Upload
truongdieu
View
237
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Zur Methodik derPlanar-ChromatographieZur Methodik derPlanar-Chromatographie
2
Planar-ChromatographiePlanar-Chromatographie
Wir benutzen “Planar-Chromatographie“ als
Synonym für:
• Moderne Dünnschicht-Chromatographie
• Instrumentelle Dünnschicht-Chromatographie
• Hochleistungs-Dünnschicht-Chromatographie
• DC/HPTLC
Wir benutzen “Planar-Chromatographie“ als
Synonym für:
• Moderne Dünnschicht-Chromatographie
• Instrumentelle Dünnschicht-Chromatographie
• Hochleistungs-Dünnschicht-Chromatographie
• DC/HPTLC
3
Warum heute Planar-Chromatographie?Warum heute Planar-Chromatographie?
Schnell
Zuverlässig
Kostengünstig
Extrem flexibel
GLP-konform
Übersichtlich
Sehr gut dokumentierbar
Schnell
Zuverlässig
Kostengünstig
Extrem flexibel
GLP-konform
Übersichtlich
Sehr gut dokumentierbar
4
EinsatzgebieteEinsatzgebiete
Forschung und Entwicklung• Screening• Qualitative Analyse• Prozessentwicklung und -optimierung• Mikropräparative TrennungRoutineanalytik • Qualitätskontrolle• Identitätsprüfung• Gehaltsbestimmung / Verunreinigungen
Forschung und Entwicklung• Screening• Qualitative Analyse• Prozessentwicklung und -optimierung• Mikropräparative TrennungRoutineanalytik • Qualitätskontrolle• Identitätsprüfung• Gehaltsbestimmung / Verunreinigungen
5
Weitere Vorteile Weitere Vorteile
Parallele Analyse von Proben und Standards
Wenig Matrixprobleme durch einmalige Verwendung der Platte
Gezielte Optimierung für einzelne Komponenten
Flexible und mehrfache Detektion
„Mehrdimensionales“ Ergebnis
Flexibilität durch off-line Methodik
Parallele Analyse von Proben und Standards
Wenig Matrixprobleme durch einmalige Verwendung der Platte
Gezielte Optimierung für einzelne Komponenten
Flexible und mehrfache Detektion
„Mehrdimensionales“ Ergebnis
Flexibilität durch off-line Methodik
6
Nachteile der Planar-ChromatographieNachteile der Planar-Chromatographie
Umwelteinflüsse durch offenes System
Begrenzte Trennleistung
Nicht durchgehend automatisierbar
(Begrenzte Kontrollierbarkeit der Gasphase)
Umwelteinflüsse durch offenes System
Begrenzte Trennleistung
Nicht durchgehend automatisierbar
(Begrenzte Kontrollierbarkeit der Gasphase)
7
Stationäre PhaseStationäre Phase Mobile PhaseMobile Phase
GasphaseGasphase
P r o b eP r o b e
Die planar-chromatographische TrennungDie planar-chromatographische Trennung
8
2
14
3
α−Front
β−Front
γ −Front
Die GasphaseDie Gasphase
Beeinflusst:• Schichtaktivität• RF• Trennung• Mobile Phase Hängt ab von:• Kammertyp• Konditionierung
Beeinflusst:• Schichtaktivität• RF• Trennung• Mobile Phase Hängt ab von:• Kammertyp• Konditionierung
9
Chromatographische Trennung – wie?Chromatographische Trennung – wie?
• Die mobile Phase fließt mit Kapillarkräften durch die
Poren (60 Angström = 6 nm)
• Die Substanzen werden in der mobilen Phase gelöst
und über eine gewisse Wegstrecke transportiert
• Unterschiedliche Adsorptions- und/oder Verteilungs-
GGW haben unterschiedliche Aufenthaltszeiten in
der stationären Phase zur Folge
• Die mobile Phase fließt mit Kapillarkräften durch die
Poren (60 Angström = 6 nm)
• Die Substanzen werden in der mobilen Phase gelöst
und über eine gewisse Wegstrecke transportiert
• Unterschiedliche Adsorptions- und/oder Verteilungs-
GGW haben unterschiedliche Aufenthaltszeiten in
der stationären Phase zur Folge
10
Wanderungsstrecke in der DCWanderungsstrecke in der DC
zzmaxmax ==
2 2 γγ
ρ ρ ** g g ** rr
zzmaxmax max. Steighöhe in einer einzelnen max. Steighöhe in einer einzelnen zylindrischen Kapillare [cm]zylindrischen Kapillare [cm]
γ γ Oberflächenspannung [Oberflächenspannung [dyndyn/cm]/cm]ρρ Dichte [g/mL]Dichte [g/mL]gg Erdbeschleunigung (9,81 m/sErdbeschleunigung (9,81 m/s22))rr Kapillarradius [cm]Kapillarradius [cm]
zzFF22 = = κ κ ** tt
zzFF Entfernung Entfernung Fm.frontFm.front--EintauchspiegelEintauchspiegelκκ FliesskonstanteFliesskonstantett ZeitZeit
11
Trennstrecke (mm)
Entwicklungszeit (min)
FliessmittelbewegungFliessmittelbewegung
12
Je länger die Laufstrecke, umso diffuser die Je länger die Laufstrecke, umso diffuser die Zonen und umso schlechter die Trennzahl!Zonen und umso schlechter die Trennzahl!
