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FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE LABO: LFSAL SECTIE - SECTION: Analyses Spéciales
VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION
Analysemethode Méthode d’analyse
I-MET-LFSAL-025B Dosage de l’histamine dans des échantillons de poissons par HPLC-UV
Techniek Technique
HPLC-Fluorimétrie
Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices
Poissons
Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaptation
Mars 2015
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• Résumé des critères de performance :
Justesse : §4 (pages 4 et 5) dossier de validation du 04/02/2010 (édition 1).
Rendement: §6 (page 7), dossier de validation du 04/02/20010 (édition 1).
Répétabilité et reproductibilité intra-laboratoire, §5 (page 6), dossier de validation du 04/02/2010 (édition 1).
LOD & LOQ : §8 (page 8 et 9) : 25 ppm (LOD) & 50 ppm (LOQ) U relatif : 15,1 %
• La validation répond aux exigences de la procédure 2014/832/LAB
• Le laboratoire qui veut appliquer cette méthode doit démontrer que les critères ci-dessous soient remplis pour les combinaisons matrices/paramètres :
Justesse : max 10 % relatif pour des résultats corrigés sur le
rendement dans la gamme 100-400 ppm Rendement: max 20 % relatif dans la gamme 50-400 ppm LOD & LOQ : §8 (page 8 et 9) : 25 ppm (LOD) & 50 ppm (LOQ) Reproductibilité intra-laboratoire : doit satisfaire à l’équation
d’Horwitz
• Historique de validation:
Edition Révision par/date Motif de la révision Modifications 2 M. Evrard / 03-2015 Recalcul de
l’incertitude de mesure
Incertitude de mesure
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VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d’analyse
I-MET-LFSAL-025B Dosage de l’histamine dans des échantillons de poissons par HPLC-UV
Techniek Technique
HPLC-FLUO
Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices
Poissons
Type validatie Type de validation
Totale
Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction)
Ir MARC EVRARD, chef de section
Opgesteld door Rédaction par
Evrard Marc 04/02/2010
Handtekeningen - Signatures: Sé
Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction)
C. Haudestaine / L. Keyaert /Y. Bouamar Experts techniques
Periode van validatie Période de validation
Start - Début: 11/01/2010 Einde - Fin: 04/02/210 Adaptation du dossier de validation au template : mars 2015
Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par
Ir Marc Evrard Chef de section
Handtekeningen - Signatures: Sé
Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals beschreven in de procedure van het desbetreffend domein. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme décrit dans la procédure du domaine concerné.
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Dossier de Validation des histamines dans les poissons riches en histidine par HPLC-UV.
L’histamine est une amine biogène produite après la mort du poisson sous l’action de certaines bactéries. Ces bactéries produisent une enzyme qui va transformer l’histidine – acide aminé présent à forte teneur dans certains poissons – en histamine. L’histidine peut se trouver sous forme libre mais aussi sous forme liée dans les pigments tels que l’hémoglobine et la myoglobine.
Les microorganismes responsables de la formation de l’histamine se développent principalement à des températures supérieures à 7-10°C dans les ouïes et les viscères du poisson. Cependant, de récentes recherches ont montré que certaines bactéries productrices d’histamine étaient actives entre 0 et 5°C. Les conditions nécessaires à la formation de l’histamine sont :
• Présence en quantité élevée d’histidine libre • Présence en nombre important des bactéries produisant l’histidine décarboxylase Une validation principale a été réalisée sur un mélange de sardines, de thons et de maquereaux à l’huile (égouttés) en même proportion massique. Les différents poissons ont été mélangés, aliquotés en tubes falcon et congelés. Les essais sur la matrice principale se sont fait à l’aide d’ajouts dosés d’histamine à 50-100-200 % de la norme Bien que similaires, deux autres matrices ont été testées afin de tester la répétabilité et le rendement d’extraction sur ces matrices ; les deux matrices secondaires sont :
- thon frais + maquereau frais + sardines fraîches en même proportions massiques - anchois saumurés.
Les essais sur les matrices secondaires se sont fait à l’aide d’ajouts dosés d’histamine à 50-100-200 % de la norme sur les poissons frais et 25-50-100 % de la norme pour les poissons saumurés Sur la validation principale, les paramètres pris en compte sont :
- la linéarité - l’exactitude (rendement, gamme de 50 à 400 ppm) et la justesse (échantillon Fapas, gamme de
120 à 340 ppm) - la précision (répétabilité et reproductibilité intralaboratoire à 50-100-200 % des normes). - La sélectivité, spécificité
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1. Normes dans les poissons n=9, c=2 : m=100 mg/kg et M= 200 mg/kg (pour produits de la pêche fabriqués à partir d’espèces de poissons associés à une grande quantité d’histidine : voir Règlement 2073/2005, annexe1, chapitre 1 : 1.25) n=9, c=2 : m=200 mg/kg et M= 400 mg/kg (pour produits de la pêche ayant subi un traitement de maturation aux enzymes dans la saumure, fabriqués à partir d’espèces de poissons associés à une grande quantité d’histidine : voir Règlement 2073/2005, annexe1, chapitre 1 : 1.26.). Mais la maturation enzymatique est exceptionnelle dans le cas de conserves de poissons.
