Wykład Monograficzny

dla DoktorantówBadanie mechanizmów reakcji katalizowanych

przez enzymy

Część pierwsza

Ogólne informacje o enzymach

Treść I części wykładu1. Ogólne własności enzymów.

2. Zalety biokatalizy.

3. Rodzaje selektywności enzymów.

4. Zastosowanie enzymów w syntezie organicznej.

5. Klasyfikacja enzymów.

6. Enzymatyczne syntezy związków biologicznie czynnych.

7. Kinetyka reakcji enzymatycznych.

Enzymy

Enzymy są biologicznymi polimerami katalizującymi liczne procesy, bez których życie nie byłoby możliwe. Enzym to biokatalizator białkowy wytwarzany przez żywe komórki organizmu. Ten biokatalizator ma zdolność do obniżania energii aktywacji danej reakcji chemicznej, co skutkuje jej przyspieszeniem. Katalizują one reakcje w układach biologicznych. Bez ich obecności dana reakcja nie zachodzi, lub przebiega tak wolno, że jej rezultat jest niezauważalny. Enzymy charakteryzują się wysoką specyficznością, zarówno pod względem katalizowanej reakcji, jak substratów biorących w niej udział.

Enzymy są białkami prostymi i złożonymi. Enzym złożony składa się z części białkowej i składnika niebiałkowego, zwanego kofaktorem. Część białkowa takiego enzymu jest zwana apoenzymem, a połączenie apoenzymu z kofaktorem nosi nazwę holoenzym.

Holoenzym = kofaktor + apoenzym

Gdy kofaktor tj. część niebiałkowa jest związana na stale z apoenzymem –nazywamy ją inaczej grupą prostetyczną.

Gdy kofaktor jest nietrwale związany z apoenzymem – jest zwany koenzymem.

Zalety biokatalizy1. Enzymy to efektywne katalizatory – zwiększają przynajmniej 106 szybkość

reakcji. W razie ich nieobecności – szybkość reakcji w układach biologicznych jest niezauważalna.

2. Enzymy charakteryzują się dużą specyficznością.

3. Enzymy działają w łagodnych warunkach tj.

• przy ciśnieniu atmosferycznym;

• W większości przypadków w przedziale temp. 20- -40oC;

• Przy pH bliskim neutralnemu;

• Reakcje przebiegają w środowisku wodnym.

4. Odpady z reakcji są mało szkodliwe dla środowiska.

5. Reakcje enzymatyczne prowadzi się w prostych aparatach.

6. Reakcje enzymatyczne wyróżniają się wysoka wydajnością.

7. Enzym nie katalizuje reakcji ubocznych.

Rodzaje selektywności enzymów

1. Chemoselektywność (np. hydrolizuje estry, a nie hydrolizuje acetali lub amidów).

2. Regioselektywność i diastereoselektywność (np. z kilku takich samych grup funkcyjnych w substracie – wyróżnia tylko jedną).

3. Enancjoselektywność (np.katalizuje tylko reakcje z L-aminokwasem lub tylko z D-sacharydem).

Zastosowanie enzymów w syntezie organicznej1. Rozdzielanie mieszanin racemicznych.

2. Otrzymywanie związków optycznie czynnych.

3. Synteza związków użytecznych biologicznie lub chemicznie.(np.alkoholi, amidów, aminokwasów).

4. Synteza związków niemożliwych do otrzymania na drodze klasycznejsyntezy organicznej.

5. Możliwość otrzymania związków selektywnie znakowanych izotopami stabilnymi lub promieniotwórczymi.

a. Izotopami wodoru.

b. Promieniotwórczym izotopem 32 P.

c. Promieniotwórczym izotopem 35 S.

d. Izotopami węgla (stabilnym 13C i promieniotwórczymi 14C i 11C).

Wady przy stosowaniu enzymów1. Mikroskala.

2. Wymagana jest wysoka czystość substratów. Niektóre zanieczyszczenia, nawet w małej ilości powodują inhibicję enzymów.

3. Niektóre enzymy są bardzo drogie. Nie wszystkie znajdują się w sprzedaży. Wydzielanie ich z materiału biologicznego jest bardzo pracochłonne i kosztowne.

Miejsce (centrum aktywne) enzymuW wiązaniu substratu i w przetwarzaniu go w produkt uczestniczy specyficzny

region cząsteczki białka enzymatycznego, nazywany miejscem aktywnym lub centrum aktywnym enzymu.W jego strukturze można wyróżnić dwa elementy funkcjonalne.

Są to: miejsce wiązania substratu i miejsce katalityczne.

Centrum aktywne cechuje się następującymi właściwościami:

A. Zajmuje stosunkowo mały fragment cząsteczki enzymu.Tylko nieliczne reszty amino- kwasowe białka enzymatycznego wchodzą w bezpośredni kontakt z substratem.

B. Miejsce aktywne jest układem przestrzennym, złożonym z łańcuchów bocznych reszt aminokwasowych, zajmujących różne odległe pozycje.

C. W tworzeniu miejsca aktywnego uczestniczą przede wszystkim te reszty aminokwasowe, które w łańcuchach bocznych mają grupy mogące być donorami lub akceptorami protonów.

D. Miejsca aktywne są zagłębieniami lub szczelinami w strukturze cząsteczki białka enzymatycznego.

Międzynarodowy kod enzymatycznyMiędzynarodowy kod enzymatyczny składa się z dwu liter i czterech

liczb oddzielonych kropkami. Jego schemat wygląda następująco: EC a.b.c.d.Symbol EC (enzyme code) oznacza, że liczby po nim dotyczą międzynarodowego kodu genetycznego.Liczba a określa numer klasy enzymu;Liczba b- numer podklasy w obrębie tej klasy;Liczba c- oznacza numer podpodklasy w obrębie podpodklasy;Liczba d -oznacza numer enzymu w obrębie wymienionej wcześniej popodpodklasy.

Każdemu dobrze poznanemu enzymowi, przypisano jego niepowtarzalny numer identyfikacyjny.

Na przykład dehydrogenaza mleczanowa ma numer kodowy EC1.1.1.27.Pierwsza liczba (1) oznacza, że enzym należy do klasy 1, jest więc oksydoreduktazą. Druga liczba (1) oznacza, że enzym należy do podklasy 1, obejmującej wszystkie oksydoreduktazy, które odłączają parę atomów wodoru od grupy H-C-OH. Trzecia liczba (1) oznacza, że enzym ten należy do podpodklasy 1, obejmującej wszystkie enzymy, które przekazuja wodory odłączone z grupy H-C-OH na NAD+. Czwarta liczba (27), to numer przyporządkowany temu enzymowi w obrębie podpodklasy EC.1.1.1

REGIOSELEKTYWNA HYDROLIZA ESTRÓW PRZEZ PLE

HO

COOMe

COOMe1

4

HO

COOMe

COOHPLEbufor

REGIOSELEKTYWNA HYDROLIZA DIESTRÓW E/Z

DIASTEREOTOPOWYCHZ UŻYCIEM PLE

PLE

bufor

R

COOEt

COOEt

R

COOEt

COOHE / Z Z

R = H, Me2N, NO2

ENZYMATYCZNY ROZDZIAŁ ESTRÓW AMINOKWASOWYCH Z UŻYCIEM ESTERAZY

R OOC

RNHR R HN

COOH

R

R OOC

R NHR

esteraza lub proteaza

L D

11

2 2

bufor

R = alkyl, aryl, R1 = Me, Et, R2 = H, acyl

ROZDZIAŁ RACEMICZNYCH DIOLI W UKŁADZIE HLADH / AlEHYDO -DH

R = -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH3, -CH2NH2, -CH=CH2, -CH2CH3

