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Vorlesung: Andrologie und instrumentelle SamenübertragungWintersemester 2006/7, 7. Fachsemester
- Spermagewinnung
- Herstellung von Besamungsportionen
- Verdünner
- Kryobiologie
Samenübertragung beim Pferd im arabischen Schrifttum für 1286 datiert
Entdeckung der menschlichen Spermien
Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723)
Erste erfolgreiche Besamung bei einem Säugetier im Jahre 1780 an einer Hündin
Lazzaro Spallanzani (1729-1799)
Karl-Ernst von Baer (1792-1876)
Entdeckung der Eizelle 1827 bei einer Hündin
Entwicklung einer künstlichen Vagina für Hunde 1914 durch einen italienischen Physiologen
Ab 1900 umfangreiche Versuche zur künstlichen Besamung in Russland/UdSSR
Erste Versuche an Meerschweinchen, Kaninchen und Hunden
1932: künstliche Besamung bei 2182 000 Schafen und 385 000 Rindern
In Deutschland Weiterentwicklung vor allem in Hannover
- eindeutiger Schwerpunkt beim Nutztier- Bekämpfung von Deckseuchen
Erste deutsche Besamungsstation 1943 in Pinneberg
Heutige Situation - Deutschland
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Schweinpro Jahr werden zwischen 5 – 6 Millionen Spermaportionen verkauft
WarmblutpferdAnteil der Besamungen liegt mehr als dreimal so hoch wie der Natursprung
Schritte der Herstellung einer Besamungsportion
- Spermagewinnung
- Spermabeurteilung
- Spermaverarbeitung
- Verdünnung - Berechnung des Verdünnungsgrades - Verdünnungsvorgang - Konfektionierung u. Kennzeichnung - Glasampullen - Pellets - Pailletten - sonstige Plastikgefäße - Lagerung
- Spermaverbrauch - Entnahme - Handling bis zur Besamung
- Besamung
Arten von Besamungsportionen
Direkte Übertragung nach der Gewinnung
Nativsperma
Verlängerung der Haltbarkeit durch Zusatz von Verdünnern und Kühlungflüssigkonserviertes Sperma
Verlängerung der Haltbarkeit durch Zusatz von Verdünnern, Kryoprotektiva und Tiefgefrierung bei -196°Ctiefgefrierkonserviertes Sperma
Nativsamen
Vorteile: - wenig Aufwand (Verarbeitung, Besamungstechnik) - geringe Schädigung der Spermien
(gute Befruchtungskompetenz) - leichte Besamungstechnik
Nachteile: - Besamungsportion muss sofort versamt werden - örtliche und zeitliche Bindung
Typische Situation:
- Hündin lässt Rüden trotz richtigem Besamungszeitpunkt nicht decken
- Rüde wird abgesamt – Hündin wird besamt
flüssigkonserviertes Sperma
Prinzip:- durch Zugabe von Verdünnern und Kühlung wird die Besamungsportion bis
etwa 3 Tage konserviert- beste Ergebnisse innerhalb von 48 Std. nach der Gewinnung
Vorteile: - kein direkter Kontakt von Zuchttieren notwendig - Vermeidung von zeit- und kostenaufwendigen Fahrten - Verminderung des Infektionsrisikos
Nachteile: - Fehler in der Samenhandhabung führen zum Leerbleiben
- höhere Anforderungen an die Besamungstechnik
Tiefgefriersperma
Prinzip:- durch Zugabe von Verdünnern, Kryoprotektiva, schrittweise Kühlung und Gefrierung in flüssigem Stickstoff bei -196°C wird der Samen konserviert
Vorteile: - „unendliche“ Lagerungsdauer möglich (3000 – 10000 Jahre) - keine Begrenzung von Zeit und Ort - Anlage von Genbanken möglich
