impliquant un biofilm (Chicurel 2000). La

formation d’un biofilm a été décrite sur de nombreux biomatériaux (Silverstein and

Donatucci 2003) (cathéters, valves cardiaques, matériel orthopédique,…), à partir

desquels ils peuvent attaquer les tissus corporels environnants. Les conséquences de ces

infections peuvent être désastreuses, imposant souvent la dépose du matériel prothétique

et pouvant même mettre en jeu le pronostic vital du patient dans le cas d’une septicémie

généralisée. La gestion de ces complications constitue une prise en charge souvent

difficile et coûteuse.


1.1.1. Développement du biofilm bactérien

Le biofilm bactérien peut se définir comme une communauté bactérienne,

adhérente à une surface et enrobée d’une matrice exopolysaccharidique (Costerton,

Stewart et al. 1999). Son développement répond classiquement à trois étapes

successives : l’attachement, la colonisation et l’accroissement (Hall-Stoodley,

Costerton et al. 2004). L’étape initiale d’attachement fait intervenir, pour certaines

espèces, des appendices générateurs de mouvements, qui permettent l’approche de la

surface à coloniser (O'Toole and Kolter 1998). Cette approche permet, par le biais de

protéines spécifiques comme les adhésines, un attachement transitoire et une

évaluation de la surface à coloniser. Dans un

deuxième temps, une association plus stable

avec la surface elle-même ou avec d’autres

micro-organismes déjà présents peut alors

s’établir (Hinsa, Espinosa-Urgel et al. 2003).

Ces rassemblements conduisent à la formation

de micro-colonies, dont la différenciation

cellulaire mène à l’élaboration du biofilm

(Stoodley, Sauer et al. 2002; Webb, Givskov et

al. 2003). La matrice exopolysaccharidique,

dont le volume peut représenter jusqu’à 85% du

volume total du biofilm, renforce sa structure,

tout en lui conservant une grande plasticité.

L’organisation d’un réseau de canaux aqueux au

sein du biofilm permet l’acheminement de

l’oxygène et des nutriments entre les micro-

colonies et vers les régions les plus enfouies,

ainsi que l’évacuation des déchets. Toutefois,

u

d

a

d

K

F

D

igure 1-1 : Biofilm bactérien observé enmicroscopie électronique à transmission’après (Costerton, Stewart et al. 1999).

n gradient de nutriments et d’oxygène existe depuis la superficie vers la profondeur

u biofilm, où l’environnement devient plus propice aux organismes évoluant en

naérobiose. Ainsi, l’état métabolique d’une bactérie au sein du biofilm peut être

irectement dépendant de sa localisation à l’intérieur de la structure (O'Toole,

aplan et al. 2000; Tolker-Nielsen and Molin 2000; O'Toole 2003). La capacité des


bactéries à former des biofilms a été largement étudiée, sur de nombreuses espèces

différentes : Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Vibriae cholerae,

Escherichia coli ou Pseudomonas aeruginosa. La détermination des modifications

d’expressions génétiques des différentes espèces, à la fois dans le but de leur

conférer des capacités à développer des organelles spécialisées dans les

déplacements (flagelles, pili, fimbriae,..) et dans l’organisation communautaire, fait

l’objet de nombreuses recherches. Prigent-Combaret et coll. (Prigent-Combaret and

Lejeune 1999) ont ainsi mis en évidence une modification dans l’expression de 38%

des gènes d’ E. coli lors de la formation d’un biofilm. Ces modifications dans

l’expression des gènes semblent coordonnées par un mode de régulation particulier,

correspondant à un mode de communication spécifique entre bactéries d’une même

espèce. Ce système, particulièrement étudié sur le modèle de biofilm développé par

P. aeruginosa, est appelé « quorum sensing » (Parsek and Greenberg 2000). Il est

basé sur la sécrétion de phéromones diffusibles, les acyl-homosérines lactones (acyl-

HSL), et leur réception par les récepteurs membranaires des bactéries de la même

espèce. Les HSL produits par une bactérie présentent des longueurs et des

substitutions différentes dans leurs chaînes d’acides gras. Elles donnent une

indication de la densité cellulaire dans un environnement donné, et conditionnent au-

delà d’un certain seuil la formation du biofilm, voire le déploiement de facteurs

toxiques pour certaines souches pathogènes (de Kievit and Iglewski 2000). Ces

systèmes de signalisations semblent aussi intervenir dans des interactions entre

bactéries d’espèces différentes, sans que ces mécanismes soient encore bien élucidés

(Chicurel 2000).

1.1.2. Résistance aux antibiotiques

L’éradication d’un biofilm bactérien pose de gros problèmes cliniques, car

l’antibiothérapie active habituellement sur les bactéries à l’état planctoniques se

révèle bien souvent moins efficace sur des structures organisées en biofilm (Brooun,

Liu et al. 2000; Stewart and Costerton 2001).

Les mécanismes de résistance habituels, basés sur des modifications

enzymatiques, des mutations ou des pompes membranaires d’efflux, ne semblent pas

entrer en jeu dans les résistances observées dans les biofilms bactériens (Mah and


O'Toole 2001). En revanche, la dispersion des bactéries d’un biofilm permet

généralement de constater l’efficacité des antibiotiques adaptés (Anwar, van Biesen

et al. 1989; Williams, Venables et al. 1997).

Trois hypothèses principales sont avancées afin d’expliciter les mécanismes de

résistance des biofilms aux antibiotiques (Stewart and Costerton 2001). La première

repose sur une notion de barrière physique qui expliquerait la pénétration lente et

incomplète de certains antibiotiques. La seconde hypothèse est liée à

l’environnement spécifique du biofilm, dont les zones les plus profondes, riches en

résidus acides et pauvres en oxygène et en nutriments, pourraient gêner l’action de

l’antibiotique. Enfin, la dernière hypothèse s’appuie sur les modifications

phénotypiques observées dans certains biofilms et dont les micro-organismes

constituants pourraient présenter des formes plus résistantes. Ces trois hypothèses

reposent sur la nature communautaire et multi-cellulaire du biofilm. La plupart des

spectres antibiotiques ont été étudiés sur des formes planctoniques, et doivent

maintenant être étudiés sur des

modèles de biofilms plus

complexes. Ainsi, de nouvelles

concentrations minimales

d’inhibition, ainsi que de

nouvelles associations

médicamenteuses doivent être

envisagées. Les recherches

actuelles essaient d’envisager

des molécules capables de

rompre ou d’empêcher la

formation de la matrice

polysaccharidique, voire d’agir

sur les signaux de

différentiation du « quorum

sensing ».

Pénétration en profondeur

La matriceexopolysaccharidique gênela diffusion du peptide enprofondeur.

Phénotype résistant

Certaines bactériesexpriment un phénotyperésistant lorsqu’elles sontdans le biofilm.

Micro-environnement

Les zones les plusprofondes sont unenvironnement enanaérobie et riche endéchets.

Figure 1-2 Les trois mécanismes de résistancedu biofilm aux antibiotiques.

D’après (Costerton, Stewart et al. 1999)


1.2 : Les biofilms fongiques

Les biofilms fongiques n’ont fait l’objet de travaux que depuis une vingtaine

d’années. Ces derniers sont pourtant de plus en plus souvent impliqués dans les

pathologies nosocomiales, lors de soins intensifs prolongés ou dans des populations à

risque comme les patients greffés ou séropositifs, qui sont immuno-déprimés. Parmi les

souches les plus souvent rencontrées lors de ces infections fongiques, le genre Candida, et

plus particulièrement l’espèce C. albicans, semble capable d’engendrer des complications

locales et générales. Ces candidoses sont généralement associées à des matériels médicaux

(Kojic and Darouiche 2004), implantés ou temporaires (cathéters, valves cardiaques,

lentilles, prothèses laryngées…), qui favorisent le développement du biofilm candidal à

leur surface.

1.2.1. Développement du biofilm candidal

La formation de ce biofilm répond aux mêmes étapes que celle d’un biofilm

bactérien, toutefois lors de la phase de colonisation une modification morphologique

est observable, caractérisée par l’apparition de filaments appellés hyphes. Le biofilm

mature est composé de morphotypes divers, spores, hyphes et pseudo-hyphes,

intégrés dans une matrice polysaccharidique. La nature chimique de la surface

influence la formation du biofilm: les surfaces comme le latex favorisent cette

formation, tandis qu’elle apparaît plus difficile sur des surfaces de polyuréthane ou

de silicone (Hawser and Douglas 1994) . L’architecture du biofilm candidal est aussi

influencée par le support sur lequel il se développe, laissant envisager des

mécanismes de régulation génétique hautement spécifiques, dépendants de la

réponse au contact avec la surface (Douglas 2003). L’hydrophobicité de la surface

semble positivement corrélée avec la formation du biofilm (Li, Yan et al. 2003), et

des conditions environnementales comme les turbulences rencontrées dans les

cathéters vasculaires ou urétraux favorisent la croissance de la levure (Hawser,

Baillie et al. 1998; Kojic and Darouiche 2004).


Figure 1-3 Biofilm candidal sur cathéter, dans la lumière interne (A) et sur la face externe (B).D’après (Lew and Kaveh 2000)

Les capacités de modification du phénotype, appelée « phenotypal switching »,

semblent aussi jouer un rôle prépondérant dans la formation de ce biofilm. Dans une

étude comparant le biofilm développé sur des cathéters par des souches C. albicans

sauvages et mutantes, incapables de polymorphisme, Baillie G. et Douglas LJ.

(Baillie and Douglas 1999) observent une architecture de biofilm totalement

différente et une adhérence à la surface du cathéter moindre pour les biofilms des

mutants. Ils suggèrent que le dimorphisme entre la forme sporulée et la forme avec

hyphes soit une condition nécessaire au développement du biofilm et par là même

une condition de la pathogénicité de C. albicans. Cette capacité de modification de

son phénotype permet à la levure de s’adapter aux conditions environnementales,

notamment lors de la croissance du biofilm, et explique aussi la grande diversité de

phénotypes selon sa localisation (orale, vaginale, urétrale, environnementale,…).

Des études récentes ont mis en évidence l’activation de gènes spécifiques lors

de cette phase de croissance, qui permettrait l’acquisition de ces phénotypes

particuliers (Garcia-Sanchez, Aubert et al. 2004). L’activation de ces gènes semble

sous la dépendance de molécules de signalisation de type « quorum sensing »,

certaines assurant un contrôle positif sur le passage à la forme hyphe comme le

tyrosol (Chen, Fujita et al. 2004), d’autres comme le farnesol un contrôle négatif

(Sato, Watanabe et al. 2004). Ces molécules constitueront certainement de nouvelles

voies thérapeutiques dans le futur.


1.2.1.1. Une forme clinique : la stomatite sous-prothétique

Dans le domaine odontologique, la pathologie la plus fréquente impliquant un

biofilm fongique est représenté par la stomatite sous-prothétique. Encore appellée

candidose sous-prothétique, c’est une forme de complication infectieuse impliquant

principalement C. albicans et qui peut affecter jusqu’à 65% des porteurs de prothèse

amovible complète (Budtz-Jorgensen 1990; 1990). La prévalence de cette candidose

est particulièrement forte dans les populations à risques que constituent les immuno-

déprimés, les diabétiques et plus généralement les patients âgés. Selon les études, la

proportion de patients hospitalisés et immuno-déprimés représente de 8 à 9% du

total des hospitalisés; de même le taux de prévalence du diabète dans l’union

européenne atteignait 4,1% en l’an 2000 (source OMS). Quant aux données

épidémiologiques concernant le vieillissement de la population, l’INSEE prévoit

qu’en 2050, en France, un tiers de la population (soit environ 22 millions de

personnes) sera âgée de plus de 60 ans. Ces données épidémiologiques confirment

que la candidose orale sous-prothétique sera certainement une préoccupation

croissante pour les années à venir.

Cette candidose, qui siège surtout au maxillaire et rarement à la mandibule

(Iacopino and Wathen 1992), est classiquement limitée, partiellement ou en totalité,

à la zone de muqueuse recouverte par la prothèse dentaire amovible. La muqueuse

présente alors un état inflammatoire chronique.

Figure 1-4 Candidose sous-prothétique : (A) forme modérée sous une prothèse amovible complète. (B) forme

sévère sous une prothèse amovible partielle. (Doc. Personnelle)

L’expérience montre que devant une stomatite prothétique, les praticiens

envisagent plus facilement soit une allergie à la résine acrylique qui reste très

exceptionnelle, soit un traumatisme prothétique. Or la nature candidosique de cette


stomatite est presque toujours retrouvée lorsqu’elle est recherchée. La présence de la

prothèse recouvrant la muqueuse palatine favorise la survenue d’une candidose. En

effet la muqueuse ne subit plus l’auto-nettoyage par la langue et par le brassage

alimentaire lors des repas, ce qui entraîne la stagnation de plaque dentaire sous la

prothèse et une légère diminution du pH buccal à ce niveau (Jeganathan and Lin

1992). Cette candidose, souvent asymptomatique, surtout au début, se décline selon

trois formes cliniques: un érythème punctiforme, ou diffus, ou bien encore une

hyperplasie épithéliale inflammatoire qui en constitue la forme la plus grave. La

porosité de l’intrados de la prothèse en résine acrylique permet à Candida et aux

autres germes saprophytes buccaux de trouver refuge. Ils sont toujours présents en

grand nombre sur la face muqueuse de la prothèse. Candida albicans, à l’état

parasitaire, présente des filaments à extrémités arrrondies, de 3 à 5 µm de diamètre,

et de longueur variable. Ces hyphes, résultent de l’alignement des blastospores

(forme commensale).

Figure 1-5 Biofilm prothétique. Observation en microscopie à balayage du biofilm à la surface d’une résineà prise retard après 21 jours de port.

En effet, les bourgeons ne se séparent pas de la cellule mère, prennent une

forme cylindrique réalisant un pseudomycélium (Samson 1990). L’analyse

ultrastructurale de ces formes parasitaires confirme la présence de nombreux noyaux

dans une masse cytoplasmique mobile (Walter and Frank 1985; Walter, Frank et al.

1986). Ce mycelium composé d’hyphes plus ou moins allongés et ramifiés envahit

les tissus épithélio-conjonctifs (Holmstrup and Axell 1990). Lorsque les hyphes sont


de grande taille, ils ne peuvent plus être phagocytés, des mécanismes comme la

prolifération et la desquamation de la barrière épithéliale sont alors nécessaires.

L’infection candidosique est sans doute l’élément inducteur ou déclenchant de la

stomatite, mais l’irritation traumatique par la prothèse qui occluse le palais, la prise

de certains psychotropes, le tabagisme, une mauvaise hygiène buccale et un mauvais

nettoyage de la prothèse sont sûrement des facteurs prédisposants ou aggravants non

négligeables (Lucas 1993).

1.2.2. La résistance aux antifongiques

La résistance des biofilms impliquant C. albicans a été étudiée par de

nombreux auteurs. Chandra et coll. (Chandra, Kuhn et al. 2001) ont étudié la

formation de tels biofilms sur des surfaces de polyméthacrylate de méthyle et ont

montré que leur résistance vis-à-vis des traitements antifongiques classiques que

sont l’amphothéricine B, la nystatine, le fluconazole et la chlorhexidine, s’accroît au

fur et à mesure de la formation du biofilm. Ces résultats sont concordants avec ceux

observés par d’autres équipes sur des biofilms développés à la surface de cathéters

(Hawser and Douglas 1995; Baillie and Douglas 1999). De nouvelles molécules,

telles les echinocandines et les formulations lipidiques de l’amphotéricine B,

semblent avoir une activité sur le biofilm candidal (Jabra-Rizk, Falkler et al. 2004;

Kuhn and Ghannoum 2004). Les recommandations actuelles imposent quasi-

systématiquement la dépose du matériel médical car malgré une thérapie

antifongique adaptée, le risque de développer une candidose généralisée est

important. Les études relevant les cas de candidémie observent une mortalité allant

jusqu’à 40% des cas (Colombo and Guimaraes 2003; Martin, Mannino et al. 2003).

Données bibliographiques Chapitre 2 – Les traitements antimicrobiens de surface

2Chapitre 2 : Les traitements antimicrobiens de surface

des biomatériaux

Depuis l’avènement de la notion de biofilm, beaucoup d’efforts ont été faits sur les

biomatériaux et sur leur capacité à ne pas laisser se constituer ce biofilm à leur surface. En

effet, tout processus de contact entre un biomatériau et un tissu engendre une cascade

d'évènements, conséquence de l'adsorption de protéines puis de l’adhésion (ou non) de

diverses cellules à la surface du solide. Ces phénomènes initiaux à l’interface sont

primordiaux car ils conditionnent l'adhésion de bactéries (Van Loosdrecht, Lyklema et al.

1990) mais aussi des éléments cellulaires nécessaires à l’intégration du matériel. Deux

stratégies de traitement de surface sont habituellement étudiées : la première consiste à

lutter contre l’adhésion bactérienne (Jansen, Peters et al. 1988), la seconde, à éliminer ces

agents pathogènes par l’incorporation de molécules antimicrobiennes (Pascual 2002). Ces

deux axes répondent aussi à deux indications cliniques différentes, la première s’adresse à

des matériaux destinés à être explantés ou à usage temporaire, tandis que la seconde

s’adresse à des matériaux implantés dans un tissu à long terme.

Dans le but de modifier la surface des biomatériaux, diverses approches peuvent être

utilisées :

• la modulation des propriétés physico-chimiques de surface telles que la

mouillabilité, la charge de surface ou la rugosité,

• le greffage de molécules en surface du matériau ou le dépôt par adsorption de

molécules qui assureront un relargage contrôlé,

Selon les applications recherchées, le recouvrement de surface devra être stable dans

le temps ou il pourra être dégradé rapidement, selon que la protection recherchée soit de

plusieurs mois ou de quelques heures.


2.1 : Les traitements physico-chimiques

De nombreux paramètres sont reconnus influencer l’adhésion bactérienne. Parmi

ceux-ci, on peut citer : le caractère hydrophile/hydrophobe de la surface, défini par sa

mouillabilité ; les forces électrostatiques en présence, caractérisées par les charges de

surface du biomatériau et de la membrane bactérienne ; la topographie et la rugosité de la

surface qui conditionnent la facilité d’adhésion bactérienne.

2.1.1. La mouillabilité de surface

Le caractère hydrophobe ou hydrophile d’une surface joue un rôle sur

l’adsorption des protéines, sur l’étalement cellulaire, et sur l’adhésion bactérienne.

Van Dijk et al. (van Dijk, Herkstroter et al. 1987) ont ainsi étudié in vitro chez le

chien beagle, la relation entre l’énergie de surface et l’adhésion de streptocoques sur

des échantillons de poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA), de poly(vinyl siloxane)

(PVS) et de poly(tétra-fluoro-éthane) (PTFE). Ces différents échantillons, fixés sur

des couronnes réalisées sur les molaires des chiens, sont récupérés 2 heures après

leur mise en place. Ils concluent qu’une forte énergie de surface est corrélée avec

une forte adhésion. Des travaux plus récents sur l’adhésion de C. albicans à des

surfaces de PVS confirment ces résultats (Waters, Williams et al. 1997). De façon

plus générale, il est souvent constaté que les surfaces très hydrophobes conduisent à

une faible adhésion (Olsson, van der Heijde et al. 1992; Everaert, Mahieu et al.

1999; Tsibouklis, Stone et al. 1999). Les caractéristiques d’énergie de surface du

matériau peuvent être modifiées en ce sens par greffage chimique, avec des

molécules de polyéthylène glycol (Park, Kim et al. 1998; Zhang, Desai et al. 1998),

ou des molécules de Téflon (Legeais, Werner et al. 1998). Enfin, des monocouches

auto-assemblées (SAMs) contenant des groupements fonctionnels différents peuvent

également contribuer à modifier le caractère hydrophile/hydrophobe de la surface

(Margel, Vogler et al. 1993).


2.1.2. La charge de surface

Il est reconnu que la charge de surface influence l’adhésion cellulaire. Les

forces électrostatiques interviennent en effet dans l’adhésion de la bactérie sur la

surface lorsque la distance est suffisamment faible (moins de 20 nm) (Busscher and

Weerkamp 1987) .

Figure 2-1 Interactions à l'interface du matériau. Pour des distances > à 50 nm seules les forces de Van derWaals interviennent, entre 10-20 nm les répulsions électrostatiques entrent en jeu, à <5 nm des interactionsspécifiques interviennent et maintiennent l’adhésion bactérienne (interactions hydrophobes, électrostatiques

ou de type ligand/récepteur). D’après (Busscher and Weerkamp 1987).

Qiu et al. (Qiu, Sayer et al. 1998) ont montré, sur des surfaces d’oxyde

d’indium et d’étain dont la charge était électriquement modulée, que les cellules

adhèrent plus sur les surfaces positives. Hogt et al. (Hogt, Dankert et al. 1986) ont,

eux, observé l’adhésion de staphylocoques sur divers polymères et confirment la

diminution d’adhésion sur les surfaces chargées négativement. Des études

spécifiques à l’adhésion de C. albicans sur des surfaces de PMMA de charges

différentes ont corroboré ces résultats (Uyen, van der Mei et al. 1989; Harkes, Feijen

et al. 1991). Toutefois, pour Gottenbos et al., les surfaces de charge positive, bien

que favorisant l’adhésion, exerceraient une action antibactérienne sur les bactéries à

Gram négatif (Gottenbos, Grijpma et al. 2001; Gottenbos, van der Mei et al. 2003).


2.1.3. La topographie et la rugosité de surface

La topographie de surface et en particulier sa rugosité ont une grande

importance vis-à-vis de l’adhésion bactérienne. En ce qui concerne la « micro-

rugosité », elle peut permettre une meilleure adhésion de certains types cellulaires

(Cooper 2000) mais peut aussi être à l’origine d’une forte adhésion bactérienne et

des macrophages (Salthouse 1984) avec le risque associé de réactions

inflammatoires chroniques. De nombreux travaux sur des échantillons de cobalt-

chrome, de PVS et de PMMA confirment que le polissage de la surface permet de

réduire l’adhérence de Candida albicans (Verran and Maryan 1997; Radford, Sweet

et al. 1998; Taylor, Maryan et al. 1998).

En conclusion, les résultats des différentes études apparaissent parfois

contradictoires, laissant perplexes certains auteurs sur la valeur des relations entre les

caractéristiques thermodynamiques d’une surface et sa capacité à influencer l’adhésion

bactérienne (Morra and Cassinelli 1997). Ainsi, le rôle de la pellicule salivaire dans la

diminution globale de l’impact de ces facteurs physico-chimiques est confirmé par de

nombreuses études (Vasilas, Molina et al. 1992; Radford, Sweet et al. 1998). Les modèles

étudiés in vitro diffèrent et ne peuvent rendre compte de la complexité des phénomènes de

l’adhésion bactérienne in vivo, où les interactions protéiques, cellulaires, l’incidence des

flux et des fluides physiologiques, sont autant de cofacteurs influençants.

2.2 : Les traitements par incorporation d’agents antimicrobiens

Divers types de molécules peuvent être déposés à la surface des matériaux. Les

cathéters en polyuréthane sont certainement les dispositifs médicaux ayant le plus

bénéficié de ces divers traitements de surface. Parmi les systèmes les plus répandus, on

peut citer : les recouvrements à l’héparine, les imprégnations aux antiseptiques ou aux

antibiotiques.


2.2.1. Les recouvrements à l’héparine

L’héparine est utilisée à la surface de certains cathéters, notamment ceux

destinés à l’artère pulmonaire (cathéters de Swan Ganz). L’héparine prévient la

thrombose en interagissant avec l’antithrombine, diminuant ainsi les dépôts de

fibronectine. Dans une récente méta-analyse (incluant cathéters imprégnés

d’héparine, héparine intraveineuse et sous cutanée), il a été montré que la

prophylaxie anti-thrombotique réduit significativement le risque de colonisation

bactérienne du cathéter, et tend fortement à réduire le risque de bactériémie

(Randolph, Cook et al. 1998). Chez l’enfant, 2 études, confirment ces résultats. Une

étude prospective consécutive a comparé les cathéters fémoraux standards aux

cathéters imprégnés d’héparine. Une hémoculture par le cathéter était réalisée tous

les 3 jours. Il existait un plus faible taux d’hémocultures positives prélevées sur le

cathéter imprégné (Krafte-Jacobs, Sivit et al. 1995). Plus récemment, une étude

randomisée en double aveugle a confirmé ces résultats (209 patients ont été inclus).

Les hémocultures positives étaient moins fréquentes chez les enfants avec un

cathéter imprégné d’héparine (Pierce, Wade et al. 2000). Certains auteurs expliquent

ces propriétés antibactériennes par la forte hydratation de la molécule d’héparine,

qui créerait ainsi une surface hydrophile et anti-adhésive (Arciola, Radin et al.

1993). D’autres auteurs attribuent plutôt ces propriétés antibactériennes au chlorure

de benzalkonium qui est un détergent cationique liant l’héparine à la surface du

matériau (Mermel, Stolz et al. 1993).

2.2.2. L’imprégnation par des antiseptiques

L’iode a été initialement utilisé, mais sans développement commercial

ultérieur malgré des résultats prometteurs in vitro (Jansen, Kristinsson et al. 1992).

Une approche ultérieure, validée par des travaux in vitro (Li, Zhang et al. 1999),

s’est concentrée sur l’imprégnation interne et externe par un ammonium quaternaire,

le chlorure de benzalkonium, et deux études cliniques récentes ont permis d’obtenir

une réduction significative de la colonisation bactérienne (Moss, Tebbs et al. 2000;

Jaeger, Osthaus et al. 2001). En pratique clinique, c’est l’ion argent qui est


actuellement le traitement de surface le plus répandu, en raison de sa large activité

sur de nombreux micro-organismes nosocomiaux, tels que les staphylocoques

(résistants ou non à la méticilline), les entérobactéries, P. aeruginosa et C. albicans

(Darouiche 1999). Dès 1979, Akiyama et al. ont rapporté de bons résultats cliniques

avec l’utilisation de cathéters urétraux imprégnés d’ions argent (Akiyama and

Okamoto 1979). En dépit de résultats contrastés et jugés parfois non significatifs

(Bach, Eberhardt et al. 1999) (peut-être liés à la seule imprégnation externe des

cathéters), des résultats prometteurs ont été récemment obtenus avec une technique

de dispersion de micro-particules d’argent dans la matrice même du polyuréthane

(Guggenbichler, Boswald et al. 1999), qui permet de prolonger l’activité anti-

adhésive et anti-colonisation pendant plus d’un mois in vitro. Boswald et al.

(Boswald, Lugauer et al. 1999) ont ainsi obtenu chez 263 malades porteurs de

cathéters de durée moyenne de 8-9 jours une réduction significative de la

colonisation de 23% à 14%.

Les recouvrements à base d’ions argent ont été testés aussi sur des valves

cardiaques, sans complications majeures. Les auteurs ont toutefois noté un pic

sanguin en ions argent juste après la mise en fonction de la valve, confirmant un

relargage partiel (Brutel de la Riviere, Dossche et al. 2000).

L'imprégnation par deux antiseptiques (chlorhexidine/sulfadiazine-argent)

(Chl-SAg), uniquement sur leur face externe, a été initialement proposée par Modak

et al. (Modak, Sampath et al. 1987) en raison de l’activité synergique de ces 2

composants envers un large spectre de micro-organismes. Maki et al. ont obtenu

ainsi une réduction du taux de colonisation (13,5 vs 24%) et de bactériémies liées

aux cathéters (1,0 vs 4,7%) (Maki, Stolz et al. 1997) dans une étude prospective

portant sur 403 cathéters insérés chez 158 malades de réanimation. D'autres études

ne montrent qu'une tendance, non significative, en faveur de tels cathéters (Ciresi,

Albrecht et al. 1996; Pemberton, Ross et al. 1996), voire une absence complète

d’efficacité pour les cathétérismes de durée supérieure à 20 jours en onco-

hématologie (Logghe, Van Ossel et al. 1997), sans doute en raison de la perte

progressive de l’activité antimicrobienne des antiseptiques, élués dans la circulation

au cours du temps, et du fait que l’imprégnation externe seule néglige le risque de


contamination endoluminale, qui augmente avec le temps et la multiplication des

manipulations de la ligne veineuse.

Une méta-analyse de la littérature, menée par Veenstra et al. (Veenstra, Saint

et al. 1999) a évalué les 12 études cliniques prospectives ayant comparé ce type de

cathéters imprégnés à des cathéters identiques non imprégnés, soit 2611 cathéters.

Elle conclut à l’efficacité anti-infectieuse de l’imprégnation par chlorhexidine et

sulfadiazine-argent, tant au plan de la colonisation bactérienne que des bactériémies.

Une autre méta-analyse, plus récente, confirme ces données (Marin, Lee et al. 2000).

D’autres recouvrements de surface associant la chlorhexidine et le

chloroxylenol ont démontré une activité antibactérienne forte sur des clous intra-

medullaires (Darouiche, Farmer et al. 1998).

Enfin, plus récemment, une technique de recouvrement de surface par un

complexe hydroxyapatite-chlorhexidine a été proposée en traumatologie, pour la

surface des vis associées aux fixateurs externes (Campbell, Song et al. 2000;

DeJong, DeBerardino et al. 2001). Ce type de traitement améliore à la fois

l’intégration osseuse et la résistance antibactérienne.

Toutefois, des réactions d'hypersensibilité à la chlorhexidine (dont un choc

anaphylactique mortel (Oda, Hamasaki et al. 1997)) auraient été rapportées, et

l’apparition d’une résistance secondaire à ces antiseptiques ne peut être écartée

(Tattawasart, Maillard et al. 1999).

2.2.3. L’imprégnation par des agents antibiotiques

L’imprégnation peut être réalisée industriellement, ou parfois manuellement

lorsque le matériau le permet (ciment à os). Le potentiel clinique de ce nouveau

concept a été évalué pour la première fois en 1991 par Kamal et al. dans une étude

prospective et randomisée, en service de réanimation (Kamal, Pfaller et al. 1991). En

comparant des cathéters veineux centraux imprégnés ou non par la céfazoline, les

auteurs ont montré que les cathéters imprégnés réduisaient de 12% l’incidence de

colonisation bactérienne. Un suivi à long terme a permis aux mêmes auteurs de

confirmer les avantages de ces cathéters imprégnés de céfazoline par rapport aux

cathéters traditionnels (Kamal, Divishek et al. 1998).


L'imprégnation par deux antibiotiques (minocycline / rifampicine) a été

proposée par Raad et al. (Raad, Darouiche et al. 1996), sur la base d’une activité

anti-staphylococcique de cette combinaison équivalente à celle des glycopeptides, au

moins en application « topique ». Dans une première étude clinique multicentrique,

Raad et al. ont comparé les cathéters Min-Rif au même matériel non imprégné chez

201 malades pour lesquels un cathéter était mis en place pour une durée supérieure à

72 heures. La colonisation et l’incidence des bactériémies étaient significativement

réduites avec les cathéters Min-Rif (26% vs 8%).

Des études récentes ont comparé in vitro et ex vivo les propriétés anti-

adhésives et antibactériennes des cathéters imprégnés de Chl-SAg et de Min-Rif vis

à vis des staphylocoques, des entérobactéries et de Klebsiella pneumoniae. Si

l’activité ex vivo des cathéters Rif-Min envers Staphylococcus aureus minocycline

résistants, S. epidermidis et E. faecalis apparaît supérieure à celle des cathéters Chl-

SAg dans le travail de Marik et al. (Marik, Abraham et al. 1999), les résultats de

Yorganci et al. sont plus nuancés. Dans leur étude, d’une manière générale, les

propriétés anti-infectieuses des 2 types de cathéter étaient similaires et durables (21

jours) pour le staphylocoque (Yorganci, Krepel et al. 2002). De manière

intéressante, les agents antibactériens étaient relargués au cours du temps dans

l’environnement des cathéters, avec un effet bactéricide durable pour Chl-SAg et

bactériostatique pour Min-Rif (Yorganci, Krepel et al. 2002). Dans une étude

multicentrique prospective randomisée, Darouiche et al. ont comparé les cathéters

Min-Rif (avec des concentrations de rifampicine et de minocycline très supérieures à

celles des premières études) aux cathéters Chl-SAg (imprégnés d’antiseptiques

seulement sur leur face externe), chez 738 patients porteurs au total de 865 cathéters

(Darouiche, Raad et al. 1999). L’étude a conclu à la supériorité des premiers sur les

seconds, tant pour la réduction de la colonisation bactérienne que pour la diminution

du risque infectieux (3,4% vs 0,3%). Plus récemment, cette même association Min-

Rif a été validée in vitro et in vivo sur des valves cardiaques (Darouiche, Mansouri et

al. 2002).

