Zur molelularen Topologie der Bindung von Fetuin an HApsylvester.bth.rwth-aachen.de/dissertationen/2002/117/02_117.pdf · Knochen besteht aus etwa 45% Mineral, 40% organischer Matrix

Zur molekularen Topologie der Bindung

natürlicher und rekombinanter Varianten

von α2-HS-Glycoprotein/Fetuin an

Hydroxylapatit

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-Westfälischen

Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Natur-

wissenschaften genehmigte Dissertation.

vorgelegt von

Diplom-ChemikerWolf-Alexander Heiss

aus Göttingen

Berichter: Universitätsprofessor Dr. W. Jahnen-Dechent

Universitätsprofessor Dr. H. Höcker

Tag der mündlichen Prüfung: 12. Juni 2002

Teile Dieser Arbeit sind publiziert oder eingereicht:

W. Jahnen-Dechent. C. Schäfer, A. Heiss, C. Grötzinger. Systemic inhibition of spontaneous calcifi-

cation by the serum protein α2-HS-glycoprotein/fetuin. Z. Kardiologie, 90 (Suppl.3): 47–56, 2001

R. Westenfeld, A. Heiss, M. Ketteler, J. Flöge, A. Schwarz, W. Jahnen-Dechent. Fetuindefizienz - ein

neuer Pathogenesemechanismus der Kalziphylaxie. Medizinische Klinik; 97 (Abstract Band): 136,

2002

Calciphylaxis is linked to systemic deficiency of the calcification inhibitor α2-HS-glycoprotein/fetuin.

R. Westenfeld, A. Heiss, M. Ketteler, J. Flöge, A. Schwarz and W. Jahnen-Dechent. eingereicht

A. Heiss, A. Duchesne, B. Denecke, J. Grötzinger, K. Yamamoto, T. Renné and W. Jahnen-Dechent.

Structural basis of calcium binding by α2-HS-glycoprotein/fetuin: formation of colloidal calciprotein

particles. eingereicht

C. Schäfer, A. Heiss, T. Schinke, A. Schwarz, R. Westenfeld, M. Ketteler and W. Jahnen-Dechent. The

serum protein α2-HS-glycoprotein/fetuin is a systemically acting inhibitor of ectopic calcification.

eingereicht

Abkürzungsverzeichnis

ACP amorphes Calciumphosphat

AHSG m(urines), b(ovines), h(umanes) α2-HS-Glycoprotein/Fetuin-A

As Aminosäure

BGP Bone-GLA-Protein

BMP Bone Morphogenic Protein

BSA Bovines Serum Albumin

cDNA komplementäre (complementary) DNA

CRP C-reaktives Protein

DLS Dynamische Lichtstreuung

EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäure

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FETUB Fetuin-B

FOP Fibrodysplasia Ossificans Progressiva

GdnHCl Guanidin Hydrochlorid

GLA γ-carboxyliertes Glutamat

GST Glutathion-S-Transferase

HRG Histidine Rich Glycoprotein

IB Inclusion Body

HAp (Calcium-) Hydroxylapatit

IPTG Isopropylthiogalactosid

kDa Kilodalton

KNG Kininogen

II

KO Gen-Knockout

mAHSG-D1 murine Fetuin Domäne 1

MBP Maltose Binding Protein

MGP Matrix-GLA-Protein

mRNA Messenger RNA

NDSB 201 3-(1-Pyridino)-1-Propan Sulfonat

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PCR Polymerase Chain Reaction

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

SDS Natrium (sodium) Dodecylsulfat

SEM Scanning Electron Microscopy

TEM Transmission Electron Microscopy

TRIS TRIS (hydroxymethyl)-Aminomethan

WT Wildtyp

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1. Biomineralisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.1. Die mineralische Phase und assoziierte Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.1.1. Eis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.1.1.2. Silikat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.1.1.3. Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.1.1.4. Calciumphosphat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.1.2. Knochenbiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.1.2.1. Osteoblasten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.1.2.2. Osteoclasten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.1.2.3. Pathologische Formen der Mineralisation . . . . . . . . . . . . . . 9

1.2. α2-HS-Glycoprotein(AHSG)/Fetuin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.2.1. Lokalisation, Konzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.2.2. Struktur und Funktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.2.3. Fetuin Typ B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.2.4. Die Cystatin-Superfamilie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.2.5. α2-HS-Glycoprotein-Domäne1 vermittelte Inhibition der Calciumphosphat-

Präzipitation aus übersättigter Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.3. Proteinexpression und Proteinfaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.4. Modellierung von Proteinstrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.5. Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

IV Inhaltsverzeichnis

2. Material und Methoden 17

2.1. Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.1.1. Laborchemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.1.2. Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.1.3. Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.1.4. Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.1.5. Klonierungs- und Expressionsvektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.1.6. E. coli-Stämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.1.7. Verbrauchsartikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.1.8. Chromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.2. Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.2.1. Klonierung von mAHSG-Mutanten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.2.2. Transformation der Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.2.3. Plasmid-DNA Isolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.2.4. Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.2.5. Expression rekombinanter Proteine in E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.2.6. Isolierung der rekombinanten Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.2.7. Rückfaltung denaturierter Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.2.8. Proteinbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2.9. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot . . . . . . . . . . . 23

2.2.10. Inhibition der Calciumphosphat / Apatit Präzipitation . . . . . . . . . . . . . 23

2.2.11. Untersuchung des Inhibitionsmechanismus mittels Elektronenmikroskopie und

dynamischer Lichtstreuung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2.12. Komparative Strukturmodellierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3. Ergebnisse 27

3.1. Strukturmodelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.1.1. Bewertung der modellierten Strukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.1.2. Domänen-Modell von AHSG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.1.3. Modelle der Cystatin-ähnlichen Domänen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Inhaltsverzeichnis V

3.2. Expression, Rückfaltung und Isolierung rekombinanter Fetuine . . . . . . . . . . . 34

3.2.1. Expression in E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.2.2. Rückfaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.3. Inhibition der Calciumphosphat-Präzipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.3.1. Rekombinant exprimierte Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.3.2. Einfluß des genetischen Hintergrunds bei Wildtyp und Ahsg

Mäusen . . 41

3.3.3. Humane Seren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.4. Das Prinzip der transienten Inhibition: Bildung löslicher ACP-Nanosphären . . . . . 46

3.4.1. Raster EM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.4.2. Transmissions EM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.4.3. Dynamische Lichtstreuung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4. Diskussion 52

4.1. Fetuin als systemischer Inhibitor ektopischer Calciumphosphat Calcifizierungen . . . 52

4.2. Transiente Inhibition der Präzipitation durch Bildung löslicher Nanosphären in vitro.

Mögliche Bedeutung für die Biomineralisation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

4.3. Struktur-Funktionsbeziehung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

4.3.1. Rekombinant exprimierte Domänen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

4.3.2. Vergleich Apatit-bindender Motive . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.4. Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

Literaturverzeichnis 61

A. Lebenslauf 74

B. Danksagung 76

Abstract

Das Plasmaprotein α2-HS-Glycoprotein(AHSG)/Fetuin inhibiert die Calciumphosphat-Präzipitation

aus übersättigter Lösung transient. Durch Struktur-Funktionsuntersuchungen wurde das inhibitorische

Strukturmotiv innerhalb der ersten Cystatin-ähnlichen Domäne von AHSG/Fetuin eingegrenzt und

durch Vergleiche mit weiteren Domänen der Cystatin-Superfamilie (AHSG D2, Fetuin-B (FETUB)

D1-2, Kininogen (KNG) D1-3 oder Histidine Rich Glycoprotein (HRG) D1-2) näher charakterisiert.

Da von diesen Domänen keine Strukturdaten verfügbar sind, wurden Modelle durch komparative

Strukturmodellierung erstellt. Das Modell der murinen AHSG Domäne D1 zeigt eine aminoterminale

α-Helix, um die sich ein vier-strängiges β-Faltblatt wölbt. Auf dem β-Faltblatt bilden sieben saure

Aminosäure-Seitenketten einen zusammenhängend negativ geladenen Oberflächenbereich. Keine an-

dere Cystatin-ähnliche Domäne besitzt einen vergleichbaren negativen Ladungsbereich, was zu der

Annahme führte, daß die Inhibition über eine Interaktion dieser sauren Seitenketten mit den Calcium-

Ionen der Mineraloberfläche erfolgt.

Der Test des inhibitorischen Potenzials rekombinant exprimierter Fragmente der murinen AHSG Do-

mäne D1 offenbarte, daß die von den Aminosäuren 15–70 gebildete Struktur, d.h. die aminotermi-

nale α-Helix und die ersten beiden Stränge des darauffolgenden β-Faltblattes, bereits das komplette

inhibitorische Potenzial beinhaltet. Weiterhin zeigten die Inhibitionstests, daß keine andere Cystatin-

ähnliche Domäne einen vergleichbar guten Inhibitor darstellt, da ihnen, wie die Strukturmodelle zeig-

ten, eine entsprechende Anhäufung saurer Seitenketten auf dem β-Faltblatt fehlt.

Durch Test des verbleibenden inhibitorischen Potenzials in den Seren von Dialyse-Patienten und von

Ahsg-defizienten Mäusen mit teilweise massiven ektopischen Calcifizierungen konnte die klinische

Relevanz von Fetuin als wichtigem löslichen Inhibitor belegt werden.

Bei Betrachtung des Löslichkeitsproduktes von Hydroxylapatit wird deutlich, daß die Inhibition nicht

einfach auf einer Erniedrigung des Ionenproduktes durch Bindung von Calcium-Ionen an die sau-

ren Seitenketten beruhen kann. Die Inhibition der Calciumphosphat-Präzipitation beruht vielmehr auf

der Interaktion von AHSG mit Calciumphosphat-Oberflächen. Zunächst wurde der Einfluss von Fe-

tuin auf die Morphologie des Präzipitates mittels Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Danach

gelang der Nachweis löslicher Calciumphosphat-Fetuin Aggregate mittels Transmissionselektronen-

mikroskopie. Fetuin bindet mit hoher Affinität an die Oberfläche von Kristallisationskeimen und wirkt

somit auf deren Wachstum, durch die erniedrigte Diffusionsrate von Calcium- und Phosphat-Ionen an

die Oberfläche, verlangsamend.

