VISOKOEFIKASNA TE^NA HROMATOGRAFIJA

20/12/2016

1

VISOKOEFIKASNA

TE^NA HROMATOGRAFIJA

Оддел V. Сепарациони методи Поглавје 25Б. Високоефикасна течна хроматографија Ског, Вест, Холер, Крауч, Аналитичка хемија

Предавање 12c, Инструментални аналитички методи (А), M. Стефова, 2016 http://hemija.pmf.ukim.edu.mk/subjects/view/212


TE^NA-CVRSTA ATSORPCIJA GAS-CVRSTA KOLONA RASPREDELBA TE^NA-TE^NA TENOK SLOJ JONSKA IZMENA GAS-TE^NA HARTIJA TE^NA-GEL

20/12/2016

2


na po~etokot: stakleni koloni so ID 10-50 mm, наполнети so cvrsti ~esti~ki obloèni so te~nost kako stacionarna faza so visina od 50-500 mm.

za “razumen” protok na mobilna faza niz ovoj tip stacionarna faza, goleminata na ~esti~kite treba da bide nad 150-200 m, no toga{ protokot na mobilnata faza treba da bide desetti delovi od mL/min.

zabrzuvawe so upotreba na zgolemen pritisok!

RE[ENIE: namaluvawe na dimenziite na ~esti~kite

do dimenzii od 5-10 m i usovr{ena instrumentacija

VISOKOEFIKASNA TE^NA HROMATOGRAFIJA

(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)


RE[ENIE: namaluvawe na dimenziite na ~esti~kite

do dimenzii od 5-10 m i usovr{ena instrumentacija

VISOKOEFIKASNA TE^NA HROMATOGRAFIJA

(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)

20/12/2016

3

TE^NA HROMATOGRAFIJA TEHNIKI

Tipovi - visokoefikasna te~na hromatografija:

raspredelitelna (particiona) ili te~no-te~na

hromatografija

atsorpciona ili te~no-cvrsta hromatografija

jonoizmenuva~ka hromatografija i

2 tipa димензионо исклу~ува~ка te~na

hromatografija (size-exclusion chromatography):

- gel-permеacija

- gel-filtracija


20/12/2016

4

TEÊN HROMATOGRAF

pumpa injektor kolona

detektor

prikaùvawe

obrabotka na

podatoci

otpad

A B C

rastvoruva~i

TEÊN HROMATOGRAF

20/12/2016

5

TEÊN HROMATOGRAF

Резервоари за мобилна фаза

– стаклени шишиња со

волумен од 1 L, дегазирање

Изократно елуирање –

константен состав на

мобилната фаза

Градиентно елуирање –

програмирано изменување

на составот на мобилната

фаза

TEÊN HROMATOGRAF

Пумпи – да ги исполнат условите:

- притисок до 400 atm (за UPLC и до 1200)

- излез на мобилна фаза без пулсови

- проток од 0,1 до 10,0 mL/min

- репродуцибилност на протокот од 0,5%

- отпорност кон корозија за разл. растворувачи

Алтернативна пумпа – цилиндрична комора со клип →

пулсирачки проток, висок излезен притисок (до 700 atm)

– најчесто користена

Висок притисок во системот – нема опасност од

експлозија, но треба да се внимава да нема истекување

– leak или испарување (пожар, околина)

20/12/2016

6

TEÊN HROMATOGRAF

Систем за внесување на примерок

- sample loop – јамка за примерок (5 – 500 L)

- autosampler – автоматско внесување на примерок

TE^NA HROMATOGRAFIJA KOLONI

napraveni od obvivka od ~elik {to ne 'r|osuva

dimenzii na analiti~kite koloni:

dolìna od 10-30 cm i vnatre{en dijametar od 4-10 mm,

dimenzii na ~esti~kite od stacionarnata faza 3, 5, 10 m

broj na teoretski podovi od 40 000-60 000 podovi/m

novi visokoefikasni mikrokoloni so:

dolìna od 3-7,5 cm i vnatre{en dijametar od 1-4,6 mm,

~esti~ki od 3 m, дури и 1,7 m,

broj na teoretski podovi do 100 000 podovi/m

komercijalno dostapni stacionarni fazi (silika gel,

hemiski vrzani stacionarni fazi, jonski razmenuva~i, gelovi)

pretkoloni (guard columns)

termostatirawe

20/12/2016

7

TE^NA HROMATOGRAFIJA DETEKTORI

DETEKTOR Granica na detekcija

Selektivnost Obem na primena

Karakteriza-cija na supst.

