Zur biologischen Bedeutung der Phosphatester der roten Blutkörperchen

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    10-Jul-2016

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<ul><li><p>(Aus der Marburger Kinderklinik.) </p><p>Zur biologischen Bedeutung der Phosphatester der roten Blutk~irperchen. </p><p>Von </p><p>Ernst Freudenberg. Mit 2 Textabbildungen. </p><p>(Eingegangen am 13. Juli 1935.) </p><p>In neuerer Zeit hat die Frage nach der Bedeutung der Phosphates~er des Blutes steigendes Interesse gefunden, das sich zum Teil in metho- dischen Arbeiten (E. Miiller 1, Nissen~), zum Tefl bereits in Hinweisen auf die klinische Bedeutung dieser Phosphorverbindungen bei der Rachitis ausdriiekt (Rominger a). Stearns und. Warwag 4 teilen mit, dab sie 2 F~lle yon Sp~trachitis beobachteten, in denen die Esterffaktion vermindert war, naehdem schon 1932 Kay 5 eine Verminderung derselben in den roten BlutkSrperchen bei Rattenrachitis gefunden hatte. Zufiihrung yon D-Vitamin bewirkte einen sehr raschen Anstieg bei der Heilung. Nissen ~ berichtet, dal]er Herabsetzungen bei Rachitis und Tetanie sah. Meine Beobachtungen liegen, wie vorausgeschickt werden mag, ganz in gleicher Richtung, so daft die /riihere Au//assung, bei ttachitis sei ausschliefllich der anorganische Phosphor (a. P.) im K6rper vermindert, nieht mehr au]rechterhalten werden kann. </p><p>:Die Sicherung dieses Tatbestandes wurde dutch die methodisehen Verbessermlgen der obenangeffihrten Arbeiten erleichtert. :Die Benutzung des Stufenphotometers gegenfiber dem mit Amidol als Reduk~ionsmitSel erzielten blauen Farbton fanden wit sowohl bequemer als auch genauer als die Auswertung nach Briggs unter A_awendtmg des Colorimeters yon A utenrieth. </p><p>Der gesamte s~urel6sliche Phosphor des Vollblutes wurde in 1 ccm des Trichlor- essigs~urefiltrates durch nasse Veraschung nach _Fiske-Subbarow, anschlieBende Neutralisierung mittels 25%iger Lauge, Auffiillen auf 10 ccm und Versetzen yon 1 ecru dieser Verdiinnung mit 0,2 corn Trichloressigsaurel6sung vorgenommen, indem sod~nn wie beim a. P. nachE.Mi~ller 1 gearbeitet wurde. Es kam nur ttirudin- blur in Anwendung. Die Differenz des gesamts~urel6slichen P und des a.P. ist der hydrolysierbare P, der vorwiegend aus esterartig gebundenem P besteht, wie zuerst Rona und Iwasaki e erkannten. Die weitero Aufteilung dieser Verbindungen in ihre 3 Unterfraktionen wurde nicht ausgeftihrt. Wcnn bei den Versuchsans~tzen Phosphat zugesetzt wurde, kam ein entsprechend verkleinertes Blutvolumen (0,1 oder 0,2 ecm) zur Verarbeitung. </p><p>1. H~rkunft und Entst~ungsw~ise d~r P-Ester der roten Blut~rperchen. </p><p>Was die Verbreitung dieser Verbindungen im Blur angeht, so ist bekannt, dab sie nur in geringer Menge im mensehlichen Serum vor- </p></li><li><p>428 Ernst Freudenberg: </p><p>kommen, sehr reichlich aber in den roten BlutkSrperchen. Aus diesem Grunde kann ich reich nieht den Folgerungen anschliel~en, die Erantali ~ aus seinen interessanten Experimenten ableitet, in denen er Blutserum und enteiweiflte Serumfiltrate ultraviolett bestrahlte und hierdurch eine Vermehrung des a. P= erzielte, die naeh ihm auf Kosten