uvod u mikrobiologiju i fizikalno-kemijsku analizu voda

Jadranka FRECE i Ksenija MARKOVUVOD U MIKROBIOLOGIJU I

FIZIKALNO-KEMIJSKU ANALIZU VODA

Voda je sve i u vodu se sve vraća.

Aristotel

J. Frece i K. Markov UVOD U MIKROBIOLOGIJU I FIZIKALNO-KEMIJSKU ANALIZU VODA

Naslov:UVOD U MIKROBIOLOGIJU I FIZIKALNO-KEMIJSKU ANALIZU VODA

Autorice i urednice:izv. prof. dr. sc. Jadranka FRECEPrehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska

izv. prof. dr. sc. Ksenija MARKOVPrehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska

Koautori i suradnici:prof. dr. sc. Jasna BOŠNIR, znan. savj.Nastavni zavod za javno zdravstvo “Dr. Andrija Štampar”, Zagreb, Hrvatska

Aleš KRULECInštitut za sanitarno inženirstvo Republike Slovenije, Ljubljana, Slovenija

dr. sc. Dario LASIĆNastavni zavod za javno zdravstvo “Dr. Andrija Štampar”, Zagreb, Hrvatska

mag. sc. Jasmina NIKIĆInštitut za sanitarno inženirstvo Republike Slovenije, Ljubljana, Slovenija

doc. dr. sc. Darija VUKIĆ LUŠIĆNastavni zavod za javno zdravstvo Primorsko-goranske županije, Sveučilište u Rijeci, Medicinski fakultet, Rijeka, Hrvatska

Tehnički urednik: Aleš KRULEC

Izdavač:Inštitut za sanitarno inženirstvoInstitut for Food Safety and Environmental HealthZaloška cesta 155, SI-1000 Ljubljana, Slovenija www.institut-isi.si, [email protected]

Za izdavača:Aleš KRULEC, Jelena ĐUGUM, Staša RASPOTNIK

Recenzenti:izv. prof. dr. Matjaž KUNAVERKemijski inštitut, Ljubljana, Slovenija

dr. sc. Stanka VADNJALUniverza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta, Inštitut za higieno živil in bromatologijo, Ljubljana, Slovenija

Oblikovanje naslovnice: Vedran JERKOVIĆ (na naslovnici: slap Savica, izvor Save Bohinjke, Slovenija, ©Michal Lazor, Fotolia)

Priprema za tisak: Tempora, Rijeka, HrvatskaTisak: C.VISTA, d.o.o., Celje, SlovenijaNaklada: 200 primjeraka

Članci odražavaju stavove autora, a ne nužno ustanove u kojoj su zaposleni, odnosno nakladnika i uredništva knjige. Copyright © Inštitut za sanitarno inženirstvo. Sva prava pridržana. Umnožavanje bez pisane suglasnosti nositelja autorskih prava nije dozvoljeno!

Jadranka FRECEKsenija MARKOV

UVOD U MIKROBIOLOGIJU I FIZIKALNO-KEMIJSKU ANALIZU VODA

svibanj, 2015.

CIP – Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana 579.68 543.3 FRECE, Jadranka Uvod u mikrobiologiju i fizikalno-kemijsku analizu voda / [avtorici Jadranka Frece, Ksenija Markov ; soavtorji Jasna Bošnir ... et al.]. - Ljubljana : Inštitut za sanitarno inženirstvo, 2015 ISBN 978-961-92846-5-0 1. Gl. stv. nasl. 2. Markov, Ksenija 279713280


PredgovorU današnje vrijeme sve se veći naglasak stavlja na problem zaštite prirode, racionalnom, znanstveno poduprijetom složenom iskorišta-vanju prirodnih vodenih resursa.

Suvremeni način života donosi iznimno velike promjene u području opskrbe stanovništva vodom. Rizicima koji su se pojavljivali u proš-losti pridružili su se novi, među kojima su i oni koji mogu imati još veći negativan učinak na zdravlje potrošača. Raz voj industrije i in-dustrijalizacija poljoprivrede dovele su do šire primjene površinskih voda za vodoopskrbu. Istovremeno, sastav vode se mijenja, jer u nju dolaze razne tvari koje se koriste u svakodnevnoj ljudskoj djelat-nosti. Te činjenice postavljaju velike izazove pred vodoopskrbu. Zbog toga i mikrobiologija, uzorkovanje i fizikalno-kemijska analiza takvih voda postaje sve složenija. Potreba neophodne zaštite vode-nih bazena od zagađenja otpadnim vodama industrijskog podrijetla, uvjetuje stroge norme doz voljenog sadržaja mikrobioloških i fizikal-no-kemijskih primjesa u tim vodama.

Razrada i uključivanje u praksu novih suvremenih metoda kon trole kvalitete voda za različitu upotrebu, od klasičnih mikrobioloških, bi-okemijskih te suvremenih molekularnih metoda, iziskuju potrebu za knjigom “Uvod u mikrobiologiju i fizikalno-kemijsku analizu voda”. Posebna pažnja posvećena je ulozi mikroorganizama u kruženju tvari u vodenom okolišu, kao i bolestima koje se prenose vodom. Također, naglasak je stavljen na praktičan opis uzorkovanja vode i na praktične mikrobiološke i fizikalno-kemijske analize koje se kori-ste u analizi voda.

Budući da smo pri radu sa studentima, primjetile potrebu za opsežnijim tekstom koji pokriva područje mikrobiologije, uzor-kovanja i fizikalno-kemijskih analiza voda, a takav tekst nije do sada bio ponuđen u obliku knjige i na jednom mjestu, sasvim je oprav-

5

6


dano započeti sa uvodom za osnove razumijevanja, koji je obuhvatio šire područje kako mikrobiologije tako i fizikal no kemijskih analiza voda, a koji će se nadograditi u drugoj knjizi. Trudile smo se dati potrebnu osnovnu količinu informacija. Mislimo da knjiga predstavlja vrijedan znanstveni i stručni doprinos koji se bavi svim aspektima sigurnosti vode.

Sadržaj je jednako važan za stručnjake koji rade u području uzorko-vanja i analize vode, kao i za studente, ali i za potrošače. Osviješte-ni potrošač je u procesu vodoopskrbe sigurne vode od ključne važ-nosti. Uz pomoć sadržaja u ovoj knjizi potrošači su opunomoćeni/osvješteni i kao takvi pravi partneri u nastojanju da se poboljša si-gurnost vode. Knjiga će za sve koji će je pročitati, postati vrijedan alat za budući rad. Uz pomoć sadržaja koje donosi, knjiga će im proširiti vidike i omogućiti bolje razumijevanje složenosti i zahtjev-nosti procesa u zaštiti vode. Sigurne smo da će im biti od velike pomoći u njihovom radu i nastojanjima da se poboljša zdravlje po-trošača.

Na kraju, posebno nam je zadovoljstvo što će ova knjiga ugledati svjetlo dana u godini povezanoj s Milenijskim ciljevima razvoja UN-a, odnosno s UN-ovim akcijskim planom “Voda za život” kojemu je 2015. godina zadnja godina za ostvarenje i provođenje zadanih ci-ljeva, jer voda je dar prirode i svi imamo podjednako pravo na taj dar.

Zahvaljujemo se suradnicima i recenzentima na dragocjenim savje-tima i kritičkim primjedbama, kao i izdavaču knjige.

Jadranka Frece i Ksenija Markov

KazaloPredgovor ...........................................................................5

DIO I. MIKROORGANIZMI ................................................15

ULOGA MIKROORGANIZAMA U KRUŽENJU TVARI U VODENOM OKOLIŠU .............17

1. KRUŽENJE VODE U PRIRODI ..................................17

1.1. Kruženje ugljika ......................................................18

1.2. Kruženje dušika ......................................................19

1.3. Kruženje sumpora ...................................................19

1.4. Kruženje fosfora ......................................................20

1.5. Kruženje silicija .......................................................20

1.6. Kruženje željeza i mangana.......................................20

MIKROORGANIZMI U VODI ...................................22

2. POVRŠINSKE VODE ................................................22

2.1. Onečišćenja površinskih voda ...................................24

3. PODZEMNE VODE ..................................................24

3.1. Onečišćenja podzemnih voda ....................................27

4. PRIRODNA VODA ZA PIĆE ......................................28

4.1. Izvorska voda .........................................................29

4.2. Mineralna voda .......................................................29

4.2.1. Mikrobiološki pokazatelji zdravstvene ispravnosti i kakvoće u prirodnoj mineralnoj i prirodnoj izvorskoj vodi .......................................................................30

7

8


KAZALO

© Inštitut za sanitarno inženirstvo, 2015. 9

5. STOLNA VODA .......................................................31

5.1. Upute za uzimanje uzoraka vode iz slavine .................32

BOLESTI KOJE SE PRENOSE VODOM ....................34

6. Escherichia coli ......................................................37

7. Pseudomonas aeruginosa .........................................37

8. Salmonella sp. ........................................................38

9. Shigella sp. ............................................................38

10. Vibrio cholerae .......................................................39

11. Sulfitoreducirajuće klostridije i Clostridium perfringens ............................................39

12. Legionella ..............................................................40

13. Hidrične infekcije ....................................................41

BAKTERIOLOŠKA ANALIZA VODE .........................43

14. METODA MEMBRANSKE FILTRACIJE .......................43

14.1. Određivanje broja kolonija na 22 °C i na 37 °C (HRN EN ISO 6222:2000) ......................................44

14.2. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterije Escherichia coli i koliformnih bakterija (HRN EN ISO 9308-1:2014) – tehnika membranske filtracije ..............................................45

14.3. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterije Escherichia coli i koliformnih bakterija Colilert metodom (HRN EN ISO 9308-2:2014) – MPN metoda (engl. Most Probable Number, hrv. najvjerojatniji broj, NVB) .................46

14.4. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterija iz roda Enterococcus (HRN EN ISO 7899-2:2000) ................50

14.5. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterija iz roda Salmonella (HRN EN ISO 19250:2013) .....................51

14.6. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterije Clostridium perfringens (HRN ISO 14189:2013) ...........52

14.7. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterije Pseudomonas aeruginosa (HRN EN ISO 16266:2008) .....................................53

14.8. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterije Legionella ...54

14.8.1. Detekcija i brojenje Legionella (HRN ISO 11731:2000) ...........................................54

14.8.2. Detekcija i brojenje Legionella – 2. dio (HRN ISO 11731-2:2008) ........................................55

MOLEKULARNI PRISTUP U IDENTIFIKACIJI MIKROORGANIZAMA U VODI ................................56

15. MOLEKULARNE METODE .......................................58

15.1. Fenotipske tehnike ...................................................58

15.1.1. Serološke (imunološke) metode .................................59

15.2. Genotipske tehnike ..................................................59

15.2.1. Lančana reakcija polimerazom (engl. Polimeraze Chain Reaction, PCR) .....................61

15.2.2. Random Amplification of Poliymorphic DNA, RAPD ...................................................................61

15.2.3. Elektroforeza u promjenjivom električnom polju (engl. Puls Field Gel Electrophoresis, PFGE) ...............61

15.2.4. Ribotipizacija – analiza gena koji kodiraju za ulomak RNA ...........................................................61

10


KAZALO


DIO II. UZORKOVANJE .....................................................63

UZORKOVANJE .....................................................65

16. UZORKOVANJE VODE IZ SLAVINE ............................66

17. UZORKOVANJE PODZEMNIH VODA ..........................67

17.1. Problem uzorkovanja podzemnih voda........................67

18. SPECIFIČNI PRIMJERI UZORKOVANJA VODE.............68

18.1. Uzimanje uzoraka iz cisterni – rezervoara ...................68

18.2. Uzorkovanje nakon dezinfekcije vodovodnoga sustava stambenih zgrada ........................................68

18.3. Pakirana pitka voda (mineralna, stolna i izvorska voda) .............................68

18.4. Voda kontaminirana s uljem, masti i sl. ......................69

KONZERVIRANJE UZORAKA .................................70

19. VRSTE AMBALAŽE .................................................70

19.1. Staklo ....................................................................71

19.2. Plastični materijali ...................................................73

19.2.1. Svojstva nekih plastičnih materijala ...........................74

20. PRIPREMA AMBALAŽE ...........................................75

DIO III. FIZIKALNO-KEMIJSKE METODE ..........................77

FIZIKALNO-ANALITIČKE METODE .........................79

21. KLASIČNE ANALITIČKE METODE .............................79

21.1. Volumetrija .............................................................79

21.1.1. Osnove ..................................................................79

21.1.2. Titracija .................................................................80

21.1.3. Neutralizacijske titracije (titracije jakih kiselina i lužina) ..................................81

21.1.4. Primjena neutralizacijskih titracija u analitičkom laboratoriju .............................................................81

21.1.5. Oksidacijsko-redukcijske titracije ...............................81

21.1.6. Primjena redoks titracije u analitičkom laboratoriju .........82

21.1.7. Kompleksometrijske titracije .....................................85

21.1.8. Primjena kompleksometrijskih titracija u analitičkom laboratoriju ............................................85

21.1.9. Taložne titracije .......................................................86

22. INSTRUMENTALNE METODE ANALIZE .....................87

22.1. Spektroskopija ........................................................87

22.1.1. Apsorpcijska spektrometrija ......................................87

22.1.2. Molekulska apsorpcijska spektrometrija ......................88

22.1.3. Spektrofotometrija ...................................................88

22.1.4. Atomska spektrometrija ...........................................89

22.2. Kromatografija ........................................................94

22.2.1. Tekućinska kromatografija, LC ...................................94

22.2.2. Plinska kromatografija, GC .......................................94

22.2.3. Kromatografija – tijek ...............................................95

22.2.4. Kvalitativna analiza ..................................................95

22.2.5. Kvantitativna analiza ................................................95

22.2.6. Kromatografija visoke razdjeljivosti, HPLC, GPC ............96

22.2.7. Ionska kromatografija, IC ..........................................97

22.3. Elektrometrija .........................................................98

22.3.1. Potenciometrija .......................................................98

22.3.2. Kulometrija i elektrogravimetrija ..............................100

22.3.3. Primjena kulometrije ..............................................100

22.3.4. Voltametrija i polarografija ...................................... 101

22.3.5. Konduktometrija....................................................102

12


KAZALO


23. UPOTREBA BRZIH TESTOVA KOD KEMIJSKIH ODREĐIVANJA U PITKOJ VODI ...................................104

23.1. Kolorimetrijski testovi.............................................104

23.1.1. Fotometrija ...........................................................104

23.1.2. Fotometrijski testni kitovi........................................105

23.2. Instrumenti za mjerenje kod upotrebe brzih testova....105

23.2.1. Mjerno područje ....................................................106

23.3. Doziranje reagensa i priprava uzoraka u korištenju brzih testova .......................................106

23.4. Osiguranje i kontrola kvalitete .................................107

23.4.1. Kontrola mjernog sustava .......................................107

23.4.2. Traženje eventualnih pogrešaka nastalih kod ručnih operacija ....................................................107

23.4.3. Utvrđivanje utjecaja matriksa ..................................108

DIO IV. ANALITIČKI REZULTATI ............................................... 109

TUMAČENJE - INTERPRETACIJA ANALITIČKIH REZULTATA ................................... 111

24. VELIČINE I JEDINICE ......................................................111

24.1. Izražavanje količine .........................................................113

24.2. Pravila za imenovanje veličina ..........................................113

25. TUMAČENJE REZULTATA ...................................... 114

26. INTERNO UPRAVLJANJE KVALITETOM .................. 115

27. VANJSKA KONTROLA KVALITETE – PROVJERA OSPOSOBLJENOSTI LABORATORIJA ...................... 115

28. VALIDACIJA KEMIJSKIH METODA .......................... 116

28.1. Selektivnost .......................................................... 116

28.2. Radno područje .................................................... 116

28.3. Osjetljivost ........................................................... 117

28.4. Granica detekcije................................................... 117

28.5. Granica kvantifikacije ............................................. 117

28.6. Preciznost ............................................................ 117

28.7. Točnost ................................................................ 117

14


DIO I. MIKROORGANIZMI

DIO V. STATISTIKA ....................................................................119

POGREŠKE MJERENJA ........................................121

29. SLUČAJNE POGREŠKE .........................................121

29.1. Standardna devijacija .............................................121

29.2. Preciznost rezultata ...............................................121

29.3. Ponovljivost ..........................................................122

29.4. Reproducibilnost ...................................................122

29.4.1. Zapisivanje rezultata ..............................................123

29.5. Mjerna nesigurnost ................................................123

30. SUSTAVNE POGREŠKE .........................................123

30.1. Pravilnost i točnost ................................................123

30.2. Prepoznavanje i smanjivanje sustavne pogreške .........124

LITERATURA ............................................................................. 126

© Inštitut za sanitarno inženirstvo, 2015.



17

ULOGA MIKROORGANIZAMA U KRUŽENJU TVARI U VODENOM OKOLIŠU

Mikroorganizmi su ključna karika u biogeokemijskim procesima i imaju važnu ulogu u vodenom ekosustavu jer omogućavaju kruže-nje, remineralizaciju i novu primarnu produkciju. U prirodi se mije-nja molekularni oblik u kojem se pojedini biogeni elementi pojavlju-ju, a takve promjene nazivamo kruženje elemenata u prirodi (slika 1). Ako se prisutni kemijski spojevi, određenog sastava i koncentra-cije, povežu s biološkom komponentom (živim organizmima) tada govorimo o biogeokemijskim ciklusima te kruženju elemenata u pri-rodi kroz biološke i geološke (atmosfera, hidrosfera, litosfera) kom-ponente na zemlji.

Slika 1. Kružni tijek tvari u vodama

Riba

Bakterije

Nitrati

Biljke ialge

HranaAmonijak

Bakterije

Nitriti

Minerali iorganski spojevi

mulj

Izvor: Helde.net. Kružni tijek tvari u vodama.

1. KRUŽENJE VODE U PRIRODI

Promatrajući kruženje vode kroz hidrološki proces, može se uočiti da se određena količina vode uvijek prirodno zadržava na pojedi-nim, za to pogodnim mjestima. Na taj način formiraju se oceani, ri-jeke, prirodne akumulacije, ledenjaci i slično. Najveće zalihe vode ili vodeni rezervoari su mora i oceani.

Voda se privremeno pohranjuje u tlu, u oceanima, morima, jezerima i rijekama, te u ledenim kapama i ledenjacima. Pod djelovanjem sunčevog svijetla voda neprestano s vodenih površina isparava u atmosferu, kondenzira se u oblacima te se ukapljena u obliku kiše, snijega ili tuče ponovno vraća na zemlju.

18




Gotovo sva voda na zemlji je nebrojeno puta prošla kroz taj ciklus, a u posljednjih se milijardu godina vrlo malo vode stvorilo ili nestalo.

Nešto više od 97 % ukupne količine vode je morska voda, dok se voda potencijalno pogodna za piće nalazi u ledenjacima, jezerima i rijekama kao i u tlu te nekim stijenama. Dva najveća svjetska rezer-voara slatke vode nalaze se u polarnim kapama na Antartici i na Grenlandu (kada bi se svi ledenjaci na zemlji otopili razina svjetsko-ga mora bi porasla za oko 80 m) te u tlu.

Neprekidan tijek vode između zemlje i atmosfere poznat kao ciklus vode (hidrološki ciklus) je raspodjela vode na zemlji koja uvjetuje njene fizikalne i kemijske reakcije s drugim tvarima koje se nalaze u prirodi i predstavlja vezu vode sa životom na zemlji.

Kruženje vode je niz tokova vode kako iznad tako i na, te ispod po-vršine tla, a uključuje slijedeće faze:

• isparavanje,

• kondenzaciju i

• ponovni povratak na zemlju (površinsko otjecanje i protjeca-nje kroz tlo).

Isparavanjem se voda pretvara u vodenu paru i ulazi u atmosferu u obliku plina, a isparena količina se nadomješta kondenziranom vo-dom koja se iz atmosfere vraća u obliku kiše, snijega ili tuče. Na-knadna vlaga u atmosferi rezultat je transpiracije odnosno isparava-nja vode s listova biljaka.

1.1. Kruženje ugljika

Osnovnu ulogu u kruženju ugljika imaju procesi sinteze i razgradnje organske tvari. Kroz te procese uspostavlja se veza ciklusa ugljika s ciklusima dušika, sumpora, željeza i drugih elemenata, koji se uklju-čuju u organsku tvar uz učešće različitih mikroorganizama. Autohto-ne grupe mikroorganizama vodenog okoliša, kao što su fotosintetizi-rajući i kemosintetizirajući autotrofi iskorištavaju sunčevu energiju za obavljanje procesa fotosinteze i atmosferski ugljik (IV) oksid kao izvor ugljika, dok heterotrofi koriste organske izvore hrane. Koncen-tracija CO2 u atmosferi ne opada jer se stalno obnavlja respiracijom, fermentacijom i izgaranjem.

Osnovni procesi kruženja ugljika koji se odvijaju u vodama su:

1. Aerobna zona – fotosinteza fitoplanktona i viših vodenih biljaka, razgradnja organske tvari, prispijeće alohtone organske tvari u vodeni bazen.

2. Mikroaerobna zona – taloženje organske tvari, fotosinteza sum-pornih bakterija, kemosinteza tiobakterija i kemosinteza nitrifi-katora.

3. Anaerobna zona – anaerobna razgradnja organske tvari, reduk-cija sulfata i oksidacija metana.

4. Mulj – procesi fermentacije, metanogeneza.

1.2. Kruženje dušika

Kruženje dušika u vodama je povezani lanac reakcija pretvorbe ra-zličitih oblika dušika. Vodeću ulogu u tim procesima imaju mikroor-ganizmi, a uključeni su sljedeći procesi:

1. Prispijeće dušika površinskim vodama iz atmosfere u vodeni okoliš.

2. Mikrobiološka fiksacija molekularnog dušika.

3. Asimilacija mineralnog dušika za rast i razvoj bakterija i fito-planktona.

4. Hidrobionti koji koriste organski dušik.

5. Razgradnja dušičnih organskih tvari do amonijaka – amonifika-cija i nitrifikacija.

6. Oksidacija amonijaka nitrificirajućim bakterijama do nitrita i ni-trata.

7. Redukcija nitrita i nitrata do slobodnog dušika denitrificirajućim i nitrat reducirajućim bakterijama.

8. Izdvajanje spojeva dušika iz sedimenta dna.

9. Gubitak dušičnih soli i plinovitog dušičnog oksida pri bazičnim reakcijama vode (odlaskom u atmosferu).

10. Denitrifikacija, tj. razgradnja spojeva dušika iz mulja u anaerob-nim uvjetima do plinovitog dušika.

1.3. Kruženje sumpora

Mikrobiološki procesi koji su vezani za kruženje sumpora u vodama, mogu se podijeliti u dvije osnovne skupine:

1. redukcija oksidiranih spojeva sumpora do H2S i

2. oksidacija H2S do niza međuspojeva elementarnog sumpora, tio sulfata i sulfita.

Voda se obogaćuje sulfatima ukoliko površinske i duboke vode prolaze preko slojeva koji sadrže naslage sulfatnih minerala (gips

20




– CaSO4) i sulfidnih minerala (pirit, FeS2). Mikroorganizmi uključe-ni u proces kruženja sumpora su: Desulfolobulbus, Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Thiobacillus, Beggiatoa, Thiothrix i dr.

1.4. Kruženje fosfora

Fosfor u prirodi postoji uglavnom u obliku fosfata, najčešće ortofosfa-ta (PO4

3-). U slatkim vodama nalaze se velike količine fosfora (> 90 %) u vidu organskih fosfata i kao glavni sastojak stanica živog svijeta. Koncentracija u vodi varira u ovisnosti o tome koliko su ga vezale jedinke fitoplanktona i zooplanktona. Propadanjem algi, fosfor se mikrobiološki transformira u mikrobnom krugu. Proces regeneraci-je traje najčešće nekoliko dana, a znatno ovisi o temperaturi.

Slobodni ortofosfat, a pogotovo organski fosfat brzo ugrađuju stani-ce alga i bakterija. Nutrijente brže apsorbiraju male stanice (piko-plankton = veličinska frakcija od 0,2 do 2 mm).

Pričvršćene bakterije na stanicama planktonskih alga su važni kom-petitori za hranjive soli. Takvi mikrobioti u kojima bakterije i alge reduciraju fosfate i stvaraju gradijent koncentracije fosfata nazivaju se mikrozone.

Zbog važnosti fosfora kao hranjivog elementa, koji često ubrzava produktivnost slatkih voda, velika pažnja se posvećuje njegovom sa-držaju u sedimentima i kretanju vode iznad sedimenta. Jezerski se-diment sadrži više fosfora od vode.

1.5. Kruženje silicija

Silicijev dioksid (SiO2) je obično prisutan u manjim količinama u slatkim vodama, a glavni je faktor, nakon fosfora, koji utječe na pro-dukciju algi u mnogim jezerima. Silicij se javlja u slatkim vodama u dva glavna oblika. Prvi oblik su topljive silicijeve kiseline, koje stva-raju stabilne otopine H4SiO4 (ortosilicijeva kiselina), a drugi oblik je granulirani silicij koji se nalazi u biološkom materijalu, posebno u silikatnim algama (Diatomeae) i nekim drugim organizmima. Prosje-čan sadržaj SiO2 u podzemnoj vodi je nešto viši od prosjeka u povr-šinskoj vodi. Glavni izvor SiO2 su silikatni minerali, a najveće kon-centracije se nalaze u podzemnoj vodi u kontaktu s vulkanskim stijenama.

1.6. Kruženje željeza i mangana

Željezo i mangan dospijevaju u vodene bazene sa slivne površine u obliku suspenzije i u otopljenom obliku. Kao rezultat procesa kemij-ske i biološke oksidacije netopljivi oksidi metala u obliku suspenzije

ulaze u naslage mulja. Uz učešće mikroorganizama u mulju dolazi do njihove redukcije i stvaranja karbonata. U redukciji željeza i man-gana sudjeluju anaerobni, fakultativno anaerobni i aerobni mikroor-ganizmi (bakterije iz rodova: Thiobacillus thiooxidans, Thiobacillus ferrooxidans, Sulfolobus acidocaldarius – za željezo, te Leptothrix, Metallogenium i Arthrobacter – za mangan).

22




MIKROORGANIZMI U VODI

Mikrobiologija voda proučava mikroorganizme i njihovu aktivnost u prirodnim vodama, a kakvoća vode u biološkom smislu ovisi o broju i vrsti mikroorganizama. Svaka vrsta teži životnoj sredini koja je za nju optimalna, no vrlo često se organizmi moraju prilagoditi uvjeti-ma, koji su bitno drugačiji od optimalnih. Stanje okoline unutar ko-jeg organizam može funkcionirati se zove područje tolerancije. Bilo koji biotički ili abiotički čimbenik koji smanjuje ili povećava područje tolerancije je ograničavajući čimbenik.

U prirodi postoje tri osnovna životna staništa, mora i oceani, kopne-ne vode i kopno. Bitan parametar za sve vodene mikroorganizme je raspon veličine mikroorganizama u vodi i utječe na: njihovu lokaciju (većina mikroorganizama živi na površini voda), biološku aktivnost i otklanjanje od strane predatora.

Vodeni ekosustavi su horizontalno podijeljeni na dva osnovna bioto-pa: pelagijal (vodeni stupac) i bental (dno).

