Z. Lebensmittel-Untersuch. u. -Forsch., Band 145, Heft 5, 1971

Verhalten yon Aminosiiuren und Amiden bei der Bestimmung yon Ammoniak in Lebensmitteln

H. TI~_L~R und W. STI I I~*

Mittellung aus dem Institnt fiir Lebensmittelchemie der Technisehen Universit~?~ Braunschweig und dem Analytischen Laboraterinm der H. Bahlsens Keksfabrik KG, Hannover (BRD)

Eingegangen am 26. August 1970

Behav iou r of Amlno-Acids and Amides dur ing De te rmina t ion of A m m o n i a in F o o d s

Summary. 1. The best known 19 amino-acids present in wheat protein were separately tested by the alkaline steam-distillation method. I t was found that only Cystein and Cystin released ammonia. ~[he other 17 amino-acids can resist these extreme conditions. Most of them were only contaminated more or less by ammonia compounds.

2. Under the same conditions - - except in the presence of very little alkali - - from glutamine o about 7 ~ ammonia was released and when the duration of distillation was prolonged three

times 9,6% ammonia had been released. This percentage represents the entire nitrogen of the amide-group of glutamine.

3. Three methods, known to liberate ammonia were tested with glutamine, in order to find out the difference in their effectiveness. After testing all three methods, much less ammonia was released than by using the steam-distillation-method. Thereby, a newly developed method of micro- vaeuum-destillation for liberation of ammonia proved to be the most mild procedure, even milder than the Isothermal Diffusion Unit method of Lips-Conway.

Zusarnmen]assung. 1. Die im Weizeneiweifl vorkommenden bekanntesten 19 Aminosauren wnrden einzeln der alkalischen Wasserdampf-Destillation unterworfen. Dabei spalteten nut Cystein und Cystin nachweislich Ammoniak ab. Alle fibrigen 17 Aminosauren kSnnen diesen aggressiven Bedingungen widerstehen. Die meisten yon ihnen waren lediglich mehr oder weniger geringffigig mit Ammonlumsalzen verunreinig~.

2. Unter den gleichen ]~edingungen - - und zwar schon bei schw~chster Alkalitat - - warden yon Glutamin etwa 7% und bei dreifach verlangerter Destillationsdauer 9,6% Ammoniak-Stiek- stoff abgespalten. Dieser Anteil entspricht der Gesamtmenge des Amidstickstoffes yon Glutamin.

3. Um ihre unterschiedliche Aggressivitat zu testen, wurden drei andere zur Isolierung yon Ammoniak vorgesehene Veffahren an Glutamin ausprobierk Nach allen 3 Methoden wurde um mindestens 1--2 Zehnerpotenzen weniger Ammonlak als bei der Wasserdampf-Destillation ab- gespalten. Dabei erwies sich nicht das Isotherm-Veffahren (in Lips-Conway-Schalen), sondem eine neu entwiekelte Mikro-Vaknum-Destillation als die bisher schonendste Methode zur Frei- setzung yon Ammonlak.

Einle i tung

Be im Aus t r e iben yon pr/~formiertem A m m o n i a k aus Subs tanzgemisehen mi t emp- f indl iehen organisehen St ieks tof fverb indungen h a t m a n sieh in den versehiedenen b iochemisehen Bereiehen schon seit J a h r z e h n t e n bemi ih t , durch m6gl ichs t sehonende I so l i e rungsmethoden eine Abspa l t ung yon A m m o n i a k aus Eiwei$ und dgl. zu ver- me iden oder wenigs~ens auf ein Mindestmal3 zu beschranken. Man se tz te A m m o n i a k frei en tweder durch Destf l la t ion un te r Verminderung von Druck und Siedetempe- r a t u r e n oder mi t t e l s langfr is t iger Durehl i i f tung [1] oder mi t den Methoden der Iso- thermdif fus ion [2]. Dabe i werden zur , , schonenden" Alkal is ierung en tweder L6sungen bzw. Aufsehwemmungen yon Pot tasche , Ba r iumhydrox id , N a t r i u m e a r b o n a t , Li- t h i u m c a r b o n a t , Cale iumoxid oder Magnes iumoxid verwendet , d . h . Alkal is ierungs- mi t t e l m i t sehr unterschiedl iehen und z. T. auch rech t hohen p H - W e r t e n . Ledigl ich in der lebensmi t te lchemischen Prax i s h a t sich bis heute noch die einfache Wasser - dampf -Des t i l l a t ion bei Norma ld ruck un te r Verwendung yon Magnes iumoxid als fibliche Methode zum Aus t re iben yon A m m o n i a k e rha l ten [3].