1. Einleitung

1.1. Biomineralisation

Knochen besteht aus etwa 45% Mineral, 40% organischer Matrix und 15% zellulären Bestandteilen.

Es handelt sich jedoch nicht um ein statisches System, sondern unterliegt einem permanenten Umbau

durch Knochen-aufbauende Osteoblasten und Knochen-abbauende Osteoclasten, der erst das Kno-

chenwachstum ermöglicht. Die gezielte Mineralisation der Knochenmatrix mit amorphem Calcium-

phosphat (ACP), Octacalciumposphat (OCP) und Hydroxylapatit (HAp) erfordert einerseits eine lo-

kale Übersättigung durch aktive Osteoblasten. Andererseits existieren im Weichgewebe systemische

Inhibitoren, die ungewollte Mineralablagerungen außerhalb des Knochens (ektopische Calcifizierung)

inhibieren.

1.1.1. Die mineralische Phase und assoziierte Proteine

Die kontrollierte Ablagerung von mineralischer Phase in Organismen ist aufgrund der vielschichtigen

Aspekte (Skelettbildung, Schutzpanzer, (Magneto-) Sensoren, Ionenreservoir) ein weit verbreitetes

Prinzip in der Biologie [Review: 1]. Im Verlauf der Evolution haben sich die Phasen der drei (Bio-)

Minerale Calciumphosphat, Calciumcarbonat und Silicat zum Aufbau von Stützgewebe bewährt. Seit

Mitte der 70er Jahre konnte jedem Biomineral eine zunehmende Zahl von Proteinen zugeordnet wer-

den, die mit ihm eine spezifische Wechselwirkung eingehen. Dies hat Auswirkung auf Keimbildung,

Wachstum und Morphologie der Kristallite.

Zwei Modelle1 der Interaktion von Proteinen mit Mineraloberflächen werden gegenwärtig kontro-

vers diskutiert. Das erste Modell geht von einer Wechselwirkung im weiteren Sinne von Epitaxie

aus, bei der sich Mineral- und Proteinoberfläche hinsichtlich der Ladungsgeometrie komplementär

zueinander verhalten und somit eine Energieminimierung bedingen [Untersuchungen an Calciumcar-

bonat Phasen: 2, 3]. Das zweite Modell betont, daß sich der Kristall im Löslichkeitsgleichgewicht mit

der umgebenden Phase befindet, d.h. permanent auf und abgebaut wird. Der Habitus ist daher von

den Kristallflächen bestimmt, die am schnellsten aufgebaut bzw. am langsamsten abgebaut werden.

1Den Untersuchungen liegt zum Teil das Calcit (Calciumcarbonat)-System zugrunde. Die Modelle sind jedoch auch fürCalciumphosphate gültig.

2 Einleitung

Hierbei wirken die Proteine bzw. Polymere rein kinetisch. Der strukturdirigierende Prozess erfordert

keinen festen Kontakt zwischen Kristall und Protein, stattdessen erfolgt die Strukturkontrolle über die

Verringerung der zeitlich gemittelten Oberflächenenergie [4, 5].

1.1.1.1. Eis

Arktische Fische produzieren antifreeze Proteine (AFP), die die Gefriertemperatur der Körperflüssig-

keiten herabsetzen2 . Unterhalb des Gefrierpunkts modifizieren AFPs die Morphologie der Eiskristal-

lite. Momentan sind vier AFP-Typen und das antifreeze Glycoprotein (AFGP) bekannt. Die AFPs I

und III sind hinsichtlich der molekularen Topologie ihrer Bindung an Flächen von Eiskristallen am

besten untersucht.

AFPs vom Typ I liegen bei 0°C als 100% α-helicales 3–5 kDa Monomer, bestehend aus 11 As lan-

gen Repeats, vor. Weiterhin fällt der hohe Alanin-Gehalt von über 60 % auf3. Erste Bindungsmodelle

gingen von einer Wasserstoff-verbrückten Bindung der OH-Gruppen des Threonins an bestimmte

Flächen des Eiskristalls aus [6], wofür eine exotherme Enthapie postuliert wurde. Dabei wurde je-

doch die Wechselwirkung dieser Reste mit Wasser vernachlässigt. Die Bindung kann jedoch nicht

allein auf Wasserstoff-Brücken beruhen, denn die Differenz der Wechselwirkungen ∆H(Thr-OH —

H2O s

- ∆H(Thr-OH — H2O l ) ist zu klein. Die α-Helix der AFPs Typ I enthält auch möglicherwei-

se ausgedehnte hydrophobe Seitenbereiche4 . Die Mutationen verschiedener Alanine, aber auch von

Threoninen, führten zu einer verminderten Effizienz [7, 8].

AFP vom Typ III ist etwa 7 kDa groß und besteht aus ungeordneten β-Faltblatt Strängen. Mutations-

untersuchungen haben hier gezeigt, daß die Hysterese-Aktvität von bestimmten polaren Resten ab-

hängt, die auf einer nahezu planaren Fläche des ansonsten globulären Proteins liegen [9]. Die Mo-

dellierung der Bindung anhand einer hochaufgelösten Protein-Röntgenstruktur ergab, daß das Protein

wahrscheinlich an mehrere parallele Ebenen des Eiskristalls zu binden vermag [10].

1.1.1.2. Silikat

Der strukturelle Aspekt der Biomineralisation von nanostrukturierten Silikaten, wie sie in den Zell-

wänden von Diatomeen zu finden sind, ist mikroskopisch gut untersucht. Die molekularen Determi-

nanten dieser Mineralisation hingegen sind bisher nur wenig erforscht. Die Silikat-Polymerisation

erfolgt allgemein katalytisch unter basischen (oder sauren) Bedingungen. Neuere Untersuchungen

weisen darauf hin, daß dieser Prozess in der Natur durch sogenannte Silaffine eingeleitet wird. Auf-

grund ihrer modifizierten Lysin-Reste besitzen sie stark basischen Charakter [11]. Vergleichbare Ei-

genschaften werden dem Silicatein zugeschrieben [12].

2Nicht aber die Schmelztemperatur (Hysterese).3Ebenso bei AFGP4Hierzu müssen die γ-Methyl-Gruppen der Threonine zur Oberfläche zeigen.

1.1 Biomineralisation 3

1.1.1.3. Calciumcarbonat

Das höhere Löslichkeitsprodukt der CaCO3-Phasen Calcit, Aragonit und Vaterit im Vergleich zu den

neutral-basischen Calciumphosphat Phasen ermöglicht eine Kristallzucht unter Laborbedingungen

und vereinfacht somit die Untersuchungen von geeigneten Proteinen auf der Kristalloberfläche. An-

hand dieses Systems konnte in frühen Untersuchungen beispielsweise gezeigt werden, daß Proteine

aus der Schale von Mollusken die Kristallkeimbildung verlangsamen [13] und den Habitus wachsen-

der Calcit-Kristalle beeinflussen [2]. Bestimmte Proteine aus den verschiedenen Schichten von Mu-

schelschalen vermögen sogar Keimbildung und Wachstum von CaCO3-Phasen (Calcit oder Aragonit)

zu determinieren [14].

Die Bindung von Lithostatin, einem Protein aus der Pankreasflüssigkeit, an wachsende Calcit-Kristalle

manifestierte sich in einer konzentrationsabhängigen Verlangsamung des Kristallwachstums und ei-

nem veränderten Habitus [15]. Lithostatin verdankt diese Eigenschaften sehr wahrscheinlich einem

aminoterminalen, strukturell sehr flexiblen Undecapeptid, welches mit hoher Affinität an die Fläche

(1120) bindet [16]5.

1.1.1.4. Calciumphosphat

Die Kristallstruktur von Apatit

Fluorapatit stellt die ideale Apatitstruktur dar und kristallisiert in einem hexagonalen Kristallsystem

mit der Raumgruppe P63/m 6. Dabei befindet sich das Fluorid-Ion genau in der Ebene der entlang

der c-Achse kanalbildenden Calcium-Ionen (Ca(II)). Diese Punktlage kann auch von Chlorid- oder

Hydroxid-Ionen eingenommen werden (Ca5(PO4)3X, X = OH

, Cl

, F

), welche jedoch leicht aus

der Ebene heraus verschoben sind.

Das Ionenprodukt I von Hydroxylapatit (HAp) ist folgendermaßen definiert: I = [Ca2 ]5[PO3 4 ]3[OH].

Im Gleichgewicht wird es als Löslichkeitsprodukt KLP bezeichnet. Das Löslichkeitsprodukt von HAp

[20] beträgt KL(HAp) = 3.7 10 58M9.

Setzt man die im Präzipitations-Assay nach Schema A (4.8 mM CaCl2, 1.6 mM Na2HPO4/NaH2PO4,

vgl. Kap. 2.2.10) verwendeten Ionenkonzentrationen ein, so ergibt sich für das Ionenprodukt I mit

pKs2(H3PO4) = 7.21 und pKs3(H3PO4) = 12.32: I = [4.8 10 3]5[1.16 10

8]3[10 6 6] 10

42. Das

Löslichkeitsprodukt ist somit deutlich überschritten.