Pelagijal čine: plankton – biljni i životinjski organizmi koji žive u vo-denom stupcu u stanju lebdenja i bakterije; nekton – krupne životi-nje s dobro razvijenim organima za kretanje, prilagođene životu na određenom mjestu u vodenom stupcu i neuston – skup organizama koji žive na površini vode zahvaljujući napetosti površine; bakterije, alge, ličinke insekata, odrasli insekti. Neuston se razvija samo u vo-dama s mirnom površinom.

Bental se sastoji od sesilnih i vagilnih organizama: fitobentos i zoo-bentos (infauna – ukopava se u dno i onfauna – životinje pričvršće-ne za dno ili se kreću).

2. POVRŠINSKE VODE

Voda je klasificirana u dvije velike kategorije: podzemna i površin-ska. U površinske vode ubrajaju se rijeke, jezera, ribnjaci i površin-ski izvori, koji kao drugi glavni izvor vode za piće (nakon podzemnih voda) često sadrže velik broj mikroorganizama. Mikrobna populacija u površinskim vodama potječe iz zraka, kiša, iz otpadnih produkata različitih industrija ili iz postrojenja za obradu otpadnih voda.

Životne zajednice opstaju u okolišu u kojem različiti ekološki faktori značajno variraju. To su primjerice temperatura, svjetlost, otopljeni plinovi i soli te priroda sedimenta dna što uvjetuje njihovu raspodje-lu po zonama:

• litoralna – pored obale,

• limnetička – zona slobodne vode,

• duboka – dublja voda i

• bentička – sediment na dnu.

Mikroorganizmi u vodi se dijele u 2 skupine ovisno o mjestu gdje provode veći dio faze rasta:

1. Pelagički mikroorganizmi (prisutni u vodi):

• nekton (plivajući mikroorganizmi) i

• plankton (plutajući mikroorganizmi)

2. Bentički mikroorganizmi (prisutni na površini i unutar sedimenta).

Litoralna zona uz obalu ima vrlo bujnu vegetaciju i kroz nju prodire svjetlo. Vrste bakterija ovise o dubini vode, a prevladavaju 24 bak-terijska roda, najčešći predstavnici su: Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Chromobacterium, Caulobacter, a raznolikost vrsta ne po-većava se s dubinom.

Limnetička zona označava površinu vode daleko od obale. U lim ne-tičkoj zoni obitavaju fotosintetičke alge, koje su izvor organske tvari i energije u površinskim vodama. U predjelu limnetičke zone, u koju ki-sik slabo difundira, a u kojoj prevladavaju bakterije iz roda Pseudomo-nas i vrste Cytophaga, Caulobacter i Hyphomicrobium, mikroorganiz-mi brzo potroše otopljeni kisik, što uzrokuje ugibanje riba i stvaranje neugodnog mirisa po H2S i organskim kiselinama.

U dubokoj zoni – dublja voda, u kojoj je količina kisika i prodor svje-tlosti mali, žive grimizne i zelene sumporne bakterije. Nazvane su tako prema njihovim pigmentima koji se nazivaju bakterioklorofili. Bakterioklorofili a i b dolaze u grimiznih sumpornih bakterija, a bakte-rioklorofili c, d i e u zelenih sumpornih bakterija. Obavljaju proces fo-tosinteze, koji se razlikuje od fotosinteze u biljaka i oksigenih foto-trofnih bakterija (cijanobakterija), jer ne proizvode kisik i obično pripadaju anaerobima. To su anoksigene fototrofne bakterije koje ne mogu upotrijebiti H2O kao elektron donor i proizvesti kisik, posjeduju samo fotosustav 1, te sudjeluju u ekosustavima osiguravajući nutri-jente za druge organizme. Fotosinteza u zelenih i grimiznih sumpornih bakterija se razlikuje od oksigenih fototrofnih bakterija (cijanobakteri-ja), jer grimizne sumporne bakterije upotrebljavaju reducirane sum-porne spojeve (H2S) umjesto vode i proizvode zrnca sumpora, umje-sto O2. Žive u anaerobnim uvjetima u okolišu kao što su sumporna vrela i ustajale vode.

U bentičkoj zoni se nalazi anaerobna populacija bakterija Desulfovi-brio, metanobakterije, te vrste iz roda Clostridium. Metanobakterije su striktni anaerobi koji redukcijom CO2, CO, formijata, metanola ili acetata stvaraju metan. Obitavaju u tlu, vodi, mulju pa čak i u pro-bavnom sustavu ljudi i životinja. Metanogene bakterije su najveća

24




skupina arheobakterija, a predstavnici su iz roda Methanomicrobi-um, Methanospirillum i Methanosarcina. Desulfovibrio reducira SO4

2- u H2S, što daje karakterističan miris trulih jaja. Bakterije iz roda Clostridium su sporotvorne bakterije, koje proizvode plin iz ugljikohidrata. Neograničeno dugo preživljavaju u okolini te su indi-katori fekalne kontaminacije.

2.1. Onečišćenja površinskih voda

Voda je kontaminirana onda kada sadrži kemijske ili biološke otrovne tvari ili infekcijske agense. Kontaminacija vodenog okoliša može biti uzrokovana fizičkim, kemijskim i ekološkim onečišćenjima.

Fizička kontaminacija vode pojavljuje se kada se pijesak i zemlja u njoj suspendiraju i zamućuju je. U takvu kontaminaciju može biti uključena i živa tvar, kao što je “cvjetanje” algi i cijanobakterija. U kombinaciji povišene temperature i nutrijenata (fosfata ili nitrata) dolazi do naglog rasta tih mikroorganizama.

Kemijska kontaminacija je rezultat ulaska anorganskih i organskih kontaminanata u vodu. Različite industrije npr. nuklearna, farmaceut-ska, prehrambena, rudarska, proizvodnja papira... ispuštaju u vodu po ljude opasne kemijske tvari (npr. teške metale, fosfate, nitrate, sumpornu kiselinu, radioaktivne otpadne tvari).

Ekološka kontaminacija nastaje od mikroorganizama koji u vodu dospijevaju iz ljudskog fecesa, prerade hrane, mesne industrije, me-dicinskih institucija i sličnih izvora.

Među glavnim skupinama mikroorganizama kontaminanata površin-skih slatkih voda su: koliformne bakterije, Escherichia coli, vrste iz roda Enterobacter, Proteus vrste, Streptococcus i Pseudomonas vr-ste, anaerobne vrste bakterija kao Desulfovibrio i Clostridium, koje proizvode plinove, što vodi daje neugodan miris te alge i cijanobakte-rije koje uzrokuju “vodeni cvijet”, što dovodi do ugibanja riba i ostalih malih životinja i biljaka zbog pomanjkanja kisika. Najpoznatije “trova-čice” su Microcystis aeruginosa i Anabaenaflosaquae, a pojavljuju se i protozoe kao npr. Paramecium, Euglena, Tetrahymena i Amoeba.

3. PODZEMNE VODE

Prije 70-ih godina prošlog stoljeća, studije o životu u ležištima podze-mnih voda bile su relativno ograničene. Tada je postalo jasno da ne-odgovorno odlaganje smeća onečišćuje podpovršinski sloj što se odražava na kvalitetu podzemnih voda. U hidrogeološkom smislu, podzemna voda je voda koja se lako iscijedi iz zbijenih, visokopropu-snih slojeva tzv. vodonosnika. Hidrolozi dijele vodonosnike na povr-šinske, srednje i dubinske.

• Površinski vodonosnici su karakterizirani kao aktivni (protok se izražava u m3 na dan) i snažno su povezani s lokalnim pa-dalinama.

• Srednji vodonosnici nalaze se pri dubini od 300 m i separira-ni su od površinskih vodonosnika nepropusnim slojem; oni imaju mnogo manji protok (izražava se u m3 u godini).

• Dubinski vodonosnici su također zatvoreni, ali na mnogo ve-ćoj dubini od 300 m i njihov je protok mnogo manji (izražava se u m3 u stoljeću).

Prirodna mineralna voda potječe uglavnom iz vodonosnika na sred-njoj razini.

Hranidbeni lanac u vodonosnicima je primarno heterotrofan (ras-padnuti organski ugljik uzduž hidrološkog protoka). Stoga mikrobi-ološko istraživanje podzemnih voda indicira da su heterotrofne bakterije (prokarioti) dominantno prisutni mikroorganizmi, dok eu-kariota nema ili je njihov broj jako mali. U podzemlju, gdje nema fotosinteze, ne mogu se naći cijanobakterije i alge, jedino ako geo-loški sloj nije hidrološki povezan s površinskim vodama.

Podzemna voda koja predstavlja jedan od dva glavna izvora vode, u pravilu je izvanredne kakvoće. Budući da se podzemna voda u tlu filtrira preko stijenja i slojeva pijeska, praktički ne sadrži mikroorga-nizme. Može sadržavati veliku količinu otopljenih minerala, te stoga biti obojena i mutna, ali općenito sadrži najmanji broj mikroorgani-zama.

U formiranju sastava podzemnih voda veliku ulogu imaju različiti mikroorganizmi čije je osnovno stanište litosfera i koji sudjeluju u razgradnji mineralnih i organskih tvari. Njihove metaboličke aktivno-sti važne su u reakcijama biogeokemijskih ciklusa (kruženja različi-tih kemijskih elemenata između zraka, vode i tla), oksidiraju anor-ganske spojeve i proizvode ATP (tablica 1).



26


3.1. Onečišćenja podzemnih voda

Najčešći izvor onečišćenja podzemnih voda fekalnim otpadnim vo-dama, u područjima bez kanalizacije, su septičke jame. Iz septičkih jama i neobrađenih komunalnih voda u podzemnu vodu mogu do-spjeti bakterije, virusi, mikroorganizmi s kože, probavnog i respira-tornog trakta, razna otapala i dezinficijensi, teški metali i organski spojevi iz ljudskog otpada. Odlagališta otpada, također predstavljaju opasnost od zagađenja, zbog otopljenih ili suspendiranih tvari koje ulaze u vodu prilikom prolaska vode kroz odlagalište. To su potenci-jalno veliki i opasni izvori onečišćenja. Podzemna voda danas se najviše koristi u poljoprivredi za navodnjavanje, ali nam je i poljopri-vreda jedan od glavnih izvora onečišćenja podzemne vode. Prven-stveno se to odnosi na kemikalije koje se koriste u poljoprivredi: fertilizatori (umjetna gnojiva), aditivi za tlo, pesticidi i herbicidi. Uko-liko se koriste u prevelikim količinama mogu prodrijeti do vode te-meljnice. Danas se te kemikalije koriste na velikim površinama i bez odgovarajuće kontrole. To su najčešće dušikovi spojevi koji mogu stvarati zdravstvene probleme. Veliki izvor zagađenja predstavljaju i industrijske otpadne vode, soli za posipanje cesta, prerada i uskla-dištenje nafte, ispuštanje otpadnih voda u podzemlje te odlaganje opasnog industrijskog otpada (slika 2). Za razliku od površinskih vo-dotokova, veći dio podzemnih voda još uvijek je nezagađen.

Tablica 1. Klasifikacija mikrobnih skupina u podzemnim vodama na osnovi izvora ugljika i energije

Skupina Izvor energijePrimarni izvor

ugljikaOdabrani izvor

elektronaTipični

predstavnici

kemoautotrofioksidacija anorganskih spojeva

CO2

H2SS0

NH4

NO2

H2

Fe2+

CH4

BeggiatoaThiobacillus NitrosomonasNitrobacterHydrogenomonasThiobacillusPseudomonas

kemoheterotrofioksidacija anorganskih spojeva

organske tvari organske tvarinajveći broj mikroorganizama

Izvor: Đukić i sur., 2000.

Među najvažnijim mikroorganizmima prirodne flore podzemnih voda su fluorescentne (sintetiziraju topljivi žuto-zeleni pigment) i nefluores-centne vrste bakterija iz roda Pseudomonas. Te bakterije, imaju na-domjesne osobine, izuzetno su prilagodljive, ne zahtjevaju specifične vitamine ili aminokiseline i mogu živjeti na različitim izvorima ugljika. Bakterije iz roda Pseudomonas uz bakterije iz roda Acinetobacter, najčešće koloniziraju podzemne sisteme, gdje su izvori organskog ugljika ograničeni. Vrste iz roda Acinetobacter su široko rasprostranje-ne u prirodi, žive u različitim staništima (suhim i vlažnim), a važne su pri mineralizaciji tla. Također, široko rasprostranjene u podzemnim vodama su i bakterije iz roda Caulobacter, a može ih se naći i u oligo-trofnim uvjetima većine vodonosnika. To je skupina neobičnih bakteri-ja koja je taksonomski povezana s prisutnošću prosteca (izbočine po-put stalka i pupova). Kada je koncentracija nutrijenata osobito mala, veličina se stalka povećava, da bi se osigurala veća površina za ap-sorpciju nutrijenata. Sposobnost povećanja površine razumljiva je zbog izloženosti neprekidnim promjenama vodenog toka.

Stalak povećava odnos površina-volumen stanice. U površinskim vo-donosnicima, gdje je koncentracija kisika relativno visoka, često se mogu pronaći i klizajuće bakterije bez plodonosnih tijela iz rodova Cytophaga i Flexibacter. Te bakterije uobičajeno žive u okruženju bo-gatom organskim materijalom (razgrađuju celulozu, hitin, agar i druge složene organske spojeve), ali se mogu prilagoditi podzemnim uvjeti-ma i iznimno su važne u ekološkim ciklusima.

Slika 2. Najčešći izvori zagađenja podzemnih voda

1

34

5

6

7

8

2

Legenda: (1) industrijske otpadne vode; (2) odlagalište otpadaka; (3) migracija efluenta prema eksploatacijskom zdencu; (4) primjena agrotehničkih kemijskih sredstava; (5) zagađeni površinski vodotok; (6) prerada i uskladištenje nafte; (7) upuštanje otpadnih voda u podzemlje; (8) odlaganje opasnog industrijskog otpada.

Izvor: www.vode-hidrološki_ciklus.png/400px

26

28




4. PRIRODNA VODA ZA PIĆE

Po definiciji voda je tekućina bez boje, okusa i mirisa. Međutim, ta-kva voda u prirodi i ne postoji. Već u atmosferi gdje dolazi do nasta-janja kapljica vode, odnosno kiše ili snijega, voda otapa čestice i plinove iz atmosfere i mijenja svoja prirodna svojstva. Stoga kapljice kiše dijelom poprimaju kemijska svojstva čestica koje se nalaze u atmosferi. Već na tom stupnju voda kišnica je čista koliko je čista sama atmosfera. Voda kao kišnica također ispire atmosferu. Stoga je nebo poslije kiše čisto i bistro.

Kad u obliku kiše ili snijega dospije na površinu kopna voda započi-nje svoj “drugi život”. U doticaju s kopnom voda pokupi svojom to-pljivošću mnoge tvari koje se nalaze na površini kopna. Bez obzira kroz kakvu podlogu protječe voda jednim dijelom dolazi u podze-mlje i tamo ostaje. To su zalihe podzemne vode na određenom po-dručju.

Te podzemne zalihe vode služe kao crpilišta za različite potrebe. Velik dio vode odlazi u mora i jezera, bilo podzemljem ili pak nadze-mnim tokovima, ovisno o podlozi.

Voda iz dubine zemlje izvire iz prirodnih izvora ili se crpi iz vodenih bušotina. Ti izvori toliko su duboko u zemlji da su zaštićeni od zaga-đivanja i bilo kakvog direktnog utjecaja sa zemljine površine. Zato je voda koja izvire iz zemlje vrlo čista i često ljekovita te sadrži minera-le, elemente u tragovima i druge sastojke uzete iz dubine zemlje.

Voda na zemlji je u stalnom kruženju, na površini zemlje isparava iz mora, kopnenih voda, iz samog tla i biljaka. Voda u plinovitom sta-nju odlazi u atmosferu gdje se pod utjecajem atmosferskih aktivno-sti ponovno spušta na zemlju u obliku kiše, snijega, magle ili rose. Samo mali dio vode ponire u zemlju i nakon nekoliko desetljeća po-novno izvire. Većina površinskih voda lakše je dostupna za korište-nje i upravo ona opskrbljuje ljude u njihovim potrebama za vodom. Međutim, obzirom na kakvoću podzem nih voda, kad god je to mo-guće, one predstavljaju prvi izbor kao resurs vode za piće.

Prema Zakonu o vodi za ljudsku potrošnju (NN 56/13) voda namije-njena za ljudsku potrošnju je sva voda koja je u svojem izvornom stanju ili nakon obrade namijenjena za piće, kuhanje, pripremu hra-ne ili druge potrebe kućanstava, neovisno o njezinom porijeklu te neovisno o tome potječe li iz sustava javne vodoopskrbe, iz cisterni ili iz boca odnosno posuda za vodu. U ove vode spadaju mineralne, prirodne izvorske i stolne vode.

Također, vode namijenjene za ljudsku potrošnju sve su vode koje se rabe u industrijama za proizvodnju hrane u svrhu proizvodnje, obra-

de, očuvanja ili stavljanja na tržište proizvoda ili tvari namijenjenih za ljudsku potrošnju, osim ako nadležno tijelo ne utvrdi da kakvoća vode ne može utjecati na zdravstvenu ispravnost hrane u njezinom konačnom obliku.

4.1. Izvorska voda

“Prirodna izvorska voda” je voda namijenjena za konzumaciju u svom prirodnom stanju, potječe iz vodonosnika zaštićenog od sva-kog onečišćenja, a puni se iz izvora.

Izvorska voda izvire iz podzemnih ležišta vode zaštićenih od utjeca-ja s površine zemlje i onečišćenja. Ona je niže mineralizirana od mi-neralne vode, a njezin sastav i ostale značajke imaju blagotvorno djelovanje na ljudski organizam. Sastav, temperatura i ostale zna-čajke izvorske vode moraju biti konstantni u okviru prirodnih pro-mjena i ne smiju se mijenjati u slučaju promjene izdašnosti izvora. Kod ovih voda nije dopuštena nikakva tehnologija prerade kemij-skim sredstvima, niti dezinfekcija kemijskim sredstvima.

U procesu punjenja izvorske vode dopušteni su postupci uklanja-nja nestabilnih elemenata kao što su željezo ili sumporni spojevi dekantacijom ili filtracijom uz prethodnu oksidaciju zrakom, kisi-kom ili ozonom. Da bi neka voda bila priznata kao izvorska voda potrebno je provesti sljedeća istraživanja: geološka i hidrogeološ-ka, fizikalna, kemijska, fizikalno-kemijska i mikrobiološka. Fizikal-na, kemijska, fizikalno-kemijska i mikrobiološka istraživanja mora-ju obuhvatiti najmanje jednu hidrološku godinu s najmanje 4 uzorkovanja pri različitim hidrološkim uvjetima.

4.2. Mineralna voda

“Prirodna mineralna voda” je voda koja udovoljava mikrobiološkim kriterijima, potječe iz vodonosnika, a zahvaća se iz izvora.

Mineralna voda nastaje u ciklusu kruženja vode na zemlji. Mineral-na voda koju danas pijemo je u stvari oborinska voda koja je stoti-nama tisuća godina unazad prodrla u zemlju. Tijekom prodiranja pročišćavala se prolaskom kroz slojeve zemlje i istovremeno se obogaćivala mineralima, elementima u tragovima i ugljičnim diok-sidom iz dolomita karbonatnog podrijetla. Potječe iz podzemnih ležišta zaštićenih od svakog onečišćenja, dobiva se iz jednog ili više prirodnih ili bušenih izvora, odlikuje se svojim senzorskim i fi-zikalno-kemijskim osobinama, bakteriološki je ispravna te ima bla-gotvoran učinak na ljudski organizam.

Od vode za piće razlikuje se po svojem prirodnom karakterističnom sadržaju otopljenih mineralnih tvari i tvari u tragovima, te određenim

30




prehrambeno-fiziološkim učincima i stanjem svoje prirodne čistoće, pri čemu su oba svojstva sačuvana zbog podzemnog podrijetla prirodne mineralne vode koje je zaštićeno od svih rizika onečišćenja. Sastav, temperatura i ostale značajke prirodne mineralne vode moraju biti stalni, odnosno u okviru prirodnih promjena, a posebno u slučaju povećanja izdašnosti izvora. Kod ovih voda nije dopuštena nikakva tehnologija prerade kemijskim sredstvima, niti dezinfekcija kemijskim sredstvima. U procesu punjenja prirodne mineralne vode dopušteni su postupci odvajanja nestabilnih elemenata kao što su željezo i sumporni spojevi postupcima filtracije ili dekantacije uz prethodnu oksidaciju zrakom, kisikom ili ozonom, ukoliko ovi postupci ne mijenjaju sastav mineralne vode u pogledu osnovnih značajki. Takoder je dopušteno miješanje više izvora istog izvorišnog područja prirodne mineralne vode, djelomično ili potpuno uklanjanje CO2 fizikalnim postupcima ili dodavanje odnosno ponovno dodavanje CO2.

Da bi neka voda bila priznata kao mineralna voda potrebno je prove-sti sljedeća istraživanja: geološka i hidrogeološka; fizikalna, kemijska i fizikalno-kemijska; mikrobiološka; prehrambeno-fiziološka, farmako-loška i/ili klinička. Fizikalna, kemijska, fizikalno-kemijska i mikrobio-loška ispitivanja moraju obuhvatiti najmanje jednu hidrološku godinu s najmanje 4 uzorkovanja pri različitim hidrološkim uvjetima.

4.2.1. Mikrobiološki pokazatelji zdravstvene ispravnosti i kakvoće u prirodnoj mineralnoj i prirodnoj izvorskoj vodi

Kriteriji za mikrobiološka ispitivanja na izvoru moraju sadržavati:

• prikaz odsutnosti parazita i patogenih mikroorganizama i

• kvantitativno određivanje mikroorganizama koji ukazuju na fe-kalno onečišćenje (tablica 2).

Prirodna mineralna voda i prirodna izvorska voda na izvoru i pri stavljanju na tržište nesmiju sadržavati mikroorganizme navedene u tablici 3. 5. STOLNA VODA

Stolna voda je mehanički i kemijski pročišćena voda koja izvorno ne mora biti čista. Ona se postupcima obrade i dodavanjem dopušte-nih kemijskih tvari dovodi u stanje za organizam prihvatljive i pitke vode. Takvu vodu dobivamo iz gradskog vodovoda. Proizvedena je od vode za piće s dodatkom dozvoljenih tvari, u cilju poboljšanja senzorskih svojstava, a zdravstveno je ispravna. Propisano je 10 tvari koje se mogu dodavati i sve te tvari moraju imati atest o upo-trebljivosti u prehrambenoj industriji. Dopušteno je dodavanje slije-dećih tvari: natrijev klorid, kalcijev klorid, natrijev karbonat, kalcijev

Tablica 2. Mikrobiološki pokazatelji prirodnih mineralnih i prirodnih izvorskih voda na izvoru i nakon punjenja u ambalažu (unutar 12 h)

PokazateljJedinice vode u ambalaži

Maksimalna dopuštena koncentracija (MDK)

Escherichia coli i druge koliformne bakterije (37 °C i 44,5 °C)

broj / 250 ml 0

Fekalni streptokoki odnosno enterokoki broj / 250 ml 0

Sulfitoreducirajuće anaerobne sporogene bakterije broj / 50 ml 0

Pseudomonas aeruginosa broj / 250 ml 0

Broj kolonija 20–22 °C / 72 h na izvoru*

broj / 1 ml20

unutar 12 h 100

Broj kolonija 37 °C / 24 h na izvoru*

broj / 1 ml5

unutar 12 h 20

* Vrijednosti broja kolonija 20-22 °C i 37 °C, smatraju se orijentacijskim brojčanim vrijednostima, a ne najvećim dopuštenim koncentracijama.

Izvor: NN 48/15.

Tablica 3. Mikrobiološki pokazatelji prirodne mineralne i prirodne izvorske voda na izvoru i pri stavljanju na tržište



Escherichia coli i druge koliformne bakterije (37 °C i 44,5 °C)

broj / 250 ml 0

Fekalni streptokoki odnosno enterokoki broj / 250 ml 0

Sulfitoreducirajuće anaerobne sporogene bakterije

broj / 50 ml 0


Paraziti i patogeni mikroorganizmi broj / 250 ml 0

Izvor: NN 48/15.

31

32




Tablica 5. Mikrobiološki parametri zdravstvene ispravnosti vode za ljudsku potrošnju

PokazateljJedinice vode

za pićeMDK

Jedinice vode u ambalaži

Escherichia coli broj / 100 ml 0 broj / 250 ml

Enterokoki broj / 100 ml 0 broj / 250 ml

Ukupni koliformi broj / 100 ml 0 broj / 250 ml

Clostridium perfringens (uključujući spore) broj / 100 ml 0 broj / 100 ml

Broj kolonija 22 °C broj / 1 ml 100 broj / 1 ml

Broj kolonija 37 °C broj / 1 ml 20 broj / 1 ml

Pseudomonas aeruginosa broj / 100 ml 0 broj / 250 ml

Izvor: NN 125/13.; http://www.stampar.hr/UputaZaUzimanje

Tablica 4. Mikrobiološki pokazatelji zdravstvene ispravnosti i kakvoće stolne vode



Escherichia coli broj / 250 ml 0

Enterokoki broj / 250 ml 0

Clostridium perfringens* (uključujući spore)

broj / 100 ml 0

Ukupni koliformi broj / 250 ml 0

Broj kolonija 22 °C broj / 1 ml 100

Broj kolonija 37 °C broj / 1 ml 20


* potrebno samo kad je voda za ljudsku potrošnju po porijeklu površinska voda ili ako na nju utječeIzvor: NN 48/15.

karbonat, natrijev hidrogenkarbonat, magnezijev karbonat, natrijev sulfat, magnezijev sulfat, natrijev florid i ugljikov dioksid. U označa-vanju stolne vode na ambalaži ili deklaraciji zabranjeno je stavljati oznake, crteže, slike ili bilo koje druge znakove koji mogu dovesti do miješanja stolne vode s prirodnom mineralnom ili izvorskom vodom, a posebno upotrebljavati riječi “mineralna voda”, “mineral”, “kiseli-ca”, “vrelo”, “izvor” ili bilo koju izvedenicu tih riječi. Tablica 4. prika-zuje mikrobiološke pokazatelje zdravstvene ispravnosti i kakvoće stolne vode.

5.1. Upute za uzimanje uzoraka vode iz slavine

Prije ispiranja i uzorkovanja sa slavine je potrebno ukloniti sve na-stavke (mrežice, gumeno crijevo i sl.). Pustiti vodu iz slavine teći 3 minute (vrijeme ispiranja), potom zatvoriti slavinu. Upaljačem oprezno spaliti otvor slavine. Otvoriti vodu da teče mirnim mla-zom. Natočiti vodu u propisanu ambalažu (boce). Prilikom otvara-nja i punjenja boce, treba paziti da ne dođe do sekundarnog one-čišćenja boce, poklopca i slavine (ne dirati rukama grlo boce, unutrašnji dio poklopca boce i otvor slavine). Bocu treba puniti izravno. Kako bi se osigurao izravni dotok uzorka u bocu, bocu treba postaviti neposredno ispod izljevnog mjesta (slavine). Količi-na uzorka (vode) ovisi o ispitivanim pokazateljima, odnosno vrsti analize. Uzorak treba dostaviti u roku od šest sati, a ako to nije moguće čuvati u hladnjaku na +4 °C. Za osnovnu analizu potreb-no je napuniti bocu od 1000 ml za kemijske pokazatelje, te steril-nu bocu od 500 ml za mikrobiološke pokazatelje (tablica 5).

