7/25/2019 Vjeba S

1/6

Vjeba S - ELEKTROFOREZA PROTEINA NA POLIAKRILAMIDNOMGELU U PRISUTNOSTI SDS-a (SDS-PAGE)

UVOD

Elektroforeza je gibanje estica u elektrinom polju pri emu njihova pokretljivost ovisi ojakosti elektrinog polja, svojstvima estica (npr. naboju , veliini, obliku) i o sredini u kojoj

se estice gibaju, tj svojstvima te sredine kao to su ionska jakost, viskoznost i temperatura.

Postoje tri osnovna tipa elektroforeze kao laboratorijske metode s pokretnom granicom,

zonska i kontinuirana elektroforeza. ! vje"bi # koristili smo jednu od izvedbi zonske

elektroforeze $ elektroforezu na #%#$poliakrilamidnom gelu. #%#$P&'E je najire koritena

elektroforetska metoda za analizu proteina. #%# u prisutnosti reagensa za razaranje

disufidnih veza denaturira i disocira veinu proteina u pojedinane polipeptidne lance, osim

toga, #%# maskira naboj polipeptidnih lanaca tako da je neto navboj po jedinici mase

pribli"no konstantan. bog svega ovoga elektroforetsko razdvajanje ovisi samo o

efektivnom promjeru molekule (koji odgovara molekuskoj masi).

MATERIJALI I METODE

Pufer za nanoenje uzorka

*+ g dm$ #%#*+ mmol dm$ -$merkaptoetanol, -* glicerol+,/ g dm$ bromfenolskog plavila,

pufer za sabijanje +,-* mol dm$ 0ris123l, p2 4,5.

Pufer koriten tijekom elektroforeze

/6,6 g dm$ glicina, ,+ g dm$ 0ris baze, #%# /,+ g, p2 5..

'el za razdvajanje

/,++ ml akrilamid1bisakrilamid (076+, 37.)

/,++ ml koncentriranog pufera za razdvajanje (0ris23l /,* mol dm$, #%# 6 g dm$, p2

5,5)

-,++ ml 8e2-9-+ :l -+ &P#

:l 0E;E%

'el za sabijanje

+,- ml akrilamid1bisakrilamid (076+, 37. )

+,* ml koncentriranog pufera za sabijanje (0ris23l +,* mol dm$, #%# 6 g dm$, p2

4,5)

/, ml 8e2-9

/+ :l -+ &P# :l 0E;E%

7/25/2019 Vjeba S

2/6

7/25/2019 Vjeba S

3/6

REZULTATI

S"ia . 8ezultati dobiveni #%#$P&'Eom

ZAKLJU/AK

! ovoj vje"bi uspjeno smo pripremili gel za elektroforezu te smo uspjeli razdvojiti proteine

iz uzoraka od /$A.

@a temelju onoga to nam je poznato o uzorcima i fotografije gela vidimo da se uzorci

razlikuju po vrsti (negdje je rije o zasebnom proteinu a negdje o smjesi), takoDeruoavamo da se razlikuju po broju i molekulskoj masi podjedinica koje ih grade. 9sim toga

mo"da neki uzorci zadr"avaju i neistoe. !oavamo razliku izmeDu ekstrakta (imaju itav

spektar podjedinica jer se sastoje od mnotva proteina, a i ti se proteini vjerojatno sastoje

od vie podjedinica) i zasebnih proteina i proteinskih smjesa (ovdje je rije o manjem broju

proteina, pa ako i imaju vie podjedinica i dalje govorimo o manjem broju vrpci nego u

sluaju ekstrakta) !z to, kod proteinskih ekstrakata mo"emo uoiti je li koji protein

nadeksprimiran (tada postoje izra"enije vrpce nego u istovrsnom ekstraktu bez

nadekspresije) ?eliinu podjedinica mo"emo odrediti zato to vee podjedinice putuju

sporije od manjih podjedinica pa zato zauzimaju i razliita mjesta na gelu, ! tu svrhu se

koristi i marker, koji ima vrpce na poznatim vrijednostima ;r$a.

7/25/2019 Vjeba S

4/6

Uzorci 3, 4, 5, i 8 neproieni proteinski ekstrakti bakterija suheterogeniji, vidimo vie vrpci, uzorci /,-,4,> i A zbog jasno razluivih linija, a i manjeg broja

vrpci su uzorci proienih proteina. Postoji nekoliko debljih vrpci, npr. na uzorku br.

najvjerojatnije pripada proteinu #er8#, na uzorku br. 6 su dvije izra"ene vrpce $ manje

izra"ena najvjerojatnije pripada proteinu #er8#, a jae izra"ena njegovoj katalitikojdomeni.Uzorak br. 6 bi trebao imati samo jednu vrpcu, pojava drue

vrpce najvjerojatnije pokazuje da postoje odre!ena oneienja.

ODGOVORI NA PITANJA

1. Izraunajte masu akrilamida i bisakrilamida potrebnih za pripravu 5 mlpoliakrilamidnog gela sastava T=20% !=5%" #oja su dva naina pomo$u kojih

moete varirati veliinu pora&

? (gel)7*ml

07-+

37*

07((makrilamidFmbisakrilamid)1g)1

(?smjese1ml)7+,-

37mbisakrilamid 1(makrilamidFmbisakrilamid)7+,+*

3G07mbisakrilamid1?

mbisakrilamid7+,+/G* 7 +,+*g

(makrilamidFmbisakrilamid)7 mbisakrilamid 1+,+*

7/g

makrilamid7(/$+,+*)g7+,A*g

7/25/2019 Vjeba S

5/6

?eliine pora u gelu mijenjamo promijenom sadr"aja krutih tvari u gelu i stupnja umre"enja.

2. 'a(to obinom elektro)orezom nije mogu$e odrediti molekulsku masu proteina& #oja je

uloga natrijevog dode*ilsul)ata +,-,a/ u odreivanju molekulskih masa pomo$u ,-,

34& #akav biste rezultat oekivali ako protein posjeduje kvaternu strukturu odnosno

vi(e istih ili razliitih podjedini*a&

ato to neto naboj estica takoDer utjee na brzinu pomicanja estica po gelu, a ne samo

masa. ?eina proteina mo"e vezati vezati /,6g #%# 1 g proteina i na taj nain se maskira

naboj polipepdidnih lanaca te je naboj po jedinici mase konstantan.

7/25/2019 Vjeba S

6/6

Tab"i,a .9visnost molekulske mase o udaljenosti od gornjeg ruba gela za razdvajanje

M%"e'"0aa0a (Mr)

"%! (Mr)U1a"je$%0* %1 !%r$je! r'ba !e"a

a ra12aja$je (,)Re"a*i2$a

p%re*"ji2%0*//*+++ *,+4+> +,5 +,/-

A*+++ 6,A>>> /,6 +,-/>*+++ 6,5>*/ /,A +,-5

*++++ 6,4AA+ -,A +,6

*+++ 6,*66/ ,A +,*>

-*+++ 6,A>A *,/ +,>*

" ".# ".$ ".3 ".4 ".5 ".6 ".% ".8

4

4.$

4.4

4.6

4.8

5

5.$

&'() * + #."8( 5.#-

relativna pokretljivost

log (Mr)

S"ia 3. Hogaritamska ovisnost molekulske mase molekule o relativnoj pokretljivosti

8elativna pokretljivost & +,6/-8elativna pokretljivost = +,44-

;r(&) 7 *644;r(=) 7 -A6+