UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI CATANIA

FACOLTA' DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI

CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE

DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE "M. La Greca"

SIMONA MALACRIA

INDAGINE SULLA INFERTILITA’ MASCHILE NEL

TERRITORIO DEL RAGUSANO DETERMINATA

DALL’IMPIEGO DI FITOFARMACI IN AGRICOLTURA

T e s i d i l a u r e a i n B i o l o g i a d e l l o S v i l u p p o

Relatrice:

CHIAR.MA PROF.SSA RENATA VISCUSO

Correlatore:

DOTT. GIOVANNI BRACCHITTA

ANNO ACCADEMICO 2004-05

UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI CATANIA

FACOLTA' DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI

CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE

DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE "M. La Greca"

INDAGINE SULLA INFERTILITA’ MASCHILE NEL

TERRITORIO DEL RAGUSANO DETERMINATA

DALL’IMPIEGO DI FITOFARMACI IN AGRICOLTURA

S i r i n g r a z i a i l C e n t r o A s t e r d i D i a g n o s i e C u r a d e l l a

S t e r i l i t à p r e s s o l a C l i n i c a d e l M e d i t e r r a n e o d i R a g u s a

n e l l e p e r s o n e d e l D o t t . G i o v a n n i B r a c c h i t t a e d e l

D o t t . N u n z i o M i n n i t i p e r l ’ o s p i t a l i t à d i m o s t r a t a e l e

i n f o r m a z i o n i r i c e v u t e

Relatrice:

CHIAR.MA PROF.SSA RENATA VISCUSO

Correlatore:

DOTT. GIOVANNI BRACCHITTA

ANNO ACCADEMICO 2004-05

Indice

Premessa …………...………………………………………. Pag. 1

Introduzione ……….………………………………………. Pag. 2

Apparato genitale femminile ……………………….. Pag. 2

Apparato genitale maschile ……………………….... Pag. 3

Ciclo vitale della cellula ………………………….… Pag. 8

La riproduzione sessuata …………………………… Pag. 11

- Ovogenesi ……………………………….……... Pag. 13

- Spermatogenesi …………………………….…. Pag. 16

- Anomalie della spermatogenesi e sterilità ……. Pag. 25

L’agricoltura nella provincia di Ragusa …………….. Pag. 28

- Intossicazioni acute da fitosanitari ……………. Pag. 31

- Intossicazioni croniche da fitosanitari ………… Pag. 35

Materiali e Metodi ………………………………………… Pag. 36

Esame del liquido seminale ………………………… Pag. 36

Tecniche di procreazione medicalmente assistita .….. Pag. 45

- Inseminazione intrauterina ………………….…. Pag. 46

- Fertilizzazione in vitro …………………………. Pag. 48

- ICSI ……………………………………….……. Pag. 49

Crioconservazione dei gameti maschili …………….. Pag. 62

- Indicazioni cliniche ……………………….……. Pag. 63

- Tecnica di congelamento ……………………….. Pag. 63

- Tecnica di scongelamento ……………….……... Pag. 66

Risultati e Discussione …………………………….………. Pag. 68

Fertilità nei serricoltori …………………….……….. Pag. 68

- Confronto dati sull’infertilità …………...……….. Pag. 70

- Gruppo di controllo ………………….…………. Pag. 71

Motilità post congelamento …………….…………... Pag. 72

Conclusione ………………………………………………… Pag. 77

Allegati ……………………………………………….…….. Pag. I

Decreto 21 febbraio 2005 …………………….…….. Pag. I

Legge 19 febbraio 2004, n. 40 ……………….……... Pag. IX

Pazienti recatisi al centro nell’anno 2004/2005 …….. Pag. XX

Gruppo di controllo ………………………………… Pag. XXV

Liquido seminale sottoposto a congelamento ………. Pag.XXVI

Premessa

Il lavoro descritto nella presente tesi è scaturito dalla

constatazione che una consistente percentuale di lavoratori serricoli, di

sesso maschile, con alterazione dei parametri standard del liquido

seminale, si sono recati al Centro Aster di Diagnosi e Cura della

Sterilità presso la Clinica del Mediterraneo in Ragusa.

Prese in considerazione le analisi del liquido seminale effettuati

presso il Centro nell’anno 2004/2005, abbiamo appurato che esiste

una riduzione della fertilità nella suddetta categoria.

A questo punto siamo andati alla ricerca di dati sull’estensione,

nella provincia di Ragusa, delle coltivazioni agricole ed in particolare

serricole, al fine di rilevare le tipologie e i quantitativi di prodotti

chimici adoperati; ciò per verificare se tali prodotti potessero avere

influenza sulla fertilità degli operatori agricoli che ne fanno un uso

diretto.

Abbiamo, inoltre, congelato il liquido seminale di pazienti

patologici e normali, per riscontrare eventuali differenze di motilità

degli spermatozoi dopo la fase di scongelamento.

Tali informazioni danno importanti indicazioni sulla più adatta

tecnica di procreazione medicalmente assistita per questa categoria di

pazienti che, oltre ad avere alterazioni del liquido seminale,

necessitano del congelamento di quest’ultimo.

Introduzione

APPARATO GENITALE FEMMINILE

L’apparato genitale femminile è un complesso di organi, che

serve da una parte alla formazione dei gameti femminili, le uova, e

dall’altra a permettere la copula, la fecondazione dell’uovo, lo

sviluppo del prodotto della fecondazione e la sua espulsione nell’atto

del parto.

Figura 1- Apparato genitale della donna

L’apparato genitale femminile consta di due componenti:

• Un organo pari, l’ovaio detto anche gonade femminile, deputato

sia alla funzione gametogenetica (produzione di cellule uovo)

sia a quella endocrina (produzione di ormoni);

• Vie genitali, rappresentate da un lungo condotto che dalle

vicinanze dell’ovaio raggiunge la superficie esterna e in cui si

possono riconoscere tre diversi tratti: le trombe o tube del

Falloppio od ovidutti (organi pari), l’utero e la vagina (organi

impari). Quest’ultima si apre in superficie a livello di una

complessa formazione cui si dà il nome di organi genitali

esterni o vulva. Ovaio, tube, utero e vagina costituiscono per

contro, gli organi genitali interni.

APPARATO GENITALE MASCHILE

L’apparato genitale maschile consta delle seguenti strutture

fondamentali: le borse scrotali; i testicoli con i relativi epididimi; le

vie spermatiche, per mezzo delle quali gli spermatozoi raggiungono

l’organo copulatore; le formazioni annesse alle gonadi e alle vie

spermatiche, e l’organo della copulazione vale a dire il pene.

Figura 2- Sezione longitudinale del bacino maschile

I testicoli o didimi rappresentano le gonadi maschili in cui ha luogo la

formazione degli spermatozoi, cioè delle cellule sessuali maschili.

I testicoli in numero di due, di forma ovoidale, sono situati al di

sotto del pene, accolti in un sacco cutaneo, la borsa scrotale, che

mantiene tale organi ad una temperatura più bassa di quella presente

all’interno della cavità addominale.

Il testicolo è diviso in numerosi setti testicolari, i quali si

approfondano nell’organo con direzione radiale.

Figura 3- Costituzione del testicolo e dell'epididimo

I setti suddividono il parenchima testicolare in circa 250-290

lobuli, di grandezza diversa fra loro e di forma conica o piramidale.

Ogni lobulo testicolare è costituito da uno o più (fino a 4)

condottini, tubuli seminiferi, chiamati anche tubuli contorti perché

avvolti su loro stessi.

I tubuli seminiferi sono circondati da tessuto connettivo in cui

sono presenti le cellule interstiziali di Leydig che sotto l’azione

dell’LH sintetizzano, partendo dal colesterolo, ormoni androgeni

(testosterone), i quali hanno come compito principale quello di

promuovere la spermatogenesi, vasi sanguigni, vasi linfatici (assai

scarsi nell’uomo) e fibre nervose.

I tubuli contorti di una loggia testicolare convergono tutti verso

un solo tubulo, breve e rettilineo, che prende il nome di tubulo retto.

I tubuli retti che fuoriescono dalle logge testicolari si aprono in

un sistema di canalicoli tra loro anastomizzati a formare la rete testis.

La parete dei tubuli seminiferi è costituita dall’epitelio

germinativo e dalla lamina propria. Quest’ultima è separata

dall’epitelio mediante una lamina basale. L’epitelio germinativo è

costituito da cellule seminali e da cellule di sostegno e poggia sulla

lamina basale.

Le cellule seminali sono situate fra le cellule di sostegno e, nel

soggetto postpubere, si trovano in differenti stati maturativi a partire

dalle cellule più periferiche e immature, gli spermatogoni, che sono in

contatto con la lamina basale, per giungere, attraverso gli spermatociti

di I ordine e gli spermatociti di II ordine, agli spermatidi, che

occupano una posizione più centrale nel tubulo. Questi ultimi si

differenziano nei veri gameti maschili: gli spermatozoi.

Le cellule di sostegno o del Sertoli sono elementi allungati e si

estendono dalla lamina basale dei tubuli seminiferi fino al loro lume,

occupando perciò tutto lo spessore dell’epitelio germinativo.

Figura 4- Sezione trasversale di un tubulo seminifero

Dalla rete testis originano 8-12 condottini efferenti che

emergono dal margine posterosuperiore del testicolo per costituire la

testa dell’epididimo.

L’epididimo è un organo allungato, contenuto insieme al

testicolo nella borsa scrotale.

Presenta un’estremità superiore ingrossata (testa), una parte

intermedia cilindroide (corpo), e una estremità inferiore assottigliata

(coda).

La coda si spinge fino al polo inferiore del testicolo, in

corrispondenza del quale si incurva indietro e in alto per continuare

nel condotto deferente.

Vie spermatiche - Il condotto deferente origina dalla coda

dell’epididimo e termina alla base della prostata. Quindi il condotto

deferente prima di raggiungere l’uretra, riceve il condotto della

vescichetta seminale e diventa condotto eiaculatore.

Le vescichette seminali sono due piccole estroflessioni che

producono un liquido che ha la funzione di diluire lo sperma.

I condotti eiaculatori avvolti in una guaina fibrosa,

costituiscono la porzione terminale delle vie spermatiche.

La prostata è un voluminoso organo costituito da due lobi

laterali. È attraversata oltre che dall’uretra, anche dai dotti eiaculatori

che vi penetrano in corrispondenza della base.

Le ghiandole bulbo-uretrali di Cowper sono due piccoli

corpiccioli, piuttosto duri, posti simmetricamente a lato della linea

mediana dell’uretra. Il loro secreto è vischioso, opalino, a reazione

alcalina.

Il pene è costituito da una parte cilindroide, il corpo, e da una

parte conoide, il glande.

La struttura principale di entrambi è di tipo vascolare, ovvero è

una rete di vasi ampiamente comunicanti tra loro in cui il volume di

sangue e la rigidità della guaina di rivestimento sono le condizioni

fondamentali per la costituzione dell'erezione.

Il corpo presenta due cilindri laterali, i corpi cavernosi, avvolti

da una guaina di tessuto fibroso poco elastico, la tonaca albuginea, e

un cilindro mediano ventrale, il corpo spongioso, in cui trova posto

l'uretra.

I corpi cavernosi sono gli elementi erettili, l'uretra è il canale

per l'emissione dell'urina, pertanto connesso alla vescica, e dello

sperma, pertanto connesso ai dotti eiaculatori che raccolgono lo

sperma dalla prostata, dalle vescicole seminali e dai testicoli.

Figura 5- Sezione longitudinale e trasversale delle strutture riproduttive nel maschio

Il glande costituisce la parte terminale del pene, utile per la sua

forma a favorire la penetrazione. La cute, con caratteri di elevata

elasticità, riveste tutto il corpo e al terzo distale (quasi al glande) si

ripiega formando il prepuzio che ricopre più o meno completamente il

glande e al cui vertice è connesso ventralmente dal frenulo o filetto.

CICLO VITALE DELLA CELLULA

La maggior parte delle cellule presenta una vita limitata nel

tempo, al termine della quale si divide in due cellule figlie che hanno

le stesse caratteristiche di quella iniziale.

Il periodo che intercorre tra una divisione e la successiva, costi-

tuisce il ciclo vitale della cellula, costituito da una regolare

successione delle fasi G1, S, G2, M.

Figura 6- Ciclo vitale di una cellula eucariotica

Come fase centrale del ciclo vitale si usa stabilire quella nella

quale la cellula duplica il proprio DNA nucleare: questa fase è detta

fase S o di sintesi.

Prima della fase S la cellula neoprodotta ha attraversato un

lungo periodo in cui ha accresciuto il citoplasma e raddoppiato il

proprio volume: questo periodo si chiama fase G1 (G sta per "gap" o

intervallo prima della fase S). La fase G1 è contraddistinta da attivi

fenomeni trascrizionali a livello del DNA e da sintesi proteiche nel

citoplasma.

Dopo la fase G2 la cellula è pronta per dividersi; entra nella

fase M (mitosi). La mitosi o divisione indiretta o cariocinesi si attua

attraverso quattro fasi: profase, metafase, anafase, telofase.

Figura 7- Mitosi in una cellula animale

Nel mondo animale le cellule che entrano in divisione mitotica

sono quelle somatiche, generalmente diploidi (2n): ciascuna di esse

produce due cellule figlie con 2n cromatidi (o cromosomi figli). Il

processo è altamente conservativo.

LA RIPRODUZIONE SESSUATA

Nella maggior parte degli animali e anche nell'uomo la

riproduzione sessuata presuppone il differenziamento di una

popolazione di cellule, detta linea germinale, i cui elementi sono

destinati a trasmettere ai discendenti le caratteristiche dell'individuo

diventando gameti. I gameti maschili sono gli spermatozoi, quelli

femminili sono le ovocellule.

I gameti dei due sessi, sono morfologicamente e funzionalmente

diversi, tuttavia essi hanno in comune una caratteristica fondamentale,

quella di essere aploidi, cioè di contenere, un numero di cromosomi

ridotto a metà (numero aploide n).

Ciò fa sì che, quando al momento della fecondazione il gamete

maschile e quello femminile si fondono, si ricostituisca nello zigote il

numero diploide (2n) di cromosomi, tipico di tutte le cellule somatiche

della specie.

Il processo durante il quale le cellule germinali riducono a metà

il loro corredo cromosomico è detto meiosi.

La divisione meiotica consta di due successive divisioni

nucleari precedute da una sola duplicazione del materiale genetico

(una sola fase S). Per questo, la quantità di DNA risulta dimezzata

nei gameti maturi.

Le due divisioni della meiosi si chiamano prima e seconda

divisione meiotica. Ognuna si può suddividere in stadi

corrispondenti a quelli tipici della mitosi: profase, metafase, anafase

e telofase.

Figura 8- Stadi della meiosi di una cellula animale

Nella gametogenesi maschile i quattro nuclei vengono

contenuti in quattro cellule distinte che si differenziano in

spermatozoi.

Nella gametogenesi femminile invece uno solo dei nuclei

diventa il nucleo dell'ovocito, gli altri vengono espulsi insieme con

una piccola quantità di citoplasma in due o tre piccole cellule

abortive che sono dette globuli polari e che restano addossate

all'ovocito. Ciò ha il significato di non suddividere il citoplasma

del1'ovocito, la cui organizzazione è di fondamentale importanza

per il successivo sviluppo dello zigote.

Le cellule progenitrici delle cellule germinali (linea germinale)

si segregano molto precocemente da quelle dalle quali deriveranno le

cellule somatiche (linea somatica).

Una volta giunte nel territorio della gonade le cellule germinali,

dopo un periodo di quiescenza più o meno lungo, iniziano il loro

differenziamento in senso maschile o femminile.

I gameti dopo che hanno iniziato il loro differenziamento

sessuale, nella donna e nell’uomo, vanno incontro a processi ben

diversi, che si chiamano, rispettivamente, ovogenesi e spermatogenesi.

OVOGENESI

Dalla 9a settimana di sviluppo embrionale poche centinaia di

cellule germinali primordiali abbandonano il sacco vitellino e si

accrescono rapidamente per mitosi durante la loro migrazione verso le

creste genitali e, continuano a proliferare, durante la colonizzazione

delle gonadi, dove iniziano a differenziarsi in ovogoni.

Dalla 12a – 13a settimana, gli ovogoni proliferanti si

localizzano nella corticale profonda dell'ovaio, iniziando il loro

differenziamento in ovociti.

Immediatamente dopo la loro differenziazione gli ovociti

primari replicano il loro DNA, entrano nella profase della prima di-

visione meiotica, aumentano di dimensione e si arrestano allo stadio di

diplotene, fase nella quale possono restare anche per 40-50 anni.

Figura 9- Ovogenesi

Gli ovogoni e gli ovociti sono circondati da uno strato di cellule

appiattite, derivate dalle cellule somatiche del blastema ovarico.

Queste cellule, proliferando attivamente e intromettendosi tra le

cellule germinali, le racchiudono, alla fine, in una rudimentale

struttura prefollicolare, contenente spesso più di una cellula germinale.

Queste cellule prefollicolari continuano a circondare le cellule

germinali che sono tutte prossime a divenire ovociti, anche quando i

ponti intercellulari sono rimossi, e avviene una frammentazione dei

gruppi di cellule.

Con questi eventi morfologici inizia la vera follicologenesi. Il

processo della follicologenesi consiste dunque in una serie di

modificazioni strutturali progressive che conducono, attraverso gli

stadi di follicolo primordiale, follicolo primario, follicolo

secondario preantrale, follicolo secondario antrale e follicolo di

Graaf, al completo sviluppo del follicolo primordiale. Ciò avviene

generalmente nei feti umani alla 18a - 20a settimane di gestazione.

Al quinto mese il numero delle cellule germinali raggiunge

circa i 6-7 milioni. Durante i successivi mesi di sviluppo prenatale

avviene un'imponente riduzione di numero, dovuta ad un meccanismo

di degenerazione o di morte per apoptosi, per cui nella donna alla

nascita, nella porzione corticale di entrambe le ovaie, sono presenti

circa 1.500.000 follicoli primordiali. Molti di essi vanno incontro a

fenomeni di atresia che rappresentano il proseguimento dei fenomeni

degenerativi iniziati, come detto precedentemente, a partire dal quinto

mese di sviluppo intrauterino. Si calcola che il numero complessivo

dei follicoli primordiali all’inizio della pubertà sia di 30.000-40.000.

SPERMATOGENESI

La spermatogenesi è un processo di proliferazione e

differenziazione di cellule staminali in spermatozoi.

Osservando la sezione di un tubulo seminifero, si nota che le

cellule della linea seminale sono raggruppate in associazioni

cellulari. Le generazioni più giovani si trovano più in basso, vicino

alla membrana basale, mentre quelle più differenziate sono situate

più in alto, in vicinanza del lume del tubulo.

La spermatogenesi nell’uomo inizia nel periodo della pubertà

e si protrae fino a un'età molto avanzata.

Il processo spermatogenetico nell’uomo, dallo spermatogonio

allo spermatozoo maturo, richiede circa 72 giorni. La

spermatogenesi si divide in tre fasi sequenziali: proliferazione degli

spermatogoni, meiosi e spermiogenesi.

Fase proliferativa

Gli spermatogoni differenziatisi dai gonociti sono indicati con

nomi diversi: gonociti di 2° tipo, prespermatogoni, spermatogoni

primitivi, spermatogoni di tipo A.

Gli spermatogoni primitivi rimangono inattivi per tutto il

periodo fetale e anche dopo la nascita, fino all'epoca della pubertà,

che nel maschio si verifica fra i 13 e i 16 anni.

In tale periodo gli spermatogoni entrano nella prima fase della

spermatogenesi, fase proliferativa, in cui gli spermatogoni primari,

che rappresentano le cellule staminali, si dividono ripetutamente per

mitosi, consentendo sia di mantenere un pool di cellule staminali, sia

di avere un rifornimento continuo di spermatogoni che, a seguito di

successive divisioni, sempre mitotiche, si avviano verso il primo passo

del processo spermatogenetico.