Die extrazellulären Ionenkonzentrationen von Calcium und Phosphat betragen im erwachsenen Men-

schen 2.1–2.6 mmol/l bzw. 0.84–1.45 mmol/l [21]. Somit ist auch hier das Löslichkeitsprodukt über-

schritten. W.F. Neuman beschrieb das Problem der regulierten und lokal begrenzten Mineralisierung

5Ergebnisse nicht unumstritten [17, 18]6a = b = 936.7 pm, c = 688.4 pm

4 Einleitung

Abbildung 1.1.: Kristallstruktur von Apatit. Blick auf die Kanäle entlang der c-Achse, die von Ca(II)Dreiecken aufgebaut werden ( ). Diese Dreiecke sind derart gegeneinander verdreht, daß in der Auf-sicht der Eindruck eines sechseckigen Kanals mit einem Durchmesser von etwa 247 pm entsteht.Außerdem sind die gerüstaufbauenden Phosphat-Tetraeder und die verbrückenden Ca(I) ( ) sichtbar[Abbildung entnommen aus 19]

als Lot’s Wife Problem7 [22]: Warum erstarren wir nicht zur Salzsäule? Es sind jedoch mehrere

Inhibitoren unkontrollierter Mineralisierung bekannt, die die Bildung von Mineralablagerungen in

Gefäßen und im Weichgewebe verhindern.

Knochenapatit

Knochen besteht etwa zur Hälfte aus mineralischer Phase, wodurch er den weitaus größten Calcium-

Speicher im Organismus darstellt. Diese anorganische Phase besteht aus sehr kleinen Carbonat-haltigen,

Fehlstellen-behafteten Apatit-Kristallen. Die große Variabilität der Struktur kann anhand folgender

7This presents us with the „Lot’s wife problem“. Left to their own devices, the five or more pounds of HAp crystals foundin our skeletons should grow and grow — as long as they are provided with a normal extracellular fluid environment.Indeed, what is it that prevents us all from turning into pillars of salt? [...] all (ion products) fall in the region ofmetastability of the aqueous calcium-phosphate system. They are well below the point of spontaneous precipitation, butwell above the effective solubility of any solid phase or mixture of solid phases likely to be stable under physiologicconditions.


Summenformel verdeutlicht werden (wobei

die Verteilung der Fehlstellen anzeigt):

Ca8 3

1 7(PO4)4 3(HPO4)0 7(CO3)(OH)0 3

1 7 [23].

Die Ausrichtung der c-Achse in den Kristalliten variiert abhängig von der Spezies stark. In calcifi-

zierten Truthahn-Sehnen ist die c-Achse mit hoher Ordnung entlang der Knochenachse ausgerichtet,

im Rinderknochen ist eine vergleichbare Ordnung nicht zu beobachten [Beugung mit Synchrotron-

Strahlung: 24].

Kristallkeimbildung und Kristallwachstum

Das sehr niedrige Löslichkeitsprodukt von HAp verhindert eine kontrollierte Kristallisation aus Lö-

sung unter normalen Laborbedingungen. Es bildet sich unter neutral-basischen Bedingungen vielmehr

zunächst ein überwiegend amorphes Präzipitat. Die darin entstehenden Kristallkeime, wahrscheinlich

aus thermodynamisch metastabilem OCP [20] (KL = 1.1 10 49M9), erfahren entweder eine Phasen-

umwandlung zu HAp oder dienen als Templat für epitaktisches HAp-Wachstum. Diese Frage ist

gerade in Bezug auf die Bildung der mineralischen Phase in Zahn und Knochen unverändert aktuell

[25, 26].

Die Übersättigung σ ist definiert als:

lnσ = ln aaGW

= ln IKL

HAp

Die Keimbildungsenergie ist folgendermaßen

definiert:

∆G = Bγ3V2

kBT lnσ 2

und für den kritischen Nukleationsradius gilt:

rc 2γV∆µ

σ = Übersättigung, kB = Boltzmann

Konstante, T = Temperatur, a und aGW

= tatsächliches Aktivitätsprodukt bzw.

Aktivitätsprodukt im Gleichgewicht,

KL(HAp) = Löslichkeitsprodukt von

Hydroxylapatit, B = Konstante: 16π3 für

einen sphärischen Nucleus, γ = Grenz-

flächenenergie und V = Volumen der

Wachstumseinheit, ∆µ = chemisches

Potenzial

Es muß hierbei beachtet werden, daß die Kristallkeimbildung aufgrund des ungünstigen Oberfläche-

Volumen Verhältnisses, bzw. einer hohen Oberflächenenergie, kinetisch gehemmt ist. Zwischen der

Keimbildung und dem Wachstum nach Bildung größerer Kristallite bzw. nach Zugabe von Keimkri-

stallen ist daher zu unterschieden.

Synthetisches ACP besteht aus sogennanten Posner Clustern mit einem Durchmesser von etwa 9.5 Å ,

die 20–120 nm große sphärische Aggregate bilden [27, 28, 29]. Es handelt sich hierbei um chirale

Ca9(PO4)6 Aggregate mit C3 Symmetrie, die bereits Teile der Apatitstruktur aufbauen, in deren Zen-

trum auf z = 0 bzw. z = 1/2 sich jeweils ein Ca(I) Ion befindet. In den letzten drei Jahren wurde die

Dynamische Lichtstreuung (DLS) so weit verfeinert, daß sie zur Untersuchung der Nukleation von

Calciumphosphaten und Calciumcarbonaten angewandt werden kann. Mit Hilfe dieser Technik ge-

lang Onuma et. al. der Nachweis, daß HAp-Keime in simulated body fluid (SBF) stufenweise durch

Anlagerung kleiner Cluster mit einem Durchmesser von 0.7 bis 1 nm auf der a-Fläche wachsen. Diese

6 Einleitung

stabilen Cluster sind kleiner als die kritische Nucleusgröße und führen daher nicht unbedingt eine

Präzipitation herbei. Die Stufenhöhe entspricht etwa der Größe von Posner Clustern [30, 31].

In vitro Tests der Calciumphosphat-Mineralisation

Zu Beginn der Forschung an Proteinen, die die Calciumphosphat-Mineralisation beeinflussen, wurden

u.a. Doppeldiffusionssysteme gewählt, um unter möglichst kontrollierten Bedingungen Proteine aus

dem Serum und der Knochenmatrix auf inhibitorische oder nukleierende Eigenschaften hinsichtlich

der Calciumphosphat-Präzipitation zu untersuchen [z.B. 32, 33, 34, 35]. Alternativ wurde die zeitab-

hängige pH-Erniedrigung bei Präzipitation aus proteinhaltiger Lösung gemessen [z.B. 36, 37, 38]. Bis

Ende der 90er Jahre wurden auf diese Weise viele Proteine identifiziert, die in vitro auf die Keimbil-

dung entweder nukleierend oder inhibierend wirkten:

Nukleation

• Bone Sialoprotein (BSP) [34]

• Dentin Phosphoryn [35, 39, 40]

• Fibronectin (FN) [41]

Inhibition

• α2-HS-Glycoprotein (AHSG)/Fetuin [42, 43]

• Histidine Rich Glycoprotein (HRG) [44]

• Osteopontin (OPN) [38]

• Statherin [45]

• Matrix GLA Protein (MGP) [46]

• schwach:

– Albumin8 [37]

– Bone GLA Protein (BGP) bzw. Osteocalcin (OC) [35, 36]

8Aufgrund der hohen Konzentration trotzdem eines der wichtigsten Inhibitoren im Serum.


Die Inhibitoren lassen sich in lösliche und Oberflächen-gebundene Inhibitoren einteilen. Lösliche

Inhibitoren zeichnen sich durch saure (Fetuin, HRG, Osteopontin, Albumin) oder zudem phosphory-

lierte Sequenzmotive (Osteopontin, Statherin, Phosphoryn) aus. Die Entfernung der kovalent an OPN

gebundenen Phosphate mit alkalischer Phosphatase führt zu einer mehr als 40-fachen Reduktion der

inhibitorischen Aktivität [47]. Matrix GLA Protein, ebenfalls aminoterminal phosphoryliert, ist je-

doch als unlösliches Protein auf Chondrozyten und glatten Muskelzellen zu finden. Die Inhibition

beruht hier wahrscheinlich eher auf γ-carboxylierten Glutamat-Resten (vgl. Kap. 4.3.2).

Erste Überlegungen gingen davon aus, daß es lokaler Mineralisationsinitiatoren, wie z.B. Kollagen

und BSP, bedarf. Ein neueres Konzept hingegen beschreibt die unkontrollierte Calcifizierung als

default pathway. Neben der örtlich begrenzten und kontrollierten Mineralisation in Zahn und Kno-

chen sind folglich ebenso eine Reihe spezifischer Inhibitoren im umgebenden Gewebe notwendig

[48].

Physiologische Relevanz

Von einigen der oben genannten, das Kristallwachstum modulierenden Proteine wurden durch Gen-

Deletion sogenannte Maus-Knockouts generiert.

Ahsg

Mäuse, d.h. Tiere denen beide Allele des AHSG/Fetuin-Gens fehlen, neigen abhängig vom

genetischen Hintergrund (d.h. vom Stamm) zu ektopischen Calcifizierungen unterschiedlichen Aus-

maßes9 [43]. MGP

Mäuse weisen extreme Calcifizierungen in der Media von Arterien auf [46].

Aber nicht alle Knockouts zeigen den erwarteten Phänotyp. So führte die Deletion des OPN-Gens zu

einer unveränderten Mineralisation von Zahn und Knochen [49].

1.1.2. Knochenbiologie

1.1.2.1. Osteoblasten

Der permanente Umbau des Knochens erfolgt durch eine regulierte Aktivität der aufbauenden Osteo-

blasten und der abbauenden Osteoclasten. Ob und wie sich die beiden Zelltypen unmittelbar in ihrer

Aktivität beeinflussen (bone coupling) ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen.