Za određivanje količine pojedinih mikrobioloških pokazatelja potreb-no je koristiti sljedeće norme:

• Escherichia coli i koliformne bakterije (HRN EN ISO 9308-1),

• Enterokoki (HRN EN ISO 7899-2),

• Pseudomonas aeruginosa (HRN EN ISO 16266),

• Broj kolonija 22 °C (HRN EN ISO 6222),

• Broj kolonija 37 °C (HRN EN ISO 6222),

• za Clostridium perfringens – Direktiva Vijeća (EZ) 83/98

Uzorak se filtrira kroz membranu i inkubira u anerobnim uvje -tima na mCP agaru na 44 ± 1 °C tijekom 21 ± 3 sata. Broje se mutno žute kolonije koje postaju ružičaste ili crvene kada ih se 20 do 30 sekundi izloži parama amonijevog hidroksida.

C. perfringens (uključujući spore) uključen je kao indikator ka-kvoće vode u Direktivi Europske Unije (98/83/EZ). Obzirom da u trenutku stupanja na snagu navedene Direktive nije bila na raspolaganju ISO metoda za dokazivanje C. perfringens u vodi, u Direktivi je preporučeno korištenje mCP agara. Međutim, ra-zličita istraživanja potvrdila su da su za dokazivanje C. perfrin-gens iz relativno čistih ili podzemnih voda drugi mediji pogodni-ji, a da mCP agar daje vrlo slabo iskorištenje C. perfringens. Zbog navedenih raz loga Međunarodna organizacija za normiza-ciju (engl. International Organization for Standardization, ISO) odbila je upotrebu mCP agara, u korist metoda temeljenih na korištenju TSC hranjivog agara. ISO 14189:2013 opisuje doka-zivanje C. perfringens u vodi tehnikom membranske filtracije upotrebom TSC agara.

33

34




BOLESTI KOJE SE PRENOSE VODOM

Ulaskom Hrvatske u EU na snagu je stupio i primjenjuje se Zakon o vodi za ljudsku potrošnju (NN 56/13). Odredbe Zakona primje-njuju se na sve vode bez obzira na njihovo porijeklo, u prirodnom stanju ili nakon obrade, ako se koriste kao vode za ljudsku potroš-nju ili u svrhu proizvodnje, prerade, očuvanja i distribucije hrane, predmeta koji dolaze u neposredan dodir s hranom i predmeta opće uporabe, neovisno o tome da li je isporučena iz razvodne mreže ili u ambalaži.

Na temelju članka 10. stavka 2. podstavka 1. i stavka 4. Zakona o vodi za ljudsku potrošnju (NN 56/13), ministar zdravlja uz suglasnost ministra nadležnog za graditeljstvo i prostorno uređenje donosi Pravil-nik o parametrima sukladnosti i metodama analize vode za ljudsku potrošnju. Pravilnikom se reguliraju: senzorska svojstva, fizikalni, ke-mijski, mikrobiološki i parametri radioaktivnosti. Voda mora biti bi-stra, hladna, bez neugodna mirisa i okusa, te ne smije sadržavati za ljudsko zdravlje škodljive kemijske tvari niti mikroorganizme.

Mikrobiološki ispravna voda za piće osigurava se zaštitom izvorišta, pročišćavanjem vode, izgradnjom i održavanjem vodoopskrbnih objekata u ispravnom sanitarno-tehničkom i higijenskom stanju te ispitivanjem kvalitete vode izvora i zdravstvene ispravnosti vode u razdjelnom sustavu (mreži).

Ciljevi bakteriološke kontrole su:

• utvrditi da li je voda kontaminirana ljudskim fekalijama,

• odrediti stupanj zaštite vodonosnog sloja,

• istražiti djelotvornost tehnološkog procesa obrade vode, i

• otkriti izvore fekalne kontaminacije.

Indikatori fekalne kontaminacije su:

• koliformne bakterije,

• fekalni streptokoki odnosno enterokoki,

• sulfitoreducirajuće klostridije i C. perfringens,

• vrste iz roda Salmonella i

• vrste iz roda Proteus.

Koliformi su prirodna mikroflora probavnog sustava ljudi i životinja, aerobni ili fakultativno anaerobni, gram negativni, nesporogeni šta-pići, fermentiraju laktozu i tvore CO2, u vodi preživljavaju tjednima, neki i mjesecima.

Predstavnici koliformnih bakterija su:

• Escherichia coli,

• Klebsiella pneumoniae, i

• Enterobacter aerogenes.

Enterokoki

Fekalni streptokoki su sojevi bakterije Streptococcus faecalis, ne mogu dugo preživjeti u okolini pa služe kao indikatori skorašnje kon-taminacije. Enterokoki su podgrupa fekalnih streptokoka u koju je uključeno 19 vrsta, od kojih su dominantne Enterococcus feacalis, E. feacium, E. durans i E. hirae. Ponekad se mogu dokazati i druge vr-ste roda Enterococcus te neke vrste roda Streptococcus. Enterokoki u okolišu preživljavaju duže od E. coli, posebice u morskoj vodi. Osim toga, pokazali su najbolju korelaciju s gastrointestinalnim smetnjama koji se javljaju kod ljudi nakon kupanja na plažama. U rutinskoj anali-zi mikrobiološke ispravnosti vode za piće najčešće se termini fekalni streptokoki, enterokoki i intestinalni enterokoki smatraju sinonimima.

Mnoge bolesti koje se prenose vodom vezane su za vrste iz rodova Yersinia i Campylobacter i toksikogene sojeve Escherichia coli, a po-seban problem predstavlja bakterija Pseudomonas aeruginosa. Voda može biti prijenosno sredstvo za širenje nekih bolesti uzroko-vanih protozoama, kao npr. Entamoeba hystolytica, Giardia lamblia i Cryptosporidium parvum (tablica 6).

36




6. ESCHERICHIA COLI

Escherichia coli može izazvati enterokolitis, ekstraintestinalne infek-cije, od kojih su najčešće infekcije mokraćnih puteva te neonatalni meningitis i sepsa.

Među sojevima E. coli opisane su četiri skupine crijevnih patogena:

• klasične enteropatogene E. coli (EPEC) odgovorne za epidemi-ju proljeva kod dojenčadi i male djece, glavni mehanizam dje-lovanja EPEC sojeva je njihovo tijesno priljubljivanje uz epitel-ne stanice sluznice crijeva što dovodi do oštećenja epitela i uništenja crijevnih resica;

• enterotoksične E. coli (ETEC) koje su najčešći uzročnici bak-terijskih proljeva u nerazvijenim zemljama, a u razvijenim ze-mljama javljaju se uglavnom kao proljevi putnika; patogenost ispoljavaju preko dva enterotoksina, termostabilnog i termola-bilnog koji djelujući na intercelularne ciklaze smanjuju apsor-pciju i povećavaju ekskreciju elektrolita, a time i vode; stolice su vodenaste i bez upalnih stanica;

• enteroinvazivne E. coli (EIEC) koje su slične šigelama, ali rijet-ko su uzročnici proljeva koji imaju kliničku sliku dizenterije, mogu prodirati u epitelne stanice crijeva i oštetiti ih; stolice su vodenaste s puno granulocita, sluzi i krvi;

• enterohemoragične E. coli (EHEC) koje izazivaju hemoragični kolitis i proizvode toksin sličan Shiga-toksinu verotoksin, prija-njaju na epitel crijevne sluznice poput EPEC sojeva, ali proi-zvode i verotoksine koji lokalno oštećuju sluznicu kolona i dru-ge organe.

7. PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Pseudomonas aeruginosa najznačajniji je patogen unutar roda Pse-udomonas. Ova oportunistička bakterija rijetko izaziva oboljenja u zdravih osoba, premda je uobičajeni saprofit u ljudi. Kolonizacija crijeva, kože i sluznice zdravih ljudi ili bolesnika u općoj populaciji je niska, dok hospitalizacija pridonosi širenju P. aeruginosa infekcija. Najčešća lokalizacija infekcija je respiratorni sustav, mokraćni sustav i oštećena koža kod opsežnih opekotina. Infekcije se mogu očitovati kao gnojna infekcija kože (apcesi), sepsa, meningitis, endokarditis, in-fekcija oka i respiratornog trakta.

Tablica 6. Bolesti hidričnog porijekla koje su izazvane biološkim uzročnikom

Bolest Uzročnik

BAKTERIJE

Trbušni tifus i paratifus Salmonella typhi i S. paratyphi

Bacilarna dizenterija Shigella sp.

Kolera Vibrio cholerae

Tularemija Francisella tularensis

Gastroenteritisi

Salmonellae, Shigellae, Proteus,Vibrio parahaemolyticus,enterotoksična E. coli, Yersinia enterocolitica

Legionarska bolest Legionella sp.

Leptospiroza Spirohete – Leptospira sp.

VIRUSI

Zarazna žutica Hepatitis A

Dječja paraliza Poliovirus

Gastroenteritisi Entero-, Adeno-, Reo- virusi

PROTOZOE

Amebna dizenterija Entamoeba histolytica

Amebni meningoencefalitis Naegleria fowleri, Acanthamoeba

Giardijaza Giardia spp.

Gastroeneritisi Balantidium coli

HELMINTI

Trihurijaza Trichiuris trichiura

Ascarijaza Ascaris lumbricoides

ShistosomijazaSchistosoma japonicum, Sch. mansoni, Sch. hematobium

Drakunkulijaza Dracunculus medinensis

INSEKTI – VEKTORI BOLESTI

Malarija (vektor komarac iz roda Anopheles)

Plasmodium sp.

Tripanosomijaza (vektor muha iz roda Glossina)

Tripanosoma sp.

Filarijaza (vektor komarac) Nematoda

Onhoceroza (vektor muha) Nematoda

Žuta groznica (vektor komarac) Virus

RAZNO

Kožne bolesti Bakterije, virusi, gljivice

Očne bolesti Bakterije, virusi

Gastroenteritis Lebdeći organizmi

Izvor: Šantić, 2008/2009.

38




8. SALMONELLA SP.

Salmonella sp. može uzrokovati različite kliničke sindrome u istih ili različitih domaćina, a prema afinitetu za svog prirodnog domaćina dijele se u tri skupine:

1. serotipovi adaptirani samo na čovjeka,

2. serotipovi adaptirani samo na neke određene životinje, i

3. serotipovi koji imaju raspon domaćina.

Činitelji koji određuju patogenost pojedinih tipova salmonela su po-vršinski antigeni (O-antigen, čini bakteriju otpornom na makrofage), invazivnost (iskazuje se u sposobnosti prodora u epitelne stanice), endotoksin, enterotoksin i citotoksin.

Salmonele ulaze u ljudski organizam putem probavnog sustava i uzrokuju tri tipa bolesti:

1. Gastroenteritis je najčešći oblik salmoneloze. To je infekcija kratke inkubacije (12 – 48 h) s mučninom, grčevima u trbuhu, povraćanjem i proljevom.

2. Crijevnu groznicu, trbušni tifus, uzrokuje bakterija S. typhi. Ona prolazi kroz sluznicu crijeva i razmnožava se u limfnom tkivu, limfnim čvorovima, te u jetri i slezeni. Nakon inkubacije od 7 do 10 dana dolazi do bakterijemije te pojave općih znakova infekci-je: kontinuirane visoke temperature do 40 °C, krajnje iscrpljeno-sti te pojave osipa na trbušnom zidu. Tijekom bakterijemije do-lazi do infekcije bilijarnog stabla te drugih organa.

3. Septički sindrom je najrjeđi oblik salmoneloze. Uzrokuju ga sal-monele visoke invazivnosti, koje odmah prolaze kroz crijevni epi-tel u krvotok, izazivaju opće septičke simptome. Mogu izazvati sekundarne infekcije različitih organa, ali se ne razmnožavaju se-kundarno u crijevu, tako da nema proljeva.

9. SHIGELLA SP.

Shigella sp. uzrokuje gastrointestinalnu infekciju pod nazivom šige-loza ili bacilarna dizenterija. Ove bakterije su vrlo infektivne. Njihovu patogenost određuje nekoliko činitelja: egzotoksin (djeluje neurotok-sično, kod bolesnog čovjeka može izazvati meningitis i komu) i en-dotoksin (izaziva nadražaj sluznice crijeva, time pojačavajući peri-staltiku).

Infekcija je ograničena na probavni trakt, šigele rijetko prelaze u krv. Inkubacija traje 1 do 2 dana, početak bolesti je nagli s povišenom temperaturom, kolikama i vodenom stolicom.

Nakon dan, dva, broj stolica se povećava i sadrže krv i sluz. Kod odraslih dolazi do spontanog izlječenja za 2 do 5 dana, dok kod djece i starijih osoba može doći do acidoze, dehidracije i smrti.

10. VIBRIO CHOLERAE

Vibrio cholerae uzrokuje koleru koja zahvaća tanko crijevo. Činitelj patogenosti je kolera toksin koji potiče lučenje iona klora u crijevo, a zaustavlja apsorpciju iona natrija iz crijeva. Ti procesi dovode do osmotske neravnoteže i dolazi do ulaska velike količine vode u crije-vo. Simptomi kolere su jak vodenasti proljev, povraćanje, grčevi u crijevima te dehidratacija. Stolica u kolere ima karakterističan izgled rižine sluzi, a sastoji se od epitelnih stanica, crijevne sluzi i vrlo veli-kog broja bakterija. Smrtnost od kolere može u neliječenih slučajeva iznositi i do 60 %.

11. SULFITOREDUCIRAJUĆE KLOSTRIDIJE I CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

U ispitivanju voda klostridije imaju ulogu pomoćnog indikatora. Ob-zirom na stvaranje sulfida kao metabolita (reduciraju sulfite u sulfide pri 37 °C u 24 h), većina pripadnika roda Clostridium nazivaju se sulfitoreducirajućim klostridijama (SRK). Rod Clostridium čini više od 100 vrsta gram-pozitivnih, sporogenih, anaerobnih štapića, koji pripadaju porodici Clostridiaceae, od kojih su poneki sposobni sporo rasti pri manjim količinama zraka. Većina vrsta ovog roda su saprofiti koji normalno rastu u tlu, vodi, sedimentu, razgrađujući organski ma-terijal. Neke vrste su komenzalni u crijevima ljudi i životinja.

Nekoliko vrsta je patogeno za ljude, prvenstveno C. perfringens (plinska gangrena), C. tetani (tetanus), C. botulinum (botulizam) i C. difficile (dijareja). Ovi patogeni imaju primarnu saprofitsku ulogu u prirodi, što ih na neki način čini oportunističkim patogenima. Uz samo neke iznimke, ove bakterije proizvode snažne egzotoksine. Koriste se kao pokazatelji fekalne kontaminacije.

Mogućnost stvaranja spora omogućuje ovim bakterijama preživlja-vanje u nepovoljnim uvjetima okoliša, u kojem su široko rasprostra-njeni. Znatno duže preživljavaju od vegetativnih bakterijskih stanica, otpornije su na koncentracije klora koje se primjenjuju pri dezinfek-ciji vode, te stoga ovaj mikrobiološki pokazatelj može biti pokazatelj efikasnosti procesa dezinfekcije vode ili može ukazivati na stariju fekalnu kontaminaciju. U površinskim vodama kao i drugim okoliš-nim uzorcima, može biti prisutan veliki broj vrsta klostridija. Najvaž-

40




nija sulfit-reducirajuća vrsta je Clostridium perfringens. Spore su im vrlo otporne u okolišu. Zbog toga, služi kao robustan indikator, kako svježe fekalne kontaminacije, dodatno otežane kemijskim onečišće-njem, pri čemu su drugi fekalni indikatori uništeni, tako i starijeg onečišćenja. U okolišu se C. perfringens ne razmnožavaju, te zbog toga njihov nalaz u vodi ne precjenjuje stupanj fekalne kontaminaci-je.

Clostridium perfringens je bakterija koja stvara najveći broj toksina koji su proteini, a razlikuju se po vrsti i broju antigenih činitelja. Naj-važniji toksin je lecitinaza (alfa-toksin) koju stvaraju svi tipovi C. per-fringens, djeluje hemolitički te uzrokuje nekrozu na membranama le-ukocita i mišićnih stanica. Beta-toksin je letalan i izaziva nekrozu, a ostali toksini su kao činitelji virulencije od manjeg značaja. Neki sojevi C. perfringens za vrijeme sporulacije izlučuju enterotoksin koji je od-govoran za alimentarne toksikoinfekcije.

Clostridium perfringens uzrokuje brojne kliničke manifestacije kao što su:

• plinska gangrena (klostridijska minekroza) – akutna, po život opasna infekcija koja predstavlja klinički sindrom, infekcija je često polimikrobna, aerobne bakterije oštećuju tkiva i troše kisik te pomažu razvoju anaerobne infekcije, nastaje nakon teške ozljede mišića,

• klostridijska sepsa javlja se nakon operativnih zahvata na cri-jevima, kod alkoholičara, srčanih i plućnih bolesnika,

• gangrenozne nekroze crijeva javljaju se nakon operativnih za-hvata, penetrantnih ozljeda ili uz malignome, i

• nekrotizirajući enteritis je uzrokovan lučenjem beta-toksina.

12. LEGIONELLA SP.

Legionele su bakterije koje spadaju u porodicu Legionellacae, rod Legionella, a bolesti koje izazivaju nazivaju se legioneloze. To su štapići veličine 0,3–0,9 × 2–20 µm, boje se negativno po Gramu, aerobi su. Za rast su im neophodni L-cistein hidroklorid i soli želje-za. Legionele su ubikvitarni mikroorganizmi koji se nalaze svugdje u prirodi, posebice u vodi i vlažnom tlu. U prirodi su prisutne u ma-lom broju i ne predstavljaju opasnost za čovjeka. Problem se javlja kada legionela dospije u umjetne sustave koje je izgradio čovjek i tamo se razmnoži (“Man made Disease”). Poznato je pedesetak vr-sta iz roda Legionella i više od 70 seroskupina. Infekcije kod ljudi najčešće izaziva L. pneumophila (~90 % infekcija) koja je na teme-lju antigene građe podijeljena u 14 seroskupina od kojih je najčešća

seroskupina O1 koja uzrokuje legionarsku bolest, a češće se pojav-ljuju i seroskupine 4 i 6. Druga vrsta oboljenja je Pontiak groznica, blaži oblik respiratorne infekcije, slična gripi. Temperatura, stagnaci-ja vode (posebno u slučajevima sezonskog rada objekta), korozija cijevi, formiranje biofilma... su sve faktori povezani s prisutnošću le-gionele. Legionele mogu kolonizirati sustave i uređaje koji koriste vodu na temperaturi 20-45 °C, a prisustvo biofilmova štiti ih od vanjskih utjecaja i djelovanja biocidnog sredstva. Tako se može naći u vodovodnim cijevima, vodospremama, uređajima za zagrijavanje, hlađenje i ovlaživanje zraka, aparatima za pravljenje leda, fontana-ma. Organski sediment, različiti organski i anorganski precipitati, vodeni kamenac, metalni oksidi, olakšavaju legionelama vezanje za površinu. Ljudi se zaraze udisanjem kontaminiranog vodenog aero-sola, najčešće na slavinama, tuševima, spa bazenima, u okolici vo-denog tornja. Od legioneloza obolijevaju sve dobne skupine, ali če-šće starije osobe i osobe oslabljenog imuniteta, a legionarska bolest češće se javlja u proljeće i ljeto.

Kultivacija legionele je zahtjevna i dugotrajna, najbolje raste na hra-njivim podlogama s puferiranim drvenim ugljenom i ekstraktom kvasca (engl. Buffered Charcoal Yeast Extract Agar, BCYE).

13. HIDRIČNE INFEKCIJE

Hidrične infekcije nastaju: ingestijom mikroorganizama, lošom higije-nom (npr. prljavim rukama), u kontaktu s vodom onečišćenom uzroč-nicima – domaćinom koji jedan dio životnog ciklusa živi u vodi (infek-cije uzrokovane mikroorganizmima koji parazitiraju u parazitima), ubodom insekata – vektora bolesti (infekcije člankonošcima).

Hidrične bolesti (“Water-borne Diseases”) su bolesti nastale ingesti-jom vode kontaminirane humanim ili životinjskim materijalom koji sadrži patogene mikroorganizme. Uključuju koleru, tifus, amebnu i bacilarnu dizenteriju i druge dijaralne bolesti.

Dijaralne bolesti su:

• giardijaza (protozoa),

• kriptosporidijoza (protozoa),

• kampilobakterijoza (bakterija),

• šigeloza (bakterija), i

• virusni gastroenteritisi (virusi).

42




Bolesti uzrokovane lošom higijenom, kontaktom kože ili očiju sa za-gađenom vodom uključuju scabies, trahomu, tifus i druge bolesti koje se prenose člankonošcima. Hidrične bolesti uzrokuju i paraziti koji se nalaze u organizmima koji žive u zagađenim vodama. Uklju-čuju šistosomijazu i drakunkulijazu. Bolesti uzrokovane člankonošcima koji se razmnožavaju i hrane bli-zu vode uključuju dengue, filarijazu, malariju, onhocerozu, tripano-somijazu i žutu groznicu (tablica 6).

BAKTERIOLOŠKA ANALIZA VODE ZA PIĆE

14. METODA MEMBRANSKE FILTRACIJE

Tehnika membranske filtracije koristi se u mikrobiologiji voda jer je praktična, jednostavna, ekonomična, ponovljiva, te omogućuje kvantitativnu detekciju mikroorganizama. Princip ove tehnike je kon-centriranje mikroorganizama iz uzorka na površini membranskog filte-ra, te nacjepljivanje mikroorganizama na hranjivu podlogu. Uzorkova-nje se provodi u posebno oblikovanim bocama u koje se uzima najčešće po 100 ml uzorka vode. Odabrani volumen vode filtrira se preko membranskih filtera, te se na filteru, ovisno o veličini pora, zadr-žavaju bakterije prisutne u vodi. Nakon filtracije, membranski filter prenese se s metalnog držača na kruti hranjivi medij i inkubira na temperaturi koja je definirana metodom. Nutrijenti i metaboliti se iz-mjenjuju kroz sustav pora membranskog filtera. Kolonije, koje se ra-zvijaju na površini membranskog filtera tijekom inkubacije, se broje i preračunavaju s obzirom na volumen uzorka. Važno je naglasiti, da je kod primjene ove metode filter potrebno prenijeti na krutu hranjivu podlogu, jer na tekućoj hranjivoj podlozi brojanje kolonija ne bi bilo moguće. Prednosti primjene ove tehnike je mogućnost ispitivanja ve-ćeg volumena uzorka, što kod direktne metode nije moguće. Koncen-tracija uzorka povećava točnost mikrobiološke detekcije. Sljedeća prednost jest to što se izbrojene kolonije mogu direktno preračunati na volumen uzorka. Membranski filter se nakon obrade može osušiti i spremiti kao trajni dokaz testa (slika 3).

Slika 3. Tehnika membranske filtracije

Izvor: Vukić Lušić D., 2015.

43

44




14.1. Određivanje broja kolonija na 22 °C i na 37 °C (HRN EN ISO 6222:2000)

Slika 4. Postupak određivanja broja kolonija na 22 °C i na 37 °C


14.2. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterije Escherichia coli i koliformnih bakterija (HRN EN ISO 9308-1:2014) – tehnika membranske filtracije

Slika 5. Postupak dokazivanja bakterije Escherichia coli i koliformnih bakterija




46


14.3. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterije Escherichia coli i koliformnih bakterija Colilert metodom (HRN EN ISO 9308-2:2014) MPN metoda (engl. Most Probable Number, hrv. najvjerojatniji broj, NVB)

Tradicionalni testovi dokazivanja koliforma koji su koristili tehniku membranske filtracije, bazirali su se na fermentaciji šećera laktoze uz stvaranje kiseline i plina. Jedan od enzima koji sudjeluje u ovom procesu je ß-galaktozidaza, koji razgrađuje disaharid laktozu na mo-nosaharide glukozu i galaktozu.

Colilert testovi koriste tehnologiju definiranog supstrata (DST tehnolo-gija), pri čemu traženi mikroorganizmi koji posjeduju potrebne enzime metaboliziraju hranjive indikatore (kemijski supstrat), a test se bazira na dokazivanju aktivnosti tih specifičnih enzima.

Bakterijska stanica može se inducirati na proizvodnju ß-galaktozida-ze izlaganjem hranjivom indikatoru ONPG-u (orto-nitrofenil-ß-D-ga-laktopiranozid), koji imitira molekulu laktoze, te ga cijepa na ONP (orto-nitrofenil-ß-D-piranozid), koji je žute boje. Dakle, koliformi (uključujući E. coli) metaboliziraju kromogeni supstrat ONPG, što testne jažice boji u žuto (Slika 6).

E. coli metabolizirati će također i fluorescentni MUG (substrat 4-metilumbelliferil-ß-D-glukoronide) pomoću enzima ß-glukoronida-ze stvarajući 4-metil-umbelliferon, koji fluorescira pod UV svjetlo-šću (365 nm). Nažalost, sposobnost pretvorbe supstrata MUG u fluorescentni spoj ne iskazuju mnogi patogeni sojevi E. coli, tako da se oni ovom metodom ne detektiraju.

Metoda se može primijeniti na sve tipove vode, uključujući one koje imaju povećanu količinu suspendiranih tvari ili su opterećene viso-kim udjelom ostalih heterotrofnih bakterija. Međutim, ne može se koristiti za brojanje koliformnih bakterija u morskoj vodi. U slučaju korištenja ove metode za brojanje E. coli u morskoj vodi, potrebno je uzorak deseterostruko razrijediti sa sterilnom vodom, obzirom da su dobiveni dobri rezultati s morskom vodom s nižom koncentraci-jom soli. U nedostatku podataka o salinitetu, potrebno je koristiti deseterostruko razrjeđenje.

Postupak

Tijekom kvantitativnog određivanja pojedinog mikroorganizma u vodi ulije se 100 ml uzorka vode s reagensom u posebnu ploču (Quanti-Tray) s jažicama. Nakon inkubacije broje se jažice s pozitiv-nom reakcijom, a točan se broj očita iz MPN tablica (Tablica 7).

Postoje Quanti-Tray pločice koje omogućuju brojenje do 200 bakte-rija (51 jažica) i pločice do 2419 bakterija (97 jažica) u 100 ml uzorka. Na istoj Quanti-Tray pločici moguće je očitati ukupan broj koliforma i E. coli. Najprije se očita broj žutih jažica (koliformi), a zatim se pod UV svjetlom očita broj jažica koje fluo resciraju (E. coli) (slika 7).

Ako je jažica žuta reakcija je pozitivna na ukupne koliforme. Ako iste jažice fluoresciraju pod UV svijetlom reakcija je pozitivna na E. coli.

Metoda ne zahtijeva korištenje potvrdnih testova, što je čini testom jednostavnim za provedbu. Identifikacija je specifična (eliminirana je interferencija nespecifičnih bakterija), a subjektivna interpretacija prisutna kod tradicionalnih testova je izbjegnuta.