des Ester-P (E.P.) im Blutserum gcht. Da, wie gesagt, diese Fraktion im menseh- lichen Serum nur wenige Milligramme, oft auch nur Bruehteile won Milligrammen pro 100 ccm an P betr~gt, kann ihr ffir den P-Stoffweehsel keine entscheidende Bedeutung zuerkannt werden. In der friiheren Literatur findet sieh sogar die Behauptung, der a. P. stimme mit dem s~urelSslichen P des Serums in den Fehlergrenzen fiberein: Als Vorrats- stapel ffir de.n a.P. kann diese d~qtige Reserve nicht dienen, denn der Bestand eines biologischen Depots rauB doch unter allen Umsts ein Mehrfaches der aktuellen Masse sein. Man denke an den zirkulierenden Traubenzucker, tier welt hinter den Glykogenstapein an Menge zurfick- tritt. </p><p>Es taucht die Frage auf, ob nieht der E.P. der BlutkSrperehen als ein Depot ffir den a.P. dient, das bei seiner Einstelhmg im Serum regu- lierend eingreift. Bevor dieser Grundfrage nachgegangen wird, erhebt sich aber die andere, woher der E.P. stammt, aus was und wo er gebildet wird. </p><p>I-Iierfiir stelle ich die folgende ttypothese zur Er6rterung. Die roten Blutzellen entstehen bekanntlieh aus den kernhaltigen Normoblasten im Knoehenmark. Kernhaltigkeit bedeutet die Anwesenheit yon Nukleo- tiden. Die , ,Karyolyse" muff also einen Abbau dieser Stoffe darstellen. Der Aufbau aus Kohlehydratphosphorsaure, an welche Basen (Purine, Pyrimidine) in Glykosidform gebunden sind, ergibt nun flit die M6glieh- keit der Entstehung einer Glycerinphosphorss den Weg, dab die Hexose wie bei der Glykolyse zwisehen dem 3. und 4. Kohlenstoffatom unter Oxydations- und Reduktionsvorg/iugen aufgespalten wird, wobei Glycerin entsteht. Wenn dagegen eine Abspaltung der Basengruppe attf fernaen- tativem Wege dutch Nuldeosidasen erfo]gt, so tritt ttexosephosphors~m'e als Abbauprodukt auf. Wenn die vorgetragene Hypothese zutreffen4 ist, mul3 sie sich reehnerisch begrfinden lassen. </p><p>Man kennt durch Ackermann s den P-GehalC der isolierten, gereinigten, getrockneten Vogelblutzellenkerne. Er betragt 3,93%. Fiir die Um- rechnung auf die wasserhaltige frische Substanz sei der durchschnitthche Wassergehalt jugendlieher Gewebe ohne Paraplasma won 80---85% angenommen. Dann ergeben sieh in den feuehten Zellkernen 0,588 bis 0,786% P. Es wird vorausgesetzt, dal~ der P in den Kernen tier Vogel- blutzellen and im Kern der menschlichen Normoblasten in gleieher Menge enthalten sei. Als Volumen normaler mensehlieher Erythrocyten gibt Barker 9 86__87tta an. Der Kerndurehmesser des Normoblasten werde auf die Hiilfte des Zelldurehmessers angenommen. Die Volumina </p></li><li><p>Zur biologischen Bedeutung der Phosphatester. 429 </p><p>verhalten sich dann wie 8 :1 . Dann ist das Kernvolumen 10,75# a. Das Volumen, welches die Kerne in 100 cem Blur einnehmen wiirden, wenn Normoblasten in einer Zahl yon 5 000 000 pro Kubikmillimeter start Normocyten zirkulieren wiirden, betriige: 10,75 10 -11 5 10 +1~ = 5,375 ecm. Man kann die Rechnung aueh unter Zugrmldelegung der Tatsache durchfiihren, dab das Volumen der roten Zellen in 100 ccm im Durehsehnitt 44 Gem betragt, dab sich das Gesamtzellvolumen zum Kernvolumen wie 87 zu 10,75 verhalt, so dab das Gesuchte