Osteoblasten sind mesenchymalen Ursprungs. Sie sind den Fibroblasten ähnlich, exprimieren aber

zusätzlich den Transkriptionsfaktor Cbfa1 und das sekretierte Protein Osteocalcin. Der Transkrip-

tionsfaktoren Cbfa1 und das weiter downstream gelegene Osterix (Osx) sind für die Osteoblasten-

differenzierung essentiell. Cbfa1

Mäuse sind nicht lebensfähig, da aufgrund der unterdrückten

Osteoblastendifferenzierung keine Skelettmineralisierung erfolgt [50]. Auch bei den erst kürzlich be-

schriebenen Osx

Mäusen bleibt die Mineralisierung der Knochenmatrix aus [51].

9Auf die Serum-Inhibition von Ahsg

Mäusen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund wird im Ergebnisteileingegangen.

8 Einleitung

Es sind zwei Modelle mit konditioneller Osteoblasten Ablation bekannt [52, 53]. Bei den hierzu

erzeugten transgenen Mäusen wurde eine verkürzte Mutante der Herpes Simplex Thymidinkina-

se (HSV-tk) hinter die Osteoblasten-spezifischen Promotoren von Kollagen Typ I bzw. Osteocalcin

geschaltet. Der Kollagen Typ I Promotor wird zu einem frühen Zeitpunkt während der Osteobla-

stendifferenzierung aktiviert, der von Osteocalcin hingegen zu einem späteren, nachdem die Zell-

teilung beendet ist. Die Verabreichung von Ganciclovir bewirkt die gezielte Abtötung der HSV-

tk exprimierenden Osteoblasten zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung. Es zeigte sich,

daß eine Kollagen-Promotor regulierte frühe Osteoblasten-Ablation unmittelbar die Osteoclasten-

Differenzierung negativ beeinflusst. Die Ablation zu einem späteren Zeitpunkt über den Osteocalcin-

Promotor bewirkt keine Veränderung der Osteoclasten-Aktivität, was eine (reversible) Osteopenie10

zur Folge hat. Folglich besteht eine vom Differenzierungsstadium der Osteoblasten abhängige Korre-

lation mit der Osteoclasten-Aktivität. Es wird vermutet, daß bei einer späten Osteoblasten-Ablation

noch genügend Osteoclasten-stimulierendes OPGL (Osteoprotegerin Ligand, vgl. Kap. 1.1.2.2) frei-

gesetzt wird, um eine unbeeinträchtigte Aktivität zu garantieren.

Neben einer Kontrolle der Osteoblasten-Aktivität über die genannten Transkriptionsfaktoren wird eine

neurokrine Kontrolle durch Einwirkung von Leptin auf den Hypothalamus vermutet [54].

Abhängig vom Knochentyp erfolgt die Skelett-Mineralisation auf zwei unterschiedliche Arten. Die

endochondrale Ossifikation führt zum Wachstum der lamellenartigen Röhrenknochen. Zellen aus dem

Perichondrium differenzieren zu Osteoblasten. Die Knorpelmatrix im Bereich hypertropher Chondro-

zyten der Epiphyse beginnt dabei zu calcifizieren, verbunden mit einem Einwachsen von Blutgefäßen

[55]. Koordination und Regulation der Chondrozyten-Differenzierung erfolgt über PTH/PTHrP bzw.

deren Rezeptor, wodurch die Ausbildung einer geordneten Wachstumszone, der sogenannten growth

plate, und zugleich das Wachstum des benachbarten Knochens gewährleistet ist [56]. Diese Mineral-

ablagerung geht mit der Ausbildung des Knochenmarks und der Osteoblasten-Differenzierung einher.

Die Calcifizierung zu Knochenplatten durch direkte Differenzierung von mesenchymalen Zellen zu

Osteoblasten wird als desmale Ossifikation bezeichnet.

1.1.2.2. Osteoclasten

Knochen abbauende Osteoclasten sind mehrkernige Zellen, die zusammen mit den Makrophagen ei-

ner Differenzierungslinie entstammen. Integrin-Rezeptoren in der kreisförmigen Sealing Zone ge-

währleisten einen engen Kontakt mit der abzubauenden Knochenmatrix. Durch die basale stark ge-

faltete Membran (ruffled border) werden Protonen, die Protease Cathepsin K und Metalloprotein-

asen in den Zwischenraum abgegeben, die gemeinsam den Knochenabbau herbeiführen. In einem als

Transcytose bezeichneten Prozess werden die auftretenden Abbauprodukte endocytiert, von dort zur

apikalen Seite der Zelle transportiert und wieder ausgeschleust [57, 58].

10Knochenschwund


Die Regulierung des Knochenumbaus erfolgt durch verschiedene calcitrope Zytokine und Hormone.

Den Abbau fördernden Einfluß haben z.B. das Parathormon (PTH) und 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3,

hemmenden Einfluß hingegen haben Calcitonin oder Östrogene.

Differenzierung und Aktivität der Osteoclasten wird durch das OPG/OPGL11-Effektor-System [59,

60] ausbalanciert. Der OPG-Ligand (OPGL) ist auf der Oberfläche von Osteoblasten und Stroma-

zellen lokalisiert, der Rezeptor RANK auf Osteoclasten. Eine Ligand-Rezeptor-Bindung induziert

die Differenzierung bzw. Aktivierung der Osteoclasten. OPG ist ein löslicher Rezeptor, der durch

Bindung an OPGL eine Wechselwirkung von OPGL mit seinem Rezeptor RANK auf Osteoclasten-

Vorläuferzellen unterbindet. Knochenabbau führt zur Freisetzung von TGF-β1. TGF-β ist ein zen-

trales Zytokin des Knochenwachstums bzw. -umbaus, da es die Expression von OPG in Osteobla-

sten/Stromazellen induziert, während die Expression von OPGL herabreguliert wird. Somit wird die

Differenzierung und Aktivierung der knochenabbauenden Osteoclasten TGF-β abhängig über das

OPG/OPGL System reguliert [61, 62]. Eine weitere Möglichkeit der Gegenregulation ist durch die

Bindung von IFN-γ an seinen Rezeptor auf Osteoclasten gegeben. Es folgt ein Stat1 abhängiger Ab-

bau des für die OPGL/RANK Signaltransduktion unabdingbaren TRAF6 [63].

1.1.2.3. Pathologische Formen der Mineralisation

Die mediale vaskuläre Calcifizierung von Arterien wird als Mönckeberg Sklerose bezeichnet. Sie tritt

gehäuft bei älteren Menschen und bei Diabetikern auf. Matrix-GLA-Protein (MGP) 12 Mäuse ent-

wickeln ebenfalls schwere Calcifizierungen in der Media der Arterien [46]. Daraufhin wurde gezielt

die Expression von Osteopontin (OPN) und MGP in glatten Muskelzellen calcifizierter Arterien von

Diabetikern untersucht. Nur sehr wenig OPN mRNA konnte in der Media nachgewiesen werden. OPN

wird aber stark von Makrophagen der Intima exprimiert. Eine starke MGP-mRNA-Synthese wurde in

unmittelbarer Umgebung der Calcifizierungen nachgewiesen [64].

Calcifizierungen des Knorpels, verbunden mit Gehörlosigkeit, Brachytelephalangie und pulmona-

ler Stenose, werden unter dem Begriff Keutel-Syndrom zusammengefasst, das durch Mutationen des

MGP hervorgerufen wird. Drei Mutationen, die zu nicht-funktionellem MGP führen, konnten bisher

identifiziert werden [65].

Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) ist eine seltene erbliche Funktionsstörung im Bindege-

webe. Die Mineralisierung wird durch Infiltration von Lymphozyten, bei gleichzeitiger Degenerati-

on der Muskelzellen, eingeleitet. Nachfolgend bildet sich stark vaskularisiertes Fibroblasten-reiches

Gewebe. Lymphoblastoide Zellen, die aus mineralisierenden Bereichen von FOP-Patienten isoliert

wurden, zeigen eine erhöhte BMP-4 Expression. Bone morphogenic proteins (BMP) stimulieren die

Differenzierung mesenchymaler Zellen zu Osteoblasten, die, wie bereits einleitend oben besprochen,

11Osteoprotegerin (OPG), Osteoprotegerin Ligand (OPGL, RANKL, TRANCE, ODF)12diesen Tieren fehlen beide Allele des Gens. Man spricht daher von Gen-Knockout.

10 Einleitung

die Mineralisierung der kollagenen Matrix bewirken. Dies mag die Ursache der massiven ektopischen

Knochenbildung bei FOP-Patienten sein, die vergleichbar der endochondralen Ossifikation ist [66].

Häufig treten Calcifizierungen der Arterien und vereinzelt auch verschiedener Organe und der Haut

(Calciphylaxie) zusammen mit einem sekundären Hyperparathyroidismus als Folge einer terminalen

Niereninsuffizienz auf. In solchen Fällen werden vorbeugend eine phosphatarme Diät empfohlen und

Aluminium-haltige Phosphatbinder verabreicht.

Die biochemischen Eigenschaften von Fetuin, sowie dessen Funktion als systemischer Inhibitor der

Calciumphosphat-Präzipitation und negatives Akutphase-Protein wird in den Kapiteln 1.2 und 3.3.3

behandelt.

1.2. α2-HS-Glycoprotein(AHSG)/Fetuin

1.2.1. Lokalisation, Konzentration

Durch fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung von fötalem Kälberserum gelang es Pedersen et. al.

[67], ein darin hochkonzentriertes Protein zu isolieren, das den Namen Fetuin erhielt. α2-HS-Glyco-

protein (AHSG13), ein bereits 1960 von Heremans und Schmid entdecktes Protein [68, 69] wurde

erst 1990 durch Vergleich der cDNA und Aminosäure-Sequenzen als das humane Homolog von

AHSG/Fetuin identifiziert [70]. Fetuin wird in der Leber exprimiert, wo es vorübergehend phosphory-

liert [71, 72] vorliegt. Nach Sekretion besitzen noch etwa 20% des zirkulierenden Fetuin durchschnitt-

lich eine Serin-Phosphorylierung pro Molekül, wobei etwa 77% auf Ser312 und 23% auf Ser120 ent-

fallen [42, 71]. Die Plasmakonzentration in fötalem Blut ist etwa 10-fach gegenüber der im adulten

menschlichen Organismus von ca. 500 µg/ml beim Menschen erhöht. Über die Blutzirkulation erreicht

Fetuin den Knochen, wo es akkumuliert. Grund hierfür ist die im Vergleich zu anderen Plasmaprotei-

nen hohe Bindungsaffinität an Calciumphosphat/Apatit [73, 74, 75, 76].