Gli spermatogoni secondari che derivano dalle ultime divisioni

mitotiche (spermatogoni maturi) perdono la capacità di dividersi e si

trasformeranno in spermatociti di 1 ° ordine.

Dalle mitosi degli spermatogoni primari derivano sempre

spermatogoni liberi, mentre dalle divisioni mitotiche degli

spermatogoni secondari derivano spermatogoni che restano uniti tra

loro da ponti citoplasmatici, per divisioni incomplete: ciò accade

perché alla divisione nucleare non segue quella citoplasmatica. Tale

condizione permane fino allo stadio di spermatidio ed è chiamata

sincizio.

Fra tutte le cellule germinali, gli spermatogoni risentono

maggiormente dell'influenza di fattori nocivi, come le radiazioni

ionizzanti, le malattie infettive, l'alcoolismo, un'alimentazione

inadeguata, sostante tossiche presenti nell’ambiente ecc.

Gli spermatogoni vengono classificati in tre tipi: tipo A scuro,

tipo A chiaro e tipo B.

Lo spermatogonio A di tipo scuro viene considerato cellula

staminale primitiva: da esso hanno origine gruppi di cellule staminali

che si rinnovano continuamente, perché la spermatogenesi possa

continuare indefinitamente, senza che si esaurisca il rifornimento di

spermatogoni.

Lo spermatogonio A di tipo chiaro è alquanto più

differenziato rispetto al tipo A scuro e dà origine al tipo B.

Gli spermatogoni di tipo B presentano nucleo sferico e molto

più piccolo rispetto ai precedenti tipi: esso contiene grosse zolle di

cromatina in vicinanza della membrana nucleare e inoltre un

evidente nucleolo situato al centro. Il citoplasma è scarsamente co-

lorabile e contiene un numero maggiore di organuli rispetto agli

spermatogoni di tipo A.

Figura 10- Spermatogenesi

Fase meiotica

Gli spermatociti di 1 ° ordine o primari sono da principio molto

simili agli spermatogoni di tipo B dai quali derivano. Situati in un

primo tempo in prossimità della membrana basale dell'epitelio

seminifero vengono poi spinti verso l'alto dalle divisioni degli

spermatogoni.

Lo spermatocito di 1 ° ordine è ancora una cellula con corredo

cromosomico diploide. Man mano esso si accresce e, al termine della

fase di accrescimento, subisce la prima divisione meiotica (divisione

riduzionale), originando così due spermatociti di 2° ordine, aventi

ciascuno un numero aploide di cromosomi e uniti da ponti

citoplasmatici

A sua volta, i due spermatociti di 2° ordine entrano rapidamente

in divisione (seconda divisione meiotica o divisione equazionale)

dando origine a quattro spermatidi.

Gli spermatociti di 2° ordine o secondari appaiono meno

voluminosi di quelli primari. Poiché tale stadio ha una durata molto

breve (circa 8 ore), gli spermatociti secondari sono raramente

osservabili nelle sezioni dei tubuli seminiferi.

Gli spermatidi che si sono appena formati dalla divisione

dello spermatocita secondario appaiono più piccoli di quest'ultimo e

presentano una struttura abbastanza semplice, in parte simile agli

spermatociti.

Spermiogenesi

La spermiogenesi o spermioistogenesi consiste in una lunga serie

di cambiamenti morfologici che trasformano lo spermatidio in

spermatozoo.

I fatti più salienti del processo che porta alla differenziazione

dello spermatozoo sono sostanzialmente la modificazioni del nucleo e

la comparsa di organuli altamente specializzati che consentono il

trasferimento dello spermatozoo e la fecondazione.

Il processo di spermiogenesi viene generalmente distinto in

quattro fasi: fase del Golgi, fase del cappuccio, fase dell'acrosoma e

fase di maturazione.

La fase del Golgi è caratterizzata dalla comparsa, nel complesso

del Golgi, di granuli di natura polisaccaridica. Tali granuli sono

chiamati granuli preacrosomiali e ciascuno di essi è contenuto in una

vescicola.

Man mano essi si fondono tra loro per coalescenza, dando

origine a un unico grosso granulo, il granulo acrosomiale, che si

colloca nella porzione anteriore del nucleo, addossato alla membrana

nucleare.

Durante la fase del cappuccio la vescicola acrosomiale si

accresce notevolmente e si sviluppa un cappuccio che, sempre

adagiato sulla membrana nucleare, copre i due terzi anteriori del

nucleo.

Nella fase dell'acrosoma il nucleo dello spermatidio si porta

in vicinanza della membrana cellulare, si allunga e si appiattisce,

mentre la cromatina si condensa in grossi granuli che, per coalescenza,

originano una massa densa e omogenea in cui sono presenti aree

chiare di forma e grandezza variabile chiamate vacuoli nucleari.

Nella fase di maturazione si forma il segmento di connessione

tra il flagello e il nucleo e una guaina fibrosa costituita da 9 grosse

fibre disposte longitudinalmente lungo il flagello. Quindi i mitocondri

si dispongono a spirale intorno alla porzione prossimale del flagello.

Successivamente quasi tutto il citoplasma dello spermatidio

viene eliminato sotto forma di corpo residuo e fagocitato dalle cellule

del Sertoli che, per mezzo dei loro lisosomi, lo digeriranno

completamente.

Inoltre si dissolvono anche i ponti citoplasmatici tra gli

spermatidi, mentre una piccola porzione di citoplasma contenente

gocce lipidiche segue lo spermatozoo liberato nel lume dei tubuli, per

abbandonarlo in un momento successivo.

Completamento della maturazione dello spermatozoo

I cambiamenti maturativi iniziano nelle vie genitali maschili

e si completano in quelle femminili.

Dopo il distacco dalle cellule nutrici del Sertoli, gli spermatozoi

immessi nel lume dei tubuli seminiferi, non hanno né la proprietà di

muoversi né quella di fecondare e sono contenuti nel liquido secreto

dagli elementi sertoliani.

Sempre immersi in questo primo contingente di liquido

seminale essi vengono poi spinti nei tubuli retti.

I tubuli retti sono rivestiti da cellule che, con la loro funzione

secretoria, incrementano il quantitativo di liquido che circonda gli

spermatozoi, con l'aggiunta di nuovi componenti molecolari e di

potassio, necessari perché possa iniziare il processo di maturazione.

I tubuli retti confluiscono nella rete testis. Questo sistema

lacunare rappresenta una stazione di raccolta, di sosta e di smista-

mento degli spermatozoi verso i condotti efferenti che li trasportano

poi nel canale dell'epididimo.

Per l'attività secretiva delle cellule epiteliali dell'epididimo gli

spermatozoi completano la loro maturazione, oltre a raggiungere un

alto grado di motilità, ottiene anche la capacità di fecondare a causa

della particolare composizione chimica di tale ambiente.

Emissione degli spermatozoi

Gli spermatozoi contenuti nel liquido seminale secreto

dall'epididimo imboccano successivamente il canale deferente. Alla

estremità terminale del deferente è annesso un diverticolo laterale,

la vescichetta seminale. Deferente e vescichetta seminale si

continuano con il dotto eiaculatore. Quest'ultimo, dopo avere at-

traversato il parenchima della prostata, sbocca nell'uretra prostatica.

Il meccanismo mediante il quale gli spermatozoi contenuti nel

liquido seminale vengono immessi nelle vie genitali femminili è

detto eiaculazione. Tra una eiaculazione e l'altra il liquido seminale

sosta nella vescichetta seminale.

Infine il liquido seminale si arricchisce, al momento della

eiaculazione, del secreto elaborato da due ghiandole annesse

all'apparato genitale maschile: la prostata e le ghiandole bulbo-

uretrali. La prima produce un liquido di aspetto lattescente, mentre

le seconde secernono un liquido chiaro e filante (simile a muco) che

riversano nel canale uretrale e che ha il compito di esercitare

un'azione lubrificante durante la copulazione.

I due condotti eiaculatori terminano aprendosi nell'uretra

prostatica. Nel suo ultimo tratto l'uretra percorre il pene per tutta la

sua estensione, aprendosi all'estremità del glande. Al momento

dell'accoppiamento lo sperma viene depositato nella vagina della

femmina.

Dopo che il seme è stato depositato nella vagina, in questa

sede si forma un coagulo gelatinoso, prodotto dagli enzimi

prostatici e favorito dall'ambiente acido della vagina stessa. Tale

coagulo, tuttavia, viene diluito nello spazio di un'ora appena, da un

altro enzima prodotto dalla stessa prostata sotto forma di proenzima e

da alcune ghiandole delle vie genitali femminili. Spesso, con il

coagulo, si ha la perdita di un certo numero di spermatozoi nella

vagina.

Capacitazione dello spermatozoo

Gli spermatozoi depositati in vagina vanno incontro all’ultima

tappa della maturazione: la capacitazione.

La capacitazione viene definita come il processo mediante il

quale lo spermatozoo acquisisce la capacità fecondante. Esso durante

questo periodo coincidente in vivo con l’attraversamento del muco

cervicale, subisce cambiamenti biochimici e ultrastrutturali che sono

un preludio alla reazione acrosomiale, la quale permette allo

spermatozoo il legame con la zona pellucida dell’oocita.

Reazione acrosomiale

Una volta terminata la capacitazione, gli spermatozoi sono

pronti per la reazione acrosomiale, che rappresenta un processo di

esocitosi con fusioni localizzate tra la membrana acrosomiale esterna

e la membrana plasmatica dello spermatozoo con formazione di

vescicole.

Il primo spermatozoo che raggiunge l’ovulo trova rapidamente i

recettori leganti lo spermatozoo presenti sulla membrana e fonde la

sua membrana con quella dell’ovocita. La zona fusa della membrana

si apre e il nucleo dello spermatozoo penetra nel citoplasma

dell’ovulo.

Figura 11- La fecondazione

Un altro processo innescato dalla fusione ovulo spermatozoo è

la reazione corticale. Questa reazione chimica è finalizzata ad

impedire la polispermia, cioè la fecondazione da parte di più di uno

spermatozoo.

Strutture definite granuli corticali, legati al versante interno

della membrana dell’ovulo, rilasciano il loro contenuto all’esterno

della membrana dell’ovocita.

Queste sostanze chimiche modificano la membrana e la zona

pellucida circostante in modo da impedire la penetrazione o il legame

di altri spermatozoi.

Quando l’ovulo è stato fecondato e diventa uno zigote, inizia la

divisione mitotica, mentre si avvicina lentamente all’utero, dove si

impianta per tutto il periodo della gestazione.

ANOMALIE DELLLA SPERMATOGENESI E STERILITA’

I difetti della maturazione dei gameti quindi della

spermatogenesi sono le cause più frequenti d’infertilità maschile.

Concentrazione, vitalità, morfologia e motilità degli

spermatozoi sono i parametri più specifici che ci consentono di

classificare i seguenti quadri clinici:

• Normospermia;

• Azoospermia: completa assenza di spermatozoi nel

liquido seminale;

• Oligozoospermia: riduzione del numero di spermatozoi

(<20mil/ml);

• Teratozoospermia: alterazione di forma degli spermatozoi

(>30%);

• Astenozoospermia: alterazione della motilità degli

spermatozoi (<50% a+b);

• Oligoastenoteratozoospermia: associazione dei quadri

sopra descritti.

L’uomo è forse l’unico tra i mammiferi che presenti un elevato

grado di eterogeneità tra i suoi gameti, quindi lievi anomalie si

presentano anche in un uomo fertile.

Secondo una prima definizione la sterilità, almeno nella donna,

andrebbe distinta dall’infertilità, intesa come incapacità di condurre la

gravidanza fino all’epoca di vitalità fetale. Nell’uomo, invece, essendo

il concetto di aborto ovviamente estraneo alla patologia della

riproduzione, i due termini sono largamente utilizzati come sinonimi.

Secondo un’altra definizione, una coppia è considerata infertile

quando non è stata in grado di concepire e di procreare un bambino

dopo un anno o più di rapporti sessuali non protetti, mentre è sterile la

coppia nella quale uno o entrambi i coniugi sono affetti da una

condizione fisica permanente che non rende possibile la procreazione.

Secondo questa interpretazione il termine “sterilità” si riferisce,

quindi, ad una condizione più grave e comunque assoluta di

“infertilità” riguardante la coppia e non il singolo membro di essa.

Ai fini della presente trattazione i due termini, infertilità e

sterilità, saranno usati come sinonimi.

Tutte le coppie che non ottengono gravidanza nei termini sopra

definiti costituiscono la popolazione delle coppie infertili. I dati

relativi all’incidenza ed alle principali cause di sterilità sono simili a

livello mondiale.

Non esiste alcuno standard di riferimento nella misurazione

dell’infertilità. In Italia si calcola oggi che ogni anno 60000-80000

nuove coppie si trovino a dover affrontare problematiche di infertilità,

il che rappresenta il 20-25% delle 300000 nuove unioni.

Nella nostra società motivazioni molteplici di ordine sociale,

economico e culturale portano molte donne a rinviare oltre la terza

decade di vita la ricerca di un concepimento.

Dagli ultimi dati relativi alla natalità in Europa, infatti, emerge

che l’età media in cui la donna italiana partorisce il primo figlio è 30

anni, dato aumentato rispetto al precedente rilievo del 1990 dove

risultava essere di 29 anni.

E’ interessante rilevare come da uno studio eseguito presso il

Laboratorio del Centro di Andrologia di Pisa, confrontando i valori

medi riscontrati negli esami odierni con quelli eseguiti venti anni

orsono, sia stato rilevato un marcato decremento sia a carico della

concentrazione sia della motilità e della morfologia spermatica.

Non è, però, solamente il trascorrere degli anni che comporta la

riduzione della capacità riproduttiva, che stiamo osservando, ma è

anche l’influenza combinata di molti fattori esterni, presenti nel

mondo che ci circonda.

L’aumento dell’infertilità maschile è imputabile, infatti, a tutto

un insieme di cause, prima tra tutte quella ambientale, intendendo per

ambientali sia quei fattori legati all’inquinamento dell’ambiente in cui

viviamo oggigiorno, sia alle mutate abitudini di vita, alle quali la

società odierna ci costringe.

In particolare si è studiata e si continua a studiare l’esposizione

a sostanze tossiche sia prima della nascita, nel ventre materno, sia

dopo la nascita. Sotto accusa sono sostanze molto diverse come

fitofarmaci agricoli, policlorobifenili, certi detergenti e altre ancora.

Infine, è innegabile che stiamo assistendo ad una recrudescenza

di molte forme di patologia dell’apparato riproduttivo maschile, in

primo luogo di quelle flogistiche-infettive legate alle mutate abitudini

sessuali di oggi.

In Italia ogni anno 500000 coppie chiedono un consulto per

infertilità e il fenomeno sembra inoltre in aumento.

L’AGRICOLTURA NELLA PROVINCIA DI RAGUSA

Il comparto ortoflorovivaistico rappresenta la voce più

importante per lo sviluppo economico e sociale della provincia di

Ragusa, una provincia di soli 12 comuni accomunati da una spiccata

vocazione per le produzioni legate al settore agricolo che sempre più

spesso si evolvono in veri e propri distretti di eccellenza, tanto è vero

che la provincia di Ragusa rappresenta l’area territoriale d’Italia con la

più alta concentrazione di serre.

Per fare qualche considerazione sulla dimensione, in termini

economici e occupazionali, del comparto agricolo della provincia di

Ragusa possiamo notare che in termini percentuali mentre la

popolazione della provincia di Ragusa costituisce solo il 6%

dell’intera popolazione siciliana (303.000 Ab.), di contro la sua

produzione agricola lorda vendibile rappresenta più del 20% di quella

regionale, con 10186 aziende agricole che occupano 18.000 lavoratori

agricoli e 12000 lavoratori serricoli.

La coltivazione in serra è stata introdotta in Sicilia intorno agli

anni ’50. Già da allora le colture protette si sono localizzate

soprattutto lungo il litorale mediterraneo ed in particolare in provincia

di Ragusa dove negli ultimi anni hanno raggiunto un alto grado di

innovazione tecnologica.

In provincia di Ragusa sono presenti il 56% degli impianti

terricoli siciliani, mentre il 20% si trovano nel siracusano, il 12% in

provincia di Caltanissetta e l’8% in provincia di Trapani.

PROVINCIA DI RAGUSA

Estensione territoriale Kmq 1.614

Popolazione generale Ab. 303.000

Superficie coltivata a serre Ha 8.000

Popolazione lavorativa agricola stimata N° 18.000

Popolazione lavorativa in sericoltura N° 12.000

Aziende agricole N° 10.186

Consumo medio di antiparassitari t. 6000/anno

Per tali coltivazioni nel ragusano c’è un elevato consumo di

antiparassitari pari a 6000 t/anno.

PRODOTTI FITOSANITARI DI MAGGIORE USO

AGRICOLO NEL RAGUSANO

Nome commerciale

Principio attivo Utilizzo Classificazione

Rubrum Acidi naftilenici Fitoregolatore Nocivo

Giberellina Acido giberellinico Fitoregolatore Nocivo

Galben Benalaxil Fungicida Non classificato

Furacon Benfuracarb Insetticida Non classificato

Applaud Buprofezin Regolatore di crescita Irritante

Aldicarb Carbaryl Insetticida Tossico

Bavistin Carbendazim Fungicida Tossico/nocivo

Benzim Carbendazim Antibotritici Tossico

Mocap Chloprophos Nematocida/insetticida Tossico/nocivo

Dursban Chlorpyrifos Insetticida Tossico

Geodinfos Chlorpyrifos Insetticida Tossico

Lorsban Chlorpyrifos Insetticida Tossico

Dormex Cianammide Fitoregolatore Nocivo

Curzate Cymoxanil Anticrittogamico Nocivo

Vitene Cymoxanil Fungicida Tossico

Vitex Cymoxanil Fungicida Tossico

Euparen Dichlofluamid Fungicida Irritante

Telone Dichloropropene Fumigante Tossico

Sclerosan Diclogan Fungicida Irritante

Dinocol PB Dinocap Antioidico Irritante

Fenocap 25 Dinocap Antioidico Irritante

Rumitane PB Dinocap Antioidico Irritante

Seccatutto Paraquat dicloruro Diserbante Nocivo

Thiodan Endosulfan Insetticida Tossico

Nemacur Fenamiphos Nematocida Nocivo

Glifosan Glyphosate Erbicida Non classificato

Agrocillina Idrossichinolina -

solfato Fungicida Nocivo

Confidor Imidacloprid Insetticida Nocivo

Match Lufenuron Insetticida Irritante

Ridomil Metalaxil-rameici Fungicida Nocivo

Fumarate Metam-sodium

anidro Fumigante Nocivo

Vapam Metam-sodium

anidro Fumigante Nocivo

Carakol Methaldehyde Molluschicida Non classificato

Tamifun Methamidophos Insetticida/caricida Tossico

Mesurol Methiocarb Acaricida/insetticida Tossico

Metham Methomyl Insetticida Molto tossico

Agrolene Methomyl Insetticida Molto tossico

Lannate Methomyl Insetticida Molto tossico

Systane Miclobutanil Antioidico Irritante

Vydate Oxamil Insetticida/nematocida Tossico

Topas Penconazolo Fungicida Nocivo

Cereweed Pendimethalin Erbicida Nocivo

Fitocarb Propamocarb

hidroclorito Fungicida Irritante

Acarion Propargite Acaricida Tossico

Bayfidan Triadimenol Fungicida Nocivo

Tiovit Zolfo Fungicida Poco tossico

I principi attivi in grassetto sono quelli più frequentemente associati alle

intossicazioni acute e croniche da prodotti fitosanitari di uso agricolo

INTOSSICAZIONI ACUTE DA FITOSANITARI

Dal momento che, nell’area del ragusano oltre l’elevato

consumo di antiparassitari, c’è una considerevole manovalanza a

basso livello culturale rappresentata dai lavoratori extracomunitari che

ormai rappresenta il 30% della manodopera attiva e la tipologia

prevalente delle aziende è di piccola dimensione e a conduzione

familiare, l’area è stata scelta come territorio ideale per portare avanti

un progetto pilota per la rilevazioni delle intossicazioni acute da

antiparassitari al fine di programmare delle iniziative di prevenzione e

di tutela mirate.