HLADH - Horse Liver Alcohol Dehydrogenase (hydrogenaza alkoholowa z wątroby końskiej)DH - Dehydrogenase

L

NAD+ recykling

Aldehydo-DH

e.e > 97 %

L D e.e.( nie określono)

rac

++NAD+ recykling

HLADH

R COOH

OH

RO

OH

HR

OH

OH

ROH

OH

Przekształcania glukozo-6-fosforanu w zależności od enzymu

OCH2

H H

OH

H

O

OH

P

HOH

H

HO

OCH2

H H

OH

H

OH

OHOH

H

HO

P

P

glukozo-1-

PGM = fosfogluomutaza

PGM

OCH2

H H

HOH

O CH2OH

OHHO

P

P

PHI

PHI = fosfoheksoizomeraza

fruktozo-6-P

OCH2

H

OH

H

O

O

P

HOH

H

HO

6- P -glukonolakton

DHG-6- P

DHG-6- P = dehydrogenaza glukozo-6- P

OCH2OH

H H

OH

H

OHHOHHO

G-6-F

G-6-F = glukozo-6-fosfotaza

glukoza

H

= fosforan

Mechanizm biokatalizy na przykładzie wybranych enzymów

Mechanizm biokatalizy został dość dobrze poznany dla kilku enzymów hydrolitycznych tj.

Lizozymu, karboksypeptydazy A i chymotrypsyny.Lizozym jest białkiem enzymatycznym o dość prostej strukturze: zawiera

129 reszt aminokwasowych. Nie ma grupy prostetycznej. Jego struktura przestrzenna jest stabilizowana przez cztery wewnątrzcząsteczkowe mostki disiarczkowe. Substratem lizozymu jest polisacharyd ściany bakteryjnej, zbudowany z powtarzającego się wielokrotnie dimeru: złożonego z kwasu N-acetylomuraminowego i N-acetyloglukozoaminy. Obydwa te składniki są połączone wiązaniem 1,4-β-glikozydowym. Wiązanie to jest rozkładane przez lizozym.

Na powierzchni cząsteczki lizozymu znajduje się zagłębienie wiążące polisacharyd. Decydujące znaczenie dla biokatalizy mają dwie grupy karboksylowe.

Są to: niezjonizowana grupa γ-karboksylowa glutaminianu w pozycji 35 i zjonizowana grupa β-karboksylowa asparaginianu w pozycji 52

Reakcja katalizowana przez lizozym

O

CH2OH

OR

NH

C

CH3

O

O

O

CH2OH

OH

NH

C

CH3

O

O

CH2OH

OR

NH

C

CH3

O

1

2 3

4

O

CH2OH

OR

NH

C

CH3

O

O O1

23

4

5 5

66

O OHCH2OH

OR

NH

C

CH3

O

O

O

CH2OH

OH

NH

C

CH3

O

O

CH2OH

OR

NH

C

CH3

O

12

3

4

O

CH2OH

OR

NH

C

CH3

O

O1

23

4

5 5

66

HO

NAG

NAG NAG

NAGNAM NAM

NAM NAM

H2O

NAG = N-acetyloglukozoamina NAM = kwas N-acetylomuraminowy

Karboksypeptydaza AJest enzymem proteolitycznym, odłącza od białka (peptydu)

pojedyncze aminokwasy C-końcowe, z wyjątkiem lizyny i argininy. Wykazuje szczególnie wysoką aktywność wobec wiązań peptydowych, powstałych z udziałem aminokwasów zawierających pierścień aromatyczny lub długołańcuchowy. Jest białkiem jednołańcuchowym , zbudowanym z 307 reszt aminokwasowych i objętych w 38 procentachstrukturą α-helisy. Cząsteczka enzymu jest zwarta, ma kształt elipsolidalny, a w miejscu aktywnym zawiera kowalencyjnie związany jon cynku (Zn2+).Jon ten wytwarza wiązania koordynacyjne z dwoma łańcuchami bocznymi histydyny, łańcuchem bocznym glutaminianu i cząsteczką wody. Dzięki temu połączeniowi cząsteczka wody staje siębardzo aktywna.Wiązanie substratu powoduje istotne zmiany centrum aktywnego enzymu.

Chymotrypsyna

Jest ona także enzymem proteolitycznym. W odróżnieniu od karboksypeptydazy nie odłącza aminokwasów C-końcowych tylko hydrolizuje wiązania peptydowe położone w głębi łańcucha białkowego, co prowadzi do fragmentacji substratu na peptydy o różnej długości. Jest białkiem złożonym z trzech łańcuchów polipeptydowych, połączonych mostkami disiarczkowymi.

Centrum aktywne chymotrypsyny: seryna 195, histydyna 57 i asparaginian 102.

PODZIAŁ ENZYMÓWOXYDOREDUKTAZY

Katalizują reakcje utleniania i redukcji

TRANSFERAZY

Katalizują przenoszenie grup funkcyjnych (np. aldehydowych, ketonowych, acylowych)

HYDROLAZY

Katalizują hydrolizę np. peptydów, estrów, amidów

LIAZY

Katalizują reakcje addycji i eliminacji

IZOMERAZY

Katalizują racemizację, przenoszenie wiązań wielokrotnych, przekształcenie grup funkcyjnych

LIGAZY ( SYNTETAZY )

Katalizują tworzenie wiązań C - C, C- heteroatom (mają zastosowanie w syntezie organicznej )

KOENZYMY NIEZBĘDNE PODCZAS BIOTRANSFORMACJI

KOENZYM TYP REAKCJI

NAD+ / NADH usunięcie lub addycja wodoru

NADP+ / NADH jak wyżej

ATP /a fosforylacja

SAM C1 - alkilacja

Acetyl - CoA C2 - alkilacja

Flawiny utlenianie

Pyridoksal-fosforan transaminacja

Biotyna karboksylacja

Kompleksy

metaloporfirynowe

utlenianie

peroksydacja

a) Inne trójfosforany takie jak: GTP, CTP i UTP działaja podobnie.G - guanidyna; C - cytozyna; U - uracyl.