1.2.2. Struktur und Funktion

Fetuin setzt sich aus drei Domänen D1-D3 zusammen. Die ersten beiden Domänen D1 und D2 ge-

hören wegen ihrer Homologie zum Cystatin zur Cystatin-Superfamilie (vgl. Kap. 1.2.4). Innerhalb

der ersten Domäne befindet sich ein zum TGF-β-Typ II Rezeptor homologer Loop14. Fetuin ver-

mag daher über diesen Sequenzbereich Zytokine wie TGF-β oder BMP-2 zu antagonisieren [77]. Im

Osteogenese-Zellkulturmodell unterliegt die Osteoblasten-Aktivität einer TGF-β abhängigen Regu-

lation. Dementsprechend stellt Fetuin als TGF-β-Antagonist in vitro einen indirekten Regulator der

Osteoblasten Aktivität dar [78].

13Sogenanntes Fetuin Typ A, das im Nachfolgenden mit AHSG für das Protein und mit Ahsg für das Gen abgekürzt wird.14TGF-β receptor II homology 1 domain (TRH1), 18–19 Aminosäuren.

1.2 α2-HS-Glycoprotein(AHSG)/Fetuin 11

Sechs Disulfid-Brücken tragen zur Stabilität der Fetuin-Struktur bei. Fünf davon sind innerhalb der

Domänen D1 (2) und D2 (3) lokalisiert. Die sechste Disulfidbrücke verbindet die erste und die dritte

Domäne miteinander [79].

Im Gegensatz zu allen AHSGs anderer Spezies besteht humanes AHSG (hAHSG) aus einer schweren

A- und einer leichten B-Kette [80, 81], die über eine Disulfid-Bindung miteinander verbunden sind. A-

und B-Kette sind das Produkt eines mRNA Transkripts, das unter Verlust von R322 gespalten wird.

Bei chymotryptischer Aktivität wird durch eine weitere carboxyterminale Spaltung das sogenannte

connecting peptide freigesetzt [82, 83].

AHSG verfügt über vier N- und O-glycosidisch verknüpfte (teilweise verzweigte) Kohlenhydratketten

in der A-Kette und ein O-glycosidisch verknüpftes Trisaccharid. SCAfet gehört zur Superfamilie der

Monocot Mannose-bindenden Lectine. Das Monomer ist 244 As lang (26kDa) und besteht aus 2 un-

glycosylierten Domänen. Das funktionelle Tetramer bindet im Gegensatz zu den anderen Mitgliedern

dieser Lectin Superfamilie keine einfachen Zucker, sondern spezifisch an die komplexen Kohlenhy-

dratketten des Fetuins [84].

Aus Serum isoliertes bovines Fetuin enthält assoziierte Lipide, vor allem Cholesterin, dessen Ester und

in kleineren Mengen Phospholipide, Triglyceride und Fettsäuren [85]. Die Fetuin-vermittelte Aufnah-

me von Fettsäuren in glatte Muskelzellen und Fibroblasten wurde auf diese Lipid-Bindeeigenschaften

zurückgeführt [86]. Gleichzeitig fördert die isolierte Fetuin-Lipid Fraktion die Absonderung von Cho-

lesterin aus Fibroblasten und Hep-G2 Zellen [87].

1.2.3. Fetuin Typ B

Kürzlich wurde die Fetuin-Familie um das Fetuin-B (FETUB) erweitert, das durch Vergleich der klo-

nierten cDNA mit zusammengesetzten Expressed Sequence Tags (ESTs) aus der dbEST-Datenbank

entdeckt wurde. Die Sequenzidentität zwischen den länger bekannten Fetuinen verschiedener Spe-

zies, nunmehr als Typ A bezeichnet, beträgt 58%, zwischen den B-Fetuinen 61%, und die beider

Fetuin-Gruppen zusammen 17% (24% homolog). Darüber hinaus zeigte ein Vergleich der Proteinse-

quenzen (Alignment), daß alle 12 Cysteine konserviert vorliegen und ein gemeinsames Sequenzmotiv

DXLETXCHXL innerhalb der ersten Domäne existiert [88]. Fetuine (A+B) gehören zu der Gruppe

der negativen Akutphase-Proteine [88, 89], d.h. bei Entzündung und Trauma werden diese Proteine

herunterreguliert.

12 Einleitung

1.2.4. Die Cystatin-Superfamilie

Folgende Proteine werden aufgrund der hohen Homologie einzelner Domänen zu Cystatin zur Super-

familie gruppiert:

• Stefin 11.5 kDa

• Cystatin 13 kDa

• Fetuin (AHSG) 48 kDa

• Histidine Rich Glycoprotein (HRG) 67 kDa

• Kininogen (KNG) 120 kDa

Cystatine zählen, abgesehen vom Fetuin und dem HRG, denen die vermittelnde Konsensussequenz

QXVXG in einem Loop fehlt, allgemein zu den Cystein-Proteaseinhibitoren [90]. Ihre Sequenzen sind

etwas mehr als 100 Aminosäuren lang, wovon ein relativ hoher Anteil sauer ist (der pI von Cystatinen

liegt daher im sauren pH-Bereich).

1.2.5. α2-HS-Glycoprotein-Domäne1 vermittelte Inhibition der

Calciumphosphat-Präzipitation aus übersättigter Lösung

Durch C-terminal verkürzte Deletionsmutanten des mAHSGs konnte das inhibitorische Sequenzmotiv

auf die erste Domäne eingegrenzt werden [42]. Da die in E. coli exprimierten (produzierten) Proteine

keine N- und O- glycosidisch gebundenen Sialinsäure-haltigen Kohlenhydratseitenketten besitzen,

zeigte sich auch, daß der inhibitorische Effekt davon unabhängig ist. Darüber hinaus zeigen in vitro

Cystatin [91] und HRG [44] ein vergleichsweise schwächeres Inhibitionspotenzial.

1.3. Proteinexpression und Proteinfaltung

Die Expression, d.h. die gezielte Überproduktion, von Proteinen in E. coli ist eine etablierte Methode

zur selektiven Synthese eukaryotischer Proteine. Somit können beispielsweise Proteine in ausreichen-

der Menge gewonnen werden, deren Isolierung aus dem entsprechenden Gewebe und Anreicherung

ansonsten sehr aufwändig wäre.

Nicht selten weisen jedoch rekombinant in Bakterien exprimierte Proteine eine fehlerhafte Faltung

auf. Disulfid-Brücken zwischen einzelnen Cysteinen können entweder nicht geschlossen sein oder es

kann zu falschen Verbrückungen kommen. Die Faltung einzelner Domänen kann in ihren Sekundär-

oder Tertiärstrukturen fehlerhaft sein. Im Verlauf von Proteinfaltungen kann es daher zu Aggregatio-

nen der nunmehr exponierten hydrophoben Bereiche des Kerns kommen. Als Folge dessen bilden sich

1.4 Modellierung von Proteinstrukturen 13

lösliche oder unlösliche (Inclusion Bodies) hochmolekulare Aggregate. Speziell unter biotechnologi-

schem Aspekt ist somit die Untersuchung der Faltungsmechanismen von großer Bedeutung.

Die Faltung bzw. ebenso die Entfaltung von Proteinen verläuft allgemein über einen sogenannten

Molten Globule Zustand. In diesem Zustand besitzen die Proteine zwar eine recht kompakte Kon-

formation, sind allerdings partiell denaturiert. Die Sekundärstruktur ist vorhanden, die Tertiärstruktur

hingegen ist nicht ausgebildet. Der Faltungsmechanismus von bovinem Fetuin in Guanidin Hydro-

chlorid verläuft über einen derartigen Zustand [92].

Der Faltungsmechanismus der Cystatine soll nun im Hinblick auf Fetuin als Teil der Cystatin-Super-

familie genauer beleuchtet werden. Staniforth et. al. untersuchten die Kinetik der Faltung von Cysta-

tin C genauer. Zunächst bildet sich ein globuläres Zwischenprodukt, wobei die hydrophoben Seiten-

ketten bereits den noch wasserhaltigen Kern bilden. Die zur weiteren Faltung notwendige Entfernung

der Wasser Moleküle aus dem Kern stellt die entscheidende Energiebarriere dar, die die native Kon-

formation von den partiell denaturierten Konformationen trennt. Die weitere Verdichtung des Kerns

und die optimierte Anordnung der Seitenketten ist enthalpisch, nicht aber entropisch begünstigt [93].

Verharrt Cystatin C im Verlauf der Faltung zu lange in einem Zwischenzustand mit nur teilweiser

Faltung, so neigt es zur Dimerisierung. Cystatin C zeigt in vivo keine Tendenz zur Dimerisierung.

Eine dominant vererbte Leu68 Gln (L68Q) Mutation führt allerdings zur Aggregation von Di-

meren zu Fibrillen. Diese Ablagerung in den Blutgefäßen des Gehirns wird als Cystatin C Amyloid

Angiopathie15 bezeichnet [94]. Es handelt sich hierbei jedoch nicht um die Aggregation hydropho-

ber Bereiche, wie bei der Aggregation im Molten Globule Zustand. NMR-, UV-, Fluoreszenz- und

CD-spektroskopische Methoden wurden zur Charakterisierung des Dimers angewandt. Dabei wurde

festgestellt, daß der Dimerisierung eine tiefgreifende Konformationsänderung zwischen dem zwei-

ten und dritten Strang des β-Faltblattes vorangeht [95, 96]. Die neuerdings ermittelten Strukturen

des L68Q Mutanten-Dimers und des unter denaturierenden Bedingungen erzeugten Dimers zeigen,

daß die Dimerisierung über einen Austausch von Strängen des β-Faltblattes erfolgt. Der federartige

Spannungsabbau in der Schleife zwischen dem zweiten und dem dritten Strang des fünf-strängigen

β-Faltblattes (speziell bei der L68Q Mutante) begünstigt somit das Dimer gegenüber dem Monomer

[97, 98].