* Auszug aus der Dissertation W. Sturm: Zur Bestimmung yon Ammoniak in Getreidemehlen und Backwaren. Technische Universit•t Braunschweig 1967. 19 Z. Lebensmitt.-Untersuch., Band 145

264 H. Thaler und W. Sturm:

Bei den in der Vergangenheit an Lebensmitteln durehgefiihrten Ammoniakbestimmungen, wie z. B. an Fleischbriihwiirfeln, Wiirzen u. ~. Erzeugnissen, an Fischen oder an (mit Ammonium- salzen) alkalisierten Kakaopulvern ging es um relativ hohe Ammoniumgehalte, wobei das durch die analytische Arbeitsweise aus organischen Verbindungen abgespaltene Ammoniak mengen- m~l~ig keine Rolle zu spielen sehien, jedenfalls kaum Anlal~ zu grunds~tzlichen Fehlschlfissen geben konnte. Nach Wirksamwerden der ,,Verordnung fiber die Zulassung ffemder Stoffe als Zusatz zu Lebensmitteln" und der ,,Verordnung fiber Essenzen und Grundstoffe" vom 19. 12. 1959 wurden jedoeh wegen der eingeschr~nkten Verwendung yon Hirschhornsalz f fir ,,trockenes Flach- geb~ck" auch auf dem Baekwarensektor und wegen des begrenzten Zusatzes yon Ammoninm- chlorid zu Lakritzwaren Ammoniakbestimmungen erforderlieh. Bei entspreehenden Unter- suehungen wurden mit der Wasserdampf-Destillation aueh an nieht mit ammoninmsalzhaltigen Triebmitteln hergestellten Dauerbaekwaren sowie an vielen B~ekerei-Rohstoffen z.T. recht beaehtliche Ammoniakausbeuten ermittelt [4], die zur Annahme yon ,,Blindwerten" in einer Grfl3enordnung yon etwa 200 mg Ammoniak im kg Ware fiihrten [5, 6]. Bei systematiseher ~berpriifung aller Bedingungen der Wasserdampf-Destillation unter Normaldruck wurde fest- gestellt, dab selbst bei der ffir eine quantitative Freisetzung yon Ammoniak ausreiehenden schwaehen AlkalR~t yon pH 7,4 proteinhaltige Lebensmittel schon zus~tzliehes Ammoniak ab- spalten. Diese Abspaltungen sind im wesentliehen auf den EinfluB der Kochtemperatur zurfick- zufiihren und h'dngen nieht nur yon der Art der Substanz und der Alkalit~t der L6sung, sondern aueh yon der Beheizungsintensiti~t und der Destillationsdauer ab.

D a Ver~nderungen i m Verh~l tnis y o n E inwaagemenge zu Alka l i s ie rungsmi t te l fiber Alka l i t~ t sve rseh iebungen jeweils untersehiedl iche A m m o n i a k a u s b e u t e n liefern, k a n n dieses Veffahren aueh u n t e r fes tgelegten Bedingungen ffir A m m o n i a k b e s t i m - m u n g e n in Subs tanzgemisehen m i t zersetzl ichen St ieks tof fverb indungen n ieh t mehr ane rkann t , sondern mul3te ffir diesen Verwendungszweck endgfi l t ig abge lehn t wer- den [3]. T r o t z d e m in teress ier te die grundsi~tzliehe Frage , welehe organisehen St ick- s tof f -Verbindungen be i den Abspa l tungse r sehe inungen als A m m o n i a k - L i e f e r a n t an- zusehen sind.

1. Anwendung der Wasserdampf-Des t i l l a t ion auf kminos~iuren

U m zu i iberprfifen, ob einzelne EiweiBbauste ine bevorzug t A m m o n i a k abgeben, wurden die b e k a n n t e s t e n Aminos~uren den bisher fiblichen, naehfolgend besehriebe- n e n Des t i l l a t ions -Bedingungen unterworfen .

1 g reine Aminos~ure in 100 ml Wasser mit 1,5 g MgO (pH 10,5) unter Einleiten yon Wasser- dampf 40 rain destfllieren; Vorlage: ges~ttigte Bors~urelfsung; Ammoniak-Bestimmung: acidi- metrisehe Titration des gesamten Destillates [7].