Dostupnost različitih testova (supstrati) omogućuje detektiranje spe-cifičnih vrsta bakterija (Enterolert – za detekciju enterokoka, Pseu-dalert – za detekciju P. aeruginosa).

Slika 6. Djelovanje ß-galaktozidaze na glukozu i ONPG

Izvor: http://faculty.sdmiramar.edu/dtrubovitz/micro/microhandouts/colilerthandout.pdf

46

48




Slika 7. Colilert metoda za dokazivanje bakterija E. coli i koliformnih bakterija


Tablica 7. MPN tablice za očitanje rezultata Colilert testa

Broj jažica sa pozitivnom reakcijom MPN (Most Probable Number)0 01 12 23 3,14 4,25 5,36 6,47 7,58 8,79 9,910 11,111 12,412 13,713 1514 16,415 17,816 19,217 20,718 22,219 23,820 25,421 27,122 28,823 30,624 32,425 34,426 36,427 38,428 40,629 42,930 45,331 47,832 50,433 53,134 5635 59,136 62,437 65,938 69,739 73,840 78,241 83,142 88,543 94,544 101,345 109,146 118,447 129,848 144,549 165,250 200,551 > 200,5

Izvor: http://www.idexx.com

Voda se smatra sigurnom ako je: • MPN E. coli = 0, • MPN ukupni koliformi ≤ 10 (9,9 u Tablici 7).

50




14.4. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterija iz roda Enterococcus (HRN EN ISO 7899-2:2000)

Slika 8. Slanetz & Bartley-selektivna podloga za dokazivanje i određivanje broja živih stanica bakterija iz roda Enterococcus


14.5. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterija iz roda Salmonella (HRN EN ISO 19250:2013)

Slika 9. Metoda za dokazivanje bakterija iz roda Salmonella


52




14.6. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterije Clostridium perfringens (HRN ISO 14189:2013)

14.7. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterije Pseudomonas aeruginosa (HRN EN ISO 16266:2008)

Slika 11. Metoda za dokazivanje bakterije Pseudomonas aeruginosa


Slika 10. Metoda za dokazivanje bakterije Clostridium perfringens


54




14.8. Metoda za dokazivanje i brojenje bakterije Legionella

14.8.1. Detekcija i brojenje Legionella (HRN ISO 11731:2000)

Slika 12. Metoda za dokazivanje bakterije Legionella


14.8.2. Detekcija i brojenje Legionella – 2. dio (HRN ISO 11731-2:2008)

Slika 13. Metoda za dokazivanje bakterije Legionella – za vode s malim brojem bakterija


56




MOLEKULARNI PRISTUP U IDENTIFIKACIJI MIKROORGANIZAMA U VODI

Složenost interakcija u vodenom sustavu između prisutnih mikroor-ganizama u vodi i različitih kemijskih, organskih i anorganskih kom-ponenata uključuje kompetitivne, simbiotičke i interakcije s različi-tim mikroorganizmima.

Molekularni pristup u istraživanju interakcija koje se odvijaju u vo-denom ekosistemu omogućuje i precizniji uvid u mehanizam djelo-vanja različitih mikroorganizama. Molekularni pristup u izučavanju mikrobnih ekosustava potvrdio je ograničenja u izolaciji bakterijskih vrsta klasičnim mikrobiološkim metodama, a kao rezultat razvilo se novo područje istraživanja tzv. “molekularna mikrobna ekologija”. Novi pristup se od klasične mikrobne ekologije razlikuje po tome što se mikrobni ekosustavi proučavaju bez upotrebe konvencionalnih kultivacijskih tehnika.

Glavne poteškoće za postizanje detaljnijeg uvida u vodeni ekosustav i djelovanje mješovitih kultura mikroorganizama u složenom vode-nom ekosustavu su sljedeće:

1. Velik broj mikroorganizama prisutnih u vodi ne može se uzgojiti klasičnom kultivacijom na postojećim hranjivim podlogama.

2. Svojstva koje mikroorganizam pokazuje u in vitro uvjetima, ne moraju biti ista kakva će pokazivati in situ, u vodi.

3. Vrlo je teško definirati ulogu jedne mikrobne vrste u tako kom-pleksnom sustavu kao što je vodeni ekosustav.

Primjena molekularnih tehnika za identifikaciju mikroorganizama (engl. Polymerase Chain Reaction, PCR; lančana reakcija polimera-zom, i njezinih modifikacija) omogućava bolje razumijevanje sastava mikrobne populacije u vodenom ekosustavu od onog dobivenog po-moću tradicionalnih mikrobioloških tehnika koje koriste selektivne hranjive podloge i uzgoj mikroorganizama na Petrijevim pločama. Pri-mjena metodologije bazirane na nukleinskim kiselinama je značajno poboljšala identifikaciju bakterijskih izolata iz vodenog mulja. Ove tehnike pomažu u analizi bakterijskih zajednica na razini roda ili vrste i razumijevanje načina njihove interakcije s ostalim sudionicima vode-nog ekosustava. Molekularne tehnike su omogućile neposrednu iden-tifikaciju bakterijskih vrsta u uzorku i bez prethodnog uzgoja na hra-njivoj podlozi.

Tako je razvijena tehnika direktne amplifikacije 16S rRNA iz uzoraka otpadne vode ili mulja, uz upotrebu PCR-a.

Bakterijske stanice iz uzorka se koncentriraju centrifugiranjem, a za-tim direktno podvrgnu PCR analizi, ili se prethodno ekstrahira DNA ili RNA. Ukupna RNA može se također uzeti u daljnju analizu ako se upotrijebi enzim reverzna transkriptaza koji će napraviti dvolančanu nukleinsku kiselinu za PCR analizu. rRNA se češće koristi za analizu nego DNA, jer bakterije koje brzo rastu proizvedu veće količine rRNA. Metode koje se mogu primijeniti za završnu analizu sastava mikroorganizama u uzorku su: kloniranje i sekvencioniranje indivi-dualnih rRNA gena; odvajanje individualnih rRNA produkata gel-elektroforezom u denaturirajućem gradijentu (engl. Denaturing Gradi-ent Gel Electrophoresis, DGGE) ili gradijentu temperature (engl. Temperature Gradient Gel Electrophoresis, TGGE) i hibridizacija sa specifičnim oligonukleotidnim probama. Dobivanje informacija o po-jedinačnim stanicama in situ u uzrocima otpadne vode ili mulja, ta-kođer je moguće zahvaljujući razvoju osjetljivih fluorescentnih mar-kera koji omogućavaju da oligonukleotidne probe postanu vidljive primjenom fluorescentne mikroskopije. Vizualizacija specifičnih bak-terijskih vrsta, na razini jedne stanice, in situ, može se postići pro-kariotskom in situ PCR analizom (PI-PCR) ili fluorescentnom in situ hibridizacijom (FISH) (tablica 8).

Tablica 8. Različite metode za identifikaciju mikroorganizama u vodenom ekosustavu

Metode Primjena Komentari

Klasične mikrobiološke kultivacijske tehnike

Izolacija čiste kulture Nepouzdana za identifikaciju većine vrsta, hranjive podloge su nedovoljno selektivne; dugotrajan postupak identifikacije

16S rRNA banka gena i sekvencioniranje

Identifikacija i filogenost

Odabir specifičnih početnica može biti upitan

16S rRNA/rDNA dot-blot hibridizacija

Detekcija, kvantifikacija i aktivnost pojedinih vrsta mikroorganizama

Daje informacije o aktivnosti pojedinih vrsta mikroorganizama pomoću omjera rRNA/rDNA; potreban je opsežan set rRNA proba

FISH – primjena 16S rRNA proba

Detekcija i specifikacija pojedinačne stanice

Obrada velikog broja uzoraka uz primjenu “image analysis” programa i protočne citometrije

DGGE/TGGE 16S rRNA amplikona

Brza identifikacija različitih vrsta mikroorganizama

Zasniva se na specifičnom umnožavanju; “semi-quantitative pairs”; identifikacija ekstrakcijom fragmenata i sekvencioniranje validacijom početnica za pojedine vrste mikroorganizama

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (real-time PCR) jedinstvene genomske DNA ili 16S rRNA

Detekcija i kvantifikacija

Zahtjeva dizajnirane probe/početnice i validaciju; različiti genomi pojedinih vrsta mikroorganizama, obrada velikog broja uzoraka

Izvor: Frece J., 2007.

58




odnosa sa njihovom relativnom molekulskom masom. Proteinski kompleksi sa SDS-om gibaju se prema anodi brzinom obrnuto proporcionalnom logaritmu njihovih relativnih molekulskih masa. Molekule s manjom relativnom molekulskom masom putuju brže, nego one veće relativne molekulske mase, uslijed efekta molekulskog sita umreženog poliakrilamida.

15.1.1. Serološke (imunološke) metode

Najbrža od fenotipskih tehnika je serološka metoda, pomoću koje se bakterijski izolati mogu biti direktno klasificirani, bez precijeplji-vanja, vezanjem s monoklonalnim antitijelom specifičnim za određe-ni rod, vrstu ili soj. Baziraju se na specifičnom vezanju antitijela na antigen.

15.2. Genotipske tehnike

Prva genotipska metoda (“DNA fingerprinting”) je bila hibiridizacija s “probama” nukleinskih kiselina (“proba” je dio jednolančane nu-kleinske kiseline koja se može specifično hibridizirati sa svojom komplementarnom sekvencijom). Relativno kratke oligonukleotidne “probe” (oko 20 nukleotida) iz određene regije rRNA koriste se za utvrđivanje specifičnog roda odnosno bakterijske vrste. Takve oligo-nukleotidne probe (početnice) moraju biti dizajnirane za identifikaci-ju pojedinih bakterijskih vrsta. Potrebna je liza stanica, izolacija DNA ili RNA.

Iako je hibridizacija s nukleinskim kiselinama temeljna tehnika, ra-zvijene su iz nje mnoge druge, sofisticiranije metode, koje se u pra-vilu zasnivaju na usporedbi duljine fragmenata DNA pomoću gel elektroforeze, kao npr:

• Lančana reakcija polimeraze (engl. Polymerase Chain Reacti-on, PCR)

• Nasumična amplifikacija (umnažanje) (engl. Random Amplifi-cation of Polymorphic DNA, RAPD) (slika 14)

• Elektroforeza u promjenjivom električnom polju (engl. Puls Field Gel Electrophoresis, PFGE) (slika 15)

• Ribotipizacija.

Da bi se koristila fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) potrebno je razviti specifične oligonukleotidne probe za prepoznavanje 16S rRNA sekvencije pojedinih bakterijskih vrsta ili ostalih mikroorgani-zama. Ovom metodom mogu se identificirati i one bakterijske vrste koje nije moguće uzgojiti klasičnim mikrobiološkim metodama, a prisutne su u uzorku. Međutim, najmanja koncentracija stanica po-trebnih za mikroskopsku identifikaciju bakterijskih vrsta primjenom in situ hibridizacije je 106 stanica/g. Primjenom određene kombina-cije tih proba mogu se razlikovati žive, mrtve i oštećene bakterijske stanice. Za razvrstavanje tih stanica koristi se protočna citometrija, a identifikacija bakterijskih sojeva se provodi primjenom gel elektro-foreze u denaturirajućem gradijentu (DGGE) nakon amplifikacije DNA koja kodira za 16S rRNA.

15. MOLEKULARNE METODE

Za identifikaciju i klasifikaciju bakterija na razini vrste, izoliranih iz ra-zličitih vodenih ekosustava (rijeke, jezera, mora, otpadne vode), pri-mjenjuju se fenotipske i genotipske identifikacijske tehnike.

15.1. Fenotipske tehnike

Biokemijski testovi – nakon kultivacije na selektivnim podlogama, biokemijski testovi pomažu u dodatnoj identifikaciji i potvrdi odre-đene bakterijske vrste. Često se koriste biokemijski testovi koji se baziraju se na vrlo jednostavnom principu, na fermentaciji različitih ugljikohidrata.

SDS – poliakrilamidna gel elektroforeza – topljivih proteina i

masnih kiselina

PRINCIP RADA

Proteinski uzorci se tretiraju sa SDS-om (engl. Sodium Dodecil Sul-fat, SDS) uz zagrijavanje (najčešće kuhanjem nekoliko minuta). Ani-onski detergent (SDS) veže se čvrsto na većinu proteina dovodeći im velik broj negativnih naboja. Interakcije sa SDS-om cijepaju sve nekovalentne veze izazivajući odmotavanja proteina.

Popratni tretman disulfidnim reducirajućim agensom, kao što je β-merkaptoetanol, dalje denaturira proteine i disocira ih u podjedi-nice.

Elektroforetska pokretljivost nekog proteina ovisna je o omjeru naboja i mase, a vezivanje SDS-a na proteine ujednačava taj omjer u proteinskoj smjesi, te rezultira poprimanjem istih funkcionalnih

60




Slika 14. DNA fragmenti dobiveni RAPD analizom pomoću specifične početnice

Izvor: Frece J., 2007.

Slika 15. Elektroforeza u promjenjivom električnom polju

Izvor: http://www.nuigalway.ie/salmonella_lab/molecular_analysis.html

15.2.1. Lančana reakcija polimerazom (engl. Polimeraze Chain Reaction, PCR)

To je metoda umnažanja određenog odsječka DNA, brza, osjetljiva i specifična. Mora se poznavati slijed DNA, odnosno slijed nukleotida odsječka DNA koji se umnaža. Taj slijed nukleo tida poslužit će za odabir početnica (engl. primers), tj. parova kraćih oligonukleotida koji predstavljaju granice odsječka DNA koji se umnaža. To je kvali-tativna metoda, a postoji i Real time PCR, koji je kvantitativna me-toda.

15.2.2. Random Amplification of Poliymorphic DNA, RAPD

To je metoda nasumičnog umnažanja dobivenih odsječaka DNA, brza i nespecifična. Koristi se jedna kratka početnica (10 – 12 nu-kleotida), nespecifična, a rezultat je višestruko vezanje na djelomič-no ili potpuno komplementarne sekvence u genomu.

15.2.3. Elektroforeza u promjenjivom električnom polju (engl. Puls Field Gel Electrophoresis, PFGE)

Metoda razdvajanja odsječaka DNA bakterijskog kromosoma koji su nastali razgradnjom restrikcijskim enzimima. Genomska DNA se raz-građuje restrikcijskim endonukleazama pri čemu nastaje tek nekoliko velikih fragmenta DNA. Nastali fragmenti DNA se razdvajaju prema veličini pomoću PFGE tehnike. Dobiveni “DNA fingerprint” ovisi o upotrebljenoj restrikcijskoj endonukleazi i o genomu bakterije, a ka-rakterističan je za bakterijsku vrstu ili soj. “DNA fingerprint” profil nastaje kao rezultat enzimske razgradnje genoma što omogućuje pra-ćenje pojave mutacija koje su posljedica primjerice delecije, insercije te prerasporeda gena.

15.2.4. Ribotipizacija – analiza gena koji kodiraju za ulomak RNA

Osim za utvrđivanje genetičke raznolikosti različitih vodenih ekosu-stava (“diversity analysis”, “comparative genomics”), mogu se razvi-ti i specifične oligonukleotidne probe za utvrđivanje metaboličke ak-tivnosti otpadnih voda ili mulja, jezera, oceana, kojima se proučava fiziološka aktivnost na razini pojedinačnih mikrobnih stanica. Pri-mjenom određene kombinacije tih proba mogu se razlikovati žive, mrtve i oštećene bakterijske stanice. Za razvrstavanje tih stanica koristi se protočna citometrija, a identifikacija bakterijskih sojeva se provodi primjenom DGGE elektroforeze nakon amplifikacije DNA koja kodira za 16S rRNA.

62


Stanice se automatski detektiraju kad prođu kroz laserski snop, upo-trebom fluorescentnih boja i antitijela mjere se ukupne nukleinske ki-seline, DNA, RNA, različite vrste stanica. Rezultat se dobije u nekoli-ko minuta, osjetljivost je 102 – 103 st/ml, ali uporaba protočnog citometra nije raširena jer je skup i zahtjeva kompleksnu opremu.

Primjena velikog broja oligonukleotidnih proba za obradu uzoraka iz otpadnih voda ili mulja može se ostvariti primjenom “DNA čip” teh-nologije. Ona podrazumijeva imobilizaciju DNA na površinu čipa koja se zatim hibridizira s DNA iz uzorka obilježenim fluorescentnim bojama. Na jedan čip moguće je nanijeti desetak tisuća uzoraka.

Preduvjet za primjenu “DNA-microarray” metode, kojom se mogu odrediti svojstva prisutnih mikroorganizama u vodenom ekosustavu, kompletno je sekvencioniranje genoma pojedinih bakterijskih vrsta i ostalih mikroorganizama.

Kompletno sekvencioniranje, ne samo pojedinih bakterijskih geno-ma, već i animalnih modela i ljudskog genoma, omogućilo je global-ni razvoj tehnologija funkcionalne genomike što uključuje transkrip-tomiku, proteomiku i metabolomiku.

Zbog kompleksnosti proteomičkog pristupa, on se za sada ne koristi za proučavanje kompleksnih ekosustava kao što je vodeni ekosustav.

Proteomika se bavi vizualizacijom, kvantifikacijom i identifikacijom proteina u stanici tj. odražava posljedicu ekspresije gena.

Metabolomika određuje koncentraciju metabolita u stanici i reflekti-ra enzimsku aktivnost i regulaciju metaboličkih puteva. Moćna ana-litička metoda koja se u današnje vrijeme koristi za izučavanje me-tabolizma (metabolomike) je nuklearna magnetska rezonancija (engl. nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR). Primjenom NMR-a može se dobiti informacija u realnom vremenu, o koncentra-ciji intracelularnih metabolita u živoj stanici (neinvazivna tehnika) i o istjecanju metabolita iz nje. Ova tehnika, u kombinaciji s “DNA-mi-croarrays” (za identifikaciju koordinirane regulacije gena), dvodi-menzionalnom elektroforezom proteina i masenom spektrometri-jom, predstavlja najsuvremeniju metodologiju za provođenje metabolomičkih, transkriptomičkih i proteomičkih analiza za prou-čavanje dinamičkog modela metabolizma bakterijske stanice i nje-nih interakcija s okolinom.

Također, metabolomičke metode još nisu primjenjive u ovakvim istraživanjima, međutim u bliskoj budućnosti treba računati na pri-mjenu najsuvremenijih pristupa koji nisu utemeljeni na nukleinskim kiselinama (“non-nucleic acid-based approaches”), a koji će upot-puniti genomički pristup istraživanjima vodenog ekosustava.

DIO II. UZORKOVANJE



DIO II. UZORKOVANJE


UZORKOVANJE

Bit uzorkovanja je izuzimanje dijela uzorka na način koji osigurava njegovu reprezentativnost. Transport do laboratorija mora osigurati nepromjenjivost uzorka u svim njegovim dijelovima u svrhu provo-đenja tražene analize te dobivanja točnog i pouzdanog rezultata.

S uzorkom postupamo na način da tijekom razdoblja uzorkovanja, transporta i trajanja analize ne dođe do promjene u sastavu uzorka (vode). Ako su uzorci reprezentativni, obično je dovoljno jednokratno uzorkovanje. Nereprezentativni uzorci se ne analiziraju – izuzetak su uzorci dostavljeni od privatnih osoba na vlastiti zahtjev, ali uz napo-menu da se analiza odnosi isključivo na dostavljeni uzorak. Ako se sastav izvora mijenja u vremenu, uzorkujemo u određenim vremen-skim intervalima, a ako se sastav izvora mijenja više u prostoru, nego u vremenu, uzorkujemo na različitim mjestima.

Svrha uzorkovanja vode može biti:

• određivanje kvalitete vode (određivanje koncentracije pojedi-nih komponenti u vodi),

• kontrola kvalitete vode (praćenje jednog ili više parametara unutar određenih propisanih vrijednosti, pri čemu broj uzorko-vanja ovisi o mogućnosti pojave odstupanja od postavljenih uvjeta, ili ako je do odstupanja već došlo, od dužine trajanja stanja),

• identifikacija izvora onečišćenja vode (utvrđivanje zagađenja nepoznatog izvora, uglavnom slučajno otkriće periodičnog uzorkovanja).

Ako se planiraju opsežna uzorkovanja, prije uzimanja uzoraka izrađuje se plan uzorkovanja, koji treba sadržavati sljedeće podatke:

• mjesta uzorkovanja,

• frekvenciju uzorkovanja,

• približno trajanje uzorkovanja,

• postupke uzorkovanja, i

• obrada, odnosno konzerviranje uzoraka, a s time i planiranje kemikalija, laboratorijske ambalaže i analitičke opreme.

Plan bi također trebao sadržavati način obrade dobivenih rezultata i vrste statističkih parametara koji će se primijeniti za pojedini uzo-rak.

Prije početka programa preporučeno je provesti preliminarno uzor-kovanje.

66


DIO II. UZORKOVANJE


16. UZORKOVANJE VODE IZ SLAVINE

Prije uzimanja uzoraka potrebno je najprije ukloniti rešetke sa slavi-ne. Na miješanim slavinama ne uzimaju se uzorci za mikrobiološku pretragu, osim ako ne postoji druga mogućnost.

Kod uzorkovanja, svaku bocu ili plastičnu ambalažu isperemo tri puta s vodom (uzorkom), osim ambalaže koja sadrži dodatne rea-genase (za konzerviranje, za redukciju klora idr.). Ispiranje treba provesti oprezno, kako ne bi došlo do kontaminacije ambalaže.

Vodu treba pustiti da neko vrijeme teče, a zatim polako napuniti ambalažu. Kod takvog načina uzorkovanja, voda istiskuje već nato-čenu tekućinu i zrak prema vrhu i sprječava miješanje uzorka sa zrakom. To je osobito važno kod uzorkovanja vode za određivanje otopljenih plinova (O2, CO2, H2S i dr.). Prilikom uzorkovanja treba utočiti vode za barem tri puta veći volumen ambalaže prije nego što je zatvorena.

Ambalažu s uzorcima, namijenjenima za fizikalno – kemijske anali-ze, obično napunimo do vrha, kako ne bi došlo do zadržavanja zra-ka. Na taj način ograničimo miješanje uzorka s plinovitom fazom i miješanje tijekom transporta (spriječimo promjene u sadržaju CO2, pH vrijednosti, taloženje karbonata, oksidaciju Fe (II), smanjimo promjene boje). Ako uzorke namjeravamo zamrznuti ili ih je potreb-no prije upotrebe snažno miješati, napunimo posudu samo do odgo-varajućeg volumena.

Tijekom uzorkovanja provode se određena mjerenja, kao što su: mi-ris, okus, pH, slobodni i ukupni klor (Cl2), ozon (O3), otopljeni kisik (O2), lužnatost, ugljični dioksid (CO2), električna vodljivost, T vode, T zraka, također se upišu vizualna zapažanja. Ukoliko je potrebno, prije transporta uzorke još konzerviramo.

Nakon toga, uzorke propisno označimo uz zapisivanje datuma, mje-sta i vremena uzimanja uzoraka, volumena, dodanih konzervansa, uvjeta uzorkovanja i imena djelatnika koji su proveli uzorkovanje.

17. UZORKOVANJE PODZEMNIH VODA

Prilikom uzimanja uzoraka podzemnih voda najprije se bušotina ili bunar napune svježom vodom, nakon čega se uzorkuje.

Pumpa, koja se koristi za pumpanje i uzorkovanje mora biti čista, te ju je potrebno koristiti samo za pumpanje vode za piće. Kapacitet pumpe mora biti dovoljno velik da ispumpa volumen vode iz buna-ra.

Ako se kao izvor vode za piće koristi podzemna voda, uzorkujemo najmanje jednom mjesečno, a u slučaju da se radi o provjeri izlože-nosti riziku u smislu zaštite ljudskog zdravlja (pogotovo ako se ta voda ne dezinficira), još i češće.

Frekvencija uzorkovanja može se odrediti na osnovu razlike u koncen-traciji pojedinih komponenti. Vremenske i prostorne varijacije u kvali-teti podzemne vode veće su u odnosu na druge izvore. U podzemnim vodama javljaju se i velike sezonske oscilacije.

U slučaju onečišćenja podzemnih voda promjene se najbrže uoča-vaju ako se uzorkuje kontinuirano od nekoliko sati do 2 dana.

Parametri kao što su: vodljivost, pH, temperatura se prate kontinuira-no. Stalno odstupanje bilo kojih od navedenih parametara može biti razlogom povećanja broja uzetih uzoraka i proširenja broja traženih parametara u cilju utvrđivanja eventualnog zagađenja.

Prilikom uzorkovanja podzemne vode koristi se tzv. dubinsko uzor-kovanje i uzorkovanje s pumpama.

Uz pomoć pumpe uzorkujemo vodu koja se koristi kao voda za piće. Pri ovom načinu uzorkovanja, voda iz bunara se izmiješa iz različitih dubina i dobije se reprezentativni uzorak. Pri pumpanju pratimo temperaturu vode, otopljeni O2, pH, vodljivost, a odstupanja ne bi trebala biti veća od 10 % vrijednosti svakog parametra i 0,2 °C kod temperature.

Dubinsko uzorkovanje se izvodi posebnim uređajem koji omogućava uzorkovanje na različitim dubinama. Ovaj način uzorkovanja koristi-mo kada želimo dobiti podatke o promjenama u sastavu vode na različitim dubinama, odnosno ako želimo detektirati tzv. difuzno za-gađenje, koje ulazi s vrha.

17.1. Problem uzorkovanja podzemnih voda

Pri uzorkovanju podzemnih voda dolazi do fizikalnih i kemijskih pro-mjena vode, koje se javljaju kad se uzorak pumpa na površinu. Tada se promijeni temperatura, tlak, pH-vrijednost, električna provodlji-vost te koncentracija otopljenih plinova (posebno O2 i CO2).

68


DIO II. UZORKOVANJE


Dodir s atmosferskim kisikom može uzrokovati oksidaciju, poveća-nje mikrobiološke aktivnosti, utjecaj oborina, isparavanje, promjene u boji i mutnoći uzorka. Važno je da parametre kod kojih očekujemo promjene: pH, temperaturu, otop ljene plinove i lužnatost, odmah odredimo.

Promjena metereoloških uvjeta utječe na kvalitetu vode, naročito ako je promjena temperature između uzorkovanja veća. Pri većoj promjeni temperature tijekom uzorkovanja, mijenjaju se i uvjeti rada mjernih instrumenata.

Uzorke nakon uzimanja označimo, zapišemo ime osobe koja je uzor-kovala, mjesto, datum, tip uzorkovanog mjesta, dimenzije bunara, kapacitet pumpe, razinu vode, dubinu izvlačenja, opis uzorka tije-kom uzorkovanja, rezultate mjerenja na terenu i detalje o konzervi-ranju.

18. SPECIFIČNI PRIMJERI UZORKOVANJA VODE

18.1. Uzimanje uzoraka iz cisterni – rezervoaraUzorkujemo na slavinama, što bliže cisterni. Nekoliko minuta pusti-mo da voda teče, a po potrebi i više. Direktno uzorkovanje iz cister-ne izbjegavamo, osim ako nije apsolutno neophodno (npr. nakon postupaka čišćenja).