1.4. Modellierung von Proteinstrukturen

Die Funktion eines Proteins ist an dessen dreidimensionale Faltung geknüpft. Die Ermittlung der

dreidimensionalen Struktur durch Beugung am Proteinkristall oder mittels NMR-Spektrometrie einer

Proteinlösung ist somit ein wertvolles Werkzeug zum Verständnis der Eigenschaften und Interaktionen

von Proteinen. Von manchen Proteinen ließ sich nur unter großen Mühen eine Struktur ermitteln, bei

anderen Proteinen war es bisher sogar unmöglich.

15auch als „cerebral hemorrhage with amyloidosis, icelandic type“ bezeichnet

14 Einleitung

Momentan stehen 797935 (Stand 25.6.2001) bekannte Proteinsequenzen [99] 13960 Proteinstruktur-

bestimmungen (Stand 17.7.2001) [100] gegenüber. Modellierte Strukturen besitzen daran allerdings

einen Anteil von nur etwa 2%. Bei einer geschätzten Anzahl von etwa 1000 Domänen-Familien mit

gleichem Faltungsmuster ist die Anzahl der anhand von Homologien bestimmbaren Strukturen jedoch

bedeutend höher als die der bekannten. Aus diesem Grunde wird zur Funktionszuweisung der Se-

quenzdaten aus Genom-Projekten verstärkt auf (automatisiertes) Homology Protein Structure Model-

ling zurückgegriffen. Die Qualität einer durch Modellierung generierten Struktur hängt entscheidend

von der Identität bzw. Homologie von Ausgangsstruktur (template) und Zielstruktur (target) ab. Der

gewählte Modelling-Ansatz, mit dem im Rahmen dieser Arbeit Modelle Cystatin-ähnlicher Domänen

generiert wurden, berücksichtigt die sterischen Erfordernisse. Eine 40%ige Identität der Sequenzen

kann bereits ausreichen, um Modelle mit einer Genauigkeit zu entwerfen, die der niedrig aufgelöster

Röntgenstrukturen nahekommt. Bei Identitäten unter 30% wird das Alignment der Sequenzen zuneh-

mend ungenauer, worunter letztendlich die Qualität des Modells stark leidet. Trotz zahlreicher Ein-

schränkungen wird die Modellierung homologer Strukturen heute hauptsächlich zur Erstellung von

Basismodellen in der Protein-Kristallographie, zum Drug Design oder zur Überprüfung möglicher

Liganden-Bindungsstellen eingesetzt [101].

(a) Torsionswinkel der Sekundärstrukturele-mente im Ramachandran-Plot

(b) Ramachandran-Plot von 1CEW

Abbildung 1.2.: Die Verteilung der Torsionswinkel bedingt durch verschiedene Sekundärstruktu-ren (α-Helix oder β-Faltblatt) [Bild entnommen aus: 102] (a) am Beispiel des mit dem ProgrammProcheck [103] für die Röntgenstruktur von chicken egg white cystatin (1CEW [104]) erstelltenRamachandran-Plots. Begünstigte Bereiche sind dunkel markiert, erlaubte Bereiche heller und ver-botene Bereiche weiß.

Das Alignment der Proteinsequenzen ist für die Qualität des Modells von elemtarer Bedeutung. Der

Ramachandran-Plot (Abb. 1.2a) zeigt an, welche Torsionswinkel entlang der relativ leicht drehbaren

1.5 Aufgabenstellung 15

Bindungen des Rückgrates, d.h. um Cα—N-H (φ) und Cα—C=O (ψ) notwendig sind, um ein be-

stimmtes Sekundärstrukturelement aufzubauen. Aufgrund der unterschiedlichen Reste ist nicht jede

Aminosäure zu bestimmten Torsionen fähig, da es sonst zur Überlappung der Van der Waals Radien

einzelner Atome käme. Modelle, die Torsionswinkel innerhalb dieser im Ramamchandran-Plot weiß

gekennzeichneten, verbotenen Bereiche aufweisen, besitzen folglich keine Relevanz.

Prolin kommt eine besondere Bedeutung zu, da es aufgrund seiner starren cyclischen Struktur nur

bestimmte Torsionswinkel einnehmen kann. Mit den möglichen Winkeln für φ um -60o und für ψum -45o bzw. um +135o ist zwar Prolin in der Lage Konformationen entsprechend der α-helicalen

Bereiche des Ramandran-Plots einzunehmen, aufgrund sterischer Hinderung gilt es jedoch als „Helix-

Brecher“. Durch die starre Struktur werden jedoch Krümmungen in der Primärstruktur induziert, die

die Ausbildung von nachfolgenden α-Helices oder β-Turns begünstigen. Prolin ist auch vereinzelt in

antiparallelen β-Faltblättern zu finden, bricht aber mit seinem Pyrolidin-Ring die Wasserstoff-Brücken

auf.

Glycin indess besitzt keine Seitenkette und ist somit hinsichtlich der Konformation die flexibelste

Aminosäure. Weiterhin stellen Disulfid-Brücken wichtige Markierungspunkte innerhalb der Struktur

dar.

Abbildung 1.2b zeigt beispielsweise den Ramachandran-Plot für die Röntgenstruktur von chicken

egg white cystatin (1CEW [104]), die als Basisstruktur der Cystatin-Superfamilie im Rahmen dieser

Arbeit eine tragende Rolle spielt. Ungefähr 90% der Aminosäuren liegen mit ihren Konformationen

innerhalb der dunklen bevorzugten Bereiche. Eine Anhäufung von mindestens 90% in den bevorzug-

ten Bereichen ist eines der wichtigen Kriterien, anhand dessen der Wert einer Struktur abgeschätzt

werden kann. Die Orientierung der Aminosäuren ist ein weiteres Kriterium. Geladene Aminosäuren

sind meist an exponierten Stellen außen zu finden, hydrophobe Aminosäuren hingegegen bilden den

dicht gepackten Kern (core). Nicht zuletzt müssen auch die Bindungslängen zwischen den Atomen

des backbones beachtet werden.

1.5. Aufgabenstellung

Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es, mit Hilfe von Struktur-Funktions-Beziehungen genauere

Einblicke in den Inhibitionsmechanismus der Calciumphosphat Präzipitation zu erhalten. Dies im-

pliziert nicht nur die Untersuchungen der Protein—Mineral Interaktion in vitro sondern auch deren

pathophysiologische Relevanz.

Weder von Fetuin noch von einzelnen seiner drei Domänen sind Strukturdaten verfügbar. Der ur-

sprüngliche Ansatz, das Protein rekombinant in Bakterien zu exprimieren und nachfolgend für spek-

troskopische Strukturuntersuchungen aufzubereiten, lies sich nicht verwirklichen. Daher wurde auf

die computergestützte Modellierung der einzelnen Domänen, ausgehend von bekannten Templat-

Strukturen, zurückgegriffen. Das inhibitorische Potenzials von Fetuin, dessen (Deletions-) Mutanten

16 Einleitung

sowie einzelner homologer Domänen wurde mit einem etablierten Inhibitions-Assay bestimmt. Ver-

gleiche des inhibitorischen Potenzials eines getesteten Proteins bzw. einer Domäne mit dessen model-

lierter Struktur sollte Rückschlüsse auf die Binderegion zulassen und Einblicke in den Mechanismus

der Inhibition gewähren.

Die hohe Bindungsaffinität von Fetuin an die mineralische Phase des Knochen stellt einen wichtigen

Schlüssel zum Verständnis der Inhibition dar. Daher wurde nicht nur die veränderte Morphologie

de novo gebildeter Calciumphosphat Phase untersucht, sondern es gelang auch, die noch löslichen

Vorläufer-Aggregate in Gegenwart von Fetuin elektronenmikroskopisch nachzuweisen.

Weiterhin sollte die physiologische bzw. klinische Relevanz von Fetuin/AHSG als systemischer In-

hibitor durch Bestimmung des inhibitorischen Potenzials von Seren unterschiedlicher Herkunft her-

gestellt werden. Dazu wurden die Seren Fetuin defizienter Mäuse, die Stamm-abhängig massive ek-

topische Calcifizierungen aufweisen können, und die Seren von Dialyse-Patienten getestet. Etwa 4%

dieser Patienten weisen calcifizierende Hautnekrosen sowie Weichteilverkalkungen ähnlich denen im

Fetuin-Knockout auf. Mit derartigen Seren sollte die große Bedeutung von Fetuin als löslicher syste-

mischer Inhibitor der Calciumphosphat Bildung in vivo belegt werden.

2. Material und Methoden

2.1. Materialien

2.1.1. Laborchemikalien

Die verwendeten Laborchemikalien besaßen allgemein p.a.-Qualität.

2.1.2. Proteine

• Bovines Fetuin Sigma

• Bovines Serum-Albumin (BSA) und Ovalbumin Roth

2.1.3. Enzyme

• Lysozym, RNase A Sigma

• DNase Roche

• Restriktionsendonukleasen und T4 -DNA - Ligase MBI Fermentas

• Taq - Polymerase, Faktor Xa, Thrombin Pharmacia

• Proteinase K Merck

18 Material und Methoden

2.1.4. Antikörper

Polyklonal Antikörper-Seren gegen folgende Proteine, die durch Immunisierung von Kaninchen ge-

wonnen wurden, standen zur Verfügung:

• Murines Fetuin

• Bovines Fetuin

• Glutathion-S-Transferase (GST)

Monoklonal α-myc-Tag wurde aus Hybridoma-Überstand gewonnen. α-human - BMP-2 wurde von

R&D Systems bezogen.