Die sehr empfindiiche photometrische Mikro-Bestimmung mit Phenolat-Hypochlorit [8] und der dabei m6gliehe Einsatz wesentlieh geringerer Einwaagemengen der z. T. teuren Aminos~uren war bei den in Rede stehenden Untersuehungen wegen der (zwangsl~ufig) zu grol3en Destillat- mengen nieht durehfiihrbar.

mg/kg 3353 3512

Z

"l--

z 1057 s181

203 I I 74 90 11562j 298

0 0 011 164168 80 91 - , , • I 1 • . . . . . . . . i . i l m l l l

e ~~.~-Z: ~ =-~ = ~ ~ ~ < ~ ~ - ~ n n t - : > ' r ' l - ~...9 ' ~ > ' ~ >" Verunreinigungen Abspa[tungen

Abb. 1, Ammoniak-Ausbeuten r~oh Wasserdampf-Destillation an 19 reinen Aminos~uren

Aminos~uren und Amide bei der Bes$immung yon Ammoniak 265

Die S/~ulendiagramme in Abb. 1 stellen Mittelwerte der naeh dieser Yfethode yon 19 Amlnos/iuren erhaltenen Ammoniakausbeuten dar. (Ihre wi]lkHirliche Anordnung soll nieht den Eindruek einer ,,aufsteigenden" Reihe erweeken.) Von den zuerst auf- gezeiehneten 5 Aminos/iuren abgesehen, die entweder kein oder nur spurenweise A mmoniak aufwiesen, lieferten die meisten anderen tmtersehledlieh geringe Ausbeuten yon etwa 50-300 mg/kg. Lediglich bei fl-Alanin und Serin wurden Amraoniak- ausbeuten yon etwa 800 bzw. 1050 mg/kg erzielt, und Cystein sowie Cystin fielen mit > 3000 mg/kg vSllig aus dem Rahmen.

Diese Befunde kSrmten - bei erster Betraehtung - die verbreitete Meinung fiber die leiehte Abspaltbarkeit yon Ammoniak aus Aminos/~uren ganz allgemein[9] sehein- bar bestatigen. Um diesen Saehverhalt aber endgfiltig zu kl/~ren, wurden Glyein, fl-Alanin und Serin bei versehiedenen Alkalit/~ten yon pit 7,4 bis pH 13,4 wieder- holten Destillationen ausgesetzt. Trotzdem lieferten alle 3 Aminos/~uren immer wieder Ammoniakausbeuten der gleiehen GrSgenordnung. Dabei ist die starke Alkali¢~t der ges/~ttigten K~COa-L6sung mit pH 13,4 besonders zu beaehten. AuBerdem zeigte beim gleiehen Lieferanten zu versehiedenen Zeitpunk~en gekauftes fl-Alanin ,,gleicher Qualit~t" jeweils versehiedene Ammoniakwerte (etwa 200~ 300 bzw. 800 mg/kg).

Danach widerstehen fast alle Aminosituren der alkalisehen Wasserdampf-Destflla- tion, und die untersehiedlieh geringe ,,Ammoniakabspaltung" ist auf Verunreinigtmgen mit Ammoniumsalzen yon der HersteUung der Aminos/iuren her zurfiekzuffihren.

Die Aminos/~uren Cystein und Cystin lieferten unter den gleiehen Destilla~ions- Bedingungen an Ammoniak-Stiekstoff etwa 3500 bzw. 3700 mg/kg und damit unter allen Aminos/~uren die hSehsten Ausbeuten. Um die Ursache dieser Extremwerte zu fiberprfifen, wurden die beiden Aminosi~uren verl/ingerten DestfllationszeRen ausgesetzt (Tab. 1). Cystein lieferte dureh Fraktionierung naeh je 40 rain auch

Tabelle 1. Wasserdamp]-Destillation yon zwei schwe]elhaltlgen Aminosauren bel unterschlecllicher Destillationsdauer. Alkalisierungsmittel: 100 ml Magnesiumoxid-Au/schlSmmung pH 10,5

Einwaage 1 g

Aminos~iuren

m

Cys~ein Cystin

Ammoniak-N-Ausbeute in 40 min Summe Fraktionen na~h 40 rain 80 rain 120 min mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg

3531 3670 3313 10514 3784 2932 2812 9529

jeweils fast gleiehgroSe Mengen an Ammoniak-Stiekstoff zwisehen etw~ 3300 und 3700 mg/kg und Cystin in der 1. Fraktion etwa 3700 mg/kg, in der 2. und 3. Frak- tion etwa 2900 bzw. 2800 mg/kg. Somit halten diese beiden Aminosiiuren den Bedin- gmagen einer alkalisehen Wasserdampf-Destfllation nicht stand, sondern spalten dabei laufend Ammoniak ab. Beim Vergleieh der aus Weizenmehl bzw. -eiweil~ erzielbaren Ammoniak-Ausbeute [10] mit der aus einem entspreehenden Cystin-Antefl errechen- baren ergibt sieh abet, dab fin WeizenmeM Cystin nieht als wesentlieher Ammoniak- IAeferant in Frage kommen kann [7].