Dans le domaine orthopédique, le PMMA utilisé comme ciment pour les

prothèses, peut être mélangé à un autre antibiotique de la classe des aminosides, la

gentamicine. Les premières tentatives de mélange entre une résine de PMMA et


antibiotique datent des années 70 (Buchholz and Engelbrecht 1970). Le relargage de

l’antibiotique répond aux lois de la diffusion. Il est à la fois proportionnel au

potentiel hydrophile du ciment, et à sa surface. Les différents ciments disponibles

commercialement démontrent des taux de relargage différents, principalement

fonction des propriétés hydrophiles des composants polymères. Le relargage

antibiotique se fait essentiellement à partir de l’épaisseur superficielle du ciment.

Figure 2-2 Relargage de la Gentamicine à partir des ciments osseux. Processus en deux temps: 1) absorption d'eau, 2) relargage.

Cependant, plusieurs études montrent que la plus grande partie des

antibiotiques reste confinée dans le ciment (Powles, Spencer et al. 1998). Wahlig et

Dingeldein (Wahlig and Dingeldein 1980) observent des traces de gentamicine dans

les tissus environnant la prothèse après 5 ans et attribuent ce relargage tardif aux

craquelures et aux fêlures du ciment . De façon générale, les études portant sur la

cinétique de relargage démontrent un taux initial relativement élevé, puis une

réduction marquée pendant les jours suivants. Cette cinétique est typique à tous les

ciments PMMA (Kühn 2000). Les études démontrent que les formulations

commerciales donnent de meilleurs résultats que les mélanges manuels (Neut, van

de Belt et al. 2003). Toutefois, dans un souci de limitation des risques d’apparition

de souches résistantes, les aminosides en application locale permettant ces mélanges

manuels ont été interdits, et seules les formulations préparées industriellement sont

utilisées en France. Les études récentes se penchent sur l’association de plusieurs

antibiotiques, de divers adjuvants ou moyens physico-chimiques améliorant ce

système (Hendriks, van Horn et al. 2004).

En conclusion, parmi les critiques formulées envers ces imprégnations

antibiotiques figure leur durée d’action efficace limitée dans le temps, liée à un relargage

rapide et très partiel, de l’ordre de 15% seulement, de la quantité totale de produit

incorporé dans le matériau (van de Belt, Neut et al. 2000; Neut, van de Belt et al. 2003).


Cette cinétique de relargage antibiotique qui se poursuit longuement à faible dose pose

cependant un problème bien plus crucial, qui est celui du risque de voir se développer des

souches résistantes à terme (Tunney, Ramage et al. 1998; van de Belt, Neut et al. 1999).

Enfin, bien que rarement décrites, des réactions anaphylactiques peuvent apparaître (Oda,

Hamasaki et al. 1997).

2.2.4. Les nouveaux axes de recherche

D’autres voies de recherche font actuellement l’objet d’intenses investigations

afin de pallier ces inconvénients, soit par la création de liaisons covalentes entre les

molécules actives et le matériau, soit en exploitant des propriétés physico-chimiques

nouvelles.

Parmi ces nouveaux axes, on peut citer:

- L’incorporation covalente d’héparine dans la matière des cathéters

(Appelgren, Ransjo et al. 1996).

- L’incorporation covalente d’ammonium quaternaire dans le silicone

(Darouiche, Mansouri et al. 2002)

- L’incorporation d’argent et de benzalkonium dans le polyuréthane,

l’ensemble donnant une activité antibactérienne similaire à celle de Chl-

SAg et plus durable (25 jours vs 14 jours) (Li, Zhang et al. 1999).

- L’incorporation d’argent, de platine et de micro-particules de carbone sous

la surface du polyuréthane. En contact avec les liquides biologiques, ces

métaux natifs provoquent in vitro la formation d’un flux constant d’ions

argent à proximité du cathéter, phénomène appelé « ionophorèse

oligodynamique ». Les auteurs avancent une activité anti-infectieuse in vitro

de 9 mois, qui ouvre d’intéressantes perspectives pour les matériels

implantés à long terme (Milder 1999).


- L’utilisation de courants positifs de faible voltage (10mA) pour supprimer

ou réduire l’implantation des micro-organismes qui sont habituellement

porteurs de charges négatives (Liu, Tebbs et al. 1993; Raad, Hachem et al.

1996). Cette technique a été appliquée avec succès in vitro à des cathéters

imprégnés de carbone ou d’argent : l’élution suivant les cas de peroxyde

d’hydrogène ou d’ions argent permet de prévenir toute colonisation par de

hautes concentrations de staphylocoque. Il est possible que la combinaison

de courants de faible ampérage avec divers agents anti-infectieux offre de

réelles perspectives cliniques.

L’avenir appartient sans doute aussi aux avancées de la biologie moléculaire et

de la biologie cellulaire. C’est ainsi que des recherches actuelles s’orientent vers le

développement de messagers susceptibles de s’opposer à la formation du biofilm

bactérien, tels que des anticorps bloquant l’adhésine de S. aureus qui médie sa

fixation à la fibronectine (Sun, Smith et al. 1997). Enfin, l’analyse structurale de la

signalisation inter-bactérienne (quorum-sensing) qui semble nécessaire à la

maturation du biofilm (Davies, Parsek et al. 1998), donnera peut être de nouveaux

moyens dans la lutte antimicrobienne.

Données bibliographiques Chapitre 3 – Les films en multicouches de polyélectrolytes

3Chapitre 3 : Les films en multicouche de polyélectrolytes

3.1 : Aspects physico-chimiques des films en multicouche

La méthode de dépôt couche par couche (LbL de l'anglais "Layer-by-Layer") est

basée principalement sur les interactions électrostatiques qui existent entre des éléments

anioniques et cationiques adsorbés alternativement sur un support. Cette technique permet

de s'affranchir en grande partie de la nature, de la taille et de la topologie du substrat.

3.1.1. Principe du dépôt couche par couche

Plusieurs types de molécules chargées ou de nano-objets peuvent être

envisagés dans la méthode du dépôt couche par couche, les polyélectrolytes étant les

plus utilisés pour construire ce type d'architecture. Le principe de la méthode de

construction est décrit schématiquement dans la figure 3.1. Un substrat, chargé

négativement, est exposé à une solution de polycations pendant un temps variant de

5 à 20 min (Ramsden, Lvov et al. 1995; Advincula, Aust et al. 1996; Hoogeveen,

Cohen Stuart et al. 1996). Les polycations s'adsorbent à la surface du substrat et le

surplus est éliminé par simple rinçage (Caruso, Donath et al. 1998; Lvov, Ariga et

al. 1999). Après rinçage, la surface n'est pas neutre mais chargée positivement car il

y a surcompensation de charge lors de l'adsorption.

Exposé ensuite à une solution contenant des polyanions, le film peut se

construire car ces polyanions peuvent également interagir et s'adsorber. Cette


adsorption est à nouveau suivie d'une étape de rinçage et le signe de la charge de

surface, à l'issue du rinçage, est à nouveau inversé. Des cycles consécutifs, alternant

l'adsorption de polycations et de polyanions, permettent ainsi la croissance par

étapes de l'architecture du film de polyélectrolytes. Grâce aux multiples interactions

électrostatiques entre les polyélectrolytes et le substrat, les films présentent une

bonne uniformité et généralement une bonne adhésion sur le substrat.

Figure 3-1 Schéma simplifié de la construction d'une multicouche depolyélectrolytes par adsorptions successives de polycations et depolyanions et par répétition cyclique des deux étapes représentées.

D’après (Decher 1997).

La surcompensation de charge à chaque étape du dépôt a été clairement mise

en évidence par des mesures du potentiel électrocinétique (charge de surface)

(Hoogeveen, Cohen Stuart et al. 1996; Caruso, Lichtenfeld et al. 1999; Ladam,

Schaad et al. 2000) et constitue le principe de construction des multicouches de

polyélectrolytes. Outre les interactions électrostatiques, des forces secondaires à

courte distance, comme les interactions hydrogènes et hydrophobes, ont également

une influence sur l’épaisseur et la morphologie finales.

La méthode de dépôt par trempages successifs dans les différentes solutions est

la méthode la plus simple à mettre en œuvre. Elle peut être réalisée mécaniquement

par un automate et s’adapte à tous les substrats classiquement utilisés dans les

études. Toutefois, d’autres techniques de dépôt ont été étudiées en vue de changer la

structuration des films ou de les déposer plus rapidement. Ainsi, les polyélectrolytes

peuvent être déposés à l’aide d’un procédé aérosol, le spray, contenant

alternativement des polycations et polyanions. Schlenoff et al. (Schlenoff, Dubas et

al. 2000) ont ainsi construit des films à base de PSS/PDADMAC en présence de sel

(1M) en effectuant un rinçage entre chaque couche. Les auteurs ont comparé ces

films à ceux réalisés par immersion et montrent que les spectres infrarouges ainsi


que la perméabilité aux ions sont identiques. De même, pour des temps de contact

similaires, les épaisseurs mesurées par ellipsométrie sont similaires.

Une autre possibilité consiste à utiliser la méthode de « spin coating ». Il s’agit

de déposer une gouttelette de polyélectrolytes sur une surface en rotation qui est

étalée par force centrifuge lorsque la surface est mise en mouvement. Le temps de

dépôt d’une seule couche peut être ainsi réduit à quelques secondes (Chiarelli, Johal

et al. 2001). En utilisant des solvants très volatiles, il est donc possible de construire

des films sans rinçage entre les dépôts de polyélectrolytes. Les films déposés par

cette méthode présentent une stratification homogène.

Il est aussi possible de renforcer la cohésion du film une fois assemblé, afin de

moduler certaines de ses propriétés physico-chimiques. Ceci est obtenu par le biais

d’une réticulation entre les différents constituants du film (« cross-linking »).

Trois méthodes sont principalement utilisées pour réaliser cette réticulation :

- la réticulation thermique, qui consiste à placer le film à haute température

pendant un certain temps. Elle peut être appliquée à des polyélectrolytes

contenant des groupements amine et imine, qui en réagissant avec des

groupements carboxyliques vont former des liaisons amides ou imides (Lee

and Kunitake 1994; Harris, DeRose et al. 1999) .

- la réticulation chimique, qui utilise différentes molécules, appelées agents de

couplage, en vue de réaliser des ponts chimiques entre les polyélectrolytes.

Plusieurs agents de couplage, agissant sur des groupements réactifs différents,

ont été étudiés : le glutaraldéhyde (Brynda and Houska 1996), le tétraéthyl

orthosilicate, ou encore les carboiimides qui permettent la formation de

liaisons amides entre les groupements acide carboxylique et amine (Schuetz

and Caruso 2003).

- la photo-réticulation, qui fait intervenir un agent photo-sensible incorporé dans

le film ou couplé à un des polyélectrolytes. Son activation à la longueur d’onde

requise déclenche le processus de réticulation (Chen, Huang et al. 1999;

Vuillaume, Jonas et al. 2002). L’intérêt de cette méthode réside dans la


possibilité qu’elle offre de réaliser des motifs gravés, en utilisant des masques

limitant l’action de la source lumineuse.

Le choix des constituants du film en multicouche se fait en fonction des

applications envisagées. Les applications biomédicales devant évidemment répondre

à des principes de biocompatibilité et de non-toxicité, le respect de ces critères

impose le choix des composants. En revanche, la méthode d’assemblage doit être

choisie selon des critères liés au contexte industriel ou individuel de la construction.

3.1.2. Nature du substrat

Les supports les plus souvent utilisés dans la littérature sont des surfaces

planes ou des particules colloïdales, dont le matériau et les dimensions dépendent

des applications envisagées et/ou des techniques de caractérisation employées. Il

peut s’agir de substrats inorganiques tels que des lames de verre (Decher 1997), de

quartz (Lvov, Ariga et al. 1995), de mica (Kim, Han et al. 1999) ou de silicium

(Sukhorukov, Montrel et al. 1996; Thierry, Winnik et al. 2003) ou encore d'argent

(Yamada and Shiratori 2000). Des substrats inorganiques fréquemment utilisés dans

les matériaux odontologiques tels que l'or (Caruso, Niikura et al. 1997; Kurth and

Osterhout 1999) ou le titane fritté (Vautier, Hemmerle et al. 2003), l’acier (Tan, Ji et

al. 2003) ou les particules de calcium (Gao, Leporatti et al. 2001) peuvent être

recouvertes. On peut également utiliser des substrats organiques, en polymères,

comme des particules colloïdales de polystyrène (Donath, Walther et al. 1997), de

silicone (Ai, Meng et al. 2003) , de latex (Schuetz and Caruso 2002); mais aussi des

polymères greffés avec des groupements ioniques (Teflon) (Chen and McCarthy

1997) et même des polymères standards non chargés (polypropylène, polystyrène,

poly(éthylène-téréphtalate)) (Delcorte, Bertrand et al. 1997; Brynda and Houska

2000).


Figure 3-2 Observation en polyélectrolytes (PG

Dans ce dern

hydrophobe qui as

générale, comme l’

taille ou de forme

structures bi et tri

exemple, de diriger

vue de construire d

Jiang and Hammo

D'autres formes pe

assemblant des mu

dissoutes sélectivem

Mohwald 1999; 19

3.1.3. Croissance du

Au fur et

polyélectrolytes, sa

croissance des film

croissance linéaire

a b

microscopie environnementale à balayage d’un film (a) en multicouche deA-PLL)20 sur une surface de PMMA polie (b). (Doc. personnelle)

ier cas, ce sont des interactions de type Van der Waals et/ou

surent l'adsorption du polyélectrolyte sur le support. De façon

auto-assemblage en multicouches n'impose aucune restriction de

aux supports, il est même possible de concevoir également des

-dimensionnelles (Hammond 1999). Il est devenu possible, par

la formation de films selon des motifs imposés par le substrat en

es microstructures complexes régulières (Chen, Jiang et al. 2000;

nd 2000; Zheng, Rubner et al. 2002; Berg, Choi et al. 2003).

uvent également être envisagées comme des sphères creuses en

lticouches sur des particules de latex qui sont ensuite calcinées ou

ent avec un acide ou un solvant organique adéquat (Caruso and

99).

film en multicouches

à mesure de la construction du film en multicouche de

masse et son épaisseur augmentent. L’étude de la cinétique de

s fait apparaître deux types de films différents: les films à

de ceux à croissance exponentielle.


3.1.3.1. Les films à croissance linéaire

Les films à croissance linéaire sont construits dans des conditions telles que,

lors de chaque dépôt, les polyélectrolytes de la solution n’interagissent qu’avec les

polyélectrolytes de charge opposée constituant la surface externe du film (Decher

1997). De telles conditions sont remplies lorsque les polyélectrolytes ne peuvent pas

diffuser vers l'intérieur du film, par exemple à cause de sa trop forte densité. Le

système poly(allylamine)/poly(styrène sulfonate) (PSS/PAH) constitue l’un des

exemples les plus étudiés de ce type de multicouche. Il existe un désordre local et un

degré élevé d'interpénétration entre couches adjacentes, ce qui confère au film une

certaine homogénéité de structure et de distribution de charge (Decher, Lvov et al.

1994; Korneev, Lvov et al. 1995). De leurs études, ces auteurs ont également déduit

que les multicouches de polyélectrolytes doivent présenter une stoechiométrie 1:1

entre les groupes anioniques et cationiques.

L'épaisseur, la densité, la rugosité et la structure des films à croissance linéaire

peuvent être contrôlées quasiment à volonté en changeant les paramètres physico-

chimiques lors de la construction. En utilisant des polyacides et des polybases

faibles, il est possible de faire varier l’épaisseur de chaque nouveau dépôt de moins

d'un nanomètre à quelques dizaines de nanomètres en ajustant de manière adéquate

le pH de la solution de polyélectrolytes (Shiratori and Rubner 2000). Ainsi, lorsque

l'un au moins des deux polyélectrolytes est faiblement chargé, il interagit avec le

polyélectrolyte de charge opposée en formant des boucles. L'épaisseur d'une

bicouche (polyanion/polycation) devient alors plus importante. De tels films sont

généralement très hydratés.

3.1.3.2. Les films à croissance exponentielle

En augmentant le taux de sel en solution, certains auteurs ont observé une

croissance plus rapide que la croissance linéaire, qu’ils ont appelée « super linéaire »

(Ruths, Essler et al. 2000; McAloney, Sinyor et al. 2001). Ils ont relié cette

augmentation d’épaisseur à une augmentation de la rugosité du film. En effet,


l’augmentation de la rugosité entraîne une augmentation de l’aire de la surface

d’adsorption et, par conséquent, de la quantité de matière déposée.

Les films construits à base de polypeptides comme les systèmes PLL/PGA

(Lavalle, Gergely et al. 2002) et à base d’un polypeptide et d’un polysaccharide, le

hyaluronane (PLL/HA) (Picart, Lavalle et al. 2001) en sont deux exemples types.

L’épaisseur des films peut atteindre un à plusieurs micromètres après le dépôt d’une

vingtaine de paires de couches. Ces épaisseurs permettent de visualiser la

structuration en z du film, après marquage fluorescent d’un des polyélectrolytes, par

le biais de la microscopie confocale. Il a été mis en évidence que la croissance

exponentielle du film est liée à la diffusion d’au moins l’un des deux

polyélectrolytes constituant le film, à chaque étape de dépôt (Picart, Mutterer et al.

2002). Le mécanisme de construction associé à la diffusion est schématisé sur la

Figure 3-3 pour le système PLL/HA dans lequel le PLL diffuse.

HAPotentiel

électrostatique

A

potentiel chimique

B

PLLPotentiel

électrostatique

C

PLL potentiel chimique

Potentielélectrostatique

Formation de complexes

PLL/HA potentiel chimique

PotentielélectrostatiqueHA

E

D

Rinçagepotentiel chimique


HA

F

potentiel chimique


Réservoir de PLL

potentiel chimique

HAPotentiel

électrostatique

A

potentiel chimique

B

PLLPotentiel

électrostatique

C



C




PLL/HA potentiel chimique


E


PLL/HA potentiel chimiquepotentiel chimique


E


E

D

Rinçagepotentiel chimique


potentiel chimique


HA

F

potentiel chimique


HA

F

potentiel chimique


Réservoir de PLL

potentiel chimique

Figure 3-3 Schéma du mécanisme de construction d’un film multicouche (PLL/HA), basée sur la diffusiondu polycation: (A) le mécanisme proposé débute par un film s’achevant par une couche de HA chargée

négativement, (B,C) le film est mis en contact avec la solution de polycation (PLL) ; la majeure partie desmolécules de PLL diffuse dans le film; quelques chaînes s’adsorbent sur le film, rendant sa charge de

surface positive; (D) après le rinçage, quelques chaînes de PLL polycations libres restent dans le film; (E)Lors de l’adsorption de HA, les molécules de PLL libres diffusent à l’interface et se complexent avec le HA

présent en solution qui s’adsorbe sur le film; (F) En fin d'étape E, la surface est de nouveau chargéenégativement et une grande partie des molécules de PLL libres a été utilisée pour complexer le HA. Le cycle

d'adsorption peut alors recommencer (Picart, Lavalle et al. 2001)


Dans un premier temps, les molécules de PLL diffusent dans le film au

moment du dépôt de la solution de PLL (Fig. 3-3, B et C). Lors du rinçage, ces

molécules de PLL « libres » ne seront que partiellement éliminées car une partie

seulement diffuse vers la surface du film et sort du film (Fig. 3-3, D). En effet, toutes

les molécules ne sortent pas en raison de l’existence d’une barrière de potentiel en

surface du film. Lors de l’addition de HA, ces molécules de PLL peuvent à nouveau

diffuser hors du film mais au contact de la solution de HA, elles vont complexer et

s’adsorber en surface du film pour en constituer la couche supérieure (Fig. 3-3, E).

Le nombre de molécules de PLL piégées dans le film est en première approximation

proportionnel à l’épaisseur du film. Cela entraîne une augmentation de l’épaisseur de

la couche de HA en fonction du nombre de couches déposées et conduit ainsi à un

régime de croissance exponentielle (Lavalle, Picart et al. 2004). De tels films

possèdent des caractéristiques physico-chimiques proches de celles d’un hydrogel

notamment en raison de leur forte teneur en eau.

3.2 : Fonctionnalisation des films en multicouche

Une interface est définie comme "fonctionnalisée" dès lors qu'on lui confére une

ou des propriété(s) spécifique(s) en la modifiant chimiquement ou physiquement. Ainsi,

des matériaux adhérents vis-à-vis de cellules ou rendus non adhérents par dépôt d'un film

sont dits "fonctionnalisés". Conférer à des matériaux des propriétés anti-inflammatoires,

antibactériennes ou les rendre capables de libérer dans le temps des substances actives

constituent d'autres exemples de fonctionnalisation. Les films en multicouche peuvent être

fonctionnalisés, soit par insertion de protéines (identiques ou différentes) à un ou plusieurs

niveaux de l’édifice, soit par couplage d’un peptide à un polyélectrolyte suivi de

l’insertion au sein ou en surface du film (Figure 3-4). Ces multicouches peuvent aussi être

constituées exclusivement de protéines. Les architectures peuvent aussi être

fonctionnalisées par insertion de médicaments. Enfin, les multicouches peuvent posséder

des propriétés anti-adhérentes ou antibactériennes par la nature chimique des

polyélectrolytes employés.


Figure 3-4: Schéma des deux modes de fonctionnalisation des films en multicouche de polyélectrolytes : soit

par l’intégration dans le film d’une protéine active(A) (Lvov, Katsuhiko et al. 1996), soit par l’utilisationd’un polyélectrolyte couplé à un principe actif (B) (Chluba, Voegel et al. 2001).

3.2.1. Fonctionnalisation par insertion de peptides ou de molécules libres

Afin que les protéines puissent rester actives dans le film, il est important

d’éviter leur dénaturation. Des analyses par spectroscopie infrarouge à transformée

de Fourier ont montré la conservation de la structure secondaire des protéines

insérées dans les architectures de polyélectrolytes (Schwinté, Voegel et al. 2001;

Schwinté, Ball et al. 2002). L’enfouissement des protéines présente même

l’avantage de les stabiliser thermiquement en empêchant la formation de feuillets β

intermoléculaires.

L’activité potentielle d’un film fonctionnalisé est aussi liée au comportement

de la molécule active au sein du film. Szyk et al. (Szyk, Schaaf et al. 2001; Szyk,

Schwinte et al. 2002) ont montré qu'une fraction importante des protéines comme la

HSA, adsorbées ou insérées, diffuse latéralement dans des films de type PAH/PSS.

Les coefficients de diffusion latérale sont de l'ordre de 10-10 à 6 × 10-11 cm2/s selon

la nature des polyélectrolytes qui entourent les molécules de HSA dans

l'architecture.

Enfin, les études biologiques confirmant le maintien de la structure et de

l’activité des molécules incorporées dans le film sont nombreuses. Ainsi, par

exemple, sur le plan structurel, Caruso et al. (Caruso, Niikura et al. 1997) ont


montré que des immunoglobulines (IgG) enfouies sous un petit nombre de couches

de polyélectrolytes continuent à interagir avec leurs antigènes. Sur le plan

fonctionnel, il a été montré que des enzymes, comme la glucose-oxydase, la

peroxydase et la glucose-amylase, inclues dans les films, conservent toute leur

activité enzymatique (Onda, Lvov et al. 1996).

Plus récemment, il a été démontré que des cellules peuvent communiquer avec

une protéine, la protéine A, enfouie au sein des films multicouches. Jessel et al.

(Jessel, Atalar et al. 2003) ont ainsi inséré la protéine A (à activité anti-tumorale)

dans des films multicouches de type (PLL/PGA) puis ont déposé des myocytes à sa

surface. La réponse cellulaire a été analysée en mesurant la production d’une

cytokine pro-inflammatoire, le TNFα (facteur de nécrose tumorale) en réponse à

l’interaction cellule/protéine A. Quand la protéine A est recouverte de dix paires de

couches, la production de TNFα est maximale après une durée de contact de 2H et

atteint un plateau après cette durée. Ces auteurs ont pu visualiser un film constitué

de vingt paires de couches en co-marquant la protéine A en rouge et la PLL-FITC en

vert : ils ont montré que la protéine reste localisée dans le film. Ils ont pu également

observer des dégradations locales du film par les macrophages ainsi que le

développement de pseudopodes. Ces pseudopodes permettraient à la cellule

d’atteindre la protéine A enfouie.

Ces différentes observations confirment i) le maintien de la molécule active

insérée au sein du film en multicouches, dans lequel elle semble toutefois capable de

se déplacer, ii) le maintien de la structure secondaire garante de son activité, iii) les

interactions cellulaires rendues possibles par l’enfouissement ou la pénétration par

pseudopodes de celles-ci.

3.2.2. Fonctionnalisation par couplage de peptides ou de molécules

Une autre voie de fonctionnalisation consiste à inclure dans l’architecture un

polyélectrolyte modifié par couplage covalent à un peptide ou à une autre molécule.

Les premiers travaux dans ce domaine sont ceux de Chluba et al. (Chluba, Voegel et

al. 2001) qui ont évalué la réponse de mélanocytes (cellules de mélanomes) mises au


contact de films (PLL/PGA) dont certaines couches de PLL étaient remplacées par

de la PLL couplée à l’hormone α-mélanocortine (α-MSH). Cette hormone

peptidique est un stimulateur potentiel de la mélanogénèse. Ces auteurs ont tout

d’abord vérifié que le peptide couplé (PLL-α-MSH) déposé en couche terminale du

film conserve une activité similaire à celle de l’hormone libre. Ils ont montré que la

profondeur d’enfouissement du peptide (peptide enfoui sous une à trente paires de

couches) joue un rôle sur l’activité cellulaire surtout aux temps courts. La réponse

aux temps longs n’est que peu affectée par la profondeur d’enfouissement. Une

explication possible à cette observation est que la communication puisse être établie

grâce à la diffusion de la PLL-α-MSH à travers tout le film, de façon similaire à ce

qui a été montré pour les films (PLL/HA). Une autre origine pourrait être la

dégradation du film par les cellules, mais l’insertion de couches de (PSS/PAH) non

dégradables par les enzymes n’empêche pas totalement la communication cellulaire.

3.2.3. Fonctionnalisation par les propriétés propres des polyélectrolytes

L’étude des propriétés propres aux composants des films a porté

essentiellement sur la modulation des propriétés d’adhésion, protéiques ou

cellulaires.

L’utilisation de polyélectrolytes naturels tels que le chitosan et le dextrane

sulfate (Serizawa, Yamaguchi et al. 2000; Serizawa, Yamaguchi et al. 2002) pour la

construction des films permet de moduler des propriétés pro ou anticoagulantes vis-

à-vis du milieu sanguin. La force ionique des solutions de polyélectrolytes lors de la

construction des films joue un rôle primordial sur ses propriétés. L'augmentation de

la concentration saline conduit à une augmentation de l’épaisseur par couche

déposée, ainsi qu'à une augmentation de l'excès de charges négatives observé après

chaque dépôt de dextran. Ainsi, à partir de la troisième bicouche, et pour une teneur

en sel supérieure à 0.5 M, un comportement procoagulant est obtenu lorsque le film

s'achève par le chitosan et un comportement anti-coagulant lorsque la structure se

termine par le dextran. Les propriétés anticoagulantes sont expliquées par l'excès de

charges introduit par la couche externe de dextran. Pour les autres conditions (taux

de sel plus faibles et films plus minces), un comportement procoagulant est obtenu.


Des constructions identiques réalisées par dépôts successifs de chitosan et

d'héparine à partir de solutions à 1 M en NaCl possèdent de fortes propriétés

anticoagulantes, quelle que soit la nature de la couche extérieure. En 1999, Elbert et

al. (Elbert, Herbert et al. 1999) ont déposé des multicouches de type poly(L-lysine)

/alginate sur des supports solides de gélatine, de matrice extracellulaire produite par

des fibroblastes et de collagène de type I. Ces films constituaient un premier

exemple de multicouches à croissance exponentielle possédant des propriétés de bio-

inertie vis-à-vis de fibroblastes humains.

En effet, la construction de ces multicouches sur une surface initialement

"adhésive" permet d'obtenir une surface inerte vis-à-vis des cellules. D'autres

multicouches à base de polysaccharides comme le système PLL/HA et chitosan/HA

se sont depuis également révélées non adhérentes vis-à-vis des cellules de

chondrosarcomes (Richert, Lavalle et al. 2002) ou d'ostéoblastes.

Récemment, Mendelsohn et al. (Mendelsohn, Yang et al. 2003) ont démontré

que des multicouches réalisées à partir de poly(allylamine hypochloride) (PAH) et

d’acide poly(acrylique) (PAA) possèdent des propriétés d'adhérence modulable vis-

à-vis d'une lignée de fibroblastes. En effet, en faisant varier les conditions de pH lors

de la construction des films, ils parviennent à modifier les propriétés des

multicouches vis-à-vis de l'adhérence cellulaire. De façon surprenante, lorsque le

polyanion et le polycation sont tous les deux déposés à pH 2.0, ces films se montrent

très résistants vis-à-vis de l'adhésion cellulaire, que le film s'achève par une couche

de polycations ou de polyanions. Un comportement similaire était noté vis-à-vis de

ces mêmes cellules lorsque le PAA était remplacé par l'acide poly(méthacrylique) ou

le poly(styrène sulfonate) (PSS) et pour le système chlorure de poly(diallyldimethyl

ammonium) et PSS. Ces auteurs ont de plus mis en évidence une corrélation directe

entre le caractère non adhérent des films et leur capacité, une fois séchés, à gonfler

lorsqu'ils sont remis au contact d'une solution aqueuse. L'ensemble de ces résultats

suggère fortement que le caractère non adhérent d'une multicouche est directement

lié à son degré d'hydratation. D'autre part, ces auteurs démontrent également

l'absence de corrélation directe entre l'adsorption de protéines sur un film et sa non-

adhérence vis-à-vis des cellules. En effet, bien que les films multicouches soient

modulables en ce qui concerne l'adhérence cellulaire, les protéines (lysozyme et

fibrinogène) s'adsorbent en quantité égale sur tous les films multicouches testés. Ce

résultat remet fortement en cause le postulat sur lequel étaient fondées toutes les


études d'adsorption de protéines durant des dizaines d'années. Il était entendu que

des surfaces non adhérentes vis-à-vis des cellules devaient également être non

adsorbantes vis-à-vis des protéines.

Richert et al. (Richert, Lavalle et al. 2002) ont utilisé la technique de

micromanipulation pour évaluer quantitativement des forces d’adhésion entre des

cellules de chondrosarcome et des films de PLL/PGA construits à pH 7.4 se

terminant par PGA ou PLL. Alors que pour des films s'achevant par PGA les forces

d'adhésion sont très faibles, voire nulles, elles sont beaucoup plus importantes sur les

films se terminant par PLL. Sur ces derniers, la force d'adhésion décroît avec le

nombre de bicouches. Par ailleurs, une forte adsorption protéique a été observée sur

les films se terminant par PLL, alors que les films se terminant par PGA semblent

prévenir totalement l’adsorption protéique, du moins au pH 7.4 auquel le film a été

construit.

L'équipe de Kotov [Grant et al. 2001] a construit des films en utilisant du collagène

de type-I alterné avec du PSS. Les films contenant un nombre variable de couches

de collagène conduisent à une bonne adhérence de cellules telles que les cellules

musculaires (myoblastes).

L'élaboration de multicouches anti-adhésives constitue non seulement un

objectif en soi mais s'inscrit aussi dans une démarche visant à rendre certaines

surfaces sélectivement non adhérentes à certains types cellulaires. Pour cela, la voie

envisagée consiste à fonctionnaliser des couches non adhérentes par des peptides

d'adhésion spécifiques de certains types cellulaires (ex : RGD, IKVAV,…).

