USO DE LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU PARA LA IDENTIFICACIÓNRÁPIDA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN HEMOCULTIVOSUSE OF THE FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION TECHNIQUE FOR THE RAPID IDENTIFICATION OFSTAPHYLOCOCCUS AUREUS IN BLOOD CULTURESMaria L. Cómito (1), Mario Vilaró (1), Eduardo Cuestas (2), Eduardo Moscone (3).

ResumenAntecedentes: La técnica de referencia para la detección de bacteriemias es el hemocultivo. Uno de losgérmenes que causa bacteriemias con mayor frecuencia es Staphylococcus aureus (SAU). La presencia decocos Gram positivos en racimos (CGPR) en un hemocultivo es sugestiva de bacteriemia, aunque la relevan-cia del hallazgo depende de la identificación correcta del microorganismo. La tipificación definitiva demandaentre 24 y 48 hs. La técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH), es un método rápido para la identificaciónde bacterias en hemocultivos. Objetivos: El objetivo de este trabajo fue poner a punto la técnica de FISH dirigidoal ARN 16s de SAU, en muestras de hemocultivos con CGPR a la coloración de Gram, determinar la concor-dancia con el método de referencia y la factibilidad de implementarlo en la rutina del laboratorio de Microbi-ología. Material y métodos: Se incluyeron los hemocultivos estudiados en el Laboratorio de Microbiología delHospital Privado de Córdoba, entre el 1/01/09 y 31/12/09. A cada hemocultivo positivo que mostró CGPR se lesrealizó simultáneamente identificación microbiológica bioquímica y FISH. Resultados: Sobre 496 positivas 32mostraron CGPR y 24 se identificaron como SAU. Se observó una concordancia de 100% (IC95% 99 a 100)entre ambos métodos diagnósticos, con un valor de κ <0,01. Discusión: Las excelente concordancia obtenidaabre la puerta a un estudio para determinar el valor predictivo de FISH, su sensibilidad y especificidad; y eval-uar el impacto clínico de su incorporación a un laboratorio de bacteriología clínica.Palabras Clave: hemocultivos, bacteriemia, Stahylococcus, identificación rápida, FISH.

AbstractBackground: The technique of reference for the detection of bacteriemia is the blood culture. One of the mostfrequent bacteria responsible of bacteriemia is Staphylococcus aureus (SAU). The presence of Gram positivecocci (CGPR), in blood culture give the suspicious of bacteriemia, although the relevance of the finding dependson the correct identification of the microorganism. The definitive typification it demands from 24 to 48 hours. Thetechnique of fluorescent in situ hybridization (FISH), is a rapid method for the identification of bacteria in bloodculture. Aims: The aims of this work was to establish the FISH technique directed to the 16S RNA of SAU in sam-ples of blood cultures with CGPR to the Gram staining, to determine the concordance with the method of refer-

TRABAJO ORIGINAL

(1)Laboratorio de Microbiología, Hospital Privado Centro Médico de Córdoba;(2) Área de Epidemiología Clínica y Bioestadística Hospital Privado Centro Médico de Córdoba, Av. Naciones Unidas 346.

X5016KEH, email: lucrecom@hotmail.com;(3) Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal, Universidad Nacional de Córdoba

Realizado con el apoyo del Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal, Universidad Nacional de Córdoba.Enviado: 06/10/2009Aceptado: 18/11/2009

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ence, and to evaluate the possibility to use as standard method in the laboratory of microbiology. Material andMethods: The blood cultures analyzed in the Laboratory of Microbiology of the Hospital Privado Cordoba from01.01.2009 to 31.12.09 were included in this study. To each positive blood culture which showed CGPR was ap-plied simultaneously biochemical identification and FISH. Results: From 496 positive samples, 32 showed CGPR,24 of them were identified as SAU. A concordance of 100% (IC95% 99 to 100) between both methods of diag-nosis, with a value of k<0.01 was observed. Discussion: The excellent concordance opens the prospect for astudy in order to determine the predictive value of FISH, its sensibility and specificity. Furthermore, it will be pos-sible to evaluate its clinical impact being incorporated in a laboratory of clinical bacteriology.Key words: blood cultures, bacteriemia, Stahylococcus, rapid identification, FISH

Uso de la técnica de hibridación fluorescente / Comito ML y col.