2. Anwendung vier versehiedener Methoden der Ammoniak-Isolierung auf Glutamin

W asserdam p/- Destillation Da im Weizenkleber die Glutamins/~ure zusammen mit ihrem ttalbamid, dem

Glutamin, den Itauptbestandtefl darstellt, lag es nahe, aueh das Amid auf seine Ab- spaltbarkeit yon Ammoniak bin zu untersuehen. Glutamin wurde den gleiehen, oben I 9 "

266 H. Thaler und W. S~urm:

beschriebenen Bedingungen der Wasserdampf-Destfllation unterwoffen und lieferte naeh 40 rain 4 g Ammoniak-Stickstoff/100 g Glutamin (4% !). Bei Verwendung yon Ba(OH)2-L6sung (pH 12,5) oder Phosphat-Puffer-L6sung (pH 7,4) anstelle yon NIgO wo_rden trotz dieser unterschiedlichen Alkalit~ten iihnliche Mittelwerte yon sogar 7,4 bzw. 7,2 % Ammoniak-Stickstoff erzielt. Zur Best~tigung, dal] diese aul3ergewShn- lieh hohen Ammoniak-Ausbeuten fast unabh~ngig yore Alkaliti~tsgrad sind, also offenbar durch die aggressiven Bedingungen der Koehtemperaturen sehon bei der Mindestalkalit~t yon pH 7,4 entstehen, wurde Gluts,mlu in diesem fast neutralen Milieu einer dreifach verl~ngerten Destfllationsdauer yon 120 min ausgesetzt. Dabei warden nach den ersten 40 rain schon fast 8% Ammoniak-Stickstoff erhalten, die sich bis zum Ende der Destfllation auf insgesamt 9,6% erhShten (Tab. 2a). Bei wei- terer Verl~ngerung der Destillationsdauer effolgte keine weitere Ammoniak-Abspal- tung. Glutamin enth~lt n~mlich 9,6 % Amid-Stiekstoff, der unter den besehriebenen Bedingungen demnaeh quantitativ abspal~bar ist.

Zum Vergleich an Asparagin durchgeffihrte Versuche lieferten auch nach mehr- fach verli~ngerter Destillationsdauer nur Ammoniak-Ausbeuten yon etwa 0,5 % Stiek- stoff, bezogen auf seinen Amid-Stickstoff entsprechend 4,7 %.

Naehdem sich Glutamin mater dem Einflul3 der alkalischen Wasserdampf- Destillation somit als aul3erordentlich labfl erwiesen hatte, lag die ffir die vergleichende Beurteflung der Methoden wiehtige Frage nahe, um wieviel niedriger die Ammoniak- Ausbeuten bei Anwendung yon Veffahren der Vakuum-Destfllation und der Iso- therm-Diffusion ausfallen wfirden. So hatte Glutamin, nachdem es bei der Wasser- dampf-Destfllation als einer der wesentliehen ,,Ammoniak-Lieferanten" erkannt war, in den folgenden Versuehsreihen als Testsubstanz zu dienen: Erst diejenige yon drei zur Diskussion stehenden Ammoniak-Isolierungsmethoden, die bei Glutamin die geringste Ammoniak-Anspaltung verursacht, kann als das mildeste Verfahren be- zeichnet werden.

Makro- Vakuum-DestiUation

In einer Vakuumapparatur mit modifizierter Destilliervorlage wurden die f/Jr ein sehonendes Verfahren optimalen Destfllationsbedingungen zur quantitativen Frei- setzung geringer Ammoniakmengen ermittelt, wobei sich z. B. die Notwendigkei~ einer Alkalisierung auf mindestens pH 9 ergab. Die Methode lieferte aber bei protein- haltigen Lebensmitteln ebenfalls - wenn auch nur in geringem Mal3e - Ammoniak- abspaltungen, deren Ausmal~ yon den gleichen Faktoren abh~ng~, wie sie oben fiir die Wasserdampf-Destfllation besehrieben wurden. Diese Vakuumdestillation im MakromaBstab ist somit bei Ammoniakbestimmungen in Substanzgemisehen mi~ empfindliehen organischen Stickstoffverbindungen der Wasserdampf-Destillation bei Normaldruck zwar fiberlegen, sie kaun jedoch ebenfalls noeh nich~ als zuverl~ssige Ylethode empfohlen werden [11].