Il principale problema emerso in tale iniziativa è stato ed è

tuttora il flusso informativo sui singoli eventi. Di fatto, esiste una

procedura di segnalazione dei casi, in ottemperanza alla legge

638/1975, all’ufficiale sanitario e da questi al medico provinciale e

successivamente al ministero della salute. In realtà tale obbligo, in

passato, è stato largamente disatteso.

Nell’ambito dei piani triennali di controllo delle vendite, del

consumo e dell’uso di fitofarmaci, nel corso del 2004, la Regione

Siciliana ha avviato un piano di rilevazione dei casi di intossicazione

acuta da antiparassitari statuito dalla Circolare Assessoriale n° 1142

del 23/06/04 e che vede la collaborazione dei P.S., delle Direzioni

Sanitarie Ospedaliere, dei SIAN e dei CAV e che assegna agli

SPreSAL (Servizio Prevenzione e Sicurezza Ambienti di Lavoro) un

ruolo centrale nella monitorizzazione dei casi.

Questo meccanismo risulta essere in fase di rodaggio, per cui a

tutt’oggi, il dato nazionale complessivo del fenomeno risulta

approssimativo ed è basato sui calcoli delle segnalazioni e delle

ricerche di consulenza che pervengono ai centri antiveleni e sulle

sporadiche segnalazioni spontanee ai servizi dei dipartimenti di

prevenzione delle ASL.

Direttamente legata alla difficoltà delle segnalazioni spontanee

è sicuramente la nazionalità dei lavoratori.

NAZIONALITA’ DEI LAVORATORI

2001 2002 2003 2004

Italiani 88% 76% 88% 90%

Extracomunitari 12% 24% 12% 10%

Nella larga maggioranza dei casi si tratta di lavoratori

dipendenti. I casi che interessano lavoratori extracomunitari sono

sottostimati: si ritiene, infatti, che il numero dei soggetti

extracomunitari coinvolti in eventi acuti sia molto maggiore, in quanto

i lavoratori clandestini o comunque non in regola con il permesso di

soggiorno non si reca al Pronto Soccorso e comunque non denuncia la

vera causa del malore.

Al fine di riuscire ad intercettare anche questi casi è stata

avviata alla fine del 2004 una collaborazione con Medici Senza

Frontiera che, grazie alla presenza sul territorio con due ambulatori a

Vittoria e S. Croce Camerina, sono in grado di rilevare gli eventi che

normalmente sfuggono all’osservazione del Sistema Sanitario

Nazionale.

Un altro parametro importante per la valutazione dei rischi è la

fascia di età dei lavoratori.

FASCE DI ETA’

2001 2002 2003 2004

Minori 1 2 0 3

18 – 30 anni 21 17 15 5

31 – 40 anni 21 16 24 16

41 – 50 anni 5 10 12 5

51 – 60 anni 11 3 3 7

> 60 anni 4 1 3 5

Si conferma la fascia di età (18 – 40 anni) come quella a

maggior rischio di infortuni, quella maggiormente rappresentata nella

forza lavoro del settore; da segnalare i sei casi relativi a minori dovuti

ad iniziative personali non sufficientemente vigilati da adulti. Il

fenomeno colpisce quasi esclusivamente la popolazione maschile.

0

5

10

15

20

25

Minori 18-30 31-40 41-50 51-60 > 60

2001

2002

2003

2004

Figura 12- Intossicazioni da fitosanitari 01/04 - Fasce di età

Nel seguente grafico guardiamo alle sostanze che hanno

maggiormente causato intossicazioni.

0

5

10

15

20

25

30

35

Chlorp

yrifos

Endosulfan

Fen

amiphos

Cym

oxan

il

Imidacloprid

Methom

yl

Dichloropropen

e

Cianam

mide

2001

2002

2003

2004

Figura 13- Intossicazione da fitosanitari 01/04 - Principi Attivi

Il methomyl si conferma, come il presidio sanitario più

frequentemente coinvolto nelle intossicazioni da fitosanitari;

sicuramente è uno dei fitosanitari più utilizzato nei trattamenti, sia da

solo che in associazione con altri prodotti.

INTOSSICAZIONI CRONICHE DA FITOSANITARI

Per intossicazioni croniche intendiamo tutte quelle

intossicazioni che hanno effetti a lungo termine. Gli apparati

maggiormente colpiti sono il sistema polmonare, il sistema nervoso

centrale e periferico e anche il sistema oggetto del nostro studio vale a

dire l’apparato genitale maschile.

Gli studi precedentemente riportati sull’età dei lavoratori più

colpiti, sul sesso di questi e sui principi attivi più frequentemente

associati alle intossicazioni da prodotti fitosanitari di uso agricolo

possono essere riproposti a riguardo delle intossicazioni croniche.

In più dall’indagine statistica effettuata all’interno del Centro si

evince con chiarezza che la categoria di pazienti con patologiche

alterazioni dei parametri del liquido seminale sono proprio i lavoratori

serricoli.

Materiali E Metodi

ESAME DEL LIQUIDO SEMINALE

L’esame del liquido seminale, o spermiogramma, è il caposaldo

dell’attività del laboratorio di andrologia, poiché rappresenta il punto

di partenza dello studio della capacità fecondante di un uomo.

RACCOLTA E CONSEGNA DEL CAMPIONE

Il campione deve essere raccolto dopo un periodo di astinenza

sessuale di non meno di 48 ore e non più di 7 giorni.

Sul modulo di accompagnamento di ogni analisi dovranno

essere registrati il nome del paziente, il periodo di astinenza, il giorno

e l’ora della raccolta, e l’intervallo intercorso tra la raccolta e l’analisi.

Preferibilmente, il campione andrà raccolto in un’apposita

stanza nei pressi del laboratorio. Altrimenti, dovrà essere consegnato

al laboratorio entro 1 ora dalla raccolta.

Il campione dovrà essere ottenuto per masturbazione e raccolto

in un contenitore etichettato con il nome del paziente, con la data e

l’ora della raccolta.

ESAME MACROSCOPICO INIZIALE

Liquefazione

Un campione normale subisce il processo di liquefazione in un

tempo variabile dai 10 ai 60 minuti a temperatura ambiente. In alcuni

casi, la liquefazione completa non avviene entro 60 minuti e questo

fatto dovrà essere registrato. Campioni normali di liquido seminale

possono contenere corpi gelatinosi che non si liquefanno, ma non

sembrano avere nessun rilevanza clinica.

Aspetto

L’aspetto del campione viene valutato immediatamente dopo la

liquefazione o dopo un’ora dall’eiaculazione, secondo la sua

opacità/trasparenza.

Il colore fisiologico del seme è avorio opalescente. Un colore

giallastro può essere espressione di una rilevante presenza di globuli

bianchi. Un colore rosato o rosso intenso è invece, indicativo della

presenza di sangue.

Volume

Il volume dell’eiaculato viene considerato normale se è

superiore ai 2ml e inferiore a 5 ml

Viscosità

La viscosità del campione liquefatto potrà essere valutata

aspirando delicatamente il liquido seminale in una pipetta da 5 ml

dall’imboccatura ampia, e lasciatolo gocciolare per gravità,

osservando la lunghezza del filamento ottenuto: un campione normale

lascia la pipetta come piccole gocce distinte.

In caso di anormale viscosità la goccia formerà un filamento

superiore ai 2 cm

pH

Una goccia di liquido seminale deve essere uniformemente

stesa su un’apposita cartina indicatrice. Dopo 30 secondi, il colore

della zona bagnata diventa uniforme e deve essere confrontato con la

scala delle colorazioni per leggere il valore di pH.

Il pH seminale, anche se patologico, non è comunque, come

valore limite, superiore a 8,0 o inferiore a 7.2.

ESAME MICROSCOPICO INIZIALE

Determinazione della concentrazione di spermatozoi

Con l’ausilio di una micropipetta vengono posti 10 µl di liquido

seminale sul portaoggetti della camera di Makler, preriscaldata e

coperti con uno speciale vetrino coprioggetti dotato di ghiera

metallica, che consente di creare un monostrato di 10 µm di spessore.

Messa a fuoco la griglia, si procede alla conta degli spermatozoi.

Valutazione della motilità

E’ consigliabile un semplice sistema di classificazione, che

permetta la valutazione delle motilità degli spermatozoi.

E’ necessario osservare e registrare almeno 5 campi in modo

sistematico per classificare 200 spermatozoi. La motilità di ogni

spermatozoo è definita:

“a” motilità progressiva rapida,

“b” motilità progressiva lenta o irregolare,

“c” motilità non progressiva,

“d” immobili.

Vitalità degli spermatozoi

La vitalità degli spermatozoi è definita dalla percentuale di

cellule vive, determinata dall’esclusione del colorante o dal test di

swelling (rigonfiamento) ipoosmotico. Essa dovrebbe essere valutata

quando la percentuale degli spermatozoi immobili supera il 50%.

VALUTAZIONE DELLA MORFOLOGIA SPERMATICA

Per valutare la morfologia dobbiamo effettuare una colorazione;

miscelando 70microlitri di liquido seminale, 70microlitri di terreno e

10microlitri di colorante Gimsa, quindi si depone una piccola goccia

del preparato colorato su di un vetrino e utilizzando un obiettivo in

campo chiaro 100x ad immersione di olio si valuta la morfologia

esaminando almeno 100 spermatozoi.

Morfologia dello spermatozoo normale

Lo spermatozoo umano, normale e maturo, osservato al

microscopio ottico, appare costituito da una porzione apicale, detta

“testa”, di forma ovalare appiattita, le cui dimensioni standard sono

descritte nella seguente tabella.

Dimensione standard della testa nemaspermatica normale

(criteri del WHO, 1987, 1992, 1999)

WHO 1987 Lunghezza da 3,0 a 5,0 µ Larghezza da 2,0 a 3,0 µ Rapporto Larghezza/Lunghezza da 0,5 a 0,7

WHO 1992 Lunghezza da 4,0 a 5,5 µ Larghezza da 2,5 a 3,5 µ Rapporto Larghezza/Lunghezza da 1,50 a 1,75

WHO 1999 Lunghezza da 4,0 a 5,0 µ Larghezza da 2,5 a 3,5 µ Rapporto Larghezza/Lunghezza da 1,50 a 1,75

La testa è per gran parte occupata dal nucleo contenente DNA

(con assetto cromosomico aploide). Nella parte anteriore si trova il

complesso acrosomiale o “acrosoma”, una struttura a forma di

cappuccio.

La coda spermatica è inserita in maniera simmetrica in una lieve

depressione alla base della testa.

Morfologia degli spermatozoi anomali

Anomalie della testa

Le anomalie più frequenti sono:

- Testa larga (macrocefalia);

- Testa piccola (microcefalia);

- Testa amorfa;

- Testa a punta detta a sigaro;

- Testa piriforme;

- Testa vacuolata;

- Testa a palla;

- Testa doppia o multipla;

- Assenza della testa (acefalia);

- Difetti dell’acrosoma.

Figura 14- Disegni schematici delle anomalie della testa

Anomalia del collo:

Le anomalie più frequenti sono:

- Collo angolato;

- Tratto sottile (assenza della guaina mitocondriale);

- Tratto spesso e irregolare;

- Inserzione asimmetrica della coda.

Figura 15- Disegni schematici delle anomalie del collo

Il segmento di connessione si presenta a volte particolarmente

assottigliato oppure la testa risulta ripiegata ad angolo retto sul

flagello. Ne consegue movimento anomalo non direzionale dello

spermatozoo.

Tale anomalia non è descritta in realtà come isolata, ma si

associa ad altre alterazioni strutturali dello spermatozoo ed è

presente generalmente in eiaculati oligoastenoteratozoospermici.

Un’anomalia generalizzata ed isolata del segmento di

connessione è la separazione della testa dalla coda. Tale difetto ha

una base genetica essendo presente in più componenti della stessa

famiglia.

Anomalie della coda:

Le anomalie più frequenti sono:

- Coda assente;

- Coda mozza;

- Coda rigonfia

- Coda arrotolata;

- Coda angolata;

- Coda doppia o multipla.

Figura 16- Disegni schematici delle anomalie della coda

Residuo citoplasmatico:

E’ presente negli spermatozoi immaturi, la sua grandezza è

circa metà della testa di uno spermatozoo.

Figura 17- Disegno schematico di spermatozoo con residuo citoplasmatico

L’esame a fresco o su striscio colorato del liquido seminale

permette di evidenziare, la componente cellulare non nemaspermatica,

rappresentata dai seguenti elementi figurati:

• Elementi della linea spermatogenetica. Possono essere

presenti spermatidi; spermatociti primari e secondari e

spermatogoni; gli spermatidi e gli spermatociti primari

sono gli elementi più frequentemente rappresentati;

• Globuli bianchi, costituiti prevalentemente da granulociti,

linfociti e macrofagi;

• Emazie;

• Cellule di sfaldamento derivanti dalle ghiandole

accessorie, dai dotti e canali dell’apparato genitourinario;

• Cristalli di spermina e corpuscoli prostatici.

Un’importanza particolare assume, nella diagnostica

differenziale delle azoospermie, la ricerca delle cellule germinali;

infatti, la presenza di tali cellule nell’eiaculato permette di escludere

un’ostruzione bilaterale delle vie genitali e indirizza la diagnosi verso

la presenza di un blocco maturativi a livello dell’epitelio seminifero.

Altre anomalie

Oltre alle anomalie della forma, nel corso della

spermatogenesi si possono osservare anche delle aberrazioni

cromosomiche.

Il caso più frequente è quello che si verifica nel corso della

prima divisione meiotica, quando i cromosomi omologhi devono

separarsi, raggiungere i poli opposti della cellula e ripartirsi ognuno

in ciascuna delle due cellule figlie. Se i cromosomi omologhi non

riescono a separarsi (fenomeno noto con il termine di non

disgiunzione), le due cellule figlie conterranno una 24 cromosomi e

l'altra 22. All'atto della fecondazione si possono così avere cellule

con 47 (24 + 23) o con 45 (22 + 23) cromosomi.

Le aberrazioni dei cromosomi sessuali sono molto più

frequenti di quelle degli autosomi. La più frequente alterazione è

quella del cariotipo 47 (XXY) seguita dall'assetto XYY Queste

anomalie, in particolare quella del cromosoma Y, conducono

all'azoospermia.

Altra aberrazione riguarda la formazione dei bivalenti nel

corso della meiosi, quando il mancato appaiamento dei cromosomi

sessuali e degli autosomi provoca l'arresto della spermatogenesi.

Studi compiuti sull'uomo e sul topo hanno accertato che in

molti casi le aberrazioni degli autosomi provocano arresto della

spermatogenesi.

Al pari di tutti i processi differenziativi, la spermatogenesi

avviene sotto il diretto controllo dell'espressione genica. Infatti, nel

genoma sono presenti alcuni geni i quali sono deputati alla

regolazione della spermatogenesi. La presenza di geni mutanti

omozigoti nei tratti di genoma implicati nella regolazione della

spermatogenesi è causa di imperfezioni di sviluppo.

TECNICHE DI PROCREAZIONE

MEDICALMENTE ASSISTITA (PMA)

Secondo l’Articolo 4, Legge 40/2004 il ricorso alle tecniche di

procreazione medicalmente assistita è consentito solo quando sia

accertata l'impossibilità di rimuovere altrimenti le cause impeditive

della procreazione ed è comunque circoscritto ai casi di sterilità o di

infertilità inspiegate o accertata documentate da atto medico.

Le tecniche di procreazione medicalmente assistita devono

essere applicate in base ai seguenti principi:

1. Gradualità, al fine di evitare il ricorso ad interventi aventi

un grado di invasività tecnico e psicologico più gravoso

per i destinatari, ispirandosi al principio della minore

invasività;

2. Consenso informato, da realizzare ai sensi dell'articolo 6

3. Inoltre è vietato il ricorso a tecniche di procreazione

medicalmente assistita di tipo eterologo.

Per tecniche di procreazione medicalmente assistita si intendono

tutti quei procedimenti che comportano il trattamento di ovociti

umani, di spermatozoi o embrioni nell’ambito di un progetto

finalizzato a realizzare una gravidanza.

Questi procedimenti includono: l’inseminazione omologa, la

fecondazione in vitro ed il trasferimento embrionale, il trasferimento

intratubarico dei gameti, il trasferimento intratubarico degli zigoti, il

trasferimento intratubarico degli embrioni, la crioconservazione dei

gameti.

Delle suddette tecniche noi ci occuperemo soltanto di:

1. Inseminazione intrauterina (IUI);

2. Fertilizzazione in vitro ed embriotransfer (IVF-ET/ICSI);

3. Crioconservazione dei gameti maschili.

INSEMINAZIONE INTRAUTERINA (IUI)

Indicazioni

• Oligoastenospermia;

• Fallimento eiaculatorio;

• Fattore femminile;

• Endometriosi.

Materiale utilizzato

• Vasetti da urinocoltura;

• Guanti monouso sterili senza talco;

• Micropipette sterili; Camera di Makler;

• Provette tappo bianco a 2 posizioni da 5 ml;

• Ham’s F10 con rosso fenolo, senza glutamina, per

lavaggio spermatozoi;

• Provette Falcon da 15 ml sterili (tappo blu);

• Centrifuga;

• Pasteur in vetro sottile;

• Tettarelle in gomma (sterilizzate);

• Siringhe da 1ml;

• Catetere per inseminazione Gynetics IUI 4220.

Tecnica

Il campione seminale viene prodotto dal paziente all’interno del

centro in un locale apposito, il contenitore viene fornito al paziente

con su scritto nome, cognome e data di nascita suo e della partner e

viene portato da un’infermiera in laboratorio.

Il campione viene lasciato liquefare per 30-60 minuti su piastra

riscaldata o stufa a 36°C.

Avvenuta la fluidificazione se ne prelevano 10 µl con una

micropipetta sterile e si effettua la conta degli spermatozoi mobili in

camera di Makler, in base al risultato di questa prima conta

l’embriologo decide il tipo di trattamento da effettuare al campione:

Swim-up da pellet Swim-up da strato.

Tecnica dello Swim-up da strato:

Un’aliquota di terreno di coltura (0,3-0,5 ml) viene stratificato

sopra il liquido seminale (circa 1 ml) in una provetta Falcon a fondo

conico, sterile, da 15 ml; si pone la provetta in incubatore, o sul

termoblock per 45’.

Si controlla la concentrazione degli spermatozoi mobili alla

sommità del terreno stratificato e si trasferisce un’aliquota di questo

terreno (0,5-0,6 ml), contenente gli spermatozoi selezionati, in una

provetta tappo bianco da 5 ml, poi si procede al caricamento del

catetere.

Tecnica dello Swim-up da pellet:

Un’aliquota di medium Ham’s F10, o altro terreno di lavaggio,

(1-2-3 ml) viene stratificato sopra il liquido seminale (circa 1 ml) in

una provetta Falcon a fondo conico, sterile, da 15 ml. Si miscelano le

due frazioni con agitazione delicata (o pipetman), si centrifuga a 1500

RPM per 10’, si elimina il surnatante con una pasteur in vetro sterile,

si stratificano 300 µl di terreno di coltura e si pone in incubatore, o sul

termoblock per 45’. Si controlla la concentrazione degli spermatozoi

mobili alla sommità del terreno stratificato e si trasferisce un’aliquota

di questo terreno (0,5-0,6 ml), contenente gli spermatozoi selezionati,

in una provetta tappo bianco da 5 ml, poi si procede al caricamento del

catetere.