2. La linéarité
Le modèle linéaire sur une gamme de 35 à 550 µg/g en 5 points a été retenu. Les critères concernant la linéarité sont les suivants :
- Un coefficient de détermination >= 0.99 ; - La gamme de concentration de la droite dans la validation comme en routine doit couvrir les
valeurs des pics détectés ; des dilutions des extraits finaux sont, le cas échéant, effectués. - Un écart maximum de chaque point <= 10 % (pourcentage résiduel selon la formule ci-dessous)
par rapport au modèle.
100×−
théorique Valeur
estimée Valeurthéorique Valeur
Les résultats de validation sont tous calculés à partir de régressions linéaires au sens des moindres carrés
(intégration sur la hauteur) respectant les 3 critères énoncés ci-dessus.
3. La sélectivité et la spécificité
3.1. La spécificité
La spécificité est démontrée par l’absence de pics aux temps de rétention des analytes dans les échantillons blancs donc non fortifiés pour chaque matrice dans chaque séquence d’analyses de la validation. Pour tout pic <LOD, la valeur du blanc est retranchée de son dopé.
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3.2. La sélectivité.
La détection en UV étant non sélective (dans le cas de l’histamine, pas de critère DAD probants), un contrôle (DBG) à été ajouté afin de garantir une « sélectivité » sur base du temps de rétention relatif de l’histamine par rapport à ce DBG. Il faut observer dans le chromatogramme 2 pics correspondants au pic de l’histamine et un standard de référence chromatographique (DBG) entre 5 et 15 minutes ; les temps de rétentions absolus de l’histamine et du DBG peuvent varier en fonction de la vie de colonne et de petites différences de compositions dans le tampon d’élution mais la différence des temps de rétentions relatifs de 2 injections (entre l’échantillon et la vérification la plus proche) d’histamine (par rapport au DBG) ne devra pas excéder 5 % selon la formule :
%5100_
_
1
1 ≤×−RtRt
RtRt
vérifDBG
vérifhista
DBG
hista
Tous les chromatogrammes de la validation respectent le critère de la formule ci-dessus. A noter également, que dans le cas de la vérification de la justesse (sur échantillons Fapas, cf ci-dessous), ces mêmes échantillons, en plus du caractère quantitatif, ont tous été confirmés qualitativement en ELISA (MET-LFSAL-025) en contrôle 3ième ligne (cf § 4)..
4. La justesse
Pour avoir une idee de la justesse de la méthode, 3 échantillons Fapas répétés 8 fois dans des conditions de répétabilité. Ces échantillons ont été séléctionnés pour parcourir au maximum la gamme d’étalonnage. A vu des résultat ci-dessous, l’écart maximum entre la valeur estimée et la valeur vraie est de maximum 3.8 % ce qui est grandement acceptable et en tout cas prouve que la méthode HPLC est plus juste que la méthode Elisa..
A) Valeur cible (check vwa 418) : 123 ppm résultat corrigé sur le rendement : 120.2 ppm (Elisa : 106.2 ppm). Technicien : Y. Bouamar
Justesse (différence relative) : 100*(123-120.16)/123 = 2.3 %
Pesée Résultat en ppm Result. Corr. Rend BlancMatrice2-1 1 5,0039 2,41
DopéMatrice2-100ppm 2 5,0116 102,053 102,90 CHECK 09050085-1 3 5,0195 124,01 120,51
09050085-2 4 5,0412 124,01 120,52 09050085-3 5 5,0115 123,01 119,54 09050085-4 6 5,0244 124,36 120,85 09050085-5 7 5,0332 125,27 121,74 09050085-6 8 5,0125 123,10 119,63 09050085-7 9 5,0139 123,04 119,57 09050085-8 10 5,0203 122,36 118,91
123,64 120,16
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B) Valeur cible (fapas 2757) : 226 ppm résultat corrigé sur le rendement : 234.5 ppm (Elisa : 244.8 ppm). Technicien : keyart Luc
Justesse (différence relative) : 100*(226-234.5)/226 = 3.8 %
Pesée Résultat en ppm Result. Corr. Rend BlancMatrice2-1 1 5,0071 0,00
DopéMatrice2-200ppm 2 5,0177 199,39 100,05 FAPAS 09270677-1 3 5,0371 230,60 230,48 FAPAS 09270677-2 4 5,0143 228,77 228,66 FAPAS 09270677-3 5 5,0134 229,78 229,66 FAPAS 09270677-4 6 5,033 241,96 241,84 FAPAS 09270677-5 7 5,0048 236,96 236,84 FAPAS 09270677-6 8 5,0136 241,27 241,15 FAPAS 09270677-7 9 5,016 235,22 235,10 FAPAS 09270677-8 10 5,0249 232,43 232,31
234,62 234,50
C) Valeur cible (fapas 2760) : 342 ppm résultat corrigé sur le rendement : 341.87 ppm (Elisa : 360
ppm). Technicien : Bouamar Y.