Oksyreduktazy

Katalizują reakcję utleniania i redukcji. Przykładem może być dehydrogenaza mleczanowa, która przekształca mleczan w pirogronian z udziałem NAD+ i odwrotnie z udziałem NADH

CC

CH3H OH

O O-

CC

CH3H O

O O-

NAD+ NADH + H+

dehydrogenazamleczanowa

mleczan pirogronian

UTLENIANIE ALKOHOLI ASPEKT STREOCHEMICZNY

AD

N

HD

R'

O

NH2+ C

D

OCH3N

O

NH2

R'

+ C

D

D

OHCH3

R’-adenozyno-difosforan rybozy

UTLENIANIE ALDEHYDÓW

LADROHH.Acc+OC

H

ORC OHH

ORHAccHCHO

Acc - grupa przyłączająca jon hydroniowy z utlenianej cząsteczki

UTLENIANIE PIERWSZORĘDOWYCH AMIN DO ALDEHYDÓW

HS

BSAO

HR

O

HR

HS

NH2

+

+Eox

Ered

BSAO - Bovine Serum Amine Oxidase

REAKCJE ALKINÓW I CYKLOPROPANÓWKATALIZOWANE HALOPEROKSIDAZĘ

CH3Cl

O

CHCl2

OCl Cl

O+ +

1 : 2 : 0,3

chloroperoksidaza

Cl- , H2O2

+

chloroperoksidaza BrO

CHBr2

O

Br-, H2O2

chloroperoksidazaR

X-, H2O2R

OH X

R = CH3, X = ClR = Ph, X = Br

HALOGENACJA ZWIĄZKÓW AROMATYCZNYCH

chloroperoksidaza

NH2

Cl

NH2

Cl

Br

Br-, H2O2

p-chloroanalina 2-bromo-4-chloroanilina

chloroperoksidaza

Br-, H2O2N

SAcHN

N

SAcHN Br

N-acetylo-2-bromotiazolN-acetylo-tiazol

OTRZYMYWANIE HALOHYDRYN Z ALKENÓW

JOH

OH

J+

90 : 10

chloroperoksidaza

J- , H2O2

Br

OH

OH

Br

Br

OHHO

Br

bromoperoksidaza

Br-, H2O2

90 : 10 ślady

chloroperoksidaza

Br-, H2O2

OOH

Br

O O

HO

Br

chloroperoksidaza

Br-, H2O2

rac rac

REAKCJA HALOGENOWANIAL-TYROZYNY Z UDZIAŁEM

ENZYMU CHLOROPEROKSYDAZY

COOH

HONH2

COOH

HONH2

Ichloroperoksydaza

H2O2, X-, bufor

gdzie X- = Cl -, Br -, I -

Transferazy

Przenoszą grupy chemiczne z substratu (dawcy) na produkt (biorca lub akceptor). Np. aminotransferaza alaninowa przenosi -NH2 z glutaminianu na pirogronian w wyniku czego powstaje alanina i α-ketoglutaran. Koenzymem jest fosforan pirodoksalu.

CH2CH2CCOO-

H NH3+

COO-

COO-CCH3

O+ CH2CH2CCOO-

O

COO-

COO-CCH3

NH3+H+

aminotransferaza alaninowa

PLP

glutaminian pirogronian α−ketoglutaran alanina

SYNTEZA DIHYDROKSYACETONU ZNAKOWANEGO FOSFOREM P- 32

CH2OH

C

CH2OH

O + AT P Fosforo-kinaza

+ AD P + H3232

CH2O P

C

CH2OHO

32

= fosforanP

Hydrolazy Hydrolizują wiązania np. amidowe, estrowe, itp.

Hydroliza peptydów i białek, kwasów nukleinowych

LiazyLiazy są enzymami, które katalizują reakcje addycji lub

eliminacji.

W wyniku reakcji eliminacji powstają dwa produkty. Jednym z nich jest najczęściej woda, amoniak, dwutlenek węgla, czy cząsteczka aldehydu, które odrywają się od substratu i w wyniku tej reakcji powstaje w produkcie podwójne wiązanie lub układ cykliczny.

Liazy dzielimy:

-ze względu na rodzaj powstającego produktu;

-ze względu na rodzaj użytego kofaktora.

LIAZYSą enzymami katalizującymi przekształcenie substratu, którym towarzyszy powstawania lub zanik wiązania podwójnego. Przykładem jest fumaraza – enzym cyklu kwasów trikarboksylowych, katalizujący odwracalną przemianę fumaranu w jabłczan. W tej reakcji powstaje lub zanika wiązanie podwójne

C

C

O O-

H

C

CO O-

H+ H2O

C

C

O O-

HHO

C

CO O-

H H

fumaran jabłczan

fumaraza

Addycja amoniaku do kwasu (E)-cynamonowego

COOH

NH2PhCOOH

PAL

T(or D)H

[3S-2H]-, or[3S-3H]-L-Phe

ADDYCJA WODY KATALIZOWANA PRZEZ FUMARAZĘ

e.e. 100 %X = H, Cl

fumarazaHOOC

COOH

X

OH

HH

XHOOC

COOHbufor

Kwas (chloro)fumarowy[trans(chloro)butanodiowy]

Kwas hydroksy(chloro)butanodiowy

Dekarboksylacja kwasów organicznych polega na rozerwaniu wiązania C-C, a jednym z jej produktów jest CO2.

Enzymatycznej dekarboksylacji ulegają cztery typy kwasów karboksylowych:

α-ketonokwasy β-ketonokwasy

R

O

COOHCOOH

R

O

aminokwasy

R COOH

NH2

hydroksykwasy

R COOH

OH

W wyniku enzymatycznej dekarboksylacji α-aminokwasów

powstają aminy biogenne.

R

NH2

COOH R

NH2

+ CO2enzym

Biogenne aminy spełniają doniosła rolę w metabolizmie organizmachżywych. Niektóre z nich wchodzą w skład błon organelli komórkowych.Są składnikami koenzymów, witamin, choliny.Pełnią rolę hormonów tkankowych, Pewne z nich są ważnymi neuroprzekaźnikami.

Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim

HOCOOH

NH2

CO2

HO

NH2

L-treonina propanoloamina

Składnik witaminy B12

HOCOOH

NH2

CO2HO

NH2

L-seryna etanoloamina

Składnik fosfatydów i choliny.

Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim

COOH

NH2

HOOCCO2

ΝΗ2

HOOC

kwas L-glutaminowy kwas χ-aminomasłowy

Produkt metabolizmu w mózgu.Neuroprzekaźnik

HSCOOH

NH2

CO2

cystamina

Składnik koenzymu A

L-cysteina

HS

NH2

Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim

COOH

NH2NH2

CO2

NH2 NH2

L-lizyna kadaweryna

Stabilizator rybosomów.Produk tmetabolizmu bakteriiprzewodu pokarmowego.

HOOCCOOH

NH2

CO2

HOOC

ΝΗ2

kwas L-asparginowy β−alanina

Składnik koenzymu A

Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim

HONH2

L-tyrozyna tyramina

Hormon tkankowypowoduje skurcze macicy

HO

COOH

NH2

histamina

Hormon tkankowyobniżający ciśnienie

L-histydyna

CO2

NNH NH2

NNH

COOH

NH2

CO2

Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim

CO2

NH

COOH

NH2 NHNH2

L-tryptofan tryptamina

Hormon tkankowy

CO2

NH

COOH

NH2

HO

NHNH2

HO

serotonina

Hormon tkankowypodwyższający ciśnienie krwi,neuroprzekaźnik

5'-hydroksy-L-tryptofan

Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim

CO2

dopamina

Prekursor w syntezie melanin(naturalnych pigmentów zwierzęcych)oraz katecholoamin takich jak:noradrenaliny i adrenaliny tj. jednych z najważniejszych neuroprzekażników

HONH2

HO

HO

COOH

NH2

HO

L-DOPA

(3',5'-dihydroxyphenylalanine)

Stereospecyficzność enzymatycznej dekarboksylacji L-aminokwasów

R

NH2

COOH R

NH2

dekarboksylaza

H2O

R

NH2

COOHR

NH2

dekarboksylaza

D2O

T(S)

T(S)

R

NH2

COOH R

NH2

dekarboksylaza

T(S)

H(R)

H(S)

T(S)

H(S)

T(R)THO

D(R)

α−L-aminokwas

[2S-3H]-α−L-aminokwas

[2S-3H]-α−L-aminokwas [1S-

3H, 1R-2H]-α−amina

[1S-3H]-α−amina

[1R-3H]-α−amina

IZOMERAZYSą enzymami katalizującymi reakcje izomeryzacji. Przykładem może być jeden z enzymów glikolizy tj. izomeraza fosfotriozowa. Przekształca ona odwracalnie aldehyd 3-fosfoglicerolowy w fosfodihydroksyaceton.