Nachteile: - Schädigung der Samenzellen (Verlust von 20 – 50 %) - hohe Anforderungen an die Besamungstechnik - nicht jedes Vatertier ist geeignet
Spermagewinnung
- Methode beeinflusst die Qualität des Ejakulates(negative Erfahrungen, Volumen und Dichte, Stimulation)
Zwei Methoden:- Elektroejakulation ohne Auslösung der Paarungsreflexkette- Nutzung der natürlichen Paarungsreflexkette
Prinzip der Elektroejakulation
- Einführen einer bioplaren Elektrode in das leere Rektum - mehrmalige elektrische Reizung mit steigender Stromstärke
(Bulle: 0 auf 40 – 60 mA, Spannung bei 10 – 30 Volt) - Möglichkeit der Ejakulation ohne Erektion – Ejakulat tropft aus der
Präputialöffnung ab
Spermagewinnung
Nutzung der natürlichen PaarungsreflexketteAblauf: - Auslösung der natürlichen Paarungsreflexkette
- Schlüsselreize (visuell, olfaktorisch, mechanisch)- mit natürlichem Sprungpartner
- weiblich- im Östrus- nicht im Östrus
- männlich
- mit einer Attrappe, die den Schlüsselreizvermittelt (Phantom)
- allein durch manuelle Stimulation
Spermagewinnung
Spermagewinnung
Nutzung der natürlichen PaarungsreflexketteMethoden:
- Nutzung einer künstlichen Vagina
- manuelle Methode
Spermagewinnung
Nutzung der natürlichen Paarungsreflexkette
Methoden: - Nutzung einer künstlichen Vagina
- Mantelrohr z. B. aus Hartgummi
- Innenschlauch z. B. aus Latex
- Samenauffangglas
- Gummiringe
- Ventil
- Gleitmittel
- Latextrichter
Spermagewinnung
Nutzung der natürlichen PaarungsreflexketteMethoden: - Nutzung einer künstlichen Vagina
Spermagewinnung
Nutzung der natürlichen PaarungsreflexketteMethoden: - Nutzung einer künstlichen Vagina
Spermagewinnung
Nutzung der natürlichen PaarungsreflexketteMethoden: - Nutzung einer künstlichen Vagina
Schlüsselreize:- Temperatur (zwischen 40 - 41°C)- Druck
- Gleitvermögen
- Wärmeschrank (Cave: Keimvermehrung)- Wasser (Cave: spermizid)- Alternativ: Luft
Spermabeurteilung
- siehe Spermatologische Untersuchung
SpermaverarbeitungZiel: Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit über einen möglichst
langen Zeitraum
Verdünnung
- ausgehend von der Dichte des Ejakulates- Zusatz von Verdünnern:
- Volumenvergrößerung- Nährstoffe (Glukose, Fruktose)- Schutzstoffe: Eidotter und synthetische - Kryoprotektiva- Erhaltung des osmotischen Druckes (250-300 mOsm/l)- Pufferkapazität (pH: 6-7)- Verhinderung von Keimvermehrung
- Volumenvergrößerung- Konservierung
Kryoprotektiva
- Glycerin: am häufigsten eingesetzt, aber auch zytotoxisch(1 – 3 %)
- DMSO: Bedeutung beim Kaninchen
Warum Zusatz von Kryoprotektiva?
Reduzierung der Zellschäden durch
- Kühlschäden- Gefrierschäden
Schäden vor allem im Bereich der Plasmamembran und des Akrosom
Kühlschäden
- Strukturelle Veränderungen der Plasmamembran im Temperaturbereich 17°C bis 4°C
- sehr empfindlich sind Eberspermien- Reduktion der Schäden durch Zusatz von Schutzkolloiden
- Schädigungsfaktoren: - Wasserentzug durch extrazelluläre Eisbildung
– Zerstörung der Isotonie – Anreicherung von Stoffen in der Zelle, die nicht durch die Plasmamembran durchtreten können.