Justesse (différence relative): 100*(342-341.87)/342 = 0.04 %
Pesée Résultat en ppm Result. Corr. Rend BlancMatrice2-1 1 5,0071 0,00
DopéMatrice2-200ppm 2 5,0177 199,39 100,05 FAPAS 09221484-1 3 5,0197 340,27 340,09 FAPAS 09221484-2 4 5,035 343,68 343,51 FAPAS 09221484-3 5 5,0386 342,80 342,63 FAPAS 09221484-4 6 5,0144 341,47 341,30 FAPAS 09221484-5 7 5,0344 342,61 342,44 FAPAS 09221484-6 8 5,0473 343,89 343,72 FAPAS 09221484-7 9 5,0355 341,77 341,59 FAPAS 09221484-8 10 5,0074 339,83 339,66
342,04 341,87
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5. Répétabilité et reproductibilité intralaboratoire.
5.1 Validation principale (thons, maquereaux, sardine à l’huile). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration
du dopage (ppm)
Répétabilité r (2.8XSr) ppm
Reproductibilité R (2.8XSr) ppm
CVr (%) n=12
CVr max 2/3 CVHorwitz
CVR (%) n=12
CVR max CVHorwitz
Histamine
50 2.70 5.08 1.86 5.92 3.50 8.88 100 3.00 12.98 1.07 5.33 4.64 7.99 200 16.19 17.47 2.88 4.80 3.11 7.21 400 28.21 28.21 2.56 4.32 2.56 6.49
Toutes les RSD de répétabilité et de reproductibilité intra-laboratoire (respectivement < 3 et 5 %) satisfont à l’équation de Horwitz.
5.2 Validation secondaire sur répétabilité (thons, maquereaux, sardine au naturel). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration
du dopage (ppm)
Répétabilité r (2.8XSr) ppm
CVr (%) n=4
CVr max 2/3 CVHorwitz
Histamine
50 1.13 0.82 5.92 100 2.43 0.89 5.33 200 7.29 1.30 4.80 400 12.76 1.14 4.32
Toutes les RSDr (respectivement < 1.30) satisfont à l’équation de Horwitz.
5.3 Validation secondaire sur répétabilité (anchois saumurés). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration
du dopage (ppm)
Répétabilité r (2.8XSr) ppm
CVr (%) n=4
CVr max 2/3 CVHorwitz
Histamine
50 2.25 1.71 5.92 100 2.72 1.10 5.33 200 10.44 2.07 4.80 400 1.85 0.17 4.32
Toutes les RSDr (respectivement < 1.71) satisfont à l’équation de Horwitz. Pour chaque concentration, les matrices de la validation secondaire présentent des RSDr inférieures ou égales à celles de la validation principale. Il est dès lors de moindre importance d’investiguer la reproductibilité sur ces matrices secondaires. Les critères de répétabilité et de reproductilité de la validation principale leur seront aplliqués
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6. Exactitude (rendement de l’extraction)
6.1 Validation principale (thons, maquereaux, sardine à l’huile). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert
Concentration du dopage (ppm), n=12
Concentration calculée en ppm
Rendement (%)
Histamine
49.78 51.73 103.9 99.45 99.94 100.5 199.32 200.80 100.7 398.74 393.98 98.8
6.2 Validation secondaire sur répétabilité (thons, maquereaux, sardine au naturel). Techniciens :
Y.Bouamar ; Cl. Haudestaine ; L. Keyaert Concentration
du dopage (ppm), n=4
Concentration calculée en ppm
Rendement (%)
Histamine
49.78 49.62 99.7 99.62 97.58 98.0 199.44 200.81 100.7 397.26 399.00 100.4
6.3 Validation secondaire sur répétabilité (anchois saumurés). Techniciens : Y.Bouamar ; Cl.
Haudestaine ; L. Keyaert Concentration
du dopage (ppm), n=4
Concentration calculée en ppm
Rendement (%)
Histamine
49.75 47.12 94.7 99.72 87.81 88.1 199.17 179.85 90.3 396.60 382.38 96.4 498.71 477.09 95.7
En routine, les résultats sont rendus corrigés sur le rendement de l’échantillon de contrôle Fapas (par rapport à sa valeur de référence soit +/- 20 %) ou à défaut d’un Blanc dopé à 100 ppm.