Si collega il catetere da inseminazione ad una siringa da 1ml, si

aspira dalla punta del catetere un’aliquota del terreno contenente gli

spermatozoi selezionati (circa 0,5 ml), quindi si porta il catetere al

ginecologo che provvede all’inseminazione.

Tale trattamento non comporta l’esecuzione di anestesia; è

completamente indolore; si esegue nel periodo fecondo.

È il meno costoso e ripetibile; se ne eseguono circa due ogni

ciclo e statisticamente dà una percentuale di successo del 15/20%. La

maggiore percentuale di gravidanze avviene in media al 3°/4° ciclo,

ma non si continua per più di sei cicli.

Condizioni necessarie sono: presenza di ovulazione, tube libere

e funzionanti, spermatozoi nella normalità o modicamente ipomobili.

FERTILIZZAZIONE IN VITRO (IVF)

Indicazioni

• Patologia tubarica;

• Endometriosi;

• Infertilità inspiegata;

• Fattore maschile;

• Fallimenti di 3-6 cicli di IUI.

Oggi la FIVET è indicata in molta situazioni: che vanno dalla

sterilità tubarica alla subfertilità maschile. È una metodica che dà

buone possibilità di successo ma non è priva di limiti; inoltre è

complessa, costosa e comporta scelte di tipo etico.

ICSI

Indicazioni

Sperma eiaculato

• Oligozoospermia;

• Astenozoospermia;

• Teratozoospermia;

• Ripetuti fallimenti della fertilizzazione FIVET;

• Disordini eiaculatori.

Sperma epididimario

• Assenza congenita bilaterale dei deferenti;

• Ostruzione di entrambi i dotti eiaculatori;

Materiale utilizzato

• Fiasche sterili da 50 ml;

• Fiasche da 500 ml;

• Provette tappo bianco a 2 posizioni da 15 ml;

• Provette tappo bianco a 2 posizioni da 5 ml;

• Piastre Petri medie nunc cod. 153066 (dischi di coltura);

• Piastre nunc a 4 pozzetti;

• Piastre Petri grandi Falcon cod. 3004 (Pick-up);

• Pipette Pasteur di vetro;

• Forbici ;

• Pinzette;

• Tettarelle in gomma (sterilizzate);

• Puntali da 100 e da 1000 µl;

• Vetrini coprioggetto grandi (TESE);

• Garze e telini;

• Guanti in lattice senza talco;

• Aghi di aspirazione ovocitaria Wallace o altra marca;

• Guanti monouso sterili senza talco;

• Provette Falcon da 15 ml sterili (tappo blu);

• Vasetti da urinocoltura;

• Piastre Petri piccole Falcon cod. 1006 (dischi ICSI);

• Aghi per micromanipolazione COOK, Eppendorf o

Humagen: ICSI e Holding;

• Catetere per embryo transfer COOK – Wallace.

Soluzioni e Terreni di coltura Utilizzati

• H2O Bidistillata (Carlo Erba);

• Olio Minerale Sterile (Medicult): Olio di copertura per

colture cellulari per evitare un’eccessiva evaporazione del

terreno di coltura e per creare un filtro protettivo sulla

coltura stessa agendo anche come riserva di CO2. Deve

essere equilibrato in incubatore O.N. a 37 °C e 5% CO2;

• Hearle con rosso fenolo: terreno di coltura di gameti

utilizzabile per primo lavaggio ovociti dopo pick-up;

• IVF (Medicult) con rosso fenolo: Terreno di coltura di

gameti ed embrioni, contiene bicarbonato viene

equilibrato a 37°C e 5% CO2 prima dell’utilizzo;

• Ham’s F10 con rosso fenolo, senza glutamina, per

flushing ovocitario e per lavaggio spermatozoi;

• Sperm Prep (Medicult) con rosso fenolo: Terreno di

coltura di gameti, contiene bicarbonato e HEPES per

migliorare la stabilità fuori dall’incubatore dove viene

equilibrato a 37°C e 5% CO2 prima dell’utilizzo;

• PVP, 7% - ready to use solution;

• Hyaluronidase 80 U/ml in HTF w/hepes;

• PVP (Medicult) con rosso fenolo (Medium PVP 10 %):

Soluzione ad alta viscosità per immobilizzare gli

spermatozoi da prelevare per procedura ICSI

Preparazione laboratorio

Prima dell’inizio di un ciclo di fecondazione assistita il

laboratorio viene accuratamente disinfettato e monitorato per

accertarsi del corretto funzionamento delle apparecchiature.

Tecnica

L’ICSI è una tecnica che comporta la microiniezione di un

singolo spermatozoo in un ovocita maturo allo scopo di ottenerne la

fertilizzazione.

Perché ciò avvenga la donna si deve sottoporre ad una

stimolazione della crescita follicolare con dei farmaci

(gonadotropine). È una tecnica che permette di avere una gravidanza a

quelle coppie dove il partner maschile è affetto da grave infertilità.

DAY –2

Si preparano 50 ml di olio minerale sterile + 5 ml di terreno di

coltura (IVF, Hearle o altro) per paziente in una o più fiasche, e si

mettono in incubatore senza tappo per far sedimentare il terreno di

risciacquo e far equilibrare l’olio (non mettere i tappi nell’incubatore).

DAY –1

Alla sera si prepara per ogni paziente una provetta da 15 ml con

terreno Ham’s F 10 per il pick-up ovocitario e delle provette vuote in

funzione del numero di follicoli e si mettono sotto cappa a

temperatura ambiente.

Si mettono in incubatore delle provette contenenti terreno di

coltura (IVF o Fert) e alcune contenenti Sperm Prep (o altro terreno

con Hepes), in base al numero di pazienti da trattare, come riserve di

terreno.

Si preparano 5 Piastre (Nunc 153066) per paziente, si scrive il

nome della paziente al centro della piastra, sul fondo esterno, con una

penna vetrografica e si riempiono con 4,2 ml di olio minerale. Si

dispongono le piastre in incubatore in file frontali all’apertura e senza

coperchio.

Si prepara, per ogni paziente, una piastra nunc a 4 pozzetti, (o

più, in base al n° di follicoli da aspirare) di raccolta ovocitaria, con

all’interno 500 µl di terreno di coltura (FERT), ricoperto da olio

minerale, per pozzetto, e la si pone in incubatore.

Si posizionano le piastre per il Pick-up (Falcon 3004), in

confezione, sul termoblock già dalla sera prima.

Si preparano Pasteur in vetro sterili in numero di 20 circa per

paziente.

Si sterilizzano: forbici, pinzette, tettarelle, puntali da 100 e da

1000 µl, vetrini coprioggetto grandi (TESE), garze e telini.

DAY 0

Prima dell’inizio dei pick-up si mettono a temperatura ambiente

il PVP e la Hyaluronidase.

Aspirazione dei follicoli

Figura 18- Prelievo ovocitario

L’aspirazione dei follicoli è eseguita per mezzo di un ago

(Wallace o equivalente) a singolo lume ecoguidato. All’ago è

applicata una pressione negativa (-80 / -100 millibar) regolata da una

pompa di aspirazione (pompa di Kraft).

Gli ovociti recuperati sono raccolti nelle provette tappo bianco

sterili da 15 ml, o alternativamente in fiasche sterili da 50 ml, e

trasferiti in laboratorio.

I tubi contenenti gli ovociti vengono svuotati in piastre Falcon

(cod. 3004) grandi poste su piano riscaldato all’interno della cappa

sterile a flusso laminare orizzontale e il liquido viene controllato allo

stereomicroscopio per la ricerca degli ovociti. Si controlla allo

stereomicroscopio il fondo della provetta prima di buttarla.

A questo punto gli ovociti vengono trasferiti nella piastra nunc a

4 pozzetti contenenti ognuno 500 µl di terreno di coltura ricoperto

d’olio, in numero di 2/3 per ogni pozzetto, in incubatore e ivi

mantenuti per circa 1 ora.

Figura 19- Piastra nunc a quattro pozzetti

Affinchè la procedura ICSI possa aver luogo, gli ovociti devono

essere privati del cumulo ooforo e della corona radiata.

Si preparano piastre nunc 35 x 10 con microgocce di 50 µl,

preparando 4 microgocce di terreno di coltura (FERT) e una goccia di

terreno + hyaluronidase (40 UI/ml finale), o solo hyaluronidase (80

UI/ml finale) da segnare con un cerchio sotto la piastra mediante la

matita vetrografica.

Cognome moglie – Cognome marito

1 3

2 4

50 µl di FERT + 50 µl di hyaluronidase

50 µl di FERT

Figura 20- Piastra I (percorso ovociti) Figura 21- Piastra II (disco di riposo)

Le piastre vengono rimesse in incubatore (down) per 15’, si

preparano intanto delle Pasteur assottigliate e si dispongono sotto

cappa in ordine di diametro decrescente.

Si utilizza prima la piastra I che viene uscita dall’incubatore

insieme alla nunc a 4 pozzetti, contenente gli ovociti, che vengono

prelevati dal pozzetto e messi in una goccia di FERT (1) e poi passati

in hyaluronidase (2), spipettati dolcemente fino all’eliminazione del

cumulo (utilizzando Pasteur normale), e poi passati tutti assieme nelle

gocce di lavaggio (3-4-5-6) mediante pipette assottigliate per

allontanare il più possibile ogni traccia di enzima dagli ovociti.

Spipettamento con pasteur assottigliate, si ottiene la rimozione

delle cellule follicolari, e gli ovociti vengono lasciati nella goccia di

lavaggio (6).

A fine trattamento si aspira la goccia di Hyaluronidase. La

procedura deve essere effettuata velocemente per non esporre gli

ovociti alla soluzione di Hyaluronidase per più di 30 secondi.

3

4

1

6

5

2 paziente

1

6

5

2

3

4

Dopo l’eliminazione del cumulo ooforo gli ovociti vengono

trasferiti nella piastra II, uno per goccia, classificati all’invertoscopio,

e rimessi in incubatore.

Alternativamente la decoronizzazione può essere effettuata in

piastre nunc a 4 pozzetti, contenenti nel pozzetto n°1 500 µl di

hyaluronidase (80 UI/ml finale), contrassegnato con un puntino nero,

e nei pozzetti n° 2-4 500 µl di terreno di coltura con hepes (HTF

w/hepes). La piastra viene riscaldata sul termoblock a +37 °C, non in

incubatore, e il procedimento di decoronizzazione è uguale.

Hyaluronidasi 80UI/ml finale

HTF con hepes

Figura 22- Piastra nunc (1-4: percorso degli ovociti)

Preparazione del campione seminale

Il campione seminale viene prodotto, subito dopo la

constatazione del recupero di almeno un ovocita.

Il campione verrà trattato come già visto per l’inseminazione

intrauterina.

Cognome moglie – Cognome marito

1 4

2 3

Fertilizzazione

FIVET:

Le piastre nunc a 4 pozzetti contenenti gli ovociti vengono

prelevate dopo circa 4 ore di incubazione e ad ogni pozzetto

contenente gli ovociti (max 3 per pozzetto) viene aggiunta una

quantità di seme trattato tale da contenere 40.000 – 50.000

spermatozoi per ovocita. Le piastre vengono quindi rimesse in

incubatore.

ICSI:

Dopo la pulizia degli ovociti si preparano piastre Falcon 1006

(con indicato sul fondo il cognome della paziente) con 3 gocce da 10

µl di terreno di coltura (Fert), e, sopra, due gocce con un volume <10

µl di PVP, si ricopre di olio minerale. Si aggiungono 2 µl di seme

trattato in una goccia di PVP, si mette la piastra in incubatore per 30’

a 37°C e 5% CO2.

PVP (Medium PVP 10 %) + Spermatozoi

PVP

Fert

Figura 23- Piastra Falcon per ICSI

Nome Paziente 1 2 3

Si utilizza il PVP perchè grazie alla sua alta viscosità riduce la

mobilità degli spermatozoi e ne permette una facile cattura e una

agevole immobilizzazione.

Si trasferiscono gli ovociti nelle microgocce di terreno con una

Pasteur assottigliata rispettando la numerazione iniziale.

Si procede alla microiniezione. Al momento della ICSI si pone

la piastra sull’invertoscopio e si fa equilibrare la pressione della

micropipetta Injecting immergendola nella goccia contenente PVP ma

non spermatozoi.

Si immobilizza uno spermatozoo toccando la coda con la

micropipetta, e lo si aspira con la testa rivolta verso l’estremità aperta

della micropipetta.

Si sposta la piastra per inquadrare nel campo visivo la goccia

con l’ovocita, lasciando la micropipetta Injecting abbassata; si abbassa

la micropipetta Holding e si blocca l’ovocita aspirandolo leggermente,

si sta attenti ad orientarlo con il globulo polare a ore 6 (zona

disorganizzata dell’ovocita).

Si perfora l’ovocita con la micropipetta Injecting, si aspira un

po’ di citoplasma, al fine di capire se si è perforata la zona pellucida.

Dopo si espelle lo spermatozoo all’interno del citoplasma,

questa procedura permette anche di attivare l’ovocita per l’afflusso di

ioni Ca++ dal terreno di coltura al citoplasma.

Si blocca subito il flusso dalla micropipetta Injecting e la si

estrae lentamente dall’ovocita.

Dopo ogni microiniezione si sollevano leggermente le

micropipette e si riposiziona il campo nella goccia con gli spermatozoi

e si procede con una nuova iniezione.

A fine procedura si pongono gli ovociti microiniettati nelle

goccie di una terza piastra Nunc 35 x 10 con FERT, rispettando la

numerazione iniziale e si mette la piastra in incubatore.

Figura 24- Piastra nunc III

1

2

3

A fine giornata si prepara una nuova piastra di coltura, per

paziente, con gocce di terreno (cleavage) per il cambio di terreno da

effettuarsi a day +1 dopo il controllo dell’avvenuta fertilizzazione e si

pone in incubatore.

DAY 1

Il controllo dell’avvenuta fertilizzazione degli ovociti, mediante

osservazione dei 2 pronuclei all’invertoscopio, viene effettuato 15-19

ore dopo l’inseminazione in caso di procedura IVF classica, in caso di

procedura ICSI il controllo può essere effettuato 12-18 ore dopo

l’iniezione intracitoplasmatica in quanto i pronuclei appaiono prima.

Gli ovociti fertilizzati, provenienti da FIVET o ICSI, vengono

classificati e trasferiti in una nuova piastra di coltura (nunc 153066)

con gocce di terreno (cleavage), rispettando l’eventuale numerazione.

DAY2

La seconda osservazione viene effettuata 40 - 48 ore

dall’inseminazione. In questa fase si fa una valutazione embrionale e

una classificazione.

Gli embrioni vengono valutati per il numero totale e la

regolarità dei blastomeri, presenza di frammentazione, presenza di

granulazioni nel citoplasma dei blastomeri e soprattutto per il rispetto

dei tempi di divisione; gli embrioni dopo osservazione possono essere

riposti in incubatore, oppure trasferiti in terreno fresco.

DAY 3

La terza osservazione viene effettuata 66 - 74 ore

dall’inseminazione. Si controlla la divisione degli embrioni al mattino

mediante osservazione allo stereomicroscopio su piano riscaldato.

Figura 25- Embrione a quattro cellule

Si procede al transfer embrionale. Si prepara una siringa da

insulina, si riempie di terreno di caricamento (cleavage) e si tiene sul

termoblock riscaldato in una provetta sterile da 15 ml.

Si porta il catetere in sala operatoria dove si lascia al ginecologo

la guida affinché sia inserita nel canale cervicale e si ritorna in

laboratorio con il catetere e l’astuccio.

Si taglia l’astuccio di 2-3 cm per far uscire la punta del catetere,

lo si connette alla siringa da 1 ml e lo si sciacqua con il terreno di

coltura dell’embrione da trasferire lasciando circa 20 µl di terreno

nella siringa. Gli embrioni vengono trasferiti con una Pasteur nella

goccia centrale della piastra di coltura. Si aspirano all’interno del

catetere in sequenza, gli embrioni entro una quantità di terreno pari a

20 µl, una bolla d'ari paria 10 µl e, nella punta del catetere, una

quantità di terreno pari a 5-10 µl, si ripone il catetere così preparato

nella confezione sterile e si porta in sala per il transfer.

Il ginecologo inserisce il catetere nella guida e, finito il

posizionamento, l’embriologo o il ginecologo, aziona lo stantuffo

della siringa. Si attende circa 1 minuto e, successivamente, il

ginecologo estrae delicatamente il catetere dalla guida e lo consegna

all’embriologo che lo riporta in laboratorio.

Qui, sotto cappa, si poggia la punta del catetere su una piastra

sterile con una goccia di terreno fresco e si controlla la presenza di

embrioni sulla punta del catetere. In caso di esito negativo si comunica

al ginecologo di estrarre la guida altrimenti si ripete l’operazione.

CRIOCONSERVAZIONE DEI GAMETI

MASCHILI

Gli spermatozoi sono organismi mobili unicellulari: è nota dai

primi anni del XX secolo la loro proprietà di sopravvivere al

congelamento, riacquistando in buona parte con lo scongelamento, la

loro capacità di movimento e fertilizzante.

Una banca per il congelamento dei gameti maschili è costituita

da un contenitore criogenico per i gameti (contenitore n° 1) e da un

contenitore di stoccaggio per l’azoto liquido (contenitore n° 2), come

riserva per i rabbocchi periodici.

Per ogni contenitore criogenico, contenente gameti, è presente

un registro contenente la suddivisione interna dello stesso, e il

contenuto in paillettes, con i riferimenti ai pazienti proprietari del

materiale crioconservato.

Al termine del congelamento viene rilasciata, da parte del

Centro, al paziente, una relazione conclusiva del trattamento dove

viene riportato il numero di paillettes congelati.

Tutti i contenitori criogenici vengono ispezionati con frequenza

quindicinale al fine di accertarne il livello di azoto liquido all’interno

ed eventalmente effettuarne il rabbocco; le operazioni di pulizia dei

contenitori criogenici vengono effettuate con cadenza annuale.

INDICAZIONI CLINICHE

Le indicazioni cliniche per cui un paziente si rivolge ad un

centro per la crioconservazione del liquido seminale sono molteplici:

1. Crioconservazione per inseminazione artificiale omologa

in alcune forme di ipofertilità maschile in cui il

trattamento farmacologico o chirurgico determinano un

peggioramento transitorio o definitivo.

2. Crioconservazione per inseminazione artificiale eterologa

(nei paesi dov'è consentito);

3. Crioconservazione per inseminazione artificiale omologa

in pazienti (anche con parametri normali) che presentano

difficoltà alla raccolta nei tempi stabiliti, mettendo così a

rischio l’intera procedura;

4. Crioconservazione del seme per pazienti che devono

sottoporsi a terapie antineoplastiche o comunque a terapie

spermiotossiche;

5. Crioconservazione del seme in pazienti che si

sottopongono a vasectomia.

TECNICA DI CONGELAMENTO

Terreno di crioconservazione

Freezing Medium Test Yolk Buffer (TYB) with Glycerol

(IRVINE Scientific):

� 12 % v/v Glycerol;

� 20 % egg yolk;

� 1.000 units/ml Penicillin G;

� 1.000 µg/ml Streptomycin Sulfate;

Il glicerolo ha la funzione di proteggere la cellula dai danni

dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio intracitoplasmatici.

Il tuorlo d’uovo, contiene fosfolipidi, che proteggono la

membrana dello spermatozoo, e lipoproteine che hanno un’azione

protettiva durante lo shock termico che avviene nella prima fase del

congelamento.