- Intrazelluläre Eisbildung
- Zwischen -5 °C und -15 °C setzt die extrazelluläre Eisbildung ein
Gefrierschäden Beim
Einfrieren und A
uftauen
Exosmose: Entzug von Wasser durch extrazelluläre Eisbildung
intrazelluläre Eisbildung
Aus: Busch et al. , 1993
Beides soll in seinen negativen Auswirkungen reduziert werden
Exosmose: Entzug von Wasser durch extrazelluläre Eisbildung
intrazelluläre Eisbildung
Beides soll in seinen negativen Auswirkungen reduziert werden
- Zusatz von Kryoprotektiva
- Zeitkurve der Einfrierung: - schnelles Einfrieren: vermehrt intrazelluläre Eisbildung- langsames Einfrieren: Exosmose, Lösungseffekt
Verdünnung
- Temperaturangleichung von Samen und Verdünner- Beachtung bestimmter Haltezeiten (Äquilibrierung – bei TGS)
1. Berechnung der erforderlichen Verdünnermenge- erforderliche Gesamtspermienzahl pro Portion- Anteil der zu erwartenden vorwärtsbeweglichen Spermien zum Zeitpunkt der Besamung
2. Bestimmung des Endvolumens nach Verdünnung
Gesamtspermienzahl x VorwärtsbewegungFaktor x Spermien pro Besamungsdosis
= Anzahl Samenportionen
Anzahl Samenportionen x Volumen Portion = Endvolumen nach Verdünnung
u. a.: Verhältnis Samen:Verdünner
Verdünnung (Beispiel: Flüssigkonservierung Rüde)
1. Berechnung der erforderlichen Verdünnermenge
2. Zusatz des Verdünners bei Raumtemperatur
3. Wartezeit von 10 Minuten
4. Kontrolle der Motilität
5. Abfüllen und Kennzeichnen der Besamungsdosis
6. Überführen in den Kühlschrank und Lagerung bei 5°C
Verdünnung (Beispiel: Tiefgefrierkonservierung Bulle)
- Abkühlung in mehreren Schritten
- Zugabe von Verdünner bei Raumtemperatur
- schrittweise Absenkung auf -196°C
- computergesteuerte Temperaturabsenkung
- tierartliche Besonderheiten
Konfektionierung
- Handhabung (Lagerung, Schutz, Identifikation, kryobiologische Aspekte)
Konfektionierung für die Flüssigkonservierung
- Kunststoffgefäße mit starrer Wand (z.B.: Spritzen)- Kunststoffgefäße mit flexibler Wand (z.B.: Tuben)
Konfektionierung für die Tiefgefrierkonservierung- Pellets (historisch)- Ampullen (historisch)- Pailletten
Aus: Busch et al. , 1993
Aus: Busch et al. , 1993
Pailletten
- Entwicklung aus Frankreich, die sich seit den sechziger Jahren weltweit verbreitet hat.
- Polyvinylchlorid, verschiedene Farben
- Andere Bezeichnung: Straws
- Verschiedene Größen:- große Pailletten (Makrotübs): Länge 240 mm; 5 mm, Inhalt 4 ml
- mittlere Pailletten: Länge 133 mm; 2,9 mm, Inhalt 0,5 ml- feine Pailletten: Länge 133 mm; 2 mm, Inhalt 0,25 ml- Modell Minitüb: Länge 65 mm; 3 mm, Inhalt 0,25 ml
Vorteile der Miniaturisierung:- rationelle Lagerung- Veränderung des Verhältnisses von Oberfläche zu Inhalt
Nachteile der Miniaturisierung:- bei einigen Tieren müssen mehrere Pailletten eine Besamungsportion
ergeben
Grundaufbau Pailletten
Baumwollstopfen mit Polyvinylalkohol-Puder
Dient später als Stempel
LuftblaseVerschluss durch maschinelles Zusammenpressen oder Kugel
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Grundaufbau Pailletten
Luftblase
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Grundaufbau Pailletten
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Grundaufbau Pailletten
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Grundaufbau Pailletten
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Angaben auf der Besamungsportion- Identitätsnummer- Kurzname (Rasse)- Datum der Spermaentnahme- (Name) und Code der Besamungsstation
Sinn:- Identitätsnachweis der Nachkommen- Rückverfolgung (Seuchenhygiene, Erbhygiene)
Lagerung des Tiefgefriersperma
- im flüssigen Stickstoff (N2)
- Temperatur -196 Grad Celsius
- Eigenschaften: - farblos- geruchlos- chemisch nicht aggressiv- schwerer als Luft- Siedepunkt: -196 °C
Siedetemperatur oder -punkt: Der Siedepunkt stellt die Bedingungen dar, welche beim Phasenübergang eines Stoffes von der flüssigen in die gasförmige Phase vorliegen, was man als Sieden oder Verdampfen bezeichnet.