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7. Modélisation de l’incertitude de mesure relative (k=2)
L’incertitude est calculée pour des résultats corrigés sur le rendement selon le template xls 2014/871/LAB en vigueur à l’afsca U= 15,1 % relatif La gamme d’intérêt (selon les normes) varie de 100 à 400 ppm. L’incertitude est calculée sur les PT réalisés de 2009 à fin 2014 pour des z-scores compris entre +/- 2.
8. Limite de détection et de quantification
Dans la matrice la plus difficile d’un point de vue rendement d’extraction (anchois saumurés), le rapport S/B multiplié par 5 correspond à une teneur d’environ 25-30 ppm. Les pics sont parfaitement détectables à cette teneur mais une chute significative des rendements est constaté. Ci dessous les résultats pour un dopage à 30 ppm sur des anchois saumurés et à 25 ppm sur du thon, maquereaux et sardines à l’huile ; dans cette matrice, à 25 ppm, les rendements restent dans la moyenne de la validation (proche de 100 %). Comme les matrices, en routine, peuvent-être variables et que nous faisons une correction sur le rendement, nous prenons une sécurité et fixons la LOD à 25 ppm (environ 5*S/B) et la LOQ à 50 ppm (la teneur la plus basse inclue dans notre validation). Ces valeurs restent confortables étant donné que la norme la plus basse est à 100 ppm et que nous acceptons une variation de 20 % sur les rendements d’extractions
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Techniciens : Bouamar Y, Haudestaine Cl.
9. Stabilité/robustesse.
La présente validation et méthode repose sur la publication suivante : Validation and comparison of analytical methods for the determination of histamine in tuna fish samples, A.L. Cinquina, F. Longo, A. Cali, L. De Santis, R Baccelliere, R. Cozzani; Journal of Chromatography A, 1032 (2004), 79-85. Dans cette publication repose une étude de robustesse ayant conduit au choix des paramètres utilisés en routine. 10. Annexe
thon, maquereaux, sardines à l'huile
Colonne1 Colonne2 Colonne3 Colonne4 Colonne5 Colonne6Pesée Résultat en ppm Valeur cible fct pesée Rendement %
BlancMatrice2-1 1 5,0039 2,41 2,182DopéMatrice2-25ppm-1 3 5,0017 24,65 24,99 98,62DopéMatrice2-25ppm-2 4 5,0214 25,37 24,89 101,91DopéMatrice2-25ppm-3 5 5,0173 25,26 24,91 101,39DopéMatrice2-25ppm-4 6 5,0019 25,65 24,99 102,65DopéMatrice2-25ppm-5 7 5,0092 24,69 24,95 98,94DopéMatrice2-25ppm-6 8 5,0214 24,69 24,89 99,19DopéMatrice2-25ppm-7 9 5,0169 24,40 24,92 97,94DopéMatrice2-25ppm-8 10 5,009 25,41 24,96 101,82
Anchois saumurés
Colonne1 Colonne2 Colonne3 Colonne4 Colonne5 Colonne6 Colonne62Pesée Résultat en ppm Valeur cible fct pesée Valeur sans blanc Rendement %
BlancMatrice4-1 1 5,0039 7,91 DopéMatrice4-30ppm-1 3 5,0017 29,23 29,99 21,32 71,08DopéMatrice4-30ppm-2 4 5,0214 28,88 29,87 20,97 70,21DopéMatrice4-30ppm-3 5 5,0173 28,72 29,90 20,81 69,61DopéMatrice4-30ppm-4 6 5,0019 29,49 29,99 21,58 71,97DopéMatrice4-30ppm-5 7 5,0092 28,80 29,94 20,89 69,76DopéMatrice4-30ppm-6 8 5,0214 29,38 29,87 21,47 71,89
MET-LFSAL 025B Annexe photos
AFSCA-LFSAL
Préparation de la phase mobile (MeoH:tampon phosphate + ion pairé)
Préparation de la séquence HPLC
Exemple de séquence HPLC
Préparation des points d’étalonnage à partir de la solution mère
Scellage des bouchons
Vortexer
Mise en vial des points d’étalonnage
Numérotation des vials
Préparation des échantillons
Mixer
Pesée
Ajout d’HClO4
Vortexer
Centrifuger à 4°C
Récupération du surnageant (répéter l’extraction 3X)
Ajout de DBG dans chaque échantillon
Mise au trait
Filtration sur PTFE et mise en vial
Mise des vials dans l’autosampler
Séparation chromatographique (DBG & histamine)
DGB HISTA
Echantillon conforme (pic de DBG et absence d’histamine)
DBG