2.1.5. Klonierungs- und Expressionsvektoren

• pUC - 18 New England Biolabs

• pGEX - 2T Pharmacia

• pMAL - c2 bzw. - p2 New England Biolabs

• pFLAG - MAC bzw. - ATS Sigma

• pET - 21a(+) Novagen

2.1.6. E. coli-Stämme

• BL 21 DE3 pLysS, XL - 1 Blue MRA und JM 109 Stratagene

• BL 21 DE3, AD494 Novagen

2.1.7. Verbrauchsartikel

• Filter und Blot-Membranen Schleicher & Schuell

• Ultrafiltrationsmembranen Schleicher & Schuell, Amicon

• Dialyseschläuche Roth

• Plasmid-DNA - Midi-Präparation und Gel-Extraktion Qiagen

2.2 Methoden 19

2.1.8. Chromatographie

Alle verwendeten Säulen sind Produkte von Amersham-Pharmacia:

• Gelfiltration: Superdex 200 HR 10/30, 75 HR 10/30, 75 26/60

• Anionenaustauscher: Resource Q und S

2.2. Methoden

2.2.1. Klonierung von mAHSG-Mutanten

Um das Apatit-Bindungsmotiv innerhalb der ersten Domäne von Fetuin genauer zu lokalisieren, wur-

den von dieser weitere carboxy- und amino-terminale Verkürzungen kloniert. Alle Konstrukte verfü-

gen über ein Fusionspeptid (z.B. His-tag, GST oder MBP), das eine einfache affinitätschromatogra-

phische Aufreinigung ermöglicht. Darüber hinaus wurde die Cystatin-ähnliche Domäne 1 von Fetuin

über einen poly-Glycin-Serin-Linker mit BMP-2 fusioniert.

1. Hot-Start 71°C 120 s2. Denaturierung 96°C 10 s

40Zyklen

3. Annealing 45-6 °C 120 s4. Synthese Taq-Pol.: 71°C

120 sPfu-Pol.: 75°C

5. Lagerung 4°C ∞

Tabelle 2.1.: PCR-Programm

Die PCR-synthetisierten (polymerase chain reaction) DNA-Stränge wurden mit den entsprechenden

Restriktionsendonukleasen geschnitten. Nach elektrophoretischer Auftrennung in einem 1%igen Aga-

rose Gel, wurden die gewünschten Banden ausgeschnitten und die DNA mit Hilfe des Qiagen Gel-

extraction Kits isoliert. Ligationen wurden über zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht

bei 16°C durchgeführt.

2.2.2. Transformation der Bakterien

Die zur Transformation verwendeten Bakterien (XL-1 oder JM 109) wurden zuvor nach der Methode

von Inoue et. al. [105] kompetent gemacht und bei -75°C gelagert.


2.2.3. Plasmid-DNA Isolierung

Mini-Protokoll (Boiling-Methode) 2 ml Ampicillin-haltiges (100 µg/ml) LB-Medium wurde aus ei-

ner Kultur transformierter Bakterien angeimpft und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Davon wurden

1,5 ml entnommen und bei 2500 g 5 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und

das Bakterien-Pellet in 200 µl STET-Puffer (8% Sucrose, 50 mM TRIS pH8, 5% Triton-X-100) resus-

pendiert. Nach Zugabe von Lysozym (800 µg/ml) wurde die Suspension im Wasserbad zwei Minuten

lang gekocht. Zelltrümmer und genomische DNA wurden durch 5minütige Zentrifugation bei 18000 g

abgtrennt. Sollte das Plasmid nachfolgend sequenziert werden, so wurde zweimal mit jeweils 200 µl

Phenol/CHCl3 extrahiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 20 µl 3 M Na-Acetat pH 4.8 und 515 µl

Isopropanol bei -20°C gefällt.

Midi-Protokoll Für die Plasmid-Isolierung aus 50 ml LB/Ampicillin-Kultur wurde das Midi-Kit von

Qiagen verwendet.

2.2.4. Sequenzierung

Generell wurden alle verwendeten Konstrukte mittels geeigneter Plasmid-Primer von den 5’ und 3’-

Enden ausgehend sequenziert. Bei Konstrukten mit mehr als 600 bp Länge war häufig eine zusätzliche

Sequenzierung mit einem Primer innerhalb des Konstrukts notwendig.

Plasmid 5’ Primer 3’ Primer

pGEX-2T pGEX-2T fwd. pGEX rev.GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG TCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG

pMAL-c2 pMAL fwd. (malE) pMAL M13/pUCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC GGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC

pET21a(+) T7 fwd pET21a T7term rev. pET21aTAATACGACTCACTATAG CTAGTTATTCGTCAGCGG

Tabelle 2.2.: Primer

Der Sequenzierungs-Ansatz:

4 µl Sequenziermix (Taq-Polymerase, Fluoreszenz-markierte Didesoxy-Nukleotid-Terminatoren)

1 µl 10µM Primer

1 µg DNA in vollentsalztem Wasser

mit vollentsalztem Wasser auf 20 µl auffüllen

2.2 Methoden 21

PCR-Programm:

1. Denaturierung 95°C 20 s25Zyklen

2. Annealing 48°C 20 s3. Synthese 60°C 240 s4. Lagerung 4°C ∞

Tabelle 2.3.: Sequenzierung

Aufarbeitung Nach Beendigung der PCR wurde der 20 µl Ansatz mit vollentsalztem Wasser auf

100 µl verdünnt und die DNA durch Zugabe von 10 µl 3 M Natrium-Acetat pH 4.8 und 250 µl 100 %

Ethanol gefällt. Nach Zentrifugation (18000 g, 20 Minuten) wurde der Überstand abgezogen und das

DNA-Pellet mit 300 µl 70 % Ethanol gewaschen. Um ein unbeabsichtigtes Ablösen des Pellets zu

vermeiden, wurde erneut zentrifugiert (18000 g, 5 min). Durch 5-10 minütiges Antrocknen wurde

restliches Ethanol entfernt.

2.2.5. Expression rekombinanter Proteine in E. coli

Nach Transformation des Plasmids in E. coli BL21 DE3 (pLysS) wurden einzelne Kolonien zur Vor-

bereitung der Expression in Vorkulturen überführt. Ampicillin-haltiges LB-Medium wurde daraus

1:300 – 500 angeimpft und bei 37°C, 250 rpm zunächst bis zu einer optischen Dichte von 0,3 bis 0,5

bei 600 nm inkubiert (logarithmische Wachstumsphase). Die Expression des rekombinanten Proteins

wurde durch 0.1 – 0.3 mM IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid) induziert. Darauf folgte ei-

ne weitere Inkubationsphase über 2 Stunden bei 37°C oder über 2–3 Stunden bei Raumtemperatur

(durch eine erniedrigte Temperatur konnte vereinzelt die Menge an Inclusion Bodies verringert wer-

den). Danach wurden die Bakterien abzentrifugiert (15 min, 2500g, 4°C), das Medium abdekantiert

und die Bakterien in PBS bzw. TRIS-Puffer (50 mM Tris/HCl pH 8) mit 1 mM EDTA, 1 mM DTT,

1mM PMSF, 1mM Benzamidin resuspendiert (500 ml LB-Medium 20 ml Puffer). Bis zur weiteren

Aufarbeitung wurde die Bakteriensuspension bei -75°C gelagert.

2.2.6. Isolierung der rekombinanten Proteine

Die gefrorene Bakteriensuspension wurde in Eiswasser aufgetaut. Eine Ultraschall-Behandlung (Son-

de, ~60%, 3 mal 15 Sekunden auf Eis) lysierte die Bakterien und zertrümmerte genomische DNA.

Nach Zugabe von 1 mM PMSF, jeweils 10 µg/ml DNAse bzw. RNAse, 2 mM MgCl2 sowie 1%

Tween-20 wurde die Suspension 30 min bei 4°C durchmischt. Durch Zentrifugation wurden lösliche

(cytoplasmatischer Überstand) und unlösliche Produkte (Zelltrümmer und Inclusion Bodies) der Lyse

voneinander getrennt.


Aus dem cytoplasmatischen Überstand Glutathion-S-Transferase (GST, ~29 kDa) fusionierte

Proteine können durch Bindung an Glutathion-Sepharose aufgereinigt werden. Die gebundenen GST-

Fusionsproteine wurden mit 50 mM TRIS pH 8, 10 mM Glutathion eluiert. GST-fusioniertes murines

Fetuin bzw. dessen Deletionsmutanten fallen jedoch zu über 90% in Form von Inclusion Bodies an.

Maltose Binding Protein (MBP, 42.5 kDa) fusionierte Proteine hingegen binden an Amylose und wur-

den mit 10 mM Maltose, 10 mM TRIS pH 7.4, 200 mM NaCl und 1 mM EDTA eluiert.

Aus Inclusion Bodies GST-mAHSG und dessen Deletionsmutanten werden auch bei IPTG Kon-

zentrationen <0.1 mM und Raumtemperatur derart stark exprimiert, daß sie in unlöslicher Form als

Inclusion Bodies anfallen. Durch Zentrifugation bilden sie ein kompaktes bräunliches Pellet. Mehr-

maliges waschen mit 50 mM TRIS pH 8, 1 mM DTT und 1 mM EDTA, 1 mM PMSF und 1%

Triton-X 100 führt zu einer deutlichen Aufhellung des Pellets. Dieses wurde in Denaturierungspuffer

(6 M GdnHCl, 50 mM HEPES pH 8, 20 mM DTT, 1 mM EDTA) in hoher Konzentration (~10 mg/ml)

gelöst. Sollten die Inclusion Bodies über einen längeren Zeitraum gelagert werden, erfolgte eine Dia-

lyse gegen 20 mM NH4CO3 bei 4°C, die zur vollständigen Präzipitation des denaturierten Proteins

führte. Das nunmehr beige-weiße Präzipitat wurde mit 20 mM NH4CO3 gewaschen und lyophylisiert.