18.2. Uzorkovanje nakon dezinfekcije vodovodnoga sustava stambenih zgrada

Nakon dezinfekcije vode lokaliziranog cjelokupnog sustava za opskr-bu vodom (stambena kuća, obiteljska kuća, dječji vrtić itd.) potreb-no je pričekati minimalno 8 sati da se započne sa uzorkovanjem. U slučaju dezinfekcije cijeloga vodovodnog sustava stambenih zagra-da, uzorkujemo na različitim mjestima, a osobito na kraju distribu-cijskog sustava (može biti i više krajnjih točaka) kako bi se mogla kontrolirati učinkovitost dezinfekcije. Prije uzimanja uzorka pustimo vodu da teče 2 – 3 minute (ili do 30 minuta, ovisno o veličini susta-va).

18.3. Pakirana pitka voda (mineralna, stolna i izvorska voda)

Uzorkovanje pakiranih voda, odnosno količina uzorka koji se uzorku-je za analizu, ovisi o veličini serije iz koje se uzorak uzorkuje, odno-sno o vrsti i broju parametara koji će se u takvim uzorcima analizi-rati. Uzeti je potrebno reprezentativni uzorak, izuzeti dovoljan broj plastičnih ili staklenih boca istog lota, serijskog broja i istog datuma proizvodnje odnosno roka upotrebljivosti.

18.4. Voda kontaminirana s uljem, masti i sl.

Prilikom uzorkovanja vode kontaminirane s uljem, masti i sličnim kontaminantima koji na površini tvore mrlje, teško je uzeti reprezen-tativni uzorak. Slično je kod otopljenih nečistoća, hlapljivih tvari i tvrdih kontaminanata. Ako uzorkujemo samo za identifikaciju spoje-va – snimanje onečišćivača, uzmemo što više uljne mrlje ili konta-minirane faze, dok kod kvantitativnog određivanja trebamo homo-gen i reprezentativan uzorak, uzet u linearnom toku vode, bez turbulencije.

70


DIO II. UZORKOVANJE


KONZERVIRANJE UZORAKA

Konzerviranje uzoraka se može provesti fizikalnim i kemijskim pu-tem. Uzorci vode nakon uzorkovanja mogu biti sačuvani i spremljeni na 4 °C, a tijekom duljeg razdoblja mogu se zamrznuti na -20 °C.

Postupkom konzerviranja uzorke stabiliziramo. Reagense za konzer-viranje dodamo u uzorak ili prethodno u ambalažu, ovisno o para-metrima koji će se određivati u uzorku, ali važi opće pravilo: konzer-viramo sa čistim i koncentriranim reagensima kako bi se izbjeglo onečišćenje i razrjeđivanje uzorka.

O općim pravilima za konzerviranje je teško govoriti zato što ni izbor ambalaže niti konzerviranje, odnosno njegova učinkovitost nisu uvijek ovisni o parametrima koje određujemo, nego i o prirodi samog uzor-ka. Događa se da reagensi za konzerviranje uzrokuju probleme kod daljnjih analiza ili utječu na kemijski oblik drugih komponenata u uzorku.

Stoga se preporučuje da se za pojedine parametre ili parametar gru-pa, ambalaža priprema zasebno pa uzorke tako i uzorkujemo, dok se o konzerviranju savjetujemo s analitičarima.

Zašto konzervirati?

U vremenu od uzorkovanja do same analize u vodama se mogu od-vijati različiti fizikalno-kemijski i biološki procesi. Veličina tih reakci-ja je funkcija kemijske i biološke prirode uzorka, njegove temperature, izloženosti svjetlu, osobinama posuda i vremenskom trajanju od uzor-kovanja do analize.

Te reakcije odvijaju se ponekad i nekoliko sati, pa je važno da se uzorci konzerviraju što prije.

19. VRSTE AMBALAŽE

Razlikujemo:

• staklenu,

• plastičnu i

• ambalažu od nehrđajućeg čelika.

Obično upotrebljavamo ambalažu iz stakla ili plastike, što ovisi o parametrima koji će biti testirani u uzorku. Ambalažu od nehrđaju-ćeg čelika upotrebljavamo za uzorkovanje pri visokim tlakovima i vi-sokim temperaturama.

Općenito, ambalaža mora biti takva da se spriječi gubitak uzorka i istovremeno zaštiti od kontaminacije sa stranim spojevima.

Gubici mogu biti posljedica prolijevanja, hlapljenja ili adsorpcije na stijenke posude.

Kontaminacija uzorka može biti vanjska (kontaminacija pri uzorkova-nju, transportu) ili unutrašnja (zbog nepravilne ili nedovoljno očišćene posude, kontaminacije spojevima koji migriraju iz samog materijala).

Svojstva koja dobra ambalaža za uzorkovanje mora imati su:

• otpornost na promjene temperature,

• mehanička otpornost,

• kemijska otpornost,

• kemijska i fizička inertnost (onečišćenje uzoraka s komponen-tama iz ambalaže ili čepova mora biti minimalna, što manja mogućnost reakcija između komponenata u uzorku i kompo-nenti u materijalu iz kojeg je izrađena ambalaža, što manja adsorpcija na stijenke, ...),

• dobro brtvljenje i lako otvaranje,

• jednostavnost pranja i

• mogućnost ponovnog korištenja.

19.1. Staklo

Staklo se ubraja među najbolje inertne materijale. Njegova inert nost ovisi o sastavu, vremenu kontakta s uzorkom, temperaturi, pH vri-jednosti uzorka i uvjetima čuvanja.

Postoji puno vrsta stakla, no kao laboratorijsko staklo najviše se ko-risti natrij-silicijevo (pipete, reagens boce) i borosilikatno staklo (ti-kvice, čaše, Erlenmayer tikvice, staklene aparature).

Prvo je kemijski manje otporno i bolje se rasteže, dok je drugo ke-mijski više otporno i ima oko tri puta manji koeficijent ekspanzije.

Borosilikatno staklo je jako otporno na vodu, kiseline, otopine soli, organske spojeve, halogene (klor, brom) i ima relativno dobru otpor-nost na alkalne otopine (ispiranje alkalijskih silikata).

Kemijska otpornost natrij-silicijevog stakla je slabija zbog povećanog djela lužine u sastavu materijala.

Kod materijala u kojima je monovalentna lužina zamijenjena s poli-valentnim elemenatima (dodaci BaO, CaO, MgO, PBO, Al2O3, ZnO, TiO2), veze su jače i rezultat je bolja kemijska otpornost stakla.

Jedan od kriterija za kemijsku otpornost stakla su migracijski testovi (migracija lužine pod posebnim uvjetima).

72


DIO II. UZORKOVANJE


Tablica 9. Kemijski sastav natrij-silikatnog stakla

Komponenta %

SiO2 73,0

Na2O K2O

15,0

CaOMgO 10,0

Al2O3 1,0

SO3 0,2

Fe2O3 0,05

B2O3 do 0,5

Izvor: Pihlar B., 1994.

Migracijski testovi su u nekim istraživanjima pokazali migracije K, Li, Na, isto i Ca, Mg, Ba, Sr i Fe, Al, As, Cr, Mn. Za razliku od Al, ostali polivalentni ioni su u migracijskim otopinama prisutni samo u tragovima. Migracije nisu bile veće od 1 ppm.

Tablica 10. Kemijski sastav borosilikatnog stakla

Komponenta %

SiO2 80,6

B2O3 12,6

Na2O/K2O 4,2

Al2O3 0,04

CaO 0,1

MgO 0,05

Cl2 0,10

Cu, Zn, Pb, As, Ba < 5 ppm


19.2. Plastični materijali

Osim staklene ambalaže u laboratoriju se također koristi veliki broj različitih vrsta plastične ambalaže. Materijali od kojih je plastično laboratorijsko posuđe najčešće izrađeno (koji se najčešće nalaze u laboratorijskom posuđu) su:

• polietilen (PE),

• polipropilen (PP),

• polietilen tereftalat (PET),

• polivinil klorid (PVC),

• fluoretilen (PTFE),

• etilen – klor – trifluoretilen kopolimer (ECTFE) i etilen – te-trafluoretilen kopolimer (ETFE),

• perfluoroetilen – propilen kopolimer (FEP), i perfluoralkoksi ko-polimer (PFA),

• polistiren (PS),

• stiren – akrilonitril kopolimera (SAN),

• akrilonitril – butadien – stiren kopolimeri (ABS),

• polimetil metakrilata (PMMA),

• polikarbonata (PC),

• poliamid (PA) i

• poloksimetilen (POM).

74


DIO II. UZORKOVANJE


Tablica 11. Svojstva plastičnih materijala

PERazlikujemo niske gustoće (LD) i visoke gustoće (HD), gdje se PE – LD koristi za T = 80 °C i PE – HD do 105 °C.

PETIma odlična mehanička svojstva, temperaturno je postojan materijal, odličan je za pakiranje hrane, posebno pića.

PTFEOtporan je na sve kemikalije, na temperaturu u rasponu od -200 °C do 300 °C i pogodan za upotrebu u mikrovalnoj pećnici.

ECTFE, ETFE, FEP, PFA

Odlikuje ih mehanička otpornost i kemijska inertnost, slično kao kod PTFE, ali su upotrebljivi u užem temperaturnom rasponu.

PVC Kemijski otporan, posebno na ulje.

PA Kemijski otporan na organska otapala, manje na kiseline i oksidanse.

PC Proziran, temperaturno područje upotrebe je od -130 °C do 130 °C.

PSKemijski otporan na vodu, manje na otapala, upotrebljava se pri nižim temperaturama.

SAN Kemijski nešto bolje otporan i ima bolja mehanička svojstva nego PS.

ABS Otporniji je i ima puno bolja mehanička svojstva nego PS.

PMMA(organsko staklo)

Zamjena za staklo, gdje je T < 90 °C i ne zahtijeva se visoka kemijska otpornost.

Izvor: Bregar, 2005.

Tablica 12. Vrste ambalaža koje se koriste u uzorkovanju

Vrsta ambalaže Koristi se za uzorkovanje za parametre

Plastična ambalaža (PE, PTFE, PET, PVC) cijanidi, aluminij, bor, litij i silikati

Ambalaže od plastike ili stakla (natrij-silicijevog stakla)

lužnatost, amonij, arsen, BPK5, bromid, spojevi broma, kalcij, ugljični dioksid, klorid, klor, COD, boje, vodljivost, nitrat, nitrit, kisik, pH, sulfat, sulfid, sulfit, suspendiranih krutina, suhi ostatak, zamućenost

Ambalaža od plastike ili borosilikatnog stakla

barij, kadmij, krom (VI), krom, kobalt, bakar, teški metali (osim Hg), željezo (II), željezo, olovo, magnezij, mangan, nikal, srebro, kositar, cink

Ambalaža od borosilikatnog stakla ili natrij-silicijevog stakla

ortofosati, ukupni fosfor, selen

Ambalaža od stakla (natrij-silicij)AOX, ugljični dioksid, jod, miris, kisik, permanganat indeks, TOC, pesticidi, anionski detergenti

Ambalaža od borosilikatnog stakla živa, fenoli

Izvor: Bregar, 2005.

19.2.1. Svojstva nekih plastičnih materijala

U tablici 11. prikazana su svojstva plastičnih materijala pogod-nih za ambalažu uzoraka.

20. PRIPREMA AMBALAŽE

Nepravilno ili neadekvatno očišćena ambalaža često je uzrok konta-minacije uzoraka.

Novu ambalažu prije uzorkovanja uvijek treba očistiti kako bi se spriječilo moguće onečišćenje zbog prašine i ostataka pakiranja.

Prije čišćenja potrebno je znati koji će se parametri analizirati, te se shodno tome prilagođava proces čišćenja i izabiru sredstva za či-šćenje. Naravno, pri čišćenju moramo voditi brigu o mehaničkim i kemijskim svojstvima materijala iz kojih je ambalaža izrađena.

Preporučljivo je da se pojedini setovi ambalaža koje koristimo pri uzorkovanju za određenu vrstu uzoraka ili parametara pripremaju i spremaju odvojeno. Tako se sprječava unakrsna kontaminacija.

Pri uzorkovanju se, u svrhu kontrole procesa čišćenja ambalaže, u ambalažu uzorkuje i deionizirana voda koja se zatim podvrgava istim analitičkim postupcima kao i ostali uzorci.

Pojedini slučajevi čišćenja:

Kako staklenu, tako i plastičnu ambalažu možemo prati ručno ili strojno. Najbolje je da se nakon upotrebe odmah operu u otopini de-terdženta i temeljito isperu deioniziranom vodom (deterdženti nisu prikladni za čišćenje sredstava za ambalažu namjenjenih uzorcima u kojima se traže fosfati, anionski deterdženti, silikati ili borati).

Staklene posude ne namačemo u jakim lužnatim otopinama (T > 70 °C) dok plastične peremo u slabo alkalnim deterdžentima (posuda iz PS i PC samo u neutralnim deterdžentima).

Ako ambalažu namačemo u otopini sredstva za čišćenje, činimo to 20 do 30 minuta na sobnoj temperaturi. U svim slučajevima, izbje-gavajte agresivna sredstva.

Staklenu ambalažu namijenjenu uzorkovanju za analize mikroele-menata napunimo s otopinom 1 M HCl ili HNO3, ostavimo stajati (do 6 sati), a zatim isperemo s deioniziranom vodom. Još bi bilo bolje da staklenu ambalažu zagrijavamo u 1 M HNO3 približno 1 sat (pri temperaturi vrelišta). Plastične posude ne smijemo zagrijavati (HNO3 je snažan oksidans, uzrokuje krhkost i lom ljivost plastike).

Kod uzorkovanja za analizu pesticida, sve posude se isperu s naj-prije vodom i deterdžentom, potom se dobro isperu s deionizira-nom vodom te dva sata suše na 105 °C, ohlade i isperu smjesom koja se koristi za ekstrakciju pri samoj analizi (obično heksan).

76


Za posudu koja je već bila u upotrebi, preporuča se ekstrakcija s acetonom, nakon čega slijedi ispiranje s otapalom i sušenje, kao što je prije spomenuto.

Uzorke čuvamo pri temperaturi nižoj od one koja je bila prilikom uzorkovanja. Hlađenje, odnosno čuvanje pri temperaturi od 2 °C do 5 °C je učinkovito u vremenskom razdoblju od uzorkovanja do laboratorija, odnosno za kratko vrijeme do analize. Pri duljem razdoblju, potrebno je zamrzavanje (-20 °C).

Volumen uzorka

Adekvatna količina uzorka, je ona koja osigurava dovoljnu količinu za analizu i moguće ponavljanje. Ako uzmemo mali volumen uzor-ka, najvjerojatnije uzorak neće biti dovoljno reprezentativan, a ad-sorpcija na stijenku posude (zbog malog omjera volumen / površina) više nije zanemariva. U svakom slučaju, volumen uzorka ovisi o koncentraciji pojedinih komponenti u vodi, analitičkoj metodi, broju ponovljenih analiza pa se prije uzorkovanja potrebno posavjetovati s analitičarima.

Transport uzoraka

Prilikom transporta uzoraka vode, potrebno je osigurati hladni lanac od mjesta uzorkovanja do laboratorija u kojem će se analiza prove-sti. Iz navedenog proizlazi da je potrebno osigurati hlađeno prijevo-zno sredstvo ili hladnjaču gdje temperatura ne prelazi 8 °C. Također, sve boce sa uzorcima moraju biti dobro zatvorene i stabilizirane, kako u transportu ne bi došlo do otvaranja čepa, prevrtanja i/ili izli-jevanja vode. Zato je potrebno da sve boce sa uzorcima budu tran-sportirane u posebnim plastičnim spremnicima koji su još dodatno zaštićeni od djelovanja sunčeve svjetlosti.

Prijem u laboratorij

Uzorke predajemo u prijemni ured zajedno s pažljivo ispunjenim obrascem o uzorkovanju, ispunimo pripremljenu dokumentaciju s podacima donositelja.

Uzorci označeni protokolarnim brojevima i popraćeni odgovaraju-ćom dokumentacijom odnose se u laboratorij na analizu.

DIO III. FIZIKALNO-KEMIJSKE METODE





FIZIKALNO-ANALITIČKE METODE

Kemijska analiza može biti kvalitativna (identificiranje komponenti prisutnih u uzorku) ili kvantitativna (određivanje količine pojedine komponente u uzorku). Ovisno o udjelu komponenti koje su utvrđe-ne, može biti djelomična (određivanje samo neke od komponenti) ili potpuna analiza.

Ovisno o omjeru određene komponente u uzorku razlikujemo:

• glavne komponente (100 – 1,0 %),• oligo-komponente (1 – 0,1 %),• tragovi (ispod 0,01 %),• mikrosljedove (10-4 – 10-7 %),• nanosljedove (10-7 – 10-10 %) i• pikosljedove (10-10 – 10-13 %).

Ovisno o masi analiziranog uzorka razlikujemo:

• makro-analize (1,0 – 0,2 g),• mezo-analize (0,1 – 0,01 g),• mikro-analize (0,001 – 0,0001 g),• submikro-analize (10-3 – 10-4 g) i• ultramikro-analize (ispod 10-4 g).

Analitičke metode razlikujemo i prema instrumentima:

• klasične analitičke metode poput gravimetrijskih, volumetrij-skih i

• instrumentalne analitičke metode, kao što su spektrometrija, kromatografija.

21. KLASIČNE ANALITIČKE METODE

21.1. Volumetrija

21.1.1. OsnoveVolumetrijska metoda analize temelji se na mjerenju volumena rea-gensa, koji je stehiometrijski ekvivalent količini mjerene tvari (anali-ta).

aX + bR ↔ XaRb analit reagens reakcijski produkt

Volumetrijskom analizom određujemo samo one tvari, kod kojih je reakcija s reagensom stehiometrijski poznata, koja je brza i kvanti-tativna (ima veliku konstantu ravnoteže, Kt > 104).

Kt = [XaRb] / ([X]a[R]b)

80




21.1.2. Titracija

Titracija je postupak polaganog dodavanja standardne otopine rea-gensa poznate koncentracije iz birete u otopinu analita.

Pogreške u volumetrijskoj analizi, ovise o pogreškama pri poznavanju koncentracije reagensa, te od pogrešaka u određivanju točke ekviva-lencije titracije.

Standardizacija

Koncentraciju reagensa možemo provjeriti tzv. standardizacijom, odnosno titracijom primarnog standarda.

Primarni standardi su tvari koje ne sadrže nečistoće, postojani su i njihov se sastav ne mijenja pod utjecajem atmosfere, svjetlosti nisu higroskopni.

Za standardizaciju kiselina se često koriste: natrijev karbonat (Na-

2CO3, sušen 2 sata na 110 °C), boraks (Na2B4O7 × 10 H2O) te živa (II) oksid (HgO).

Za standardizaciju lužina se koriste: kalijev hidrogen ftalat (KHC8H4O4) te oksalna kiselina (H2C2O4 × 2 H2O).

Točka ekvivalencije (količina dodanoga reagensa ekvivalentna količini analizirane tvari)

U ekvivalentnoj točki je količina standardne otopine (reagensa) jed-naka količini tvari s kojom reagira. Razlika između ekvivalent ne toč-ke titracije i završne točke titracije je mala i zove se pogreška titraci-je.

Ekvivalentnu točku određujemo eksperimentalno, na temelju fizikal-nih promjena, kao što su boja, napetost, itd., koje se odvijaju u bli-zini točke ekvivalencije.

Za utvrđivanje točke ekvivalencije najčešće upotrebljavamo tzv. in-dikatore. To su tvari koje, s obzirom na promjene u kemijskoj struk-turi, mijenjaju boju u blizini krajnje točke titracije.

Titracijska krivulja

Titracijska krivulja prikazuje ovisnost izmjerene vrijednosti (pH, po-tencijal itd.) o volumenu reagensa.

Podjela titracijskih metoda

Titracijske metode dijelimo prema načinu titracije i prirodi kemijske reakcije.

Prema načinu titracije razlikujemo dvije vrste titracije:

1. izravna titracija (izmjerenu količinu uzorka titriramo izravno s reagensom poznate koncentracije)

2. povratna titracija (izmjerenoj količini uzorka dodamo suvišak standardnog reagensa i njegovu neizreagiranu količinu odredi-mo titracijom s drugim reagensom).

21.1.3. Neutralizacijske titracije (titracije jakih kiselina i jakih lužina)

Kao što joj samo ime govori, radi se o titraciji za reakciju neutraliza-cije, kao što je npr. reakcija:

HCl + NaOH ↔ H2O + Na+ + Cl–

Sama titracija je proces neutralizacije između hidronijevih i hidrok-silnih iona.

H3O+ + OH– ↔ 2 H2O

Krajnja točka se smatra

[H3O+] = [OH–] = Kw (Kw = 10-14)

21.1.4. Primjena neutralizacijskih titracija u analitičkom laboratoriju

Lužnatost, p – m – vrijednost, koncentracija HCO3–

Temelj metode je neutralizacijska titracija:

1. m – vrijednost predstavlja zbroj hidroksilnih, karbonatnih i hi-drogenkarbonatnih iona, određujemo ih titracijom uzorka s 0,1 M HCl do pH vrijednosti 4,40 (indikator metiloranž),

2. p – vrijednost predstavlja količinu hidroksilnih i karbonatnih iona do pH vrijednosti 8,35 (indikator fenolftalein).

Množenjem vrijednosti m s faktorom 61, dobiva se rezultat izražen u mg HCO3

–/l.

21.1.5. Oksidacijsko-redukcijske titracije

Oksidacijsko-redukcijske titracije skraćeno zovemo redoks titracije. U redoks reakcijama, koje se odvijaju u ovom tipu titracije, pratimo promjene koncentracije reaktanata, u ovisnosti od dodanog reagen-sa. Budući da se promjena u koncentraciji odražava u promjeni na-petosti redoks sustava, napetost redoks sustava je funkcija dodanog reagensa.

82




Kod redoks titracija, kao reagens mjerenoj komponenti (analitu) do-dajemo otopinu oksidansa ili reducensa, koji je ekvivalentan analitu, tj. potpuno oksidira ili reducira.

Primjer:

5 Fe2+ + MnO4– + 8 H3O

+ ↔ 5 Fe3+ + Mn2+ + 12 H2O

Reakcija se sastoji iz dvije faze:

Fe3+ + e– ↔ Fe2+; E°Fe3+ = 0,771 V

MnO4– + 8 H3O

+ + 5 e– ↔ Mn2+ + 12 H2O, E°MnO4– = 1,51 V

Zapišemo Nerstnovu jednadžbu pojedinačnih polovica, po dogovoru ih zapišemo kao redukcija, bez obzira da li se u otopini odvija re-dukcija ili oksidacija.

EFe = EFe3+ – 0,0591 log [Fe2+]/[Fe3+]

EMn = E MnO4– – 0,0591 log [Mn2+]/([MnO4

–][H3O+]8)

Budući da se redoks reakcija odvija u homogenom sustavu (otopi-na), u svakoj točki titracijske krivulje napetost obiju faza je jednaka.

EFe = EMn = Es

Da bi izračunali potencijal sustava (ES) u svakoj točki titracije, do-voljno je znati napetost jedne od faza. Kako je ES funkcija logaritma kvocijenta koncentracije, potencijal nije ovisan o raz rjeđenju.

21.1.6. Primjena redoks titracije u analitičkom laboratoriju

Indikatori za redoks titracije

Pokazatelji krajnje točke titracije su različiti indikatori. Pravi redoks indikatori su ti koji tijekom titracije oksidiraju ili reduciraju i pri tom promijene boju.

Inoks + z e– ↔ Inred

Važni redoks indikatori su: difenilamin, metilensko modrilo, 1,10 – fenantrolin i dr.

Kod redoks reakcija možemo koristiti i indikatore, koji tijekom titra-cije ne oksidiraju ni reduciraju, već promijene boju u prisutnosti rea-gensa ili analita. Takav indikator je npr. škrob, koji se u pri sut nosti joda oboji u plavo.

J2 + škrob → plavi adsorpcijski kompleks s b-amilazom

U reakcijama u kojima nastaju ili se koriste Fe3+ ioni koristimo tioci-janat. On tvori crveni kompleks sa željezo (III) – ionima.

Fe3+ + SCN– ↔ FeSCN2+

Titracija s kalijevim permanganatom (VII), KMnO4 (potrošnja

KMnO4 ili oksidacija)

KMnO4 u kiselom mediju je jaki oksidans i reducira se do Mn2+:

MnO4– + 8 H3O

+ + 5 e– ↔ Mn2+ + 12 H2O

u neutralnom mediju se reducira do mangana (IV) u reakciji:

MnO4– + 4 H3O

+ + 3 e– ↔ MnO2 + 6 H2O

u jako lužnatom mediju do mangana (VI):

MnO4– + e– ↔ MnO4

2–

Reagens KMnO4 koristimo za indirektne titracije, na primjer u kise-loj sredini za određivanje oksidativnosti u vodi, što je mjerilo prisut-nosti organskih tvari u vodi za piće i za kupanje. U tom slučaju, u kiselu otopinu uzorka dodamo oksalnu kiselinu (H2C2O4), a ostatak titriramo sa standardnom otopinom KMnO4. Rezultat se izražava u mg O2/l (oksidativnost) ili kao potrošnja KMnO4, u mg KMnO4/l.

Titracija s kalijevim dikromatom (VI), K2Cr2O7

Oksidacijska svojstva kalijevog dikromata ovise o pH vrijednosti. U kiselom se reducira do Cr (III), u reakciji:

Cr2O72– + 14 H3O

+ + 6 e– ↔ 2 Cr3+ + 21 H2O

Dikromat se u analitici voda koristi za određivanje kemijske potroš-nje kisika, koja se temelji na oksidaciji organskih tvari s kalijevim dikromatom u sumpornom kiselom mediju. Nakon oksidacije, višak dikromata određujemo sa standardnom otopinom željezo (II) amo-nij-sulfata. Količina potrošenog dikromata je jednaka količini organ-ske tvari u uzorku. Rezultat iskazujemo u mg O2/l. Metoda je pri-kladna za određivanje organskih tvari u jako zagađenim vodama.

Poznata aplikacija s K2Cr2O7 je kvantitativo određivanje etanola, po reakciji:

3 C2H5OH + 2 Cr2O72– + 16 H3O

+ ↔ 4 Cr3+ + 3 CH3COOH + 27 H2O

Spomenuta reakcija se također koristi za kvalitativno određivanje etanola jer se otopina radi nastalog krom (III) oboji u zeleno (alko-test, Breathalyzer).

84




Titracija jodom, J2

Jod je relativno slab oksidant, koji se može koristiti za selektivne oksidacije brojnih anorganskih i organskih tvari. Elementarni jod se zbog svoje nepolarnosti slabo topi u vodi. Topljivost mu se značajno povećava u prisutnosti jodida, s kojim tvori trijodidni kompleks i tu otopinu najčešće koristimo. Međutim, vrlo je nestabilna (zbog hla-pljivosti J2 i oksidacije J– s kisikom), pa ju je potrebno jednom tjed-no standardizirati.

J2 + J– ↔ J3–

Reakcija s jodom temelji se na procesu:

J3– + 2e– ↔ 3J–

U praksi, koristimo dvije vrste reakcija:

1. titracije, u kojoj je oksidirajuće sredstvo jod, nazivaju se izravne ili jodimetrijske titracije

2. indirektne ili povratne (jodometrične), kod kojih oksidirajućem uzorku dodajemo kalijev jodid i zatim retitriramo oslobođeni jod.