imaginare Kernvolumen in 100 ccm Blur 5,44 ccm betragt. Es ergibt sich also fast die gleiche Zahl. Rechnet man, wie oben begriindet wurde, mit 0,588 bis 0,786% P in den genuinen Kernen, so ergibt die Benutzung der ersten Volumzahl 32--42 mg-% E.P. Der Betrag, der sich analytisch ergibt, ist im menschlichen Blur in der Norm 25--35 mg-% E.P., stellt also eine durchaus in der GrSBenordnung der Rechnung liegende Menge dar. Da fiir sie versehiedene Annahmen und Sch/itzungen n5tig waren, ist nur eine ungefahre Annitherung zu erwarten. Besonders sci darauf ver- wiesen, dab die Reinigung der Zellkerne Stoffe entfernt, wodurch der P-Gehalt steigt. DaB eine Ann/~herung aber tats/iehlich erreicht wird, daft als Stiitze der Hypothese angesehen werden. </p><p>2. Bedingungen des Zer/alls der P-Ester in den roten .Blutk6rperchen. </p><p>Die Ester zerfallen bei Aufbewahnmg yon dutch Hirudin ungerinnbar gemachtem Blur aui~erhalb des KSrpers bei steigenden Temperaturen in zunehmendem Mafle, wie neben- stehende Tabelle zeigt. </p><p>Angesichts der Tatsachc, dab beim einfachen Aufbewahren des Blutes, wie der Versuch zeigt, der E.P. rasch zerfs erhebt sich die Frage, was denn diesen Zerfall in vivo hemmt. Man k5nnte daran den.ken, dab sich die Phosphatase, die die Spaltung bewirkt, im Serum befindet und erst in die Blutzellen eindringen mul3, was na- tiirlieh unter abnormen Bedingungen auBerhalb des KSrpers eher mSg- lich sein wird. Dem ist </p><p>Tabelle 1. VenSses Hirudinblut 24 Stunden in Zentrifugengl~sern </p><p>steril aufbewahrt. </p><p>Temperatur a.P. rag-% t E.P. rag-% </p><p>40 4,77 29,73 200 7,04 27,36 37 o 20,89 13,81 </p><p>Tabelle 2. Blutkerperchen aus venSsem Hiru- d inbht dureh Zentr i fugieren und 3maliges Waschen mit KochsalzlSsung gewonnen, zu m </p><p>Vergleieh genuines Hirudinblut selbst. 24 Stunden bei 37 bzw. 40 . </p><p>Blutart I a.P. rag-% </p><p>Rote Blutk6rperchen bei 37 0 17,20 Rote Blutkfrperchen bei 40 ] 4,29 Vollblut bei 370 . . . . . 20,70 Vollblut bei 4 ~ . . . . . 4,65 </p><p>E.P. n~-% </p><p>13,50 26,49 13,10 30,05 </p><p>aber nicht so~ Phosphatase ist yon vornherein in den Erythrocyten ent- halten, wie der nebenstehende Versueh zeigt. </p></li><li><p>430 :Ernst Freudenberg: </p><p>])er P-Zuwachs im Versuch mit BlutkSrperchen betr/~gt also 12,91 rag-%, im Vollblut 16,05 rag-%. Es liegt mithin nut eine geringe Besserstellung des Vollblutes gegeniiber den isolierten Zellen vor. Es kann kein Zweifel daran entstehen, dal3 die Eryttu'oeyten selbst phos- phatasehaltig sind. </p><p>])ie n/~ehstdem zu erw/~gende MSglichkeit war die, dal~ in vivo eine Hemm~mg der Zerfallsreaktion vorliegt. Hierbei ist in erster Linie an die Zerfallsprodukt e selbst zu 4enken. Hemmt etwa ein erhShter Zucker- gehalt so, wie es Brugsch und Horst~rs lo und D~muth n fiir den Zerfall der tfexosephosphors/~ure angeben ? Es wurde Zucker selbst zugesetzt und Glykogen, aus welehem die Blutdiastase langsam ])extrose bildet. </p><p>Tabelle 3. </p><p>Blu tart </p><p>Venenblut mit ttirudin sofor~ untersucht . . . . . . . ]~benso, 24 Stunden bei 4 o aufbewahrt . . . . . . . . 2 Gem Blut+ 5 mg Glucose 24 Stunden bei 370 . . . . 