In dieser Vakuumapparatur je 1 g Glutamin nach Vermischen mi~ tMffer-LSsung yon pH 9,2 einer Destilla~icn yon 20 lnin unterwerfen; in die ¥orlage (ges. ]3ors~ure-L6sung und Misch- indil~a¢or n. ~orti~rer) dureh verl~ngertes I~fihlerrohr mit angeschnmlzener G 1-Fritte quanti- tative Absorption ; Peheizung durch Einstellen in ein auf 70 ° C teml0eriertes Wasserbad, Siedetem- 10eratur nach ]~val~uieren (etwa 10 Torr) zwischen 35--40 ° C. Messung des fibergegangenen Ammo- niaks mi~telsacidimetrischer Titration.

Mi~ dieser Methode wurden bei Glutamin im Mittel etwa 0,045% Ammoniak- Stickstoff gefunden (Tab. 2b). Somit liegt diese Ausbeute im Vergleich zu der bei der Wasserdampf-Destillation erzielten zwar um zwei Zehnerpotenzen niedriger, stellt aber noch immer eine etwas zu hohe und nicht befriedigend reproduzierbare Ammo- niak-Abspaltung dar.

Aminos~uren und Amide bei der Bestimmung yon Ammoniak 267

Mil~ro-Di~uslon in Lilos-Conway-Schalen Unter versehiedenartigen Gef~Ben ffir die Isothermdiffusion erwies sich am zweck-

mi~l~igsten die mit Schlifffl~chen und unterteflter AuBenrille versehene Lips-Conway- Schale, mi t der die optimalen Bedingtmgen fiir eine quanti tat ive Freisetzung geringer Ammoniakmengen ermittelt wurden. Die bei einer Temperatur yon 37 ° C und einer Mindestalkaliti~t yon p H 11 notwendigen Diffusionszeiten yon 24 Std waren wesent- lich liinger als die im Schrifttum allgemein ffir Conway-Schalen angegebenen. Bei Anwendung au/Suspensionen wurde eine Behinderung der Ammoniakfreisetzung un4 bei Mehl eine durch Alkalieinwirkung verursachte Ammoniakabspal tung festgestellt. Fiir Ammoniakbest immungen in echten LSsungen ist das beschriebene Mil~rodiffu- sionsveffahren gut brauchbar, abet flit Substanzgemische mit empfindlichen organi- schen Stickstoffverbindungen kann diese l~ethode - ebenso wie die zwei vorher be- schriebenen - nicht als zuverl~ssig empfohlen werden.

Auch diesen an anderer Stelle bereits genauer beschriebenen Bedingungen einer Isothermdiifusion in Lips-Conway-Schalen (1 g in etwa 10 ml PufferlSsung, pH 11,0, im W~rmeschrank bei 37 ° C 24 Std) [12], warden nun die Glutaminproben ausgesetzt. Das dabei in eine 0,01 n-H~SO 4 diffundierte Ammoniak konnte nach l~berspiilen uncl Auffiillen photometrisch gemessen werden [8]. Die Ausbeuten liegen mit etwa 0,73 % iiberraschenderweise ganz erheblich hSher (Tab. 2 c) als die bei dem Makro-Vakuum- Destillations-Veffahren erhaltenen Werte.

Mi/~ro. Valcuum-DestiUation im Apparat nach Burg-Moolo

Schliel31ich wurde als viertes Verfahren die Ermit t lung des aus Glutamin abspalt- baren Ammoniaks mittels der Apparatur nach Burg-Mook versucht (Abb. 2).

Aus den an anderer Stelle ausfiihrlich beschriebenen, sehr umfangreichen l~Iodellversuchen [10] mit der in Abb. 2 dargestellten Mikro-Vakuum-Apparatur ergab sich nachfolgende Ammoniak- Bestimmungsmethode [10].

PV 14

' ~ 220mm

Abb. 2. Mikro-Vakuum-Destillations-Apparatur nach Burg-Mook. a Des~illationsk61bchen, b EinsteckkSlbchen fiir AlkalisierungsmRtel, c Obergangsstiick, d VorlagerShrchen, e Absaug-

stutzen. (,,KPV" ,,Klare Pr~zisions-Verbindungen")

Besondere Gergite. Wasserbad mi¢ Thermosta~anschluB. - - Kleine Vakuum-Destillations- apparatur (KPV 14 u. 19, vgl. Abb. 2). - - Elektrofilterphotometer mit Glaskfivetten.

lCeagentien, n-Schwe~els~ure. - - Borat-Natronlauge-Puffer pH I0:12,4 g Bors~ure in 100 ml n-NaOH 15sen und auf 1 1 auffiillen; 6 Teile dieser LSsung und 4 Teile 0,1 n-NaOH: pit ~ I0. - - Sfliconfett. - - Zaponlack: 150 g Collodinmwolle E 950 in 850 g Aceton 15sen.