IntroducciónLa detección e identificación de microorganismosen la sangre de un paciente es uno de los diag-nósticos más importantes del laboratorio de Mi-crobiología Clínica (1). La bacteriemia se definecomo la presencia de bacterias viables en la san-gre circulante. Una bacteriemia transitoria, o debajo nivel, puede ocurrir luego de intervencionesdentales o de maniobras invasivas (2), no pre-senta signos clínicos, su evolución es benigna ygeneralmente tiene resolución espontánea. Sinembargo, cuando las bacterias se multiplican auna velocidad tal que excede la capacidad delsistema retículo endotelial de removerlas se pro-duce la septicemia, que puede originar infec-ciones graves y generalizadas como el fallomultiorgánico séptico. La tasa de mortalidad dela septicemia en los pacientes oscila entre el 30y el 70% y depende de varios factores, in-cluyendo agentes patógenos y los factores delhuésped.La técnica microbiológica de referencia para ladetección de bacteriemias es el cultivo de san-gre -hemocultivo- que permite recuperar las bac-terias viables, identificarlas y realizar los ensayosde sensibilidad. Uno de los gérmenes que causabacteriemias con mayor frecuencia es Staphylo-coccus aureus (SAU), ya que debido a la pres-encia de numerosos factores de virulenciapresenta tasas de morbi-mortalidad elevadas(3,4,5). Se ha descripto un aumento en la inci-

dencia de bacteriemias por Staphylococcus co-agulasa negativa (SCN) aunque se comprobóque en la mayoría de los casos se trataba decontaminaciones y falsos positivos (6). La pres-encia de cocos Gram positivos dispuestos enracimos (CGPR) en una muestra de hemocultivoes sugestiva de bacteriemia, pero la relevanciadel hallazgo depende de la identificación correctadel microorganismo y su evaluación dentro delcontexto clínico de cada paciente. La tipificacióndefinitiva requiere de subcultivos en medio sólidoy pruebas bioquímicas que demandan un tiempoque oscila entre 24 y 48 hs (7). La identificaciónrápida de CGPR es de suma importancia pordiferentes razones: (i) uso apropiado de los an-tibióticos evitando el tratamiento empírico degérmenes contaminantes; (ii) menor presión deselección de microorganismos resistentes; (iii)mejora en el pronóstico de los pacientes con bac-teriemia y (iv) disminución en los costos de in-ternación. Ensayos inmunológicos, coagulasa entubo y endonucleasa estable, métodos emplea-dos para la identificación de Staphylococcus au-reus a partir de sub-cultivos, han sido usadosdirectamente sobre las botellas de hemocultivoque mostraron CGPR a la coloración de Gram,con resultados de sensibilidad y especificidadvariables (8,9). En general todos los estudios serealizaron usando un solo tipo de medio de cul-tivo, sin apuntar a las posibles interferencias quese pueden producir usando diferentes medios

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de cultivo, lo que explica la variabilidad en los re-sultados obtenidos. Técnicas moleculares comola reacción en cadena de la polimerasa (PCR) yla Hibridación Fluorescente in situ (FISH) hansido descriptas para la identificación de SAU di-rectamente sobre las botellas de hemocultivopositivas (10,11). Sin embargo, la realización PCRademás de ser laboriosa y costosa requiere deuna infraestructura compleja haciéndola poco vi-able su incorporación a la rutina del laboratorioclínico. El uso de FISH ha mostrado ser unmétodo rápido, fidedigno y practicable para laidentificación directa de bacterias que han de-sarrollado en hemocultivos (12). La técnica con-siste en realizar una hibridación molecular conuna sonda oligonucleotídica, marcada en su ex-tremo con un fluorocormo, dirigida a una regiónespecífica y conservada del ARNr de SAU, pro-duciendo una unión irreversible que se traduceen señales lumínicas cuando son observadas almicroscopio de fluorescencia.El objetivo de este trabajo fue poner a punto latécnica de FISH dirigido al ARN 16s de SAU, enmuestras de hemocultivos positivos que presen-ten CGPR a la coloración de Gram, determinar laconcordancia con el método de referencia y es-tablecer la factibilidad de implementarlo en larutina de un laboratorio de Microbiología Clínica.Material y MétodosSe incluyeron todos los hemocultivos estudiadosen el Laboratorio de Microbiología del HospitalPrivado Centro Médico de Córdoba, en elperíodo comprendido entre el 1° de enero y 31de diciembre de 2009. Las muestras de sangrefueron incubadas durante un período de 5 días aun temperatura de 35°C bajo agitación constanteen el sistema automatizado de detección de bac-teriemias Bactec 9120 (Becton Dickinson, USA).A cada muestra positiva se le hizo coloración deGram y aquellas que mostraron la presencia deCGPR se les realizó simultáneamente cultivo en