CCC

O

OOH

H

HH

H

CCC O

OHH

H

OHH

H

PP izo meraza

fosfotriozo w a

aldehyd3-fos foglicerynowy

fos fodihydroks yaceton

SYNTETAZY czyli LIGAZYSą enzymami katalizującymi reakcje syntezy kosztem energii pochodzącej od ATP (lub innego nukleotydu trifosforanowego). Np.. Enzym syntetaza glutaminy wiąże amoniak z grupą γ-kar-boksylową kwasu glutaminowego, tworzac glutaminę. W reakcji zużuwa się jedna cząsteczka ATP.

CH2

CH2

C

CC

O

O O-

O-

NH3+H

CH2

CH2

C

CC

O

O O-

NH2

NH3+H

synte taza glutaminy

ATP ADP + Pi

glutaminian glutamina

KOENZYMY NIEZBĘDNE PODCZAS BIOTRANSFORMACJI

KOENZYM TYP REAKCJI

NAD+ / NADH usunięcie lub addycja wodoru

NADP+ / NADH jak wyżej

ATP /a fosforylacja

SAM C1 - alkilacja

Acetyl - CoA C2 - alkilacja

Flawiny utlenianie

Pyridoksal-fosforan transaminacja

Biotyna karboksylacja

Kompleksy

metaloporfirynowe

utlenianie

peroksydacja

a) Inne trójfosforany takie jak: GTP, CTP i UTP działaja podobnie.G - guanidyna; C - cytozyna; U - uracyl.

Koenzymy mogą być klasyfikowane zależnie od grupy, przeniesienie której ułatwiają

Koenzymy przenoszące wodór H:

NAD+, NADP+

FMN, FADKwas liponowyKoenzym Q

Koenzymy przenoszące inne grupy niż HCoA-SHPirofosforan tiaminyFosforan pirodoksaluKoenzymy folianoweBiotynaKoenzymy kobamidowe

Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy - NAD+

N

O

NH2

O

CH2 O P

O

O P O

O

O- O-

HOOH OCH2

OH OH

N

NN

N

NH2

amid kwasunikotynowego

ryboza ryboza

adenina

Przez przyłączenie fosforanu P

P

poprzez wiązanie estrowe

w miejscu wskazanym strzałką, powstaje fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP+)

Flawinomononukleotyd (FMN) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)

N

N

N

NH

CH2

H3C

H3C

C

C

C

C

O

O

H

H

H

H

H

N

N

N

NH

CH2

H3C

H3C

C

C

C

C

O

O

H

H

H

H

H

P P CH2

O

OH OH

N

NN

N

NH2

rybitolrybitol

ryboza

adenina

FAD

FMN

dimetyloizoalloksazyna dimetyloizoalloksazyna

P

Koenzym A (CoA)

Jest przenośnikiem grup acylowych (reszt kwasowych). W jego strukturze można wyróżnić trzy elementy składowe. - Nukleotyd difosforanowy – adenozynodifosforan (ADP)- Kwas pantotenowy (witaminaB5), będący połączeniem β-alaniny i kwasu pantoinowego- Cysteamina.

Cysteamina zawiera grupę –SH, która wytwarza wiązania tioestrowe z różnymi kwasami organicznymi. Na tej drodze powstająacylowe pochodne CoA, określane w skrócie jako acylo∼S-CoA.Ta forma zapisu acylowych pochodnych CoA ma na celu wskazanie, że miejscem wiązania grupy acylowej jest atom siarki, a połączenie pomiędzy siarkąCoA a grupą acylową (przedstawione falista kreską „∼”) jest wiązaniem bogatym w energię.Tą droga reszty kwasowe zostają aktywowane. W tej postaci mogą być substratami w syntezie różnych estrów np. acetocholiny, acylogliceroli, bądź włączać się do szlaków katabolicznych, takich jak: β-oksydacja kwasów tłuszczowych lub cykl kwasów trikarboksylowych.

Koenzym A

P CH2

O

O OH

N

NN

N

NH2

POHSCH2

CH2N

CCH2

CH2N

CCH

CO O

OHHH

CH2

CH3

CH3

cysteamina

kwas pantotenowy

kwas pantoinowy

β−alanina

P

Zaznaczono składniki koenzymu A oraz grupę –SH

będącą miejscem wiązania reszt acylowych

S-Adenozylometionina (SAM)Koenzym SAM jest przenościkiem –CH3 na różne akceptory. Po odłączeniu –CH3 powstaje S-adenozylohomocysteina zdolna do przyłączenia grupy mety-lowej i odtworzenia cząsteczki SAM

CH2

O

OH OH

N

NN

N

NH2

CH2

CH2

CH

C

+H3N

S

O O-

H3C

metionina

SAM

BiotynaKoenzym biotyna wiąże CO2 tworząc karboksybiotynę – substrat w reakcjachkarboksylacji. Jest to reakcja odwracalna.

S

NN

O

CH2 CH2 CH2 CH2 CO

OH

CO2

kwas walerianowy

BIOTYNA

Liponian/lipoamidTen tiokwas występuje w dwóch postaciach. W formie zredukowanej ma

dwie grupy –SH przy C6 i C8, a w formie utlenionej zawiera mostek disiarczkowy. GrupaCOO- jest połączona z enzymem przez wiązanie amidowe ε-NH2 reszty Lys, dlate-go koenzym jest zwany lipoamidem. Liponian jest przejściowym akcepto-rem grup acylowych w procesie oksydacyjnej dekarboksylacji α-aminokwasów.

CH2 CH2 CH CH2 CH2 CH2 CH2 CO

O-

CH2 CH2 CH CH2 CH2 CH2 CH2 CO

O-

S S

SH SH

+2H

-2Hliponian

dihydroliponian

Zastosowanie enzymów w praktyce medycznejEnzymy znajdują liczne praktyczne zastosowania w diagnostyce laboratoryjnej

wielu chorób; są odczynnikami laboratoryjnymi lub lekami.

Zastosowanie enzymów do naprawy materiału genetycznego komórki stwarza nowe możliwości leczenia wrodzonych wad metabolicznych i chorób nowotworowych.

Enzymy jako markery chorób.

Aktywność niektórych enzymów w tkankach i płynach ustrojowych zmienia się w przebiegu różnych chorób.