Enfin, certaines équipes ont étudié les propriétés biologiques de multicouches

composées exclusivement de protéines. Leur construction est cependant plus

complexe. Dans un premier temps, des assemblages constitués par une alternance de

protéines et de polyélectrolytes, suivie par une réticulation du film multicouche par

le glutaraldéhyde, ont été réalisés [Brynda et al. 1996; Houska et al. 1997]. Des

constructions constituées uniquement de protéines ont également été obtenues après

élimination des polyélectrolytes non couplés, mais servant lors de la construction de

l'édifice [Gölander et al. 1990]. Ainsi, des assemblages constitués uniquement

d'albumine [Brynda et al. 2000] ou d'albumine et d'héparine ont été employés pour

le recouvrement d’équipements médicaux utilisés au contact de plasma.

Données biblioraphiques Chapitre 4 – Les peptides antimicrobiens

4Chapitre 4 : Les peptides antimicrobiens

4.1 : Deux systèmes de défense immunitaire

Au cours de l’évolution, deux systèmes de défense immunitaire ont été

sélectionnés: l’immunité innée et l’immunité acquise ou adaptative (Hoffmann, Kafatos et

al. 1999). La réponse acquise est apparue il y a environ 400 millions d’années. Elle

n’existe que chez les vertébrés et présente deux caractéristiques essentielles, la spécificité

de reconnaissance et la mémoire. La différence entre les réponses immunitaires innées et

acquises est principalement liée aux mécanismes de reconnaissance des micro-

organismes.

Dans le processus d’immunité innée, la reconnaissance est médiée par des

récepteurs dont la spécificité est génétiquement déterminée dès la naissance (d’où le terme

« inné »), et n’est pas modifiable. Ces récepteurs sont exprimés sur de nombreux types

cellulaires susceptibles de rencontrer des micro-organismes qui envahissent l’hôte:

certaines cellules épithéliales et endothéliales, les cellules dentritiques, les monocytes et

les macrophages. Au nombre d’une ou de deux centaines par espèce, leur spectre de

reconnaissance est dirigé vers des motifs structuraux microbiens largement répandus chez

ces organismes, mais absents des cellules de l’hôte. Ce sont, par exemple, les

lipopolysaccharides (LPS) des bactéries à Gram-négatif, les peptidoglycanes bactériens

(Dziarski 2003), les mannanes et β-(1,3)-glucanes des champignons et des levures. Toutes

les structures reconnues par les récepteurs de l’immunité innée sont communes à de très

nombreux micro-organismes car elles jouent un rôle essentiel dans la physiologie et la


survie de ces micro-organismes. Ce caractère «universel» et indispensable, rend peu

probable des mutations importantes et par conséquent une résistance au système

immunitaire inné (Gura 2001).

Le problème inhérent à la réponse immunitaire adaptative est celui de la durée de

la réaction de défense, en particulier lors de l’expansion clonale des lymphocytes naïfs en

cellules effectrices en réponse à une infection. Il faut en effet entre 3 et 5 jours pour que le

système acquière sa pleine efficacité pour combattre une infection, ce qui donne largement

le temps aux pathogènes de nuire à l’hôte. Là encore, la réponse immunitaire innée joue

un rôle crucial par ses mécanismes effecteurs (phagocytose, peptides antimicrobiens,

voies alterne et lectine du complément, par exemple) qui sont activés dès le début de

l’infection et contrôlent de façon quasi-immédiate la prolifération de pathogènes qui

envahissent l’hôte. Au bout de cette période, la réponse adaptative est en mesure de

prendre le relais chez les vertébrés.

Tous les métazoaires font appel à la réponse immunitaire innée pour combattre les

infections par les micro-organismes (bactéries, champignons, virus, parasites). Seuls les

vertébrés utilisent, en plus de la réponse innée, une réponse adaptative.

4.1.1. La reconnaissance de I’infection par le système immunitaire inné

Les micro-organismes se heurtent en premier lieu à des épithélia qui forment

une barrière ininterrompue au niveau de la peau, des muqueuses orales et

respiratoires, du tractus gastro-intestinal et du système uro-génital. Certaines cellules

de ces épithélia produisent rapidement des peptides antimicrobiens qui s’opposent

directement aux bactéries. Des cellules sanguines, essentiellement des

polynucléaires neutrophiles et des monocytes/macrophages, s’accumulent aux sites

où les micro-organismes ont réussi une pénétration et participent activement à la

défense en phagocytant les envahisseurs activant la réponse adaptative des

lymphocytes. Toutes ces réactions, pour rapides qu’elles soient, requièrent une

première étape de reconnaissance de l’agresseur microbien, qui est médiée par les

récepteurs de l’immunité innée et reconnaissent des motifs structuraux présents


uniquement sur des micro-organismes. Les Toll-like receptors (TLRs) ont des rôles

particuliers en ce sens qu’ils activent l’expression de très nombreux gènes de la

réponse immunitaire par le biais du NF-κB. A côté des TLRs, d’autres récepteurs

jouent un rôle important dans la lutte contre les infections, et ont fait l’objet de

travaux approfondis depuis de nombreuses décennies. Ce sont les récepteurs

sécrétés, présents dans la circulation (ex : mannose binding lectin (MBL)), et les

récepteurs de l’endocytose/phagocytose présents sur les phagocytes.

La découverte des Toll-like receptors est toute récente, puisqu’elle remonte

aux années 1997-1998. On sait de longue date que le lipopolysaccharide bactérien

est un puissant inducteur de réponses immunitaires et peut, dans certaines

conditions, être à l’origine d’un choc septique (Abreu and Arditi 2004). En 1990, il a

été montré qu’une protéine caractérisée par la richesse en domaines riches en résidus

leucine (LRR pour leucine rich repeats) appelée CD14 (Cluster Determinant), fixe le

LPS (Wright, Ramos et al. 1990). CD14 peut être circulante, mais est surtout fixée

sur de nombreuses cellules du système immunitaire par une ancre membranaire GPI

(glycosylphosphoinositide). Cependant, la simple présence de GPI ne permet au

récepteur CD14 d’activer des cascades de signalisation intracellulaire conduisant à

l’expression de gènes de la réponse immunitaire. L’interaction de CD14 avec les

récepteurs transmembranaires Toll-like permet le déclenchement de cette cascade.

On sait aujourd’hui que l’homme a dix gènes codant pour les TLR et que les

différents TLR de mammifères reconnaissent des motifs structuraux très divers, mais

essentiellement d’origine microbienne. Ainsi, TLR3 reconnaît l’ARN double brin

d’origine virale, TLR4 reconnaît le LPS, TLR5 la flagelline, TLR9 des séquences

d’ADN CpG non-méthylées propres à certains micro-organismes. TLR2 peut

s’associer à TLR1 ou TLR6 pour reconnaître différents lipopeptides bactériens.

TLR2 est en outre impliqué dans la réponse au peptidoglycane des bactéries Gram

positif.


Figure 4-1 Les différents récepteurs TLR reconnaissent des motifs microbiens spécifiques et participent àl'activation des réponses immunitaires innées et adaptatives.D’après (Hoffmann, Kafatos et al. 1999)

4.1.2. Les mécanismes effecteurs de la réponse innée

La reconnaissance des micro-organismes par les récepteurs de la réponse innée

déclenche selon le cas, des réactions différentes et complémentaires. Un premier cas

de figure est la reconnaissance par un récepteur phagocytaire, qui va induire une

série complexe de modifications au niveau de la membrane et du cytosquelette de la

cellule phagocytaire, suivie de l’internationalisation du micro-organisme, et sa mort.

Là encore, plusieurs mécanismes concourent à tuer le micro-organisme: peptides

antimicrobiens relargués à haute concentration dans la vacuole de phagocytose,

synthèse d’oxyde nitrique hautement bactéricide, production d’anions superoxydes

et de radicaux libres, protéases lysosomales. De plus, la présentation de fragments

peptidiques par les lymphocytes ayant ingéré des micro-organismes permet

l’activation de la réponse adaptative. La reconnaissance par le complément

déclenche une cascade de réactions qui toutes concourent à l’élimination de micro-

organismes. Quelques-uns des produits de clivage protéolytique des protéines du

complément jouent le rôle de chémoattractants pour les neutrophiles et les


monocytes/macrophages, favorisant l’inflammation au site de l’activation primaire

du complément. Par ailleurs, un complexe multimérique de protéines de complément

peut s’insérer dans la membrane microbienne et conduire à leur lyse. Enfin,

l’interaction entre des patterns microbiens et les TLRs déclenche une cascade de

signalisation intracellulaire aboutissant, entre autre, à la synthèse des peptides

antimicrobiens.

4.2 : Les peptides antimicrobiens

La synthèse de peptides antimicrobiens est partie constituante de la réponse

humorale innée aux infections microbiennes. Elle est commune aux mammifères comme

aux insectes et aux plantes, confirmant là son rôle fondamental dans l’évolution. A l’heure

actuelle, plus de 500 peptides à activité antimicrobienne ont été isolés (Bulet, Hetru et al.

1999; Zasloff 2002).

4.2.1. Structure et diversité des peptides antimicrobiens

Cette grande diversité rend leur classement difficile si ce n’est par le biais de

leur conformation structurale secondaire. Ce sont principalement des peptides

cationiques et de petite taille (2-5 kDa) qui présentent un caractère fortement

basique. Le caractère commun à presque tous les peptides antimicrobiens est la

faculté qu’ils ont de constituer, dans une structure secondaire, une conformation

amphipatique. Celle-ci se définit par l’existence de domaines hydrophobes et

cationiques distincts.


Figure 4-2 Structure secondaire schématisée d’un peptide linéaire (magainine 2) et d’un peptide cyclique àponts disulfures (défensine alpha humaine). Dans les deux cas, la structure secondaire permet la

constitution de domaines hydrophobes (vert) et cationiques (rouge).D’après (Zasloff 2002)

Ces molécules peuvent se regrouper en quatre familles sur la base de leurs

séquences et de leurs caractéristiques structurales : les peptides à hélice alpha

amphipatique, les peptides à pont disulfure, les peptides riches en proline et les

peptides riches en glycine (Dimarcq and Hoffman 1998).

- les peptides à hélice alpha amphipatique :

Ce sont en général des peptides linéaires dépourvus de résidus cystéine, comme les

cécropines (Steiner, Hultmark et al. 1981) ou les magainines (Zasloff 1987), qui

adoptent une structure à hélice alpha uniquement lors de la pénétration

membranaire (Bechinger, Zasloff et al. 1993).

- les peptides à pont disulfure :

Ils sont représentés par les bacténécines (Romeo, Skerlavaj et al. 1988) et les

défensines (Selsted, Harwig et al. 1985) et se caractérisent par la présence d’un

feuillet beta rigide, maintenu par un pont disulfure.

- les peptides riches en proline :

Ce sont en général des peptides linéaires, riches en résidus proline, dont les

domaines cationique et hydrophobe occupent les extrémités de la chaîne.

- les peptides riches en glycine :

Ils sont organisés en chaîne linéaire et comme leurs homologues riches en proline,

se caractérisent par la prédominance dans leur séquence de résidus glycine.


Ces peptides antimicrobiens sont, pour la plupart, représentés chez les êtres

multicellulaires. Ils sont tous dérivés de précurseurs, qui subissent des modifications

post-transcriptionelles. Si une parfaite concordance des séquences d’acides aminés

ne peut pas être rencontrée entre les différentes espèces et même au sein d’une

même espèce, il n’en reste pas moins que de nombreux motifs sont conservés et

retrouvés dans les précurseurs.

4.2.2. Mécanismes d’action

Les peptides antimicrobiens présentent une grande diversité de structures et de

spectres d’activité (Tossi and Sandri 2002). La plupart d’entre eux semblent agir sur

la membrane des micro-organismes, tandis que d’autres agissent après

internalisation sur des éléments intra-cytoplasmiques comme l’ADN et l’ARN pour

la Buforine (Park, Kim et al. 1998).

4.2.2.1. Spécificité d’action

Les peptides antimicrobiens présentent une grande diversité et sont présents

dans presque tous les tissus. Les mécanismes permettant à ces peptides de faire la

distinction entre les agents pathogènes et les cellules de l’hôte sont particulièrement

importants à définir, surtout en terme de toxicité pour l’hôte. Cette reconnaissance

spécifique repose sur plusieurs facteurs de reconnaissance, basés sur les différences

entre membranes eucaryotes et procaryotes, que nous évoquons ci-après.

Toutes les membranes biologiques sont constituées d’une mosaïque fluide de

protéines et de phospholipides. Pour certains organismes, des stérols (cholestérol,

ergostérol) et des glycérides peuvent compléter cette architecture. Cependant des

différences fondamentales existent entre les membranes plasmiques microbiennes et

les membranes plasmiques des organismes pluricellulaires, qui constituent autant de

critères de reconnaissance spécifique pour les peptides antimicrobiens.


♦ Composition , hydrophobicité et charge

La structure élémentaire, commune à presque toutes les membranes

biologiques, est la double couche phospholipidique. Les principaux phospholipides

entrant dans la composition de ces membranes sont la phosphatidylcholine (PC), la

phosphatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS) et la sphingomyéline

(SM). Outre ces phospholipides, les membranes animales contiennent aussi des

glycolipides et du cholestérol, dont sont dépourvues la plupart des cellules

procaryotes.

Figure 4-3 La membrane plasmique des cellules animales. Composition et Charge.(Cooper)

Les stérols, comme la PC, la PE et la SM ont des charges électriquement

neutres, tandis que les phospholipides hydroxylés, comme le phosphatidylglycérol

(PG) et son dimère la cardiolipine (CL), ou la PS présentent des charges négatives

nettes. La répartition entre les feuillets interne et externe, de même que la proportion

de ces composants diffère entre les cellules procaryotes et eucaryotes (figure 4-4).

Ainsi, dans de nombreuses membranes de pathogènes, la composition du feuillet

externe en PG, CL et PS, rend la charge de surface très négative (Matsuzaki 1999).

Au contraire, les membranes eucaryotes, riches en phospholipides dits

zwitterioniques (PE, PC, SM) ont une charge de surface globalement neutre.


Figure 4-4 Comparaison de lacomposition de la membranemicrobienne et animale. E. coli(blanc) ; S. aureus (hachureshorizontales) ; B. subtilis (gris) ;C.albicans (carrés) ; érythrocytehumain (noir).D’après (Yeaman and Yount 2003).

♦ Asymétrie m e mbranaire

La membrane est une structure asymétrique, tant dans la répartition des

composants au sein d’un feuillet, qu’entre les deux feuillets de la membrane. Cette

asymétrie est différente entre les cellules procaryotes et eucaryotes, et peut expliquer

la réponse spécifique lors de l’interaction avec un peptide antimicrobien cationique.

Lasch et al. ont ainsi observé une redistribution en secteurs totalement distincts, des

PE et des lipolysaccharides (LPS) après interaction de la membrane avec des

peptides cationiques (Lasch, Schultz et al. 1998). Ces exagérations dissymétriques

au sein de la membrane peuvent être responsables d’une dissociation membranaire,

et constituent une voie de discrimination sélective entre les cellules pathogènes et les

cellules de l’hôte.

♦ Ligands mem branaires microbiens

Si les phospholipides chargés négativement peuvent être considérés comme

des sites récepteurs privilégiés, des interactions autres, de type ligand-récepteur, ont

aussi été envisagées pour expliquer la spécificité de reconnaissance des peptides

antimicrobiens. Ainsi, Edgerton et al. ont observé la fixation d’histatine radioactive

sur la membrane de C.albicans (Edgerton, Koshlukova et al. 1998). La quantité

d’histatine fixée à la membrane varie d’un facteur dix entre la cellule et le

sphéroblaste. Cette observation permet aux auteurs de conclure à l’inexistence


d’interactions de type électrostatique ou hydrophobe, mais plutôt à l’acquisition par

la cellule d’un ligand spécifique.

♦ Potentiel tran smembranaire

Une autre différence fondamentale entre les cellules eucaryotes et procaryotes

réside dans le potentiel de charge transmembranaire. Les cellules animales

présentent habituellement une différence de potentiel de l’ordre de -90 à -110 mV,

tandis que les bactéries en phase exponentielle de croissance ont une différence de

potentiel variant entre -130 et -150mV. Cette caractéristique a aussi été avancée dans

le mécanisme de la reconnaissance spécifique (Hancock 1997).

En conclusion, ces aspects biophysico-chimiques expliquent en partie la spécificité

de reconnaissance des peptides antimicrobiens. Cependant, d’autres phénomènes semblent

entrer en jeu. Ainsi, les travaux in vivo de Welling et al. montrent, après injection

intraveineuse d’ ubiquicidine et de lactoferrine marquées, une affinité et une spécificité de

ces peptides antimicrobiens pour des zones infectées par S. aureus, K. pneumoniae ou C.

albicans, par rapport à des zones inflammatoires stériles (Welling, Paulusma-Annema et

al. 2000). Les auteurs concluent, dans une deuxième étude, à la capacité des peptides

antimicrobiens circulants à reconnaître une zone infectée d’une zone saine (Welling,

Lupetti et al. 2001). Ces résultats indiquent que les peptides antimicrobiens sont capables

de localiser rapidement les sites infectés et de s’y accumuler.

4.2.2.2. Mode d’action

Les caractéristiques principales permettant de déterminer l’action d’un peptide

antimicrobien sont liées à sa conformation, sa charge, son amphipathie, son

hydrophobicité et son angle de polarisation. Une charge cationique minimum est

ainsi nécessaire, afin de permettre l’attraction électrostatique initiale et l’intégration

ou la translocation du peptide dans la membrane (Yeaman and Yount 2003). Mais

aucun de ces paramètres ne doit être excessif sans quoi le risque de cytotoxicité par

perte de la spécificité de reconnaissance est augmenté. Le mode d’action des


peptides antimicrobiens peut se diviser en trois temps : la fixation initiale,

l’intégration dans la membrane, la mort cellulaire.

♦ La fixation in i tiale du peptide

La fixation initiale du peptide antimicrobien est sous l’influence de facteurs

biophysiques et biochimiques.

Figure 4-5 Schéma des relations spécifiques entre le peptide antimicrobien et les membranes d’organismespluricellulaires et pathogènes. D’après (Zasloff 2002)

Parmi ceux-ci, l’attraction électrostatique est certainement le facteur le plus

important dans cette étape initiale. De nombreuses études ont ainsi montré la relation

directe entre la charge du peptide et sa capacité à se fixer sur une membrane

(Bessalle, Haas et al. 1992; Vaz Gomes, de Waal et al. 1993; Matsuzaki, Nakamura

et al. 1997; Dathe, Nikolenko et al. 2001). De même, la différence de potentiel

membranaire est nécessaire à cette étape initiale, comme l’ont montré les travaux de


Matsuzki (Matsuzaki, Sugishita et al. 1997) ou de Breukink et Kruijff (Breukink and

de Kruijff 1999).

D’autres interactions de type ligand-récepteur, ont aussi été envisagées dans

cette étape initiale. L’hypothèse d’une interaction spécifique, médiée par un

récepteur, a été proposée pour la nisine, après avoir observé son activité à des

concentrations nanomolaires, là où d’ordinaire les concentrations nécessaires aux

autres peptides antimicrobiens sont micromolaires. Breukink et Kruijff (Breukink

and de Kruijff 1999) ont montré que l’affinité de la nisine est 1000 fois plus

importante pour des vésicules intégrant le lipide II (composant de la membrane

bactérienne) que pour des vésicules en étant dépourvues. Ils concluent que cette

spécificité d’activité de la nisine est liée à une interaction de type récepteur-ligand

avec le lipide II. D’autres travaux récents, en démontrant une activité différente pour

des isoformes d’un même peptide, semblent confirmer cette voie d’interaction

spécifique pour certains peptides antimicrobiens (Vunnam, Juvvadi et al. 1997).

♦ Les interacti ons avec la membrane

Aucun mécanisme universel n’est clairement démontré, et tout porte à croire

que plusieurs mécanismes existent selon les différents peptides. Plusieurs modèles

d’action membranaire ont été étudiés, sur la base d’observations en spectroscopie à

dichroïsme circulaire (CD)(Stark, Liu et al. 2002), en spectroscopie à infra-rouge

(FTIR)(Sal-Man, Oren et al. 2002), en résonance magnétique nucléaire (NMR)

(Bechinger 1999), ou plus récemment à l’aide de la diffraction à rayons X (Ding,

Yang et al. 2003). Les mécanismes, de même que les spectres d’activité, sont à

l’évidence dépendants des méthodes et des conditions expérimentales (pH, forces

ioniques, température,…) utilisées (Vogt and Bechinger 1999). Toutefois, la

concordance des résultats permet de dégager les principales étapes de l’interaction

des peptides avec les membranes.

Trois facteurs conditionnent l’interaction peptide/membrane :


- le seuil d’activité: il est dépendant de la concentration du peptide, de sa

capacité à s’auto-assembler, de la composition et de la fluidité de la membrane

cellulaire (Yang, Weiss et al. 2000),

- la conformation: le changement de conformation après la fixation du peptide à

la membrane a été largement décrit pour les peptides à hélice alpha. De

nombreux travaux ont ainsi démontré le changement de conformation, de

linéaire à hélicoïdale, des magainines au contact de la membrane cellulaire

(Matsuzaki, Harada et al. 1991; Bechinger, Zasloff et al. 1993). Au contraire,

les structures secondaires à feuillet β, que l’on retrouve dans les peptides à

pont disulfure, présentent une grande stabilité de conformation au contact des

phospholipides membranaires. Leur activité pourrait être conditionnée à une

modification de leur structure quaternaire, ou à une monomérisation (Yeaman

and Yount 2003),

- l’auto-assemblage : de nombreux travaux ont démontré l’existence

d’interactions entre peptides et phospholipides membranaires, dans le but de

former des structures plus complexes. Ce potentiel, propre à chaque peptide,

est fonction de la composition et de la conformation du peptide monomérique.

Ainsi, par exemple, les peptides à domaines hydrophobes et hydrophiles bien

définis, peuvent s’auto-assembler par la simple orientation favorable de ces

domaines, entre eux et avec les constituants membranaires. De tels

assemblages permettent la création de pores comme nous le décrivons ci-après.

Ces trois facteurs, variables pour chaque peptide étudié, expliquent la diversité

des modèles proposés pour expliquer le mode d’action des peptides anti-microbiens.

La plupart des modèles décrits dans la littérature, considèrent que la phase de

fixation à la membrane se poursuit par une perméabilisation de cette dernière, qui

peut à elle seule engendrer la mort cellulaire ou n’être qu’une étape intermédiaire.

De façon très schématique, la perméabilisation de la membrane serait le résultat

d’une interaction des peptides avec les bicouches lipidiques membranaires, soit par

la formation de structures de type pores ou canaux suivie de la fuite extracellulaire

du cytoplasme (Yang, Weiss et al. 2000) ou de la dépolarisation membranaire


(Westerhoff, Juretic et al. 1989), soit encore par rupture membranaire par excès

d’incorporation de peptides (Tossi, Sandri et al. 2000). Plusieurs modèles sont ainsi

décrits :

Le modèle des pores transmembranaires (Barrel-stave model)

Dans ce modèle, après fixation à la membrane, les peptides changent de

conformation puis insèrent leurs domaines hydrophobes dans la membrane en

repoussant les têtes hydrophiles des phospholipides. Lorsqu’un certain seuil est

atteint, les peptides s’internalisent et se regroupent dans la membrane en créant des

pores, dont la face externe est représentée par les domaines hydrophobes des

peptides monomériques, et la face interne par leurs domaines hydrophiles. Ainsi, ces

pores sont constitués de plusieurs monomères peptidiques orientés comme les

planches d’un tonneau (barrel stave).

Figure 4-6 Modèle des pores transmembranaires.Schéma décrivant le pore formé par les peptides

(rouge)et la membrane phospholipidique(bleu).(Doc. personnelle)

L’exemple type de peptide répondant à ce modèle est l’alaméthicine (Yang,

Harroun et al. 2001; Chen, Lee et al. 2003), cependant il semble ne convenir qu’à

très peu d’autres peptides.

Le modèle des pores toroïdaux (Toroidal pore, wormhole model)

La différence principale de ce modèle avec le précédent réside dans

l’organisation du pore, dont les lipides membranaires sont une partie constituante.

Ce modèle a été particulièrement bien décrit pour la magainine 2 par. Matsuzaki et

al. (Matsuzaki, Mitani et al. 1998) qui ont estimé le diamètre des pores formés par la


magainine à 2 ou 3 nanomètres. Ce modèle a été confirmé avec de nombreux autres

peptides, dont le PGLa (Wieprecht, Apostolov et al. 2000), la mellitine (Yang,

Harroun et al. 2001) et les protégrines (Yang, Weiss et al. 2000).

Après fixation à la membrane par les forces électrostatiques en présence, les

peptides prennent une conformation en hélice alpha, mais restent parallèles à la

surface membranaire (Hara, Mitani et al. 2001). Puis les domaines hydrophobes

s’enfouissent dans la membrane en déplaçant les têtes phospholipidiques, et

induisent une courbure positive de la membrane. Cette tension dans la membrane

permet, une fois le ratio peptide/lipide atteint, l’orientation perpendiculaire des

peptides et la formation du pore.

Figure 4-7 Modèle des pores toroïdaux. Le pore estformé par un assemblage composite fait depeptides_et de têtes phospholipidiques.(Doc

personnelle)

Le modèle « carpet-like »

Le « carpet model » est souvent décrit comme un mécanisme de type

détergent. Cependant, les peptides présentant ce mode d’action ne sont en aucun cas

des détergents. Le mécanisme repose sur l’accumulation d’un très grand nombre de

peptides à la surface membranaire. Cet enfouissement superficiel induit des

désordres et des limitations de fluidité dans la membrane qui finissent par entraîner

la rupture de celle-ci. L’exemple type est donné par la cécropine P1, dont les études

en spectroscopie infra-rouge (FTIR) menées par Sitaram et Nagaraj (Sitaram and

Nagaraj 1999) confirment l’orientation strictement parallèle sans atteinte de la

couche hydrophobe, avant la rupture membranaire.


Figure 4-8 Le modèle « carpet-like ». L’insertion et l’accumulation des peptides à la surface de la membraneentraînent des déplacements et des contraintes dans la fluidité qui aboutissent à une rupture de la

membrane. (figure droite d’après (Bechinger 1999))

Le modèle de Shai-Matsuzaki-Yang

Le modèle proposé par Shai-Matsuzaki-Yang (Matsuzaki 1999; Shai 1999;

Yang, Weiss et al. 2000) reprend ces différentes propositions, en les associant

chronologiquement. Après interactions électrostatiques entre les phospholipides

chargés négativement de la membrane et les acides aminés cationiques des peptides,

ces derniers s’étalent (« carpet model ») puis s’intègrent à la membrane créant alors

une déstabilisation générale. Si cette déstabilisation ne suffit pas à entraîner la

rupture de la membrane, le mécanisme peut alors se poursuivre par l’enfouissement

des hélices alpha et la formation de pores entraînant soit une osmolyse, soit la

diffusion de fragments peptidiques à cible intra-cellulaire.


Figure 4-9 Modèle de Shai-Matsuzaki-Yang expliquant le mode d’action des peptides antimicrobiens(d’après (Zasloff 2002))

4.2.2.3. Mécanismes de la mort cellulaire

♦ La perméabi l isation membranaire

La perméabilisation membranaire est l’effet principal des peptides

antimicrobiens, entraînant la mort cellulaire (Lehrer and Ganz 1996). Celle-ci peut

être rapide (2 à 3 min (Lehrer, Barton et al. 1989)), laissant supposer une

dépolarisation membranaire rapide, associée à une fuite d’ions et de métabolites et la

perte des fonctions essentielles comme la respiration (Blondelle, Lohner et al. 1999).

La perméabilisation de la membrane a été démontrée sur des bactéries à Gram-

négatif comme E. coli dont les deux membranes sont successivement perméabilisées

par les défensines humaines (Lehrer, Barton et al. 1989). Elle a aussi été mise en

évidence sur des Gram-positif (Ohta, Ito et al. 1992). Cependant, plusieurs études

ont pu montrer que ce mécanisme ne pouvait pas être systématiquement envisagé


comme seul responsable de la mort cellulaire (Zhang, Dhillon et al. 2000; Koo,

Bayer et al. 2001).

♦ L’inhibition des fonctions cellulaires vitales

Certaines études, comme celles de Park et al. (Park, Kim et al. 1998) sur la

Buforine II confirment l’existence de récepteurs intra-cytoplasmiques au niveau des

acides nucléiques intra-cellulaires. D’autres études sur C. albicans démontrent

l’existence d’une action de l’histatine-5 au niveau des mitochondries de cette levure

(Helmerhorst, Troxler et al. 2001). La perméabilisation membranaire, lorsqu’elle

existe, n’est pas responsable directement de la mort cellulaire, mais elle permet

l’internalisation du peptide.

D’autres mécanismes d’internalisation peuvent aussi entrer en jeu, sans pour

autant engendrer la formation de pores. C’est le cas de la Buforine II dont la

translocation à travers la membrane cellulaire est favorisée par sa structure

secondaire (Kobayashi, Takeshima et al. 2000).

4.2.2.4. La synergie d’action

Plusieurs études relatent une considérable diminution des concentrations

d’activité de certains peptides lorsqu’ils agissent en synergie. Kieffer et al. (Kieffer,

Goumon et al. 2003) montrent ainsi une synergie entre l’Ubiquitine et la

Chromogranine sur l’inhibition de la croissance de Neurospora crassa et de C.

albicans, la concentration minimale d’inhibition étant réduite respectivement d’un

facteur 5 et d’un facteur 2. Cette synergie peut s’expliquer par le rôle respectif de

chaque peptide, l’un formant les pores et l’autre s’internalisant. Cependant cette

synergie peut aussi se traduire par la formation de pores composés d’hétérodimères,

comme l’ont montré Hara et al. (Hara, Mitani et al. 2001), qui se révèlent plus

stables que ceux composés des mêmes monomères.

En conclusion, il semble donc que la mort cellulaire soit le résultat de plusieurs

mécanismes d’action indépendants ou coopérants. La réponse innée étant non-spécifique,

la réponse à l’infection se traduit systématiquement par la synthèse de très nombreux


peptides antimicrobiens utiles ou inutiles. Cette diversité de production et d’action permet

aux peptides antimicrobiens de s’adapter aux conditions physiologiques variables, tout en

restant actifs sur une grande variété de micro-organismes.

4.2.3. Résistance des micro-organismes

Ces mécanismes d’action très basiques pour la plupart des peptides

antimicrobiens, confèrent une grande sérénité face au risque d’apparition de

résistance. Cependant, plusieurs études rapportent des résistances, que l’on peut

globalement distinguer en résistances constitutives et résistances adaptatives.

Les résistances de type constitutives, sont liées à la composition en

phospholipides de la membrane et par conséquent à sa charge de surface. La

présence de molécules de cholestérol dans la membrane bactérienne semble réduire

l’activité des peptides antimicrobiens, par l’augmentation de la stabilité

membranaire mais aussi par certaines interactions spécifiques entre le peptide et le

cholestérol (Matsuzaki 1999). Certains genres bactériens, tels Morganella et

Serratia, présentent des membranes externes pauvres en phospholipides acides et

offrent par conséquent moins de sites de fixation pour les peptides cationiques

(Yeaman and Yount 2003). Nahaie et al. (Nahaie, Goodfellow et al. 1984) ont

examiné la composition de plusieurs espèces de Staphylocoques. Si la plupart

d’entre eux présentaient une structure riche en phospatidylglicérol (PG) et

cardiolipine (CL), S. aureus incluait dans sa membrane des ménaquinones insaturées

et des formes dérivées de PG nettement moins électronégatives. Cette configuration

diminue la charge négative de surface de la membrane et limite les interactions

électrostatiques. Une autre hypothèse de résistance constitutive est avancée par la

présence de glycocalyx à la surface de certaines capsules bactériennes. Celui-ci, très

anionique, emprisonnerait les peptides cationiques et limiterait ainsi leur contact

avec la membrane. Cette résistance a été démontrée pour les acides alginiques du

glycocalyx de P. aeruginosa par Friedrich et al. (Friedrich, Scott et al. 1999). Enfin,

le micro-environnement physiologique (forces ioniques, pH, …) dans lequel

certaines espèces évoluent in vivo, semble être à l’origine de leur résistance aux

peptides antimicrobiens (Dhawan, Yeaman et al. 1997).