Diffusion und TrennzahlDiffusion und Trennzahl
13
Ideales ZonenprofilIdeales Zonenprofil
Einzelwerte
Häufigkeit
14
Cs
Cm
Cs
Cm
Cs
Cm
VerteilungsisothermenVerteilungsisothermen
KonzentrationsprofileKonzentrationsprofile
ZonenformenZonenformen
TailingTailing FrontingFronting
konvexkonvex
konkavkonkav
o.k.o.k.
Verteilungsisothermen - KonzentrationsprofileVerteilungsisothermen - Konzentrationsprofile
15
Tailing - Ursachen und AbhilfeTailing - Ursachen und Abhilfe
Überladung: Substanzmenge reduzieren
Zu hohe Schichtaktivität: Sättigung, Vorbedampfen
Reaktion: Schicht wechseln, modifizieren
Polare Lösungsmittelreste: Trocknen
Konvexe Isotherme: Phasensystem ändern
Dissoziation: Schicht/Fließmittel puffern
Veränderung der Substanz: Schutzatmosphäre
Überladung: Substanzmenge reduzierenSubstanzmenge reduzieren
Zu hohe Schichtaktivität: Sättigung, VorbedampfenSättigung, Vorbedampfen
Reaktion: Schicht wechseln, modifizierenSchicht wechseln, modifizieren
Polare Lösungsmittelreste: TrocknenTrocknen
Konvexe Isotherme: Phasensystem ändernPhasensystem ändern
Dissoziation: Schicht/Fließmittel puffern Schicht/Fließmittel puffern
Veränderung der Substanz: SchutzatmosphäreSchutzatmosphäre
16
Fronting-Ursachen und AbhilfeFronting-Ursachen und Abhilfe
Feuchte Startzone & schwaches Fliessmittel:Startzone trocknen, stärkeres Fliessmittel
Konkave VerteilungsisothermePhasensystem ändern
aus: Frey, H.-P. und Zieloff, K.:Qualitative und quantitative Dünnschicht-Chromatographie, VCH, Weinheim, 1992
Feuchte Startzone & schwaches Fliessmittel:Startzone trocknen, stärkeres FliessmittelStartzone trocknen, stärkeres Fliessmittel
Konkave VerteilungsisothermePhasensystem ändernPhasensystem ändern
aus: Frey, H.aus: Frey, H.--P. und Zieloff, K.:P. und Zieloff, K.:Qualitative und quantitative DünnschichtQualitative und quantitative Dünnschicht--Chromatographie, VCH, Weinheim, 1992Chromatographie, VCH, Weinheim, 1992
RRFF-- bzw. bzw. RRrelrel--WertWert
LösemittelfrontLösemittelfront
StartzoneStartzone
aabb bbii
bbstst
18
Laufstrecke der Fließmittelfront (Startzone Laufstrecke der Fließmittelfront (Startzone -- Fließmittelfront)Fließmittelfront)
Laufstrecke der Fraktion (Startzone Laufstrecke der Fraktion (Startzone -- Substanzmitte)Substanzmitte)
aaRRFF
bb==
Rückhaltefaktor, Retardation Rückhaltefaktor, Retardation FactorFactor oder oder RelateRelate to Frontto FrontRelative Position einer Zone auf der DC/Relative Position einer Zone auf der DC/HPTLCHPTLC--PlattePlatte
aabb
hRhRFF = R= RF F ** 100100
< 1< 1
RRFF-- bzw. bzw. hRhRFF--WertWert
19Auflösung zweier ZonenAuflösung zweier Zonen
RS =2 (zF1 - zF2)w1 + w2
zF1, zF2 Wanderungsstrecken
w1, w2 Peak-Basisbreiten
Summe der Summe der PeakPeak--BasisbreitenBasisbreiten/2/2
LaufstreckenLaufstrecken--DifferenzDifferenz
Unterschiedliche KUnterschiedliche K--Werte (Steigung der Werte (Steigung der Isothermen, Selektivität)Isothermen, Selektivität)Arbeiten im linearen Bereich (Konzentration!)Arbeiten im linearen Bereich (Konzentration!)Optimale Entwicklungsstrecke (Diffusion!)Optimale Entwicklungsstrecke (Diffusion!)