Na przykład aktywność aminotransferaz w osoczu krwi rośnie w przebiegu zawału mięśnia sercowego lub uszkodzenia wątroby.

Aktywność amylazy – enzymu rozkładającego skrobię – wzrasta u chorych na zapalenie trzustki.

Znaczenie diagnostyczne maja tez wzajemne relacje pomiędzy aktywnościami

określonych izoenzymów np.

-u ludzi zdrowych aktywność LDH-1 w osoczu krwi jest niższa niż LDH-2.

-u chorych z zawałem serca aktywność LDH-1 przewyższa aktywność LDH-2

Enzymy jako leki i odczynniki

Niektóre enzymy służą jako leki np.- Lipaza – enzym hydrolizujący tłuszcze – jest użyteczna w leczeniu niedomogi wydzielniczej trzustki.- Asparaginaza – enzym rozkładający asparaginę – jest przydatna w leczeniu białaczek.

Pewne enzymy służą jako odczynniki w praktyce laboratoryjnej np.- Ureaza może być zastosowana do oznaczania mocznika,- Dehydrogenaza mleczanowa - do oznaczania mleczanu.

Enzymy w biotechnologii i terapii genowej

Za pomocą nukleaz można wycinać wadliwe skonstruowane odcinki DNA, a powstałe ubytki wypełniać odpowiednimi fragmentami pochodzących z komórek zdrowych tego samego gatunku.

Zespalanie fragmentów DNA jest możliwe dzięki ligazom DNA.Stwarza to możliwość naprawy uszkodzonego genu i otwiera perspektywę rozwoju nowej dziedziny medycyny, określanej mianem terapii genowej.

Międzynarodowy kod enzymatycznyMiędzynarodowy kod enzymatyczny składa się z dwu liter i czterech

liczb oddzielonych kropkami. Jego schemat wygląda następująco: EC a.b.c.d.Symbol EC (enzyme code) oznacza, że liczby po nim dotyczą międzynarodowego kodu genetycznego.Liczba a określa numer klasy enzymu;Liczba b- numer podklasy w obrębie tej klasy;Liczba c- oznacza numer podpodklasy w obrębie podpodklasy;Liczba d -oznacza numer enzymu w obrębie wymienionej wcześniej popodpodklasy.

Każdemu dobrze poznanemu enzymowi, przypisano jego niepowtarzalny numer identyfikacyjny.

Na przykład dehydrogenaza mleczanowa ma numer kodowy EC1.1.1.27.Pierwsza liczba (1) oznacza, że enzym należy do klasy 1, jest więc oksydoreduktazą. Druga liczba (1) oznacza, że enzym należy do podklasy 1, obejmującej wszystkie oksydoreduktazy, które odłączają parę atomów wodoru od grupy H-C-OH. Trzecia liczba (1) oznacza, że enzym ten należy do podpodklasy 1, obejmującej wszystkie enzymy, które przekazuja wodory odłączone z grupy H-C-OH na NAD+. Czwarta liczba (27), to numer przyporządkowany temu enzymowi w obrębie podpodklasy EC.1.1.1

ENZYMY KINETYKAFORMALNA

Część II

Procesy metaboliczneKatabolizm

AnabolizmProcesy kataboliczne przekształcają składniki tkanek do mniejszych, prostszych

cząsteczek. Końcowymi produktami katabolizmu są bardzo proste substancje jak woda, dwutlenek węgla, amoniak, mocznik czy kwas moczowy.

Procesom katabolicznym (np.reakcje utleniania) towarzyszy uwalnianie energii i jest ona przetwarzana w formę użyteczną dla komórki. Jest magazynowana w postaci związków bogato energetycznych.

Procesy anaboliczne polegają na syntezie składników złożonych ze składników prostych wykorzystując energię uzyskaną z procesów katabolicznych. Synteza zachodząca w układzie biologicznym często nazywa się biosyntezą. W wyniku biosyntezy powstają z prostych związków wielkocząsteczkowe tj. białka, polisacharydy czy kwasy nukleinowe.

Większość energii zmagazynowanej w wiązaniach chemicznych składników odżywczych ulega rozproszeniu w postaci ciepła, dlatego masa pożywienia potrzebna organizmowi jest zdecydowanie większa niż łączna masa produktów, które mogą być wytworzone w procesach anabolicznych.

Entropia

Entropia, funkcja termodynamiczna, jest miarą uporządkowania układu.

Im większy jest stan nie uporządkowania (chaos), tym większa jest entropia układu.

Procesy anaboliczne prowadzą do wzrostu uporządkowania materii biologicznej.W tym przypadku entropia maleje

Procesy kataboliczne zmniejszają stopień uporządkowanie materii. W tym przypadku entropia wzrasta.

`Energia swobodna

Zawartość energii swobodnej w produktach reakcji jest niższa lub wyższa od jej zawartości w substratach reakcji. Różnica ta nosi nazwę zmiany energii swobodnej (∆G).

Wartość ta mierzona w standardowych warunkach (standardowych warunkach tj. wtedy gdy stężenie substratów wynosi 1M, pH 7,0) nosi nazwę standardowej zmiany energii swobodnej i jest określana symbolem ∆G0.

A+ B ↔ C + D

[A][B][C][D]K =

]][[]][[lnG 0

BADCRT−=∆

∆G0 =- RTlnK = -2,303 RTlogKZ powyższego równania wynika, że przy stałej temperaturze ∆G0 zależy wyłącznie od od K.

Jeżeli K = 1, to ∆G0 = 0. Nie zachodzi żadna reakcja lub przebiega ona w obu kierunkach z taką samąszybkością.

Energia swobodna cd. Jeżeli w stanie równowagi iloczyn stężeń produktów jest większy niż iloczyn stężeń

substratów, to stała równowagi K jest wyższa od 1, a ∆G0 ma wartość ujemną. Oznacza to, że reakcja jest egzoergiczna. Reakcja jest spontaniczna i zachodzi tak długo, aż ∆G0 osiągnie wartośćzerową. Ustala się wtedy stan równowagi.

Jeżeli w stanie równowagi iloczyn stężeń produktów C i D jest niższy od iloczynu stężeńsubstratów to stała równowagi K jest niższa od 1, a ∆G0 ma wartość dodatnią. Oznacza to ze reakcja przebiega z pobieraniem energii, jest endoergiczna i nie zachodzi spontanicznie w kierunku A + B →C + D.

W odwracalnej reakcji wartość bezwzględna a ∆G0 w obydwu kierunkach jest jednakowa tylko różni się znakiem.

Jeżeli ∆G0 ma wartość ujemną , nosi nazwę termodynamicznie korzystnej. Może ona zachodzić samorzutnie.

Jeżeli dla reakcji wartość ∆G0 jest dodatnia, to ta reakcja jest termodynamicznie niekorzystna. Nie może zajść spontanicznie. W organizmie zachodzą reakcje obydwu rodzajów. Reakcje termodynamicznie niekorzystne są „napędzane” reakcjami termodynamicznie korzystnymi.