2 ecm Blut+ 120 mg Glykogcn 24 iStunden bei 37 o . . </p><p>~. P, rag-% E.P. rag-% </p><p>4,67 29,53 4,70 28,89 </p><p>17,05 16,75 20,21 13,29 </p><p>])ieser Versuch l/~l~t eine Hemmang selbst dutch hohe Kohlehydrat- konzentrationen nieht erkennen. Als weiterer Gesiehtspunkt bei der Fahndung nach Reaktionshemmung diente die (~berlegung, dab in vivo das Blur immer wieder arterialisiert, d. h. frisch mit Sauerstoff beladen und yon Kohlens/s befreit wird. Konnte dies etwas ausmaehen? </p><p>Tabelle 4. </p><p>Bluta~ </p><p>Venenblut mi~ Hirudin sofort untersuch~ . . . . . . Ebenso, 6 Stunden bei 37 ~ zeitweise Luft durehgeleitet Ebenso, 6 Stunden bei 370, unter Kohlen~ure . . . . </p><p>a .P . E.P. rag-% rag-% </p><p>4,67 I 28,43 7,02 26,68 </p><p>14,10 19,39 </p><p>PlI </p><p>7,32 8,05 7,10 </p><p>])er Mechanismus war hiermit entdeckt. Die ArZ~rialisierung des Blutes hemmt die Phosphatolyse der Blutk6rperchen-P.Ester in vivo. </p><p>])er Versuch wurde wiederho]t, indem start Luft Sauerstoff durch- ge]eitet wurde. ])as Ergebnis war das gleiche, ieh verziehte daher auf Wiedergabe des Versuches. ])ie ])eutung der gemachten Beobachtung war abet noeh often. Es konnte ein p~-Effekt vor]iegen, und es konnte ein spezifischer KohIenss die Phosphatolyse fSrdern bzw. ent- hemmen. ])ir erste Vorstellung ist sehr unwahrscheinlich. Phosphatasen wirken nach Robison und vielen anderen im allgemeinen bei PE 8 und in der NiChe dieser Reaktionsstufe am besten. ])a13 die Verschiebung nach p~ 7,1 fSrdern soUte, w~hrend bei pH 8 eine starlre Hemmun~ vorliegt, ist daher unverst~ndlieh, wenn man die KohlensiiurefSrderung </p></li><li><p>Zur biologischen Bedeutung der Phosphatester. 431 </p><p>dutch direkte pH-Einwirkung auf den ~ermentprozeB erkl~ren will. Im folgenden Versueh wurde auger der Kohlens~ureprobe auch eine Probe mi~ Essigss angesetzt, eine dritte Probe mit Biearbonatzusatz. </p><p>.Tabelle 5. Je 3 ccm I-I irudinvollblut mit den im folgendon angefi ihrten Zus~tzen werden 8 8tunden bei37 ~ bebrfitet. </p><p>a .P . E.P. I PH Zu~vachs Zusatz ing-% rag-% an a. P. T </p><p>0,5 cem l~atriumbicarbonat 1,3%]g . . . . . 7,17 26,33 I 7,94 2,37 I </p><p>0,5 ccm Essigs~ure 0,9%ig . . . . . . . . 13,71 19,99 I 7,08 9,01 0,5 ccm Kochsalzl~sung ~- C02-A~mosph~re . 16,14 17,26 7,10 11,44 </p><p>Hieraus ergibt sich, dab Essigs~ure sozusagen dig Kohlens~ure ersetzt und dab Natriumbiearbonat wie die Durchlfiftung des Blutes wirkt. Im ersten Fall erfo]gt Phosphatolyse, im zweiten Hemmung. Wieder kSnnte man hierin eine Best~tigung dafiir sehen, dab die aktuelle Reaktion in unmittelbarem Einflu~ auf den ~ermentprozel~ entscheidend sei. Ehe dies angenommen wttrde, sollte ers~ ermittelt werden, in welcher Weise zunehmende, durch Biearbonatzust~nde bewirkte Alkalit~t hemmt. </p><p>Tabelle 6. 