U prvom slučaju, reagens je standardna otopina joda, u drugom standardna otopina Na2S2O3. Konačnu točku u oba slučaja odredi-mo pomoću škroba kao indikatora.

Upotreba jodimetrije

Tipičan primjer reakcije korištenja jodimetrije u praksi je određiva-nje SO2 u vinima, određivanje askorbinske kiseline u tabletama vita-mina C, određivanje vode po Karl-Fischeru itd.

Inidrektna (neizravna) jodimetrija

Za analitiku voda nadasve je važna jodimetrijska metoda za određi-vanje otopljenog kisika po Winkleru. U ovoj metodi, uzorku dodaje-mo otopinu Mn(II) iona i lužnatu otopinu KI. Mn(II) se u prisutnosti kisika oksidira do trovalentnog mangana.

O2 + 4 Mn2+ + 8 OH– + 2 H2O ↔ 4 Mn(OH)3

Kad se otopina zakiseli, Mn(III) ioni oksidiraju jodid u jod,

2 Mn(OH)3 + 2 J– + 6 H3O+ ↔ J2 + 2 Mn2+ + 12 H2O,

kojeg određujemo s tiosulfatom.

J2 + 2 S2O32– ↔ 2 J– + S4O6

2–.

Posljednja reakcija također se koristi za određivanje slobodnog klora u vodi pri višim koncentracijama (> 1 mg/l). Otopini klora dodaje se otopina KI, slobodni klor otpušta jod iz otopine, a jod se titrira sa standardnom otopinom tiosulfata.

21.1.7. Kompleksometrijske titracije

Titracije koje se temelje na reakcijama pri kojima nastaju komplek-sni spojevi zovemo kompleksometrijske titracije. Koristimo ih za određivanje koncentracije različitih kationa ili liganda.

Općenito, koordinacijski spoj definiramo kao spoj u kojem su na središnjem (centralnom) atomu vezani ili ioni ili koordinirani ligandi. Ligandi mogu biti anorganski ioni ili molekule, organske prirode ili sintetski spoj.

Većina anorganskih liganada su jednovezni dok su organski ligandi obično viševezni, kao npr:

EDTA – etilendiamintetraacetat (šestvezni ligand) i

CN, NH3, F – (jednovezni ligandi)

Koordinacijske spojeve u kojima je jedan ligand vezan s više donor-skih skupina na isti središnji (centralni) ion nazivamo kelati.

21.1.8. Primjena kompleksometrijskih titracija u analitičkom laboratoriju

Određivanje koncentracije kalcija i magnezija

Kompleksometrijske reakcije u analitici voda koristimo u određivanju pojedinih metala povišenih koncentracija kao što su: Ca i Mg, odno-sno pri određivanju kalcijeve i magnezijeve tvrdoće vode.

Budući da su koordinacijski spojevi metala s EDTA neobojani za odre-đivanje konačne točke ekvivalencije koristimo, osim instrumentalnih metoda, indikatore metalnih iona. Uloga kompleksometrijskih indika-tora je da s metalnim ionima tvore obojene kelate.

Kod određivanja kalcijeve i magnezijeve tvrdoće vode koristimo indi-kator Eriokrom crnilo T.

Mz+ Inm– ↔ MIn(z-m)+

Primjer: Određivanje Ca2+ i Mg2+ s EDTA

EDTA daje topljive kelatne komplekse u otopini s metalnim ionima.

Ako u otopinu metalnih iona dodamo malu količinu indikatora, poja-vit će se intenzivno tamno crveno obojenje jer će indikator reagirati s metalnim ionima u otopini uzorka, u našem slučaju s kalcijem i magnezijem.

Pri titraciji sa EDTA oba iona se povezuju sa EDTA, jer je reakcija metalnih iona s EDTA u ovom slučaju dominantna. Kada se svi kal-cijevi i magnezijevi ioni u titraciji sa EDTA potroše, boja indikatora se promijeni u plavu (originalna boja indikatora).

86




Tvrdoća vode

Većina prirodnih voda sadrže kalcij i magnezij hidrogenkarbonat te manje količine sulfata, nitrata i klorida. U ovisnosti o koncentraciji soli možemo reći da su vode više ili manje tvrde.

Otopine hidrogenkarbonata u vodi daju alkalnu reakciju. Ako voda sadrži samo kalcij i magnezij hidrogenkarbonat govorimo o karbo-natnoj tvrdoći, a ako sadrži također druge ione (natrijeve) govorimo o lužnatosti vode.

Razlikujemo karbonatnu i nekarbonatnu, te u ovisnosti o koncentra-ciji kalcijevih i magnezijevih iona – kalcijevu i magnezijevu tvrdoću. Dakle, zbroj karbonatne i nekarbonatne, kao i zbroj kalcijeve i ma-gnezijeve tvrdoće nam daju ukupnu tvrdoću vode.

Tvrdoću vode obično izražavamo u njemačkim stupnjevima N°. Je-dan njemački stupanj vode ima voda koja sadrži 1 mg CaO u 100 ml vode.

Tvrdoću vode možemo izraziti kao zbroj koncentracija kalcija i ma-gnezija (oba izražena kao CaCO3, u mg/l).

Vrste titracija sa EDTA

To su:

• izravne titracije (Mg2+ titriramo izravno s EDTA),

• povratne titracije (suvišak EDTA retitriramo sa standardnom otopinom Mg2+ iona),

• razmjena titracija (dodamo suvišak MgL2– i nakon izmjene ti-triramo otpušteni Mg2+ s EDTA), i

• alkalometrijske titracije (otopini dodamo suvišak Na2H2L i oslobođenu količinu H3O

+ odredimo titracijom sa NaOH).

21.1.9. Taložne titracije

Za taložne titracije u principu možemo koristiti većinu reakcija koje su upotrebljive u gravimetriji. Većina taložnih titracija koje se koriste u svakodnevnom analitičkom radu temelje se na titraciji sa standar-dnom otopinom AgNO3 i zajedničkim imenom ih zovemo argento-metričke titracije.

Kod taložnih reakcija dodavanjem prvog reagensa nastaje talog koji otežava određivanje završne točke titracije. Jedna od mogućnosti je određivanje završne točke pomoću turbidimetrije (mjereći promjene u mutnoći otopine), ili pomoću kemijskih indikatora, instrumental-nom indikacijom, itd.

U laboratorijima za analitiku voda se često koristi titracija po Mo-hru, za određivanje koncentracije klorida:

Ag+ + Cl– ↔ AgCl

Kao indikator za titraciju klorida se koristi K2CrO4 koji sa suviškom Ag+ iona tvori crveno-smeđi Ag2CrO4.

Indikatorska reakcija s viškom reagensa:

2 Ag+ + CrO42– ↔ Ag2CrO4

Indikatorska reakcija ovdje predstavlja konkurentnu reakciju primar-noj reakciji, zato moramo poznavati potrebne koncentracije indika-tora u otopini kako bi mogli odrediti završnu točku reakcije (na te-melju stvaranja taloga u reakciji suviška reagensa s indikatorom).

22. INSTRUMENTALNE METODE ANALIZE

22.1. Spektroskopija

Spektroskopska metoda temelji se na interakciji tvari M (analita) s elektromagnetskim valovima E:

Apsorpcija emisija:

M + E → M* → M + êE

pobuđenje čestica u pobuđenom stanju opuštanje

Energija koju čestica apsorbira, uzrokuje prijelaz čestice iz osnov-nog stanja u pobuđeno nestabilno stanje M*, koje je kratkotrajno (10-9 do 10-6 sekundi). Povratak u osnovno stanje nazivamo relak-sacija pri čemu čestica otpusti (emitira) energiju.

Ovisno o tome da li su čestice atomi ili molekule, spektroskopske tehnike dijelimo na molekulske i atomske.

S obzirom na interakcije dijelimo ih na apsorpcijske i emisijske. Kod apsorpcijskih mjerimo apsorpciju pobuđene energije, a kod emisij-skih intenzitet energije opuštanja (relaksacije).

22.1.1. Apsorpcijska spektrometrija

Apsorpcijske metode temelje se na mjerenju smanjenja intenziteta (snage) elektromagnetskih valova (svjetlosti) pri prolazu kroz uzo-rak.

88




22.1.2. Molekulska apsorpcijska spektrometrija

Apsorpcija je proces pri kojem se pri prolazu svjetlosti kroz česticu koja val apsorbira, intenzitet tog vala smanji. To svojstvo iskorištava-mo u spektrofotometriji.

22.1.3. Spektrofotometrija

Spektrofotometrija je apsorpcijska molekulska metoda kod koje koncentraciju analita u uzorku određujemo s mjerenjem apsorpcije monokromatske svjetlosti pri prolazu svjetlosti kroz otopinu uzorka.

Pri prolazu svjetlosti kroz staklenu kivetu u kojoj je obojana otopina uzorka dio svjetlosti se apsorbira u otopini (apsorpcija), dok dio svjetlosti prolazi kroz otopinu (propusnost).

Apsorpcija A je komplementarna propusnosti T.

A = 1 – T

Apsorpciju elektromagnetnih valova opisuje Beerov zakon:

Apsorpcija (A) otopine je definirana jednadžbom:

A = log Po/P

Po = intenzitet upadne svjetlosti

P = intenzitet propuštene svjetlosti

Vrijedi sljedeći izraz između apsorbance (A) i propusnosti (T):

A = – log T

Apsorbanca je direktno jednaka dužini puta kroz otopinu (kiveta ili staklena posuda (l)) i koncentraciji otopine (c).

Vrijedi sljedeći izraz:

A = ε · l · c (Beer Lambertov zakon)

gdje je ε konstanta (apsorptivnost). Ako je koncentracija uzorka izra-žena u mol/l, konstanta se zove molarna apsorptivnost (ε = l/cm mol).

Apsorptivnost je svojstvo čestice i ovisna je od valne duljine.

Apsorbanciju obično mjerimo pri valnoj dužini kod koje je apsorp-tivnost tražene tvari najveća. Podatke dobijemo iz literature ili sni-mimo apsorpcijski spektar tvari.

Spektrofotometar

Sastoji se od sljedećih komponenti:

• izvor svjetlosti (W žarulja za vidno područje ili H2 odnosno D2 za UV područje),

• monokromator (prizma ili difracijska rešetka, valnu dužinu izaberemo i s optičkim filtrima (fotometar) i

• detektor (fotostanica, fotodioda)

Jednostavniji instrumenti imaju jednu zraku, a kod onih s dvije zra-ke istovremeno mjerimo signal uzorka i referentne otopine (otapalo i reagensi). Time se poboljšava osjetljivost i točnost mjerenja. Razlika između spektrofotometra i fotometra je u instrumentu – spektrofo-tometri imaju monokromator, a fotometri obične filtere.

Primjena spektrofotometrije

Spektrometrija je jedna od najčešće upotrebljavanih instrumentalnih metoda u analitičkoj praksi. Odlikuje ju jednostavnost mjerenja i po-uzdanost.

Spektrometrijom mjerimo širok spektar tvari. Najčešći načini mjere-nja su:

• direktno (tvari koje su obojane i apsorbiraju u UV području),

• indirektno (tvari koje nisu obojene pretvorimo u obojene spo-jeve pomoću organskih i anorganskih reagensa), i

• fotometrijska primjena kod titracija.

22.1.4. Atomska spektrometrija

Kod atomskih spektroskopskih metoda mjerimo apsorpciju ili emisi-ju elektromagnetnih valova atoma. Kako bi dobili slobodne atome uzorak moramo atomizirati. Atomizacija je proces uparavanja i raz-gradnje uzorka na atome (ione) što postižemo pomoću visoke tem-perature.

Atomi u plinovitom stanju razdvojeni su jedan od drugog, apsorbira-ju ili emitiraju energiju valnih dužina karakterističnih za pojedini ele-ment. Pri tome dobijemo prugasti spektar. Za analitiku je važna val-na duljina l i intenzitet spektralne linije. Valna duljina spektarne linije je ovisna od energetske razlike prijelaza:

êE = E2 – E1 = hn2

h – Planckova konstanta (6,62 × 10-34 Js)

90




Energija emitiranog fotona je jednaka energiji apsorbiranog fotona; valna duljina pri kojoj neki atom apsorbira je jednaka valnoj duljini emitirane svjetlosti. Kvalitativna spektroskopska analiza temelji se na određivanju položaja spektralnih linija (valne duljine). Što je veća energijska razlika među orbitalama êE, viša je frekvencija valova n i kraća je valna duljina zračenja što ga apsorbira ili emitira neki atom.

Intenzitet spektralnih linija povezan je s prirodom prijelaza (êE). Jačina (intenzitet) svake pojedine linije proporcionalna je koncentra-ciji čestica što je temelj za kvantitativnu analizu. Intenzitet spektral-nih linija je proporcionalan koncentraciji atoma.

Postoji nekoliko atomskih spektroskopskih tehnika koje su prikaza-ne u Tablici 13.

U slučaju elektrotermičke atomizacije mijenjamo temperaturu grafitne kivete, koju zagrijavamo s električnom strujom (Tablica 14).

Tablica 13. Atomske spektroskopske tehnike

Metoda Atomizacija Veza s koncentracijom

Atomska apsorpcijska spektrometrija (AAS)

plamen, elektrotermičko u grafitnoj kiveti

apsorpcija monokromatske svjetlosti

Emisijska spektrometrija (ES) električni luk, iskra, plazma intenzitet spektralne linije

Plamenska fotometrija (PF) plamen intenzitet emitirane svjetlosti

Rentgenska fluorescencija (XRF) nije potrebna intenzitet fluorescencije


Tablica 14. Temperatura plamena za određene elemente

Element Plamen Temperatura (°C)

K, Na, Li, Mg, Ca, Ba, Srpropan/butan – zrak

acetilen – zrak1500 – 19002100 – 2400

Cu, Zn, Pb, Cd, Fe, Cr, Ni, Co, Hg, Mn, Mo, As, Sb, Ag, ...

acetilen – kisikacetilen – N2O

3060 – 31352060 – 2800


U analitičkoj praksi najčešće se koristi subatomska apsorpcijska spek-trometrija AAS, te sve više koristi multi elementarna tehnika ICP-in-duktivno spregnuta plazma. Ova tehnika se u pravilu veže tandemski uz optičke i masene detektore. ICP-AES (drugi naziv je ICP-OES te ICP-MS kojim se postižu još niži limiti detekcije).

Atomska apsorpcijska spektrometrija AAS

AAS je najvažnija spektroskopska analitička tehnika. Upotrebljava se za kvantitativnu elementarnu analizu. Pomoću nje možemo odre-diti koncentraciju pojedine vrste ili organskih spojeva.

Elemente koji su u otopini uzorka pretvorimo u plinovito ili atomsko stanje (atomizacija). Atomizaciju provodimo sa:

• plamenom (T = 1000 – 3150 °C) i

• elektrotermički s grafitnom kivetom (T = 1200 – 3000 °C).

Za atomizaciju s plamenom koristimo različite gorive plinove (butan, acetilen, ...), koji u kombinaciji s oksidansom (zrak, kisik, N2O, ...) daju plamen dovoljno visoke temperature.

Temperatura plamena utječe kako na emisiju tako i na apsorpciju pa zato kod atomizacije moramo održavati konstantni sastav i tem-peraturu plamena.

Veza s koncentracijom

Apsorpcija atoma je, slično kao kod molekula u otopini, proporcio-nalna koncentraciji atoma u plamenu, a time i koncentraciji analita u otopini.

A = a(l) l N = K c

Proporcionalna konstanta K sadrži koeficijent apsorpcije (l) i duljinu puta zrake kroz uzorak l (cm).

Koncentraciju analita dobivamo na osnovi gore navedene jednadžbe pomoću prethodno pripravljene kalibracijske krivulje ili s metodom standardnog dodatka.

Aparatura za AAS

Atomski apsorpcijski spektrometar se sastoji od sljedećih dijelova:

• izvora monokromatske svjetlosti,

• gorionik/kiveta (generator atoma),

• monokromator i

• detektor.

Upotreba AAS

Pomoću AAS možemo odrediti više od 40 elemenata. Osjetljivost i granica detekcije su uglavnom ovisni o energiji pobuđivanja. Elemen-te kao što su Mg, Ca, Cd ili Zn, možemo mjeriti s plamenom pri kon-centraciji do nekoliko µg, a s elektrotermalnom atomskom apsorpcij-skom spektrometrijom (ETAAS – Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry) čak i tisuću puta manje koncentracije.

Prednost AAS u odnosu na druge spektroskopske i elektrokemijske metode je u brzom i jednostavnom mjerenju te izvrsnoj selektivnosti.

92




Ona je uvjetovana s diskretnom prirodom atomskih spektara koji sa modernom instrumentacijom (monokromatori visokog razlučivanja HD) isključuje spektralne i druge smetnje.

Emisijska spektroskopija, EC

Kod tih metoda mjerimo intenzitet emitirane svjetlosti koju atomi emitiraju pri prijelazu elektrona iz pobuđenog stanja u niže ili osnov-no stanje.

Aparatura za emisijsku tehniku je slična onoj atomskoj, s tim da nije potreban poseban izvor svjetlosti jer valove emitira uzorak.

Izvor atomizacije može biti plamen (plamenska fotometrija), elek-trični luk ili iskra (emisijska spektrografija), plazma (induktivno sklo-pljena argonova plazma, ICP).

Atomizacija s plazmom

S ovim načinom atomiziranja i pobuđivanja postižemo vrlo visoke temperature (6000 – 10.000 °C) i stabilnost, slično kao i s pla-menskim.

Plazmu proizvodimo u cilindričnom plameniku s visoko frekventnom ionizacijom argona (27 MHz, 2 kW). Ioni Ar+ i elektroni reagiraju u plinskoj fazi s visokofrekventnim magnetskim poljem kojeg proizvo-di Teslina zavojnica omotana oko plamenika. Zbog otpora kretanja čestica dolazi do otpuštanja visokih temperatura, koja prevodi česti-ce analita u pobuđene atome.

Induktivno spregnuta plazma (ICP) je struja visoko ioniziranog argona koji prolazi kroz magnetno polje zavojnice. Visoko frekventno magnet-no polje ionizira argon koji je inertni plin i formira se plazma. Plazma razvija temperature od 8000 – 10 000 K (kelvina) što joj omogućuje potvrđivanje oko 75 elemenata iz periodnog sustava.

Tehnika koju ICP koristi za mjerenje uzoraka može biti atomska emisijska spektrofotometrija (AES) ili, kako se još naziva, optička emisijska spektrofotometrija (OES). Dakle, uređaj radi na principu emisije. Kada se uzorak uvodi u plazmu koja razvija visoku tempe-raturu, dolazi do pobuđivanja elektrona koji onda prelaze u pobuđe-no stanje. Prilikom vraćanja u osnovno stanje dolazi do emitiranja svjetlosti određene valne duljine koja se mjeri na detektoru. Da bi uzorak transportirali u plazmu prvo ga treba raspršiti (engl. nubuli-ze), a to postižemo raspršivačem (engl. nebulizer).

Tri su osnovna načina razdvajanja u MS sustavima: kvadripolarni, magnetski i na temelju vremena leta. Sukladno tome, razlikujemo i tri različite vrste masenih spektrometara.

Uzorak se uvodi u instrument, prevodi se u aerosol, te zagrijava na 6000 °C u plazmi argona. Ekstremno visoke temperature plazme u potpunosti ioniziraju molekule prisutne u uzorku. Kao rezultat, ICP-MS detektira samo pojedinačne ione elemenata. Sustav za uvođenje sastoji se od peristaltičke pumpe, raspršivača i komore. ICP plamenik generira plazmu u kojoj se atomi analita prevode u ione. Većina ICP-MS uređaja bazira se na kvadripolarnom sustavu. Na slici 16. prikazana je konfiguracija proizvođača Perkin Elmer (SAD). Uređaj se sastoji se od četiri paralelna cilindra u kojima se razdvajaju ioni u električnom polju nastalom na temelju visokih voltaža. Kad je određeni omjer masa/napon narinut na šipke, pozi-tivni ili negativni naboji na šipki elektrostatski usmjeravaju prema kraju ciljane ione analita od interesa, gdje se pretvaraju u električ-ni impuls i putuju prema masenom detektoru. Drugi ioni različitih masa i omjera napona će proći kroz prostor između šipke i biti iz-bačeni. Nakon prolaska kroz maseni separator (spektrometar), ioni udaraju u aktivnu površinu detektora koji elektronskom multiplika-cijom proizvodi specifičan puls od kaskade elektrona. Ovom para-lelnom tehnikom snimanja svih analita proces je zatim ponavljan za druge analite od interesa koji su u potpunosti različitih masa (tzv. multi elementarna analiza).

Slika 16. ICP-MS Perkin Elmer Elan DRC-e

Izvor: www.perkinelmer.com

94




22.2. Kromatografija

Pod pojmom kromatografije podrazumijevamo vrstu postupaka raz-dvajanja kemijskih spojeva (od najmanjih molekula do biomolekula s masom više od 10 000 D).

Osnova kromatografskog razdvajanja je u različitoj brzini migracije pojedinih komponenti pod utjecajem mobilne faze (plin, tekućina) radi selektivnog zadržavanja (retencije) komponenti na stacionarnoj fazi (čvrsta površina ili nepokretna tekućina).

Pojam kromatografije uveo je ruski botaničar M. Cvet (1903), kada je u koloni ispunjenoj vapnencem ispiranjem odvojio pigmente boje iz lišća biljaka (klorofil). To je zapravo bila preteća metoda tekućin-ske kromatografije.

Ovisno o vrsti stacionarne i mobilne faze dijelimo kromatografske metode u dvije skupine:

1. tekućinska i

2. plinska kromatografija.

22.2.1. Tekućinska kromatografija, LC

Tekućinska kromatografija (LC) je metoda razdvajanja supstanci na osnovu različite distribucije između čvrste stacionarne i tekuće mo-bilne faze. Stacionarna faza se nalazi u stupcima ili na pločama.

S obzirom na kontakt između nepokretnih i pokretnih faza razlikuje-mo:

• kolonsku kromatografiju (stacionarna faza je smještena u ko-loni, mobilnu fazu potiskujemo kroz sustav gravitacijom, nad-tlak...),

• planarnu kromatografiju (stacionarna faza se nalazi na ravnoj ploči ili na papiru, mobilna faza se pomiče kroz sustav putem kapilarnog usisavanja ili gravitacije).

22.2.2. Plinska kromatografija, GC

Plinska kromatografija (GC) je metoda razdvajanja i detekcije volatil-nih organskih spojeva i nekih anorganskih plinova iz smjese. GC je nastala 1950. godine i danas se razvila u jednu od primarnih tehni-ka u kemijskoj analizi. U GC dolazi do razdvajanja plinovitog uzorka između inertnog plina kao mobilne faze i tekuće ili čvrste stacionar-ne faze.

Uređaj za GC se naziva plinski kromatograf. Kao mobilna faza (plin nosač) najčešće se upotrebljavaju helij, dušik ili smjesa argona i metana. Izbor plina ovisi od uzorka i detektora, a najviše se koristi

helij. Uzorak se unosi pomoću injektora (ručni ili automatski) gdje se upari i nošen plinom prelazi u kolonu.

U početku su se za GC koristile tzv. kolone sa punjenjem ili punjene kolone. Danas su u uporabi kapilarne kolone zbog bolje učinkovito-sti razdvajanja. Unutarnji zidovi kapilarne kolone su prevučeni čvr-stim poroznim materijalom ili viskoznom tekućinom. U GC se koristi više tipova detektora, a izbor ovisi o komponenti koja se analizira.

22.2.3. Kromatografija – tijek

Uzorak eluiramo kroz kolonu pomoću svježe mobilne faze koja može biti plin ili tekućina. Brzina putovanja određene komponente uzorka ovisi o vremenu zadržavanja u određenoj fazi: ako je spoj dugo vre-mena u stacionarnoj fazi eluira se sporije, a ako je dulje vremena u mobilnoj fazi, eluira se brže.

Vrijeme zadržavanja ovisi o tijeku različitih procesa.

To su: • adsorpcija,• distribucija,• interakcija,• ionska izmjena.

Graf vremenske ovisnosti signala zovemo kromatogram.

U kromatogramu opažamo niz kromatografskih vrhova (engl. peak), svaki vrh odgovara određenoj komponenti iz uzorka. Osnovna linija se zove signal otapala.

22.2.4. Kvalitativna analiza

Na temelju usporedbe vremena zadržavanja nepoznatog spoja s vre-menom zadržavanja poznatog spoja (referentni standard), lako iden-tificiramo nepoznati spoj.

Identifikacija je problematična u slučajevima kada se kod istog vre-mena zadržavanja eluira više spojeva istovremeno. Selektivnost, a time pouzdanost identifikacije, poboljšava se upotrebom selektivnih detektora.

22.2.5. Kvantitativna analiza

Kod kvantitativnih analiza uspoređujemo visinu ili površinu kromato-grafskih vrhova s kromatografskim vrhovima komponenti iz standar-dnih otopina različitih koncentracija. Pripremimo kalibracijsku liniju (vanjski standard) ili upotrijebimo unutarnji standard, kojeg dodamo u uzorke točno određene količine.

96




22.2.6. Kromatografija visoke razdjeljivosti, HPLC, GPC

HPLC (engl. High Perfomance Liquid Chromatography) je moderna analitička tehnika kod koje se mobilna faza dovodi pomoću pumpe. Komponente uzorka (otopina) otopimo pa ih potom pod tlakom (do 200 bara) potiskujemo kroz kolonu pomoću mobilne faze. Kolona je 10 – 25 cm duga metalna cijev ispunjena česticama stacionarne faze (< 10 µm). Zbog tih uvjeta (odabir odgovarajućih faza) postiže-mo odvajanje više komponentne smjese u nekoliko minuta.

Postoji više tipova detektora za HPLC. Najčešće se koristi UV-VIS detektor, a osim njega i fotodiodni, fluorescentni, elekroke-mijski i drugi. Na temelju polarnosti razlikuje se LC na normalnim i obrnutim fazama. Razdvajanje na normalnim fazama podrazumijeva da je stacionarna faza polarna (npr. silikatna), a mobilna faza nepo-larna (npr heksan). Kod razdvajanja na obrnutim fazama stacionar-na faza je nepolarna (npr. C-18 hidrokarbonate), a mobilna faza po-larna (npr. voda i metanol).

HPLC tehniku karakterizira visoka osjetljivost i točnost. Pogodna je za određivanje termički nestabilnih i nehlapljivih spojeva. Jedini uvjet je da je uzorak topljiv u mobilnoj fazi (pravilni odabir mobilne faze). U novije vrijeme sve više se koristi UPLC tehnika (engl. Ultra Performance Liquid Chromatography) kojom se postižu još bolje performanse od HPLC-a. Ova tehnika uključuje primjenu kraćih ko-lona (5 cm) s manjim veličinama čestica punjenja (1,7 – 1,8 µm), postižući precizne rezultate uz vrlo visoke tlakove (i preko 1000 bara) i vrlo kratko vrijeme eluacije.

