1 2 2 1 1Anne Stamm , Sarah Strauß , Peter Vogt , Thomas Scheper , Iliyana Pepelanova

Zentrum für Angewandte ChemieInstitut für Technische ChemieCallinstr. 5 , 30167 Hannover

In Studien konnte gezeigt werden, dass die epidermalen Lipoxygenasen (eLOX) aus Homo sapiens und Ambystoma mexicanum (Axolotl)an der Regeneration der Epidermis beteiligt sind und einen positiven Einfluss auf die Wundheilung haben. In Säugern ist die epidermale Lipoxygenase ALOXe3 u. a. an der Regu-lation der Differenzierung von Keratinocyten beteiligt,im Axolotl hingegen konnte eine epidermale Lipoxygenase (AmbLOXe) nachgewiesen werden,

Ziel I

.

Produktion und Analyse epidermaler Lipoxygenasen mittels biotechnologischer Methoden

die vor allem während der Neuentwicklung der Gliedmaßen exprimiertwird. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass AmbLOXe eine

positive Wirkung auf die Wundheilungseigenschaften humaner Zellen hat. Aus diesen Gründen bieten

epidermale Lipoxygenasen ein vielversprechendes Werkzeug für unterschiedliche klinische An-

wendungen insbesondere in der narbenfreien Wundheilung.

Methoden & Ergebnisse

Zusammenfassung & Ausblick

Entwicklung eines

Wundheilungsassays mit

Proteinaggregaten

Nutzung de r P ro te inagg rega te (Inclusion Bodies) aus Escherichia coli

zur Gewinnung von funktionellem Enzym

Produktion und Aufreinigung der Proteine: Wundheilungsassays:

- Wundheilungsassay mit Inclusion Bodies konnte etabliert werden- Epidermale Lipoxygenasen zeigen Potential in der Wundheilung in in vitro

Experimenten

- Um bessere Reproduzierbarkeit zu erreichen, sollte das Design der Assays angepasst werden- Weitere Charakterisierung der Inclusion Bodies notwendig

Ziel II

Determininat ion der Wundhei l-ungseigenschaften der Enzyme ALOXe3 ( H . s a p i e n s ) und AmbLOXe ( A .

mexicanum) in Inclusion Bodies

Abbildung 1: Densitometrische Konzentrationsbe-stimmung anhand einer BSA Standard-reihe; Ausbeute an Inclusion Bodies (IBs): - ALOXe3 (83 kDa): 175 mg in 1 L Kulturbrühe- AmbLOXe (74 kDa): 171 mg in 1 L Kulturbrühe;Aufgetragen sind die aufgereinigten Fraktionen von ALOXe3 IBs und

AmbLOXe IBs

Abbildung 2: In Wundheilungsassays genutzte Zellverletzungs-

methoden [1](A) Scratch Assay(B) Stempeln(C) Thermales Verwunden(D) Elektrisches Verwunden mittels Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS)(E) Optisches Verwunden mittels eines Lasers

Bei den hier dargestellten Methoden handelt es sich um „echte“ Zellverletzungsmethoden, da die konfluente Zellschicht verletzt wird und nicht wie sonst häufig bei Migrationsassays lediglich eine Barriere für die Zellen besteht.

Abbildung 4: (D) ECISDie höchste verwendete Inclusion Body

Konzentration (0,5 µg) führt zur schnellsten Regeneration der konfluenten Zellschicht

Abbildung 3: (A) Scratch Assay(a) Verlauf des Scratch Assays über 12 Stunden(b) Wundgröße nach 12 Stunden für Wells mit unterschiedlichen ALOXe3 Inclusion Body

Konzentrationen (0 - 1,5 µg / Well)

(a)

0

200.000

400.000

600.000

800.000

1.000.000

1.200.000

1.400.000

0 0,01 0,1 0,5 1 1,5

Wundgröße (Pixel2)

ALOXe3 IB Konzenration pro Well [±g]

(b)

Danksagung:Diese Arbeit wurde als integraler Teil der BIOFABRICATION FOR NIFE Initiative durchgeführt, welche finanziell vom

Niedersächsischen Ministerium für Wissenschaft und Kultur und der VolkswagenStiftung unterstützt wird. (NIFE ist das

niedersächsische Zentrum für Biomedizintechnik, Implantatforschung und Entwicklung, ein translationeller Forschungsverbund der

Medizinischen Hochschule Hannover, der Leibniz Universität, der Tierärztlichen Hochschule und des Laser Zentrums Hannover.)

[1] Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., and Pepelanova, I. (2016). In vitro wound healing assays – state of the art, , 17, 79–87.

1Institut für Technische Chemie, Leibniz Universität Hannover2Klinik für Plastische, Ästhetische, Hand- und Wiederherstellungschirugie, Medizinische Hochschule Hannover

7000

8000

9000

10000

11000

12000

20 25 30 35 40 45 50 55

Impedanz [Ohm]

Zeit [h]

ALOXe3 0,01 ±g ALOXe3 0,1 ±g ALOXe3 0,5 ±g Unverletzte Zellen Keine Zellen

Zelllyse

Entfernung von Rückständen

und Waschschritte

Gereinigte Inclusion

Bodies

Inclusion Bodies:- Aggregation von nicht-gefaltetem, teilweise gefaltetem und korrekt gefaltetem Proteinà Reservoir für funktionelles Enzym - mechanisch stabil- Größe: 50 nm – 1µm

Steriltest

Virusfreie Proteinproduktion in

E. coli (InclusionBodies)

Wundheilungsassay