Efekt termodynamiczny reakcji

A (substrat) ---→ B (produkt) C (substrat) ---→ D (produkt)

∆G < 0

Stanpoczątkowy

A

G G

∆G > 0

Stankońcowy

D

B Stanpoczątkowy

Stankońcowy C

Przebieg reakcji Przebieg reakcjiReakcja termodynamiczniekorzystna

Reakcja termodynamicznieniekorzystna

Addytywność zmian energii swobodnej

Zmiany wolnej energii, towarzyszące następującym po sobie reakcjom, sumują się. Określa się to mianem addytywności zmian wolnej energii.

W organizmie funkcjonują ciągi reakcji enzymatycznych, których celem jest wieloetapowe przekształcenie substratów w określone produkty.

Substrat A, pod działaniem enzymu a przechodzi w produkt B, a ten staje się substratem do enzymu b, który przekształca go w produkt C itd.

Dzięki addytywnej właściwości wolnej energii szlak metaboliczny może funkcjonować w kierunku: A→B →C→D→ dopóki suma ∆G0 wszystkich reakcji składowych jest ujemna. Może to występować także wtedy, gdy niektóre reakcje z reakcji cząstkowych wykazują ∆G0 dodatnie.

Przykładem takiego szlaku metabolicznego jest glikoliza.

Reakcja przebiegająca z enzymem i bez udziału enzymu

Stanpoczątkowy

Ga ← bez enzymu

Ga ← z enzymem

G

Stankońcowy

Przebieg reakcji

FORMALNA KINETYKA REAKCJI KATALIZOWANYCH PRZEZ ENZYMY (1)

E + S k

k ES produkty

k 1.1 +1

-1

+2

v(szybkość) = k +2[ ES ] 1.2

Jeżeli oznaczymy Ks jako stałą równowagi dysocjacji kompleksu ES na E i S, i jeżeli przez [E'] oznaczymy początkowe stężenie enzymu; wtedy stężenie wolnego enzymu wynosi ([E'] - [ES]). Wówczas:

1.3 [ES][ES])[S] - ([E][S] [E] = ]ES[

Ks =

Z równania 1.2 otrzymujemy:1.4

[ES][S]) [ES] -([E][S] =sK

1.5

][K + 1

][k = s

2+

S

Ev

FORMALNA KINETYKA REAKCJI KATALIZOWANYCH PRZEZ ENZYMY (2)

Kiedy stężenie substratu jest bardzo duże, wtedy równanie (1.5) określa maksymalną szybkość reakcji V i zbliża się do wyrażenia

V = k [E' ]+2

Wstawiając to wyrażenie na V do równania (1.5) otrzymujemy

v = V

1 + K[S]

s

1.6

Jest to równanie Michaelisa - Menten'a

Stałą Michaelisa , Km, definiuje się jako takie stężenie [S], przy którym osiąga się połowęszybkości maksymalnej V. Wartość Km można otrzymać eksperymentalnie z (1.6) Chociaż jest możliwe wyznaczyć Km z wykresu, lecz dokładność jest mała, ze względu na asymptotyczny charakter zależności. W praktyce preferuje się stosowanie równania (1.7) otrzymanego przez przekształcenie (1.6):

1v

= 1[S]

KV

+ 1V

m 1.7

WYKRES MICHAELISA- MENTEN’A

Km

V/2

stężenie substratu [ S ]

Zależność szybkości reakcji v od stężenia substratu [S] w warunkach stałego stężenia enzymu. Przy wysokich stężeniach substratu szybkość reakcji v osiąga wartość maksymalną V. Kmrówna się stężeniu substratu przy wartości v = 0.5 V.

WYKRES LINEWEAVERA - BURK’A ( podwójne odwrotności)

1/v

nachylenie = K / Vm

odcięta = 1 / Vodcięta = -1 / Km

1 / [ S]

Zależność 1/v od 1/[S] dla reakcji katalizowanej enzymatycznie opisanej równaniem Michaelis-Menten’a

Zgodnie z kinetyką Michaelisa-Menten’a, Km = Ks. Wobec tego Km jest bezpośrednią miarąsiły wiązania między enzymem a substratem.

Powyższy wykres jest też bardzo użyteczny do badania inhibicji w reakcjach enzymatycznych.

Zależność prędkości reakcji enzymatycznej (V) od temperatury

10 20 30 40 50

Temperatura [oC]

V

Zależność prędkości reakcji katalizowanych przez niektóre enzymy od pH

2 4 6 8 10 pH

Vpepsyna

trypsynaamylaza

Przykładowe wartości stałej Michaelisa

2,5 × 10-2mocznikUreaza

1,2 × 10-2CO2Anhydraza węglanowa

4,0 × 10-3laktozaβ-Galaktozydaza

9,5 × 10-5acetylocholinaEsteraza acetylocholinowa

5,0 × 10-5benzylopenicylinaPenicylinaza

5,0 × 10-6fumaranFumaraza

KM [mol/L]SubstratEnzym

Efektory allosteryczneEfektory allosteryczne są drobno cząsteczkowymi metabolitami, które łącząc się z białkiem enzymatycznym modyfikują jego strukturę czwartorzędową, a niekiedy strukturę trzeciorzędową. Efektem tego jest zmiana powinowactwa enzymu do substratu, co skutkuje zmianą wartości Km .

Enzymy podatne na działanie tych efektorów noszą nazwę efektorów allosterycznych.

Powoduje to zmianę wykresu Michaelisa- Mentena.

Efektory allosteryczne dzielą się na dodatnie (aktywatory allosteryczne) iujemne (inhibitory allosteryczne).

Aktywator allosteryczny sprawia,że prędkość maksymalna reakcji zostaje osiągnięta przy niższym pH. Wartość Km maleje. Inhibitor allosteryczny powoduje efekt odwrotny. Wartość Km wzrasta.

Wykresy Michaelisa- Mentena (A)i Lineweavera--Burka (B) dla reakcjiz udziałem inhibitora kompetycyjnego

Vmax

Vmax2

A

KM KM(i) [S]

(-) inhibitor

(+)inhibitor

(-) inhibitor

(+)inhibitor

1/Vmax = 1/Vmax(i)

[S]-1/KM 1/KM(i)

B

Wykresy Michaelisa- Mentena (A)i Lineweavera--Burka (B) dla reakcjiz udziałem inhibitora niekompetycyjnego

Vmax

Vmax/2

Vmax(i)

Vma(i)

2

(-) inhibitor

(+) inhibitor

A

V

KM=KM(i) [S]

(-) inhibitor

(+) inhibitor

1/V

[S]1/KM = 1/KM(i)

B

1/Vmax(i)

1/Vmax

Różnice między inhibitorami kompetycyjnymi i niekompetycyjnymi

Bez zmianwzrastaKM

malejeBez zmianVmax

Inhibicja nieodwracalna przez wzrost stężenia substratu

Inhibicja odwracalna przez wzrost stężenia substratu

Odwracalnośćinhibicji

Poza miejscem aktywnym

Miejsce aktywneMiejsce wiązania

Niepodobny do substratuPodobny do substratuBudowa

Inhibitor niekompetycyjny

Inhibitor kompetycyjny

Wykres Michaelisa-Menten zależności V od [S] glukozydla heksokinazy (H) i glukokinazy (G)

Vmax(H)/2

Vmax(G)/2

V

[S]KM(H) KM(G) glukoza

heksokinaza

glukokinaza

Część III

BADANIA MECHANIZMÓW REAKCJI

Mechanizm reakcji

Mechanizm opisuje przebieg reakcji chemicznej. Mówi on o tym:

a) które wiązania ulegają pęknięciu,b) jakie wiązania się się tworzą, c) jaka jest kolejność tych zjawisk,d) z ilu etapów składa się rozpatrywany proces,e) jakie są względne szybkości poszczególnych etapów

Poznanie odpowiedzi na te pytania jest często bardzo trudnym zadaniem.Szczególnie może to być skomplikowane w przypadku reakcji enzymaty-cznych, ze względu na złożoną strukturę enzymu i zachodzące procesy katalityczne.