3 ccm venSses t I i rudinblut werden mit steigenden Mengen einer 1,3%igen BicarbonatlSsung versetzt, und das Volumen jeweils mit KochsalzlSsung ausgegllchen, hierauf 8 Stunden bei 37 ~ aufbewahrt. </p><p>Bicarbonatzusatz 0,1 ccm 0,2 ccm 0,3 ccm 0,4 ccm </p><p>pn am Versuchsende . . a.P. mg-% . . . . . . F,.p. rag-% . . . . . . </p><p>7,38 7,02 </p><p>26,48 </p><p>7,63 8,54 </p><p>24,86 </p><p>7,76 8,24 </p><p>25,16 </p><p>7,85 8,85 </p><p>24,85 </p><p>Hieraus ist ersichtlich, dal~ der Verlauf der p~-Kurve yon 7,38 nach 7,85 keinen Einflu~ auf die Phosphatolyse nimmt, die iiberall gleich- m~Big sehwach ist. Wie die frfiheren Versuche zeigten, springt sie bei Ss rasch an, sobald p~ sich unter 7,30 senkt. </p><p>Zum Verst~ndnis, was dies bedeutet, tr~gt ein Blick auf die Zeitkurve der Phosphatolyse bei; die in der Abb. 1 dargestellt ist. Die Spaltung im offenen Gef~fi und unter Kohlens~ureatmosph~re sind in dieser Kurvendarstellung verglichen. Unter Kohlens~ure tritt sie raseh ein, ohne solche macht sich eine deutliche Phase einer anf~nglichen VerzSge- rung yon 3 Stunden bemerkbar. In Abb. 2 dauert diese Phase sogar 4 Stunden. Der Verlauf dieser Kurven ist S-fSrmig. Die chemische Kinetik kennt solehe Verl~ufe yon der Autokatalyse her, bei welcher ein Reak~ionsprodukt selbst beschleunigend wirkt, bis sich durch Substrat- erschSpfung Ver]angsamungen bemerkbar machen. Genau so wie dort das allm~hliche Auftreten eines Katalysators wird sich aber auch die Entfernung tines Hemmungsk5rpers auswirken miissen. Die Phosphato- </p><p>Zeitschrift fiir :ILinderheilkunde. 57. 29 </p></li><li><p>482 Ernst :Freudenberg: </p><p>lyse der Hexosediphosphorskure wird nach Demuth ~o dutch Phosphate gehemm~. Das Eingr~i/~n der Kohlensliur~ und ander~r in den Erythro. cyte, n eindring~nde, r S~iuren bei d~r Phosphatolys~ stelle ich mir so vor, daft sie iiber den seit 38 Jahren bekannten and in den einsehl~igigen Lehr- biiehern besehriebenen ,,Anionenaustausch" wirkt (vgl. HamburllerZ*): Bekanntlich besagt dieser Vorgang folgendes: Worm I(ohlens~ure dutch Blur geleite~ wird, so dringt C1 in die Erythroeyten ein, Bicarbonat verl~l~t sie hn Austauseh, wie dies zuerst </p><p>181 l C02"Afmos. ,. ,~h, Cr~ I unt, r/.uffim %~. ,/ , / </p><p>1 . / </p><p>/ </p><p>i/ / R / ....... </p><p>/ ~ ...... ~'l#~rd~W)i ~ </p><p>Abb. Z. Phosphatolyse in H i ru4 inb lu t yon e inem Erwachsenen. </p><p>~ss </p><p>ein Pi~diater, n~mlich Koepps, </p><p>~6 / ,I </p><p>l~ I 16 //~ 15 I , </p><p>/ / " / j ; </p><p>A </p><p>5 0 2 r 6 6 l#~Td. </p><p>Abb. 2, Phosphatolyse in Hirlldinblut~ yon oinem Fall sohwerer :Rachitis. A vor Bo- handlung, Bl nach Behandlung, B, ebenso </p><p>unter C02. </p><p>richtig erkl~rt hat. Ieh mache nun die Annahme, dab ebenso wie Bi- carbonat auch Phospha~ auswandert, indem es dutch Chlorid verdr~ng~ wird. Dutch die Herausdr~ngung des Phosphates wird das Gleichgewich~ des a.P. zum E.P. gestSrt, der Ester beginnt zu zeffallen. ])as ent- stehende Phosphat wird erneut unter Einwirkung der Kohlenss ver- dr~ngt, indem Chlor einwander~, ~md so geh~ der Spal~ungsprozeB weiter. Setzt man Bicarbonat im Oberschu~ zu, so wh.d der Austanseh ebenso gehemmt wie durch Phosphat. Die I)urehleittmg yon Luft oder Sauer- scoff wirken gegensinnig, indem sie Koh]ens~ure entfernen. </p><p>Wie kann aber der Ester im Hirudinb]ut zerfallen, das sich selbs~ iiberlassen bleibt ? Die: Antwort lautet, dadureh, dal~ hierbei die Glyko- lyse in der entstehende...</p></li></ul>

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