medio sólido sobre placas de agar sangre decarnero (Biomerieux) y FISH (13). La identifi-cación de las colonias aisladas en medio sólidose hizo con el sistema de Identificación Automa-tizada VITEK 2 (Biomerieux, Francia). Para elcontrol de calidad se usaron las cepas de refer-encia de la American Type Culture Colection(ATCC) 25923 y 29213 para SAU sensibles a lameticilina y la cepa ATCC 43300 para SAU re-sistentes a la meticilina. La técnica de FISH sellevó a cabo usando la sonda con la siguiente se-cuencia de nucleótidos: 5'- GAA GCA AGC TTCTCG TCC G -3' marcada con fluoresceína(Metabion, Alemania). Para la elección de lasonda se consultó la base de datos del Centrode ]Ecología Microbiana de la Universidad deViena (probe-base). Brevemente: luego de haberfijado las muestras sobre portaobjetos recubier-tos con poli-L-lisina al 0,01%, previo tratamientoenzimático con 1 mg/ml de lisozima (Sigma) du-rante 10 min. a 30°C, seguido por lisostafina(Sigma) a una concentración de 1 mg/ml por 5min at 30°C, se realizó la hibridación con bufferformamida adicionado con 50 ng/l de sonda,durante 90 min. a una temperatura de 46°C. Pos-teriormente se lavaron con buffer de lavado du-rante 10 min. a 48°C. Los preparados fueronmontados con medio Vectashield y se obser-varon al microscopio de epifluorescencia LeicaDMLB, con filtro para fluoresceína bajo una ex-citación de 492 nm. Las imágenes se capturaroncon una cámara Leica DC 250 y fueron proce-sadas con el programa de tratamiento de imá-genes Leica IM 1000.Se realizó un análisis estadístico para establecerla concordancia entre los métodos, estimándoseésta, en porcentajes con IC95%. La significaciónse calculó por medio de la prueba κ de Krom-bach. Se escogió un valor de p < de 0,01.ResultadosSobre 7756 muestras de hemocultivos estudi-

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adas, 496 fueron positivas (6,4% IC95% 5,8 a 7),de las cuales 32 mostraron CGPR a la coloraciónde Gram, siendo la identificación definitiva de losaislados: 24 SAU y 8 SCN. La técnica de FISHmostró resultados positivos en las 24 cepas deSAU y no se hallaron resultados positivos en las8 cepas de SCN mostrando una excelente con-cordancia entre FISH y la identificación microbi-ológica de referencia. El control calidad con lascepas patrón ATCC de SAU no mostró resulta-dos falsos (Figura 1).

Figura 1: Señales fluorescentes obtenidas luego de la hibri-

dación de la sonda oligonucleotídica sobre una muestra de

hemocultivo que mostró CGPR a la coloración de Gram.

Para SAU se observó una concordancia de100% 24/24 (IC95% 85,7 a 100) entre ambosmétodos diagnósticos (Tabla 1), con un valor de κde 1,0; p 0,001; en el caso de SCN la concor-dancia fue de 100% 8/8 (IC95% 63 a 100) (Tabla2), con un valor de κ de 1,0; p 0,001.