Metody wyznaczania mechanizmów reakcji

1. Badanie produktów produktów reakcji:• identyfikacja,• dowody stereochemiczne.

2. Badanie produktów pośrednich:• izolacja produktów pośrednich,• wykrywanie produktów pośrednich (metody spektroskopowe i rezonansowe),• wychwycenie produktów pośrednich (przy założeniu, że produkt pośredni będzie reagować

z danym reagentem dając ściśle określony produkt),• dodatek oczekiwanego produku pośredniego.

3. Badania kinetyczne:• równanie kinetyczne (mechanizm musi objaśniać obserwowane równanie i rząd reakcji),• badania katalizy (również inhibicji),• efekty izotopowe.

4. Stosowanie cząsteczek znakowanych izotopowo (analiza produktów takimi technikami, jak MS, NMR itp.).

Kinetyczny efekt izotopowyk1

A + 1B ------------→ A1Bk2

A + 2B ------------→ A2B

k1 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego (1B)k2 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego (2B)

KIE odwrotny 1

KIE jest 1

KIE ma nie 1

π

φ

2

1

2

1

2

1

kk

kk

kk

=

Kinetyczny efekt izotopowy

Jednym z najpotężniejszych narzędzi w badaniu mechanizmów reakcji jest metoda kinetycznego efektu izotopowego. Jest ona bardzo często stosowana do badania mechanizmów reakcji enzymatycznych.

Teoretyczne wyjaśnienie kinetycznych efektów izotopowych jest złożonym i trudnym zadaniem. Z praktycznego punktu widzenia istotne jest jedynie uzmysłowienie sensu fizycznego tego zjawiska. Zastąpienie atomu pierwiastka, w cząsteczce związku biorącym udział w reakcji, na jego cięższy izotop często powoduje zmianę szybkości reakcji.

Różna szybkość tych dwóch reakcji jest nazywana kinetycznym efektem izotopowym i określa się ją jako stosunek stałych szybkości:

kiz. lżejszego / kiz. cięższego

Różnica ta wynika z tego, że energia oscylacyjna wiązania chemicznego na najniższym możliwym poziomie (zero-point energy) nie jest zerowa (wynosi: E = hυ) i zależy od masy zredukowanej:

µ = 21

21

mmmm

+

zgodnie z prawem Hook’a:

µ≈

k21

υ

(k- stała siłowa niezależna od masy).

Z tego wynika że wiązanie z cięższym izotopem będzie miało niższą energię oscylacji i rozerwanie wiązania będzie wymagało większej energii.

Obrazowo przedstawiono to na poniższym schemacie:

Energia dysocjacji wiązań C-H i C-D

Ta właśnie różnica w energiach dysocjacji jest powodem różnych szybkości procesów z udziałem izotopów. Efekt izotopowy obserwujemy jedynie wówczas, gdy rozpatrywany etap jest wystarczająco wolny, aby mieć decydujący wpływ na szybkość całego procesu.

Kinetyczne efekty izotopowe. Najważniejsze kryteria podziału.

1. Podział KEI ze względu na wielkość stosunku

heavier.is

lighter.is

kk

• efekty normalne, występują wówczas gdy szybkość reakcji dla związku z izotopem lżejszym jest większa niż dla związku z izotopem cięższym

heavieris

lighteris

kk

.

. > 1

• brak efektu izotopowego

heavieris

lighteris

kk

.

. = 1

• efekty odwrotne (obserwowane rzadko) gdy:

heavieris

lighteris

kk

.

. < 1

2. Podział KEI ze względu na położenie znacznika izotopowego w stosunku domiejsca w cząsteczce, gdzie zachodzi etap determinujący szybkość reakcji:

a) pierwszorzędowe,b) α−drugorzędowec) β−drugorzędowe

Na przykładzie mechanizmu E1 można wyjaśnić te efekty.Według tego mechanizmu, najwolniejszym etapem jest rozerwanie wiązania pomiędzy atomem węgla a grupą X (odchodzącą), co prowadzi do utworzenia karbokationu. Ten etap będzie decydował o szybkości całego procesu. W związku z tym podstawienie atomu 12C1izotopem 14C spowolni reakcję. Taki efekt izotopowy jest nazywany efektem pierwszo-rzędowym. Analogicznie dla wodoru H2 wystąpi efekt α−drugorzędowy, a dla wodoru H3

wystąpi efekt β−drugorzędowy.

C C 1

H 3

H X

H 2

HHC C

+1

H 3

H

H 2

H H

C C+1

H 3

H

H H

H 2

C C 1

H 3 H 2

HH

wolno

szybko

Mechanizm E1

3. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe

• substratowe – występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratupowoduje zmianę szybkości reakcji,

• rozpuszczalnikowe – występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np. • z H2O na D2O powoduje zmianę szybkości reakcji.

4. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie wzmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych:

kinetyczne efekty izotopowe na Vmax

kinetyczne efekty izotopowe na Vmax /Km

4. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe

• substratowe – występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratupowoduje zmianę szybkości reakcji,

• rozpuszczalnikowe – występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np. • z H2O na D2O powoduje zmianę szybkości reakcji.

5. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie wzmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych:

kinetyczne efekty izotopowe na Vmax

kinetyczne efekty izotopowe na Vmax /Km

METODY WYZNACZANIA KINETYCZNYCH EFEKTÓW IZOTOPOWYCH

1. Bezpośrednie wyznaczanie kinetycznych efektówizotopowych.

2. Metoda zaburzeń równowagi.

3. Metody z użyciem spektrometrii mas.

Wyznaczanie KIE wg równań Bigeleisena i Wolsgerga

)1ln(

)1ln(

])1(

)1(1ln[

)111ln( 0

0

0

0

fRRf

RRRfR

RRf

p

p

p

p

−

∗−≈

+∗+∗∗

−

++

∗−=α

)1ln(

)1(ln

)1()1()1(ln

1)1()1(ln 0

0

0

0

fR

Rf

RRRfR

RRf

s

s

s

s

−

∗−

≈

+∗+∗−∗

++∗−

=α

])1(

)(1

1ln[

])1(

)(1

1ln[

])1()1(

)(1

1ln[

])1()1(

)(1

1ln[

ps

sp

p

sp

ps

sp

p

sp

RRfRRf

f

RfRRf

f

RRfRRf

f

RfRRf

f

∗∗−−∗

−−

∗−−∗

−−

≈

+∗∗−−∗

−−

+∗−−∗

−−

=α

0

0

0

)()(

ln

ln

RRRRRR

RRRR

sp

sp

sp

p

∗−∗−

−−

=α

- R0 - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w substracie przed rozpoczęciem reakcji,

