Hromatografija – kolona i tanki sloj

1. Adsorpciona hromatografija u koloni – spektrofotometrijsko odreñivanje β-karotena izdvojenog kolonskom adsorpcionom hromatografijom

-TEORETSKI PRINCIPI VEŽBE: str. 1-40 udžbenika

-PRAKTIČNI DEO: str. 45 udžbenika, uz modifikacije (modifikovana priprema kolone, upotreba rastvarača itd. – pogledati u svesci!)

-vid hromatografije: adsorpcioni

-tehnika: kolonska

2. Razdvajanje prehrambenih boja hromatografijom na tankom sloju

-TEORETSKI PRINCIPI VEŽBE : str. 1-40 udžbenika

-PRAKTIČNI DEO: sveska

-vid hromatografije: adsorpcioni

-tehnika: laminarna

Adsorpciona hromatografija u koloni

Staklena kolona

Ventil koji otvara/zatvara kolonu

U suženi deo kolone stavi se parče vate, pa kolut filter papira, da bi se zadržala stacionarna faza, a istovremeno propustila tečna, mobilna faza sa komponentama koje se razdvajaju

Sipanje stacionarne faze u kolonu, pomoću špatule

Priprema kolone

Priprema kolone

Vata

Kolut filter hartije

Al 2O3:Na2SO4:MgO = 3:2:1Adsorbens (stacionarna faza – u ovom slučaju polarna) u visini od ~ 5 cm

Od gore se stavi kolut filter hartije, pa se sve sabije staklenim štapićem

Priprema kolone

Kroz kolonu se propusti čist n-heksan , izrazito nepolarni rastvarač, da proñe kroz celu visinu kolone. Nivo n-heksana se na kraju ostavi na nekoliko mm iznad gornje površine adsorbensa. Ovim postupkom se dodatno sabija i homogenizuje adsorbens, i istiskuju se mehurići vazduha.

2-3mm

Priprema uzorka

U cilju oduzimanja vode iz biljnog materijala, maceriranje se vrši uz dodatak bezvodnog Na2SO4. Voda bi se zbog svoje polarnosti, vezivala za polarnu stacionarnu fazu, zasitila je i istiskivala komponente koje su adsorbovane.

Avan

tučak

Špatula sa praškastim bezvodnim Na2SO4

Biljni materijal odreñene mase (g), iz koga se izoluje β-karoten

Bezvodni Na 2SO4 Polarni adsorbens, stacionarna faza

za pripremu kolone

Priprema uzorka

Izgled biljnog materijala nakon maceriranja. Usled prisustva praškastog, bezvodnog Na2SO4 koji vezuje vodu, pripremljeni uzorak dobija izgled zelenog rastresitog praška

Nanošenje uzorkana vrh kolone

Pripremljeni biljni uzorak se sipa na vrh pripremljene kolone

Razvijanje (eluiranje)

Kao rastvarač (mobilna faza –nepolarna), koristi se 2%-ni aceton u n-heksanu

Hlorofili imaju polarne grupe, pa se vezuju za vrh polarnog adsorbensa (stacionarne faze). U mobilnoj nepolarnoj fazi se slabije rastvaraju od karotena, pa se ne pomeraju sa vrha kolone

β-karoten

β-karoten je nepolaran molekul, bolje se rastvara u nepolarnoj mobilnoj fazi (kreće se sa njom), a ne vezuje se za polarni adsorbens (stacionarnu fazu). Stoga se brže kreće kroz kolonu i izdvaja se u vidu narandžastog prstena

β-karoten se skuplja u normalni sud od 100 ml koji je pričvršćen za donji kraj kolone preko šlifovanog kraja i ventila. Izdvajanje β-karotena se ubrzava primenom vakuum pumpe. Kada je kompletna narandžasta frakcija dobro isprana, sav β-karoten je izdvojen u normalnom sudu. Sud se dopuni do oznake od 100 ml (sa mobilnom fazom koja je korišćena za razdvajanje)

Sav β-karoten iz poznate mase biljnog materijala sada se nalazi rastvoren u 100 ml 2%-nog acetona u n-heksanu. Ovaj ekstrakt se sipa u kivetu spektrofotometra, očita se apsorbanca (na maksimumu za β-karoten u datom rastvaraču, merenjem spektra odredi se talasna dužina maksimuma apsorpcije) i izračuna koncentracija β-karotena prema formuli

Razblaživanje ekstrakta na poznatu V

Primer zna čaja izbora rastvara ča (mobilne faze) za

razdvajanje komponenti

Korišćenjem čistog acetona kao mobilne faze, koji značajno jače rastvara hlorofile (aceton je polarniji od n-heksana), dolazi i do pomeranja hlorofila kroz kolonu – vidi se zelena zona pigmenata koji su istisnuti sa adsorbensa i kreću se sa mobilnom fazom. Da je aceton primenjen odmah, ne bi došlo do razdvajanja β-karotena, jer bi se rastvorili i hlorofili, tj. svi pigmenti bi zajedno izašli iz kolone.

Prsten hlorofila

Hlorofili izlaze iz kolone

Čist aceton

Adsorpciona hromatografija na tankom sloju

Standardne prehrambene boje (9 kom.) koje se koriste u prehrambenoj industriji za farbanje različitih vrsta namirnica

Prehrambene arome (uzroci). Cilj hromatografije je da se odredi koje od 9 standardnih boja su upotrebljene za bojenje ovih aroma

Kapilara za ručno nanošenje uzoraka na hromatografsku ploču

Adsorpciona hromatografija na tankom sloju

Staklena ploča sa nanesenim adsorbensom (silika gel-G), stacionarnom fazom

Imaginarna startna linija na koju se nanose uzorci

9 standardnih prehrambenih

bojaUzorci-arome

Nivo rastvarača u komori za razvijanje treba da omogući kontakt rastvarača sa adsorbensom,

ali da bude ispod startne linije (ne sme da dodiruje nanešene mrlje uzoraka

Rastvarač se postepeno penje uz sloj adsorbensa, rastvara nanešene mrlje uzoraka i nosi ih u većoj ili manjoj meri u zavisnosti karakteristika uzoraka

Rastvarač (mobilna faza):

etanol (96%) : amonijak (25%) =

9 : 1

Rastvarač mora da bude zatvoren u komori, tako da se i

atmosfera u komori zasiti parama rastvarača.

Standardi

Nakon sat vremena, analizira se razvijeni hromatogram:

Hromatogram: na osnovu računanja Rf vrednosti vrši se poreñenje standarda sa nepoznatim uzorcima i vrši identifikacija standarda koji su upotrebljeni za bojenje aroma. U ovm slučaju, pošto su uzorci vidljivi,

identifikacija je moguća i vizuelno.