20
2
K =CsCm
KK22
KK11Selektivität α =
K VerteilungskoeffizientCS Konzentration in der stationären PhaseCM Konzentration in der mobilen Phase
CS
Cm
frische mobile PhaseCS
Cm1 10
K2 = 2
K1 = 0,2
KK11KK22
Verteilungs-/AdsorptionsisothermeVerteilungs-/Adsorptionsisotherme
21Auflösung nach SnyderAuflösung nach Snyder
zF
HN =
RRss == 1144
KK11KK22
-- 11)) ** ** ((11 -- RRFF) ) √RRFF * * NN((
aa bb cca Selektivitätstermb Schichtqualitätc FliessmitteleinflussRF mittlere RF-Wert des zu trennenden SubstanzpaaresN TrennstufenzahlzF WanderungsstreckeH Trennstufenhöhe, HETP
Selektivität von Selektivität von grossemgrossem Einfluss: Einfluss: RRss ~ ~ ααTrennstrecke von geringem Einfluss: Trennstrecke von geringem Einfluss: RRss ~ ~ √ √ NNii
22
Der a-Term: SelektivitätDer a-Term: Selektivität
Abhängig von den Verteilungskoeffizienten der beiden Substanzen
Abhängig von der chemischen Natur von:
• Probe
• Schicht
• Fliessmittel
Ist nicht einfach ΔRF
Abhängig von den Verteilungskoeffizienten der beiden Substanzen
Abhängig von der chemischen Natur von:
• Probe
• Schicht
• Fliessmittel
Ist nicht einfach ΔRF
23
Der b-Term: SchichtqualitätDer b-Term: Schichtqualität
N ist die Trennstufenzahl über die gesamte
Trennstrecke
Beeinflusst Auflösung nur über Quadratwurzel
Auflösung ist proportional Wurzel RF
RF = 0 ergibt RS = 0
Verlangt hohen RF
N ist die Trennstufenzahl über die gesamte
Trennstrecke
Beeinflusst Auflösung nur über Quadratwurzel
Auflösung ist proportional Wurzel RF
RF = 0 ergibt RS = 0
Verlangt hohen RF
24
Der c-TermDer c-Term
Extremer RF Effekt:• RF =1 ergibt Rs=0
•
Verlangt kleinen RF
Vom b und c Term:• RF muss optimiert werden
• Rs maximal bei RF=0.3
1 Auflösung Rs
0.5
0 0.5 1
Rf
25Zonenverbreiterung nach van Zonenverbreiterung nach van DeemterDeemter
H = H = AA + + + + C C * * vv
A Schichtqualität, Eddy-DiffusionB Diffusionsterm, longitudinale DiffusionC Verzögerungsterm, lokales Nicht-GGW
H = 2 H = 2 λλ dpdp + + + +
H chromatographische Stufenhöhev Fliessmittelgeschwindigkeitλ Funktion der Schichtpackungdp Teilchendurchmesserγ Labyrinth-FaktorD Diffusionskoeffizientω Packungsstruktur-Faktor
vvBB
2 2 γγ DDvv
ωω dpdp2 2 vvDD
A,C bei DC: H ~ 30 A,C bei DC: H ~ 30 μμmmB bei HPTLC: H ~ 12 B bei HPTLC: H ~ 12 μμmm
26Ziel der ChromatographieZiel der Chromatographie
Trennung Anforderung
qualitativ geringe Differenz der Laufstrecken
quantitativ "genügende" Differenz der Laufstrecken
präparativ vollständige Peaktrennung
Welches Ziel will ich erreichen?Welches Ziel will ich erreichen?
- Trennung qualitativ oder quantitativ?- Zwei- oder Vielkomponenten-
gemische?- Trennzeitoptimierung
28
Was ist bekanntWas ist bekannt
Anzahl von KomponentenChemische StrukturenMolekulargewichteLöslichkeitenArt der MatrixKonzentrationsbereichSonstiges: pKa ; UV Spektrum, etc. NICHTS
Anzahl von KomponentenChemische StrukturenMolekulargewichteLöslichkeitenArt der MatrixKonzentrationsbereichSonstiges: pKa ; UV Spektrum, etc. NICHTS
29
InformationenInformationen
Ähnliche Trennungen in der Literatur finden• CAMAG Bibliography Service (CBS) auch auf CD-ROM• Chemical Abstract Service (CAS)• Chromatography Abstracts• J. Chromatography A (Bibliog. Sect.)Fachzeitschriften (Journal of Planar Chromatography)Offizielle Methoden (USP, EuPh, AOAC) Handbücher• CRC Handbook of Chemistry and Physics• CRC Handbook of Chromatography• Merck IndexDC-Literatur: siehe Auslage
Ähnliche Trennungen in der Literatur finden• CAMAG Bibliography Service (CBS) auch auf CD-ROM• Chemical Abstract Service (CAS)• Chromatography Abstracts• J. Chromatography A (Bibliog. Sect.)Fachzeitschriften (Journal of Planar Chromatography)Offizielle Methoden (USP, EuPh, AOAC) Handbücher• CRC Handbook of Chemistry and Physics• CRC Handbook of Chromatography• Merck IndexDC-Literatur: siehe Auslage
30
31
32
Vom „Klecksen“ zur optimalen Probenauftragung
Probenauftragung allgemeine Hinweise
• Die Proben müssen exakt positioniert seinIdentitätsprüfung über den Rf-Wert nur möglich wenn Proben in gleichem Abstand vom unteren Rand aufgetragen sind. Abstand vom linken und rechten Rand und Bahnabstand müssendefiniert sein
Das Probevolumen muss kontrolliert seinVermeidung von Schichtüberladung oder Auftragemengen unter der Nachweisgrenze. Bei Quantifizierung geht das Probenvolumen in die Berechnung ein!