DiscusiónEl desarrollo de métodos de diagnóstico micro-biológico rápido es un desafío creciente. Lanecesidad de dar una respuesta concreta en elmenor tiempo posible se ha transformado en elobjetivo primordial en todo laboratorio de Micro-biología moderno.El uso de las técnicas moleculares que permiten

identificar microorganismo, sin pasar necesaria-mente por la etapa de cultivo, se ha presentadocomo una alternativa sensible y específica, enparticular cuando la disminución del tiempo de

Uso de la técnica de hibridación fluorescente / Comito ML y col.

Muestra SAUIM SAUF1 + +2 + +3 (-) (-)4 + +5 (-) (-)6 (-) (-)7 + +8 + +9 + +

10 + +11 + +12 + +13 + +14 + +15 (-) (-)16 + +17 (-) (-)18 + +19 + +20 + +21 + +22 + +23 (-) (-)24 + +25 + +26 (-) (-)27 + +28 + +29 + +30 (-) (-)31 + +32 + +

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TABLA 1: Tabla de concordancia de los resultados obtenidos

con identificación microbiológica y FISH para SAU. Referen-

cias: SAUIM: Staphylococcus aureus identificación microbi-

ológica, SAUF: Staphylococcus aureus identificación por

FISH., , +: resultado positivo, (-) resultado negativo.

detección condiciona la implementación de untratamiento adecuado. Esto último se verificapuntualmente en el caso de los pacientes con .

bacteriemia en los que cualquier retraso en laantibioticoterapia puede tener consecuenciasgravesEl principal inconveniente que presentan losmétodos basados en la detección de ácidos nu-cleicos bacterianos es la elección de secuenciade nucleótidos adecuada para evitar las reac-ciones cruzadas con otros microorganismosafines, que pueden originar resultados falsospositivos. Para ello en necesario verificar la es-pecificidad de la secuencia elegida comparán-dola con las cepas de referencia ATCC queconfirman la presencia de resultados positivosverdaderos.Los resultados obtenidos sobre la muestra estu-diada mostraron una excelente concordanciaentre la técnica de FISH y el método microbi-ológico de referencia. La ausencia de falsos pos-itivos mostró una buena sensibilidad del métodopara ser implementado como diagnóstico. Eltiempo de realización insume 3 horas, enrelación a las 48 hs. que demanda lametodología tradicional, constituyendo un aportesignificativo que influye directamente sobre el pa-ciente optimizando la calidad de su tratamientocon las previsibles mejoras clínicas conse-cuentes, en especial en pacientes sépticos enestado crítico. Una ventaja adicional de FISHsobre el resto de los métodos moleculares exis-tentes, es la prescindencia de requerimientostecnológicos complejos volviendo la técnica ac-cesible a la mayoría de los laboratorios de bac-teriología clínica y la facilidad de incorporarlo a larutina diaria de trabajo sin agregar complica-ciones ya que su realización es sencilla y prác-tica. El principal inconveniente de la observaciónal microscopio de fluorescencia es la necesidadde personal entrenado en la misma. Con fre-cuencia la interpretación de las imágenes sueleser subjetiva originando resultados confusos. Lalectura de FISH contra CGPR mostró señales de

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Muestra SCNIM SCNF1 (-) (-)2 (-) (-)3 + (-)4 (-) (-)5 + (-)6 + (-)7 (-) (-)8 (-) (-)9 (-) (-)

10 (-) (-)11 (-) (-)12 (-) (-)13 (-) (-)14 (-) (-)15 + (-)16 (-) (-)17 + (-)18 (-) (-)19 (-) (-)20 (-) (-)21 (-) (-)22 (-) (-)23 + (-)24 (-) (-)25 (-) (-)26 + (-)27 (-) (-)28 (-) (-)29 (-) (-)30 + (-)31 (-) (-)32 (-) (-)

TABLA 2: Tabla de concordancia de los resultadosobtenidos con identificación microbiológica y FISH paraSCN. Referencias: SCNIM: Staphylococcus coagulasanegativa identificación microbiológica, SCNF: Staphylococ-cus coagulasa negativa identificación por FISH, +: resul-tado positivo, (-) resultado negativo.