Luft:Gasgemisch der Erdatmosphärehauptsächliche Bestandteile:
- Stickstoff 78 %- Sauerstoff 21 %- Argon 0,9 %- Kohlenstoffdioxid 0,03 % - Rest
Gefahr durch flüssigen Stickstoff
- N2 muss verdampfen können- Explosionsgefahr bei festen Verschluss- Erstickungsgefahr in verschlossenen Räumen
- Erfrierungen- besondere Gefahr: Augenverletzungen
Merke: - Container vor Umkippen schützenauch im Auto
- Augen schützen (Schutzbrille tragen)
- Container nicht in schlecht belüfteten Räumen lagern (Keller, Abseiten, u .a.)
- Container müssen regelmäßig aufgefüllt werden
Sollte nicht im Fahrgastraum transportiert werden.
Sofortmassnahmen bei Unfällen mit flüssigen Stickstoff
- Kleidung und Schuhe ausziehen, wenn N2 zwischen Kleidung und Haut
- Augen: mit Wasser spülen
- Bei Blasenbildung nicht reibenbetroffene Stellen mit Verbandsmaterial abdecken
- Räume lüften
Lagerungsgefäße für Tiefgefriersperma- Container
Isolierung durch - doppelwandiger Behälter
- Vakuum + Isoliermaterial
Deckel gewährleistet- Schutz- Verdampfung
Technische Daten von Containern- Füllmenge- Verdampfungsrate
Stickstoffverbrauch muss kontrolliert werden- Messstäbe- Waagen
Lagerungsgefäße für Tiefgefriersperma
- 196 °C
- 150 - 190 °C
- 120 °C
nahe Umgebungstemperatur
Spermaschädigung ab einer Temperatur von - 120 °C
Wiederholte Exposition führt zur Akkumulation der Schäden
Aus: Busch et al. , 1993
Container
Kanister
Goblet
Reinigung und Desinfektion von Spermacontainern
- vorgeschrieben, wird auch kontrolliert (Dokumentation)
- Ansammlung von Sediment (Dreck, Spermaportionen)
- Infektionserreger werden konserviert
Vorgehen
- Spülung mit destilliertem Wasser
- Begasung wäre ideal (Formaldehyddampf)
Entnahme einer Besamungsportion
Prinzip
- Nur die Portion entnehmen, die gebraucht wird- Die anderen Portionen nicht schädigen- die entnommene Portion unverzüglich dem Auftauprozess zufügen
Vorgehen
- Container öffnen – Standplatz des Deckels- Kanister soweit anheben, dass Paillette mit Pinzette erfasst werden
kann – obere Kante der Pailletten darf Niveau der Containeröffnung nicht überragen
- Paillette kurz schwenken- Kanister absenken- Paillette ins Auftaugerät überführen- Container schließen
Entnahme einer Besamungsportion
Vorraussetzungen
- Inventarverzeichnis- gute Lichtverhältnisse
Fehler
- Langes Suchen der richtigen Portion- Zu weites Hochziehen der Kanister- „Fecheln“ mit der Hand
Auftauen einer Besamungsportion
Prinzip
- schnelles Auftauen verhindert Rekristallisation- kontinuierliche Wärmeübertragung verhindert ungleichmäßiges Auftauen- optimal: 75°C über 5 bis 10 Sekunden- Samenportion darf nicht zu „warm“ werden < 40°C- Die Temperatur darf nur nach oben gehen
Schlechte Auftaubedingungen- in der Hand- im Mund- an der Luft (Umgebungstemperatur)
Auftauen einer Besamungsportion
Vorgehen
- Kontrolle des Auftaugerätes (Betriebstemperatur)- Temperatur des Wasserbades 38 ± 2 °C- Dauer: feine Pailletten: 25 Sekunden
mittlere Pailletten und Minitüb: 30 Sekunden - Überführen der Portion in das Auftaugerät - Entnahme der Portion - Identitätskontrolle - Abtrocknen der Portion - Beförderung der Luftblase auf die Verschlussseite - Öffnen der Portion - Einbringen in das Besamungsgerät
Lagerung des flüssigkonservierten Spermas
- Eber: ca. 17°C
- Rüde: ca. 5°C
- Hengst: 4 - 6°C
- Kühlkette muss eingehalten werden – auch kurzfristige Erwärmung verhindern
- Lagerung im Kühlschrank