- Rp - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w produkcie w chwili, gdy stopień przereagowania wynosi f,

- Rs - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w substracie, gdy stopień przereagowania wynosi f,

- f - stopień przereagowania.- α - kinetyczny efekt izotopowy,

Zakładany mechanizm eliminacji amoniaku i odtworzenie miejsca aktywnego

NNR

O

NH3+

NNR

O

NH2+

NNR

O

NNR

O

NH2

Enzym

+CO2

-

Enzym

Enzym

CO2-

Enzym

CO2-

+ NH3

a) b)

c)a ) Addycja Michae lab) β−e liminacjac) odtworzenie dehydroa laniny przez β-e liminację

+

Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany przez Havir’a i Hanson’a

BH

NH

O

NH

H

HNH2

HPh

B

BH

HNH2+

HPh

NH

OH

NH

H H

B

B

HNH2+

Ph

NH

OH

NH

H H

H

HB B

Ph

HB

NH2NH

OH

NH

H H

+

COO-

Re

Si

:-

COO-

Re

Si

:-

COO-

Re-

:

:

COO-

:

Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany przez Schuster’a i Retey’a

NH

NH

OH+

COOH H

NH3+

H

NH

NH

OH

COOH H

NH3+

H

B

NH

NH

OH

COO

NH3+

H

HBNH

NH

OH+

COO

HB

-Re Si -Re Si

+

:

-

+

-

NH3

+

Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji 3-pro-S L-tyrozyny

Liaza fenyloalaninowa katalizuje również eliminację amoniaku z L-tyrozyny, co

pozwala na zbadanie wpływu grupy elektrodonorowej na wielkość kinetycznego efektu izotopowego w tej reakcji. Nie można jednocześnie wykluczyć, że reakcja eliminacji z udziałem L-tyrozyny przebiega według innego mechanizmu. Potwierdzeniem takiej tezy byłby wynik znacząco różny od otrzymanego dla L-Phe, czyli na przykład brak efektu lub duży efekt.

C14

NH2

T

OH

OOH C14

OH

OOHPALpH = 8,7, 30 oC + NH2T

Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji orto pierścienia aromatycznego L-fenyloalaniny

C14

OH

O

NH2

T

T

C14

OH

O

T

T

NH3

PAL

pH = 8,7 +

Wyniki badań kinetycznego efektu izotopowego H/T w pozycji 2 i 6 pierścienia aromatycznego L-fenyloalaniny.

Nr eksperymentu –

nr frakcji

Stopień

przereagowania [%] KEI

1-1 5,89 0,8595

1-2 9,32 0,9664

1-3 12,09 1,0254

1-4 13,86 1,0870

1-5 16,22 1,0991

2-1 9,95 1,0143

2-2 12,34 1,0354

2-3 19,70 1,1559

2-4 21,82 1,1591

2-5 24,12 1,1598

Kinetyczny efekt izotopowy 12C/14C w pozycji 2 L-Phe

CH

OH

O

CH

OH

O

NH2

*PALpH = 8,7

*

Kinetyczny efekt izotopowy 12C/14C w pozycji 2 L-fenyloalaniny

Nr eksp.* R0, Rp, f R0, Rr, f Rp, Rr, f R0, Rr, Rp Średnia

1 0.9957 1.0262 1.0003 0.9981 1.0051

2 0.9955 0.9918 0.9955 0.9955 0.9946

3 1.0095 0.9696 1.0020 1.0050 0.9965

4 1.0085 1.0044 1.0075 1.0078 1.0070

średnia 1.0023 0.9980 1.0013 1.0016 1.0008±0.0062±0.0019

Procedura wyznaczenie KEI H/T w pozycji 3-pro-R

Procedura postępowania dla każdej frakcji

C14

O

O

NH3+

T

Mieszanina reakcyjna pH=8,7

C14

O

OT

H+

C14

OH

O

NH3+

T

C14

OH

OT

Reakcja enzymatyczna zatrzymana pH=0-1

Ekstrakcja (Et2O)

Warstwa eterowa

C14

OH

O

NH3+

TWarstwa wodna

C14

OH

OT

Pomiar aktywnosci 14C (Ai)oraz stosunku aktywności 3H/14C Rp

Po wydzieleniu L-Phe zastosowana do następnego eksperymentu

Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnejMierzę aktywność (A 0) 14 C oraz stosunek aktywności 3H/14C (R0)

Mieszanina reakcyjna:enzym, L-Phe [1-14C, 3R-3H]bufor boranowy 0,2M pH = 8,7

Pobieram 5 frakcji (każda V1) o różnym stopniu przereagowania w zakresie od 10% do 20%

t1 t2 t3 t4t5

Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji 3-pro-R L-Phe

Nr Eksp. KEI Odchyleniestand.

1 1,0594 0,0215

2 1,0535 0,0187

3 1,0566 0,0151

4 1,0480 0,0167

5 1,0585 0,0193

Średnia 1,0552 0,0046

Procedura badania KEI w pozycji 3-pro-S L-Phe

Procedura postępowania dla każdej frakcji

C14

O

O

NH3+

T

Mieszanina reakcyjna pH=8,7

C14

O

O H+

C14

OH

O

NH3+

T

C14

OH

O

Reakcja enzymatyczna zatrzymana pH=0-1

Ekstrakcja (Et2O)

Warstwa eterowa

C14

OH

O

NH3+

TWarstwa wodna

C14

OH

O

Pomiar aktywnosci 14C (Ai)

Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnejMierzę aktywność (A 0) 14 C oraz stosunek aktywności 3H/14C (R0)

Mieszanina reakcyjna:enzym, L-Phe [1-14C, 3S-3H]bufor boranowy 0,2M pH = 8,7

Pobieram 5 frakcji (każda V1) o różnym stopniu przereagowania w zakresie od 10% do 20%

t1 t2 t3 t4t5

NH2T+NH3T

+NH3TKolumna jonowymienna Amberlit IR 120 (H+)

elucja H2O

H OT

C14

OH

O

NH3

+

T

0,3 M NH3

C14

OH

O

NH3+

TOdparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem Pomiar stosunku

aktywności 3H/14C (Rri)

Kinetyczny efekt izotopowy D/T w pozycji 3-pro-S L-Phe

Nr Eksp. KEI OdchylenieStand.

1 1,0750 0,0186

2 1,0953 0,0187

3 1,0899 0,0151

4 1,0734 0,0167

Średnia 1,0834 0,0109(1,01%)

Zależność Swain’a-Schaad’akk k

H

T D

= kH

1 44,

kk

D

T obl obs

⟨

3 26,

= kk

kk

H

T

H

T

α = α =

Gdzie: kH/kT - KIE dla 1H/3H.kH/kD - KIE dla 1H/2H.kD/kT - KIE dla 2H/3H.

Jeśli efekt 1H/3H, obliczony z efektów 1H/2H lub 2H/3H przy pomocy wspomnianych zależności, jest mniejszy od efektu zaobserwowanego, wtedy prawdopodobnie w reakcji następuje tunelowanie protonu.

Jeśli wartość wyliczonego KIE jest większa od zaobserwowanej, to mamy do czynienia ze złożonością kinetyczną, tzn. nie tylko etap odrywania protonu decyduje o szybkości reakcji.