Les résistances adaptatives correspondent à une réponse spécifique du micro-

organisme lors du contact avec le peptide antimicrobien. Ces mécanismes ont pu être

étudiés récemment, grâce notamment à des travaux sur des souches mutantes

génétiquement modifiées. Cette réponse peut se traduire par la sécrétion de protéases

capables de cliver certains peptides, ou par la modification de certains composants

membranaires en réponse à l’agression par les peptides antimicrobiens. Par exemple,

Guina et al. (Guina, Yi et al. 2000) ont démontré à la surface de Salmonella, la

présence d’une endopeptidase, PgtE, proche de la protéase VII d’E.coli, capable de

cliver des peptides cationiques. De même, la résistance aux défensines et aux

protégrines de S. aureus a été associée à la modification de ses composants

membranaires, notamment la production de lysyl-PG dérivé nettement moins

électronégatif (Peschel, Jack et al. 2001).

Ces mécanismes de résistance doivent faire l’objet de travaux complémentaires

afin de mieux comprendre leur fonctionnement. De même, l’étude de la résistance

naturelle de certains peptides antimicrobiens aux processus de dégradation des

micro-organismes permettra l’élaboration de nouvelles molécules.

Matériels et Méthodes

MATERIELS ET

METHODES


Chapitre 1 : Matériel

1.1 : Polyélectrolytes

Les polyélectrolytes sont préparés en solution aqueuse, à une concentration de 1

mg/mL. Le pH est ajusté avec des solutions d’acide chlorhydrique et de soude. Plusieurs

types de polyanions et polycations ont été utilisés. Leurs caractéristiques sont données

respectivement dans les tableaux 2-1 et 2-2.

Tableau 2-1 : Tableau récapitulatif des polyanions utilisés dans les multicouches.

Nom despolypeptides Notation Nature pKa Formule développée Fournisseur

Massemolaire

(Mw)

(103

g.mol-1)

Acide Poly(L-glutamique) PGA

Polypeptidesynthétiquedégradable

4.3 (Kyte 1995) Sigma ~55

Poly(4-styrènesulfonate) PSS Synthétique

non dégradable

2(Ahrens,

Baekmark et al.2000).

Aldrich 70

Acidehyaluronique HA

Polysaccharidenaturel

dégradable

2.9(Lapcík, Lapcík

et al. 1998)Bioiberica 400

.CH2

CH.

S

O

O O-

n

Na+

O

O

HH

HH

OOH

H OH

O

OH

OO

HH

HH

H NH

O

OH

CH3

O

OH

n

CH-CH2

-

C

O-O

n


Tableau 2-2 : Tableau récapitulatif des polycations utilisés dans les multicouches.

1.1.1. Construction des films multicouches de polyélectrolytes

Les substrats utilisés pour les études sont généralement à base de silice qui est

chargée négativement et présente une faible rugosité. De plus, sa transparence

facilite les observations optiques. Ces différentes caractéristiques font donc du verre

un bon support d’étude. Les résultats obtenus sur le verre sont facilement

transposables, car les films multicouches de polyélectrolytes possèdent rapidement

Nom despolypeptides Notation Nature pKa Formule développée Fournisseur

Masse molaire(Mw)

(103 g.mol-1)

Poly(L-lysine) PLLPolypeptidesynthétiquedégradable

10.5(Kyte 1995) Sigma 30

Poly(éthylèneimine) PEI Synthétique

non dégradablePolybase forte Aldrich 750

Poly(allylamine)hydrochloride PAH Synthétique

non dégradable

9(Mendelsohn,

Yang et al.2003)

Aldrich 70

Chitosan CHIPolysaccharide

natureldégradable

6.5(Denuziere,Ferrier et al.

1996)

FMCBiopolymer

110/128272/460

H2C

C

CH2

CH

O

NH

H2C

NH3+

. .

CH2

Br-

n

Cl-

CH-CH2

-

H2C

NH3+

n

O

O

HH

HH

OOH

H NH

O

OH

O

HH

HH

OH

H NH2

O

OH

O

CH3

H

DA 1-DA


au cours de leur construction des caractéristiques indépendantes du substrat (Ladam,

Schaad et al. 2000).

Pour les études en microscopie confocale, les films multicouches de

polyélectrolytes sont construits sur des lamelles de borosilicate de diamètre 12 ou 14

mm (VWR). Les lamelles sont préalablement nettoyées dans du SDS 0.01 M (10

min, au bain-marie), puis dans du HCl 0.1 N (10 min, au bain-marie) et enfin,

rincées abondamment à l’eau et séchées sous flux d’azote. Les lamelles sont ensuite

immergées dans la solution de polycations (à 1 mg/mL), la surface des lamelles de

verre étant chargée négativement, pendant 10 min. Puis les lamelles sont rincées

avec une solution saline de concentration identique à la solution de polyélectrolytes.

Le temps de rinçage est compris entre 5 et 10 min selon les études. L’ensemble est

enfin plongé dans une solution de polyanions et rincé suivant le même protocole que

pour le dépôt du polycation. L’opération d’immersion successive dans le polycation

et dans le polyanion est répétée jusqu’à l’obtention du nombre de couches

souhaitées.

Pour la réalisation de films contenant un nombre élevé de couches, l’opération

de dépôt est programmée à l’aide d’un bras automatisé (Dipping Robot DR3,

Kriestein) déplaçant séquentiellement les portoirs à lamelles dans les différents bains

de polyélectrolytes et de rinçage.

1.2 : Peptides antimicrobiens

1.2.1. La Défensine

La Défensine utilisée dans nos expériences est issue de l’hémolymphe du

moustique Anopheles gambiae (Richman, Bulet et al. 1996). Elle a été fournie

gracieusement par le Dr J-L. DIMARCQ (Société Entomed SA) dans le cadre d’une

coopération. Elle a été stockée en alicots à -30°C après dissolution de sa forme

déshydratée dans du NaCl 0,15 M à 1 mM, pH 6,3. Pour nos expériences, elle a été

utilisée à 10µM ou 20µM, concentrations supérieures à la concentration minimale

d’inhibition (mic) pour les deux souches bactériennes testées (Cociancich, Ghazi et

al. 1993; Vizioli, Richman et al. 2001). Son pHi étant de 8,58 elle présente donc à


pH 6,3 une charge cationique de +4,18 mV. Son insertion s’envisage, par

conséquent, après une couche anionique de PGA.

1.2.2. La Chromofungine

La chromofungine nous a été fournie gracieusement par le Dr M-H METZ-

BOUTIGUES (UMR-S575). Ce peptide a été synthétisé dans le laboratoire de

l’UMR et fourni sous forme lyophilisée. Il correspond à la fraction 47-66 de la

chromogranine A (CGA) bovine, et répond une séquence de 20 acides aminés

RILSILRHQNLLKELQDLAL. Pour les expériences de fluorescence, le peptide

nous a été fourni greffé à de la rhodamine. Son spectre antifongique est large et sa

mic envers C. albicans est de 50µM (Lugardon, Chasserot-Golaz et al. 2001). Nous

avons inséré la chromofungine entre le PGA et le PLL, avec une concentration en

solution de 500 µM.

1.3 : Synthèse du copolymère de l'acide poly(L-glutamique) /

poly(éthylène glycol)

Le mono-méthoxy-poly(éthylène-glycol), noté PEG, a été fourni par Sigma

(N° cat : M 7143 / M 7268). Sa masse molaire varie de 2000 à 5000 g/mol.

La synthèse du copolymère PGA-PEG a été réalisée par les Dr B. Fritsh et F.

Boulmedais. Elle suit une séquence chimique qui confère tout d’abord une fonction

amine au PEG afin de permettre le couplage des deux polymères par des liaisons de

type amide (figure ci-après)


Shéma du couplage PGA / PEG réalisé par les Dr FRITSCH et BOULMEDAIS

Le couplage du PGA et du PEG amine s’effectue en milieu tamponné

tétraborate de sodium à pH 8.5. Le taux de couplage entre le PGA et le PEG est

calculé en supposant un rendement de 100%. Il y a formation de liaisons amides

entre les deux polymères. 20 mg (soit 0.13 mmol de fonction acide) de PGA, 23.8

mg (soit 0.012 mmol de fonction amine, 9% de greffage espéré) de PEG 2000, et 1

mg (0.005 mmol) de Sulfo NHS sont dissous dans 1 mL de tampon, 50 mM de

sodium tétraborate à pH 8.5. 3.6 mg (0.019 mmol) d'EDC sont ajoutés au mélange

sous agitation et à température ambiante. Le système est maintenu sous agitation

pendant 6 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est trouble. Après

filtration, le milieu réactionnel est dialysé pendant 24 heures contre 2L de tampon

phosphate ( 0.1 M, pH = 7.4, Na2HPO4 / NaH2PO4 ), puis 24 heures contre 2L d’eau

(membrane cut off 10 000). Un solide jaune translucide (17.2 mg) est récupéré après


passage au Speed Vack. Le rendement est de 44%. La RMN 1H donne un

pourcentage de greffage de 7.4%. Aucune autre technique de purification n’est

utilisée. Au-delà de 30% de couplage, le PGA-g-PEG se comporte comme un

hydrogel, c'est à- dire qu'il absorbe l'eau et ne se dissout pas.


Chapitre 2 : Méthodes

2.1 : Analyses physico-chimiques

L’étude physico-chimique des films multicouches de polyélectrolytes a été réalisée

à l’aide de différentes techniques complémentaires (Figure 2-1). Elle a porté

principalement sur la caractérisation d’épaisseur (OWLS, QCM-D, Microscope

confocale), l’indice de réfraction (OWLS), et le potentiel électrocinétique de surface

(potentiel d’écoulement).

Haut du film

QC

M-D

OWLS

≈400 nm

Substrat

Microscopie

Confocale

Potentiel Zeta Haut du film

QC

M-D

OWLS

≈400 nm

Substrat

Microscopie

Confocale

Potentiel Zeta

Figure 2-1 Ensemble des méthodes utilisées pour caractériser le film. La spectroscopie optique par guided’onde (OWLS) permet de mesurer l’indice de réfraction et l’épaisseur de films multicouches jusqu’àenviron 400 nm. La microbalance à cristal de quartz (QCM) informe sur la masse des films. Enfin, la

mesure du potentiel zêta informe sur la charge de surface des films multicouches.

2.1.1. Spectroscopie optique par guide d’onde

2.1.1.1. Principe et description de la technique

La spectroscopie optique par guide d'onde (ou OWLS Optical Waveguide

Lightmode Spectroscopy) est une technique optique permettant d’étudier in situ

l’adsorption de macromolécules sur un substrat (Tiefenthaler and Lukosz 1989). La


technique utilise les propriétés de réflexion de la lumière à l’interface guide/couche

adsorbée pour déterminer l’épaisseur et l’indice de réfraction de cette couche. Un

faisceau laser est dirigé sur le guide d’onde (généralement en oxyde métallique

transparent de ~200 nm d’épaisseur et d’indice de réfraction supérieur à 1.7) sur

lequel est gravé un réseau de diffraction. Pour un angle donné, appelé angle de

couplage, le faisceau laser reste confiné au sein du guide d’onde par réflexion totale

interne et se propage dans le guide (dans la direction x) jusqu’aux photodiodes

disposées aux extrémités latérales du guide d’onde.

Figure 2-2 Schéma de principe de la spectroscopie par guide d'onde.

. Dispositif expérimental

Le dispositif expérimental, mis au point au sein de l’unité par le Dr Frédéric

Cuisinier, est schématisé sur la figure 2-3. Un laser Hélium-Néon de 5 mW (Melles-

Griot), de longueur d'onde 632.8 nm, est réfléchi par un miroir sur un guide d'onde

en Si0.8Ti0.2O2 (Micro Vacuum Ltd) mono-mode (m=0) permettant uniquement une

réflexion du premier ordre (l=1). Le guide est monté dans une cellule de mesure,

deux photodiodes (Hamamatsu) sont disposées à chaque extrémité du guide. Un

ordinateur pilote le déplacement d’un moteur (M-UTM Newport) permettant la

rotation du guide sur une plage angulaire de –8° à +8° avec une précision angulaire

de 3.10-4 degré. La résolution en indice de réfraction effective (∆N) est alors de 10-5.

solution C (nc)

réseau

Substrat S

Guide F

Couche adsorbée A

α

γs

θi θf ns

nf

na

Phot

oDio

de

PhotoDiode


Les guides d’onde ASI 2400 (MicroVacuum Ltd) sont en Si0.8Ti0.2O2, ils sont

déposés sur un substrat en silice pure.

Figure 2-3 Schéma de principe du spectroscope par guide d'onde comprenant un laser polarisé, un guided’onde, deux photodiodes qui mesurent les intensités de couplage et un moteur qui permet d'effectuer un

balayage angulaire (schéma repris de [234])

Lorsque les conditions de couplage sont vérifiées, le faisceau diffracté par le

réseau se propage jusqu’aux photodiodes où l’intensité est mesurée. Deux angles de

couplage sont ainsi obtenus pour chaque photodiode. Le temps d’acquisition d’un

point étant d'environ 1min 30s, il est ainsi possible de suivre la construction du film

multicouche.

2.1.1.2. Protocole expérimental

Les solutions sont préalablement dégazées pendant 30 minutes. Cette opération

est nécessaire pour éviter la formation de bulle d’air dans le montage. L'indice de

réfraction de la solution tampon (nc) est mesuré dans les conditions expérimentales

avec un réfractomètre RFM 340 (Bellingham-Stanley).


Après réglage du laser pour avoir des pics symétriques et d’intensité maximale,

la cellule de mesure est mise à l’équilibration pendant 30 min. Les guides d’ondes

utilisés étant chargés négativement, la construction du film débute par l’injection de

la solution de polycations (100µL) dans la cellule de mesure (37µL). L’ensemble est

laissé au repos durant 10 min. Après le dépôt de la couche de polycations, la cellule

est rincée sous flux (10mL/h) pendant 10 min avec la solution de rinçage. Les étapes

d’injection et de rinçage des différents polyélectrolytes sont ensuite répétées selon le

même schéma avec une alternance entre les polyélectrolytes chargés négativement et

positivement. La construction de la multicouche est ainsi suivie in situ.

2.1.1.3. Traitement du signal

Les indices effectifs (NTE et NTM) sont mesurés en fonction du temps. Avant le

calcul de l’indice de réfraction du film (nA) et de son épaisseur (dA), il faut

auparavant caractériser les propriétés optiques du guide d’onde : indice de réfraction

(nF) et épaisseur (dF).

Un programme de résolution numérique des équations a été développé au sein

du laboratoire. L’ensemble des équations nécessaires au traitement du signal a été

décrit par Picart et al. (Picart, Gergely et al. 2004). Pour l’analyse numérique, le film

multicouche de polyélectrolytes est défini comme un film homogène et uniforme.

A partir des grandeurs nA et dA, une formule approchée donnant la masse

adsorbée (qA) a été proposée par DeFeyter et al. (De Feijter, Benjamins et al. 1978):

dcdnQq

/1.0A

A

×= où dn/dc (en mL/g) est la variation d’indice de réfraction

par rapport à la variation de concentration en polyélectrolyte dans le film avec :

dn/dc = 0.197 mL/g pour les polyélectrolytes (Huglin 1972)

dn/dc = 0.18 mL/g pour les protéines (Huglin 1972)

La précision de l’appareil (10-5 sur les indices effectifs) limite l’épaisseur

maximale réellement mesurable à environ 400 nm d’épaisseur pour les films

d’indice 1.5 (Picart, Gergely et al.).


2.1.2. Microbalance à cristal de quartz

La microbalance à cristal de quartz permet de suivre in situ la construction

d’un film en multicouches, ainsi que le dépôt d’un peptide lors cette construction.

Toutefois, la résolution actuelle de l’appareillage rend difficile l’interprétation des

résultats pour de petits poids moléculaires.

2.1.2.1. Principe

La microbalance à cristal de quartz (ou QCM pour Quartz Crystal

Microbalance) développée dans les années 60 (Sauerbrey 1959), est une technique

utilisant les propriétés piézo-électriques d’un cristal pour mesurer la masse adsorbée

sur ce cristal. La fréquence caractéristique de vibration d’un matériel piézo-

électrique (cristal de quartz) est en effet reliée à la masse de l’objet déposée sur ce

cristal. Des impulsions de courant alternatif sur les deux faces du cristal induisent

des contraintes de cisaillement sur le cristal perpendiculairement au champ

électrique. Inversement, les oscillations du cristal génèrent aux électrodes un signal

électrique qui est collecté par l’appareil.

Figure 2-4 Photographie (a) et schéma (b) des cristaux de quartz sur lesquels se trouvent deux électrodes enor et éventuellement une couche superficielle de SiO2 (QSX 303; Q-Sense)

Le cristal entre en résonance quand la relation qt

nvf2

= est vérifiée avec n un

nombre entier impair, tq l’épaisseur du cristal, v la vélocité de l’onde d’extension et

v/f est la longueur d’onde. L’adsorption de molécules sur le cristal augmente la

masse oscillante et induit un changement de fréquence de résonance du cristal. Ce

phénomène s’observe également aux harmoniques impaires. Pour ces fréquences, la


sensibilité de la technique est augmentée. Toutefois leur longueur de pénétration

diminue avec l’augmentation de la fréquence étudiée. Le changement de fréquence

dû à l’adsorption peut être corrélé à la variation de masse pour des films fins, rigides

et uniformes au contact de l’air ou sous vide grâce à la relation de Sauerbrey (ci-

dessous). Il est ainsi possible de convertir la variation de fréquence en masse.

où ρq, tq et f0 sont respectivement la densité, l’épaisseur et la fréquence de

résonance fondamentale et n le rapport entre la fréquence de l’harmonique et la

fréquence fondamentale. Cette relation a été développée pour un dépôt au contact

avec le vide. Muramatsu et al. (Muramatsu, Tamiya et al. 1988) ont montré que la

mesure en solution liquide génère une résistance sur l’oscillation du cristal. Il a été

récemment démontré que la relation de Sauerbrey s'applique également, mais de

façon approchée, à un dépôt solide au contact d'un liquide (Rodahl and Kasemo

1996), mais toujours pour des films fins, rigides et uniformes.

Or, les films multicouches étudiés sont très hydratés et possèdent généralement

un comportement de gel lorsqu’ils deviennent épais. La relation de Sauerbrey n’est

alors plus applicable. Les récentes évolutions techniques ont permis l’étude d’un

nouveau paramètre : la dissipation. Le facteur de dissipation (D) est inversement

propositionnel au temps de vibration du cristal après son excitation. (Figure 2-5).

Tem ps

Am

plit

ude

Excitation R elaxation (f’= ( -

to tiTem ps

Am

plit

ude

Excitation R elaxation

to tiTem ps

Am

plit

ude


to tiTem ps

Am

plit

ude


(f’= (f-∆ f)υ M H z; D )

to t

(f= fυ M H z)

Tem ps

Am

plit

ude

Excitation R elaxation (f’= ( -

to tiTem ps

Am

plit

ude


to tiTem ps

Am

plit

ude


to tiTem ps

Am

plit

ude


(f’= (f-∆ f)υ M H z; D )

to t

(f= fυ M H z)

Figure 2-5 Amplitude d'oscillation du cristal en fonction du temps A(t) lors d'une expérience en QCM :Première phase (jusqu'à t0), excitation du cristal à sa fréquence de résonance. Seconde phase, étude de la

relaxation du cristal avec obtention de la nouvelle fréquence de résonance (f’=f-∆f) et de la dissipation (D) àl’aide des formules : τπ teftAtA −××= )'2sin()( 0 et

0

1fD τπ=

Hzcmngft

C qq 2

0

7.17≈=ρ

nfC

nfft

m qq ∆−=

∆−=∆

0

ρ avec


Le facteur de dissipation est lié aux propriétés viscoélastiques (module

d’Young, et viscosité) du dépôt. Une analyse de l’évolution des fréquences et de la

dissipation a été réalisée à partir du modèle proposé par Voinova et al. (Voinova,

Rodahl et al. 1999). Ce modèle a été étendu par le Dr B. Senger (Inserm U 595) aux

données obtenues à l’aide de la QCM-D (Q-Sense). Le programme détermine ainsi

l’évolution de l’épaisseur sur plusieurs centaines de nanomètres ainsi que les

propriétés mécaniques des films telles que la viscosité et le module élastique pour

des multicouches de polyélectrolytes (Zhang, Senger et al. 2004).

La technique est sensible à la masse totale mise en mouvement lors de

l’oscillation et notamment à l’eau emprisonnée dans le film. Ces deux phénomènes

rendent une analyse quantitative du dépôt délicate et plus particulièrement pour la

caractérisation mécanique du film.

Les cristaux utilisés sont de type QSX 303 (cristaux de cristal Quartz recouvert

d’un film de SiO2 de 100 nm (Q-Sense)) et ils possèdent une fréquence de résonance

fondamentale à 5 MHz et des fréquences harmoniques à 15, 25 et 35 MHz. Les

fréquences de résonance du cristal sont mesurées avec une précision de 1 Hz. La

sensibilité en masse de l'appareil dans ces conditions est de ~5 ng/cm2 dans l'eau et

de ~1 ng/cm2 dans l'air à la fréquence de résonance fondamentale de 5 MHz.

2.1.2.2. Protocole expérimental

Avant chaque expérience, le cristal est nettoyé in situ, avec une solution de

Hellmanex II à 2% (cat n : 320.001, Hellma, Müllheim, Allemagne) pendant une

demi-heure à température ambiante. Il est ensuite rincé avec du HCl 0.1N puis lavé à

l’eau et séché à l'azote.

La suite de l’expérience se déroule de manière similaire à l’étude en OWLS

par une injection alternée des solutions de polycations et de polyanions (10 min

d’adsorption suivie de 10 min de rinçage) dans la cellule de mesure (Figure 2-7).

Toutefois, il faut utiliser 2 mL de solution par dépôt : une expérience en QCM-D

nécessite des quantités de produits plus importantes qu’une expérience réalisée par

OWLS. Pour suivre la construction des films, la température de mesure est fixée à

25°C, dans les essais de dégradation salivaire la température est fixée à 37°C. Le


temps séparant 2 mesures est de quelques secondes permettant ainsi d’observer les

cinétiques de dépôt et de désorption.

Cristal

Sortie

Electrodes

Entrée

Cellule de mesure

Cristal

Sortie

Electrodes

Entrée

Cellule de mesure

Cristal

Sortie

Electrodes

Entrée

Cellule de mesure

Figure 2-6 Schéma de la cellule de mesure (Q-Sense). Les polyélectrolytes sont injectés par le port d’entréeet sortent par le port de sortie.

2.1.3. Mesure du potentiel d’écoulement

La mesure du potentiel d’écoulement permet de déterminer la charge électrique

d’une surface. A ce titre, il permet le suivi des changements de charge de la surface

des films en multicouche de polyélectrolytes, et l’effet sur cette charge de

l’adsorption d’un peptide au cours de l’auto-assemblage.

L'environnement ionique d'une surface s'organise pour maintenir l'électro-

neutralité du système. Ainsi, les ions de charge opposée à celles de la surface sont

attirés sous l'effet de la force d'attraction de Coulomb et les ions de charge identique

sont repoussés. Combinées au mouvement brownien, ces forces conduisent à une

distribution des charges normale à l'interface. L'atmosphère ionique, fixée à la paroi,

constitue ce qu'on appelle la double couche.

. La double couche électrique

Graham et al. (Graham 1947) ont proposé un modèle à deux zones pour la

distribution normale des ions à une surface chargée. Dans la première zone, seuls les


ions de charge opposée à la surface sont présents, cela constitue la couche de Stern.

Dans cette couche, les ions sont présents sous deux états : fortement liés à la surface,

ils sont alors très peu hydratés et leur distance moyenne avec la surface définit le

plan interne d’Helmholtz (PIH). Au-delà de ce plan, les ions sont hydratés et leur

interaction à la surface est plus faible.

D’après le modèle, dans la seconde zone, il existe une distribution entre les

anions et les cations qui suit le modèle défini par Chapman (Chapman 1913). Ce

modèle (Figure 2-7) définit l’évolution du rapport entre les espèces positives et

négatives à partir de la couche de Stern jusqu’à l’équilibre à l’aide de considérations

thermodynamiques. Ainsi, l'approximation de Debye-Hückel permet d’estimer

l’évolution du potentiel en fonction de la distance par rapport à la surface, pour des

potentiels faibles, et s’écrit :

)κexp(ψψ 0 x−=

avec ψ0 le potentiel de la surface, x la distance normale à la surface et 1/κ la

longueur de Debye-Hückel.

Le potentiel zêta (ξ) correspond au potentiel au niveau du plan de cisaillement

entre la surface et un flux parallèle à la surface. Les ions de la couche de Stern sont

fortement liés à la surface et ils ne sont pas arrachés par le flux. Le plan de

cisaillement est généralement confondu avec le plan de Stern.

Le potentiel zêta est défini par la relation de Smoluchowski (Smoluchowski

1903; 1921) :

où r est le rayon du capillaire (en m), L la longueur du capillaire (en m), RC la

résistance électrique du capillaire contenant l'électrolyte (en Ω), εε0 la permittivité

de l'électrolyte et µ la viscosité dynamique de l'électrolyte.

En mesurant ∆V en fonction de ∆P, il est ainsi possible de calculer le potentiel

zêta de la surface du capillaire.

)(**

02 πεε

µζ

rLR

PV

C∆∆

=µ

ζπεεL

RrPV C )( 02

∆=∆ d’où


κ1

xi d d’

xi

κ1

xi d d’

κ1

xi d d’

κ1

xi d d’

κ1

xi d d’

κ1

xi d d’

κ1κ1

xi d d’

xi

κ1

xi d d’

κ1κ1

xi d d’

κ1κ1

xi d d’

κ1κ1

xi d d’

Figure 2-7 Le modèle de Graham (Graham 1947) Le plan interne de Helmholtz (PIH) est localisé à ladistance xi de la surface, alors que le plan externe de Helmholtz (PEH) ou plan de Stern est localisé à ladistance d et le plan de cisaillement est proche du plan de Stern à une distance d’ proche de d (Viallis-Terrisse 2000)

Expérimentalement, la mesure consiste à appliquer un flux d’une solution

d’électrolytes (solution tampon) dans un capillaire recouvert du film multicouche.

La différence de potentiel ou potentiel d’écoulement (∆V) aux extrémités du

capillaire est mesurée en fonction de la différence de pression (∆P) qui est appliquée

aux extrémités du capillaire.

2.1.3.1. Dispositif expérimental

Le dispositif expérimental mis au point par C. Picart (Figure 2-8) est constitué

de deux cellules de mesure reliées par un capillaire en silice de 20 cm de longueur et

530 + 12 µm de diamètre (Sin 2042-R10, Perichrom SARL). Les films multicouches

de polyélectrolytes sont construits dans le capillaire. L’ensemble est relié par une

extrémité à un réservoir de solution d’électrolytes qui peut être mise sous pression

(1.2 bar) avec une bouteille d’azote. Au cours de l’expérience, les valeurs du

potentiel d’écoulement ainsi que la différence de pression aux extrémités du

capillaire sont acquises en continu par un logiciel mis au point par J. Iss (Institut

Charles Sadron, Strasbourg).


Azote sous pression (1.2 bar) Solution

d’électrolyte

Circuit du polyelectrolytes lors de la construction du

film

Capillaire

Mesure de différence de potentiel (DV)

Mesure de différence de pression (DP)

∆P=f(t)∆V=f(t)⇒ potentiel ξ

Flux d’électrolytes lors de la mesure

Capteur de pression

Electrode de Pt

Figure 2-8 Dispositif expérimental de mesure du potentiel d'écoulement. Le potentiel ξ est obtenu paranalyse de la différence de pression et du potentiel d’écoulement aux extrémités du capillaire en fonction dutemps lors de la mise en mouvement de la solution d’électrolytes à l’aide de la surpression dans le réservoird’électrolytes. D'autre part, un circuit secondaire au niveau du capillaire permet d'injecter directement lespolyélectrolytes dans le capillaire et de les rincer après chaque adsorption.

2.1.3.2. Procédure de mesure

Après étalonnage de la résistance du capillaire (Rc) et du circuit dans les

conditions expérimentales (sans flux), le film multicouche est construit in situ dans

le capillaire. 8 mL d’une solution de polycations sont injectés pour le dépôt de la

première couche, laissés au repos pendant 20 min puis rincés par 50 mL de solution

d’électrolytes. Après le rinçage du film, le potentiel d’écoulement est mesuré à trois

reprises en fonction de la pression aux extrémités du capillaire. La pression est

contrôlée par l’application ponctuelle d’une pression de 1.2 bars à une extrémité du

capillaire. La valeur moyenne de ces trois mesures (et l’écart type) est prise pour

valeur du potentiel zêta.


2.1.4. Microscopie de fluorescence

La fluorescence est la propriété d’une molécule à absorber un photon, puis à le

ré-émettre à une longueur d’onde plus élevée (Diagramme de Jablonski, Figure 2-

10). Soumise à une excitation lumineuse de longueur d’onde donnée, la molécule

fluorescente est portée dans un état électronique excité (S1’). A température

ambiante, la conversion interne entraîne une perte partielle de l’énergie absorbée et

la molécule se retrouve à un état excité moins élevé (S1). Le retour de la molécule à

son état stable (So) est associé à la libération d’énergie sous forme lumineuse. La

perte d’énergie par conversion interne, se traduit par une longueur d’onde

d’émission supérieure à la longueur d’onde d’absorption (Déplacement de Stocke).

Ener

gie

Ener

gie

Figure 2-9 Diagramme de Jablonski. Un électron du fluorophore adsorbe de l’énergie sous forme lumineuse(1) et se retrouve à l’état excité S1’. Lors de la désexcitation, il y a tout d’abord perte de l’énergie par

conversion interne (2) (vibration, chocs...). La molécule se trouve à état d’excitation inférieur (S1) et retrouveson état stable (S0). Cette transition libère de l’énergie sous forme lumineuse (3), correspondant à une

longueur d’onde plus élevée (car l’énergie est plus faible).

2.1.5. Microscopie à épi-fluorescence

En microscopie à épi-fluorescence, la lumière est tout d’abord filtrée (filtre

d’excitation) puis dirigée par un miroir dichroïque vers l’objectif qui sert d’abord de

condensateur au faisceau d’excitation. L’objectif est ensuite utilisé pour collecter la

fluorescence émise par l’échantillon. L’utilisation d’un tel dispositif (TE200 ;


Nikon) associé à l’emploi d’un miroir dichroïque et d’un film d’émission limite

l’incidence de la lumière excitatrice sur le signal collecté aux oculaires et fournit des

images avec un bon rapport signal/bruit. L’objectif collecte également la

fluorescence provenant des plans non focalisés et ne permet alors pas d’analyse

volumétrique.

2.1.6. Microscopie confocale

Le principe général de la microscopie confocale a été proposé par Minsky

(1957). Il s’agit de diriger une lumière ponctuelle, généralement obtenue à partir

d’un laser, sur un point précis (point focal) de l’échantillon à l’aide d’un microscope

à épi-fluorescence. Cependant, le trajet du faisceau laser dans l’échantillon génère de

la fluorescence en dehors du plan focal. Pour éliminer cette fluorescence parasite, un

trou de filtrage (pinhole) (Figure 2-11) est placé en amont du détecteur, il ne laisse

passer que la lumière en provenance du point focal. L’image ainsi obtenue présente

un bon rapport signal /bruit. Le balayage de l’échantillon en XY par le laser fournit

une image du plan focal. Ce balayage est obtenu à l’aide de miroirs motorisés

disposés sur le trajet optique du laser. Pour le balayage en Z, l’objectif est monté sur

un moteur piézo-électrique.

Il est ainsi possible d’obtenir des images en provenance de différents plans

focaux et ainsi de reconstituer une structure en trois dimensions avec une résolution

latérale et normale respective de 0.15 µm et 0.58µm pour un objectif ayant une

ouverture numérique de 1.4 et l’utilisation d’une longueur d’onde de 500 nm

(Stelzer and Lindek 1994).. Cette caractéristique est particulièrement intéressante

pour étudier la structure normale des films multicouches épais (micrométriques) en

milieux aqueux.


Figure 2-10 Schéma de principe d'un microscope confocal en épi-fluorescence. La source laser estcondensée par l’intermédiaire du miroir dichroïque et de l’objectif en un point focal. La fluorescence est

ensuite recueillie par un photomultiplicateur. Pour éliminer la fluorescence parasite (ligne en pointillé), letrou de filtrage (pinhole) est disposé au niveau du plan image de l’objectif.