Materiale utilizzato

� Paillettes per liquido seminale (0,25-0,5 ml);

� Pipetman;

� Pipette monouso sterili;

� Puntali sterili;

� Siringa da 1 ml;

� LN2;

Tecnica

Al paziente viene illustrato il consenso informato, nel quale è

specificato che i campioni di sperma sono di esclusiva proprietà del

paziente e che, in caso di morte, verranno distrutti.

Il paziente viene istruito sulle corrette modalità per la raccolta

del campione seminale, che deve essere fatta "in loco".

Subito dopo la raccolta il liquido seminale viene posto a 37° e

dopo la liquefazione vengono valutati i parametri fondamentali:

volume dell’eiaculato, numero, motilità e morfologia degli

spermatozoi.

Si preparano delle paillettes per liquido seminale con su scritto,

cognome, nome, codice del paziente, n° scheda di congelamento e il

numero relativo di paillette, si determina la posizione in cui si

dovranno conservare in banca e si mette ad equilibrare a temperatura

ambiente il terreno di congelamento

Si diluisce a temperatura ambiente un ugual volume di liquido

seminale e terreno con crioprotettore (TYB + Glicerolo) (Rapporto

1:1) aggiungendolo goccia a goccia e miscelando bene, utilizzando il

Pipetman.

Si riempiono le paillettes collegandole ad una siringa per mezzo

di un puntale sterile e si chiude l’estremità aperta con la plastilina; dal

momento in cui si inizia la diluizione del liquido seminale con il

crioprotettore, al momento in cui le paillettes verranno poste a

contatto con i vapori di azoto liquido, non devono passare più di 10

minuti, per evitare l’azione tossica del crioprotettore.

Le paillettes sono dei tubicini in plastica della lunghezza di

circa 10 cm e del diametro di circa 2-3 mm che possono contenere

circa 0.25 ml di liquido. In media, sono sufficienti 2 o 3 campioni di

liquido seminale per ottenere la conservazione di circa 50-60 paillettes

per paziente.

Si ripongono le paillettes in un cestello forato, poste

orizzontalmente in modo ordinato, e si inserisce il cestello in un

contenitore di LN2 a circa 8 cm dal livello di LN2. Si mantiene il

cestello in quella posizione per 10 minuti, dove, dopo una prima fase

in cui la temperatura cala velocemente e il campione passa dallo stato

liquido a quello solido, la temperatura cala progressivamente fino ad

equilibrarsi con quella dei vapori di azoto (-150°).

Successivamente si procede con l’immersione delle paillettes

direttamente nell’azoto liquido e solo successivamente si trasferiscono

in banca nella posizione determinata.

Tutti i contenitori e le provette utilizzati portano scritti sul lato il

nome, il cognome e il codice del paziente proprietario dei gameti.

Il giorno dopo si procede ad uno "scongelamento di prova" per

registrare il numero di spermatozoi e la motilità residua.

Al paziente viene consegnata una relazione con il numero totale

di paillettes congelate e con la descrizione del campione seminale

prima e dopo lo scongelamento.

TECNICA DI SCONGELAMENTO

La procedura di scongelamento del liquido seminale

crioconservato è rapida.

Materiale utilizzato

� Pipetman

� Pipette monouso sterili

� Forbici sterilizzate

� Tubi Falcon da 15 ml monouso sterili

La tecnica di scongelamento, è un punto altrettanto importante

perché deve consentire alle cellule di recuperare le normali attività

biologiche limitando quanto più possibile rapide differenze di

temperatura. Infatti, al fine di evitare bruschi sbalzi termici è

necessario estrarre lentamente le paillettes dall’azoto liquido e

consentire il raggiungimento dell’equilibrio termico tra materiale

cellulare e ambiente esterno, si mantengono a temperatura ambiente

per 10 minuti e poi a 37 °C per altri 10 minuti; si tagliano le due

estremità delle paillettes e si fa fuoriuscire il liquido per gravità in un

tubo Falcon da 15 ml preriscaldato sul termoblock a +37°C.

Il liquido seminale così scongelato viene trattato prima

dell’utilizzo (vedi trattamento del liquido seminale).

Uno studio portato avanti da ricercatori polacchi e belgi

suggerisce di utilizzare la tecnica della "crioconservazione" per

'selezionare' gli spermatozoi migliori, quelli più vitali, per garantirsi

maggiore successo in caso di fecondazione con la tecnica dell'ICSI

(iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi) e, ciò che più fa

meditare, è la loro ulteriore conclusione che - nella fecondazione

assistita - gli spermatozoi congelati hanno lo stesso potenziale

riproduttivo di quelli freschi.

Gli studiosi hanno analizzato oltre duecento pazienti con liquido

seminale a ridotta fertilità. Il tasso di gravidanze per il ciclo di

trattamenti avviati è stata di quasi il 30% dopo l'ICSI con spermatozoi

freschi e quasi del 39% con spermatozoi congelati. Nei cicli successivi

il tasso è stato del 23% per quelli freschi e il 35% per quelli congelati.

Gli autori dello studio, sostengono che, la crioconservazione,

negli uomini con una 'cattiva' qualità del liquido seminale, non

influisce negativamente sul successo della fecondazione e gravidanze

dopo l'ICSI.

Risultati e Discussione

FERTILITA’ NEI SERRICOLTORI

Nel corso dell’anno 2004/2005, si sono rivolti al Centro di

Diagnosi e Cura della sterilità 133 pazienti di cui, 40 appartenenti alla

classe lavorativa “serricoltori” e 93 distribuiti nelle altre classi

lavorative non soggetti ad inquinamento da fitofarmaci.

Professioni

Impiegati 20 15,0%

Professionisti 13 9,8%

Serricoltori 40 30,1%

Operai 39 29,3%

Commercianti 14 10,5%

Altro 7 5,3%

Totale pazienti 133

DISTRIBUZIONE PROFESSIONI

15%

10%

30%29%

11% 5% Impiegati

Professionisti

Serricoltori

Operai

Commercianti

Altro

Dei 40 pazienti serricoltori 32 esami sono risultati patologici

(80%) e 8 (20%) rientravano nei canoni standard della normalità.

Dei 93 pazienti appartenenti ad altre classi lavorative 60 esami

sono patologici (64.5%) e 33 esami sono normali (35.5%).

Normali Patologici

Altro 1 1% 6 6%

Commerciante 7 8% 7 8%

Impiegato 7 8% 13 14%

Operaio 14 15% 25 27%

Professionista 4 4% 9 10%

Serricoltore 8 20% 32 80%

16 7

7

7

13

14

25

4

9

8

32

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Altro

Comm

ercian

te

Impie

gato

Opera

io

Profes

sionis

ta

Serric

oltore

DISTRIBUZIONE TRA PATOLOGICI E NORMALI ALL'INTERNO DELLE CATEGORIE

LAVORATIVE

Patologici

Normali

Dati i risultati ottenuti, la nostra ipotesi è che i lavoratori

appartenenti alla classe dei serricoltori hanno disturbi della

spermatogenesi maggiori rispetto alle altre classi lavorative.

Nonostante i dati ottenuti abbiano dato una corretta

distribuzione Gaussiana e risultano dei dati con un’alta influenza,

applicato il test del χ2 P > 0.10, ξ=0.05 quindi P > ξ la nostra

probabilità di errore è del 10% per cui l’indagine non ha una

significatività statistica per via del limitato numero di casi.

CONFRONTO DATI SULL’INFERTILITÀ

Dati standard pubblicati qualche anno fa da Collins e Spira, ci

dicono che le cause d’infertilità sono attribuibili per circa il 50% alla

donna e per il 25% circa all’uomo.

CAUSA DI STERILITA’ SPIRA COLLINS

Frequenza Frequenza

Fattore Femminile 57 % 54 %

Difetto ovulatorio 29 % 27 %

Fattore tubarico 16 % 22 %

Endometriosi 7 % 5 %

Fattore Cervicale 2 % /

Fattore Uterino 3 % /

Fattore Maschile 21 % 25 %

Sterilità inspiegata 4 % 17 %

Fattore Masch-Femm. 18 % /

Altri 4 % /

Dai dati in nostro possesso relativi, ad individui di sesso

maschile residenti nella provincia di Ragusa, possiamo dire che

l’infertilità in tale zona è invece spostata verso il maschio.

Infatti, dei 133 pazienti maschi analizzati, il 69% sono

patologici.

Patologici 92 69%

Normali 41 31%

Totale Pazienti 133

DISTRIBUZIONE TRA PAZIENTI PATOLOGICI E NORMALI

69%

31%

Patologici

Normali

GRUPPO DI CONTROLLO

Abbiamo inoltre preso in considerazione un gruppo di controllo

formato da coppie che hanno concepito un figlio nell’ultimo anno.

Fatto l’esame del liquido seminale abbiamo costatato che questi

pazienti hanno valori che rientrano nella normalità ad esclusione di 3

pazienti che hanno un’anomalia ma solo in uno dei tre parametri

(numerico, cinetico e morfologico) e i loro valori sono molto vicini

alla normalità.

Anche in questo gruppo ci sono 3 serricoltori, ma guardando le

caratteristiche di tali pazienti vediamo che sono individui molto

giovani e molto probabilmente lavorano nel settore da poco tempo.

MOTILITA’ POST CONGELAMENTO

Viste le richieste sempre più in aumento di pazienti, con un

liquido seminale di partenza già patologico, ma con necessità di

congelamento di questo, abbiamo condotto delle sperimentazione per

vedere la resistenza degli spermatozoi alle tecniche di congelamento.

Esaminato il liquido seminale di 51 pazienti di età compresa tra

i 20 e i 64 anni abbiamo rilevato che 24 pazienti sono patologici e 27

normali.

Allo scongelamento si osserva una differenza di sopravvivenza

tra gli spermatozoi mobili di tipo (a+b) e gli spermatozoi mobili di

tipo (c) indipendentemente dalla qualità del liquido seminale. Più

precisamente diciamo che gli spermatozoi (a+b) resistono meglio

degli spermatozoi (c) perché evidentemente presentano caratteristiche

chimico-fisiche che consentono allo spermatozoo di resistere alle

drastiche condizioni cui sono sottoposti con il congelamento.

CONFRONTO TRA SOPRAVVIVENZA DEI MOBILI (a+b) E DEI MOBILI ( c)

34%

23%Media soprav (a+b)

Media soprav ( c)

Abbiamo poi separato i liquidi seminali patologici dai normali

confrontando la rispettiva sopravvivenza dei mobili (a+b) al

congelamento.

Guardando ai dati pubblicati in European Journal of Obstetrics

Gynecology, and Reproductive Biology in seguito ad una

sperimentazione eseguita nel 2000, in cui sono stati congelati, con

tecniche diverse, i liquidi seminali di 63 pazienti ottenendo i seguenti

risultati di motilità post congelamento: 49+/-15.7, 43+/-15.2 e 52+/-

16.8%, abbiamo fissato intorno al 40% il parametro di buona motilità

post congelamento.

I nostri risultati ci dicono che il numero di spermatozoi mobili

(a+b) con motilità superiore al 40%, nei pazienti normali è del 63%

nei pazienti con liquido seminale patologico la percentuale scende al

25%.

Pazienti Patologici 24 47%

Pazienti normali 27 53%

51

Liquidi seminali

Patologici Liquidi seminali

Normali

6 Patologici con motilità

post congelamento>40%

25%

18 Patologici con motilità

post congelamento<40%

75%

17 Normali con motilità

post congelamento>40%

63%

10 Normali con motilità

post congelamento<40%

37%

25%

75%

63%

37%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

LiquidiseminaliPatologici

LiquidiseminaliNormali

DIFFERENZA DI SOPRAVVIVENZA TRA PAZIENTI PATOLOGICI E NORMALI

Normali con motilitàpostcongelamento<40%Normali con motilitàpostcongelamento>40%Patologici con motilitàpostcongelamento<40%Patologici con motilitàpostcongelamento>40%

Ricordiamo che tra i pazienti patologici in questo database di 51

pazienti il 30% sono lavoratori serricoli.

Professioni

Impiegati 6 25,0%

Professionisti 2 8,3%

Serricoltori 7 29,2%

Operai 6 25,0%

Commercianti 2 8,3%

Altro 1 4,2%

Totale pazienti Patologici 24

DISTRIBUZIONE PROFESSIONI TRA PAZIENTI PATOLOGICI

25%

8%

30%

25%

8% 4% Impiegati

Professionisti

Serricoltori

Operai

Commercianti

Altro

Tra i pazienti con liquidi seminali nella norma la categoria

incide solo per il 15% quindi esattamente la metà, mentre per le altre

categorie di lavoratori le percentuali tra patologici e normali oscillano

di pochi punti percentuali.

Professioni

Impiegati 7 25,9%

Professionisti 3 11,1%

Serricoltori 4 14,8%

Operai 8 29,6%

Commercianti 2 7,4%

Altro 3 11,1%

Totale Pazienti Normali 27

DISTRIBUZIONE PROFESSIONI TRA PAZIENTI NORMALI

26%

11%

15%30%

7%11% Impiegati

Professionisti

Serricoltori

Operai

Commercianti

Altro

Per questo motivo possiamo concludere dicendo che i

serricoltori, nella provincia di Ragusa sono una delle categorie

lavorative più a rischio di infertilità; molto probabilmente a causa dei

prodotti tossici con cui vengono costantemente a contatto.

Tutte le informazioni raccolte a completamento di tale studio,

sono importanti per dare ai pazienti patologici e non (che si rivolgono

al centro con una richiesta di congelamento del liquido seminale)

indicazioni precise sulla tecnica di fecondazione medicalmente

assistita più adatta alle condizioni generali del liquido seminale.

Pertanto anche se ci troviamo dinanzi ad un paziente con

liquido seminale patologico che allo scongelamento presenta una

ridotta percentuale di spermatozoi mobili (a+b), possiamo ricorrere

alla tecnica ICSI che richiede esclusivamente uno spermatozoo.

Conclusione

I dati ottenuti ci danno modo di pensare che le motivazioni per

cui abbiamo cominciato questo tipo di sperimentazione cioè il

sospetto di una consistente incidenza dell’infertilità nei serricoltori

della provincia di Ragusa sia confermato, nonostante a causa del basso

numero di pazienti non risulti statisticamente significativo.

Nonostante ciò possiamo sicuramente richiamare l’attenzione

sul fatto che l’inquinamento ambientale causato da fitosanitari di uso

agricolo sia un fenomeno da monitorare e tenere sempre sotto

controllo.

A tale proposito dobbiamo dire che il lavoro svolto nella

provincia dal SPreSAL (Servizio Prevenzione e Sicurezza Ambienti di

Lavoro) sia lodevole in quanto rilevata una grande carenza di

formazione sui rischi specifici causato dai fitosanitari ed in particolare

su:

• Danni a breve e lungo termine alla salute;

• Corretto utilizzo degli indumenti di protezione (tute o

guanti resistenti ad agenti chimici);

• Corrette tecniche di utilizzo dei fitosanitari;

• Presidi sanitari di emergenza a cui rivolgersi in caso di

malessere da esposizione a fitosanitari;

• Incapacità, per scarsa formazione o professionalità, dei

rivenditori di fitosanitari ad essere un valido supporto

all’attività degli agricoltori.

Il SpreSAL si è impegnato in collaborazione con l’I.P.A., alla

organizzazione dei corsi di aggiornamento previsti prima dal D.P.R.

290/01 ed ora dal Decreto 29 luglio 2003 della Regione Siciliana

fornendo docenza su argomenti medico – igienico - prevenzionali.

Così come stabilito dall’art.5 del succitato decreto, l’IPA

rilascia l’attestazione di partecipazione e solo dopo il superamento di

un colloquio avanti una commissione esaminatrice l’autorizzazione

(Patentino Fitosanitario) all’acquisto per l’uso di fitosanitari e loro

coadiuvanti classificati molto tossici, tossici o nocivi.

Dal 2003 ad oggi sono stati formati n° 2270 operatori e sono

stati già rilasciati n° 1733 nuovi patentini e rinnovati n° 900 patentini.

C’è anche da dire che il Ministero della Salute risulta attento agli

effetti dei fitosanitari a dimostrazione di questo possiamo citare

l’ultimo Decreto del 21 febbraio 2005 in cui si impone la sospensione,

in via cautelativa, dell’autorizzazione all’immissione in commercio e

all’impiego dei prodotti fitosanitari a base delle sostanze attive

carbendazim e dinocap, in considerazione della classificazione di

queste sostanze attive in categoria 2 di tossicità per la riproduzione

(sono inserite nella categoria 2 tutte le sostanze considerate in grado di

danneggiare la fertilità negli esseri umani, oppure le sostanze che

provocano effetti tossici sullo sviluppo umano) recentemente attribuita

e in attesa della conclusione della sua revisione comunitaria. (GU n.

60 del 14-3-2005). Riguardando la tabella dei prodotti maggiormente

utilizzati nella provincia, insieme a tanti altri sono presenti anche i su

citati prodotti.

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MINISTERO DELLA SALUTE

DECRETO 21 febbraio 2005 Sospensione, in via cautelativa, dell'autorizzazione all'immissione in commercio e all'impiego dei prodotti fitosanitari a base della sostanza attiva dinocap.