Primjena HPLC i UPLC u analitičkoj praksi

• analiza makromolekula,

• analiza anorganskih i ionskih vrsta,

• analiza temperaturno nestabilnih prirodnih proizvoda,

• analiza farmaceutskih spojeva,

• analiza biološki važnih molekula (određivanje aminokiselina, proteina, nukleinskih kiselina, ugljikohidrata, pesticida, anti-bio tika, ...)

GPC (engl. Gel Permeation Chromatography) ili gel kromatografija je vrsta kromatografije isključenja prema veličini čestica. Tehnika se često koristi za analizu polimera.

Čestice se eluiraju kroz stacionarnu fazu sa različitom brzinom zbog različitih veličina. Veće molekule putuju brže i eluiraju prve, manje čestice ostaju duže jer zaostaju u porama stacionarne faze i eluiraju

kasnije. Detektor koji se upotrebljava je u većini UV/VIS spektrofoto-meter ili RI (Refractive Index).

22.2.7. Ionska kromatografija, IC

IC je jedan od oblika tekućinske kromatografije. Novija je metoda, razvijena 1975. godine. Temelji se na tri separacijske tehnike, na osnovu kojih razlikujemo i tri vrste ionske kromatografije: kromato-grafiju ionske izmjene, ionsku isključivu kromatografiju i ionsku kro-matografiju para.

Kromatografija ionske izmjene

Osnova ovog oblika ionske kromatografije je ionska izmjena između mobilne faze i skupina, kovalentno vezanih na stacionarnu fazu.

Stacionarna faza je obično polistiren smola, umrežena s divinilben-zenom. Metoda je pogodna za odvajanje anorganskih i organskih kationa i aniona. U izmjeni kationa sudjeluje obično kvarterna amo-nijeva skupina, dok pri izmjeni aniona sulfonatna skupina.

Ionska isključiva kromatografija

Kod ionske isključive kromatografije važnu ulogu imaju sljedeći pro-cesi: Donnanova izmjena, sterička ekskluzija i apsorpcijski procesi.

Stacionarna faza je potpuno sulfonirana kationska smola visokog iz-mjenjivačkog kapaciteta (polistiren/divinilbenzen kopolimer), pogod-na za odvajanje slabih organskih kiselina od potpuno disociranih ki-selina (određivanje karbonata, borata...)

Ionska kromatografija para

Najvažniji postupak kod kromatografije ionskih para je apsorpcija.

Prednosti ionske kromatografije

U usporedbi s tehnikama kao što su turbidimetrija, volumetrija, spektrofotometrija, itd., ionska kromatografija je brža, osjetljivija, selektivnija tehnika koja omogućava istovremenu analizu kationa i aniona.

98




22.3. Elektrometrija

22.3.1. Potenciometrija

Kod potenciometrije određujemo koncentraciju analita mjerenjem napona galvanskog članka koji se sastoji od indikatorske elektrode, uzorka i referentne elektrode.

referentna elektroda // uzorak ( c = ? ) / indikatorska elektroda

Potencijal članka je jednak razlici potencijala između indikatorske i referentne elektrode:

E = Eind – Eref

Napon indikatorske elektrode je proporcionalan aktivnosti kompo-nenti:

Eind = Eo(Oks/Red) – RT/F ln [aRed/aOks]

Napon članka je funkcija aktivnosti analita, E = f(aoks,ared).

Kod mjerenja tok kroz stanicu mora biti zanemarivo malen, što po-stižemo kompenzacijskim mjerenjem ili pomoću elektronskog vol-tmetra visokog ulaznog otpora (Rin > 1012 Ohm).

Referentne elektrode

Referentna elektroda mora imati poznat potencijal koji tijekom mje-renja mora biti konstantan i neovisan o sastavu analita.

Indikatorske elektrode

Indikatorska elektroda mora brzo i ponovljivo odgovoriti na promje-ne u aktivnosti mjerene komponente. Idealna indikatorska elektroda bi bila specifična ili barem selektivna. Obzirom na vrstu senzora, razlikujemo metalne i membranske senzore.

Među membranskim, spomenimo staklenu elektrodu i ionsko osjet-ljivu elektrodu (IOE).

Staklena elektroda

Staklena elektroda je specifični senzor koji se koristi za mjerenje pH. Senzor je tanka staklena membrana (72 % SiO2, 22 % Na2O, 0,6 % CaO), koja ima otpor između 100 i 1000 Ohm.

Zbog izmjene hidronijevih iona s natrijevim ionima u hidratiziranom sloju membrane, stvara se razlika potencijala na membrani.

Staklena elektroda reagira na razliku hidronijevog iona na obje stra-ne membrane, potencijal elektrode je jednak:

E = konst. + RT/F ln [a(izvana) H3O+ / a(unutra) H3O+]

Budući da je aktivnost (koncentracija) hidronijevih iona u unutraš-njosti elektrode konstantna, elektroda odgovora na promjene pH analita.

Članak za mjerenje pH se sastoji od staklene elektrode s unutar-njom referentnom elektrodom, analita i vanjske referentne elektro-de.

Potencijal takvog članka iznosi:

E = Estek. – Eref. = E’ + RT/F ln a (izvana) H3O+

Pri 25 °C je potencijal elektrode jednak:

E = E’ – 0,0591 pH ili E = E’ – 2,303 RT/F pH

E’ je potencijal, koji je karakteristika senzorske i referentne elektro-de i tekućinskog potencijala.

Puferske otopine

Na temelju različitih termodinamičkih podataka, kao što su npr. io-nizacijske konstante slabih kiselina, određenim puferskim otopina-ma s točno definiranim sastavom – pripisane su standardne pH vri-jednosti. Ako upotrijebimo takvu otopinu u Galvanskom članku, dobijemo mjerenjem napon E i koristimo gore navedenu jednadžbu za konstantu E’.

Budući da je difuzijski potencijal kojeg sadrži ova jednadžba, ovisan o aktivnosti vodikovih iona, pH otopine pufera za mjerenje pH treba biti što bliže pH vrijednosti analita.

Mjerenje pH vrijednosti

Pri mjerenju najprije kalibriramo pH metar s jednom od puferskih otopina. Potom izmjerimo pH uzorka. Što je manja razlika između pH vrijednosti uzorka i puferske otopine s kojom smo pH metar ka-librirali, izmjerena vrijednost je pouzdanija. Ako je ova razlika zna-čajna, ponovimo kalibraciju.

Kod mjerenja pH vrijednosti temperatura pufera mora biti jednaka temperaturi uzorka, zato je moramo navesti uz rezultat mjerenja. To možemo izbjeći primjenom instrumenata s automatskom kompen-zacijom temperature.

U jako lužnatom mediju (pH > 11), odnos između E i pH odstupa od linearnosti, čemu je uzrok izmjena alkalijskih iona.

100




Ionsko osjetljive elektrode

Elektrode koje reagiraju samo na pojedine ione nazivamo ionsko osjetljive elektrode, IOE. Prema prirodi senzora razlikujemo:

• elektrode s homogenom membranom,

• elektrode s heterogenom membranom, i

• elektroda s membranom s tekućim ionskim izmjenjivačem.

Fluoridna ionsko selektivna elektroda

Fluoridna ionsko selektivna elektroda ima membranu od monokri-stala LaF3, koji omogućava reverzibilnu izmjenu iona na obje strane membrane. Odgovor elektrode je proporcionalan aktivnosti slobod-nih fluoridnih iona u otopini.

E = E’ – 0,059 log a(izvana) F–

Određivanje fluoridnih iona u vodi

Određivanje koncentracije fluoridnih iona u vodi temelji se na mjere-nju razlike električnog potencijala između fluoridne (membrana LaF3 kristala) i referentne elektrode (Ag/AgCl) u vodenoj otopini fluorida, koja je proporcionalna logaritmu aktivnosti iona fluorida, u skladu s Nerstnovom jednadžbom.

Na razliku potencijala utječe temperatura i ionska jakost otopine.

F– aktivnost ovisi o pH vrijednosti otopine.

22.3.2. Kulometrija i elektrogravimetrija

Kulometrija i elektrogravimetrija temelje se na kvantitativnoj elektro-kemijskoj redukciji ili oksidaciji tvari. Obje se svrstavaju u direktne odnosno apsolutne metode i odlikuju se visokom točnošću.

Kulometrija

U kulometriji, tijekom elektrolize, mjerimo naboj i iz njega izračuna-mo količinu tvari prema Faradeyevom zakonu.

Elektrogravimetrija

U elektrogravimetriji se mjerena tvar tijekom elektrolize izluči na elektrodi u krutom obliku, kao što je metal ili oksid, a masu ekstra-hirane tvari određujemo vaganjem.

22.3.3. Primjena kulometrije

EI-R ovisi o koncentraciji Ag+ iona u otopini prema Nerstnovom zako-nu. Promjene u koncentraciji srebrnih iona uzrokuju promjenu u EI-R.

Koncentracija Ag+ iona se promjeni kad u stanicu uđu halogeni ioni, koji uzrokuju taloženje srebrnog halida (zbog vrlo niske topljivosti pro-dukata, najmanja koncentracija halida rezultira formiranjem taloga). Potrošnja Ag+ iona (mijenja se EI-R) pokreće protok kroz krug genera-tora i Ag+ ioni ponovno nastaju na katodi.

Količina Ag+ iona, koji se generiraju i stoga količina nastalih netopi-vih srebrnih halida je opisana Faradayevim zakonom:

m = Q/n·F = I·t/n·F

m – količina pretvorene tvariQ – naboj koji prolazi kroz površinu elektrode u određenom vreme-nuF – Faradayeva konstanta, 96487 C/moln – broj elektrona koji sudjeluju u reakcijit – vrijeme titracijeI – struja

22.3.4. Voltametrija i polarografija

Voltametrijske metode temelje se na mjerenju strujno-naponske ovi-snosti i = f(E). Obično mjerimo struju i i mijenjamo napon E (poten-ciostatski način), a možemo mjeriti napon u ovisnosti o struji (galva-nostatski način).

Polarografija

Polarografija se koristi za istraživanje elektrodnih procesa, studija kinetike reakcija, mjerenja difuzijskih koeficijenata i dr. Najviše ju koristimo u analitičkoj kemiji za određivanje metala, različitih anio-na i vrsta organskih tvari.

S polarografijom možemo odrediti kako anorganske tako i organske tvari. Najvažnije primjene su određivanje:

• anorganskih iona (Cu, Bi, Sb, Sn, Pb, U, Cd, Tl, Ni, Co, V, Fe, As, Cl-, SO3

2-, CN– ...) i

• organske tvari (R-NO2, R-N = N-R1, R-C = C-H, vitamini, aminokiseline...)

Polarografija se koristi u koncentracijskom rasponu od 0,1 do 1 × 10-5 mol/l, donja granica detekcije određuje kapacitivna struja. Točnost rezultata dobivenih polarografijom općenito je bolja od 2 % (sr).

Čak niže koncentracije možemo odrediti modificiranim polarograf-skim tehnikama. U njih uvrštavamo razne pulsne i inverzne metode kao što su:

102




• pulsna polarografija, PP

• diferencijalana puls polarografija, DPP, i

• inverzna voltametrija.

Kod PP i DPP postižemo veću osjetljivost s impulsnom modulaci-jom pobuđivanja napona i optimizacijom omjera signal/šum, a kod inverznih metoda s predkoncentriranjem reaktanata na indikatorskoj elektrodi.

Pulsne i inverzne metode se koriste uglavnom u području analitike voda, kontrole industrijskih sirovina i proizvoda, u ekologiji, petroke-miji itd.

22.3.5. Konduktometrija

Električnu vodljivost mjerimo konduktometrom. Mjerimo električnu struju između platinastih ploča (obično površine 1 cm2), koje su na određenoj udaljenosti (obično 1 cm), a koja se prenosi preko iona prisutnih u vodi.

Ovisi o:

• koncentraciji iona,

• vrsti iona,

• temperaturi otopine i

• viskoznosti otopine.

U slučaju kada je u otopini samo jedan elektrolit, samo sa mjere-njem vodljivosti određujemo koncentraciju elektrolita u otopini.

U koncentracijama iznad 10-3 mol/l, konduktometrija više nije pri-kladna metoda.

Čista voda radi svoje vlastite disocijacije na 25 °C ima vodljivost 0,05483 µS/cm.

Osnovni pojmovi koji se odnose na provodljivosti

Vodljivost g je obrnuto proporcionalna otporu R:

c – specifični otporS – kvocijent između površine platinastih ploča u sondi L – udaljenost između platinastih ploča u sondi

Izmjeren otpor R je proporcionalan veličini s kojom se tvar odupire kretanju naboja.

Temperaturna ovisnost vodljivosti otopina

Ista otopina može imati različitu specifičnu vodljivost na različitim temperaturama. Stoga imamo specifičnu vodljivost (c) i specifičnu otpornost (r) pri referentnim temperaturama od 20 °C ili 25 °C. Instrument (konduktometar) izračunava obje spomenute veličine, uzimajući u obzir temperaturni koeficijent.

Temperaturni kvocijent električne provodljivosti (a) izražavamo u %, što znači, za koliko posto se promijeni vodljivost tvari, pri promjeni temperature otopine na 1 °C, ovisno o vodljivosti tvari pri referen-tnoj temperaturi (25 °C):

gdje su 25 i q temperatura u °C, pri kojima se mjeri vodljivost g25 i gq. Provodljivost, koju mjerimo pri drugim temperaturama, možemo pretvoriti u provodljivost na 25 °C pomoću jednadžbe:

a – temperaturni kvocijent električne provodljivostigq – električna vodljivost izmjerena na temperaturi qq – temperatura uzorka u °C.

Mjerenje provodljivosti uzorka

Uzorak termostatiramo na 25 °C i izmjerimo mu vodljivost.

Ako uzorku ne možemo izmjeriti provodljivost na 25 °C, izmjerimo provodljivost pri datoj temperaturi i zatim odredimo provodljivost na 25 °C, g25, pomoću gore navedene jednadžbe. Novije generacije konduktometara imaju elektronički korekcijski faktor temperature, koji omogućuje analizu uzoraka koji ne moraju biti termostatirani. Na taj način analize su brže i praktičnije za laboratorijsko osoblje.

Kod mjerenja provodljivosti moramo konduktometar kalibrirati, od-nosno umjeriti. Za kalibraciju odnosno umjerenje, pripremimo stan-dardne otopine poznatih provodljivosti.

PRIMJERI:

Standardna otopina KCl – 0,1 mol/lProvodljivost (g25) te otopine na 25 °C je 12900 µS/cm.



104




23. UPOTREBA BRZIH TESTOVA KOD KEMIJSKIH ODREĐIVANJA U PITKOJ VODI

Brzi testovi imaju čestu primjenu u analitičkoj kemiji. Na području analitike voda upotrebljavamo ih za preliminarna određivanja, kod svakodnevnih screening analiza, itd. Upotrebljavamo ih u analitici pitkih voda, voda za kupanje i otpadnih voda. Brzi testovi za analiti-ku voda su obično vrlo jednostavni i ekonomični. Većina ih se teme-lji na kolorimetrijskim, fotometrijskim i titracijskim određivanjima. Upotrebom fotometrijskih brzih testova analize se brže provode, jednostavnije su, jeftinije, a rezultati su dovoljno pouzdani.

23.1. Kolorimetrijski testovi

Koriste se testne trakice i testni kitovi.

Testne trakice vrlo su jednostavne i praktične za upotrebu. Testnu trakicu na kratko vrijeme umočimo u uzorak i uspoređujemo boju umočene trakice s bojom standardne skale.

Poboljšana modifikacija kolorimetrijskih testova su testni kitovi s te-kućim reagensima. Jedan ili više reagensa, koji reagiraju s kompo-nentom koju želimo odrediti u uzorku, dodajemo u otopinu uzorka, da se pokrene obojena reakcija. Boju uspoređujemo sa ljestvicom boja danih koncentracija ili uspoređujemo s bojama tekućih stan-darda na kojima su navedeni podaci o koncentracijama.

Kolorimetrijski testovi su primjereni za kvalitativna određivanja u vodi i za približno određivanje koncentracija traženih komponenti (koncentracijskog područja).

Upotrebljavamo ih kod mjerenja na terenu, u proizvodnji, za analize u laboratoriju.

23.1.1. Fotometrija

Pri prolasku svjetlosnog snopa kroz staklenu stanicu, u kojoj je obo-jana otopina uzorka, dio svjetlosti se apsorbira u otopini, dio svjetlo-sti prolazi kroz otopinu.

Absorbancija (A) otopine je definirana s jednadžbom:

A = log Io/I

Io – početni intenzitet svjetlosti

I – intenzitet propuštene svjetlosti

Vrijedi slijedeća veza između apsorbancije (A) i propusnosti (T):

A = – log T

Apsorbancija je direktno proporcionalna dužini puta kroz otopinu prema slijedećoj jednadžbi (Beer Lambertov zakon):

A = ε · l · c

Gdje je ε konstanta (apsorpcijski koeficijent). Ako je koncentracija uzorka izražena u mol/l, konstantu nazivamo molarni apsorp cijski ko-eficijent.

Apsorpcija se obično mjeri na onoj valnoj dužini pri kojoj je apsor-pcija traženog spoja najveća. Podatke možemo pronaći u literaturi ili se snimi apsorpcijski spektar spoja.

23.1.2. Fotometrijski testni kitovi

Fotometrijske testne kitove upotrebljavamo za kvantitativno kemij-sko određivanje u pitkoj vodi. Obično upotrebljavamo dva tipa foto-metrijskih testova:

• Reagensi ili smjesa reagensa sadrže sve komponente potreb-ne za tijek kemijske reakcije (pufere, maskirni reagensi). Rea-gensi su zatvoreni u staklenoj epruveti u koju dodajemo propi-sani volumen uzorka. Nakon konačne reakcije izmjerimo apsorbanciju obojane otopine.

• Reagensi, potrebni za tijek kemijske reakcije, u obliku su te-kućeg koncentrata ili krute smjese. Kod ovih testova u odre-đen volumen uzorka nakapamo propisan volumen reagensa ili propisanu količinu krute smjese reagensa i mjerimo apsor-banciju otopine u običnoj kiveti.

Za fotometrijska mjerenja upotrebljavamo posebno pripremljen foto-metar.

23.2. Instrumenti za mjerenje kod upotrebe brzih testova

Fotometri koji se obično upotrebljavaju kod određivanja brzim testo-vima malo se razlikuju od običnih fotometara:

1. Kalibracijske funkcije za sve testove nalaze se u instrumentu u elektronskom obliku i ne moraju se mijenjati.

2. Vrijednosti slijepe probe za sve reagense kao i za smjese reagen-sa također su pohranjene u instrumentu u elektronskom obliku.

3. Izmjerenu vrijednosti očitaju se na zaslonu u izabranim jedini-cama.

106




4. Vrlo brzo se može izabrati između metoda, bilo pomoću bar kodova na staklenim stanicama testova ili se ručno upiše broj metode s popisa.

5. Noviji instrumenti imaju ugrađenu aqua funkciju, što znači za određivanje kakvoće mjerenja.

23.2.1. Mjerno područje

Mjerena apsorbancija otopine uzorka je linearno proporcionalna koncentraciji tražene komponente samo u određenom koncentracij-skom području. Mjerno područje za određenu metodu elektronski je pohranjeno u instrumentu.

Ako je koncentracija mjerene komponente u našem primjeru niža od koncentracijskog područja upotrebljenog testa, moramo upotrijebiti veću kivetu ili drugi test, primjeren radu u nižem koncentracijskom području.

Kod mjerenja koncentracija, koje su na gornjoj granici mjernog po-dručja testa, može se dogoditi da ovisnost između mjerene apsor-bancije i koncentracije analita više nije linearna. U takvim slučajevi-ma uzorak razrijedimo ili upotijebimo test za više mjerno područje. Ako uzorak razrjeđujemo, držimo se pravila da faktor razrjeđenja nije veći od 100. Razrjeđenje priređujemo tako da je koncentracija tražene komponente u razrjeđenom uzorku približno na sredini mjernog područja testa.

U fotometriji vrijedi pravilo da se mjerenja vrše nasuprot slijepoj probi. To je obično deionizirana voda s dodanim reagensima. Te vri-jednosti su za određene brze testove već elektronski spremljene u instrumentu, a također ih možemo napraviti i sami uz korekciju vri-jednosti slijepe probe.

23.3. Doziranje reagensa i priprava uzoraka u korištenju brzih testova

Pri korištenju brzih testova doziranje uzoraka je vrlo pojednostavlje-no. To značajno skraćuje vrijeme analize, ali u isto vrijeme zahtijeva puno opreza u vrednovanju rezultata.

Manje volumene tekućih reagensa obično dodajemo pomoću kapaljke koja je pričvršćena na staklene boce reagensa, veće volumene dozira-mo pomoću priložene injekcijske brizgalice. Reagense u krutom obli-ku doziramo pomoću priloženih dozirnih posudica.

23.4. Osiguranje i kontrola kvalitete

Svrha svakog kemijskog određivanja je što preciznije i točnije odre-đivanje tražene komponente (analita).

Primjenom sustava za osiguranje kvalitete određuje se kvaliteta rada, pronalaze pogreške u mjerenom sustavu, prikazuje usporedba rezultata s rezultatima referentne metode.

Neki instrumenti za mjerenje s brzim testovima omogućuju nam punu softversku podršku u tom području, kao što su:

• kontrola fotometra,

• kontrola mjernog sustava,

• kontrola termoreaktora,

• kontrola ručnih operacija, i

• kontrola utjecaja smetnji.

23.4.1. Kontrola mjernog sustava

Kontrolu mjernog sustava provodimo pomoću referentnih standardnih otopina poznatih koncentracija, koji se posebno nabavljaju za pojedi-ne testove (podaci u katalogu proizvođača). Otopine su pripremljene i prilagođene rasponu koncentracija poje dinačnih testova. Vrijednosti s dozvoljenim odstupanjem (tolerancije) su elektronički pohranjene u instrumentu. Izmjerene vrijednosti instrument sam uspoređuje sa spremljenim vrijednostima i rezultat usporedbe se ispiše na ekranu.

Nakon mjerenja ispunimo priloženu kontrolnu kartu.

U slučaju da za određeni parametar nije dostupna već pripremljena referentna otopina, sami pripremimo standardnu otopinu uz vođenje kontrolne karte.

23.4.2. Traženje eventualnih pogrešaka nastalih kod ručnih operacija

Slijedimo upute za korištenje testova i provjerimo:

• da li smo koristili odgovarajući brzi test,

• da li je područje rada brzog testa pogodno za uzorak kojeg želimo mjeriti,

• da li smo točno poštivali upute za rad,

• da li je volumen uzorka odgovarajući, i

• da li smo provjerili datum upotrebe brzog testa.

108


23.4.3. Utvrđivanje utjecaja matriksa

U kemijskim analizama uzoraka, kada matriks može utjecati na određivanje, koristimo standardnu metodu dodatka. Uzorku se u poznatom volumenu dodaje koncentrirana otopina s poznatom kon-centracijom komponente, koju određujemo u uzorku (već pripre-mljene otopine za ovu svrhu komercijalno su dostupne za sve kito-ve). U konačnom izračunu volumen dodanih referentnih otopina može se zanemariti.

DIO IV. ANALITIČKI REZULTATI





TUMAČENJE - INTERPRETACIJA ANALITIČKIH REZULTATA

Za pravilno tumačenje (interpretaciju) analitičkih rezultata potrebno je dobro poznavanje osnova analitičkih metoda, validacije analitičkih postupaka i osnova statistike.

Kod tumačenja rezultata, sa stajališta zdravstvene ispravnosti po-trebno je poznavanje zakonodavstva s tog područja kao i zahtjeva kupaca.

Poznavanje analitičkih metoda i osnovnih validacijskih parametara kao što su donje granica detekcije, donja granica kvantifikacije, pre-ciznost, točnost metode, područje rada itd., temelj su za izbor me-tode za određenu analitičku primjenu. Ovi podaci pomažu pri tuma-čenju rezultata.

Ako je kod konačnog rezultata data mjerna nesigurnost određivanja, mora se uzeti u obzir pri tumačenju rezultata.

Zahtjevi zakonodavstva su ponekad takvi da propisuju čak i među-narodne standarde prema kojima bi se određeni parametri trebali testirati, ili umjesto njih primjerene druge odgovarajuće validirane metode.

U posljednje vrijeme se zakonska regulativa usklađuje s europskim zakonodavstvom pri čemu se zahtjevi smanjuju te navode se samo principi mjerenja uz uvjet da metode moraju biti propisno validirane.

Opseg validacije ovisi o ispitnoj metodi, o zahtjevu kupca i zakon-skoj regulativi (u poglavlju statistika).

Obično se u zakonskoj regulativi također navode zahtjevi za pojedi-ne metode kao što su preciznost, točnost i % normativne vrijedno-sti, što znači udio (u %) koji predstavlja donju granicu kvantifikacije u odnosu na normativnu vrijednost.

Primjer: nikal

Postotak normativne vrijednosti = 10 %; potrebna donja granica kvantifikacije < 1 µg/l.

24. VELIČINE I JEDINICE

Međunarodni sustav jedinica (Syst�me International, SI) se temelji na Konvenciji o metru iz 1875. godine. Sustav ažurira Međunarodni odbor (CIPM) i Opći sabor (CGPM) pri Međunarodnom uredu za utege i mjere (BIPM) u Parizu.

Međunarodni sustav jedinica i znakova (SI) također sadrži pravila za pisanje simbola za umnoške i količnike SI jedinica i SI prefiksa (vi-

112




šekratnika i umanjenika jedinica). Europska komisija je međunarodni sustav ozakonila u svojoj smjernici (Direktiva Vijeća 80/181/EEC iz-mjenama 85/1, 89/617 i 99/103/EC), koju su, s odredbom čija pri-mjena je obvezna, preuzeli kako Slovenija, tako i Hrvatska. Međuna-rodna organizacija za standardizaciju (ISO) izdala je niz standarda o veličinama i jedinicama, najopsežniji je standard ISO 314, koji je op-sežniji od dokumenta SI, a osim imena sadrži i simbole veličina. Pri-mjena ISO 314 standarda nije obavezna, ali se preporuča.

U ovom tekstu proučit ćemo osnovna pravila pisanja jednadžbi, simbola i jedinica koje proizlaze iz SI međunarodnog sustava jedini-ca kao i standarda serije ISO 31. Ovaj sustav sadrži osnovne jedini-ce i izvedene jedinice, uključujući dodatne jedinice. Tablica 15. pri-kazuje osnovne jedinice.

Tablica 15. Osnovne SI jedinice

OpisSI osnovna jedinica

Ime jedinice Simbol

Dužina metar m

Masa kilogram kg

Vrijeme sekunda s

Električni tok amper A

Termodinamička temperatura kelvin K

Količina tvari mol mol

Osvjetljenje kandela cd

Izvor: ISO 31-0 to 31-13, Quantities and units (1992, Amandments 1998); SIST ISO 31-0 do 31-13, Veličine in enote (2002)

Izvedene jedinice su one jedinice koje dobijemo iz osnovnih jedini-ca, npr. za brzinu je to m/s, kutna brzina rad/s, ili s-1, sila u kg · m/s2 i slično. Također, određene izvedene jedinice možemo označiti s no-vim jedinicama kao npr. Joule: 1 J = 1 m2 · kg · s. Posebno treba napomenuti da je preporučena oznaka za litar L a ne l iako je oboje točno.