Primenliv so gradient

UV-VIS 0,1-1 ng ** *** * **

UV-VIS

(diode-array) 0,1-1 ng *** *** ** **

Fluorescenten 1-10 pg *** * ** **

Indeks na prekr{uvawe

0,1-1 g * ** * ne

Elektrohemiski 0,01-1 ng *** * ** *

Masen spektrometar

0,1-1 ng *** ** *** *, **


UV-детектор DAD

Електрохемиски детектор

20/12/2016

8


TANDEM TEHNIKI (HYPHENATED TECHNIQUES)

HROMATOGRAF + SPEKTROMETAR

HPLC-MS

HPLC-IR

HPLC-NMR

HPLC-AAS

MNOGU KORISNO!

NO I MNOGU SKAPO!

H00 000 $, H 1


Podelbena (particiona) hromatografija

te~no-te~na hromatografija

hromatografija so hemiski vrzana stacionarna

faza (chemically bonded-phase chromatography)

Si OH + Si R

CH3

CH3

Si O Si R

CH3

CH3

Cl + HCl

R = C18H37; C8H17; alifati~ni amini, eteri, nitrili, arom. jaglevodor.

normalno-fazna hromatografija: polarni stac. fazi (trietilen

glikol, voda) i nepolarni mobilni fazi (heksan, i-propil eter)

reverzno-fazna hromatografija: nepolarna stac. faza (jaglevo-

dorodi) i polarna mobilna faza (voda, metanol, acetonitril)

Pravilo: najdobro razdeluvawe se postignuva so stac. faza so polarnost

bliska do polarnosta na supstancite koi treba da se razdelat,

a polarnosta na mobilnata faza treba da se razlikuva.

20/12/2016

9



te~no-te~na hromatografija so hemiski

vrzana stacionarna faza (chemically

bonded-phase chromatography)

CN-врзана фаза C8-врзана фаза



типични примени

20/12/2016

10


Atsorpciona (te~no-cvrsta) hromatografija

stacionarna faza: povr{ina na polarna cvrsta supstanca

(silika gel, aluminium oksid)

mobilna faza: nepolarni organski rastvoruva~i (heksan,

dihlorometan, etil acetat) i kombinacii

komponentite od probata se "natprevaruvaat" so mobilnata

faza za mesta na povr{inata na stac. faza

zadrùvaweto e rezultat na procesi na atsorpcija

edinstvena promenliva koja vlijae na zadrùvaweto na

analitite vo kolonata e sostavot na mobilnata faza

denes se koristi glavno za razdeluvawe na relativno

nepolarni organski soedinenija nerastvorlivi vo voda

TE^NA HROMATOGRAFIJA TEHNIKI Jonorazmenuva~ka (jonska) hromatografija

Stacionarna faza jonski razmenuva~i:

jonorazmenuva~ki smoli - polimeri

- katjonski smoli: so sulfokiselinski grupi

(RSO3-H+) ili so karboksilni grupi (RCOOH);

- anjonski smoli: so bazni amino grupi i toa

kvaternarni amini [RN(CH3)3+OH-], i sekundarni

ili tercijarni amini. jonorazmenuva~ki gelovi se koristat za pogolemi molekuli

(proteini, nukleinski kiselini)

neorganskite jonorazmenuva~i (pri visoka temperatura, silno

bazna sredina, silni oksidacioni sredstva)

Mobilna faza r-r koj sodrì jon koj “se natprevaruva” so jonite

analiti za naelektriziranite grupi na povr{inata na smolata.

Detektor: konduktometar

ДВА ВИДА ЈОНСКА ХРОМАТОГРАФИЈА

20/12/2016

11


Jonska hromatografija bazirana na supresori

Детектор на спроводливост – скоро идеален детектор

Но, висока конц. на електролит потребна за елуирање на јони

аналити = пречка за детекција на јоните аналити мала

осетливост!

1975 год. елуент супресорска колона веднаш по јоноразм. колона

наполнета со друга јоноразм. смола → слабо дисоц. соед.:

− ако се делат катјони → HCl елуент и анјонска супр. колона (OH) →

врзување на H+ и OH- H2O → детекција на катјони аналити!

H+(aq) + Cl-(aq) + смола+OH-(s) → смола+Cl-(s) + H2O

− ако се делат анјони → Na2CO3 (NaHCO3) елуент и катјонска супр.

колона (H) → врзување на HCO3- во H2CO3 → детекција на анјони!