Le microscope confocal utilisé est de type LSM510 (Zeiss), monté sur un

microscope AxioVert100M (Zeiss) associé à des lasers HeNe et Ar. Pour les

visualiser, les films sont marqués à l’aide de fluorophores couplés aux

polyélectrolytes, généralement à l’aide de fluorescéine isothiocyanate (FITC

adsorption/émission 488nm/520nm) ou de TexasRed (596nm/620nm). Les

polyélectrolytes marqués utilisés sont la Poly(L-Lysine)-FITC (PLL-FITC, Sigma),

le Chitosan-FITC et le Hyaluronan-TexasRed (HA-TR) ces deux composés étant

préparés par X. Shu du groupe de G. Prestwich (University of Utah). Pour obtenir un

marquage complet du film, le polyélectrolyte est déposé en couche terminale

pendant une durée minimale de 15 min pour la PLL-FITC (0.1 mg/mL).

Sur les films multicouches dont l’un au moins des polyélectrolytes diffuse, le

dépôt d’un polyélectrolyte marqué qui diffuse à travers l’ensemble de la construction

permet de visualiser l’intégralité du film. Cela permet la détermination de son

épaisseur et de sa topographie (Figure 2-11).

Le microscope confocal utilisé disposant de plusieurs lasers, il est possible de

co-marquer les films multicouches à l’aide de deux sondes fluorescentes différentes.


Il est également possible d’observer le comportement des bactéries sur un film

multicouche par un marquage distinct du film et des bactéries.

Figure 2-11 (A) Coupe normale en Zconstruit sur une lamelle de bande verte correspond à la

film et permet de mesurer l’épd’un film multicouche de (PLL

polie

2.1.7. Microscopie électroniqu

Le fonctionnement du m

par une cathode et la détection

avec l'échantillon. Ces électro

profondément dans le matéria

Le volume de cette poire dépe

l'énergie des électrons incide

faisceau vont perdre leur én

matériau générant ainsi de nom

• Réémission d'élec

• Absorption d'élec

• Courants induits

B
A
d'un film multicouche de (PLL/HA)60–PLLverre et observé avec un objectif X 40.diffusion de la PLL-FITC à travers toutaisseur du film, ici 14.5 µm.(B) Topogr/HA)20–PLL-FITC sur une surface de PMMA .(Doc. personnelle)

e à balayage

icroscope est basé sur l'émission d'électrons pro

de signaux provenant de l'interaction de ces élec

ns qui irradient la surface de l'échantillon pén

u et affectent un volume appelé "poire d'interac

nd du numéro atomique moyen de l'échantillon

nts. Dans ce volume d'interaction, les électron

ergie par collisions multiples avec les atome

breux phénomènes secondaires :

trons et de photons

trons

-FITC La leaphienon

duits

trons

ètrent

tion".

et de

s du

s du


• Potentiels électriques

• Élévation de température locale

• Vibration du réseau

La figure 2-12 illustre l'ensemble des radiations pouvant être émises lors de

l'interaction entre le faisceau d'électrons et l'échantillon.

Figure 2-12 Schéma illustrant l’ensemble des radiations émises par l’échantillon

Toutes ces radiations sont produites simultanément et rendent possibles à la

fois l'observation et l'analyse d'un objet choisi (par ex. des inclusions sur une surface

de rupture).Les électrons secondaires sont créés par le passage d'un électron incident

près d'un atome. L'électron incident peut transmettre une partie de son énergie à un

électron peu lié de la bande de conduction provoquant ainsi une ionisation par

éjection de ce dernier électron. L'énergie cinétique de ce dernier ne peut excéder

50eV. Chaque électron incident peut créer plusieurs électrons secondaires. De part

leur faible énergie, seuls les électrons secondaires émis proche de la surface

(<10nm) peuvent s'échapper de l'échantillon et être recueillis par le détecteur. La

moindre variation topographique va modifier la quantité d'électrons secondaires

collectés. Les électrons rétro-diffusés sont causés par la collision entre un électron

incident et un atome de l'échantillon. Ce sont des électrons primaires qui ont réagi de


façon élastique avec des noyaux d'atomes de l'échantillon. Ils sont dispersés dans

toutes les directions avec une faible perte d'énergie.

Figure 2-13 Schéma du microscope électronique à balayage Philips XL 30 (Doc. Philips)

Du fait de leur forte énergie, les électrons rétro-diffusés récupérés peuvent

provenir d'une plus grande profondeur que celle des électrons secondaires. Ils ont

une sensibilité topographique nettement inférieure. Du fait de leur origine, la

quantité d'électrons rétro-diffusés croît avec le numéro atomique des atomes

constitutifs de la cible.

♦ Le détecteur d 'électrons secondaires

La détection des électrons secondaires s'effectue grâce à un détecteur dont on

doit le principe à Everhart et Thornley (1960). Ce détecteur utitlise un des meilleurs

systèmes d'amplification de courant : le photomultiplicateur. Les électrons


secondaires sont attirés par le collecteur (+300V) et sont ensuite accélérés vers le

scintillateur (10KV) qui absorbe les électrons et émet des photons. Ceux-ci arrivent

dans le photomultiplicateur à travers un guide de lumière. Dans le

photomultiplicateur, les photons sont convertis en électrons qui vont très vite se

multiplier grâce à une succession de dynodes. Le gain de ce détecteur est de l'ordre

de 100.

♦ Le détecteur d 'électrons rétro-diffusés

Le détecteur d'électrons rétro-diffusés est constitué de diodes silicium. Il

comporte deux secteurs sensibles de même surface (A=B). Cela permet deux modes

de fonctionnement :

A+B:mode composition : Les images obtenues d'un échantillon poli mettent en

évidence les phases qui le constituent.

A-B:mode topographique : Les signaux provenant de la composition s'annulent

et il reste ceux venant de la topographie qui s'ajoutent.

♦ La formation de l'image

Dans un microscope électronique à balayage, l'image est obtenue

séquentiellement point par point en déplaçant le faisceau d'électrons primaires sur la

surface de l'échantillon. L'image est alors reconstruite en utilisant le signal généré

par les différents détecteurs pour moduler la brillance d'un tube cathodique. Le

rapport entre le format de l'écran et celui de la zone balayée sur l'échantillon

détermine le grandissement.

Dans nos études, le microscope électronique à balayage utilisé est un PHILIPS

XL 30 ESEM, pourvu de la capacité d’étudier les échantillons en mode

environnemental, c'est-à-dire sans traitement de métallisation préalable. Ce mode

permet donc l’observation directe des structures dans leur étét naturel hydraté ou

vivant. Dans le cadre des films multicouche ce mode est très intéressant car le film

est fortement hydraté et serait détruit par une dessication classique.


2.2 : Analyses Biologiques

2.2.1. Cultures cellulaires

2.2.1.1. Cultures bactériennes

Les études d’inhibition de croissance bactérienne ont été faites sur deux

souches bactériennes, l’une à Gram négatif : Escherichia coli D22, l’autre à Gram

positif: Micrococcus luteus. Ces deux souches ont été retenues car leur sensibilité et

la concentration minimale d’inhibition (mic) à la Défensine d’Anopheles gambiae,

en solution, étaient connues. La souche mutée D22 se caractérise par l’absence des

lipides A dans les lipopolysaccharides de la membrane bactérienne d’E. coli. Les

deux souches ont été fournies généreusement par le Dr Ph. BULET (UPR CNRS

9022).

Les cultures ont été faites dans un milieu LB (Luria-Bertani Broth ; Difco–ref

0446-17-3), en aérobiose, à 37°C pour E.coli et à 30°C pour M.luteus sous agitation

(120 tpm). Les souches ont fait l’objet de repiquages réguliers en milieu gélosé dans

des boîtes de Pétri, stockées à -4°C pour E.coli D22 et à température ambiante pour

M. luteus.

Pour chaque expérience, une colonie bactérienne issue de cultures sur milieu

gélosé est ensemencée en milieu liquide LB et suivie jusqu’à saturation, soit environ

12 heures. Chaque souche est alors repiquée à nouveau en milieu liquide LB, à une

concentration de 400 µl pour 5 ml de LB. La croissance est suivie régulièrement par

mesure de la densité optique (DO) à 600 nm sur un Metertech Σ960. Les cultures

sont utilisées pour les manipulations lorsque la phase exponentielle de croissance est

atteinte, soit une DO600 de 0,3 à 0,6 mDO. La dilution finale se fait en milieu liquide

PB (Poor Broth) plus pauvre, afin de ralentir la croissance bactérienne, et ce à 1

mDO600 ou 10 mDO600 selon l’expérimentation.


2.2.1.2. Culture de Candida albicans

Les souches C. albicans ont été fournies par le Dr Metz-Boutigues de l’UMR-

S575. Pour chaque expérience, une préculture est réalisée en aérobiose, à 37°C,

pendant une nuit dans un milieu de Sabouraud (Difco). Les levures sont ensuite

resuspendues en milieu liquide de Sabouraud, sous agitation lente (40 tpm) à 37°C

jusqu’à leur phase exponentielle de croissance déterminée par mesure de

l’absorbance à 600 nm. Elles sont alors diluées dans du milieu Sabouraud à 1 mDO

ou 10 mDO selon le cas.

2.2.1.3. Culture des fibroblastes

Les fibroblastes épithéliaux primaires ont été obtenus à partir d’explants

provenant de biopsies cliniques prélevées lors de l’avulsion de troisième molaire et

selon un protocole approuvé par le Comité d’Ethique des Hôpitaux Universitaires de

Strasbourg. Un consentement éclairé du patient a été obtenu dans tous les cas. Ces

biopsies snt ensuite été découpées en plusieurs fragments cultivés à 37°C en

atmosphère humide (95%O2, 5% CO2) dans des boites Nunc® 6 puits. Cette culture

s’est faite dans un milieu DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium, Sigma)

additioné de 10% de sérum de veau fœtal, de 100 U/ml de penicilline et 100 g/ml de

streptomicine (Invitrogen). Les cellules ont été repiquées dans du milieu frais après

avoir atteint leur confluence (env. 1 semaine).

.

2.2.1.4. Culture des cellules épithéliales

Les cellules épithéliales primaires ont aussi été obtenues par la méthode des

explants, à partir des biopsies récupérées en clinique et selon un protocole approuvé

par le Comité d’Ethique des Hôpitaux Universitaires de Strasbourg. Un

consentement éclairé du patient a été obtenu dans tous les cas. L’explant est placé

dans un tube eppendorf contenant 5 mL de PBS avec 10% de Trypsine et placé à

4°C pendant toute la nuit. Le PBS est éliminé et l’explant lavé avec 1 mL de PBS et


le surnageant centrifugé à 1000 rpm pendant 5 minutes. L’explant est coupé en trois

morceaux et placés dans un puits avec 1 mL de Milieu Ephitélial (DMEM ; de

Medium 199 Hepes 25 ; L-Glutamine 1x , Penicilline et Streptomycine à 50U/mL et

50µg/mL respectivement ; Toxine cholérique à 8,4 ng/mL ; Insuline à 5 µg/mL ;

Hydrocortisone à 0,5 µg/mL ; EGF 2ng/mL et EPB 25 µg/mL) et 10% de FCS

inactivé (chauffé pendant 30 minutes à 55°C) pour favoriser l’adhésion initiale des

cellules épithéliales. Le culot récupéré après centrifugation du surnageant est placé

dans un puits avec 1 mL de milieu Ephitéliale et 10% de FCS inactivé. Lorsque les

cellules ont adhéré, le milieu avec FCS est éliminé et remplacé par 1 mL de milieu

sans FCS.

En phase de croissance, les cellules épithéliales ont un aspect un peu

fusiforme, un cytoplasme périphérique mince et un noyau ovalaire saillant à la

surface. A confluence, elles forment une mosaïque homogène de cellules larges,

polygonales, translucides, adhérant solidement au fond de la boîte. Leur croissance

s’arrête par inhibition de contact.

2.2.2. Modification génétique des souches E. coli

Deux souches E. coli (Invitrogen) ont été transformées par électroporation.

Une souche a été transformée en utilisant un plasmide pFPV25 portant le gène de la

protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein, GFP) sous contrôle d’un

promoteur de la protéine ribosomale de Salmonella typhimurium (plasmide

généreusement offert par le Dr B. Lemaître, CNRS-CGM, Gif-sur-Yvette, France),

l’autre en utilisant un plasmide portant le gène de la protéine rouge (Red Fluorescent

Protein, RFP) sous contrôle de Discosoma sp. (Clontech Laboratories, Inc.). Ces

plasmides portaient également un gène de résistance à l’ampicilline. Les bactéries

transformées ont été cultivées en aérobie, dans un milieu LB et sélectionnées par

ajout d’ampicilline dans le milieu.

Une souche C. albicans exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) nous a

été gracieusement fournie par le Dr D. FERRANDON de l’UPR-9022.


2.2.3. Adhésion bactérienne

L’étude de l’adhésion bactérienne a été effectuée à l’aide de la souche E. Coli

modifiée pour exprimer la GFP. Les cultures sont réalisées dans des boîtes Nunc® 24

puits, sur lamelles de verre recouvertes ou non par les films en multicouche. Les

bactéries sont diluées afin d’obtenir une concentration de 1.35 × 106 bactéries par

mL, soit une DO de 0.1 à 600 nm. Après 30 minutes de culture, les multicouches

sont rincées trois fois avec du tampon phosphate, les bactéries adsorbées sur la

surface sont visualisées en microscopie à fluorescence inversée (TE200, Nikon) et

différents champs de la surface sont photographiés (DMX1200, Nikon). L’adhésion

est évaluée après comptage des bactéries, et exprimée en pourcentage de la culture

témoin.

2.2.4. Dosage de l’activité anti-microbienne par microtitration

Des plaques de microtitration Nunc® de 96 puits ont été utilisées pour toutes

les expériences. Les films en multicouche sont construits directement dans les puits,

après préparation de la surface plastique (KOH/éthanol 50/50 pendant 30 min). Les

puits périphériques sont remplis de 100 µl de milieu PB afin de limiter les

incertitudes de résultats liées à l’évaporation plus conséquente de ces puits. Ces puits

servent aussi de témoins de contamination.

Les puits centraux sont remplis de 100 µl de la culture bactérienne en phase

exponentielle de croissance, à une DO de 0.001 à 600 nm.

Ils se décomposent en :

- puits témoins de la croissance bactérienne normale,

- puits témoins avec film non fonctionnalisé, en PGA final et PLL final.

- puits témoins de 90 µl de culture bactérienne et 10µl de Défensine libre,

dissoute dans du NaCl 0,15 M, à une concentration de 10 µM,

- puits avec film fonctionnalisé.


Après 12 heures d’incubation à 37°C pour E. coli et 30°C pour M. luteus, sous

agitation douce (40 tpm), la croissance bactérienne est mesurée à une longueur

d’onde de 600 nm à l’aide d’un lecteur de plaques Metertech Σ960. L’inhibition de

croissance est exprimée par comparaison de la DO600 de la fraction testée à celle de

la culture témoin.

Fonctionnalisation des films en multicouche

RESULTATS:

FONCTIONNALISATION

DES MULTICOUCHES

Applications aux matériaux prothétiques oraux

1Fonctionnalisation par le poly(éthylène-glycol)

Polyelectrolyte multilayer films with pegylated polypeptides as a new type

of anti-microbial protection for biomaterials

Boulmedais F., Frisch B., Etienne O., Lavalle P., Picart C., Ogier J., Voegel J. C., Schaaf P., Egles C.

Article publié dans Biomaterials vol 25 (2004)

Comme nous l’avons évoqué précédemment, l'adhésion bactérienne à la surface

d'un matériel médical est la première étape conduisant à la constitution du biofilm. Afin

de réduire cette adhésion, nous avons envisagé la construction de multicouches de poly(L-

lysine)/ d'acide poly(L-glutamique) (PLL/PGA) terminées par plusieurs bicouches de

PLL/PGApeg, où le PGApeg correspond à l'acide poly(L-glutamique) couplé au

poly(éthylène glycol).

Le PEG est un polymère biocompatible qui présente à la fois des caractéristiques

hydrophiles et hydrophobes. Il a été utilisé, greffé chimiquement ou simplement adsorbé à

la surface, dans de nombreux travaux où il a démontré qu’il réduisait l’adsorption

protéique (Cheng, Kang et al. 2000; Zhu, Eurell et al. 2001) et l’adhésion bactérienne

(Park, Kim et al. 1998). Cet effet anti-adhésif est lié à sa grande affinité pour les

molécules d’eau, qui crée ainsi à la surface du matériau une couche extrêmement hydratée

rendant l’adhésion des macromolécules difficile (Harris 1992). Le couplage du PEG avec

différents polyélectrolytes a été réalisé par les Dr B.Fritsch et F.Boulmedais.


Dans un premier temps, la caractérisation physico-chimique de la construction de

différents films a été étudiée à l’aide de mesures du potentiel d'écoulement et de mesures

en microbalance à cristal de quartz. Ces études ont permis de confirmer le motif structural

adéquat consistant en une architecture de type (PGA/PLL)n-(PGApeg/PLL)n .

Dans un deuxième temps, l’adhésion protéique et bactérienne sur ces films a été

étudiée. Les protéines contenues dans le sérum foetal de veau s'adsorbent très peu sur les

multicouches terminées par PGA et par PGApeg, comparativement au verre de silice nu,

utilisé comme support pour les multicouches. De même, l'adhésion d'Escherichia

coli est réduite de 72% sur les films terminés par une bicouche de (PLL/PGApeg) par

rapport aux mêmes surfaces contrôles (fig. 2-14).

Figure 2-14 Adhésion d’E. coli sur des surfaces de verre nues (a) ou recouvertes d’un film PEI-(PGA/PLL)2-PGA-(PLL/PGApeg)3 (b)

Ces résultats sont conformes à ceux obtenus par d’autres auteurs utilisant le PEG

en recouvrement de surface, notamment en dépôts monocouches (SAMs). Cependant,

l’intérêt des assemblages en multicouches réside dans la possibilité d’augmenter la

concentration des molécules actives par la simple multiplication des couches

fonctionnalisées. En exploitant ce principe, nous avons pu obtenir une réduction de 92%

sur les films terminés par trois bicouches (PLL/PGApeg), comparativement au verre de

silice.

Ces résultats montrent la capacité du PGApeg, inséré dans les films de

multicouches, à réduire drastiquement l'adsorption de protéines et l'adhésion bactérienne.

Ce type de films "anti-adhésifs" représente potentiellement un nouveau type de


revêtement pour les biomatériaux, qui pourrait être utilisé comme protection contre

l'adhésion bactérienne, limitant ainsi ses effets pathologiques.

Dans une récente étude, Harris et al. ont modifié des surfaces de titane par

adsorption spontanée de polymères PLLpeg et de copolymères PLLpeg-RGD et PLLpeg-

RDG (Harris, Tosatti et al. 2004). Ils ont ainsi pu créer une surface d’adhésion sélective,

sur laquelle l’adhésion de S. aureus était réduite de 89 à 93%, tandis que l’adhésion de

types cellulaires était favorisée par les motifs RGD et RDG. Cette voie de

fonctionnalisation semble d’un grand intérêt, particulièrement pour les matériaux

implantés, et constitue le projet actuel d’évolution pour les films en multicouche de

polyélectrolytes à propriétés antiadhésives.

[signalement bibliographique ajouté par : ULP – SCD – Service des thèses électroniques]

Polyelectrolyte multilayer films with pegylated polypeptides as a new type of anti-

microbial protection for biomaterials

F. Boulmedais, B. Frisch, O. Etienne, Ph. Lavalle, C. Picart, J. Ogier, J. -C. Voegel, P.

Schaaf and C. Egles

Biomaterials, 2004, Vol. 25, n°11, pages 2003-2011

Pages 2003-2011 :

• La publication présentée ici dans la thèse est soumise à des droits détenus par un éditeur

commercial.

• Pour les utilisateurs ULP, il est possible de consulter cette publication sur le site de

l'éditeur : http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2003.08.039

• Il est également possible de consulter la thèse sous sa forme papier ou d'en faire une

demande via le service de prêt entre bibliothèques (PEB), auprès du Service Commun de

Documentation de l'ULP: [email protected]

http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2003.08.039

mailto:[email protected]


2Fonctionnalisation par la Défensine

Multilayer polyelectrolyte films functionalized by insertion of defensin: a

new approach to protection of implants from bacterial colonization

Etienne O., Picart C., Taddei C., Haikel Y., Dimarcq J. L., Schaaf P., Voegel J. C., Ogier J. A., Egles C.

Article publié dans Antimicrobials Agents and Chemotherapy vol 48 (2004)

Le système anti-adhésif que nous avons obtenu avec les films fonctionnalisés par

le poly(éthylène glycol) permet de réduire considérablement l’adhésion bactérienne.

Toutefois, il est limité par son caractère non sélectif. Il peut correspondre à un usage

intéressant pour des matériaux transitoires (cathéters, fils de suture,…) mais limité pour

des matériaux implantables.

Nous nous sommes donc intéressés à une autre voie de protection antimicrobienne,

plus sélective. En effet, la fonctionnalisation des films en multicouche par un peptide

antimicrobien devait permettre cette action antimicrobienne ciblée tout en autorisant les

contacts cellulaires et protéiques nécessaires à la bonne intégration d’un matériau

implantable.

La structure générale des films de polyélectrolytes utilisés lors de ces travaux

répond à des impératifs physico-chimiques et biologiques. Ainsi, les couches primaires

sont composées de poly(éthylène imine), de poly(styrène sulfonate) et de poly(allilamine)


hydroxyde sous la forme PEI-(PSS/PAH)2 car cette sous-couche est reconnue pour

donner une bonne stabilité au film. Les couches suivantes sont constituées par l’alternance

de poly(L-lysine) et d’acide poly(glutamique) reconnus pour leur bonne biocompatibilité.

Le choix du peptide antimicrobien s’est porté sur la Défensine d’Anopheles

gambiae, dont l’activité en solution était bien caractérisée. Ce peptide présente en effet un

large spectre ainsi que des concentrations minimum d’inhibition très faibles. De plus, son

mode d’action supposé laissait entrevoir un effet de type purement membranaire et non

intra-cellulaire (Cociancich, Ghazi et al. 1993). Dans un premier temps, des études

physico-chimiques ont été entreprises afin de confirmer et de caractériser l’adsorption de

la Défensine lors de la construction du film. Son pHi lui confère une charge positive de

+4,15 mV à pH 6,3 où les multicouches sont construites, ce qui permet d’envisager son

adsorption sur une couche anionique de type PGA. Cette adsorption reste très difficile à

caractériser sur le plan physico-chimique car le peptide de 4 ,6 kDa est à la limite de

détection de nombreuses méthodes, notamment du guide d’onde pourtant classiquement

utilisé dans ce but. Cependant, les mesures en microbalance à cristal de quartz nous ont

permis d’enregistrer un signal confirmant une dépose de la Défensine lors de la

construction du film, sans que celui-ci soit significativement exploitable à des fins

quantitatives. Les mesures en potentiel d’écoulement de la charge de surface confirment

aussi ce dépôt en montrant une diminution de la charge anionique de surface. La charge ne

s’inverse toutefois pas, laissant supposer une adsorption relative mais incomplète à la

surface du film. Il apparaît dès lors nécessaire de continuer la construction des

multicouches par une couche cationique PLL, et non comme nous aurions pu le penser par

une couche anionique emprisonnant en « sandwich » le peptide.

Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’activité antimicrobienne de ces

films fonctionnalisés, sur deux souches bactériennes (E.coli D22 et M. luteus).

L’inhibition de croissance mesurée après 16h d’incubation et exprimée en pourcentage du

contrôle, confirme l’effet significatif des films fonctionnalisés par une couche de

Défensine. La réduction est de l’ordre de 86% sur M. luteus et de 78% pour E. coli.

Deux observations importantes ressortent aussi de ces premiers résultats, la

première est l’effet propre du film non fonctionnalisé à fin cationique qui montre une

réduction de l’ordre de 43% sur M. luteus et de 8% sur E.coli. La deuxième observation

est liée aux résultats de la croissance sur films fonctionnalisés à fin anionique, qui ne


laisse apparaître aucune différence par rapport au contrôle. Ce deuxième point conforte

l’idée du non-relargage du peptide dans le milieu environnant.

Deux autres analyses biologiques ont alors été envisagées, afin de préciser l’effet

éventuel de la concentration du peptide inséré en monocouche et l’effet de la

multiplication de ces couches à une concentration donnée. La concentration ne s’est pas

révélée être un facteur d’importance puisqu’aucune différence significative n’a pu être

mise en évidence entre l’activité de films construits avec une solution de Défensine à 5,

10, 50, ou 100 µM. L’hypothèse retenue est que l’adsorption de la Défensine sur la couche

anionique répond à une loi de saturation, indépendante de sa concentration initiale en

solution.

En revanche, la multiplication des couches de Défensine à concentration constante

(10 µM) s’est révélée probante. L’insertion de 10 couches de Défensine dans le film s’est

traduite par une inhibition de croissance de presque 99%.

Enfin, afin de mieux comprendre les effets différents obtenus selon la charge finale

du film, nous nous sommes intéressés à l’interface et aux rapports des bactéries avec les

films à ce niveau. Pour cela, deux souches génétiquement modifiées pour exprimer l’une

la protéine fluorescente rouge, l’autre la verte, ont été utilisées afin d’observer en

microscopie confocale leurs rapports avec les films eux-mêmes de fluorescence opposée.

Les films à fin cationique présentent des rapports de contact intimes avec les bactéries

E.coli, tandis que celles-ci restent à distance des films à fin anionique. Ces observations

confirment le rôle prédominant des forces électrostatiques en présence. Des observations

en microscopie à balayage ont permis de préciser cette intimité de contact en montrant une

probable réorganisation du film autour de la bactérie, créant ainsi une « gangue » autour

de la membrane et favorisant l’action des peptides insérés.

Fma

Obser

a b

igure 2-15 (a) Schéma de l’interface bioactive : laximisant ainsi les zones de contact entre les peptidvation en microscopie à balayage de la surface d’u

E. coli. Noter les zones d’insertio

bactérie interagit en s’enfonçant dans le film,es antimicrobiens et la surface membranaire.(b)n film PEI-(PSS/PAH)2-(PGA-PLL)20 recouvert d’n des bactéries dans le film.


Ces travaux ont permis de valider le concept d’action antimicrobienne des films en

multicouche de polyélectrolytes fonctionnalisés par un peptide antimicrobien. Le choix du

peptide apparaît capital et dépendant de la protection recherchée. Les multicouches

constituent une forme d’exploitation très intéressante pour les peptides antimicrobiens,

dans la mesure où leur activité est spatialement définie.

[signalement bibliographique ajouté par : ULP – SCD – Service des thèses électroniques]

Multilayer Polyelectrolyte Films Functionalized by Insertion of Defensin: a New

Approach to Protection of Implants from Bacterial Colonization

O. Etienne, C. Picart, C. Taddei, Y. Haikel, J. L. Dimarcq, P. Schaaf, J. C. Voegel, J. A. Ogier,

and C. Egles

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, Vol. 48, n°10, pages 3662-3669

Pages 3662-3669 :

• La publication présentée ici dans la thèse est soumise à des droits détenus par un éditeur

commercial.

• Pour les utilisateurs ULP, il est possible de consulter cette publication sur le site de

l'éditeur : http://aac.asm.org/cgi/content/full/48/10/3662

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Documentation de l'ULP: [email protected]

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3Applications aux matériaux prothétiques oraux

Polyelectrolytes multilayered films deposition and stability at the surface of

denture base polymers: an in vitro and in vivo study

Etienne O., Picart C., Taddei C., Keller P., Hubsch E., Schaaf P., Voegel JC., Haikel Y., Ogier J., Egles C.

Article soumis à Journal of Dental Research, en révision

Après avoir validé le concept de protection antimicrobienne par la

fonctionnalisation des films multicouches par un peptide antimicrobien, nous nous

sommes concentrés sur l’application de cette technologie à la protection des prothèses

dentaires vis-à-vis des infections fongiques à C. albicans.

La plupart des expérimentations menées sur les multicouches sont réalisées sur des

substrats lisses et chargés comme le verre, le quartz ou le silicium. Il nous fallait dans un

premier temps, valider la dépose uniforme des films en multicouche de polyélectrolytes

sur des matériaux couramment utilisés dans le matériel médical en général et en prothèse

dentaire en particulier. Le poly(métacrylate) de méthyle et le poly(vinyl-siloxane) ou

silicone ont retenu notre attention. Ces deux matériaux constituent en effet la base de

nombreux matériels implantés définitivement ou temporairement. L’état de surface de ces

matériaux présente divers degrés de polissage selon que la méthodologie de fabrication

soit industrielle ou individualisée. Nous avons par conséquent préparé des échantillons de


différentes compositions de PMMA et de PVS, avec des états de surface polis ou non

polis.

Après avoir analysé la topographie de surface de ces échantillons, nous avons

construit à leur surface des films multicouches PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20 dont les

caractéristiques de taille et d’homogénéité avaient été au préalable étudiées sur des

substrats de verre. L’observation en microscopie confocale de ces films, et

particulièrement leur section en z, nous permet de conclure au dépôt homogène des films

sur toutes les surfaces testées. La hauteur du film sur les surfaces polies est comparable à

celle mesurée sur les surfaces de verre (env. 1µm) sauf pour le PVS sur lequel la hauteur

apparaît doublée (env. 2µm). En revanche, sur les surfaces non polies la hauteur du film

est environ 4 fois celle du contrôle sur verre, et son homogénéité est moins grande.

L’épaisseur du film de polyélectrolyte étant directement liée à son degré d’hydratation,

nous avons étudié la mouillabilité des différentes surfaces, polies ou non, avec ou sans

recouvrement par le film. Dans tous les cas, les échantillons recouverts du film

multicouches présentent une grande mouillabilité caractérisée par un angle de contact très

faible, y compris pour le matériel silicone pourtant hautement hydrophobe à l’origine.

Cette caractéristique hydrophile peut présenter en elle-même un grand intérêt comme

interface de contact avec les muqueuses environnantes notamment pour les prothèses

dentaires.

L’application de ces interfaces doit aussi faire face à la dégradation dans les

fluides corporels. Dans cette optique, nous nous sommes attachés à étudier le

comportement des films de polyélectrolytes dans un environnement oral, in vitro et in

vivo.

Ainsi, dans un deuxième temps, nous avons étudié la dégradation de ces films de

polyélectrolytes en présence de salive naturelle, in vitro. Différentes méthodes d’analyse

ont été utilisées afin de s’adapter au mieux au temps d’observation. Ainsi, pour un délai à

court terme (17h), des mesures en microbalance à cristal de quartz ont permis de suivre le

comportement du film en présence de salive, à 37°C. Sur le délai d’observation aucune

perte de poids n’a été enregistrée, et seul le passage du surfactant de nettoyage permet

d’observer la disparition complète du film. Les observations en microscopie confocale et à

fluorescence ont été faites sur des lamelles de verre recouvertes du film et plongées dans

un bain salivaire renouvelé deux fois par jour et maintenu en permanence à 37°C. Après

48h aucune dégradation n’est observable en surface comme en épaisseur. Enfin,

l’observation à 12 jours confirme le bon état du film en surface.


Ces résultats démontrent la bonne résistance du film vis-à-vis de la dégradation

chimique qu’auraient pu engendrer la salive et ses composants enzymatiques. Cependant,

les études in vitro souffrent de conditions particulières, liées à un renouvellement très

partiel de la salive contrairement aux conditions réelles in vivo, où ce renouvellement est

permanent. De plus, les variations de pH, courantes en milieu oral, sont difficilement

reproductibles in vitro.

Nous avons donc conçu un modèle d’étude animal, sur le rat wistar. Les difficultés

rencontrées lors des tentatives d’appareillage par plaque palatine avec ancrage dentaire,

nous ont fait opter pour une solution plus facile et plus reproductible, la suture jugale

d’une pastille échantillon.

Figure 2-16 Premier modèle test: la plaque palatine est réalisée sur un modèle en plâtre de la gueule du rat.L’ancrage de la plaque est obtenu par collage orthodontique aux molaires. Ce modèle a été abandonné carpas assez durable dans le temps.

Figure 2-17 Modèle retenu: une pastille ronde est suturée à la face interne de la joue du rat. Cette zone n’estpas soumise aux contraintes masticatoires. La pastille est recouverte du film de polyélectrolytes rendufluorescent par l’addition d’un PLL-FITC en couche finale.