268 H. Thaler and W. Sturm:

Tabelle 2. Ammonlak-Isolierung au8 Glutamin mlttels verschiedener Metlwden

Alkalit~t Best. Best. temp. dauer

pH °C rain

a) Wasserdampf-Destfllation 7,4 10O 120

b) Makro -¥akuum-Destillation 9,2 37

c) Mikro-Diffusion in Lips-Conway-Schalen 12,3 37

d) Mikro-Vakuum-Destillation 10,0 26 (im Apparat nach Burg-Mook) 10,0 28

10,0 30

20

24

10 15 20

Ammoniak-N- Ausbeute %

1. 7,92 • 2. 1,44 3. 0,29

9,65

0,044

0,730

0,0105 0,0159 0,0240

= Einzelergebnisse nach jeweils 40 rain.

Arbeitsvorschri/t. Alle KP-Verbindungen der Destillationsapparatur gleichm~Big diinn mit Siliconfett bestreichen. In das VorlagerShrchen: 3 Tropfen n-H~S04, in das EinsteckkSlbchen: 4 ml PufferlSsung. Ammoniumsalzhaltige LSsung bzw. Suspension (z. B. entsprechend 25 bis 200 Izg Stickstoff) in das DestillationskSlbchen geben, ira Bedarfsfalle mit dest. Wasser auf etwa 5 ml erg~inzen. KSlbehen und VorlagerShrchen mit dem ~bergangsstiick saint Absaugstutzen verbinden. Einsteckk51bchen muB nach unten zeigen (Abb. 2b). KP-Verbindungen drehen bis sie gleichm~l~ig durchsichtig erscheinen (Dichtigkeitstest). Mittels Spiralfederchen and dutch Einpinseln der Kanten der KP-Verbindungen mit Zaponlack zuverliissig abdichten. Apparatur mR einer Vakuumpumpe his etwa 15 Torr evakuieren, erfahrungsgem~B 3--4 rain.

Nan Hahn sehlieBen, Apparatur yon der Saugpumpe trennen, Probe durch Hochdrehen des EinsteckkSlbehens alkalisieren. Darauf das DestillationskSlbchen in ein Wasserbad yon 40 ° C, VorlagerShrchen in ein Geii~B mit Eiswasser stellen. Apparatur mittels Stativklemme so looker be- festigen, dab das DestillationskSlbchen im Wasserbad w~hrend der gesamten Destillationsdauer yon 10 bzw. 15 rain (bei LSsungen bzw. Suspensionen) leicht hin- and herbewegt werden kann.

Schliel31ich Hahn 5ffnen, DestillationskSlbchen abnehmen and hiingengebliebene Tropfen aus dem ~bcrgangsstfick in die Vorlage spiilen, dann je nach Ammoniakmenge in ein 25--250 ml- ~Iel3kSlbchen fiberspiilen und auffiillen. Aliquoter Tell (maximal 5 ml) in ein Schliffreagensglas, Bestimmung des Ammoniaks mit ~flfe der Phenolat-Hypochlorit-Methode nach Thaler u. Sturm [8].

Bei Serienversuchen wurden in einem sclbstgebauten Schiittelger~t mit l~Iotorantrieb 2--4 Destillationsapparaturen gleichzeitig bewegt; Anw{irmen bzw. Abkfihlen in zwei parallel ein- gebauten Wasserb~idern.

Den sehonenden Bedingungen dieser Mihro-Vakuum-Desti l lat ion warden nun Glutaminproben unterwoffen (Tab. 2 d).

Mit diesem Veffahren erhielt m a n nur noch sehr geringe _Ammoniakmengen: Bei gleichbleibender Alkalit~t von p H 10,0 wurden bei steigenden Destillationszeiten yon 1 0 - 2 0 min e twa 0 ,01-0 ,02 % (bzw. 1 0 0 - 2 0 0 mg/kg) Ammoniak-St ickstoff er- mittel t . Diese Wer te stiegen zwar mi t der Destil lationsdauer auch langsam an, sincl aber t ro tzdem die niedrigsten, die bei den vier im R a h m e n dieser Untersuehungen verglichenen Ammoniak-Isol ierungsmethoden erziel~ wurden. Diese sehr geringen Ausbeuten best/itigen damit , dab diese 1Y[ikro-Vakuum-Destfllation das bisher schonendste Veffahren zur Freisetzung yon Ammoniak neben empfmdlichen Stick- stoff-Verbindungen darstellt.