• Die Schicht darf nicht verletzt werdenSchichtschäden führen zu verzerrten Substanzflecken.Bleistiftmarkierungen können mit der Probe Wechselwirkungen eingehen und stören die densitometrische Auswertung
Auftragepositionen
8 mm15 mm
25 mm 15
mm
10 mm
5 mm
mindestens 4 mm
mindestens 2 mm
Eintauchtiefe 10 mm
Eintauchtiefe 5 mm
Auftragetechniken
Manuelle Auftragung
Halbautomatische Auftragung
Vollautomatische Auftragung
Manuelle Probenauftragung
Spritzen mit geradem KanülenanschnittAuftragung größerer Volumina möglichZwischentrocknung der Platte möglichAchtung: nicht während der Auftragung mit dem Fönoder Mund Flecken trocknen!
Nachteil:Beschädigung der Schicht- verzerrte Flecken
Schöllkraut
Elke Hahn-Deinstrop
Manuelle Auftragung
• DC-Platten bis 20x20 cm• Probevolumen: 0,5µl; 1µl, 2µl, 5µl• Rasterung 0,5 cm
Festvolumenkapillaren im µl und nl-BereichNachteile: unzureichende Füllung bedingt durch Adhäsions- oder Cohäsionsvorgänge (Oberflächenspannung und Viskosität der Lösungen)Füll- und EntleerzeitenInnendurchmesser der Kapillare
Probenauftragung
0,5µl 1µl 2µl 5µl
Die Größe des Startflecks resultiert aus dem Probevolumen und der Porosität und Dicke der Schicht.
d max = 4V(1+ Φ)/ Π dV Auftragevolumen in µlΦ Phasenverhältnis (Hptlc-Schichten=0,395)d Schichtdicke in mm
Die Größe des Startflecks belastet die Startbreite und damit die Auflösung des DC-Systems!
Dosierqualität:HPTLC ≤1 mmDC ≤ 3 mm
Einfluss der Probenmenge auf die Trennung
Probengröße (ng) Trennstufenzahl
5 3897
10 3333
50 1778
100 1250
250 1086
500 1026
H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)
Menge pro Fleck entscheidend für die Trennung.Begrenzung durch Linearkapazität der Schicht (Masse die den oberen Linearbereich der Verteilungsisotherme markiert)
Für HPTLC-Schicht 10 bis 50 ngFür DC-Schicht 50 µg
Trocknen des StartflecksVor der Entwicklung Startfleck unbedingt
trocknen !Nicht mit dem Mund wegblasen – Atemluft enthält Feuchtigkeit
Nicht heiß abföhnen – kondensierende Feuchtigkeit und Aktivitätserhöhung durch Warmluft.
Nach der Trocknung Schicht erst äquilibrieren lassen
Probleme bei der Auftragung?
Nasse Auftragestelle• Platte vor der
Entwicklung trocknen!
CAMAG Applikationslabor
Probleme bei der Auftragung ?Gingko-Extrakt
Probe auf Bahn 2 wurde zuletzt aufgetragen und nicht ausreichend getrocknet.
MP: Ethylacetat/Essigsäure/Ameisensäure/Wasser 100+11+11+26D: Naturstoffreagenz
ProbenauftragungEinfluss des Lösungsmittels auf Größe der
Startzone
n-H
exan
Tolu
ol
Chl
orof
orm
Ace
ton
H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)
ProbenauftragungEinfluss des Lösungsmittels auf Größe der
Startzone
unpolarpolar
CAMAG Applikationslabor
ProbenauftragungEinfluss des Lösungsmittels auf Größe der
Startzone
H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)
ProbenvorbereitungEinfluss des Lösungsmittels auf das Ergebnis
Usninsäure und Moosextrakte
MP: Dichlormethan/Ameisensäure 19+1D: Anisaldehyd1-2 Moosextrakt Aceton3 Usninsäure in Methanol4 Usninsäure in Aceton5 Aceton6 Methanol
Aceton ist offensichtlich kein geeignetes Lösemittel !
E.Reich,A. Schibli „HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006
Einfluss der LösemittelsIslandmoos
MP: DCM/Ameisensäure 19+1
D: UV 366 nm
Bahn 1-6 Lösemittel Aceton
Bahn 7 Lösemittel Wasser
Startzonen sorgfältig trocknen!
E.Reich,A. Schibli „HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006
Probleme bei der Auftragung?
Matrixeffekte
Gingko-Extrakt
Auf Bahn 2 enthält die Probe Glycerin als nicht flüchtige Komponente die sich nicht mit der mobilen Phase mischt
MP: Ethylacetat/Essigsäure/Ameisensäure/
Wasser 100+11+11+26
D: Naturstoffreagenz
Probleme beim Auftragen ?