Ce modèle a l’avantage d’être situé dans une zone non soumise à la mastication

directe par les incisives ou les molaires, et présente une face interne (intrados) et une face

externe (extrados) soumises à des contraintes mécaniques très différentes. L’observation

des échantillons recueillis à 4 jours confirme la bonne stabilité des films sur l’intrados,


tandis que l’extrados apparaît relativement dégradé. Cette dégradation s’explique très

certainement par la gêne occasionnée par la présence de la pastille, qui a dû engendrer des

forces de frottements importantes par la langue. Cette hypothèse est soutenue par la perte

relativement importante du nombre d’échantillons lors de nos études.

Si le nombre d’échantillons examinés (6) peut paraître relativement faible, la

différence de comportement entre intrados et extrados n’en reste pas moins significative.

Le recouvrement de surfaces de PMMA ou de PVS soumises à des contraintes

mécaniques fortes doit faire l’objet de travaux complémentaires afin de renforcer la

cohésion intrinsèque et extrinsèque du film. Cependant, l’application de cette technologie

au recouvrement de l’intrados prothétique qui constitue l’interface impliquée dans la

candidose sous-prothétique est valide. Il reste toutefois à préciser la durée réelle de

dégradation totale du film in vivo.


Polyelectrolytes multilayered films deposition and stability

at the surface of denture base polymers: an in vitro and in

vivo study

ETIENNE O. 1,2, PICART C.1, TADDEI C.2, KELLER P.1, HUBSCH E.3, SCHAAF P.3,

VOEGEL J.C.1, HAIKEL Y 2, OGIER J.A.1, EGLES C.1*

1. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 595, 11, rue

Humann, 67085 Strasbourg Cedex, France

2. Faculté de Chirurgie Dentaire, Université Louis Pasteur, 1, Place de l’hôpital,

67000 Strasbourg, France

3. Institut Charles Sadron, UPR 22 CNRS, 6 rue Boussingault 67083 Strasbourg

Cedex, France

(*) Corresponding author: Phone: 33 (0)3 90 24 33 82; Fax: 33 (0)3 90 24 33 79

Email: [email protected]

Short title: Multilayered films at dental polymers surface

Keywords: Surface treatment, Polyelectrolyte multilayer film, Denture base

polymer, Coating



Abstract

The surface of dental materials is a common site of bacterial adhesion; therefore

many surface modifications have been developed to modify the physical or biological

properties of this interface. A new approach of surface coating involving the layer-by-

layer technique has been recently developed with many potential

biofunctionalizations. Here, we investigate the compatibility of such a technique to

dental-linked applications, by testing the construction and coating of polyelectrolyte

multilayer films on denture base polymers. We demonstrate that the multilayered

films coat the whole material surface and increase the wettability of these surfaces.

Stability of these structures is tested in vitro, in saliva, and in vivo in a rat model.

Saliva does not affect the film, only a strong mechanical action involves a partial

degradation.

Taken together, our results establish that the multilayered film technique is of

interests for oral bio-application.

Introduction

Poly(methacrylate) (PMA), poly(methyl-methacrylate) (PMMA) and

poly(vinylpolysiloxane) (PVS) polymers are widely used in oral prosthesis. However,

these materials are known to be quickly colonized by a bacterial and fungal biofilm

(Radford et al., 1999) which may result in local host inflammations, stomatitis,

periodontitis and caries (Nikawa et al., 1998). Adhesion of micro-organisms at the

surface of biomaterials is the initial step of biofilm formation and depends on a variety

of physical properties such as roughness, hydrophobicity or surface free-energy


(Satou et al., 1991; Bollen et al., 1997; Radford et al., 1998), but also on the nature of

the pellicle that covers the material (Edgerton and Levine, 1992; Gocke et al., 2002).

Various techniques have been used to decrease bacterial adhesion on polymer

surfaces (Jansen and Kohnen, 1995; Park et al., 1998; Monsenego, 2000) or to

confer them antimicrobial properties (Bapna et al., 1988; Othman et al., 2002).

The build-up of polyelectrolyte multilayer (PEM) films (Decher, 1997) offers new

challenging opportunities for the preparation of bioactive biomaterial surfaces. This

method is based on alternate deposition of oppositely charged polyelectrolyte layers

(Figure 1A). The driving force for the construction is the charge excess (alternatively

positive and negative) which appears after each new polyelectrolyte deposition. The

number of cycles, the type of polyelectrolyte and the biophysical characteristics

modulate the thickness and roughness of the multilayered film. This approach allows

the preparation of supramolecular nanoarchitectures exhibiting specific properties in

terms of thickness or roughness of the film.

The purpose of this work was to study the possible application of the PEM film

technique to the dental prosthodontic field. We used environmental scanning electron

microscopy to analyze the surface of three dental polymers with or without polishing

treatment, and we observed the coating of such surfaces by PEM films using lateral

reconstruction by confocal scanning laser microscopy. We then investigated the

biostability of these PEM films: (i) using fluorescent and confocal microscopy and

using quartz crystal microbalance in vitro in natural saliva up to 7 days; (ii) using

confocal microscopy in vivo 4 days after implantation in wistar rat’s oral cavity.


Materials and Methods

Polymer specimen discs preparation

Specimen discs (1 mm thickness x 12 mm diameter for in vitro study; 1 mm x 3 mm

for in vivo study) were prepared with: heat-cured poly(methylmethacrylate) (PMMA)

(IVOCAP, IVOCLAR, Liechtenstein), cold-cured poly(dimethacrylate) (PDM) modified

by glass particles and bead polymerates (UFI gel hard C, VOCO GmbH, Germany),

and poly(vinylpolysiloxane) (PVS) (UFI gel SC, VOCO GmbH, Germany). All

specimen discs were prepared according to the manufacturer’s instructions. Half of

the specimen discs were polished.

Multilayer preparation

Poly(ethylene-imine) (PEI; MW 750 kDa), poly(sodium 4-styrene sulfonate) (PSS;

MW 70 kDa), poly(allylamine hydrochloride) (PAH; MW 70 kDa) from Aldrich, poly(L-

glutamic acid) (PGA; MW 54.8 kDa) and Poly(L-lysine) (PLL; MW 23.4 kDa) from

Sigma were used to build the films. All solutions were prepared at 1 mg/mL in a

0.15M NaCl solution (pH 6.5). For all experiments, a precursor film of PEI-(PSS-

PAH)2 (noted Pre) was build in order to cover the surface of the substrate. Sequence

was followed with (PGA-PLL) bilayers (noted Pre-(PGA-PLL)n), n varying between 11

and 20, depending on the analysis method.


Wettability measurements

The contact angle analyses were carried out in a contact angle meter face (CA-S-

150, Kyowa Kaimenkagaku) following an already described protocol (Bigelow et al.,

1946; Neumann and Good, 1979). The functionalized films were dried under nitrogen

flow before being brought in contact with a drop (Millipore MilliQ water) of 1.52mm

height and 1mm diameter. The angle was determined by the relation

∗=θ

rharctan2

with h corresponding to the height and r to the radius of the contact area of the drop

on the sample. For each sample, the mean value of three measurements was taken.

Quartz crystal microbalance (QCM)

Measurements were performed using the QCM system from Q-Sense (Götenborg,

Sweden) according to the procedure presented in (Picart et al., 2001). A decrease in

∆f/ν is usually associated, in a first approximation, to an increase of the mass

coupled to the quartz. The crystal used here is coated with a ≈ 100 nm thick SiO2

film. Polyelectrolytes were injected into the measurement cell during 5 min and rinsed

during 5 min with a 0.15M NaCl solution. During these steps, the shifts in ∆f were

continuously recorded. At the end, a surfactant (Hellmanex II, HELLMA GmbH,

Germany) was injected to clean the crystal.

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

PLL conjugated to FITC (PLL-FITC, MW 50 KDa, Sigma) was used to image the dye

labeled film in the green channel. The specimen discs were introduced in a home


made chamber and observed by imaging series of consecutive overlapping optical

sections using a Zeiss LSM510 Confocal microscope. The mean thickness (±

standard deviation) of the film was determined from 80 different measurements of the

width of the green band along a computed orthogonal vertical section through the

imaged volume (Picart et al., 2002). In order to fully appreciate PEM films by CLSM,

a minimum of 20 bilayers was needed.

Environmental scanning electron microscopy (ESEM)

Specimen discs were viewed in an environmental mode with a Philips XL30 ESEM

(FEI Company) equipped with a lanthanum hexaboride (LaB6) electron gun and a

gaseous secondary electron detector.

Stability studies

Saliva used for in vitro studies was obtained after stimulation by paraffin chewing and

used immediately at 37°C. For long-time observations saliva was changed every 12

hours. In vivo studies were conducted on 6 wistar rats. All studies were conducted

following the highest principles of animal welfare.

Results

Polyelectrolytes multilayered films build-up

The build-up of the architecture was followed step-by-step, after each new

polyelectrolyte injection, by QCM (Figure 1B). Pre-(PGA/PLL)9 film build-up showed

an exponential growth similar to that observed with PLL/hyaluronan films (Picart et


al., 2002). This exponential growth regime has been explained by the PLL diffusion in

and out of the film during the build-up steps. The film thickness, followed by optical

waveguide lightmode spectroscopy, is also directly correlated to the number of layers

with the same exponential growth (data not shown). For a Pre-(PGA/PLL)20-

PGA/PLLFITC structure built on glass surface, the film thickness is around 1µm as

observed by CLSM (Figure 1C).

Figure 1: Construction and characterization of the PEM films.(A) The buildup and structure of PEM films are based on the alternate deposition andarranging of polyanions (grey) and polycations (black).(B) Build-up of a PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)9 multilayer film as detected by QCM. Global increase in theadsorbed mass is shown by the exponential increase of frequency shift (∆f at15Hz,ν=3). (C) Vertical section obtained by CSLM observation through a PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20-PGA/PLLFITC film built up on a glass substrate. The film thickness isabout 1 µm.


Film construction on polymer surfaces

In order to analyze the topological differences between all the specimen discs, we

observed them by ESEM. Environmental mode enabled direct observations without

any of the surface treatment needed for SEM. PMMA (Fig. 2A) and PDM (Fig. 2C)

specimen discs showed a relatively smooth surface when compared to PVS (Fig.

2E). For all specimens, the effect of polishing was noticeable: PMMA specimens

presented a very homogeneous surface (Fig. 2B) whereas PDM surfaces were

heterogeneous with glass particles and bead polymerates (Fig. 2D); roughness of

PVS surfaces, while decreased, was still visually important (Fig. 2F).

Figure 2: ESEM observations of different polymer surfaces (scale bars: 50µm, inlays10µm): heat-cured poly(methylmethacrylate) (A, B), cold-cured poly(dimethacrylate)modified by glass particles and bead polymerates (C, D), poly(vinylpolysiloxane) (E,F). All the polymers have been used non-polished (A, C, E) or polished (B, D, F).PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20-PGA/PLLFITC films were built-up on the differentsamples and observed by CSLM. Vertical sections of the film on non-polished (A’, C’,E’) or polished samples (B’, D’, F’).


All specimen were coated with a Pre-(PGA/PLL)20-PGA/PLLFITC. Analysis of the Z-

sections showed a total coating on each surface, with high variations in the thickness,

especially for non-polished specimen and more particularly for PVS (as expressed by

a high standard error of the means). Polished surfaces showed a more

homogeneous film deposition (Figures 2B’, 2D’, 2F’) not influenced by the polymer

composition, with a mean thickness of 0.83 ±0.01 µm, 1.49 ±0.20 µm, 2.11 ±0.47 µm

respectively for PMMA, PDMA and PVS. Non-polished specimens showed a less

homogeneous coating, with aggregates (Figures 2A’, 2C’, 2E’) and a mean thickness

of 4.03 ±0.29 µm, 4.07 ±0.70 µm, 4.67 ±1.66 µm respectively for PMMA, PDMA and

PVS.

All samples covered with PEM films exhibited a modification in their wettability,

essentially characterized by a higher hydrophilic property as assessed by contact

angles measurements. In all conditions the contact angle was at least reduced by 5

times between the bare and the PEM coated material. Respectively: for polished

PMMA: bare θ=72.5±2, PEM coated θ=6.1±1; non polished, bare θ=100.8±2, PEM

coated θ=10.5±1; for polished PDMA: bare θ=71.9±2, PEM coated θ=9.1±1; non

polished, bare θ=95.3±2, PEM coated θ=7±1; for polished PVS: bare θ=113±2, PEM

coated θ= 24.6±1; non polished, bare θ=109.3±3, PEM coated θ=7.6±1.

Stability of the films in saliva

PEM films were observed after incubation in saliva at 37°C. QCM measurements

showed no alteration of Pre-(PGA-PLL)6 film up to 17 hours, whereas surfactant’s

injection completely removed it (Figure 3A). Stability of Pre-(PGA-PLL)20-PGA-

PLLFITC film was also assessed using confocal microscopy: no changes in thickness

between the control film dipped in NaCl 0.15M (1.24±0.37µm ) and the film in saliva


(1.28±0.46µm) were observed after 48h (Figure 3B, 3C). Fluorescence microscopy

was used to follow the stability up to 7days (Figure 3D, 3E) and confirmed the

integrity of the film in saliva at 7 days.

Figure 3: Stability of the PEM films in saliva. (A) Measurements performed using theQCM system shows no changes in -∆f/ν associated to a decrease of the masscoupled to the quartz during 1000 min (16 h and 40 min), the injection of a surfactant(Hellmanex) in the chamber totally removes the film in seconds. (B,C). CSLM verticalsections through a PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20-PGA/PLLFITC film, after 48 hours inNaCl 0.15M (B) or in saliva (C). (D,E) Top view of a PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20-PGA/PLLFITC observed by fluorescent microscopy before (D) and after 7 days insaliva (E). Films were scratched to follow their integrity.

In vivo observations

Specimen discs were coated with a Pre-(PGA/PLL)20-PGA-PLLFITC film using a

dipping automate (DR3, Kirstein GmbH, Germany) to ensure a whole coating (Figure

4A) and sutured to the rat’s cheek (Figure 4B). This location was chosen to avoid


interferences with teeth and to ensure a strong tongue mechanical action. After 4

days, the discs were retrieved and observed by CLSM. Cheek side surface, only

exposed to saliva, showed almost no degradation (Figure 4C) while tongue side

surface showed large free spaces but were, however, not totally degraded (Figure

4D).

Figure 4: In vivo experiments in rat oral cavity. PMMA discs are coated on theirwhole surface with PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)20-PGA-PLLFITC film using a dippingautomate (A) and sutured to the rat’s cheek (B). (C,D) Top view observation byCSLM of surfaces of the polymer after 4 days in the rat mouth. PEM film is stillentirely covering the disc on its cheek side (C) while only fragments are detectable onthe lingual side (D). Each area is 115X115 µm.

Discussion

The aim of this study was to investigate the possible use of a new type of surface

coating, based on PEM films, onto dental polymers. This technique has been

described as able to cover, theoretically, all kind of surfaces, as soon as these

surfaces are or can be charged (Decher, 1997). Various applications have been


considered, covering large domains, from food to medical industries. Although, to our

knowledge, there are no studies to date devoted to dental polymers using PEM films.

Dental applications have to face two major problems: the specific environment of the

oral cavity in which materials are in constant contact with saliva, containing, among

many other components, specific enzymes such as lysozymes or amylases.

Furthermore, the low and changing pH of the mouth could be a serious destabilizing

factor for the integrity of the multilayered films. According to our results, PGA-PLL

multilayered films are resistant to saliva environment and only mechanical abrasion

seems able to alter the film. To overcome this mechanical degradation, two

approaches could be considered: one would be a polyelectrolyte chemical cross-

linking, changing physical to covalent bonds between polyelectrolytes. Using this

approach, (Engler et al., 2004) have shown a 10 times increase in the elastic

modulus, leading to a more rigid film. Another approach would be to increase the

interactions between the film and the material, either by increasing the electrostatic

surface charge with copolymerization of methacrylic acid to methyl methacrylate

(Park et al., 2003), or creating covalent interactions by chemical grafting.

The second problem is the complex topography of such surfaces when compared to

glass or industrial metal surfaces. The roughness and the non-homogeneous

character of such surfaces could also lead to an incomplete build-up. Our results

establish that these films can be successfully used in the oral cavity, as the coating of

polymer surfaces was achieved and no chemical degradation was observed.

Moreover, the high initial hydrophobicity of PVS did not seem to affect the deposition.

Indeed not only for PVS, but also for PMA and PMMA, the covering of the polymer


surface by multilayer films was strongly increasing the wettability of the material. The

PEM would therefore add a superior lubricating layer between the material and the

supporting tissues, reducing physical frictions and patient discomfort.

More than surface modifications the PEM films technique make many potential dental

applications conceivable. Anti-microbial protection of oral polymer surfaces is one of

the most promising. Simple chemical modifications by grafting poly(ethylene glycol)

directly on the polyelectrolytes have been shown to increase the anti-adhesive

properties of these films on glass surfaces (Boulmedais et al., 2004). Another

biofunctionalizing approach is to confer specific biological properties to multilayered

films by integrating antimicrobial proteins directly in the film (Etienne et al., Accepted

for publication # 164-04 164-04 #33).

PEM films seem therefore an extremely promising method to achieve active coatings

of great interest for biomaterials in general and especially dental polymers as a

possible prevention of oral infections.

Acknowledgements

The authors thank Jerome Mutterer (IBMP, Strasbourg) for the access to the CSLM,

and J.H. Lignot for the SEM.


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Films de polysaccharides dégradables

4Films de polysaccharides dégradables

Degradability of polysaccharides multilayer films in oral environment: an

in vitro and in vivo studyOlivier Etienne, Aurore Schneider, Corinne Taddei, Pierre Schaaf, Jean-Claude Voegel, Christophe Egles,

Catherine Picart

Article soumis à Biomacromolecules, accepté

La stabilité des films de polyélectrolytes PGA-PLL dans l’environnement oral

(article 3) et le maintien in situ du peptide inséré dans le film (article 2) ne nous

permettaient pas d’envisager un contrôle dans le temps du relargage peptidique. Nous

nous sommes intéressés alors à d’autres types de films élaborés à base de constituants

naturels, biocompatibles et biodégradables : le chitosan et l’acide hyaluronique.

Le chitosan est dérivé de la chitine, qui est un produit naturel extrait de carapaces

de crustacés ou de plumes de calmars. La chitine est constituée d'une chaîne linéaire de

groupes acétylglucosamine. Le chitosan est obtenu en enlevant suffisamment de groupes

acétyl (CH3-CO) pour permettre à la molécule d'être soluble dans la plupart des acides

dilués. Cette opération, appelée déacétylation libère les groupes amine (NH) et confère au

chitosan une nature "cationique".

L’acide hyaluronique, ou hyaluronane, appartient au groupe des

glycosaminoglycanes qui forment de grandes chaînes de polysaccharides. Il contient

jusqu’à 25 000 molécules de disaccharides identiques. Cette molécule volumineuse est un


des constituants les plus importants de la matrice extracellulaire qui joue un rôle important

dans beaucoup de tissus, mais surtout dans le tissu conjonctif. Grâce à sa très grande

capacité de rétention d’eau, il forme, même à de faibles concentrations, des gels très

volumineux et viscoélastiques.

Ces deux constituants sont des polysaccharides déjà utilisés dans le domaine

dentaire sous forme de gel : le premier pour ses propriétés anti-microbiennes (Sano,

Shinasaki et al. 2001; Ikinci, Senel et al. 2002) et le second pour lutter contre les états

inflammatoires (Moseley, Waddington et al. 2002; Jentsch, Pomowski et al. 2003).

La construction de ces films a été caractérisée préalablement à l’étude de leur

dégradabilité in vitro puis in vivo. Enfin, la réticulation de ces films, et son influence sur le

temps de dégradation, ont été évaluées dans l’optique de déterminer un système de

relargage contrôlé.

Les films ont montré qu’ils s’auto-assemblaient selon une croissance de type

exponentielle, et une épaisseur de 6µm a été mesurée en microscopie confocale pour un

film de 24 bicouches (CHI/HA)24-CHIFITC. Ces films sont par conséquent plus hydratés

que les films de polyélectrolytes (PGA/PLL) avec lesquels nous avions travaillé jusque là.

Leur réticulation a été réalisée par les Dr L. Richert et C. Picart, selon un procédé de

réticulation chimique en présence d’EDC/sulfo-NHS. Celle-ci a été suivie en

spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et a permis de confirmer la

formation de liaisons amides et esters entre le chitosan et l’acide hyaluronique.

Dans un deuxième temps, la stabilité des films a été évaluée in vitro, à la fois en

présence d’enzymes spécifiques à la cavité orale (lysozyme, alpha-amylase) et en

présence de salive naturelle. Les films non réticulés présentent rapidement une

dégradation, avec des aspects toutefois différents selon l’enzyme. En revanche, les films

réticulés semblent résister à la dégradation enzymatique.

Les observations en microbalance à cristal de quartz et en microscopie confocale

confirment ces résultats en présence de salive naturelle. La dégradation des films non

réticulés est lente et progressive durant les 5 premières heures, puis s’accélère ensuite

jusqu’à la disparition quasi-totale du film en 10 heures. Les observations en microscopie

confocale mettent en évidence une dégradation évoluant de la superficie vers la

profondeur, ce qui laisse envisager des perspectives pharmacodynamiques intéressantes


car contrôlées par la profondeur de l’enfouissement du peptide à relarguer. Les films

réticulés, sur la même période, n’ont pas présenté de dégradation notable.

Ces observations in vitro ont été complétées par des études in vivo, sur le modèle

de la pastille jugale chez le rat wistar (article 3). A nouveau, le contraste entre la face

jugale et la face linguale a pu être observé, confirmant le rôle de l’action mécanique

d’auto-nettoyage de la langue. Cependant, les résultats concernant l’effet de la réticulation

sur la stabilité du film se sont avérés concluants. En effet, après 6 heures, il ne reste plus

que 12% de surface recouverte sur les faces jugales des pastilles à films non réticulés,

contre 80% dans le cas des films réticulés. Après 3 jours, le film non réticulé a disparu de

la surface jugale tandis qu’il persiste plus de 60% des films réticulés.

Ces films à base de polysaccharides (CHI/HA) constituent une alternative très

intéressante aux films de polyélectrolytes (PGA/PLL) dans la mesure où leur dégradation

est totale, et surtout contrôlable, dans l’environnement salivaire.


Degradability of polysaccharides multilayer films in oral environment: an

in vitro and in vivo study

Olivier Etienne1,2, Aurore Schneider1, Corinne Taddei2, Ludovic Richert1, Pierre Schaaf3,

Jean-Claude Voegel1, Christophe Egles1, Catherine Picart 1*

1 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 595, Université Louis

Pasteur, Faculté de Chirurgie Dentaire, 11 rue Humann, 67085 Strasbourg Cedex, France

2Faculté de Chirurgie Dentaire, Université Louis Pasteur, 1 Place de l’Hôpital, 67000

Strasbourg

3Institut Charles Sadron, Centre National de la Recherche Scientifique, Université Louis

Pasteur, 6 rue Boussingault, 67083 Strasbourg Cedex, France

AUTHOR EMAIL ADDRESS : [email protected]

TITLE RUNNING HEAD : Degradability of polysaccharide multilayer films in oral

environment.

CORRESPONDING AUTHOR FOOTNOTE. Catherine Picart, INSERM U595, Faculté

de Médecine, Bât 3, 11 rue Humann, 67 085 Strasbourg cedex, France. Tel : 33-3-90-24-32-

58 ; Fax : 33-3-90-24-33-79.

ABSTRACT.


Biomedical devices and modified biomaterial surfaces constitute an expanding research

domain in the dental field. However, such oral applications have to face a very particular

environment with specific physiological conditions and specific enzymes. To evaluate

whether polyelectrolyte multilayer films coating could be useful to develop new types of oral

applications, the degradability of polyelectrolyte multilayer films made of chitosan and

hyaluronan (CHI/HA), which are natural polysaccharides, was investigated in vitro,

mimicking an oral environment, and in vivo in a rat mouth model. The films were either

native or cross-linked using a water soluble carbodiimide (EDC) in combination with N-

hydroxysulfosuccinimide. The in vitro degradation of the films in contact with different

enzymes present in the oral environment, such as lysozyme and amylase, was followed by

quartz crystal microbalance measurements and confocal laser scanning microscopy

observations after film labeling with CHIFITC. Whereas the native films were subjected to

degradation by all the enzymes, the cross-linked films were more resistant to enzymatic

degradation. The films were also put in contact with whole saliva, which induced a slow

degradation of the native films over an 18 h period. The in vivo degradation of the films

deposited on polymer discs and sutured in the rat mouth was followed on a 3 days period.

Whereas film degradation is fast for the native films, it is much slower for the cross-linked

ones. More than 60% of these films remained on the discs after a 3 days presence in the

mouth. Taken together, these results suggest that the multilayer films made of natural

polysaccharides are of high potential interest for oral applications, especially as drug release

system, offering various degradation and therefore releasing times.

KEYWORDS. Polyelectrolyte multilayers, polysaccharides, cross-linking, saliva, lysozyme,

amylase, degradability, in vivo, dental implant, oral bio-applications.


INTRODUCTION

Polyelectrolyte multilayer (PEM) coatings have become a new and general way to

functionnalize surfaces and their applications range from optical devices to biomaterial

coatings 1,2. The technique is based on the alternate deposition of polyanions and

polycations3,4. Film functionnalization can be achieved by incorporating particles 5 or

bioactive molecules into the architecture 6,7. Various types of films can be prepared using

synthetic polyelectrolytes, such as poly(styrene sulfonate) (PSS) or poly(allylamine

hydrochloride) 3,8synthetic polypeptides, such as poly(L-lysine) (PLL) and poly(L-glutamic)

acid (PGA) 9,10, or even natural polyelectrolytes, such as dextran, alginate, heparin,

hyaluronan and chitosan 11-13. This last type of films, being biocompatible, non toxic, and

biodegradable, is rapidly expanding due to great potential applications : preparation of

biomimetic films11,14; of drug release vehicles13,15; of bioactive coatings either by drug

incorporation or by the use of the intrinsic properties of the polyelectrolytes16,17, or build-up

of cell adhesive or non-adhesive films 11,18.

Despite the incorporation of precise functionalities into PEM films, only few examples of

functional multilayer assemblies designed to release incorporated materials have been

described 19,20. This can be achieved by gradually decomposing the film. Most of these

decomposable assemblies concern synthetic polyelectrolytes and the release mechanisms rely

on physico-chemical film properties. Usually, the dissolution of PEM films is a consequence

of a change in environmental pH, for instance for hydrogen bonded multilayers 20 or a change

in ionic strength19,21. Dubas and Schlenoff 21and Schüler and Caruso 19 have demonstrated that

salt induced dissolution can occur in high salt containing solutions. However, the transitions

from stability to dissolution are very rapid and neither does it seem possible to control either

the degradation rate or such decomposition in physiological conditions. Recently, Vazquez et

al. 22 used a hydrolytically degradable polyelectrolyte, poly(β-amino-ester) in combination


with poly(styrene sulfonate) (PSS) to build a degradable film in aqueous environment. In

these experiments, the film was degraded within about a day.

An alternative way to create biodegradable films for biomedical applications is to make use

of the intrinsic properties of natural polyelectrolytes and of the potential presence in vivo of

different enzymes in the biological fluids. For instance, all the natural polyelectrolytes and

proteins present in tissues and fluids can be cleaved by specific enzymes : this is the case for

collagen by collagenase, for hyaluronan by hyaluronidase23, for chitosan by chitosanase and

other enzymes…Serizawa et al. started to explore such possibilities by investigating, by

quartz crystal microbalance, the degradation of chitosan/dextran sulfate films in the presence

of chitosanase24. They found a more rapid hydrolysis when dextran sulfate constitute the

outermost layer of the film, which occurred only at 40°C. These authors also evidenced that

DNase can hydrolyze DNA/poly(diallyl dimethylammonium chloride) films in a controlled

manner provided that the concentration of both Mg2+ and Ca2+ ions in the medium is

adjusted25. In an attempt to mimic the in vivo behavior, one also has to consider the nature of

the enzymes present in vivo, which will largely depend on the nature of the fluid in contact

with the coated material in its specific location. In the oral environment, biomaterials will be

in contact with saliva, which contains many proteins and enzymes such as lysozymes and α-

amylase26. The polyelectrolyte multilayer films can be used for many potential oral bio-

applications such as antimicrobial protection27,28, or anti-inflammatory protection 29. All the

biomedical applications are mainly linked to two factors, the biocompatibility of the

multilayer films and the stability of the films in vivo, especially for a controlled release of a

peptide or a molecule. The biocompatibility of various polyelectrolyte multilayers made of

polysaccharides and polypeptides has already been evaluated 7,17.

In the present work, we investigate the degradability properties of chitosan/hyaluronan

(CHI/HA) films in vitro and in vivo in oral environment over several days. Chitosan is


obtained after N-deacetylation of chitin by alkaline treatment (Figure 1), chitin being the

second most abundant naturally occurring polysaccharide 30. It is found in crustacea shells and

insects and is also synthesized by some unicellular organisms. Hyaluronan (HA) (Figure 1) is

a highly hydrated polysaccharide of great biological interest 31. It possesses lubricating

functions in the cartilage, participates in the control of tissue hydration, water transport, and in

the inflammatory response after a trauma. It is widely used in cosmetic formulation and seems

promising in tissue engineering applications 32,33. These two polysaccharides are

biocompatible, non-toxic and biodegradable by enzymatic hydrolysis with chitosanase 24, α-

amylase 26, lysozyme, and hyaluronidase 34. Both have already been widely used in

biomedical applications and have interesting intrinsic properties 35. Chitosan in solution or as

hydrogel are particularly used in pharmaceutical drug formulations, in sustained release of

water-soluble drugs 30,36 and also exhibit anti-bacterial and anti-microbial activity 37,38. Tissue

engineering based on chitosan and hyaluronan hydrogels seems also promising 39,40. Chitosan

and hyaluronan can be easily chemically modified 41-43 and bounded to various molecules

such as cell-targeted prodrugs44, carbohydrates 45, which could be released upon film

hydrolysis.

O

--

--

OH

- OH

COOH

-

OO

--

--

OH

- NHCOCH3

CH2OH

O-

BNnAnio


FIGURE 1. Molecular structures of the hyaluronan (A) and chitosan (B) repeating units.

DA is the degree of acetylation of chitosan.

Chitosan and hyaluronan have already been used for oral applications as hydrogel or

membranes 37,46. Recently, we showed also that these polysaccharides can form PEM films in

acidic conditions in the presence of 0.15 M NaCl. As the film growth is exponential, film

morphology and thickness can be estimated by confocal laser scanning microscopy using

fluorescently labeled chitosan. The activity of the whole saliva, as well as specifically

lysozyme and α-amylase enzymatic activity on these films will be more precisely

investigated. Lysozyme (14 kDa) is able to hydrolyze chitin and chitosan 47. Alpha-amylase

(45-60 kDa) is an abundant salivary enzyme that catalyzes the hydrolysis of α(1,4) glycosidic

bindings between glucose residues of polysaccharides. Amylase has already been found to

hydrolyze chitosan in solution 47. For our in vivo experiments, the films were deposited on

polymer discs and sutured in oral cavities of rats. Film cross-linking was performed using a

water soluble carbodiimide 48 in order to investigate the possible relations between physico-

chemical properties of the film and modifications in its biodegradability.

Materials and Methods

Polyelectrolyte and enzyme solutions. HA (sodium hyaluronate, 4x105 g/mol), was

purchased from Bioiberica (Spain). HA is a polyanionic macromolecule with a pKa ≈ 2.9 32

and with a negative charge at pH = 4.5. It has a low charge density since only one residue

from two is charged 49. CHI (chitosan, oligo-saccharide of low molecular weight, LMW =

5x103 g/mol) was purchased from Medipol (Switzerland). According to the manufacturer, the

degree of acetylation (DA) given is below 20%. CHI is a weak base, a positively charged

polyelectrolyte in acidic condition with a pKa ≈ 6 49,50. Sodium dodecyl sulfate (SDS) was


purchased from Sigma and sodium chloride (purity 99.5%) was obtained from Fluka (St

Quentin Fallavier, France). All solutions were prepared using ultrapure water (Milli Q-plus

system, Millipore) with a resistivity of 18.2 MΩ.cm. Fresh polyelectrolyte solutions at 1

mg/mL were always prepared by dissolution of the respective adequate polymer amounts in

filtered saline solutions. CHI and HA were dissolved at 1 mg/mL in 0.15 M NaCl in water and

were gently stirred overnight. The pH of the polyelectrolyte solutions was adjusted to 4.5 with

0.1M acetic acid. For both polyelectrolytes, taking into account their molecular weight, the

concentration were below the critical concentration c*51,52. (CHI/HA)i architectures were

built with i number of deposited layer pairs. Fluorescently labeled chitosan (CHIFITC) was

prepared according to a published protocol 11.

