Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells

Cycle du VIH

Règne : virus

Groupe VI : ssRNA RT

Famille : Retroviridae

Sous-famille : Orthoretrovirinae

Genre : Lentivirus

Virus de l’immunodéficience humaine

Introduction

Pour atteindre le pore nucléaire, traversée du cytoplasme

Diffusion des particules est limitée : viscosité du cytoplasme

Moyen de transport : le cytosquelette , not. les dynéines le long des microtubules.

Objectif de l’étude : grâce à la fluorescence

Caractérisation du trafic intracellulaire permettant de détecter des complexes d’origine virale

Observation du mouvement du virion dans la cellule

Observation des interactions du VIH avec les éléments cytoplasmiques

Production virale

CoTransfection de cellules 293 T avec pLAI- Yu (DNA proviral)

peGFPC3

Collecte du surnageant contenant les virus

Suivi du virus suivi de la GFP-Vpr (Vpr reste associée à l’ADN viral)

Vpr : protéine accessoire du VIH

Incorporation Vpr –GFP par interaction avec la région gag p6 pendant l’assemblement viral

peGFPC3

GFP VprPPGènes proviraux

pLAI- Yu

Exposition cellule cible (exprimant le CD4) avec surnageant

Observation de la fluorescence

Infection précoce

Signaux dans toute la cellule

Après 2h d’incubation

Accumulation du signal GFP dans la région péri nucléaire, au niveau des MTOC

+ Ac anti-tubuline (rouge)

Utilisation de la GFP : technique fiable?

Surnageant des cellules transfectées

Fixation des particules virales

Ac anti p17MA

(protéine de matrice)

Ac anti p24CA

(protéine de la capside)

Co-fixation de GFP-Vpr avec p24 ou p17 (protéines gag) ds 50-80 % des cas (flèches).

Ccl : Détection possible de plus de la ½ des virions grâce à la GFP.

Cellules transfectées + DiD (colorant des membranes)

Collecte du surnageant (virus)

Fixation

Co-localisation GFP-Vpr- DiD

Ccl : GFP-Vpr co-localise avec les membranes cellulaires enveloppant le virion.

But : montrer que GFP-Vpr est incorporé dans les virions infectieux

Transfection de cellules par constructions plasmidiques

Collecte virions Fractionnement sur gradient Précipitation TCA

SDS PAGE

Western Blot

Ac anti p24

Ac anti GFP

FractionsLysat de cellules transfectées avec GFP

Co-purification Vpr-GFP avec p24CA = incorporation spécifique dans les particules virales

Ccl : incorporation de la GFP-Vpr ds les virions intactsPas d’association non spécifique

Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (1)

Infection cellules HeLa (CD4/CCR5) avec HIV (GFP-Vpr)

Mitochondries=structure cellulaire Mouvement de 5 particules

Progression du VIH

Trajectoire curviligne vers le noyau.

Trajectoire du virus

Quantification du mvt des 5 particules :

Migration nucléaire relative=b/(a+b)

Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (2)

Mesure de la position des part.virales ttes les 5 min.

Mouvements vers l’int et l’ext . Migration nucléaire significative.

Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (3)

Mvt dép. et indép. des microtubulesInjection de rhodamine-tubuline à des cellules CD4 infectées par HIV (GFP-Vpr,DiD)

Microtubules

Rouge : VIH-DiD

Suivi d’1 particule DiD(-) qui utilise le réseau de microtubules

Suivi d’1 particule DiD(-) qui n’utilise pas le réseau de microtubules

Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (4)

Injection d’Ac anti- dynéine + rhodamine-dextrane (marqueur d’injection=cellules bleues) à des cellules cibles

Infection par VIH (GFP-Vpr, DiD)

Observation des particules DiD(-)

Cellule n’ayant pas reçu d’Ac

Cellules ayant reçu Ac anti-dynéine : accumulation des particules à la périphérie. Cellules n’ayant pas reçu l’Ac : accumulation près du noyau.

Ccl : La dynéine permet le mvt des particules vers le noyau.

Importance de la dynéine.

Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (1)

Injection Alexa 594- dUTP (rouges) à des cellules CD4

Infection par HIV (GFP-Vpr)

Microtubules : Ac anti- tubuline

Agrandissement des MTOC

MTOC Particules virales ayant incorporé les dUTPFlèches:

2 complexes doublement étiquetés : RTC, associés aux microtubules.

Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (2)

Injection à des cell. CD4/CCR5 d’Ac anti-dynéine ou IgG contrôle

Infection VIH (GFP-Vpr)

Diminution de la progression nucléaire

3 fois plus de RTC

Masquage des RTC par le signal de fluorescence nucléaire (accumulation près du noyau)

Ccl : utilisation de la dynéine par les RTC le long des microtubules.

Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (3)

Injection d’Alexa-dUTP (rouge) dans des cellules CD4/CCR5

Infection par VIH (GFP-Vpr)

Ac anti-p24CA

Région périnucléaire incorporation de dUTP

RTC p24 (-)

RTC p24 (+)

RTC p24(-) et p24(+) associés aux microtubules

67 % des RTC ont 1 quantité de p24CA similaire aux particules extracellulaires

capside intacte pendant l’initiation de la RT dans le cytoplasme

Particules p24 (+) et (-) asso aux microtubules

asso avt la perte de la capside

Analyses des RTC au microscope électronique

Gelsoline : déplétion de l’actine

Injection de Alexa-dUTP dans des fibroblastes

Infection VIH GFP-Vpr

Ac anti-tubuline (bleu)

RTC associés aux microtubules

EM

RTC= cylindre de 100 nm sur 400

Diamètre= 100 nm

Discussion

1) Utilisation d’une technique de fluorescence pour suivre la progression du VIH dans le cytoplasme

Vpr empaqueté dans les virions

Fusion GFP-Vpr : détection de ces virions et les complexes dérivés par

La sédimentation de GFP-Vpr avec les protéines virales

La colocalisation avec p17MA, p24CA et les membranes des virions

L’association de l’activité reverse transcriptase

Pour repérer les virus infectieux : particules ayant perdu leur mb marquée (fusion cellulaire) et celles ayant incorporé des desoxynucléotides

Mouvement dépendant des microtubules + indépendant (actine?)

Discussion

2) Rôle de la dynéine cytoplasmique dans la mobilité du HIV

Utilisation du réseau de microtubles par les virions pour arriver au noyau.

Association RTC-microtubules non spécifique d’une cellule : détection dans les cellules Hos, Hela et fibroblastes.

Traitement au nocodazole= destruction du réseau de microtubules=inhibition de l’infection par le VIH.

Autres études sur HSV et AD-2 = seulement baisse de l’efficacité de l’infection

Entrée proche du noyau?

Microtubules résistants au nocodazole?

Mvt brownien?

Discussion

3) Initiation de la reverse transcription

2 posibilités :

Libération de la capside juste après la fusion avec la mb cellulaire.

La capside reste intacte jusqu’à l’atteinte du pore nucléaire par le génome viral .

Etudes structurales de la capside : présence de pores suffisamment larges pour faire rentrer des nucléotides.

Association RTC- microtubules avant la perte de la capside.