IL DIRETTORE GENERALE

della sanita' veterinaria e degli alimenti

Visto l'art. 6 della legge 30 aprile 1962, n. 283, modificato dall'art. 4 della legge 26 febbraio 1963, n. 441, concernente la disciplina igienica degli alimenti; Vista la circolare del Ministero della sanita' 3 settembre 1990, n. 20, concernente «Aspetti applicativi delle norme vigenti in materia di registrazione dei presidi sanitari»; Visti i decreti con i quali i prodotti fitosanitari di cui all'allegato al presente decreto sono stati autorizzati per essere immessi in commercio; Visto il decreto legislativo 30 marzo 2001, n. 165, che detta norme generali sull'ordinamento del lavoro alle dipendenze delle amministrazioni pubbliche; Visto il regolamento (CEE) n. 3600/92, recante disposizioni d'attuazione della prima fase del programma di lavoro di revisione comunitaria delle sostanze attive presenti sul territorio della comunita' europea alla data del 26 luglio 1993, tra le quali e' compresa la sostanza attiva dinocap; Visto il decreto legislativo 17 marzo 1995, n. 194, di attuazione della direttiva n. 91/414/CEE, relativo alla immissione in commercio di prodotti fitosanitari; Vista la circolare del Ministero della sanita' 10 giugno 1995, n. 17, concernente gli aspetti applicativi delle nuove norme in materia di autorizzazione di prodotti fitosanitari; Visto, in particolare, il comma 1, lettera b) dell'art. 4 della citata direttiva n. 91/414/CEE, che stabilisce che un prodotto puo' essere autorizzato solo se, tra l'altro, non produce effetti nocivi in maniera diretta o indiretta sulla salute dell'uomo o degli animali o sulle acque sotterranee;

Visto il decreto legislativo 14 marzo 2003, n. 65, modificato dal decreto legislativo 28 luglio 2004, n. 260, di attuazione delle direttive n. 1999/45/CE e n. 2001/60/CE relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura dei preparati pericolosi; Visto il decreto del Ministro della salute del 14 giugno 2002 di recepimento della direttiva n. 2001/59/CE del 6 agosto 2001, recante il ventottesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva n. 67/548/CEE del 27 giugno 1967 in materia di classificazione, imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose; Visto il paragrafo 4.2 dell'allegato VI del citato decreto ministeriale 14 giugno 2002 e in particolare le definizioni secondo le quali: le «sostanze che dovrebbero essere considerate in grado di danneggiare la fertilita' negli esseri umani» oppure le «sostanze che dovrebbero essere considerate in grado di provocare effetti tossici sullo sviluppo umano» sono classificate in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione, Vista la direttiva n. 2004/73/CE del 29 aprile 2004, che dovra' essere recepita entro il 31 ottobre 2005, recante il ventinovesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva n. 67/548/CEE del 27 giugno 1967 in materia di classificazione, imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose, secondo la quale alla sostanza attiva dinocap e' attribuita la categoria 2 di tossicita' per la riproduzione; Visto l'art. 11 della direttiva n. 91/414/CEE, secondo il quale uno Stato membro puo' limitare o proibire provvisoriamente l'uso e la vendita nel proprio territorio di un prodotto fitosanitario da esso autorizzato se ha motivo valido per ritenere che tale prodotto costituisca un rischio per la salute umana o degli animali o per l'ambiente; Visto l'art. 7 del regolamento (CE) n. 178/2002 che definisce il principio di precauzione secondo il quale, in situazioni di incertezza sul piano scientifico, possono essere adottate misure provvisorie di gestione del rischio necessarie per garantire l'elevato livello di tutela della salute che la Comunita' persegue; Acquisiti i pareri espressi dall'Istituto Superiore di Sanita' in merito alla riclassificazione dei prodotti fitosanitari attualmente autorizzati in Italia in attuazione delle direttive n. 1999/45/CE e n. 2001/60/CE, di cui l'ultimo in data 3 gennaio 2005, secondo i quali i prodotti

fitosanitari contenenti la sostanza attiva dinocap non possono essere commercializzati; Sentita l'impresa titolare della documentazione presentata per la revisione comunitaria della sostanza attiva dinocap, che nell'audizione del 28 aprile 2004 ha rappresentato la propria posizione alla Commissione consultiva per i prodotti fitosanitari di cui all'art. 20 del citato decreto legislativo n.194/1995; Acquisito il parere del 28 aprile 2004 della sopra citata Commissione consultiva che ha comunque proposto l'eliminazione dal commercio dei prodotti fitosanitari contenenti dinocap, in considerazione della classificazione della sostanza attiva in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione; Sentita l'associazione di categoria Agrofarma che nell'audizione del 16 settembre 2004 ha illustrato alla sopra citata Commissione consultiva la posizione delle imprese in merito alle problematiche relative alle sostanze attive di categoria 2 di cancerogenesi, mutagenesi o tossicita' per la riproduzione; Considerato quanto esposto dal Ministro della salute con la nota del 14 luglio 2004 diretta al Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori al fine di definire criteri armonizzati sulla valutazione e la gestione delle problematiche legate ai prodotti fitosanitari contenenti sostanze attive che presentano preoccupazioni di tipo sanitario, anche in applicazione del principio di precauzione; Considerato quanto esposto nella nota del 12 ottobre 2004 dal Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori nella quale, tra l'altro, viene indicato che gli Stati membri possono continuare ad autorizzare prodotti contenenti sostanze attive gia' presenti sul mercato europeo alla data del 26 luglio 1993 in base ai criteri generali di cui al citato art. 4 della direttiva n. 91/414/CEE, in attesa della conclusione della procedura di revisione comunitaria delle sostanze stesse; Acquisito l'ulteriore parere espresso in data 16 dicembre 2004 dall'Istituto Superiore di Sanita' che, tenuto conto delle indicazioni espresse dal Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori e in applicazione del principio di precauzione, ha tra l'altro riaffermato la non ammissibilita' dei prodotti contenenti sostanze attive di categoria 1 o 2 di cancerogenesi, mutagenesi o tossicita' per la riproduzione per le quali e' ancora in corso il processo di revisione comunitaria;

Considerato che non si e' ancora conclusa la revisione comunitaria della sostanza attiva dinocap ai sensi del citato regolamento (CEE) n. 3600/92; Ritenuto di dare applicazione al citato principio di precauzione attraverso l'adozione di misure provvisorie che consentano di raggiungere un elevato livello di tutela della salute; Ritenuto pertanto di dover sospendere, in via cautelativa, l'immissione in commercio e l'impiego di prodotti fitosanitari contenenti la sostanza attiva dinocap, in considerazione della classificazione tossicologica recentemente attribuita e in attesa della conclusione della sua revisione comunitaria;

Decreta: 1. Le autorizzazioni all'immissione in commercio e all'impiego di

tutti i prodotti fitosanitari indicati nell'allegato al presente decreto, contenenti la sostanza attiva dinocap sono sospese in considerazione della attuale classificazione in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione di tale sostanza attiva e in attesa della conclusione della revisione comunitaria.

2. Alle imprese titolari delle autorizzazioni dei prodotti fitosanitari indicati nell'allegato al presente decreto viene concesso un periodo di novanta giorni per provvedere al ritiro delle scorte giacenti sia presso i magazzini che presso gli esercizi di vendita.

3. Le medesime imprese sono tenute ad adottare nei confronti degli utilizzatori ogni iniziativa idonea ad assicurare una corretta informazione in merito ai prodotti fitosanitari di cui trattasi.

Il presente decreto sara' pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana ed entra in vigore il giorno successivo alla sua pubblicazione. Roma, 21 febbraio 2005

Il direttore generale: Marabelli

DECRETO 21 febbraio 2005 Sospensione, in via cautelativa, dell'autorizzazione all'immissione in commercio e all'impiego dei prodotti fitosanitari a base della sostanza attiva carbendazim.

IL DIRETTORE GENERALE

della sanita' veterinaria e degli alimenti

Visto l'art. 6 della legge 30 aprile 1962, n. 283, modificato dall'art. 4 della legge 26 febbraio 1963, n. 441, concernente la disciplina igienica degli alimenti; Vista la circolare del Ministero della sanita' 3 settembre 1990, n. 20, concernente «Aspetti applicativi delle norme vigenti in materia di registrazione dei presidi sanitari»; Visti i decreti con i quali i prodotti fitosanitari di cui all'allegato al presente decreto sono stati autorizzati per essere immessi in commercio; Visto il decreto legislativo 30 marzo 2001, n. 165, che detta norme generali sull'ordinamento del lavoro alle dipendenze delle amministrazioni pubbliche; Visto il regolamento (CEE) n. 3600/92, recante disposizioni d'attuazione della prima fase del programma di lavoro di revisione comunitaria delle sostanze attive presenti sul territorio della comunita' europea alla data del 26 luglio 1993, tra le quali e' compresa la sostanza attiva carbendazim; Visto il decreto legislativo 17 marzo 1995, n. 194, di attuazione della direttiva n. 91/414/CEE, relativo alla immissione in commercio di prodotti fitosanitari; Vista la circolare del Ministero della sanita' 10 giugno 1995, n. 17, concernente gli aspetti applicativi delle nuove norme in materia di autorizzazione di prodotti fitosanitari; Visto, in particolare, il comma 1, lettera b) dell'art. 4 della citata direttiva n. 91/414/CEE, che stabilisce che un prodotto puo' essere autorizzato solo se, tra l'altro, non produce effetti nocivi in maniera diretta o indiretta sulla salute dell'uomo o degli animali o sulle acque sotterranee; Visto il decreto legislativo 14 marzo 2003, n. 65, modificato dal decreto legislativo 28 luglio 2004, n. 260, di attuazione delle direttive n. 1999/45/CE e n. 2001/60/CE relative alla

classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura dei preparati pericolosi; Visto il decreto del Ministro della salute del 14 giugno 2002 di recepimento della direttiva n. 2001/59/CE del 6 agosto 2001, recante il ventottesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva n. 67/548/CEE del 27 giugno 1967 in materia di classificazione, imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose; Visto il paragrafo 4.2 dell'allegato VI del citato decreto ministeriale 14 giugno 2002 e in particolare le definizioni secondo le quali: le «sostanze che dovrebbero essere considerate in grado di danneggiare la fertilita' negli esseri umani» oppure le «sostanze che dovrebbero essere considerate in grado di provocare effetti tossici sullo sviluppo umano» sono classificate in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione, Vista la direttiva n. 2004/73/CE del 29 aprile 2004, che dovra' essere recepita entro il 31 ottobre 2005, recante il ventinovesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva n. 67/548/CEE del 27 giugno 1967 in materia di classificazione, imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose, secondo la quale alla sostanza attiva carbendazim e' attribuita la categoria 2 di tossicita' per la riproduzione; Visto l'art. 11 della direttiva n. 91/414/CEE, secondo il quale uno Stato membro puo' limitare o proibire provvisoriamente l'uso e la vendita nel proprio territorio di un prodotto fitosanitario da esso autorizzato se ha motivo valido per ritenere che tale prodotto costituisca un rischio per la salute umana o degli animali o per l'ambiente; Visto l'art. 7 del regolamento (CE) n. 178/2002 che definisce il principio di precauzione secondo il quale, in situazioni di incertezza sul piano scientifico, possono essere adottate misure provvisorie di gestione del rischio necessarie per garantire l'elevato livello di tutela della salute che la Comunita' persegue; Acquisiti i pareri espressi dall'Istituto Superiore di Sanita' in merito alla riclassificazione dei prodotti fitosanitari attualmente autorizzati in Italia in attuazione delle direttive n. 1999/45/CE e n. 2001/60/CE, di cui l'ultimo in data 3 gennaio 2005, secondo i quali i prodotti fitosanitari contenenti la sostanza attiva carbendazim non possono essere commercializzati; Sentita l'impresa titolare della documentazione presentata per la revisione comunitaria della sostanza attiva carbendazim, che

nell'audizione del 28 aprile 2004 ha rappresentato la propria posizione alla Commissione consultiva per i prodotti fitosanitari di cui all'art. 20 del citato decreto legislativo n.194/1995; Acquisito il parere del 28 aprile 2004 della sopra citata Commissione consultiva che ha comunque proposto l'eliminazione dal commercio dei prodotti fitosanitari contenenti carbendazim, in considerazione della classificazione della sostanza attiva in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione; Sentita l'associazione di categoria Agrofarma che nell'audizione del 16 settembre 2004 ha illustrato alla sopra citata Commissione consultiva la posizione delle imprese in merito alle problematiche relative alle sostanze attive di categoria 2 di cancerogenesi, mutagenesi o tossicita' per la riproduzione; Considerato quanto esposto dal Ministro della salute con la nota del 14 luglio 2004 diretta al Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori al fine di definire criteri armonizzati sulla valutazione e la gestione delle problematiche legate ai prodotti fitosanitari contenenti sostanze attive che presentano preoccupazioni di tipo sanitario, anche in applicazione del principio di precauzione; Considerato quanto esposto nella nota del 12 ottobre 2004 dal Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori nella quale, tra l'altro, viene indicato che gli Stati membri possono continuare ad autorizzare prodotti contenenti sostanze attive gia' presenti sul mercato europeo alla data del 26 luglio 1993 in base ai criteri generali di cui al citato art. 4 della direttiva n. 91/414/CEE, in attesa della conclusione della procedura di revisione comunitaria delle sostanze stesse; Acquisito l'ulteriore parere espresso in data 16 dicembre 2004 dall'Istituto Superiore di Sanita' che, tenuto conto delle indicazioni espresse dal Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori e in applicazione del principio di precauzione, ha tra l'altro riaffermato la non ammissibilita' dei prodotti contenenti sostanze attive di categoria 1 o 2 di cancerogenesi, mutagenesi o tossicita' per la riproduzione per le quali e' ancora in corso il processo di revisione comunitaria; Considerato che non si e' ancora conclusa la revisione comunitaria della sostanza attiva carbendazim ai sensi del citato regolamento (CEE) n. 3600/92;

Ritenuto di dare applicazione al citato principio di precauzione attraverso l'adozione di misure provvisorie che consentano di raggiungere un elevato livello di tutela della salute; Ritenuto pertanto di dover sospendere, in via cautelativa, l'immissione in commercio e l'impiego di prodotti fitosanitari contenenti la sostanza attiva carbendazim, in considerazione della classificazione tossicologica recentemente attribuita e in attesa della conclusione della sua revisione comunitaria;

Decreta: 1. Le autorizzazioni all'immissione in commercio e all'impiego di

tutti i prodotti fitosanitari indicati nell'allegato al presente decreto, contenenti la sostanza attiva carbendazim sono sospese in considerazione della attuale classificazione in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione di tale sostanza attiva e in attesa della conclusione della revisione comunitaria.

2. Alle imprese titolari delle autorizzazioni dei prodotti fitosanitari indicati nell'allegato al presente decreto viene concesso un periodo di novanta giorni per provvedere al ritiro delle scorte giacenti sia presso i magazzini che presso gli esercizi di vendita.

3. Le medesime imprese sono tenute ad adottare nei confronti degli utilizzatori ogni iniziativa idonea ad assicurare una corretta informazione in merito ai prodotti fitosanitari di cui trattasi.

Il presente decreto sara' pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana ed entra in vigore il giorno successivo alla sua pubblicazione. Roma, 21 febbraio 2005

Il direttore generale: Marabelli

Legge 19 febbraio 2004, n. 40

"Norme in materia di procreazione medicalmente assistita" pubblicata nella Gazzetta Ufficiale n. 45 del 24 febbraio 2004

CAPO I PRINCÌPI GENERALI

ART. 1. (Finalità).

1. Al fine di favorire la soluzione dei problemi riproduttivi derivanti dalla sterilità o dalla infertilità umana è consentito il ricorso alla procreazione medicalmente assistita, alle condizioni e secondo le modalità previste dalla presente legge, che assicura i diritti di tutti i soggetti coinvolti, compreso il concepito.

2. Il ricorso alla procreazione medicalmente assistita è consentito qualora non vi siano altri metodi terapeutici efficaci per rimuovere le cause di sterilità o infertilità.

ART. 2. (Interventi contro la sterilità e la infertilità).

1. Il Ministro della salute, sentito il Ministro dell'istruzione, dell'università e della ricerca, può promuovere ricerche sulle cause patologiche, psicologiche, ambientali e sociali dei fenomeni della sterilità e della infertilità e favorire gli interventi necessari per rimuoverle nonché per ridurne l'incidenza, può incentivare gli studi e le ricerche sulle tecniche di crioconservazione dei gameti e può altresí promuovere campagne di informazione e di prevenzione dei fenomeni della sterilità e della infertilità.

2. Per le finalità di cui al comma 1 è autorizzata la spesa massima di 2 milioni di euro a decorrere dal 2004.

3. All'onere derivante dall'attuazione del comma 2 si provvede mediante corrispondente riduzione dello stanziamento iscritto, ai fini del bilancio triennale 2004-2006, nell'ambito dell'unità previsionale di base di parte corrente "Fondo speciale" dello stato di previsione del Ministero dell'economia e delle finanze per l'anno 2004, allo scopo parzialmente utilizzando l'accantonamento relativo al Ministero della salute. Il Ministro dell'economia e delle finanze è autorizzato ad apportare, con propri decreti, le occorrenti variazioni di bilancio.

ART. 3. (Modifica alla legge 29 luglio 1975, n. 405).

1. Al primo comma dell'articolo 1 della legge 29 luglio 1975, n. 405, sono aggiunte, in fine, le seguenti lettere:

"d-bis) l'informazione e l'assistenza riguardo ai problemi della sterilità e della infertilità umana, nonché alle tecniche di procreazione medicalmente assistita; d-ter) l'informazione sulle procedure per l'adozione e l'affidamento familiare". Dall'attuazione del presente articolo non devono derivare nuovi o maggiori oneri a carico della finanza pubblica.

CAPO II ACCESSO ALLE TECNICHE

ART. 4. (Accesso alle tecniche).

1. Il ricorso alle tecniche di procreazione medicalmente assistita è consentito solo quando sia accertata l'impossibilità di rimuovere altrimenti le cause impeditive della procreazione ed è comunque circoscritto ai casi di sterilità o di infertilità inspiegate documentate da atto medico nonché ai casi di sterilità o di infertilità da causa accertata e certificata da atto medico.

2. Le tecniche di procreazione medicalmente assistita sono applicate in base ai seguenti princípi:

a) gradualità, al fine di evitare il ricorso ad interventi aventi un grado di invasività tecnico e psicologico più gravoso per i destinatari, ispirandosi al principio della minore invasività;

b) consenso informato, da realizzare ai sensi dell'articolo 6. 3. È vietato il ricorso a tecniche di procreazione medicalmente

assistita di tipo eterologo. ART. 5.

(Requisiti soggettivi).

1. Fermo restando quanto stabilito dall'articolo 4, comma 1, possono accedere alle tecniche di procreazione medicalmente assistita coppie di maggiorenni di sesso diverso, coniugate o conviventi, in età potenzialmente fertile, entrambi viventi.

ART. 6. (Consenso informato).

1. Per le finalità indicate dal comma 3, prima del ricorso ed in ogni fase di applicazione delle tecniche di procreazione medicalmente assistita il medico informa in maniera dettagliata i soggetti di cui all'articolo 5 sui metodi, sui problemi bioetici e sui possibili effetti collaterali sanitari e psicologici conseguenti all'applicazione delle tecniche stesse, sulle probabilità di successo e sui rischi dalle stesse derivanti, nonché sulle relative conseguenze giuridiche per la donna, per l'uomo e per il nascituro. Alla coppia deve essere prospettata la possibilità di ricorrere a procedure di adozione o di affidamento ai sensi della legge 4 maggio 1983, n. 184, e successive modificazioni, come alternativa alla procreazione medicalmente assistita. Le informazioni di cui al presente comma e quelle concernenti il grado di invasività delle tecniche nei confronti della donna e dell'uomo devono essere fornite per ciascuna delle tecniche applicate e in modo tale da garantire il formarsi di una volontà consapevole e consapevolmente espressa.

2. Alla coppia devono essere prospettati con chiarezza i costi economici dell'intera procedura qualora si tratti di strutture private autorizzate.

3. La volontà di entrambi i soggetti di accedere alle tecniche di procreazione medicalmente assistita è espressa per iscritto congiuntamente al medico responsabile della struttura, secondo modalità definite con decreto dei Ministri della giustizia e della salute, adottato ai sensi dell'articolo 17, comma 3, della legge 23 agosto 1988, n. 400, entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge. Tra la manifestazione della volontà e l'applicazione della tecnica deve intercorrere un termine non inferiore a sette giorni. La volontà può essere revocata da ciascuno dei soggetti indicati dal presente comma fino al momento della fecondazione dell'ovulo.

4. Fatti salvi i requisiti previsti dalla presente legge, il medico responsabile della struttura può decidere di non procedere alla procreazione medicalmente assistita, esclusivamente per motivi di ordine medico-sanitario. In tale caso deve fornire alla coppia motivazione scritta di tale decisione.

5. Ai richiedenti, al momento di accedere alle tecniche di procreazione medicalmente assistita, devono essere esplicitate con

chiarezza e mediante sottoscrizione le conseguenze giuridiche di cui all'articolo 8 e all'articolo 9 della presente legge.

ART. 7. (Linee guida).

1. Il Ministro della salute, avvalendosi dell'Istituto superiore di sanità, e previo parere del Consiglio superiore di sanità, definisce, con proprio decreto, da emanare entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge, linee guida contenenti l'indicazione delle procedure e delle tecniche di procreazione medicalmente assistita.

2. Le linee guida di cui al comma 1 sono vincolanti per tutte le strutture autorizzate.

3. Le linee guida sono aggiornate periodicamente, almeno ogni tre anni, in rapporto all'evoluzione tecnico-scientifica, con le medesime procedure di cui al comma 1.

CAPO III DISPOSIZIONI CONCERNENTI LA TUTELA DEL NASCITURO

ART. 8. (Stato giuridico del nato).

1. I nati a seguito dell'applicazione delle tecniche di procreazione medicalmente assistita hanno lo stato di figli legittimi o di figli riconosciuti della coppia che ha espresso la volontà di ricorrere alle tecniche medesime ai sensi dell'articolo 6.