Lysozyme (L6876, Sigma) and α-amylase (A4551, Sigma) were prepared in the NaCl

solution at pH 5 at 1 mg/mL and 500U/mL respectively. Natural saliva was obtained after

stimulation by paraffin chewing and used immediately at 37°C. For long-term observations,

saliva was changed every 12 hours.

Automatic buildup of the polyelectrolyte multilayered films. For confocal microscopy,

fluorimetry and in vivo experiments, (CHI/HA)i films were prepared with an automatic

dipping machine (Dipping Robot DR3, Kirstein and Riegler GmbH, Germany) on 12 mm

glass slides (VWR Scientific, France) preliminarily cleaned with 10 mM SDS and 0.1 N HCl

and extensively rinsed. The glass slides were introduced vertically in a home made holder

which was dipped for 15 min. into a first polyelectrolyte solution (CHI, 12 mL) and

subsequently rinsed in 3 different beakers containing the 0.15 M NaCl solution at pH = 4.5.

The slides were dipped in the first rinsing beaker (350 mL) and once for 150 s in the two other

rinsing beakers (40 mL each). The slides were then dipped into the oppositely charged

polyelectrolyte solution (HA, 12 mL) followed by the same rinsing procedure. The robot was


programmed to move to fresh rinsing solutions after each deposition of six layers. Slides were

then stored at 4°C until use in 24-well culture plates.

Film cross-linking procedure and characterization by Fourier Transformed Infrared

Spectroscopy. For the chemical cross-linking of the films, a previously published protocol

that was applied on (PLL/HA)i films 48 was followed. It is based on the reaction of activated

carboxylic sites with primary amine groups 53 in the presence of a water soluble carbodiimide,

1-Ethyl-3-(3-Dimethylamino-propyl)Carbodiimide (EDC) and of N-Hydrosulfosuccinimide

(sulfo-NHS) (both purchased from Sigma). Briefly, EDC and sulfo-NHS were purchased from

Sigma and prepared at 400 mM and 100 mM respectively in a 0.15 M NaCl solution at pH

4.5. 1 mL of the mixed EDC/Sulfo-NHS solution (v/v) was deposited in the wells containing

the (CHI/HA)24–CHIFITC coated glass slides or in the Eppendorf tubes containing the polymer

discs and left for 12 hours at 4°C.

For film cross-linking characterization, (CHI/HA)9 films deposited on a ZnSe crystal were

investigated by in situ Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy in Attenuated Total

Reflection (ATR) mode with an Equinox 55 spectrophotometer (Bruker, Wissembourg,

France). All the experimental details have been given previously 54. The experiments were

performed in deuterated 0.15 M NaCl solution at pH ≈ 4.5. The parameters and configuration

used for the acquisition during the cross-linking reaction have already been detailed 48. The

films were cross-linked with the EDC/NHS solution and spectra were acquired before and

after cross-linking.

Film degradation analysis by quartz crystal microbalance (QCM).

The (CHI/HA)i film build-up process and its subsequent degradation by enzymes and by

saliva were followed by in situ quartz crystal microbalance (QCM-Dissipation, Qsense,

Sweden) 55,56The quartz crystal is excited at its fundamental frequency (about 5 MHz) as well


as at the third, fifth and seventh overtones (corresponding respectively to 15, 25 and 35 MHz).

Changes in the resonance frequencies δf and in the relaxation of the vibration once the

excitation is stopped are measured at the four frequencies. The apparatus gives also access to

the dissipation D of the vibrational energy stored in the resonator. From those parameters, the

film thickness can be determined using the model developed by Voinova et al. 57. (CHI/HA)6

films were built at 25°C by successive injections of 500 µL of the polyelectrolyte solutions in

the measuring cell (12 min adsorption for each layer) and a subsequent rinsing with 500 µL of

the NaCl solution (injected in about 10 seconds). This number of layer pairs was chosen to

ensure that at least two frequencies/dissipations (5 and 15 MHz) could be acquired during the

whole experiment. After film build-up, the temperature was raised to 37°C in 2°C steps in

about 2 hours and 1 mL of the enzyme or saliva solutions was injected and left at rest

overnight at 37°C.

Film degradation observations by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

For the CLSM experiments, the film coated glass slides were prepared with the dipping

robot. CHIFITC was adsorbed as the ending layer. As an example, (CHI/HA)24-CHIFITC

corresponds to a film composed of 24 pair of layers on top of which a final CHIFITC layer has

been deposited. The configuration of the microscope and the parameters used for the CLSM

observations on a Zeiss LSM510 microscope have been given elsewhere 58. 1 mL of the

enzyme solution or of saliva was deposited on the film coated glass slides (introduced in a 24-

well culture plate) and kept in an incubator at 37°C for a given period of time (from three

hours to 24 hours). For the observations, the 12 mm glass slides were introduced in a home-

made chamber and observed by imaging series of consecutive overlapping optical sections (x-

y images at different depth z). Orthogonal vertical sections were computed in order to image a

(x-z) section of the film.


In vivo studies in rat mouth

In vivo studies were conducted on 8 male Wistar rats following the principles of animal

welfare. Sixteen heat-cured poly(methyl-methacrylate) (PMMA) discs, 1 mm thick x 3 mm

diameter (Probase®, Ivoclar, Lichtenstein), were prepared as buttons with 2 holes at their

center to facilitate the suture. The discs were divided in two groups: eight discs were covered

with a native (CHI/HA)24 film and eight discs were covered with a cross-linked (CHI/HA)24

film using the automatic dipping machine (DR3, Kirstein GmbH, Germany). In order to

obtain a well-coated surface, a precursor film composed of poly(ethylene imine) (PEI),

poly(styrene sulfonate) (PSS), and poly(allylamine hydrochloride) (PAH), ie PEI-(PSS/PAH)-

PSS was first deposited on the polymer discs. For each animal, one disc was fixed with a

polyglactine 910 suture (3/0 VICRYL®, ETHICON, Johnson & Johnson Intl, Belgium) to the

cheek, between the molars and the incisors zone to prevent any risk of extraction by teeth. Six

out of the 16 discs were not recovered, which indicates that there was a strong tongue activity

around them. Ten discs were recovered: six discs after 6 hours (three of each group), two

discs after 48 hours (one of each group), and two discs after 72 hours (one of each group). All

discs were stored in a 0.15M NaCl solution and viewed under epifluorescent illumination

(excitation filter, 480/40 nm; dichroic filter, 505 nm; and emission filter, 510 nm) with a

Leica MZFLIII stereomicroscope and also by confocal laser scanning microscopy. The stereo

microscope images were analyzed by Image J software (NIH, Bethesda) to determine the film

area remaining on the disc, which was divided by the total disc area (the result being

explained in percentage).


Results and discussion

Film characterization and cross-linking

As (CHI/HA) film growth is exponential (Figure 2A), film thickness rapidly reaches several

micrometers for film containing a few tens of layers. The mean thickness (+ SE) of a

(CHI/HA)6 film was estimated at 175 nm + 18 nm by QCM (mean of three independent

experiments). For high numbers of deposited layers and much thicker films (of the order of at

least one micrometer), confocal microscopy is used to determine the film thickness. This is

done after labeling the film with CHIFITC as ending layer and measuring, on z-sections

obtained by CLSM, the green band corresponding to CHI diffusion (Richert et al. 2004b). For

a (CHI/HA)24-CHIFITC film with CHI of MW = 5kDa, the film thickness is of about 6 µm

(Figure 2B).

FIGURE 2. Film growth followed by QCM-D for a (CHI/HA)10-CHI film built in 0.15 MNaCl at pH = 4.5 (CHI, MW = 5x103 g/mol ; HA = 4x105 g/mol). Confocal laser scanningmicroscopy observation of a (CHI/HA)24-CHIFITC film built in the same conditions. Filmthickness is about 6.5 µm (line).

Number of layer pairs0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

δ f/ν

(MH

z)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200 5 MHz 15 MHz 25 MHz 35 MHz


In order to investigate the possibility of cross-linking the CHI/HA films, a protocol based on

the reaction of activated carboxylic sites with primary amine groups 53 in the presence of a

water soluble carbodiimide, EDC in combination with sulfo-NHS, was used. The cross-

linking reaction in the presence of EDC/sulfo-NHS was more precisely followed by FTIR-

ATR. Recently, this technique proved to be a powerful tool to follow the cross-linking

reaction kinetics for PLL/hyaluronan films 48 and for poly(L-lysine)/poly(L-glutamic) acid

(PLL/PGA) films 59. The detailed mechanism of the cross-linking reaction with EDC

combined to sulfo-NHS have previously been given 48. By FTIR, carboxylate peaks,

saccharide peaks and amide bands can be unambiguously identified. Figure 3 shows a typical

spectrum of a (CHI/HA)8 film deposited on a ZnSe crystal before contact with the EDC/NHS

solution. The peaks attributed to asymmetric and symmetric –COO- stretches (1606 and 1412

cm-1 respectively) from HA can be clearly identified 60. The amide I band from HA in D2O

appears in the 1630-1700 cm-1 region 60 and the C=O band for chitosan appears at around

1620 and 1660 cm-1 61. Characteristic bands of saccharide peaks representative of the skeletal

vibrations include the C-O stretching at 1082 cm-1 and 1032 cm-1 and that at 1159 cm-1 61,62

After the film has been brought in contact with the EDC/NHS solution for ten hours, the

spectrum has evolved. In particular the intensity of the peaks attributed to the carboxylic

groups (1606 and 1412 cm-1) has decreased and correlatively the intensity of the amide band

around 1660 cm-1 has increased. This proves the reaction between the ammonium groups of

CHI and the carboxylic groups of HA. The characteristic bands of the saccharide peaks also

decrease during the cross-linking reaction. This suggests the formation of other bonds such as

ester bonds, which involve hydroxyl groups of polysaccharide and carboxylic groups or acid

anhydride formed by the reaction between two carboxylic groups 63. Such reaction was

proposed by Tomihada et al. to explain the cross-linking of pure HA gels by EDC 63.

Conversely, the intensity of the peak attributed to the ester bond at 1740 cm-1 64 increases. In


the present case, the reaction most probably occurs between chitosan and hyaluronan

molecules, and not only between hyaluronan molecules, since comparable observations were

not made during the cross-linking of (PLL/HA) films 48.

The difference between the final spectrum (after rinsing the film that has been in contact for

ten hours with the EDC/NHS solution) and the spectrum of the film before contact with the

EDC/NHS solution thus clearly evidences the structural modification occurring in the film

upon cross-linking.

FIGURE 3. Film cross-linking followed by FTIR-ATR : a spectra of a native (CHI/HA)8 film(thin line) and of the same film after the cross-linking procedure and the final rinsing step (-ο-). The difference between the two spectra (before and after cross-linking) is alsorepresented (thick black line shifted downward for a better visualization).

Film degradation by enzymes and saliva in vitro : CLSM observations and QCM

measurements

In order to investigate the biodegradability of the films in vitro, the films were put in

contact with saliva enzymes such as lysozyme and α-amylase and with natural saliva. Film

degradation was followed by QCM and by confocal microscopy. For QCM, thin films

made of six layer pairs were built and then put in contact with the solutions, in order to

Frequence (cm-1)900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

Abs

orba

nce

(AU

)

-0.8

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

1412 cm-1

COO- of HA

1606 cm-1

COO- of HA Amide I saccharide

peaks

Amide II


follow the signal over a long time period. For CLSM observations, thick (CHI/HA)24-

CHIFITC films were used since they allow clear film morphology and thickness

visualization. Native and cross-linked films were compared. The native films were

degraded by both lysozyme and α-amylase, with however some differences in the resultant

film morphologies. In fact, lysozyme is already known to cleave chitin and chitosan gels 65-

67. In its presence, pores appear in the film after several hours contact (Fig 4 A) and are

visible on the film vertical sections (Fig. 4A’). The action of α-amylase is also noticeable:

a regular netlike pattern associated to a “spider’s web” like film structure (Fig. 4C and C’).

This enzyme is able to cleave the α(1,4) glycosidic binding between glucose residues of

polysaccharides and to degrade CHI 47,68.

FIGURE 4. Enzymatic degradation of native (left hand side) and cross-linked (right handside) (CHI/HA)24–CHIFITC films observed by CLSM : lysozyme at 1 mg/mL after 17 hourson a native film (A, top view and A’, vertical section through the film) and on a cross-linked film (B) and (B’) ; α-amylase at 500 U/mL after 15 hours on a native film (C, topview and C’ side view) and on cross-linked film (D) and (D’).


This result suggests also that the contact with certain enzymes enables three-dimensional

regulation of the surface structure of the multilayer film and could be used for instance to

prepare films or membranes of various porosity. In contrast, the cross-linked films are

much more resistant to all enzymatic degradation. No degradation was observed after

contact with lysozyme (Fig 4B and B’). For α-amylase, a small superficial degradation was

observed on the top view (Fig 4D), which was not visible on the film vertical section (Fig

4D’).

The effect of natural saliva on the native and cross-linked films was also investigated.

QCM degradation of a native (CHI/HA)6 film in contact with saliva at 37°C was followed

overnight (Fig 5A). The degradation is slow but progressive in the five initial hours, then a

more rapid degradation is observable during 5 and 10 hours, time after which the film is

almost totally degraded. On the CLSM observations of a (CHI/HA)24-CHIFITC film that

was in contact with saliva for 24 hours, a uniform degradation with the appearance of

preferred degradation sites can be visualized (Fig 5B and C). On the film top views, a

regular pattern of small “nodules” is visible, which looks like a grainy material. The side

view image also evidences a smooth and incomplete degradation with preferred dissolution

areas on this thick film. It is thus proven that the native films are slowly and uniformly

degraded in saliva. The degradation seems to progress from top to bottom and could thus

present advantages for the release of incorporated material, allowing a precise control of

the sequences by which one or more components are progressively released. The cross-

linked films totally resist to saliva degradation over the same time period (data not shown).


FIGURE 5. Differences in the QCM frequency shifts -δf/ν (A) as a function of time for a(CHI/HA)6 film after contact with saliva : ( ) 5 MHz, ( ) 15 MHz, (∇) 25 MHz, and ( )35 MHz. CLSM observations of a native (CHI/HA)24-CHIFITC films that has been in contactwith saliva for 24 hours : (B) scan size is 230 x 230 µm2 and (C) 57.6 x 57.6 µm2.Corresponding Z-section image (side view) of the same film (D) at 46.1 x 15.5 µm2.

Film degradation in vivo in oral environment

In oral applications, the films will be exposed to saliva in a rather harsh environment (like

tongue mechanical action and chewing) compared to the sole action of enzymes as tested

time (hours)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

δ f/ν

(MH

z)

0

100

200

300

400

500

600

700

5MHz 15MHz 25MHz 35MHz

A


in vitro. The films were thus placed in in vivo conditions to mimic a real environment. For

these in vivo experiments, the (CHI/HA)24FITC films were deposited on top of 6 mm

diameter PMMA discs (Figure 6A), which were subsequently sutured to rat’s cheek

(Figure 6B). This location was chosen to avoid any direct contact with the teeth and to

ensure a strong tongue mechanical action. Thus, the outer side of the disc was in contact

with the tongue and the inner side with the cheek, which means that this latter side was

more protected against the mechanical action and was mostly exposed to saliva.

FIGURE 6. In vivo experiments in rat oral cavity. PMMA discs are coated on both sideswith a (CHI/HA)24-CHIFITC film using the automatic dipping machine. A fluorescencestereo microscope image of the film coated polymer discs was taken before implantation inthe rat mouth. The disc was subsequently sutured to the rat’s cheek (B).

After different time periods varying from 6 hours to 3 days in the mouth, the discs were

recovered and both sides were observed using a fluorescence stereomicroscope (Figure 7)

and CLSM (Figure 8). The area of the film remaining on the disc surface was measured

using Image J software and expressed in percentage of the total surface area (Table 1).


Table 1. Percentage of (CHI/HA)24-CHIFITC film remaining on the polymer discs after varioustimes in vivo in the rat mouth.

Type of film 6 hours Day 2 Day 3TONGUE SIDE

nativecross-linked

≈ 7%≈ 75%

≈ 10 %≈ 55 %

< 2 %≈ 40 %

♦ CHEEK SID Enative

cross-linked≈ 12%≈ 81%

≈ 8 %≈ 65 %

< 2 %≈ 77 %

FIGURE 7 : Observation of the native and cross-linked (CHI/HA)24-CHIFITC coatedpolymer discs after implantation in rat oral cavity (each image is a different disc).Fluorescence stereo microscope images of the polymer discs coated with native (A, B, C)and cross-linked (D, E, F) (CHI/HA)24-CHIFITC films that have been placed in vivo fordifferent time periods in rat oral cavity : after 6 hours (A,D), after two days (B, E), afterthree days (C, F). Image sizes are 6.3 x 4.8 mm2.

The native films are rapidly degraded in the mouth on both cheek and tongue side. On the

cheek side, only 12% of the native film remains after 6 hours (Figure 7A), 8% after two

days and no film traces are visible after three days (Figure 7B,C). Only 7% of the native


film remains on the tongue side after 6 hours and the film is totally degraded after 3 days

(images not shown).

The cross-linked films are more resistant against degradation. Considering the cheek sides,

after 6 hours, more than 80% of the film remains (Figure 7D). Observations of discs

implanted in different rats after two or three days show around 65% and 75% of remaining

film respectively (Figure 7E and 7F). These data indicate that a large fraction of the cross-

linked film is still on the polymer discs after three days of implantation in vivo. Results for

the tongue side show the same trend (images not shown), except that the percentage of

cross-linked film remaining on the polymer disc is systematically lower. After six hours,

75% of the film remains on the tongue side, whereas only 55% and 40% remain after two

and three days (Table 1). The confocal images obtained by projection of a whole z-series

acquisition confirm these observations (Figure 6). Only few amounts of the native un-

cross-linked films remain after six hours, two and three days (Figure 8A, B, C). In

contrary, the discs coated with the cross-linked films are still almost entirely covered after

six hours (Figure 8D). After two days, a degradation of the film is clearly visible and the

film has a granular aspect (Figure 8E), which is even more pronounced at three days

(Figure 8F). This suggests potential applications to protect implantable materials over a

week in the oral environment.

It has to be noticed that the film coated polymer discs are not only subjected in vivo to

saliva degradation but also to a mechanical degradation due to the rat’s chewing. This

explains why the tongue side is always more degraded than the cheek side. The mechanical

action of the rat’s teeth may be responsible for the extremely rapid degradation observed

for the native films, which were not so rapidly degraded in vitro by enzymes and by saliva.

Cross-linked films, which were barely degraded in vitro are also partially degraded in the

harsh in vivo conditions. One way to reduce the mechanical degradation would be to attach


more firmly the film to the polymer discs by creating covalent bonds between PMMA and

the film. Such a way has already been used to graft hydroxyapatite to PMMA 69. A recent

work performed in our laboratory suggests the possibility to modulate the degree of cross-

linking of the film (Rudolphe Obeid, personal communication). This indicates that the

degradation rate of the cross-linked films may be more finely tuned.

FIGURE 8 : CLSM observations of native (A, B, C) and cross-linked (D, E, F)(CHI/HA)24-CHIFITC coated slides that have been placed in vivo in rat oral cavity fordifferent time periods : after 6 hours (A,D), after two days (B, E), after three days (C, F).Image sizes are 921 x 921 µm2. Each image is the projected image of a whole z-serieacquisition.

It may also be possible to combine fully degradable polyelectrolytes, such as the

polysaccharides, with less degradable polyelectrolytes, either synthetic ones like

poly(styrene sulfonate) or polyamino acids such as poly(L-glutamic acid). It would now be


of interest to embed drugs into the multilayered assembly for further controlled release of

the drug.

CONCLUSION

We successfully demonstrated that polyelectrolyte multilayers made of chitosan and

hyaluronan can be degraded by specific enzymes present in saliva and by saliva in vitro. Film

degradability was followed by quartz crystal microbalance and observed by confocal laser

scanning microscopy after film labeling with CHIFITC. The native films were rapidly degraded

whereas the cross-linked films, which exhibits amide and ester bonds, are resistant to

degradation in vitro. The in vivo degradation of the films deposited on polymer discs and

grafted in the rat oral cavity was also very rapid for the native films. However, dissolution

was much slower for cross-linked films, for which more than 60% of the films remained on

the discs after three days presence in the mouth. These results suggest that multilayer films

made of polysaccharides are of high potential interest for oral applications, especially as drug

release systems.

Acknowledgment.

We thank L. Le Bars and C. Betscha for their technical help and B. Senger for the

quantitative QCM data analysis. We are grateful to Anne Braun for careful reading of this

manuscript and for her critical comments. This work was supported by the “Institut Français

pour la Recherche Odontologique” (IFRO) through a fellowship (2004) (CP). We also thank

J. Mutterer for the access to the CLSM platform used in this study which was co-financed by

the Région Alsace, the CNRS, the Université Louis Pasteur, and the Association pour la

Recherche sur le Cancer.


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Fonctionnalisation par la Chromofungine

5Fonctionnalisation par la Chromofungine

Biofunctionalized polyelectrolytes multilayered films presenting antifungal

activity: an in vitro and in vivo study

Etienne o. 1,2, Taddei c.2, Voegel j.c.1, Aunis d.3, Metz-boutigues m.h.3, Bolcato-Bellemin a.l.1, Egles c.1*

Article en cours pour Journal of Dental Research

Les matériaux prothétiques oraux font souvent l’objet d’une contamination de leur

surface par des microorganismes fongiques. Parmi ceux-ci, Candida albicans est impliqué

comme le principal agent pathogène responsable des candidoses orales. D’autres

champignons et bactéries côtoient cette levure et sont aussi associés dans ces pathologies

fongiques. En odontologie, la forme la plus répandue de candidose est la candidose sous-

prothétique, encore appelée stomatite sous-prothétique.

Afin de conférer à la surface de ces matériaux prothétiques des propriétés

antifongiques, nous nous sommes attachés à fonctionnaliser les films en multicouches de

polyélectrolytes par des peptides antimicrobiens à spectre antifongique. La Défensine que

nous avions utilisé préalablement ne possédait pas un spectre suffisamment intéressant,

notre choix s’est donc porté sur la Chromofungine. Ce peptide constitué de 20 acides

aminés est une fraction de la vasostatine I et correspond à la région 47-66 de la

Chromogranine A (CGA). Plusieurs autres peptides à propriétés antimicrobiennes sont


issus de la dégradation de la CGA et de la CGB, présents dans les granules de sécrétion

ainsi que dans les neutrophiles polymorphonucléaires, les milieux infectieux, les liquides

de cicatrisation et les fluides post-opératoires. La Chromofungine est le plus petit

fragment issu de la CGA à exercer une activité antifongique forte. La présence de CGA a

été démontrée dans la salive, et nos travaux en collaboration avec l’équipe de MH Metz-

Boutigues (INSERM U575) nous ont permis de confirmer sa présence dans le fluide

gingival. Ce travail fait actuellement l’objet d’investigations plus poussées afin de préciser

par microséquençage, la quantité exacte de peptide ainsi que de produits post-

traductionnels associés. Tout porte à penser que parmi ces derniers, des peptides à

propriétés antimicrobiennes existent dans ce fluide gingival destiné à la protection de cette

zone sensible qu’est le sulcus.

Figure 2-18 Prélèvement de fluide gingival par pointes de papier stériles. Dot-blots (A) aucun dépôt, (B,C)fluide gingival, (D) solution de CGA à 10 µg/ml démontrant la présence de CGA et de ses dérivés dans le

fluide gingival.

Nous avons tout d’abord confirmé la bonne insertion du peptide au sein du film à

l’aide d’une Chromofungine rhodaminée. Les observations en microscopie à fluorescence

nous ont permis de constater l’homogénéité de la distribution des peptides dans le film,

mais aussi sa cohésion au sein du film après avoir supprimé ponctuellement ce dernier par

grattage. Nous avons testé deux protocoles de construction : le premier suivant le même

principe que pour l’insertion de la Défensine et alternant polyanions-peptides-polycations

(3 temps de trempage), le deuxième après mélange préalable des peptides avec les

polyanions, alternant ensuite (polyanions/peptides)-polycations (2 temps de trempage).

Dans les deux cas nos films ont montré la présence de la Chromofungine rhodaminée,

sans toutefois pouvoir en quantifier la concentration finale dans le film. Les

concentrations minimales d’inhibition (mic) en solution de la Chromofungine envers de

nombreux microorganismes ont été publiées par Lugardon et al. (2001). Nous avons


retenu la levure C. albicans (mic à 10µm) et le champignon filamenteux Neurospora

crassa (mic à 5 µm) pour nos expérimentations. En effet, pour ces deux champignons la

forte activité de la Chromofungine nous permettait d’envisager un résultat sans toutefois

connaître précisément la concentration de peptide disponible dans le film. De plus, nous

avons testé cet effet sur des films de 24 bicouches PEI-(PSS-PAH)2-(PGA-Chf-PLL)24

puisque l’effet additif des couches avait été démontré lors de nos précédents travaux avec

la Défensine.

Afin d’évaluer le risque de cytotoxicité de telles architectures, nous avons comparé

une culture de fibroblastes sur supports recouverts de films fonctionnalisés et sur supports

recouverts de films non-fonctionnalisés. Les fibroblastes gingivaux primaires ont été

obtenus à partir d’explants issus de biopsies gingivales lors d’avulsions de troisième

molaire, avec consentement des patients. Après 6 jours de culture, le support

fonctionnalisé n’a montré aucune cytotoxicité envers les cellules, au contraire le décompte

des cellules vivantes semble démontrer une meilleure acclimatation des cellules.

La pénétration de la Chromofungine dans la membrane des champignons constitue

l’étape initiale du processus antifongique. Nous l'avons observée in vitro pour C. albicans

comme pour N. crassa. Toutefois, les essais antifongiques par microtitration n’ont permis

de montrer une différence de croissance que de l’ordre de 35%. Deux explications peuvent

être avancées pour expliquer ce résultat relatif. D’une part, la concentration de peptides au

sein du film était peut être insuffisante. D’autre part, lors de nos travaux sur

l’incorporation de la Chromofungine dans la membrane, nous avons observé que toutes les

cellules ne présentaient pas cette incorporation. Il est probable que des mécanismes plus

complexes entrent en jeu. Les derniers travaux de l’unité INSERM U-575, en microscopie

confocale en temps réel, montrent que le site de prédilection pour la pénétration de la

Chromofungine correspond au site de croissance de l'hyphe ou du filament. Il est probable

que toutes les cellules ne soient pas au même stade de croissance et que le film se "vide"

de ses composants peptidiques sur les cellules alors en phase de croissance filamenteuse.

Il apparaît donc nécessaire de mieux gérer ce mécanisme antifongique afin d’augmenter

l’effet protecteur du film. Nos prochains travaux s’intéresseront plus spécifiquement à

l’étude des champignons à la surface du film en faisant abstraction du surnageant qui

n’entre donc pas en contact avec le film. Pour cela, des tests de viabilité cellulaire seront


réalisés, sur des films d’épaisseur encore plus importante, permettant ainsi de corréler le

nombre de couches de Chromofungine et l'effet en résultant.

Enfin, une étude in vivo a été menée sur 8 rats wistar, équipés des mêmes pastilles

de polyméthacrylate de métyle développées précédemment. Avant la mise en place des

pastilles, une insémination de la muqueuse juggale par C. albicans exprimant la GFP a été

réalisée. Chaque rat a été appareillé par deux pastilles, l’une vierge, l’autre recouverte

d’un film fonctionnalisé ou non, sur chaque joue. Après 6 jours in situ, les pastilles ont été

récupérées, les animaux sacrifiés afin d’observer la muqueuse sous-jacente. Ces

observations démontrent que les pastilles fonctionnalisées sont presque exemptes de

contamination par les C. albicans et que la muqueuse sous-jacente est nettement moins

infiltrée par la candidose. De plus, les surinfections autour des points de suture muqueux

donnant lieu à une suppuration, sont pratiquement inexistantes dans le cas des pastilles

fonctionnalisées par la Chromofungine.

Cette étude de la fonctionnalisation des films en multicouche de polyélectrolytes

par un peptide antifongique est par conséquent très prometteuse. Les mêmes obstacles

qu’avec l’insertion de la Défensine, notamment sur le dosage précis de la concentration en

peptides du film, limitent encore la compréhension et la maîtrise totale du système.

Cependant, l’application topique d’un agent antifongique sans résistance connue reste une

voie de premier ordre pour la protection du matériel prothétique oral, particulièrement

chez les populations à risque augmenté tels les populations âgées, diabétiques ou

immunodéprimés.


Biofunctionalized polyelectrolytes multilayered films presenting antifungal

activity: an in vitro and in vivo study

ETIENNE O. 1,2, TADDEI C.2, VOEGEL J.C.1, AUNIS D.3, METZ-BOUTIGUES M.H.3,

BOLCATO BELLEMIN A.L.1, EGLES C.1*

1. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 595, 11, rue Humann,

67085 Strasbourg Cedex, France

2. Faculté de Chirurgie Dentaire, Université Louis Pasteur, 1, Place de l’hôpital, 67000

Strasbourg, France

3. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 575, 5, rue B. Pascal,

67084 Strasbourg Cedex, France

(*) Corresponding author: Phone: 33 (0)3 90 24 33 82; Fax: 33 (0)3 90 24 33 79

Email: [email protected]

Short title: Functionnalized multilayered films with anti-candidal activity

Keywords: Biofunctionnalization, Polyelectrolyte multilayer film, Chromofungin,

Chromogranin A, Bioactive coating


ABSTRACT

Denture stomatitis is a common oral mucosal lesion in denture weavers, in which denture base

is mainly implicated as a microbial reservoir. In order to prevent such infections several

physical and chemical modifications of the denture surface have been tested. Here, we

propose a topical antifungal coating based on the layer-by-layer technique functionalized by

insertion of an antifungal peptide, Chromofungin, inside the coating film. We show that the

peptide keeps its biological activity while immobilized in the films in vitro. The non-

cytotoxicity of such architecture, functionalized or not, is also successfully assessed by

growing of oral derived cells at its surface. Finally, the coating is tested in vivo in an oral

candidosis rat model. These results describe the functionalized multilayer films as a novel and

promising technique for local antifungal protection adapted to oral applications.


INTRODUCTION

Poly(methyl-methacrylate) polymers used for dental and oral prosthesis are known to be

quickly colonized by a bacterial and/or fungal biofilm (Lamfon et al., 2003; Radford et al.,

1999) which results in local and focal host infections (Nikawa et al., 1998). Candida albicans

is described as the main agent causing denture stomatitis. The frequency of these fungal

infections in denture weavers, diabetic and immunocompromised patients, together with an

increase of resistance to classical azole antifungal drugs (Lupetti et al., 2002a) point to the

need for a new type of protection.

Antimicrobial peptides have been proposed as a new candidate class of antimycotics (Lupetti

et al., 2002b), since they have a different mode of action and are able to regulate the host

immune defense systems. Moreover, due to their specific membrane destabilization effect,

microbial resistance is very improbable. The main limitation for using such peptides is the

way to obtain their local delivery at the interface between tissues and material surface.

Different techniques have been described to immobilize an antimicrobial peptide at the

surface of biomaterials. For instance, Haynie et al. (Haynie et al., 1995) covalently linked the

carboxy-terminal amino acid of Magainin with an ethylenediamine-modified polyamide resin.

Polyelectrolyte multilayer films (Decher, 1997) offer a new type of coating, based on the

alternate deposition of oppositely charged polyelectrolyte layers (layer-by-layer technique).