Također su dogovorena pravila za pisanje simbola veličina i jednadž-bi. Simbole veličina pišemo kosim slovima latinske ili grčke abecede u Times New Roman. Ako imamo indekse (potpise i natpise) piše-mo ih normalno, npr. simbol masenog protoka pišemo qm. Iza sim-bola nema točke, osim na kraju rečenice. Ako imamo jednadžbe, tada simbole kod množenja kao i kod jedinica odvajamo točkom, npr. opću plinsku jednadžbu pišemo:

P · V = n · R · T.

Kod dijeljenja možemo koristiti nekoliko načina. Jednadžbu za brzi-nu možemo izraziti na sljedeće načine:

V = s / t, v = s · t-1.

U nastavku ćemo opisati način prikazivanja, pisanja i označavanja veličina koje su korištene u ovoj knjizi. Prije svega, to se odnosi na koncentracije, temperature, odnose itd.

24.1. Izražavanje količine

Količine u tablicama i grafikonima s numeričkim vrijednostima jasno označavamo kao što je prikazano u nastavku, npr. temperatura T/°C, qm/(m/s), Cp/(kJ/(kg·K)) i slično. Između numeričke vrijednosti i jedinice je uvijek razmak, npr. 100 mg/L.

Količine moramo izraziti jasno i nedvosmisleno: 13 mm × 15 mm × 30 mm, a ne 13 × 15 × 30 mm. Vrijednosti u granicama navo-dimo s prijedlozima od ... do s naznakom jedinice kod oba broja, znači od 0 °C do 100 °C (ne 0 do 100 °C).

Dozvoljena je upotreba simbola % (posto), simbol ‰ (promil), za broj 0,001 ne! Između broja i simbola mora biti razmak: xB = 0,0035 = 0,35 % (nepravilno je pisati xB = 0,35% ili xB = 0,35 posto). Zato što je % broj ne smijemo mu dodati infor-macije, tj. ne smijemo pisati npr. maseni postotak niti težinski % niti % (m / m), ili npr. molski postotak niti molski % niti % (mol / mol). Pravilno: maseni udio je 15 % ili wB = 15 % ili wB = 150 g/kg; molni udio je 15 % ili xB = 15 %. Kratice ppm, ppb, PPT i imena brojeva 109 i više nisu prikladne. Umjesto npr. 1 bilijun (USA) = 1 × 109, 1 bilijun (EU) = 1 × 1012, pišemo broj 10 na odgovaraju-ću potenciju. Umjesto jedinica ppm, ppb pišemo npr. 0,5 µL/L (ne 0,5 ppm), 1 nm/m (ne 1 ppb), 2 ng/kg (ne 2 ppt). Također iz tih jedinica nije jasno da li imamo maseni ili volumni omjer.

24.2. Pravila za imenovanje veličina

Različiti omjeri količina definirani su u nastavku.

Koeficijent: Količnik dvaju veličina s različitim dimenzijama npr. koeficijent (topline, masa), (križanje, prijelaz).

Faktor: Količnik dvaju veličina s istim dimenzijama.

Omjer: Količnik dvaju jednakih veličina, ne “indeksa”.

Proporcija: Omjer manji od jedan.

Razina (nivo): Logaritam omjera veličine i njezine referentne vrijed-nosti.

Konstanta: Veličina koja ima istu vrijednost za sve uvjete.

114




Maseni, specifičan: podijeljen s masom X / m = x

Volumni, gustoća podijeljena s volumenom X / V

Dužinski, linearna gustoća podijeljena s duljinom X / l (primjećuje-mo da to nije po litri).

Plošni, plošna gustoća podijeljena s površinom X / A.

Molni, podijeljen s množinom od X / n = XM.

Koncentracijski, podijeljen s ukupnim volumenom smjese X / Vz.

Koncentracijski omjeri i udjeli te pripadajuće oznake prikazane su u tablici 16.

Moramo provjeriti je li uzorkovanje provedeno prema standardima te je li ambalaža bila prikladno pripremljena jer zbog pogrešaka u procesu pripreme ambalaže, kod uzorkovanja može doći do pogreš-ne interpretacije rezultata. U takvom slučaju oslanjamo se na rezul-tate prethodnog uzorkovanja ili uzorkovanje ponovimo. Za cjeloku-pnu sliku o npr. nekom izvoru pitke vode, potrebno je kontinuirano praćenje parametara.

Na taj način možemo pratiti trendove u koncentracijama pojedinih parametara i otkriti neke nove zagađivače u vodi.

26. INTERNO UPRAVLJANJE KVALITETOM

Prihvaćen stupanj upravljanja kontrole kvalitete mora biti dovoljan kako bi se osigurala vjerodostojnost rezultata. Za rutinske analize, obim unutarnje kontrole ne smije biti manji od 5 % svih obrađenih uzoraka (tj. jedan uzorak na svakih 20 analiziranih bi morao biti za kontrolu kvalitete rada). Za složenije postupke taj udio je obično 20 %, ali povremeno mogu zahtijevati i do 50 %. Za analize koja se ne izvode često, potrebno je svaki put iznova izvršiti validaciju su-stava u smislu korištenja referentnog materijala koji sadrži certifici-ranu ili poznatu koncentraciju analita. Tek tada slijedi analiza uzor-ka. Analize koje se provode češće trebaju podlijegati sustavnom postupku kontrole kvalitete kao što su izrada kontrolnih karti te kori-štenje testnih uzoraka.

27. VANJSKA KONTROLA KVALITETE – PROVJERA OSPOSOBLJENOSTI LABORATORIJA

Jedan od najboljih načina kojim analitički laboratorij može pratiti svo-ju učinkovitost, kako u pogledu svojih zahtjeva, tako i prema norma-ma i drugim laboratorijima, je redovito sudjelovanje u programima (shemama) međulaboratorijskih ispitivanja (engl. PT – proficiency te-sting). Provjera sposobnosti ne pomaže samo rasvijetliti ponovljivost i obnovljivost rezultata analize između laboratorija, već i njihove su-stavne pogreške. Važno je da se rezultati međulaboratorijskih uspo-redbi koriste kao sredstvo osiguranja kvalitete. Akreditacijska tijela na ovaj način provjeravaju laboratorije te provođenje vanjskih kontrola propisuju kao jedan od uvjeta za dobivanje akreditacije sukladno za-htjevima norme ISO/IEC 17025:2005 za ispitne laboratorije.

Kod uvođenja metoda poželjno je nabaviti i provoditi normirane me-tode (ISO, CEN, EPA, AOAC), dok alternativno kod uvođenja vlastito razvijenih metoda (engl. in-house method) potrebno je provesti po-drobniju validaciju.

Tablica 16. Odnosi, udjeli i koncentracije

Veličina Masa Volumen Množina Brojčanost

Omjer ζ (A/B)maseni omjer

ψ (A/B) volumni omjer

r (A/B)množinski omjer

R (A/B)brojčani omjer

Udjeli wBmaseni udjel

ϕBvolumni udjel

xBmnožinski udjel

XBbrojčani udjel

Koncentracija ρBmasena

koncentracija

σBvolumna

koncentracija

cB(množinska) koncentracija

CBbrojčana

koncentracija

Izvor: ISO 31-0 to 31-13, Quantities and units (1992, Amandments 1998); SIST ISO 31-0 do 31-13, Veličine in enote (2002)

25. TUMAČENJE REZULTATA

Općenito je važno da uzorak ne ocjenjujemo ili dajemo tumačenje na osnovi jednog rezultata, posebice ako je taj rezultat veći od do-puštene vrijednosti utvrđene zakonom. Rezultat u takvom slučaju uspoređujemo s dosadašnjim rezultatima dobivenim u istovrsnim uzorcima (iskustvo analitičara), uspoređujemo ga s informacijama o trendovima promjene parametra (ako postoje) ili ga interpretiramo pomoću sličnih parametara. Kod takvog načina interpretacije, mo-ramo voditi računa o različitim rasponima koncentracija i različitim metodama rada. Prilikom procjene rezultata poteklih iz različitih la-boratorija to treba uzeti u obzir. Moramo uzeti u obzir, da se radi o različitim uvjetima rada, različitom osoblju, drugim instrumentima, moguće čak i o drugoj metodi. Nije moguće uspoređivati rezultate, ako su za metode određene različite granice određivanja, posebno rezultata koji su na granici ili čak ispod granice određivanja analitič-kih metoda. Ako imamo nekoliko grupa usporedivih mjerenja (rele-vantne rezultate) možemo ih usporediti na temelju statističkih testo-va (F-test). U konačnoj interpretaciji rezultata, moramo obratiti pozornost i na uzorkovanje te pripremu staklenog pribora.

116




28. VALIDACIJA KEMIJSKIH METODA

Validacija analitičke metode je postupak kojim utvrđujemo karakte-ristike ispitne metode i potvrdimo da li je metoda prikladna za odre-đenu analitičku primjenu.

Validacijom ispitne metode dokazujemo da ona ispunjava uvjete koji su određeni za određenu ispitnu metodu. Zahtjeve može dati naru-čitelj, propisani su standardima ili zakonskom regulativom. Validaci-ja ispitne metode uključuje ispitivanje na sljedeće parametre:

• selektivnost,• radno područje,• linearnost,• osjetljivost,• granice detekcije,• granica kvantifikacije,• preciznost, i• točnost.

Opseg validacije ovisi o vrsti ispitne metode, zahtjevima kupca i na-mjeni. Standardizirane ispitne metode su validirane pa zato provje-ravamo samo smislene parametre, kao što su preciznost i točnost te uspoređujemo dobivene rezultate validacije s već poznatim i objav-ljenim u standardu.

Kod internih metoda validacije (tzv. “kućnih”), validaciju je potrebno provesti u cijelosti.

28.1. Selektivnost

Selektivnost se odnosi na stupanj do kojeg se može odrediti neki analit u složenoj smjesi bez utjecaja drugih komponenata u smjesi. Postupak je potrebno ispitati s različitim uzorcima, od čistih stan-dardnih tvari do smjesa s kompleksnim matriksima. U svakom slu-čaju, potrebno je odrediti učinkovitost analita i utjecaj smetajućih komponenata.

Postupak je selektivan ako može odrediti analit u prisutnosti drugih spojeva u matriksu.

28.2. Radno područje

Radno je područje za kvantitativnu analizu određeno koncentracij-skom granicom, do koje koncentraciju analita u uzorku još uvijek određujemo s prihvatljivom točnošću i preciznošću. Područje rada potvrdimo izračunom homoscedastičnosti ili ga obično definiramo s najnižom i najvišom točkom kalibracijske krivulje.

Unutar radnog područja odredimo linearni raspon, tj. linearni odnos signal – koncentracija analita. Odredimo ga mjerenjem signala slije-pog uzorka i otopina različitih koncentracija (10) u cijelom području rada i izračunamo pravac regresije metodom najmanjih kvadrata. Kalibracijska krivulja je linearna ako je koeficijent korelacije ≥ 0,99.

28.3. Osjetljivost

Osjetljivost predstavlja razliku u koncentraciji analita, koji odgovara najmanjoj razlici signala koji metodom još uvijek može biti otkriven.

Predstavlja nagib kalibracijske funkcije i može se odrediti postup-kom najmanjih kvadrata ili eksperimentalno s uzorcima koji imaju različite koncentracije analita.

28.4. Granica detekcije

Granica detekcije je najmanji signal za kojeg sa sigurnošću možemo reći da još sadrži analit. Eksperimentalno ju izračunamo iz prosječ-ne vrijednosti mjernog signala slijepog uzorka čemu dodajemo tro-struko standardno odstupanje od tih mjerenja:

LOD = Xpovp. + 3s

28.5. Granica kvantifikacije

Granica kvantifikacije je najniža koncentracija analita koja se može odrediti uz prihvatljivu preciznost i točnost. Nekad je i donja granica koncentracije kalibracijske krivulje, odnosno prva točka kalibracijske krivulje (ako isključimo slijepi uzorak).

LOQ = Xpovp. + 5, 8, 10s

28.6. Preciznost

Preciznost metode govori o međusobnom rasipanju rezultata. Izra-žavamo ju kao standardnu devijaciju od 7 – 10 mjerenja.

28.7. Točnost

Točnost nam govori koliko rezultat dobiven s ispitnom metodom od-stupa od prave vrijednosti. Odredimo je tako da analiziramo odgova-rajući referentni standard i mjerni rezultat usporedimo s certificira-nom vrijednosti. Na taj način određujemo moguću sustavnu pogrešku metode.


DIO V. STATISTIKA


120


DIO V. STATISTIKA


POGREŠKE MJERENJA

Svako mjerenje fizikalnih i kemijskih količina podliježe određenim pogreškama. Pravi ili točan iznos ostaje uvijek nepoznat, a mjerni rezultat može biti približno bolja ili lošija aproksimacija.

Pogreške uzrokuju mjernu nesigurnost koja predstavlja interval unu-tar kojeg se nalazi prava vrijednost. Ovisno o tome kako se pogreš-ke odražavaju na rezultat mjerenja, dijelimo ih na:

• slučajne (proizlaze iz netočnosti mjerenja i uzrokuju međusob-no rasipanje rezultata ako analizu ponovimo nekoliko puta), i

• sustavne (uzrokuju značajno odstupanje cijele serije rezultata mjerenja od istinske vrijednosti i posljedica tih grešaka je pre-visok ili prenizak rezultat analize).

29. SLUČAJNE POGREŠKE

Slučajne pogreške uzrokuju raspodjelu rezultata mjerenja oko neke središnje vrijednosti. Ako je populacija velika i raspodjela simetrič-na, možemo ju opisati normalnom Gaussovom krivuljom pogreške:

Njena širina ovisi o parametru s, koji daje disperziju (raspršenost) rezultata i zovemo ga standardna devijacija, dok je m središnja vri-jednost serije ili pravi prosjek.

29.1. Standardna devijacija

Standardna devijacija je mjera za odstupanje rezultata od prosjeka. Kod velikog niza mjerenja (N → ∞) izračunava se prema formuli:

gdje je xi izmjerena vrijednost, m pravi prosjek, N je broj mjerenja. Kvadrat standardne devijacije s2 u statistici zovemo varijanca.

29.2. Preciznost rezultata

Ako se provodi više mjerenja dobiveni rezultat izražavamo kao pro-sječnu ili aritmetičku sredinu. Za manji niz mjerenja (n < 20) umje-sto stvarnog prosjeka m, koristimo aritmetičku sredinu rezultata izračunatu pomoću jednadžbe:

Ako neko mjerenje u nizu odstupa, umjesto prosjeka, dajemo kao rezultat srednji rezultat ili medijan vrijednost M.

Medijan je srednji rezultat po veličini raspoređenog niza mjerenja.

Za savršenu simetričnu seriju rezultata medijan i aritmetička sredi-na su jednaki.

Mjernu nesigurnost prosječne vrijednosti daje standardna devijacija. U malom nizu mjerenja standardnu devijaciju označavamo simbo-lom s, a izračunava se prema formuli:

Pojmovi preciznost i točnost znače podudaranje (skladnost) između rezultata nezavisnih mjerenja.

Standardna devijacija je statistička mjera za preciznost rezultata. To je imenovana veličina (%, mg, mol...) koja nam služi za procjenu veličine slučajnih pogrešaka. Što je manja standardna devijacija, veća je točnost analiziranih rezultata i obrnuto.

Govoreći o preciznosti mjernih rezultata, razlikujemo dva pojma: ponovljivost (repetability) i reproducibilnost (reproducibility).

29.3. Ponovljivost

Ponovljivost je preciznost rezultata dobivenih mjerenjem iste kom-ponente za redom i u istim uvjetima mjerenja (ista metoda, isti ana-litičar, isti laboratorij i mjerenja provedena u kratkom vremenskom razdoblju).

29.4. Reproducibilnost

Reproducibilnost je preciznost rezultata dobivenih pri mjerenju istog analita u promijenjenim uvjetima (druga metoda, drugi analitičar ili laboratorij, drugi uređaji, drugi kraj, dulje vremensko razdoblje...).

Pri navođenju nesigurnosti mjernih rezultata upotrebljavamo obično relativnu standardnu devijaciju sr ili RSD, koja je definirana kao kvoci-jent standardne devijacije i srednje vrijednosti mjerenja:

122


DIO V. STATISTIKA


Relativnu standardnu devijaciju izraženu u % u statistici zovemo ko-eficijent varijacije, KV.

KV = RSD × 100

Ako izvedemo više setova mjerenja s podacima N dobijemo niz srednjih vrijednosti, koji se među sobom razlikuju manje nego poda-ci u zasebnom setu. Standardno odstupanje od prosjeka zovemo standardna pogreška. Standardna pogreška je obrnuto proporcio-nalna kvadratnom korijenu broja mjerenja.

29.4.1. Zapisivanje rezultata

Rezultat analize izražavamo na onoliko brojeva koliko ih pouzdano znamo. Zadnji broj kojeg zapišemo je onaj na kojem počinje mjerna nesigurnost ili netočnost rezultata.

29.5. Mjerna nesigurnost

Mjerna nesigurnost je parametar koji određuje unutar kojih granica oko izmjerene vrijednosti leži pravi rezultat i s kolikom vjerojatnošću.

30. SUSTAVNE POGREŠKE

Sustavne pogreške uzrokuju odstupanje od izmjerenih vrijednosti od prave ili stvarne vrijednosti. Ove pogreške mogu biti pozitivne ili ne-gativne (imaju predznak), a mogu biti konstantne ili proporcionalne koncentraciji mjerene komponente. Uzroci sustavnih pogrešaka mogu biti različiti:

• pogreške analitičara,

• instrumentalne pogreške i

• pogreške metode analize.

Sustavne pogreške moramo prepoznati i smanjiti na zanemarive vri-jednosti.

30.1. Pravilnost i točnost

Razlika između izmjerenog rezultata i prave vrijednosti je pogreška, koju označavamo E.

E = x – T,

gdje je x rezultat mjerenja, a T prava (točna) vrijednost mjerenog.

Sustavne pogreške uzrokuju značajno odstupanje od cijele serije mjerenja od prave vrijednosti mjerenog. Pravilnost znači podudara-nje prosječnih rezultata mjerenja sa stvarnom odnosno dogovore-nom (referentnom) vrijednosti.

Prosječno odstupanje od stvarne vrijednosti izražavamo apsolutnom pogreškom.

Točnost se može izraziti kao relativna pogreške Er, što je kvocijent apsolutne pogreške i točne vrijednosti.

Pravu vrijednost predstavlja istinska koncentracija komponente, sa-držane u uzorku. Pošto ju u pravilu ne znamo, pomažemo si primje-renim materijalima (certificiranim standardnim referentnim materija-lima – CRM, međulaboratorijskim uspoređivanjem uzoraka, upotrebom standardnih otopina itd.).

Pojam točnosti se odnosi na podudaranje rezultata mjerenja s dogo-vorenom pravom vrijednosti, a odstupanju može biti uzrok sustavna i slučajna pogreška.

30.2. Prepoznavanje i smanjivanje sustavne pogreške

Sustavne pogreške možemo pretpostaviti ako rezultat značajno od-stupa od prave vrijednosti. Za prepoznavanje prisutnosti sustavne pogreške koristimo t-test, na temelju kojeg ćemo odlučiti o odabra-noj vjerojatnosti P ili broju napravljenih mjerenja N, da li naš prosjek značajno odstupa od istinske odnosno certificirane vrijednosti ili ne. To vrijedi ako je razlika između stvarne vrijednosti i izmjerenih rezul-tata, odnosno prosjeka, viša od 3s (99,7 % vjerojatnosti).

E ≥ ± 3s

Najčešći uzroci sustavne pogreške:

• instrumentalne i osobne pogreške (nedostatak znanja i nera-zumijevanja mjernih principa, nedostatak kalibracije i umjera-vanja instrumenata, netočni i nestabilni reagensi, nesavjesni i neprecizni rad, slaba laboratorijska osposobljenost, umor itd.)

• metodološke pogreške (krivi izbor metode, nepravilno uzor -kovanje, nepravilno skladištenje i/ili priprema uzorka, neline-arnost odziva instrumenta itd.).

124


DIO V. STATISTIKA


Pogreške se mogu kontrolirati i nadzirati (odnosno sačuvati u prihvat-ljivim granicama) samo čestim provjerama pravilnosti i preciznosti, tj. osiguravanjem kontrole kvalitete u laboratoriju (upotreba kontrolnih uzoraka, vođenje kontronih karata, sudjelovanje u međunarodnim međulabaratorijskim usporednim shemama, provođenje usporednih analiza unutar laboratorija, također primjenom različitih metoda itd.).

LITERATURA

1. Bregar R. 2005, Priročnik za vzorčenje in analitiko pitnih in kopalnih vod, Inštitut za sanitarno inženirstvo.

2. Bio-rad. Water testing. 2014. Izvor: http://www.bio-rad.com/it-it/cat-egory/water-testing.

3. COLILERT. Izvor: https://www.idexx.com/water/products/colilert.html.

4. Crompton T.R. 1992. Natural Waters. Comprehensive Water Analy-sis. Vol. 1, Elsevier Science Publishers.

5. Crompton T.R. 1992. Treated Waters. Comprehensive Water Analy-sis, Vol. 2, Elsevier Science Publishers.

6. Direktiva 2009/54/EZ Europskoga parlamenta i Vijeća od 18. lipnja 2009. o iskorištavanju i stavljanju na tržište prirodnih mineralnih voda.

7. Drever J.I. 1997. The Geochemistry of Natural Waters: Surface and groundwater Environments. 3rd Edition.

8. Duraković S. 1996. Primijenjena mikrobiologija. Prehrambeno Tehnološki Inženjering, Zagreb.

9. Duraković S., Delaš F. i Duraković L. 2002. Moderna mikrobiolo gija namirnica. Knjiga druga. Kugler, Zagreb.

10. Đukić D.A., Gajin S.K., Matavulj M.N. i Mandić L.G. 2000. Mikro-biologija voda. IP Prosveta A.D., Beograd.

11. Edenbaum J.1992. Plastics Additives and Modifiers Handbook, Van Nostrand Reinhold, New York.

12. Frece J. 2013/2014. Nastavni materijali – predavanja. Prehram beno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu. Labora torij za opću mikro-biologiju i mikrobiologiju namirnica http://www.pbf.unizg.hr/hr/zavodi/zavod_za_biokemijsko_inzenjer s t vo / laborator i j _ za_opcu_mikrobiologiju_i_mikrobiologiju_namirnica/mikrobiologija/nastavni_materijali/predavanja/predavanja

13. Frece J. 2003. In vitro i in vivo istraživanja probiotičkog mehanizma djelovanja bakterija: Lactobacillus acidophilus M92, Lactobacillus plantarum L4 i Enterococcus faecium L3. Magistarski rad, Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu.

14. Frece J. 2007. Sinbiotički učinak bakterija: Lactobacillus acido-philus M92, Lactobacillus plantarum L4 i Enterococcus faecium L3. Doktorski rad, Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu.

15. Glavič P. Mednarodni standardi – veličine in enote. MTAEC9, 37(1-2)79(2003).

16. Guidelines for drinking water quality. 2nd ed. Vol. 2, WHO, Geneva, 1996.

17. Helde.net. Kružni tijek tvari u vodama. Izvor: http://fullnulled.com/doc/pdf/download/www__hlede__net--studentski_radovi--ribe--RibeSveZajedno.pdf.

18. HR EN ISO 16266:2008 – Kakvoća vode – Detekcija i brojenje Pseu-domonas aeruginosa – Metoda membranske filtracije

126


LITERATURA


19. HR EN ISO 6222:2000 – Kakvoća vode – Brojenje uzgojenih mikroor-ganizama – Broj kolonija nacjepljivanjem na hranjivi agar

20. ISO 31-0 to 31-13, Quantities and units (1992, amandments 1998); SIST ISO 31-0 do 31-13, Veličine in enote (2002)

21. HRN ISO 19250:2013 – Kvaliteta vode – Detekcija vrsta roda Salmo-nella

22. ISO 14189:2013 – Water quality – Enumeration of Clostridium perf-ringens – Method using membrane filtration

23. ISO 9308-2 – Water quality – Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria – Part 2: Most probable number method

24. HR EN ISO 7899-2 – Kakvoća vode – Detekcija i brojenje crijevnih enterokoka – 2. dio: Metoda membranske filtracije

25. HRN EN ISO 9308-1:2000 – Kakvoća vode – Detekcija i brojenje Es-cherichia coli i koliformnih bakterija – 1. Dio: Metoda membranske filtracije

26. HRN ISO 11731:2000 – Kakvoća vode – Detekcija i brojenje Le-gionella

27. HRN EN ISO 11731-2:2008 – Kakvoća vode – Detekcija i broje nje Legionella – 2. dio: Izravna metoda membranske filtracije za vode s malim brojem bakterija

28. Katan L.L. 1996. Migration from food Contact Materials. Blackie Aca-demic & Professional, London.

29. Kakovost vode. 2013. SIST EN ISO 5667-3:2013.

30. Kay B.H. 1999. Water resources: Health, Environment and Develop-ment. E & FN Spon.

31. Kruženje vode u prirodi. Izvor: http://web.zpr.fer.hr/ergonomija/2004/cindric/kruzenje.html

32. Mara D. and Horan N. 2003. Handbook of Water and Wastewater Microbiology. Academic Press. An Imprint of Elsevier, London, UK.

33. Mijatović I. 2004. Priprema vode za hemodijalizu. Hrvatska gospo-darska komora.

34. Pihlar B. 1994. Osnove analizne kemije. I. del. Biotehniška fakulteta, Ljubljana. Univerza v Ljubljani.

35. Pihlar B. 1994. Osnove analizne kemije. II. del. Biotehniška fakulteta, Ljubljana. Univerza v Ljubljani.

36. Pravilnik o parametrima sukladnosti i metodama analize vode za ljud-sku potrošnju, “Narodne novine” br. 125/13.

37. Pravilnik o prirodnim mineralnim, prirodnim izvorskim i stolnim voda-ma, “Narodne novine” br. 48/15.

38. Reddy C.A., Beveridge T.J., Breznak J.A., Marzluf G., Schmidt T.M. i Snyder L.R. 2007. Methods for General and Molecular Microbiology. 3rd Edition, ASM Press.

39. Sigee D.G. 2005. Freshwater Microbiology. John Wiley and sons, Ltd, UK.

40. Skoog D.A. 1985. Principles of Instrumental Analysis. 3rd ed., Saun-ders College Publishing, Orlando, Florida, USA.

41. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 1999. 20th ed., American Public Health Association, American Water Works Association.

42. Šantić M. 2008/2009. Nastavni materijal predavanja, Medicinski fakultet Sveučilišta u Rijeci, Zavod za mikrobiologiju i parazitologiju http://www.medri.uniri.hr/katedre/Mikrobiologija/dsi/mikrobiologi-ja_vode/index.htm

43. Zakon o hrani. “Narodne novine” br. 81/13 i 14/14.

44. Zakon o vodi za ljudsku potrošnju. “Narodne novine” br. 125/13.

45. Zavod za javno zdravstvo Dr. Andrija Štampar. Uputa za uzimanje uzoraka iz vode iz slavine. 2001. Izvor: http://www.stampar.hr/Uputa-ZaUzimanje.

128


Documents

uvod u mikrobiologiju i fizikalno-kemijsku analizu voda