Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells
Cycle du VIH
Règne : virus
Groupe VI : ssRNA RT
Famille : Retroviridae
Sous-famille : Orthoretrovirinae
Genre : Lentivirus
Virus de l’immunodéficience humaine
Introduction
Pour atteindre le pore nucléaire, traversée du cytoplasme
Diffusion des particules est limitée : viscosité du cytoplasme
Moyen de transport : le cytosquelette , not. les dynéines le long des microtubules.
Objectif de l’étude : grâce à la fluorescence
Caractérisation du trafic intracellulaire permettant de détecter des complexes d’origine virale
Observation du mouvement du virion dans la cellule
Observation des interactions du VIH avec les éléments cytoplasmiques
Production virale
CoTransfection de cellules 293 T avec pLAI- Yu (DNA proviral)
peGFPC3
Collecte du surnageant contenant les virus
Suivi du virus suivi de la GFP-Vpr (Vpr reste associée à l’ADN viral)
Vpr : protéine accessoire du VIH
Incorporation Vpr –GFP par interaction avec la région gag p6 pendant l’assemblement viral
peGFPC3
GFP VprPPGènes proviraux
pLAI- Yu
Exposition cellule cible (exprimant le CD4) avec surnageant
Observation de la fluorescence
Infection précoce
Signaux dans toute la cellule
Après 2h d’incubation
Accumulation du signal GFP dans la région péri nucléaire, au niveau des MTOC
+ Ac anti-tubuline (rouge)
Utilisation de la GFP : technique fiable?
Surnageant des cellules transfectées
Fixation des particules virales
Ac anti p17MA
(protéine de matrice)
Ac anti p24CA
(protéine de la capside)
Co-fixation de GFP-Vpr avec p24 ou p17 (protéines gag) ds 50-80 % des cas (flèches).
Ccl : Détection possible de plus de la ½ des virions grâce à la GFP.
Cellules transfectées + DiD (colorant des membranes)
Collecte du surnageant (virus)
Fixation
Co-localisation GFP-Vpr- DiD
Ccl : GFP-Vpr co-localise avec les membranes cellulaires enveloppant le virion.
But : montrer que GFP-Vpr est incorporé dans les virions infectieux
Transfection de cellules par constructions plasmidiques
Collecte virions Fractionnement sur gradient Précipitation TCA
SDS PAGE
Western Blot
Ac anti p24
Ac anti GFP
FractionsLysat de cellules transfectées avec GFP
Co-purification Vpr-GFP avec p24CA = incorporation spécifique dans les particules virales
Ccl : incorporation de la GFP-Vpr ds les virions intactsPas d’association non spécifique
Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (1)
Infection cellules HeLa (CD4/CCR5) avec HIV (GFP-Vpr)
Mitochondries=structure cellulaire Mouvement de 5 particules
Progression du VIH
Trajectoire curviligne vers le noyau.
Trajectoire du virus
Quantification du mvt des 5 particules :
Migration nucléaire relative=b/(a+b)
Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (2)
Mesure de la position des part.virales ttes les 5 min.
Mouvements vers l’int et l’ext . Migration nucléaire significative.
Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (3)
Mvt dép. et indép. des microtubulesInjection de rhodamine-tubuline à des cellules CD4 infectées par HIV (GFP-Vpr,DiD)
Microtubules
Rouge : VIH-DiD
Suivi d’1 particule DiD(-) qui utilise le réseau de microtubules
Suivi d’1 particule DiD(-) qui n’utilise pas le réseau de microtubules
Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (4)
Injection d’Ac anti- dynéine + rhodamine-dextrane (marqueur d’injection=cellules bleues) à des cellules cibles
Infection par VIH (GFP-Vpr, DiD)
Observation des particules DiD(-)
Cellule n’ayant pas reçu d’Ac
Cellules ayant reçu Ac anti-dynéine : accumulation des particules à la périphérie. Cellules n’ayant pas reçu l’Ac : accumulation près du noyau.
Ccl : La dynéine permet le mvt des particules vers le noyau.
Importance de la dynéine.
Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (1)
Injection Alexa 594- dUTP (rouges) à des cellules CD4
Infection par HIV (GFP-Vpr)
Microtubules : Ac anti- tubuline
Agrandissement des MTOC
MTOC Particules virales ayant incorporé les dUTPFlèches:
2 complexes doublement étiquetés : RTC, associés aux microtubules.
Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (2)
Injection à des cell. CD4/CCR5 d’Ac anti-dynéine ou IgG contrôle
Infection VIH (GFP-Vpr)
Diminution de la progression nucléaire
3 fois plus de RTC
Masquage des RTC par le signal de fluorescence nucléaire (accumulation près du noyau)
Ccl : utilisation de la dynéine par les RTC le long des microtubules.
Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (3)
Injection d’Alexa-dUTP (rouge) dans des cellules CD4/CCR5
Infection par VIH (GFP-Vpr)
Ac anti-p24CA
Région périnucléaire incorporation de dUTP
RTC p24 (-)
RTC p24 (+)
RTC p24(-) et p24(+) associés aux microtubules
67 % des RTC ont 1 quantité de p24CA similaire aux particules extracellulaires
capside intacte pendant l’initiation de la RT dans le cytoplasme
Particules p24 (+) et (-) asso aux microtubules
asso avt la perte de la capside
Analyses des RTC au microscope électronique
Gelsoline : déplétion de l’actine
Injection de Alexa-dUTP dans des fibroblastes
Infection VIH GFP-Vpr
Ac anti-tubuline (bleu)
RTC associés aux microtubules
EM
RTC= cylindre de 100 nm sur 400
Diamètre= 100 nm
Discussion
1) Utilisation d’une technique de fluorescence pour suivre la progression du VIH dans le cytoplasme
Vpr empaqueté dans les virions
Fusion GFP-Vpr : détection de ces virions et les complexes dérivés par
La sédimentation de GFP-Vpr avec les protéines virales
La colocalisation avec p17MA, p24CA et les membranes des virions
L’association de l’activité reverse transcriptase
Pour repérer les virus infectieux : particules ayant perdu leur mb marquée (fusion cellulaire) et celles ayant incorporé des desoxynucléotides
Mouvement dépendant des microtubules + indépendant (actine?)
Discussion
2) Rôle de la dynéine cytoplasmique dans la mobilité du HIV
Utilisation du réseau de microtubles par les virions pour arriver au noyau.
Association RTC-microtubules non spécifique d’une cellule : détection dans les cellules Hos, Hela et fibroblastes.
Traitement au nocodazole= destruction du réseau de microtubules=inhibition de l’infection par le VIH.
Autres études sur HSV et AD-2 = seulement baisse de l’efficacité de l’infection
Entrée proche du noyau?
Microtubules résistants au nocodazole?
Mvt brownien?
Discussion
3) Initiation de la reverse transcription
2 posibilités :
Libération de la capside juste après la fusion avec la mb cellulaire.
La capside reste intacte jusqu’à l’atteinte du pore nucléaire par le génome viral .
Etudes structurales de la capside : présence de pores suffisamment larges pour faire rentrer des nucléotides.
Association RTC- microtubules avant la perte de la capside.