ART. 9. (Divieto del disconoscimento della paternità e dell'anonimato della

madre). 1. Qualora si ricorra a tecniche di procreazione medicalmente assistita

di tipo eterologo in violazione del divieto di cui all'articolo 4, comma 3, il coniuge o il convivente il cui consenso è ricavabile da atti concludenti non può esercitare l'azione di disconoscimento della paternità nei casi previsti dall'articolo 235, primo comma, numeri 1) e 2), del codice civile, né l'impugnazione di cui all'articolo 263 dello stesso codice.

2. La madre del nato a seguito dell'applicazione di tecniche di procreazione medicalmente assistita non può dichiarare la volontà di non essere nominata, ai sensi dell'articolo 30, comma 1, del regolamento di cui al decreto del Presidente della Repubblica 3 novembre 2000, n. 396.

3. In caso di applicazione di tecniche di tipo eterologo in violazione del divieto di cui all'articolo 4, comma 3, il donatore di gameti non acquisisce alcuna relazione giuridica parentale con il nato e non può far valere nei suoi confronti alcun diritto né essere titolare di obblighi.

CAPO IV REGOLAMENTAZIONE DELLE STRUTTURE AUTORIZZATE ALL'APPLICAZIONE DELLE TECNICHE DI PROCREAZIONE

MEDICALMENTE ASSISTITA ART. 10.

(Strutture autorizzate). 1. Gli interventi di procreazione medicalmente assistita sono

realizzati nelle strutture pubbliche e private autorizzate dalle regioni e iscritte al registro di cui all'articolo 11.

2. Le regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano definiscono con proprio atto, entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge:

a) i requisiti tecnico-scientifici e organizzativi delle strutture; b) le caratteristiche del personale delle strutture; c) i criteri per la determinazione della durata delle autorizzazioni e dei

casi di revoca delle stesse; d) i criteri per lo svolgimento dei controlli sul rispetto delle

disposizioni della presente legge e sul permanere dei requisiti tecnico-scientifici e organizzativi delle strutture.

ART. 11. (Registro).

1. È istituito, con decreto del Ministro della salute, presso l'Istituto superiore di sanità, il registro nazionale delle strutture autorizzate all'applicazione delle tecniche di procreazione medicalmente assistita, degli embrioni formati e dei nati a seguito dell'applicazione delle tecniche medesime.

2. L'iscrizione al registro di cui al comma 1 è obbligatoria. 3. L'Istituto superiore di sanità raccoglie e diffonde, in collaborazione

con gli osservatori epidemiologici regionali, le informazioni necessarie al fine di consentire la trasparenza e la pubblicità delle tecniche di procreazione medicalmente assistita adottate e dei risultati conseguiti.

4. L'Istituto superiore di sanità raccoglie le istanze, le informazioni, i suggerimenti, le proposte delle società scientifiche e degli utenti riguardanti la procreazione medicalmente assistita.

5. Le strutture di cui al presente articolo sono tenute a fornire agli osservatori epidemiologici regionali e all'Istituto superiore di sanità i dati necessari per le finalità indicate dall'articolo 15 nonché ogni altra informazione necessaria allo svolgimento delle funzioni di controllo e di ispezione da parte delle autorità competenti.

6. All'onere derivante dall'attuazione del presente articolo, determinato nella misura massima di 154.937 euro a decorrere dall'anno 2004, si provvede mediante corrispondente riduzione dello stanziamento iscritto, ai fini del bilancio triennale 2004-2006, nell'ambito dell'unità previsionale di base di parte corrente "Fondo speciale" dello stato di previsione del Ministero dell'economia e delle finanze per l'anno 2004, allo scopo parzialmente utilizzando l'accantonamento relativo al Ministero della salute. Il Ministro dell'economia e delle finanze è autorizzato ad apportare, con propri decreti, le occorrenti variazioni di bilancio.

CAPO V DIVIETI E SANZIONI

ART. 12. (Divieti generali e sanzioni).

1. Chiunque a qualsiasi titolo utilizza a fini procreativi gameti di soggetti estranei alla coppia richiedente, in violazione di quanto previsto dall'articolo 4, comma 3, è punito con la sanzione amministrativa pecuniaria da 300.000 a 600.000 euro.

2. Chiunque a qualsiasi titolo, in violazione dell'articolo 5, applica tecniche di procreazione medicalmente assistita a coppie i cui componenti non siano entrambi viventi o uno dei cui componenti sia minorenne ovvero che siano composte da soggetti dello stesso sesso o non coniugati o non conviventi è punito con la sanzione amministrativa pecuniaria da 200.000 a 400.000 euro.

3. Per l'accertamento dei requisiti di cui al comma 2 il medico si avvale di una dichiarazione sottoscritta dai soggetti richiedenti. In caso di dichiarazioni mendaci si applica l'articolo 76, commi 1 e 2, del testo unico delle disposizioni legislative e regolamentari in materia di documentazione amministrativa, di cui al decreto del Presidente della Repubblica 28 dicembre 2000, n. 445.

4. Chiunque applica tecniche di procreazione medicalmente assistita senza avere raccolto il consenso secondo le modalità di cui all'articolo 6 è punito con la sanzione amministrativa pecuniaria da 5.000 a 50.000 euro.

5. Chiunque a qualsiasi titolo applica tecniche di procreazione medicalmente assistita in strutture diverse da quelle di cui all'articolo 10 è punito con la sanzione amministrativa pecuniaria da 100.000 a 300.000 euro.

6. Chiunque, in qualsiasi forma, realizza, organizza o pubblicizza la commercializzazione di gameti o di embrioni o la surrogazione di maternità è punito con la reclusione da tre mesi a due anni e con la multa da 600.000 a un milione di euro.

7. Chiunque realizza un processo volto ad ottenere un essere umano discendente da un'unica cellula di partenza, eventualmente identico, quanto al patrimonio genetico nucleare, ad un altro essere umano in vita o morto, è punito con la reclusione da dieci a venti anni e con la multa da 600.000 a un milione di euro. Il medico è punito, altresí, con l'interdizione perpetua dall'esercizio della professione.

8. Non sono punibili l'uomo o la donna ai quali sono applicate le tecniche nei casi di cui ai commi 1, 2, 4 e 5.

9. È disposta la sospensione da uno a tre anni dall'esercizio professionale nei confronti dell'esercente una professione sanitaria condannato per uno degli illeciti di cui al presente articolo, salvo quanto previsto dal comma 7.

10. L'autorizzazione concessa ai sensi dell'articolo 10 alla struttura al cui interno è eseguita una delle pratiche vietate ai sensi del presente articolo è sospesa per un anno. Nell'ipotesi di più violazioni dei divieti di cui al presente articolo o di recidiva l'autorizzazione può essere revocata.

CAPO VI MISURE DI TUTELA DELL'EMBRIONE

ART. 13. (Sperimentazione sugli embrioni umani).

1. È vietata qualsiasi sperimentazione su ciascun embrione umano. 2. La ricerca clinica e sperimentale su ciascun embrione umano è

consentita a condizione che si perseguano finalità esclusivamente terapeutiche e diagnostiche ad essa collegate volte alla tutela della

salute e allo sviluppo dell'embrione stesso, e qualora non siano disponibili metodologie alternative.

3. Sono, comunque, vietati: a) la produzione di embrioni umani a fini di ricerca o di

sperimentazione o comunque a fini diversi da quello previsto dalla presente legge;

b) ogni forma di selezione a scopo eugenetico degli embrioni e dei gameti ovvero interventi che, attraverso tecniche di selezione, di manipolazione o comunque tramite procedimenti artificiali, siano diretti ad alterare il patrimonio genetico dell'embrione o del gamete ovvero a predeterminarne caratteristiche genetiche, ad eccezione degli interventi aventi finalità diagnostiche e terapeutiche, di cui al comma 2 del presente articolo;

c) interventi di clonazione mediante trasferimento di nucleo o di scissione precoce dell'embrione o di ectogenesi sia a fini procreativi sia di ricerca;

d) la fecondazione di un gamete umano con un gamete di specie diversa e la produzione di ibridi o di chimere.

4. La violazione dei divieti di cui al comma 1 è punita con la reclusione da due a sei anni e con la multa da 50.000 a 150.000 euro. In caso di violazione di uno dei divieti di cui al comma 3 la pena è aumentata. Le circostanze attenuanti concorrenti con le circostanze aggravanti previste dal comma 3 non possono essere ritenute equivalenti o prevalenti rispetto a queste.

5. È disposta la sospensione da uno a tre anni dall'esercizio professionale nei confronti dell'esercente una professione sanitaria condannato per uno degli illeciti di cui al presente articolo.

ART. 14. (Limiti all'applicazione delle tecniche sugli embrioni).

1. È vietata la crioconservazione e la soppressione di embrioni, fermo restando quanto previsto dalla legge 22 maggio 1978, n. 194.

2. Le tecniche di produzione degli embrioni, tenuto conto dell'evoluzione tecnico-scientifica e di quanto previsto dall'articolo 7, comma 3, non devono creare un numero di embrioni superiore a quello strettamente necessario ad un unico e contemporaneo impianto, comunque non superiore a tre.

3. Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa

allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione è consentita la crioconservazione degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento, da realizzare non appena possibile.

4. Ai fini della presente legge sulla procreazione medicalmente assistita è vietata la riduzione embrionaria di gravidanze plurime, salvo nei casi previsti dalla legge 22 maggio 1978, n. 194.

5. I soggetti di cui all'articolo 5 sono informati sul numero e, su loro richiesta, sullo stato di salute degli embrioni prodotti e da trasferire nell'utero.

6. La violazione di uno dei divieti e degli obblighi di cui ai commi precedenti è punita con la reclusione fino a tre anni e con la multa da 50.000 a 150.000 euro.

7. È disposta la sospensione fino ad un anno dall'esercizio professionale nei confronti dell'esercente una professione sanitaria condannato per uno dei reati di cui al presente articolo.

8. È consentita la crioconservazione dei gameti maschile e femminile, previo consenso informato e scritto.

9. La violazione delle disposizioni di cui al comma 8 è punita con la sanzione amministrativa pecuniaria da 5.000 a 50.000 euro.

CAPO VII DISPOSIZIONI FINALI E TRANSITORIE

ART. 15. (Relazione al Parlamento).

1. L'Istituto superiore di sanità predispone, entro il 28 febbraio di ciascun anno, una relazione annuale per il Ministro della salute in base ai dati raccolti ai sensi dell'articolo 11, comma 5, sull'attività delle strutture autorizzate, con particolare riferimento alla valutazione epidemiologica delle tecniche e degli interventi effettuati.

2. Il Ministro della salute, sulla base dei dati indicati al comma 1, presenta entro il 30 giugno di ogni anno una relazione al Parlamento sull'attuazione della presente legge.

ART. 16. (Obiezione di coscienza).

1. Il personale sanitario ed esercente le attività sanitarie ausiliarie non è tenuto a prendere parte alle procedure per l'applicazione delle tecniche di procreazione medicalmente assistita disciplinate dalla presente legge quando sollevi obiezione di coscienza con preventiva dichiarazione. La dichiarazione dell'obiettore deve essere comunicata entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge al direttore dell'azienda unità sanitaria locale o dell'azienda ospedaliera, nel caso di personale dipendente, al direttore sanitario, nel caso di personale dipendente da strutture private autorizzate o accreditate.

2. L'obiezione può essere sempre revocata o venire proposta anche al di fuori dei termini di cui al comma 1, ma in tale caso la dichiarazione produce effetto dopo un mese dalla sua presentazione agli organismi di cui al comma 1.

3. L'obiezione di coscienza esonera il personale sanitario ed esercente le attività sanitarie ausiliarie dal compimento delle procedure e delle attività specificatamente e necessariamente dirette a determinare l'intervento di procreazione medicalmente assistita e non dall'assistenza antecedente e conseguente l'intervento.

ART. 17. (Disposizioni transitorie).

1. Le strutture e i centri iscritti nell'elenco predisposto presso l'Istituto superiore di sanità ai sensi dell'ordinanza del Ministro della sanità del 5 marzo 1997, pubblicata nella Gazzetta Ufficiale n. 55 del 7 marzo 1997, sono autorizzati ad applicare le tecniche di procreazione medicalmente assistita, nel rispetto delle disposizioni della presente legge, fino al nono mese successivo alla data di entrata in vigore della presente legge.

2. Entro trenta giorni dalla data di entrata in vigore della presente legge, le strutture e i centri di cui al comma 1 trasmettono al Ministero della salute un elenco contenente l'indicazione numerica degli embrioni prodotti a seguito dell'applicazione di tecniche di procreazione medicalmente assistita nel periodo precedente la data di entrata in vigore della presente legge, nonché, nel rispetto delle vigenti disposizioni sulla tutela della riservatezza dei dati personali, l'indicazione nominativa di coloro che hanno fatto ricorso alle tecniche medesime a seguito delle quali sono stati formati gli embrioni. La violazione della disposizione del presente comma è

punita con la sanzione amministrativa pecuniaria da 25.000 a 50.000 euro.

3. Entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge il Ministro della salute, avvalendosi dell'Istituto superiore di sanità, definisce, con proprio decreto, le modalità e i termini di conservazione degli embrioni di cui al comma 2.

ART. 18.

(Fondo per le tecniche di procreazione medicalmente assistita).

1. Al fine di favorire l'accesso alle tecniche di procreazione medicalmente assistita da parte dei soggetti di cui all'articolo 5, presso il Ministero della salute è istituito il Fondo per le tecniche di procreazione medicalmente assistita. Il Fondo è ripartito tra le regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano sulla base di criteri determinati con decreto del Ministro della salute, da emanare entro sessanta giorni dalla data di entrata in vigore della presente legge, sentita la Conferenza permanente per i rapporti tra lo Stato, le regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano.

2. Per la dotazione del Fondo di cui al comma 1 è autorizzata la spesa di 6,8 milioni di euro a decorrere dall'anno 2004.

3. All'onere derivante dall'attuazione del presente articolo si provvede mediante corrispondente riduzione dello stanziamento iscritto, ai fini del bilancio triennale 2004-2006, nell'ambito dell'unità previsionale di base di parte corrente "Fondo speciale" dello stato di previsione del Ministero dell'economia e delle finanze per l'anno 2004, allo scopo parzialmente utilizzando l'accantonamento relativo al Ministero medesimo. Il Ministro dell'economia e delle finanze è autorizzato ad apportare, con propri decreti, le occorrenti variazioni di bilancio.

CARATTERISTICHE PAZIENTI RECATISI AL CENTRO NELL'ANNO 2004/2005

Pazienti Professione Diagnosi Età N° Spz Tot. Mobili A Morfologia N Numerica Cinetica Morfologica