CAMAG Applikationslabor
Automatisches Probenauftragen
Hahn-Deinstrop „Applied Thin-Layer Chromatography“, Willey-VCH
HalbautomatischesProbenauftragen
Linomat 5
Anzeige undProgrammierung
Anzeige undProgrammierung
PlattenhalterPlattenhalterTurm mit DosierspritzeTurm mit Dosierspritze
Automatisches Probenauftragen
DC-Probenautomat 4
Plattenhalter
Verwerf- und
Spülflasche
Abdeckhaube
Turm mit Spritze
Probenrack
Verwerfplatte
Display und Programmiereinheit
Arten der Auftragung
Vergleich punktförmige und strichförmigeAuftragung
(unpolares Lösemittel)
CAMAG Applikationslabor
BärentraubenblätterBestimmung von Arbutin
CAMAG Applikationslabor
Rechteckauftragung
OversprayingCAMAG DC-Probenautomat 4
Vorteile der automatischenAuftragung
• Proben können punkt- und strichförmig auf die DC/HPTLC-Platte aufgetragen werden
• Die Proben werden auf die DC-Platte aufgesprüht - keine Verletzung der Schicht
• Das Lösemittel der Probe verdampft während der Auftragung
• Problemlose Dosierung im nl-Bereich• Exakte Positionierung der Auftragungen• Rechteckauftragung möglich
Arbeitsgruppe Prof. Dr. Schwack, Universität Hohenheim
Was man noch so alles machen kann…
Erzeugung von Startbanden durchVorlauftechniken
Vorlauf auf Schichten mit Konzentrierungszone
Retentionsfreier
Schichtbereich
Erzeugung von Startbanden durchVorlauftechniken
Vorlauf in polaren Fließmitteln Rf ≈ 1Fließmittel vor der Entwicklung sorgfältig trocknen !!
Vergleich strichförmige Auftragung manuell / automatisch
CAMAG Applikationslabor
Manuelle Auftragung Instrumentelle Auftragung
Strich durch aneinanderfügen von
Punkten
Probenanordnung
• Chrom. Eigenschaften benachbarter Bahnen unterscheiden sich geringer als weit entfernter Bahnen. Daraus folgt, dass es für die Reproduzierbarkeit falsch ist, die Proben auf der einen, die Standards auf der anderen Seite der HPTLC-Platteanzuordnen!
Probenanordnungalternierend
S1 P1 S2 P2 S3 P3 S4 P4 S5 P5
Probe wird jeweils auf den vorhergehenden Standard bezogen
Probenanordnungalternierend
S1 P1 P2 S2 P3 P4 S3 P5 P6
Proben werden jeweils auf den vorhergehenden Standard bezogen
Probenanordnungalternierend
S1 P1 P2 S2 P3 P4 S3 P5 P6 S4
Proben werden jeweils auf den Mittelwert benachbarterStandards bezogen
S 1,2 S2,3 S3,4
ProbenanordnungData-pair-Technik
S80 P1 S100 P2 S120 P3 S80 P1 S100 P2 S120 P3
S80
S100
S120
P1
P2P3
Hinweise zur Probenauftragung
• Startfleck nicht größer als 1-2 mm• Wenn möglich, strichförmig auftragen• Nicht mehrere Fraktionen übereinander
auftragen• Bei Proben- und Vergleichslösungen das
gleiche Lösemittel verwenden• Ist Matrix vorhanden, Vergleichslösung mit
Matrix ansetzen, da Begleitstoffe Veränderung der Rf-Werte hervorrufen können.
Trenntechniken
Kammerformen und Trennung
ChromatogrammentwicklungRunge-Bilder
Chromatogrammentwicklung
Gasraumtiefe vor der Schicht:> 3 mm- große Trogkammer
< 3 mm- Schmalkammer
Kammersättigung
Alle Komponenten des Fließmittels vor und während der Entwicklung stehen im Gleichgewicht mit allen Zonen des Gasraumes.
In der mit Filterpapier ausgekleideten Kammer Gasraumsättigung nach 5 min erreicht, wenn Kp < 100°C,
ohne Filterpapier 2h
Das Einstellen einer Platte verzögert die Sättigung
Fließmittel
Vorbeladung
VorbeladungSorptive SättigungSorptive Aufnahme von Gasmolekülen aus
der Kammeratmosphäre durch unbenetzte DC-Schicht
Polare Moleküle werden bevorzugt festgehalten
Gleichgewicht Wasser-KG stellt sich nach wenigen Minuten ein
Beeinflussung durch Dampfsättigung der Partner im Fließmittelgemisch
Kapillare Sättigung
Aufsteigen der Front führt zur kapillaren Sättigung der Schicht
Maximaler endgültiger Sättigungszustand der Schicht mit Fremdmolekülen(keine Homogenität der Molekülsorten)
Schematische Darstellung chromatographischer Begriffe
kap.
Sättigung
Kammersättigung
Vorbeladung
Fließmittel
Austausch Dampf-
Flüssigkeit
NormalkammerDoppeltrogkammer
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Ungesättigt vorkonditioniert gesättigt vorkonditioniert,
anderes LösemittelFalsch eingelegte Platte
N-Kammer ohne Vorbeladung
kap.