The coating is achieved simply by dipping alternatively the solid surface into the

polyelectrolyte solutions. The electrostatic forces enable the build-up process between the

charge excess (alternatively positive and negative) after each new layer deposition. To create

a bioactive coating, these films can be functionalized by insertion of biological components

during the build-up process. Many applications have already derived from this technique in a

large variety of fields such as biosensors (Caruso et al., 1997), neurobiology (Vodouhé, 2004)


or antimicrobial protection (Boulmedais et al., 2004; Etienne et al., 2004). Our aim is to

functionalize such polyelectrolytes multilayer films with an antifungal peptide. The choice of

Chromofungin for this particular application comes from the detection of this peptide in the

oral fluids, either in saliva (Kanno et al., 1999) or in gingival crevicular fluid (OE, CE,

MHMB, personal communication), demonstrating the important role of this peptide in the

natural protection of the oral cavity. Chromofungin has been characterized as the shortest

active fragment (amino-acides 47 to 66) from Chromogranin A to exert antifungal properties

in solution (Lugardon et al., 2001). The Chromofungin activity in solution is well defined,

with a minimal concentration inhibiting fungal growth of 10µM and 5µM for Candida

albicans and Neurospora crassa respectively (Metz-Boutigue et al., 2003).

In order to validate this antifungal coating, embedding of the Chromofungin inside the films

was first studied by fluorescence microscopy. Cytotoxicity of both functionalized and non-

functionalized films was tested by growing oral derived fibroblasts. Chromofungin

penetration from the film to the cells and in vitro antifungal assays were conducted on

Candida Albicans and Neurospora crassa. Finally, in vivo experiments were made to

demonstrate the antifungal activity of this coating against oral candidosis.


MATERIALS & METHODS

Multilayer preparation

Poly(ethylene-imine) (PEI; #03880, MW 750 kDa), poly(sodium 4-styrene sulfonate) (PSS;

#243051,MW 70 kDa), poly(allylamine hydrochloride) (PAH; #283223, MW 70 kDa),

poly(L-glutamic acid) (PGA; #P4886, MW 54.8 kDa) and Poly(L-lysine) (PLL; #P7890,

MW 23.4 kDa) from Sigma-Aldrich were used in solutions to build the films. All solutions

were prepared at 1 mg/mL in a 0.15M NaCl solution (pH 6.5). For all experiments, the

multilayer film was either constructed by directly filling wells with these solutions, one after

each other with NaCl 0.15M rinses between each filling, or simply by dipping specimen discs

in the different solutions. Each filling/dipping creates a monolayer coating over the previous

one, and the sequence finally creates a multilayered film. For our experiments, a precursor

sequence of PEI-(PSS-PAH)2 (noted Pre) was followed with 24 (PGA-PLL) bilayers (noted

Pre-(PGA-PLL)24), or 24 (PGA-Chromofungin-PLL) trilayers (noted Pre-(PGA-Chf-

PLL)24). The precursor sequence has been described on silica surfaces as necessary to confer

a homogeneous final coating. When the coating was achieved, wells and discs were

maintained in a hydrated NaCl 0.15M solution to avoid dehydratation.

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

Fluorescence staining was monitored with a Zeiss LSM510 Confocal microscope. Synthetic

Chromofungin labeled with rhodamine was used to image the embedding of the peptide inside

the film and the interaction of Chromofungin with fungal membranes. Rhodamine emission

was excited using the helium/neon laser 543-nm line, and the emission signal was filtered

with a Zeiss long pass 595-nm filter. Fungi were subjected to optical serial sectioning (0.2-0.3


µm) to produce image in the x-y plane. Each optical section was scanned six times to obtain

an average image.

Chromofungin embedding

Chromofungin (Chf) was kindly synthesized and provided by M.H. Metz-Boutigues in

dehydrated form, with the following sequence: RILSILRHQNLLKELQDLAL. The peptide

has a pHi of 10.8 , the protein is positively charged at our working pH (6.5) which implies to

adsorb it onto a negative layer. Two embedding protocols were tested, one by inserting the

peptide between two layers of polyelectrolytes and repeating this step n times, in this case the

architecture was: PEI-(PSS/PAH)2-(PGA-Chf-PLL)n with n=24 (Figure 1A). The other

protocol consisted by first mixed the Chromofungin (cationic) with the anionic polyelectrolyte

(PGA) in a ratio of 1 to 10 in order to keep a global negative charge after the adsorption. Later

on, this peptidized polyanion (PGA*Chf) was used in place of PGA in the construction of the

multilayer architecture described as: PEI-(PSS/PAH)2-((PGA*Chf)-PLL)n with n=24 (Figure

1B).

Antifungal assays

In order to assess that Chromofungin embedded in the film had kept its antifungal action, we

cultured two types of fungi, filamentous Neurospora Crassa (CBS 327-54) and yeast Candida

Albicans (gift of Dr. M.H. Metz-Boutigues), at the surface of functionalized films. Both were

grown aerobically at 37°C in a Sabouraud liquid medium (BD Difco, #210986). They were

harvested at mid-exponential growth phase and diluted to an optical density at 600nm

(OD600) of 0.001 in their respective medium. Experiments were done in 96 well plates

(Sarstedt, #83-1835, USA) in which polyelectrolytes multilayer films had been constructed by

alternate depositions, in order to coat the inner surface of the wells. Control and test wells


were filled with 100 µL of fungal medium. The peripheral wells were always filled with 100

µL of respective medium in order to decrease the result uncertainties due to the strong

evaporation of these wells; they also served as control for contamination. After 6 hours of

incubation under agitation (40 r/min) at 37°C, C. albicans growth was measured using a

Metertech spectrometer Σ 960 at 600 nm. Mean of the test wells measurements was compared

to the mean of the control wells measurements. Results were expressed in % of control ±

standard deviation and a Student statistical test was done. The filamentous growth of N.

crassa was observed by optical microscopy after 18 hours incubation under the same

conditions.

Cell culture

Human gingival fibroblasts (HGF) were isolated and cultured from human biopsy (Bolcato-

Bellemin et al., 2000). Briefly, gingival biopsy was obtained during surgical removal of third

molar with informed consent of the patient. Tissues were cut into small pieces and cultured in

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, #31331-028, GIBCO) containing 10% fetal

calf serum (FCS), 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin (Invitrogen) at 37°C in a

humidified atmosphere of 95%air/5%CO2. After 4-8 days, fibroblasts began to outgrow from

the explant. When the primary culture reached near confluence, cells were trypsinized and

subcultured in the medium at a ratio 1:3. Cell cultures between 3 to 5 passages were used in

this study. 2.104 cells were deposed onto the polyelectrolyte multilayer. After 5 days, the cells

were washed with DMEM without serum, trypsinized, stained with trypan blue (Invitrogen)

and counted. Measurements were done over three cultures by counting at least 15 areas in

each culture. Standard deviation and Student T-test were done.


Polymer specimen discs preparation and in vivo studies

A 3 mm diameter cylinder made of poly(methyl-methacrylate) (PMMA) (Probase,

IVOCLAR, Liechtenstein) was obtained using the lost-wax technique and heat-cured

following a classical laboratory denture preparation. Specimen discs (1 mm thickness) were

sliced from this cylinder and were perforated by 2 holes, in their center, to enable suture. This

suture ensures a strong contact between the disc and the dental tissues in order to mimic

denture base conditions. Specimen discs were used as-is, not polished. The multilayer films

were constructed using a dipping robot (DR3, Kirstein GmbH, Germany) to ensure a coating

of the whole surface of the discs. Specimen discs were either coated with a non-functionalized

film (Pre-(PGA-PLL)24) or with a functionalized film (Pre-(PGA-Chf-PLL)24) and sutured

to the center of the rat’s cheek. This location was chosen to avoid contacts with teeth. Studies

were conducted on 8 males wistar rats, aged of 3 month. An oral candidosis model was

obtained by spreading 1 OD600 GFP-expressing Candida albicans (strain GFP-CA14,

(Alarco et al., 2004)) along the rat cheeks. Two discs were immediately sutured after

spreading, one on each cheek. The discs were kept for 6 days in the rat mouth and then

retrieved. The animals were sacrificed, and mucosa underlying discs was clinically examined

and observed. All observations were done under epifluorescent illumination (excitation filter,

480/40 nm; dichroic filter, 505 nm; and emission filter, 510 nm) with a Leica MZFLIII

stereomicroscope. All studies were conducted following the highest principles of animal

welfare, according to French ethics committee recommendations.


RESULTS

Embedding of Chromofungin in the polyelectrolyte multilayer films

No differences could be observed between the functionalized films according to their

construction protocol. The whole surface appears with red fluorescence and scratching the

film enables to confirm the embedding as no fluorescence is observed in the scratched cross

(Figure 1C and 1D). The second embedding protocol using a peptidized polyanion

(PGA*Chf) is of great interest as it limits construction time.

Figure 1: Construction and functionalization of the polyelectrolyte multilayer films.(A,B) Scheme of the construction of the polyelectrolyte multilayer film, based on the alternate deposition ofpolyanions (grey), polycations (black), and Chromofungin (black balls). Adsorption of the peptide is obtainedeither on a layer of the opposite charge (A) or by mixing first the peptide and the polyanion (B). The peptide isthen embedded under another polyelectrolyte layer. (C,D) Both construction protocols allow a stable insertion of

A

C D

Charged surface

Cationic deposition

Anionic deposition

nx3Peptide deposition

Charged surface

Cationic deposition

Anionic deposition

nx2

(Anionic + Peptide)deposition

B


rhodamin-labeled Chromofungin in the architecture (C). Removing of the multilayer by scratching demonstratethat the presence of Chromofungin is restrained to the polyelectrolyte multilayer film (D).

Antifungal activity of Chromofungin embedded in the film

For both strains, we first tested if Chromofungin was able to cover fungi growing at the

surface of the film. After 30 minutes of culture at the surface of polyelectrolytes multilayer

films containing rhodamine-labeled Chromofungin, C. albicans were detected completely

stained in CLSM observations (Figure 2A, 2B and 2C) demonstrating that Chromofungin was

able to transfer from the film to the surface membrane of the fungi. Microplate assays

confirmed that Chromofungin kept its antimicrobial activity while inserted in the

polyelectrolyte multilayer films, reducing the number of Candida Albicans by 35%±5,02%

(Figure 2D) and inhibiting the growth of Neurospora Crassa at the surface of functionalized

polyelectrolytes multilayer films (Figure 2E and F).

Figure 2: Antifungal activity of Chromofungin embedded in the polyelectrolytes multilayer films.CLSM observation of Candida Albicans (A,C) and Neurospora crassa (B) after two hours of culture at thesurface of functionalized polyelectrolytes multilayer films constructed with rhodamin-labeled Chromofungin.For both strains, the cells are covered with the fluorescent peptide demonstrating the ability of the peptide totransfer from the film to the membrane of the fungus. (D) Antifungal assays for Candida Albicans. Results areexpressed in % of control ± SD. The functionalized films showed a high capacity of reducing candidal growth by35%±5,02% (***: p > 0.001). (E,F) Optical microscopy observation of Neurospora Crassa cultured at the surface

C D

A B

E F

0

20

40

60

80

100

120

Control Chfg


of non-functionalized (E) or Chromofungin-functionalized polyelectrolyte multilayer films (F). TheChromofungin embedded in the film keeps its activity and inhibit the growth of the filamentous fungus.

Cytotoxicity of functionalized multilayer films

No differences could be detected between the two supports by counting the number of dead

cells (Figure 3A), the number of living cells was higher on the functionalized polyelectrolytes

multilayer films (Figure 3B), and no differences could be observed comparing the overall

morphology of the cultured cells (Figure 3C and D). Our results do not allow us to detect any

potential cytotoxicity of the functionalized polyelectrolytes multilayer opposed to non-

functionnalized.

Figure 3: Cytotoxicity of the functionalized multilayered films.(A) Counting of the number of dead human gingival fibroblasts at the contact of polyelectrolyte multilayer filmsor Chromofungin-functionalized polyelectrolyte multilayer films. (B) Counting of living cells on both surfaces.(C,D) Human gingival fibroblasts morphology after 6 days in culture at the surface of polyelectrolyte multilayer

0

1

2

3

4

5

Non-functionalized Functionalized

X104 c

ells

/mL

0

1

2

3

4

5

Non-functionalized Functionalized

X104 c

ells

/mL

A B

C D


films (C) or Chromofungin-functionalized polyelectrolyte multilayer films (D). In both cases the cells exhibitmany points of adherence and a normal cell body morphology.

In vivo observations

All control specimen discs retrieved were covered by C. albicans on the cheek side. Cheek

side surface of discs covered with non-functionalized films showed in 3 cases out of 4 a

diffuse covering of a candidal layer as demonstrated by a green staining of the surface. In 2 of

these 3 specimens, a more intense candidal proliferation was noticeable. None of this staining

could be detected at the surface of discs covered with Chromofungin functionalized films

(Table 1). Discs covered with non-functionalized polyelectrolyte multilayer film were

associated with an increase in the pus collection at the suture area and with an increase in the

candidosis on the mucosal layer demonstrating the good infectious protection offered by the

chromofungin-functionalized polyelectrolyte multilayer films (Table 1).

As-is Non functionnalized Functionnalized

Disc surface ++ ++++ -

Mucosa candidosis ++ ++++ +

Pus collection ++++ +++ +

Table 1: In vivo experiments in rat oral cavity.Discs made of poly(methyl-methacrylate are coated with polyelectrolyte multilayer films PEI-(PSS/PAH)2-(PGA/PLL)24 or with chromofungin-functionalized polyelectrolyte multilayer films (PEI-(PSS/PAH)2-(PGA-Chf-PLL)24) were sutured to the rat’s cheek. Observations of the cheek side of the discs by fluorescentmicroscope after 6 days in situ in the rat mouth, showed that functionalized film surface presented almost notrace of GFP-expressing Candida Albicans while non-functionalized surfaces begin to be colonized by the fungi.Discs covered with non-functionalized polyelectrolyte multilayer film were also associated with an increase inpus collections at the suture level and of an increase in the candidosis on the mucosal layer.


DISCUSSION

The aim of this study was to investigate the possible antifungal protection offered by

polyelectrolytes multilayer films functionalized with antimicrobial peptides from the innate

immunity system, onto oral medical devices.

Antimicrobial protection for medical devices can be achieved by various approaches. One

consists in preventing or reducing the bacterial adhesion at the material surface. This

approach was tested with various physical modifications (Wang et al., 1995) or monolayer

surface coatings (Huang et al., 2001). It was also assessed with the polyelectrolytes multilayer

film coating using PLL or PGA grafted to poly(ethylene glycol) (PEG) and inserted several

times in the film (Boulmedais et al., 2004; Kenausis et al., 2000). These experiments showed

that PEG containing films are able to reduce significantly bacterial adhesion. However, the

anti-adhesion properties of such films are not specific against microbial agents since such

surfaces exhibit also protein and cell repellent properties. Another way, developed in this

article, is to protect devices by attempting to “kill” microorganisms once they have adhered

on the protected surface. It has been shown previously that coatings by polyelectrolytes

multilayer films were stable in the oral environment and were able to cover most of the

polymers used for oral medical devices (Etienne et al., 2004). In order to confer bioactivity to

these films, embedding of specific bioactive components must be achieved. Here, we have

tested a specific bioactivity which is an antifungal protection of denture base conferred by an

antimicrobial peptide.

As antimicrobial peptides have been described with potential cytotoxicity at high

concentration (Pacor et al., 2002), it encourages rather topical application than general

injection. Here, we demonstrated the non-cytotoxicity of Chromofungin functionalized films.

The observation that gingival fibroblasts grow better on functionalized films may come from


an increase in the rigidity of the polyelectrolytes multilayer films after the adsorption of the

peptides. As demonstrated before (Richert et al., 2004) this rigidity favors adhesion and

growth at the surface of the films.

Embedding of the Chromofungin was successfully demonstrated by fluorescence microscopy

observations. However, no quantitative data on the final concentration of embedded

Chromofungin could be measured with classical used techniques such as Quartz Crystal

Microbalance or Optical Waveguide Laser Spectroscopy. Due to low molecular weight of the

peptide, no signals could be recorded. Therefore, the moderate activity of Chromofungin

functionalized films measured for Candida Albicans by microplate assays could be explained

either by the fact that only the surface of the multilayer exerts an antimicrobial activity or by a

low concentration of peptide in the film. In both case, the film surface cannot kill the totality

of Candida in the culture medium. We recently described the immobilization of an

antibacterial peptide, the Defensin from Anopheles gambiae, onto a planar substrate by

embedding it in multilayered films (Etienne et al., 2004). This bioactive coating was able to

decrease bacterial growth from more than 92%. Taken together, these results conclude that

activity of the functionalized films relies totally on the concentration, the activity and

spectrum of the inserted peptide. Increasing the number of Chromofungin layer, as well as

testing new kind of antifungal peptides from the innate immune system could lead to a higher

activity.

Biofunctionalized polyelectrolytes multilayer films containing antimicrobial peptides seem

therefore an extremely promising method to achieve bioactive coatings of great interest for

biomaterials in general and dental applications in particular, especially as a possible

prevention of oral fungal infections.


ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank Jerome Mutterer (IBMP, Strasbourg) for the access to the CSLM, and Dr

Metz-boutigues’s team for technical help with the Neurospora Crassa culture.

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Conclusion et perspectives

CONCLUSION ET

PERSPECTIVES



Le but de ce travail était de mettre au point une interface antimicrobienne, à partir

d’une technique de recouvrement de surface originale : les films en multicouche de

polyélectrolytes. L’étude de ces films est en effet le principal thème de recherche du

laboratoire INSERM U595 dans lequel ce travail a été réalisé. Les résultats obtenus ont

permis de valider à la fois la structure physico-chimique des films que nous avons

fonctionnalisés et leur effet antimicrobien.

Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la mise au point d’une

structure limitant l’adhésion bactérienne. Le poly(éthylène glycol) (PEG), de par ses

propriétés physico-chimiques, nous a paru être le candidat le plus adapté à la technique

des multicouches. En effet, ce polymère avait déjà démontré ses propriétés anti-adhésives

vis-à-vis des bactéries sur des recouvrements de surface en monocouche, par adsorption

spontanée. La construction de films multicouche par l’alternance d’un polyélectrolyte

couplé au PEG (PGApeg) et d’un polyélectrolyte de charge opposée non couplé (PLL)

s’est avérée concluante. L’adhésion d’E. coli à une surface de verre recouverte d’un film

fonctionnalisé (PEI-(PGA/PLL)2-PGA-(PLL-PGApeg)) a été diminuée de plus de 70%

par rapport aux surfaces nues. La multiplication des couches actives sous la forme de trois

bicouches terminales PLL/PGApeg a confirmé l’intérêt de la technologie des

multicouches puisque la réduction d’adhésion a alors atteint plus de 90%.

De telles surfaces sont particulièrement intéressantes dans l’optique d’une

protection antimicrobienne de matériel temporairement implanté, comme les cathéters.

Cependant, ce système présente l’inconvénient d’empêcher tout type d’adhésion, il est

totalement non spécifique en l’état actuel. Il ne convient donc pas à des matériels destinés

à être implantés de façon durable dans l’organisme et nécessitant par là-même une

adhésion protéique et cellulaire assurant leur intégration dans les tissus environnants.

C’est pourquoi, dans un deuxième temps, nous nous sommes attachés à améliorer

cette interface afin de la rendre spécifiquement antimicrobienne. Pour cela, nous nous

sommes intéressés aux possibilités d’incorporation d’un agent antimicrobien au sein du


film. Les critères de sélection d’un tel agent étaient liés à sa taille, à son spectre d’activité,

à sa toxicité éventuelle et à son mode d’action. Face aux risques d’engendrer une

résistance bactérienne en insérant une molécule antibiotique, nous avons envisagé

l’utilisation de peptides antimicrobiens. Leur mode d’action principalement lié à une

déstabilisation de la membrane microbienne, leur poids moléculaire minime (4-5 kDa)

ainsi que leur spectre large en faisaient des candidats idéaux. Parmi tous les peptides

antimicrobiens déjà découverts, la Défensine d’insecte s’est révélée non toxique, son

spectre est large et sa concentration minimale inhibitrice bien connue en solution. La

société Entomed SA, spécialisée dans l’application médicale des peptides antimicrobiens,

nous a gracieusement fourni une Défensine isolée initialement chez le moustique

Anopheles gambiae.

La première interrogation concernait l’insertion de ce peptide au sein du film. Sa

charge cationique au pH de travail étant beaucoup plus faible que celle des

polyélectrolytes utilisés, son adsorption et plus encore sa désorption pouvaient être

redoutées. Nous avons tenté de mesurer cette adsorption à l’aide de la spectroscopie

optique par guide d’onde sans succès, sa taille étant manifestement en dessous du seuil de

détection de cette méthode. Néanmoins, les mesures en microbalance à cristal de quartz et

l’analyse du potentiel de charge de surface, ont permis d’enregistrer un signal, confirmant

l’adsorption du peptide lors de la construction du film. Aucune de ces méthodes n’a été en

mesure de fournir la quantité précise de peptide adsorbée et donc insérée dans le film, ni

d’affirmer qu’aucune désorption n’avait eu lieu.

Ce sont des preuves indirectes, données par les résultats biologiques, qui ont

permis de confirmer la présence du peptide au sein du film. En effet, lors de nos tests sur

deux souches bactériennes E. coli D22 et M. luteus, nous avons obtenu une inhibition de

croissance significative sur ces films fonctionnalisés par rapport aux mêmes films non

fonctionnalisés et aux surfaces nues.

Cependant, l’effet antimicrobien n’a été observé que pour les films dont la couche

finale était cationique. Nous avons donc étudié les rapports à l’interface entre les bactéries

et les films de charge de surface différente. Le comportement des bactéries s’est révélé

radicalement opposé, puisqu’elles présentaient des contacts intimes avec les films

cationiques et au contraire restaient distantes de la surface des films anioniques. Cette

interaction, principalement liée aux forces électrostatiques en présence (membrane

bactérienne de charge négative), peut expliquer les résultats biologiques obtenus. En effet,


contrairement aux films anioniques, les films cationiques autorisent une surface

d’interaction maximale entre la membrane bactérienne et les peptides insérés dans le film,

favorisant l’action de ces derniers.

De plus, ces observations démontrent qu’aucun relargage du peptide dans le milieu

ne s’est produit, puisqu’aucun effet inhibiteur n’a été mesuré dans le cas des films

fonctionnalisés anioniques.

La concentration du peptide dans la solution déposée lors de la construction du

film n’a aucunement influencé l’effet antimicrobien, suggérant un phénomène de

saturation lors de l’adsorption. En revanche, les films composés de dix couches

(PGA/Défensine/PLL) ont montré une inhibition de croissance quasi-totale, confirmant à

nouveau le potentiel de la technique des multicouches.

L’application biomédicale de tels recouvrements de surface suppose une mise en

contact avec différents tissus, fluides et cellules environnants. Dans le souci de valider

notre concept, nous nous sommes concentrés sur la protection de matériaux largement

répandus dans le matériel médical et odontologique, le polyméthacrylate de méthyle et le

polyvinyl siloxane (silicone). Ces deux matériaux sont connus pour être colonisés

rapidement par un biofilm et constituer alors de véritables réservoirs microbiens. En

odontologie, la pathologie la plus fréquente liée à l’usage de ces matériaux est la

candidose sous-prothétique. Sa prévalence chez les personnes appareillées par des

prothèses amovibles est importante, plus particulièrement lorsqu’un terrain favorable

préexiste comme le diabète ou l’immunodépression.

Nous avons testé avec succès l’application de la technique des multicouches au

recouvrement de telles surfaces, qu’elles soient polies ou non polies. Nous avons ensuite

étudié le comportement des films en multicouche face au milieu salivaire dans lequel ils

sont utilisés. Pour cela, des études in vitro ont tout d’abord permis de confirmer la stabilité

du film jusqu’à 12 jours en milieu salivaire naturel renouvelé, à 37°C. Des études in vivo

complémentaires, menées sur le rat, ont permis de constater après 4 jours in situ, la

stabilité du film sur la face prothétique en contact avec la muqueuse et sa relative

dégradation sur la face linguale.

Il peut être conclu de ces études que la salive n’engendre pas une dégradation

importante du film (PGA/PLL) mais que celle-ci est plutôt dépendante de l’action

mécanique des frottements. Or, ces frottements concernent essentiellement la face externe


des prothèses dentaires qui est soumise à de multiples appuis linguaux pendant les

déglutitions quotidiennes. Au contraire, l’intrados est isolé de cet auto-nettoyage, ce qui

favorise la prolifération bactérienne et candidosique, et justifie pleinement la protection

antimicrobienne que le film est capable d’assurer sur cette face. L’amélioration de la

cohésion du film à la surface du matériau, de même que sa cohésion intrinsèque doivent

faire l’objet de futurs travaux afin d’allonger la durée de stabilité du film dans la cavité

orale. La durée idéale est difficile à estimer, mais un renouvellement hebdomadaire serait

déjà une intéressante proposition clinique.

A ce type de films PGA/PLL particulièrement résistants à la dégradation salivaire,

correspond une notion de maintien d’activité dans le temps. L’élaboration de films

biodégradables dans la salive répond à une autre voie de fonctionnalisation permettant le

relargage, contrôlé dans le temps, de molécules actives. Deux polysaccharides naturels, le

chitosan et l’acide hyaluronique, connus pour leurs propriétés antimicrobiennes, ont été

utilisés comme éléments de base de l’auto-assemblage en multicouche. La construction du

film a été validée, ainsi que sa biodégradabilité. La réticulation chimique du film CHI/HA

a permis de modifier la stabilité du film face à un environnement salivaire in vitro et in

vivo. Le contrôle de cette propriété est particulièrement intéressant pour la délivrance

localisée et contrôlée de principes actifs au niveau de la zone d’implantation. Toutefois, le

procédé de réticulation chimique utilisé pourrait dénaturer les molécules internalisées.

Ceci reste à vérifier sur quelques molécules tests, mais pourrait limiter les possibilités de

fonctionnalisation de ces films multicouches biodégradables. L’optimisation de différents

paramètres de réticulation (temps, température, concentration) voire l’utilisation d’autres

agents de réticulation, devraient permettre de moduler précisément les propriétés des films

(vitesse de dégradation, propriétés mécaniques…) mais aussi de préserver l’activité

biologique des principes actifs insérés dans les films.

Enfin, après avoir validé la stabilité du film en multicouche de polyélectrolytes

dans la cavité orale, nous nous sommes attachés à le fonctionnaliser spécifiquement face à

l’infection fongique. Pour cela, le peptide antimicrobien retenu a été la Chromofungine,

peptide à forte activité antifongique. Nous avons tout d’abord confirmé la présence du

peptide au sein du film PGA/PLL en microscopie à fluorescence, en utilisant une

Chromofungine rhodaminée. Cette même Chromofungine fluorescente nous a permis

d’observer la pénétration rapide du peptide dans les souches C. albicans en culture sur le


film. Dans un deuxième temps, des cultures cellulaires, de fibroblastes humains primaires,

ont confirmé la non cytotoxicité du film fonctionnalisé par la Chromofungine.

Enfin, un modèle d’infection fongique à C. albicans sur le rat wistar nous a

permis, in vivo, de constater le potentiel protecteur de ce type de recouvrement pour des

surfaces de PMMA.

En conclusion, l’application des multicouches fonctionnalisées à la protection

antifongique des prothèses dentaires apparaît réaliste. Ce modèle infectieux a été choisi

pour son approche clinique peu invasive et sa pathologie bien caractérisée. Cependant, le

concept de protection antimicrobienne par les films en multicouche de polyélectrolytes

fonctionnalisés par des peptides antimicrobiens est destiné à des applications beaucoup

plus larges dans le domaine médical. Chaque système et chaque problématique infectieuse

étant spécifique, les approches scientifiques futures devront suivre la même démarche de

validation : sélection in vitro du ou des peptides les plus appropriés, étude de la

dégradation dans le milieu physiologique concerné (sang, urine, …) et dans les contraintes

propres à ce milieu (dynamique des fluides, acidité, processus enzymatiques, …). Enfin,

les études in vivo permettront de valider ce concept pour les différentes applications

envisagées.

Au-delà des résultats obtenus au cours de ce travail, démontrant que le concept de

films multicouches de polyélectrolytes biofonctionnalisés pouvait s’appliquer à la

protection antimicrobienne tout particulièrement dans le milieu buccal, de nombreuses

voies de recherche sont à présent ouvertes.

Au cours de mon travail, je n’ai inséré qu’une seule sorte de molécules dans les

films multicouches (PEG, Défensine ou Chromofungine) or rien techniquement de

s’oppose à l’insertion de plusieurs molécules à la fois dans les films. Cette possibilité de

multifonctionnalisation peut être utilisée de plusieurs manières :

- soit pour augmenter le spectre d’activité antimicrobien des films. Dans ce cas,

plusieurs protéines antimicrobiennes peuvent être insérées dans les films, chacune avec

une activité différente. L’addition de ces activités permettra d’obtenir un film multicouche

protégeant le matériel implanté contre tous types de microorganismes capables de

l’attaquer. La combinaison de plusieurs peptides nous rapprocherait du mécanisme

immunitaire inné, en assurant une couverture large et en offrant peu de risques de

résistance.


- soit pour moduler la fonctionnalisation de ces films. Ainsi, l’interface anti-

adhésive non spécifique des films multicouches fonctionnalisés par le PEG pourrait être

modifiée par l’ajout de motifs de reconnaissance propres à certains types cellulaires.

L’interface ainsi constituée autoriserait alors l’adhésion spécifique de certaines cellules à

la surface du matériau, tout en conservant son caractère anti-adhésif envers les micro-

organismes.

- soit enfin pour multiplier les fonctionnalités d’un même film. En effet, si notre

approche s’est concentrée sur la protection antimicrobienne, le travail d’autres équipes a

montré qu’il était possible d’insérer des protéines ayant d’autres propriétés (anti-

inflammatoires, anti-cancéreuses, mélano-stimulantes, etc.). L’insertion de plusieurs

protéines pourrait donc aboutir à des surfaces protégeant le matériel implanté contre les

attaques microbiennes mais également favorisant son insertion dans les tissus alentours ou

limitant l’inflammation induite par l’implantation.

La protection antimicrobienne concerne de nombreux types de matériaux et de

multiples applications spécifiques. Au cours de mon travail de thèse, je me suis limité à

des applications liées à l’Odontologie, afin de mettre les films multicouches de

polyélectrolytes biofonctionnalisés à l’épreuve d’un environnement physiologique très

spécifique et d’une protection antimicrobienne ciblée. Si les résultats que j’ai obtenus sont

particulièrement intéressants, ils n’en restent tout du moins que préliminaires. Des études

futures devront d’une part poursuivre ce travail afin de valider ces techniques pour des

applications humaines et d’autre part tester d’autres applications. Les résultats que j’ai

obtenus par exemple sur des résines de PMMA ou sur le silicone permettent d’envisager

un grand nombre d’applications notamment dans le domaine des lentilles de contact, des

applications orthopédiques (ciment à os), de la chirurgie esthétique (injections d’acide

hyaluronique et de billes de PMMA), des applications cardiaques (valves), orthopédiques,

ou de reconstruction (prothèses maxillo-faciales). Dans chaque cas, il faudra définir

comme je l’ai fait dans mon travail le type de polyélectrolytes le mieux adapté à la

protection (dégradable ou non), le type de protéine inséré ainsi que le suivi du matériel

après implantation.

Enfin, une autre voie de recherche réside dans le développement des films pouvant

se dégrader dans leur environnement physiologique. Comme, je l’ai montré, cette

perspective est envisageable dans le milieu buccal avec des films CHI/HA, la dégradation


de ses films semblant être ralentie par le cross-linking chimique. Ce travail se prolongera

pour rechercher les cinétiques de dégradation des différents films (non-crosslinkés et

crosslinkés de manière plus ou moins forte). De plus, il serait intéressant de savoir si cette

dégradation permet également la libération de protéines enfouies dans les films et si les

protéines ainsi libérées le sont sous forme libre ou complexée à des polyélectrolytes. Si tel

était le cas, ces systèmes dits de « release control » nous permettraient non plus de ne

protéger que l’interface des matériaux, mais également leur environnement cellulaire et

physiologique immédiat augmentant de ce fait la protection antimicrobienne apportée.

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UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR – STRASBOURG I · Ces interfaces nouvelles sont dites « bioactives ». Elles facilitent ou stimulent la réponse de l’hôte. Parmi les axes de recherche