1 Serricoltore Pato 41 12 3 35 1 1 0

2 Serricoltore Pato 37 16 9 12 1 1 1

3 Serricoltore Pato 42 2 0 31 1 1 0

4 Operaio Pato 27 7 4 9 1 1 1

5 Professionista Pato 32 13 2 26 1 1 1

6 Altro Pato 33 32 12 15 0 0 1

7 Impiegato Normo 45 57 13 35 0 0 0

8 Operaio Pato 45 0 0 0 1 1 1

9 Serricoltore Pato 41 4 0 29 1 1 1

10 Serricoltore Normo 27 54 20 37 0 0 0

11 Impiegato Pato 34 31 4 24 0 1 1

12 Operaio Normo 30 38 12 35 0 0 0

13 Professionista Pato 32 22 9 36 0 1 0

14 Serricoltore Pato 33 1 0 13 1 2 1

15 Altro Pato 27 22 18 15 0 0 1

16 Serricoltore Pato 35 33 10 15 0 0 1

17 Serricoltore Pato 33 4 1 7 1 1 1

18 Serricoltore Normo 25 22 10 36 0 0 0

19 Serricoltore Pato 31 6 2 12 1 1 1

20 Commerciante Pato 35 2 1 30 1 1 1

21 Operaio Normo 27 22 10 34 0 0 0

22 Professionista Pato 36 24 7 27 0 1 1

23 Impiegato Pato 39 15 4 43 1 1 0

24 Professionista Normo 31 29 20 31 0 0 0

25 Professionista Pato 37 22 4 28 0 1 1

26 Serricoltore Pato 34 33 4 32 0 1 0

27 Impiegato Pato 33 0 0 0 2 2 1

28 Operaio Pato 32 22 9 34 0 1 0

29 Impiegato Pato 32 18 4 40 1 1 0

30 Operaio Normo 30 42 17 35 0 0 0

31 Operaio Pato 32 13 6 36 1 1 0

32 Operaio Normo 42 49 11 32 0 0 0

33 Professionista Normo 42 42 15 31 0 0 0

34 Impiegato Normo 28 54 16 36 0 0 0

35 Operaio Pato 34 20 3 35 0 1 0

36 Commerciante Pato 29 0 0 0 2 2 1

37 Operaio Pato 42 4 0 18 1 1 1

38 Operaio Pato 31 9 2 15 1 1 1

39 Operaio Normo 33 33 11 32 0 0 0

40 Serricoltore Pato 43 3 2 34 1 1 0

41 Serricoltore Normo 32 52 14 35 0 0 0

42 Professionista Pato 39 22 2 31 0 1 0

43 Serricoltore Pato 43 7 2 15 1 1 1

44 Serricoltore Pato 31 15 8 12 1 1 1

45 Professionista Pato 36 6 3 34 1 1 0

46 Impiegato Normo 53 48 16 31 0 0 0

47 Impiegato Normo 17 53 22 40 0 0 0

48 Operaio Pato 36 28 17 25 0 0 1

49 Impiegato Normo 37 38 15 38 0 0 0

50 Operaio Pato 25 12 9 15 1 1 1

51 Operaio Pato 53 2 1 12 1 1 1

52 Operaio Pato 38 22 6 32 0 1 0

53 Professionista Normo 35 27 13 35 0 0 0

54 Serricoltore Pato 32 10 1 20 1 1 1

55 Impiegato Pato 28 8 4 36 1 1 0

56 Commerciante Pato 33 8 2 30 1 1 1

57 Operaio Pato 30 9 1 25 1 1 1

58 Serricoltore Pato 30 14 3 27 1 1 1

59 Serricoltore Pato 27 10 3 8 1 1 1

60 Altro Pato 32 37 16 10 0 0 1

61 Professionista Normo 36 51 21 37 0 0 0

62 Serricoltore Pato 37 0 0 0 2 2 1

63 Serricoltore Normo 32 41 15 34 0 0 0

64 Commerciante Pato 41 0 0 0 2 2 1

65 Operaio Pato 30 7 2 31 1 1 0

66 Serricoltore Pato 42 0 0 0 2 2 1

67 Operaio Normo 39 35 10 36 0 0 0

68 Operaio Pato 29 34 5 39 0 1 0

69 Serricoltore Pato 35 17 7 5 1 1 1

70 Impiegato Normo 36 53 19 38 0 0 0

71 Operaio Normo 27 49 18 36 0 0 0

72 Serricoltore Pato 30 0 0 0 1 2 1

73 Impiegato Pato 35 40 2 31 0 1 0

74 Operaio Pato 37 7 3 36 1 1 0

75 Commerciante Pato 33 22 7 30 0 1 1

76 Serricoltore Normo 41 28 20 35 0 0 0

77 Altro Normo 35 38 20 33 0 0 0

78 Commerciante Pato 45 0 0 0 1 2 1

79 Operaio Pato 27 12 1 30 1 1 1

80 Professionista Pato 31 3 1 11 1 1 1

81 Serricoltore Pato 29 39 10 19 0 0 1

82 Operaio Pato 33 18 1 32 1 1 0

83 Operaio Pato 31 0 0 0 1 1 1

84 Commerciante Normo 25 35 19 34 0 0 0

85 Impiegato Pato 37 44 5 34 0 1 0

86 Commerciante Normo 27 56 15 36 0 0 0

87 Operaio Normo 29 47 10 38 0 0 0

88 Serricoltore Pato 34 11 3 5 1 1 1

89 Operaio Normo 49 58 15 31 0 0 0

90 Impiegato Pato 33 7 2 22 1 1 1

91 Operaio Normo 20 33 12 35 0 0 0

92 Impiegato Pato 32 26 6 30 0 1 1

93 Operaio Normo 46 59 22 38 0 0 0

94 Altro Pato 22 19 4 5 1 1 1

95 Impiegato Pato 38 22 2 41 0 1 0

96 Serricoltore Pato 28 16 7 10 1 1 1

97 Operaio Pato 40 22 4 35 0 1 0

98 Operaio Pato 39 51 12 19 0 0 1

99 Operaio Normo 34 43 12 32 0 0 0

100 Operaio Normo 32 59 24 35 0 0 0

101 Serricoltore Normo 29 22 12 40 0 0 0

102 Impiegato Pato 34 1 1 10 1 1 1

103 Commerciante Normo 40 45 15 37 0 0 0

104 Impiegato Pato 47 3 1 31 1 1 0

105 Serricoltore Pato 28 6 2 18 1 1 1

106 Commerciante Pato 37 0 0 0 2 2 1

107 Operaio Pato 38 2 1 32 1 1 0

108 Serricoltore Pato 41 27 11 26 0 0 1

109 Serricoltore Normo 31 43 19 34 0 0 0

110 Operaio Pato 31 6 2 17 1 1 1

111 Impiegato Normo 31 51 21 33 0 0 0

112 Professionista Pato 35 27 5 30 0 1 1

113 Impiegato Pato 40 8 3 34 1 1 0

114 Commerciante Normo 39 36 12 35 0 0 0

115 Serricoltore Pato 32 14 3 5 1 1 1

116 Serricoltore Pato 32 0 0 0 2 2 1

117 Operaio Pato 30 34 0 8 0 1 1

118 Altro Pato 28 22 5 8 0 1 1

119 Operaio Pato 42 29 9 32 0 1 0

120 Serricoltore Pato 34 6 1 10 1 1 1

121 Serricoltore Pato 29 17 6 40 1 1 0

122 Serricoltore Pato 31 29 7 9 0 1 1

123 Commerciante Normo 32 39 10 35 0 0 0

124 Operaio Pato 30 35 9 10 0 1 1

125 Serricoltore Pato 27 22 13 30 0 0 1

126 Professionista Pato 36 33 6 25 0 1 1

127 Serricoltore Pato 32 11 8 20 1 1 1

128 Commerciante Normo 28 53 17 32 0 0 0

129 Commerciante Normo 32 38 10 34 0 0 0

130 Serricoltore Normo 39 47 18 33 0 0 0

131 Serricoltore Pato 21 19 2 25 1 1 1

132 Operaio Normo 32 58 21 37 0 0 0

133 Altro Pato 25 31 11 8 0 0 1

Asimmetria età 0,46

Asimmetria Numerica 0,34

Asimmetria Cinetica 0,62

Asimmetria Morfologica -0,72

Conteggio di Condizione Professione

Condizione Altro Commerciante Impiegato Operaio Professionista Serricoltore Totale complessivo

Normo 1 7 7 14 4 8 41

Pato 6 7 13 25 9 32 92

Totale complessivo 7 14 20 39 13 40 133

Altre Profess Serricoltore

Normo 33 8

Pato 60 32

Totale 93 40

GRUPPO DI CONTROLLO

Pazienti Professione Diagnosi Età N° Spz Tot. Mobili A Morfologia N Numerica Cinetica Morfologica

1 Impiegato Normo 35 60 20 34 0 0 0

2 Serricoltore Normo 23 45 15 33 0 0 0

3 Operaio Normo 30 65 30 34 0 0 0

4 Altro Normo 35 30 11 35 0 0 0

5 Commerciante Normo 25 90 38 35 0 0 0

6 Operaio Normo 31 115 40 34 0 0 0

7 Professionista Normo 40 25 11 33 0 0 0

8 Impiegato Pato 30 31 16 27 0 0 1

9 Serricoltore Pato 27 35 12 28 0 0 1

10 Operaio Normo 45 100 27 34 0 0 0

11 Professionista Pato 36 18 11 35 1 0 0

12 Impiegato Pato 42 150 50 28 0 0 1

13 Impiegato Normo 29 54 15 36 0 0 0

14 Impiegato Normo 24 110 30 34 0 0 0

15 Altro Normo 32 26 11 37 0 0 0

16 Serricoltore Normo 25 120 40 32 0 0 0

17 Operaio Normo 30 43 15 35 0 0 0

18 Operaio Normo 37 90 20 40 0 0 0

19 Commerciante Normo 27 30 16 33 0 0 0

20 Impiegato Normo 37 105 30 32 0 0 0

21 Impiegato Normo 31 70 27 39 0 0 0

22 Commerciante Pato 33 19 10 35 1 0 0

23 Professionista Normo 35 85 18 34 0 0 0

24 Operaio Normo 40 135 24 36 0 0 0

Tabella Pivot

Conteggio di Condizione Professione

% Patologici 20,83

Condizione Altro Commerciante Impiegato Operaio Professionista Serricoltore Totale

complessivo % Normo 79,17

Normo 2 2 5 6 2 2 19

Pato 0 1 2 0 1 1 5 Totale complessivo 2 3 7 6 3 3 24

PAZIENTE ETA' DIAGNOSI PROFESSIONE MOT(a+b) A FRESCO

MOT(a+b) DOPO SCONG

MOT( c ) A FRESCO

MOT( c ) DOPO SCONG

SOPRAV (a+b)

SOPRAV ( c )

1 30 A Impiegato 10,0% 5,2% 47,5% 8,1% 52,0% 17,1%

7 38 O/A Serricoltore 4,9% 2,9% 54,7% 7,2% 58,7% 13,2%

9 24 A/T Operaio 11,1% 4,3% 43,7% 15,9% 39,0% 36,5%

14 64 A/T Altro 3,2% 0,0% 15,6% 0,0% 0,0% 0,0%

17 36 O/A/T Impiegato 6,5% 0,0% 38,7% 0,0% 0,0% 0,0%

12 36 A/T Serricoltore 20,3% 3,1% 7,2% 1,4% 15,1% 18,8%

19 40 A Commerciante 13,7% 7,0% 20,3% 4,7% 51,1% 23,0%

21 34 O/A Operaio 13,9% 9,1% 37,0% 22,7% 65,5% 61,4%

5 41 A/T Serricoltore 32,0% 4,2% 54,0% 6,3% 13,0% 11,6%

24 48 A/T Impiegato 3,9% 1,0% 50,4% 3,1% 26,1% 6,1%

37 44 O/A/T Serricoltore 22,2% 0,0% 40,7% 0,0% 0,0% 0,0%

41 32 A/T Impiegato 16,4% 3,7% 53,6% 6,0% 22,4% 11,3%

22 43 A Professionista 14,0% 2,7% 54,0% 8,1% 19,2% 14,9%

48 34 O/A/T Operaio 13,3% 5,3% 52,0% 6,7% 40,0% 12,8%

44 40 A Serricoltore 4,3% 1,4% 50,8% 5,7% 32,7% 11,1%

2 37 A/T Impiegato 11,7% 2,8% 21,5% 2,5% 23,9% 11,7%

50 29 O/A/T Serricoltore 11,4% 3,3% 37,1% 7,7% 29,0% 20,8%

46 40 A/T Impiegato 15,5% 2,4% 21,1% 2,9% 15,6% 13,8%

31 56 O/A Operaio 45,5% 13,0% 18,2% 0,0% 28,7% 0,0%

11 33 O/A Operaio 35,0% 20,1% 50,0% 19,1% 57,5% 38,3%

40 43 O/A/T Serricoltore 0,0% 0,0% 7,7% 0,0% 0% 0,0%

23 37 O/A/T Professionista 16,4% 7,3% 24,6% 8,1% 44,3% 32,8%

25 25 A/T Operaio 13,4% 4,0% 44,6% 11,1% 29,9% 25,0%

47 33 O/A Commerciante 17,0% 2,5% 34,1% 6,3% 14,7% 18,3%

20 34 N Serricoltore 57,6% 26,5% 20,1% 7,2% 46,0% 35,5%

49 36 N Impiegato 50,2% 22,0% 15,2% 6,4% 43,8% 42,5%

29 30 N Professionista 51,1% 30,2% 34,0% 15,1% 59,2% 44,4%

4 30 N Operaio 53,4% 20,4% 31,4% 10,0% 38,2% 32,0%

27 47 N Impiegato 47,1% 17,1% 33,3% 8,6% 36,4% 25,7%

16 36 N Operaio 54,1% 25,2% 29,2% 11,1% 46,6% 38,2%

38 37 N Altro 82,4% 43,1% 11,0% 4,0% 52,2% 36,8%

30 30 N Commerciante 80,0% 42,1% 14,0% 4,8% 52,7% 34,4%

42 30 N Impiegato 50,8% 10,7% 15,9% 1,7% 21,0% 10,5%

10 32 N Impiegato 54,9% 23,5% 31,3% 10,9% 42,8% 34,9%

32 39 N Professionista 88,6% 38,4% 5,1% 1,3% 43,4% 24,8%

36 27 N Impiegato 33,5% 13,3% 41,6% 11,9% 39,8% 28,6%

39 32 N Operaio 65,1% 17,7% 21,7% 4,3% 27,2% 19,6%

3 25 N Serricoltore 80,6% 18,0% 14,8% 1,9% 22,4% 12,7%

34 57 N Operaio 44,6% 23,2% 23,2% 9,3% 52,0% 40,1%

45 42 N Operaio 70,3% 32,3% 21,1% 7,8% 46,0% 37,1%

35 29 N Impiegato 41,8% 10,7% 21,7% 7,2% 25,5% 33,2%

8 32 N Altro 36,8% 0,0% 8,1% 0,0% 0,0% 0,0%

43 35 N Serricoltore 49,1% 19,9% 21,4% 8,5% 40,5% 39,8%

33 30 N Operaio 59,6% 27,6% 12,8% 3,2% 46,4% 25,1%

15 39 N Commerciante 37,3% 8,5% 13,6% 2,0% 22,9% 14,7%

28 27 N Operaio 60,8% 33,6% 29,1% 12,0% 55,2% 41,2%

6 27 N Serricoltore 45,9% 2,2% 17,6% 0,9% 4,8% 5,0%

51 31 N Professionista 71,1% 33,4% 10,0% 2,5% 47,0% 25,1%

18 20 N Impiegato 37,9% 17,2% 27,0% 7,9% 45,4% 29,3%

26 25 N Operaio 71,2% 40,5% 20,1% 6,4% 56,9% 32,0%

13 35 N Altro 59,4% 28,7% 9,8% 1,5% 48,4% 15,7%

1 2 3

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 4,0 1,9 13 3,1 100,0 22,2

Mob. non Progressivi ( c ) 19,0 3,0 24 2,8 18,3 2,3

Immobili ( d ) 17,0 32,0 74,5 105,2 5,7 98,6

Spermatozooi Totali 40,0 36,9 112 111 124,0 123,1

Motilità% (a+b) 10,0% 5,2% 11,7% 2,8% 80,6% 18,0%

Motilità% ( c ) 47,5% 8,1% 21,5% 2,5% 14,8% 1,9%

4 5 6

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 35 13,2 16,0 2,0 10,2 0,5

Mob. non Progressivi ( c ) 20,6 6,5 27,0 3,0 3,9 0,2

Immobili ( d ) 10 45 7,0 43,0 8,1 22,0

Spermatozooi Totali 66 65 50,0 48,0 22,2 22,7

Motilità% (a+b) 53,4% 20,4% 32,0% 4,2% 45,9% 2,2%

Motilità% ( c ) 31,4% 10,0% 54,0% 6,3% 17,6% 0,9% 7 8 9

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 1,2 0,6 10,0 0,0 14,0 5,5

Mob. non Progressivi ( c ) 13,3 1,5 2,2 0,0 55,0 20,2

Immobili ( d ) 9,8 18,6 15,0 27,0 57,0 101,2

Spermatozooi Totali 24,3 20,7 27,2 27,0 126,0 126,9

Motilità% (a+b) 4,9% 2,9% 36,8% 0,0% 11,1% 4,3%

Motilità% ( c ) 54,7% 7,2% 8,1% 0,0% 43,7% 15,9%

10 11 12

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 20 8,6 70 40 5,6 0,9 Mob. non Progressivi

( c ) 11,4 4 100 38 2,0 0,4

Immobili ( d ) 5 24 30 120,6 20,0 28,0

Spermatozooi Totali 36 37 200 199 27,6 29,3

Motilità% (a+b) 54,9% 23,5% 35,0% 20,1% 20,3% 3,1%

Motilità% ( c ) 31,3% 10,9% 50,0% 19,1% 7,2% 1,4% 13 14 15

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 15,8 7,5 2,7 0,0 19,0 4,3 Mob. non Progressivi

( c ) 2,6 0,4

13,0 0,0 6,9 1,0

Immobili ( d ) 8,2 18,2 67,5 80,0 25,0 45,0

Spermatozooi Totali 26,6 26,1 83,2 80,0 50,9 50,3

Motilità% (a+b) 59,4% 28,7% 3,2% 0,0% 37,3% 8,5%

Motilità% ( c ) 9,8% 1,5% 15,6% 0,0% 13,6% 2,0% 16 17 18

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 20,0 9,5 1,0 0,0 27 12

Mob. non Progressivi

( c ) 10,8 4,2 6,0 0,0

19,2 5,5

Immobili ( d ) 6,2 24,0 8,5 15,0 25 52,2

Spermatozooi Totali 37,0 37,7 15,5 15,0 71 70

Motilità% (a+b) 54,1% 25,2% 6,5% 0,0% 37,9% 17,2%

Motilità% ( c ) 29,2% 11,1% 38,7% 0,0% 27,0% 7,9%

19 20 21 Lettura a

fresco Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 15,5 7,5 40 18,5 1,5 1,0

Mob. non Progressivi ( c ) 23,0 5,0 14 5 4,0 2,5

Immobili ( d ) 75,0 95,0 15,5 46,4 5,3 7,5

Spermatozooi Totali 113,5 107,5 70 70 10,8 11,0

Motilità% (a+b) 13,7% 7,0% 57,6% 26,5% 13,9% 9,1%

Motilità% ( c ) 20,3% 4,7% 20,1% 7,2% 37,0% 22,7%

22 23 24

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 8 1,5 4 1,8 3,8 1,0

Mob. non Progressivi ( c ) 30,8 4,5 6 2 48,5 3,0

Immobili ( d ) 18,2 49,8 14,4 21 44,0 93,0

Spermatozooi Totali 57 56 24 25 96,3 97,0

Motilità% (a+b) 14,0% 2,7% 16,4% 7,3% 3,9% 1,0%

Motilità% ( c ) 54,0% 8,1% 24,6% 8,1% 50,4% 3,1%

25 26 27

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 15,0 4,5 160,0 90,0 12,0 4,2

Mob. non Progressivi ( c ) 50,0 12,5 45,2 14,3 8,5 2,1

Immobili ( d ) 47,0 95,2 19,6 118,0 5,0 18,2

Spermatozooi Totali 112,0 112,2 224,8 222,3 25,5 24,5

Motilità% (a+b) 13,4% 4,0% 71,2% 40,5% 47,1% 17,1%

Motilità% ( c ) 44,6% 11,1% 20,1% 6,4% 33,3% 8,6%

28 29 30

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 180 86,2 120,0 70,0 80,0 42,0 Mob. non Progressivi

( c ) 86,2 30,8 80,0 35,0 14,0 4,8

Immobili ( d ) 30 139,8 35,0 126,5 6,0 52,9

Spermatozooi Totali 296 257 235,0 231,5 100,0 99,7

Motilità% (a+b) 60,8% 33,6% 51,1% 30,2% 80,0% 42,1%

Motilità% ( c ) 29,1% 12,0% 34,0% 15,1% 14,0% 4,8%

31 32 33

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 1 0,3 35,0 15,3 26,0 12,0 Mob. non Progressivi

( c ) 0,4 0 2,0 0,5 5,6 1,4

Immobili ( d ) 0,8 2 2,5 24,0 12,0 30,0

Spermatozooi Totali 2 2 39,5 39,8 43,6 43,4

Motilità% (a+b) 45,5% 13,0% 88,6% 38,4% 59,6% 27,6%

Motilità% ( c ) 18,2% 0,0% 5,1% 1,3% 12,8% 3,2%

34 35 36

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 50,0 26,2 25,0 6,2 7,0 2,8 Mob. non Progressivi

( c ) 26,0 10,5 13,0 4,2 8,7 2,5

Immobili ( d ) 36,1 76,3 21,8 47,8 5,2 15,7

Spermatozooi Totali 112,1 113,0 59,8 58,2 20,9 21,0

Motilità% (a+b) 44,6% 23,2% 41,8% 10,7% 33,5% 13,3%

Motilità% ( c ) 23,2% 9,3% 21,7% 7,2% 41,6% 11,9%

37 38 39

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Lettura a fresco

Lettura dopo scongelamento

Mob. Progressivi (a+b) 0,6 0,0 154 80 55 15

Mob. non Progressivi

( c ) 1,1 0,0

20,5 7,5 18,3 3,6

Immobili ( d ) 1,0 2,0 12,3 98,3 11,2 66

Spermatozooi Totali 2,7 2,0 187 186 85 85

Motilità% (a+b) 22,2% 0,0% 82,4% 43,1% 65,1% 17,7%

Motilità% ( c ) 40,7% 0,0% 11,0% 4,0% 21,7% 4,3%

40 41 42 Lettura a

fresco Lettura dopo scongelamento

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Mob. Progressivi (a+b) 0 0 11,0 2,5 16,0 3,2 Mob. non Progressivi

( c ) 0,5 0 35,9 4,1 5,0 0,5

Immobili ( d ) 6 6,5 20,1 61,4 10,5 26,3

Spermatozooi Totali 7 7 67,0 68,0 31,5 30,0

Motilità% (a+b) 0,0% 0,0% 16,4% 3,7% 50,8% 10,7%

Motilità% ( c ) 7,7% 0,0% 53,6% 6,0% 15,9% 1,7%

43 44 45 Lettura a

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Mob. Progressivi (a+b) 60 24 4 1,3 120 54,6

Mob. non Progressivi

( c ) 26,2 10,3 47 5,2

36 13,2

Immobili ( d ) 36 86,3 41,5 85,4 14,6 101

Spermatozooi Totali 122 121 93 92 171 169

Motilità% (a+b) 49,1% 19,9% 4,3% 1,4% 70,3% 32,3%

Motilità% ( c ) 21,4% 8,5% 50,8% 5,7% 21,1% 7,8%

46 47 48

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Mob. Progressivi (a+b) 22 3,4 1,5 0,2 2 0,8 Mob. non Progressivi

( c ) 30 4,1 3,0 0,5 7,8 1

Immobili ( d ) 90 133 4,3 7,3 5,2 13,2

Spermatozooi Totali 142 141 8,8 8,0 15 15

Motilità% (a+b) 15,5% 2,4% 17,0% 2,5% 13,3% 5,3%

Motilità% ( c ) 21,1% 2,9% 34,1% 6,3% 52,0% 6,7%

49 50 51 Lettura a

fresco Lettura dopo scongelamento

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Mob. Progressivi (a+b) 58,0 24,6 2 0,6 30,0 13,4 Mob. non Progressivi

( c ) 17,5 7,2 6,5 1,4 4,2 1,0

Immobili ( d ) 40,0 80,0 9 16,1 8,0 25,7

Spermatozooi Totali 115,5 111,8 18 18 42,2 40,1

Motilità% (a+b) 50,2% 22,0% 11,4% 3,3% 71,1% 33,4%

Motilità% ( c ) 15,2% 6,4% 37,1% 7,7% 10,0% 2,5%