Sättigung
Fließmittel
Trockene Schicht
Entstehung eines Gradienten von unten nach oben mit abnehmender Sättigung
Nach 10 min- Sättigung im unteren Drittel, oben nach mehr als einer Stunde
Erhöhter Fließmitteltransport bewirkt Erhöhung der Laufstrecke der Substanzen
Verbesserung der Trennung von zusammen liegenden Flecken
Unsicher hinsichtlich der Reproduzierbarkeit
Entwicklung ohne Vorbeladung
ohne Vorbedampfung
Entwicklung
Gasmolek. Fließmittel
Fließm. Moleküle Flüssig
ads. Wasser
F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972
N-Kammer mit Vorbeladung
kap.
Sättigung
Filterpapier
Kap. Sättigung
Vorbeladung
Austausch Dampf-
Flüssigkeit
Je größer die Vorbeladung, desto größer dieFrontwanderungsgeschwindigkeit = kleiner Rf
Wasserverdrängung durch Vorbeladung = Veränderung der Polarität der stationären Phase
Entwicklung mit Vorbeladung
Vorbedampfung Entwicklung
Gasmolek. Fließmittel
Fließm. Moleküle Flüssig
ads. Wasser
F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972
Gegenüberstellung der Entwicklungmit und ohne Vorbeladung
Kap. transp. Flüssigkeit
35%
Vorbedam-pfung mit Fließmittel
50%
Adsorb. Wasser
15%
Kap. transp. Flüssigkeit
85%
Adsorb. Wasser15%
Vorbeladung der SchichtUnterscheiden Sie zwischen Kammersättigung und Schichtvorbeladung
Rechnen Sie immer mit Vorbeladung – Luftfeuchte, Lösemitteldämpfe
Vorbeladung mit FM-Dämpfen verringert den Wassergehalt im Adsorbens, erhöht damit die Aktivität.
Vorbeladung durch Fließmittelgemische mit polaren Komponenten verändert die Schichteigenschaften.
Vorbeladung erhöht die Frontwanderungsgeschwindigkeit, nicht dieFleckgeschwindigkeit
Vorbeladung mit Einkomponenten-FM erniedrigt den Rf, Trennung wird oft nicht beeinflusst
S-Kammern sind ideal ungesättigt und ermöglichen Chromatogrammeohne Vorbeladung
Ungesättigt, gesättigt, vorbeladen
Entwicklung im TrogEinfluss der Eintauchtiefe der Platte auf die nachfolgende Entwicklung
A : zu hoher FließmittelstandPartielle Wechselwirkungmit dem Fließmittel
B: korrekter Fließmittelstand
E.Hahn-Deinstrop, Applied Thin-Layer Chromatography,Wiley-VCH,2006
Entwicklung im TrogEinfluss der Randabstände auf die Entwicklung
Randeffekt• Proben sind zu nahe an
den Ränden der Platte!
CAMAG Applikationslabor
LaufstreckeTheorie für beste Auflösung: HPTLC-Platten 5 bis 7 cm mit max. 6 cm
DC-Platten 10-15 cm mit max. 12 cm
Wenn das chromatographische System hochselektiv ist, und die Anzahl der Komponenten gering, reichen auch kürzere Laufstrecken
Hydrastis canadensis
HPTLC-Platte
MP:Ameisensäure/Wasser/Ethylacetat
10+10+80
1 Hydrastinin
2 Hydrastin
3 Berberil
4 cm
6 cm
E.Reich,A. Schibli „HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006
Laufstrecke
8 cm
12 cm
Erhöhung der Laufstrecke gibt signifikante Ergebnisse
TLC-Platte
MP:Ameisensäure/Wasser/Ethylformat
8+4+881 Rutin
2 Hyperosid
3 Phenazon
4 bis 6 Tausendgüldenkraut
7 Enzian
E.Reich,A. Schibli „HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006
Laufstrecke
Ginseng
6 cm
8 cm
HPTLC Platte
MP: Chloroform/Ethylacetat/Methanol/Wasser
15+40+22+9
Seltener Fall: Auflösung ändert sich nicht signifikant mit der Erhöhung der Laufstrecke
E.Reich,A. Schibli „HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006
Entwicklung im Trog
CAMAG Applikationslabor
„Bananenfront“- Kammer ist nicht dicht
Entwicklung im TrogGewelltes Chromatogramm
• Ungenügende Kammersättigung• Luftzug?
CAMAG Applikationslabor
Entwicklung im TrogStörung des Gleichgewichtes Kammersättigung
MP: Chloroform/Methanol 9+1
Trocknen der Platte
• Schnelles Trocknen der Platte, um die Chromatographie zu stoppen, und um Fleckendiffusion zu vermeiden
• Überschüssiges Lösemittel ablaufen lassen• Vertikale Lage der Platte, um Fließen des Restlösemittels und
damit Fleckendiffusion zu verhindern (so lange wie Feuchte offensichtlich).