Disknssion der ]~rgebnisse Das Ergebnis umfangreicher Versuehe an 19 Aminos/~uren, yon denen lediglieh

zwei (Cystein und Cystin) bei der alkalischen Wasserdampf-Destf l lat ion Ainmoniak

Amlnosiuren und Amide bei der Bestimmung yon Ammoniak 269

abspalteten, die weitaus meisten jedoch nur Ammoniak-Verunreinigungen aufwiesen, widerlegt den anscheinend weir verbreiteten Irrtum, dab ,Aminos~uren sehleehthin unter den genannten Bedingungen bereits eine begirmende Hydrolyse effahren. Darfiber hinaus beweisen die Destillations-Ergebnisse von Glyein,/~-Alanin und Serin in Gegenwart versehiedener Alkalisiertmgsmittel, insbesondere gesittigter K~CO 3- LSsung, die erhebliehe Widerstandsf~higkeit der Aminos~uren gegenfiber holier Alkalit~t bei einer Temperatur yon 100 ° C. Die an 14 Aminos~uren ermittelten unter- sehiedlieh geringen Ammoniak-Mengen warden demnaeh aus Ammoniumsalzen frei- gesetzt, die als Verunreinigungen anzusehen und offensiehtlieh Rfiekst~nde yon der synthetisehen Herstellung dieser Verbindungen sind.

Naeh Wieland kSnnen Aminosiuren im allgemeinen erst nach vielst/indigem Erhitzen, z. B. mit heiBges/~ttigter Bariumhydroxyd-LSsung im gesehmolzenen RShr- chen bei 110 ° C Umwandlungen erfahren und dabei Ammoniak abspalten [13]. Auch seine Effahrungen hinsiehtlieh der hier ebenfalls untersuehten zwei sehwefelhaltigen labileren Amlnos~uren [13] wurden grunds~tzlieh best~tig%

Die Frage, ob bei der Wasserdampf-Destillation yon Mehl bzw. yon Backwaren das im GetreideeiweiB (z. B. im WeizeneiweiB zu etwa 1,5%) enthaltene Cystin als ,,Ammoniak-Lieferant" in Betraeht zu ziehen sei, muB jedoeh unter Ber/ieksiehti- gung der sehr geringen Anteile verneint werden.

Im Gegensatz zu den weitaus meisten Aminos/~uren erwies sieh jedoch Glutamin als auBerordentlieh labil. Berficksichtig$ man die Stabflit~t der Glutamins~ure, so kann die beim Glutamin sehon bei pH 7,4 fes~gestellte leiehte Abspaltbarkeit yon Ammordak nur auf den Amid-Stickstoff zurfickgeftihrt werden. Bezieht man n~mlieh den nach verl~ngerter Destillationsdauer yon 120 min insgesamt ermittelten Ammo- niak-Wert yon 9,6 % nur auf den Anteil dieses Amid-Stiekstoffes, so ergibt sieh eine 100 %ige Ausbeute. Die Abspaltung der S~ureamid-Gruppe beginnt bereits unter den sehr milden Bedingungen der Mikro-Vakuum-Methode, steigert sieh bei dem Makro- Verfahren sehr langsam, bei dem der langzeitigen Isotherm-Diffusion jedoeh sehon deutlieh und finder bei der Wasserdampf-Destillation in der quantitativen Abspal- tung des gesamten Amid-Stickstoffes ihren HShepunk~. Die leiehte Freisetzung yon Ammoniak aus Glutamin wird sogar bei der Bestimmung des letzteren in Zueker- r/ibens/~ften [14] ausgenutzt.

Damit hat sieh nun freies G]utamln als ein erstrangiger ,,Ammoniak-Lieferant" erwiesen. Die Frage, inwieweit man diese am freien Halbamid festgestellte Eigen- sehaft auch auf das im Peptidverband eingebaute Glutamin fibertragen daft, w/ire noeh zu kl~ren. Im Gegensatz zu den Amlnogruppen, die durch die Peptidbindung gesehfitzt sind, ragen die Amidgruppen des Glutamins jedoeh frei aus der Protein- kette heraus nnd dfifften somit ohne Sehwierigkeiten der Abspaltung ausgesetzt sein.

Im Gegensatz zu der Ammoniak-Abspaltung aus den beiden sehwefelhaltigen _Amln_os~uren ist die aus Glutamin deshalb yon ganz besonderer Bedeutung, weft Glutamin nicht nur im GetreideeiweiB, sondern aueh in anderen Proteinen einen mengenm~Big wesentlieh grSBeren Anteil ausmaeht.