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excelente intensidad y no se constató la presen-cia de ruido de fondo o hibridaciones no especí-ficas que pueden generar lecturas erróneas. Estoconstituye una ventaja adicional debido a que elprocedimiento puede ser llevado a cabo con rapi-dez por cualquier persona habituada a la obser-vación de preparaciones microscópicasfluorescentes eliminando la subjetividad del ob-servador.En conclusión la técnica de FISH, para identificarSAU en hemocultivos positivos con CGPR a lacoloración de Gram, se mostró como una her-ramienta rápida y eficaz que permite acortar eltiempo de emisión de resultados de laboratorio.Este es el primer trabajo de este tipo en HispanoAmérica y abre la puerta a un estudio con mayornúmero muestral con el objeto de determinar enel futuro el valor predictivo de FISH, su sensibil-idad y especificidad; y evaluar el impacto clínicode su incorporación a un laboratorio de bacteri-ología clínica.

Referencias1. Baron, E J. Processing and Interpretation of BloodCultures. In Isenberg H. D. (ed.). Essential Proceduresfor Clinical Microbiology.ASM Press, Washington, D.C.1998. p. 58-62.2. Pezzlo, M. Interpretation of Aerobic Bacterial Growthon Primary Culture Media.In Isenberg, H.D. (ed.). Es-sential Procedures for Clinical Microbiology. ASMPress, Washington, D.C. 1998. p. 51-57.3. Sheagren, J. N.. Staphylococcus aureus. The per-sistent pathogen (first of two parts). N. Engl. J. Med.1984. 310:1368–13734. Sheagren, J. N. Staphylococcus aureus. The per-sistent pathogen (second of two parts). N. Engl. J.Med. 1984. 310:1437–1442.5. Wischnewski, N., G. Kampf, P. Gastmeier, J.

Schlingmann, F. Daschner, M. Schumacher, and H.Ru¨den. Prevalence of primary bloodstream infectionsin representative German hospitals and their associa-tion with central and peripheral vascular catheters.Zentbl. Bakteriol. 1998. 287:93–103.6. Gastmeier, P., C. Geffers, D. Sohr, F. Schwab, M.Behnke, and H. Ruden. Surveillance of nosocomial in-fections in intensive care units. Current data and in-terpretations. Wien Klin. Wochenschr. 2003,115:99–103.7. Qian, Q, Eichelberger, K and Kirby, J E . Rapid Iden-tification of Staphylococcus aureus in Blood Culturesby Use of the Direct Tube Coagulase Test. Journal ofClinical Microbiology: 2007, 45: 2267-2269.8. Oliveira K, Brecher S M, et. Al. Direct Identificationof Staphylococcus aureus from Positive Blood CultureBottles. Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41, (2):889–891.9. Qian Q, Eichelberger K, Kirby J E, et. Al. RapidIdentification of Staphylococcus aureus in Blood Cul-tures by Useof the Direct Tube Coagulase Test. Jour-nal of Clinical Microbiology, 2007, 45, (7) : 2267–2269.10. Oliveira, K, Procop, W G, Wilson, D, Coull, J andStender, H. Rapid Identification of Staphylococcus au-reus directly from Blood Cultures by Fluorescence InSitu Hybridization with Peptide Nucleic Acid Probes.Journal of Clinical Microbiology; 2002, 40: 247-251.11. Brakstad, O G , Maeland J A. Direct identificationof Staphylococcus aureus in blood cultures by detec-tion of the gene encoding the thermostable nuclease orthe gene product. APMIS, 1995; 103:209–218.12. Kempf, V A J, Trebesius, K, and Autenrieth, I B.Fluorescent In Situ Hybridization Allows Rapid Identi-fication of Microorganisms in Blood Cultures. Journalof Clinical Microbiology; 2000, 38:830-838.13. Daims H, Stoecker K, Wagner M. Fluorescence insitu hybridization for the detection of prokaryotes. Ad-vanced Methods in Molec. Ecology. 2005; P. 213-239

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