• Verwendung von Kaltluftstrom, wenn Substanzen das zulassen• Bei schwer flüchtigen Lösemitteln -Warmluftstrom
Horizontalentwicklungskammern
HorizontalentwicklungskammerMehrfachfunktion:
S-Kammer mit ideal ungesättigtem GasraumKammersättigungKammersättigung + Vorbeladung
Planar-Chromatographie heute
Vortrag Dr. G. Morlock (Analytischer Fortbildungstag 2009, TU Berlin)
Vergleich HPLC-HPTLC
Vortrag Dr. G. Morlock (Analytischer Fortbildungstag 2009, TU Berlin)
Fließmittel-Entmischung in derungesättigten S-Kammer
Ursache: Binäre Fließmittelgemische mitunterschiedlicher Polarität verlieren einen Teil Ihrer polaren Komponente zumAufbau der stationären Phase
Ausbildung von ß-Fronten
stat. Phase mobile Phase
Wassermoleküle
unpolare Komponente
polare Komponente
ß-Front
Alpha-Front
F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972
Peakform in der ß-Front
Start
ß-Front
Front
Su - Kammer
• Gasraum < 3mm
• Keine Vorbedampfung
• Fließmittel- Entmischung
• Mehrere Fronten
• Reproduzierbare
Trennung
• Vergleichbar zur SäuleF. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972
Entwicklung im Trog
Sekundäre Front• Kammersättigung nötig!• Änderung der mobilen
Phase
CAMAG Applikationslabor
CAMAG VARIO-System
1.Entwicklung mit 6 verschiedenen Lösemitteln Nebeneinander in S-Konf.
2.Entwicklung in ges. Tank-Konfiguration
3.Vorkonditionierung derPlatte,dann wie 2
4.Vorkonditionieren mit 6 untersch. Lösemitteln
Spezielle Techniken-warum?
Besserer Reproduzierbarkeit: Automatische Entwicklung (ADC2)
Komplexe Matrix/schwierige Gemische: Mehrfachentwicklung
2-Dimensionale Entwicklung
Durchlauftechnik
Großer Polaritätsbereich: Gradiententechnik (AMD2)
Höhere Fleckenkapazität: Gradiententechnik (AMD2)
Mehrfach- Entwicklung(gleiche Mobile Phase)
Erste
Entwicklung
ZweiteEntwicklung
Fingerprint von Ölen nach
Pharm.Eur. 2x entwickeln gleiche mobile Phase
Bessere Auflösung?
MP: Dichlormethan/Essigsäure/Aceton 20+40+50
D: Phosphormolybdänsäure
1: Maiskeimöl
2: Olivenöl
3: Verfälschung
CAMAG ADC 2
Einhängen der Platte Kammersättigung
Laufstreckenkontrolle
Wichtigste Eigenschaften der ADC2• Vollautomatische Entwicklung von TLC/HPTLC-
Platten und Folien der Größen 20x10 und 10x10 cm
• Hohe Reproduzierbarkeit der Rf-Werte• Einstellung einer definierten Aktivität der Schicht
über die Option “Feuchtekontrolle“ möglich • Überwachungsfunktion durch den Nutzer entfällt• Einsatz einer herkömmlichen Doppeltrogkammer• Betrieb im stand-alone Modus oder unter
winCATS
Reproduzierbarkeit der Rf-Werte
Probe: Chlortoluron, Desethylatrazin, Cyanazin, Atrazin je 50 ng/µl in Acetonitril
Auftragevolumen: 5 µlBandlänge: 8 mm, Anzahl Bahnen: 15Schicht: HPTLC Fertigplatten Kieselgel 60 F 254
20 x 10 cm, Merck Fliessmittel: t-Buthylmethylether – n-Hexan 60 : 40, Laufstrecke: 60 mmLabortemperatur: 27°C/35% rel. Feuchte
Reproduzierbarkeit der Rf-Werte
Einfluss der Feuchte auf das Trennergebnis
Modul Feuchtekontrolle
36,075757575757576Natriumchlorid
222,547Kaliumthiocyanat
54,433333333333333Magnesiumchlorid
40353025201510
Löslichkeit bei 20°C g/100 g Wasser
Relative Luftfeuchtigkeit (%) bei einer Temperatur von … °C
Salz
Einfluss der Feuchte auf das Trennergebnis
Sojalecithin Standardlösung gemäss Vorschrift in CBS90
Auftragevolumen: 1 µl, Bandlänge: 8 mm, Anzahl Bahnen: 15Fliessmittel: Chloroform –Methanol - Aceton – Wasser
18:15:3:1.ungesättigte Entwicklung, Laufstrecke: 70 mmDerivatisierung: Tauchen in CuSo4/H3PO4 Reagenz
10 Min. auf 170°C erwärmt. Messung: 338 nm.
Einfluss der Feuchte auf das Ergebnis der TrennungSojalecetin-Standard (Phospholipide)
Feuchteeinstellung 17 %Ohne FeuchteeinstellungLabortemperatur 25°C/52%rel.F.