DiG aus Asparagin erzielten bedeutend geringeren Ammoniak-Ausbeuten best~ti- gen dig Sonderstellung des Glutamins. Obwohl das Asparagin im Stoffweehsel der Pflanze eine dem Glutamin im Stoffweehsel der S~ugetiere analoge Aufgabe erffillt, ist yon diesen beiden bekannt, dab sie gerade hinsichtlieh der Abspaltbarkeit ihres Amid-Stiekstoffes sehr untersehiedlich reagieren: W/ihrend Asparagin gegenfiber Erhitzen in verdfinnten S~uren widerstandsfihig ist, geht Glutamin dabei unter Ammoniak-Abspaltung in Byrrolidonearbons£ure fiber [13]. Dieser aueh im Alkali- sehen stattfmdende Reaktionsablauf hat bei der Reinigung der Zuekerr/ibens~fte groBe praktisehe Bedeutung [14].

270 H. Thaler und W. Sturm: Aminos~uren und Amide bei der Bestimmung yon Ammoniak

Die Eigenschaft des Gluts,mlns, Ammoniak leicht abzugeben, konnte bei den oben beschriebenen Vergleichs-Untersuchungen dazu ausgenutzt werden, die Aggressivit~t der verschiedenen Verfahren abzustafen bzw. das schonendste herauszufinden. Dabei ha t sich die Mikro-Vakuum-Destillation eindeutig als die weitaus am schonendsten arbeitende Methode zur Ammoniak-Isolierung erwiesen. Die auch bei Glutamin er- haltenen - wenn auch nur sehr geringen - Ammoniak.Ausbeuten zeigen durch ihr langsames Ansteigen mit der Destillationsdauer, dab sie ebenfalls durch eine Abspal- tung verursach~ werden. DaB es bei diesem Mil~ro-Vakuum-Veffahren unter den milden Bedingungen einer DestiUations-Temperatur yon etwa 25°C iiberhaupt zu einer Abspaltung kommt, is~ offenbar der ffir die Ammoniak-Isolierung erforderlichen Alkalit~t yon p H 10 zuzuschreiben.

Bei der Mikro-Methode der Isothermdiffusion dfiff~en die aus Glutamin erhaltenen verhiiltnism~Big hohen Ammoniak-Ausbeuten auf die st~rkere Alkaliti~t (pH 11 bzw. 12,5) und insbesondere au~ deren langzeitige Einwirkung zuriickzufiihren sein.

Literatur 1. Handbuch der ]andwirtseha~tliehen Versuchs- und Untersuehungsme~hodik (~ethodenbueh).

2. Aufl.; hrsg. v. R. Herrmann. Bd. III , S. 54. Radebeul-Berlin: Neumann 1951. 2. Conway, E. J.: Microdiffusion analysis and volumetric error. 5. Aufl., S. 8--15. London:

Crosby Lockwood and Son 1962. 3. Thaler, H., Sturm, W.: Z. Anal. Chem. 244, 379 (1969). 4. Sturm, W., Hanssen, E.: Deut. Lebensm.-Rundschau 58, 165 (1962). --Werner, R.: ]Kit-

teilungsbl. GDCh., Faehgr. Lebensmittelehem. 17, 147 (1963). 5. Hanssen, E., Sturm, W., Glasser, C. : Deut. Lebensm.-Rundschau 60, 180 (1964). 6. Bertling, L.: Brot Geb~ck 16, 96 (1962). 7. Zur Bestimmung vonAmmoniak in GeVreidemehlen u. Baekwaren. Dissertation vonW. Sturm

unter Leitung yon H. Thaler. Teehn. Universit~t Braunsehweig 1967. 8. Thaler~ H., Sturm, W. : Deut. Lebensm.-Rundsehau 62, 35 (1966). 9. Handbuch der Lebensmittelehemie Bd. II/2, 5. S. 168. Berlin: Springer (1967).

10. Tha]er, H., Sturm, W. : Z. Anal. Chem. 251, 30 (1970). 11. Thaler, H., Sturm, W.: Z. Anal. Chem. 246, 315 (1969). 12. Thaler, H., Sturm, W. : Z. Anal. Chem. 250, 120 (1970). 13. Wieland, Th., l~Iiiller, R., Niemann, E., Birkofer, L., SehSberl, A., Wagner, A., SSll, H.:

~Iethoden zur Herstellung und Umwandlung yon Aminos~uren und Derivaten. lYIethoden der organischen Chemie. 4. vSllig neu gestaRete Aufl., hrsg. yon E. NI~iller. Bd. 11/2, S. 436. Stuttgart: Thieme 1958.

14. Schneider, F , Reinefeld, E , Forth, H.: Zucker.Beihefte, Beilage zu Zueker 3, 102 (1959).

Prof. Dr. H. Thaler Inst. fiir Lebensmittelehemie der TU D-3300 Braunsehweig, Fasanenstra~e 3