Na+(aq) + HCO3-(aq) + смола-H+(s) → смола-Na+(s) + H2CO3(aq)


Jonska hromatografija bazirana na supresori

20/12/2016

12


Jonska hromatografija na една колона

Од неодамна комерцијално достапна опрема

Основа – мали разлики во спроводливоста помеѓу јоните од

примерокот и од елуентот

Се користат јонски разменувачи со мал капацитет за да се

овозможи елуирање со електролит со ниска конц. (и со ниска

спроводливост)


Димензионо-исклучувачка хроматографија

(size-exclusion chromatography) ili gel-hromatografija

razdeluvawe na komponentite od smesa spored goleminata na

nivnite molekuli

stacionarni fazi: sostaveni od mali ~esti~ki (10 m) od

silika gel ili polimeri koi sodràt mreà od uniformni pori,

vo koi difundiraat molekulite od mobilnata faza i primerokot

me|u komponentite od primerokot i stacионарната faza

nema hemiski i fizi~ki interakcii razdeluvaweto e rezultat samo na razli~nata golemina na molekulite

gel filtracija – hidrofilni gelovi so vodni mobilni fazi

gel permeacija – hidrofobni gelovi so nepolarni organski

rastvoruva~i kako mobilni fazi

primena: odvojuvawe i opredeluvawe na soedinenija so golemi

molekuli

20/12/2016

13


Dimenziono isklu~uva~ka hromatografija


Гел филтрација на шеќери

во сокови

Гел пермеација на компоненти

од епокси смола


Hromatografija so isklu~uvawe spored goleminata


20/12/2016

14

ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЈА МЕТОДОЛОГИЈА

ПРИМЕНА

Стратегија на поставување на НРLС метод

1. Дефинирање на целите на сепарацијата:

да се потврди присуството или отсуството на поедини

компоненти во примерокот,

да се изврши калибрација на системот со употреба на

надворешен или внатрешен стандард

да се определи концентрацијата на компонентите во

примерокот преку мерење на површината (висината)

на пикот, која е пропорционална на внесеното

количество во системот.

НРLС - МЕТОДОЛОГИЈА

20/12/2016

15

Стратегија на поставување на НРLС метод

2. Добивање и проценка на информациите за

примерокот:

број на компоненти кои ќе се анализираат и концентрациска област

хемиска структура

- молекулска маса (биополимер?)

- поларност, хидрофобност; р-рливост (вода, алкохол, етер, хексан)

- киселост, базност, основни функционални групи,

- константа на дисоцијација, присуство на хромофори во молекулата

на соединението, стабилност и реактивност во растворот

потреба од екстракција или претходна обработка на примерокот

(филтрирање, течно-течна, течна-цврста, цврсто-фазна екстр.,

taloèwe, центрифугирање, дотерување на рН, јонска моќ, гел

хроматографија)

природа на матриксот од кој се врши екстракција на компонентите

цврсти примероци, течности, екстракти од растенија и ткива

кој растворувач ќе се користи и колкава е количината на

примерокот

НРLС - МЕТОДОЛОГИЈА

НРLС - METODOLOGIJA

избор на колоната и детекторот, односно дали тоа ќе

бидат: - колони за реверзно-фазна, јоноизменувачка или гел

хроматографија,

- UV/Vis, флуоресцентен детектор, детектор на индексот на

прекршување, електрохемиски детектор итн.

избор на соодветна мобилна фаза

добивање на прв хроматограм

подобрување и оптимизација на процесот на

сепарација, со цел да се види какво е раздвојувањето,

симетријата на пикот, осетливоста

валидација на методот преку определување на: прециз-

ност, точност, осетливост, специфичност и линеарност

Фази во поставувањето на НРLС методот

20/12/2016

16

НРLС-применa-биотехнологија

НРLС-применa-фармација

20/12/2016

17

НРLС-применa-контрола на храна

НРLС-применa-природни производи

Chromatograms of Extracts of Blueberries (Vaccinium corymbosum L. variety Legacy)

Monitored at a) 280 nm, b) 320 nm, c) 360 nm, and d) 520 nm for Optimal Detection of

Flavan-3-ols, Hydroxycinnamic Acid Derivatives, Flavonols and Anthocyanins

20/12/2016

18

СПОРЕДБА: НРLС-GC I dvete metodi:

efikasni, mnogu selektivni, {iroko primenlivi

potreben e mal primerok

moè da e nedestruktivna

lesno primenliva za kvantitativna analiza

Prednosti na HPLC:

moè da se primeni na neisparlivi i

termolabilni supstanci

primenliva i za neorganski joni

Prednosti na GLC:

за испарливи супстанци

ednostavna i eftina oprema

brza

lesno se povrzuva so masena spektrometrija

Documents

VISOKOEFIKASNA TE^NA HROMATOGRAFIJA