1
2 3
42+3+45
6
75+6+7
1stde
velo
pmen
t: ve
ry p
olar
sol
vent
2nd de
velo
pmen
t: m
obile
pha
se, l
ess
pola
r
1stde
velo
pmen
t: he
xane
2nd de
velo
pmen
t: m
obile
pha
se
Abtrennen nicht-polarer Matrix
Abtrennenpolarer Matrix Fokussierung
2nd de
velo
pmen
t: m
obile
pha
se
1st de
velo
pmen
t: m
etha
nol
App
licat
ion
Mehrfach-Entwicklung (verschiedene Mobile Phasen)
Mehrfachentwicklung
Metoclopramid in Suppositorien1. Entwicklung mit polarem Fließmittel, um Matrix in die Front zu schieben
2. Entwicklung mit geeignetem FMFür die Trennung
E.Hahn-Deinstrop, Applied Thin-Layer Chromatography,Wiley-VCH,2006
DC-HPTLC
Lavendelöl mit Toluen/Ethylacetat 95+5
Derivatisierung: Anisaldehyd
DC 1.Entw. DC 2.Entw
HPTLC 1.Entw
Der Effekt des Wechsels in diesem Fall- Zeitersparnis !E.Reich,A. Schibli „HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006
Mehrfach- Entwicklung(gleiche Mobile Phase)
1. Entfernen der Matrix
2. Trennung der Probe
... Verschiedene Fliessmittel, Platte um 180° gedreht
1.
180°
2. "
“Zweidimensionale” Trennung
TRT-Technik: Trennung-Reaktion-Trennung
1. 2.
1.
90°
... mit dem gleichen Fliessmittel, Platte um 90° gedreht
Zweidimensionale Entwicklung
Stabilitätsuntersuchung(Zwei-Dimensionale Chromatographie)
CAMAG Applikationslabor
Das AMD 2 – Systemautomatisierte Mehrfachentwicklung
Gestaltung des Gradienten
DichlormethanAcetonitrilMethanol/Wasser
n-Hexant-ButylmethyletherMethanol
n-HexanDichlormethanMethanol
AbschwächerBasisfließmittelVerstärker
Universalgradient Normalphasengradient sehr polar beginnend
über mittelpolar und unpolar endend
Basisfließmittel Fließmittel mittlerer Polarität- bestimmend für die Selektivität
Verstärker Fließmittel mit hoher Elutionskraft
Abschwächer Unpolares Fließmittel
Gestaltung des Gradienten
Fokussiereffekt
AMD2
Schrittweise Entwicklung
Step 1Step 1 Step 2Step 2 Step 3Step 3 Step 4Step 4 Step 5Step 5 Step ..Step ..
Focu
sing
Focu
sing
CAMAG Applikationslabor
GradientenoptimierungFarbstoffgemisch + Benzoesäure
AMD2-AnwendungFrangulaextrakt
Gelb fluoreszierende Zone- AloinGelb fluoreszierende Zone- AloinCAMAG Applikationslabor
AMD2 Anwendungen
Trennung verbotener Amine
2µL 5µL10µL 10µL5µL2µL 2µL 5µL10µLS1 S2 S3 S4 S4S3S2S1Black leather Textile ‘red’ cotton Textile ‘blue’ cotton
CAMAG Applikationslabor
AMD2 Anwendungen
Pestizidtrennung mit Gradient A
Atr
azin
e
2,4-
D
I-St =
Ben
zani
lid
Pend
imet
halin
Met
azac
hlor
CAMAG Applikationslabor
AMD2 Anwendungen
Pestizidtrennung mit Gradient B
Atr
azin
e
2,4-
D
I-St =
Ben
zani
lid
Pend
imet
halin
Met
azac
hlor
CAMAG Applikationslabor
AMD2-Trennung von Zuckern
FructoseGlucose
CAMAG Applikationslabor
AMD-Charakteristika
• Fokussierung zu scharfen Zonen• Zonenprofil nahezu unabhängig von der
Trennstrecke• Laufstrecke unabhängig von der Matrix• Polaritätsgradienten frei programmierbar• Substanzen sehr unterschiedlicher Polarität
trennbar• Trennzahl > 40 auf 80 mm Trennstrecke
Nutzen Sie für die Lösung Ihres analytischen Problems immer die angemessene Trennkammer
•Es gibt keine beste Kammer
•Kriterium für gutes Entwicklungssystem: Reproduzierbarkeit der Arbeitsparameter, klimatisierte Räume, gute Schichtqualität, ausgereifte Verfahren
OPLC – SystemOverpressured Thin-Layer Chromatography
Fließmittel wird in eine horizontale hermetisch abgeriegelte Schicht hineingepumpt
Fließmittel für Linearentwicklung durch einen gefrästen Spalt auf die Chromatogrammbreite verteilt
Linearisierung des Fließgesetzes-dadurch kaum Fleckverbreiterung
Zirkularentwicklung
• Punktförmige Einspeisung des Fließmittels• Auftragung der Proben im Startkreis