2.2.7. Rückfaltung denaturierter Proteine

Die Isolierung der Fusionen als hochmolekulare Aggregate machte eine erneute Faltung erforderlich.

Alle Fusionen wurden in einem ersten Schritt in 6 M Harnstoff bzw. GdnHCl und 100 mM DTT

denaturiert. Die Fusionen wurden durch schnelle Verdünnung [MBP-Fusion] < 50 µg/ml in einen

Glutathion-Redoxpuffer erneut gefaltet. Der Redoxpuffer enthielt typischerweise folgende Bestand-

teile:

• 50 mM TRIS pH 8

• 2 mM reduziertes Glutathion (GSH)

• 0.2 mM oxidiertes Glutathion (GSSG)

Verschiedene Methoden wurden zur Unterdrückung der Aggregation angewandt. Allen liegt die schnel-

le Verdünnung des denaturierten Proteins in einen Rückfaltungs-/Redoxpuffer, der verschiedene Zu-

sätze enthält zugrunde:

• Chaotrope Reagenzien: 0.5–1.5 M GdnHCl, Arginin bzw. Harnstoff

• 0–300 mM NaCl bzw. KCl

• Zwitterionen: 1 M Betain, Taurin bzw. NDSB 201

• 0.001–0.1% SDS bzw. N-Lauroylsarcosin

2.2 Methoden 23

Lediglich durch Zugabe von 1 M NDSB201 zum Rückfaltungspuffer konnte Fetuin als Monomer

zurückgefaltet werden. Diese Rückfaltungsmethode wird in Kapitel 3.2.2 detailliert beschrieben.

2.2.8. Proteinbestimmung

Der Bradford Protein Assay ist ein colorimetrisches Verfahren zur Bestimmung der Proteinkonzen-

tration. Dabei bindet der verwendete Coomassie Blau Farbstoff hauptsächlich an basische und aro-

matische Aminosäuren des Proteins. Abhängig von der Proteinkonzentration ergibt sich ein Übergang

von einer rot-braunen Farbe nach dunkelblau, wobei sich das Absorptionsmaximum von 465 nm nach

595 nm verschiebt. Die Bestimmung mit Roti-Nanoquant (Roth, Karlsruhe) beruht auf der Absorption

bei 450 nm und 590 nm. Der Quotient A590A450

ist proportional zur Proteinkonzentration. Durch Vergleich

mit einer zuvor erstellten BSA-Eichreihe kann somit die Proteinkonzentration einer Probe ermittelt

werden.

2.2.9. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot

Die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Lämmli wurde zur

Überprüfung des Reinheitsgrades und der Größe der exprimierten Proteine eingesetzt.

Der Transfer der im Gel aufgetrennten Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran (Western Blot) er-

folgte nach dem “semidry” Verfahren von Schägger [106]. Zur Blockierung der Membran wurden

in Abhängigkeit vom Erstantikörper unterschiedliche Blockierpuffer verwendet (polyklonaler An-

tikörper mit 5% Milchpulver in PBS; monoklonaler Antikörper mit NET-Puffer: 50 mM Tris/HCl

pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 0.05 Triton X-100, 0.25% Gelatine). Nach jeder Inkubation mit

Antikörper-Lösung wurde die Membran kurz gespült und 3 mal 10 min bei 37°C rotierend mit Wasch-

puffer (PBS mit 0.1% Nonidet P-40) gewaschen. Der Peroxidase gekoppelte Zweitantikörper ermög-

licht über eine Chemilumineszenz-Reaktion die Detektion durch Auflegen eines Röntgenfilms [107].

Hierzu muß die Membran vorher eine Minute lang mit Substratlösung (100 mM Tris/HCl pH 8.5,

2.5 mM 3-Aminophtalhydrazid (Luminol), 0.4 mM p-Coumarsäure, 5 mM H2O2) inkubiert werden.

2.2.10. Inhibition der Calciumphosphat / Apatit Präzipitation

Die getesteten Cystatin-ähnlichen Domänen unterscheiden sich in ihrer Effizienz, die Präzipitation

von Calciumphosphat aus einer übersättigten Lösung zu inkubieren. Das Prinzip dieses Assays basiert

darauf, dem Inhibitionsmix (vgl. Tab. 2.4) eine geringe Menge 45CaCl2 beizumengen, wodurch die

Radioaktivität im Präzipitat bei Versuchsende mit dem inhibitorischen Potenzial des Proteins korrel-

liert. Es wurden zwei eng verwandte Systeme angewandt. Die Inhibition der rekombinant exprimierten

Proteine wurde nach Schema A (und B zur Kontrolle) getestet (vgl Kap. 3.3.1). Die Calciumphosphat-

Fetuin Aggregate wurden unter den Bedingungen von Schema B elektronenmikroskopisch nachge-

wiesenen (vgl. Kap. 3.4.2).


Schema A Schema Bnach Schinke et. al. [42]

V(Gesamt) [µl] 500 200CaCl2 [mM] 4.8 5

NaHPO4 [mM] 1.6 3Tris [mM] 50 50

Protein [µM] 0–10 0–10Temperatur [°C] 37 37

Inkubationsdauer [min] 90 70

Tabelle 2.4.: Parameter des Präzipitations-Assays. Das radioaktiv-versetzte CaCl2 wurde zuletzt hin-zugegeben.

Um die Vergleichbarkeit der Inhibitionspotenziale der murinen AHSG-Mutanten zu wahren, wurde

auf den von T. Schinke entwickelten Assay zurückgegriffen [42]. Die gebildete Präzipitatmenge wurde

in Triplikaten bestimmt. Es ist wichtig, unmittelbar nach Zugabe des radioaktiv versetzten CaCl2 zum

fertigen Inhibitionsmix stark zu vortexen, um die Standardabweichung hinsichtlich der gemessenen

Radioktivität im Präzipitat möglichst gering zu halten.

Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde das präzipitierte Calciumphosphat abzentrifugiert (5 min,

10000 g) und der Überstand vorsichtig abgenommen. Das Präzipitat wurde in 200 µl 1%iger Essigsäu-

re gelöst und anschließend mit 1 ml Szintillationsflüssigkeit vermischt. Die Messung der β-Strahlung

erfolgte mit einem Wallac 1450 MicroBeta TriLux.

2.2.11. Untersuchung des Inhibitionsmechanismus mittels Elektronenmikroskopie

und dynamischer Lichtstreuung

Die unten beschriebenen Untersuchungen wurden am MPI für Polymerforschung Mainz in Zusam-

menarbeit mit Dr. A. DuChesne (Transmissionselektronenmikroskopie) und Dr. J. Gapinski. (Dyna-

mische Lichtstreuung) durchgeführt.

Das verwendete bovine Fetuin wurde unmittelbar vor Versuchsbeginn in 50 mM TRIS pH 7.4 gelöst

und das Monomer von höhermolekularen Aggregaten mittels Gelfiltration (Pharmacia Superdex 200

HR 10/30) befreit. Zur Proteinbestimmung wurde ein modifizierter Bradford-Assay (Roti-Nanoquant,

Roth) eingesetzt. Alle verwendeten Lösungen wurden zuvor filtriert (0.22 µm Celluloseacetat-Membran,

Schleicher & Schuell). Die Proben wurden, wie zuvor in Kapitel 2.2.10 beschrieben, nach Schema B

mit 10 µM bovinem Fetuin, bzw. mit BSA1 in gleicher Konzentration zur Kontrolle, hergestellt.

1Bovines Serum Albumin (BSA) ist das am höchsten konzentrierte Plasmaprotein. Eine Funktion dieses Proteins bestehtdarin, Calcium-Ionen im Serum zu binden. Im Präzipitations-Assay zeigt es, vermutlich aufgrund der starren Helix-Struktur, nur ein geringes inhibitorisches Potenzial.

2.2 Methoden 25

Transmissionslektronenmikroskopie (TEM) Nach Ablauf der Inkubationszeit (2–30 h) bei Raum-

temperatur bzw. 37°C, wurde der Versuch durch Dialyse (mindestens 1:500) gegen leicht basisches

(NH3) Millipore Wasser bei 4°C abgebrochen. Anschließend wurden die Proben 1 min lang bei etwa

3000 g zentrifugiert. Ein Tropfen des Überstandes wurde dann auf ein mit einem Kohlenstoff-Film

beschichtetes Kupfer-Netzchen übertragen. Nicht abfließende Flüssigkeit wurde seitlich mit Zellstoff

vorsichtig abgesaugt.

Die transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden an einem Leo 912 Ω bei 120 kV

durchgeführt, wobei eine Objektiv-Apertur von 16.5 mrad verwendet wurde. Die Breite des Energie-

fensters betrug 10 eV. Alle Bilder wurden mit einer Slow Scan CCD Kamera (1024 x 1024 Pixel bei

14 Bit Grauwert-Tiefe) aufgenommen.

Die Energy Filtering Transmission Electron microscopy (EFTEM) verknüpft die TEM mit der Elec-

tron Energy Loss Spectroscopy (EELS). Mit EELS wird die Energieverteilung inelastisch gestreuter

Elektronen ermittelt. Hierbei können unter Ausnutzung der Element-spezifischen Absorptionskanten

gezielt Elemente detektiert werden. EFTEM vermag daher die Verteilung der inelastisch gestreuten

Elektronen ortsaufgelöst wiederzugeben. Dazu wird aus zwei Bildern vor der Absorptionskante durch

Extrapolation ein Bild unmittelbar vor der Kante berechnet und ein Bild bei maximaler Absorption

ermittelt. Anschließend wird vom Bild bei maximaler Absorption das Untergrundbild abgezogen.

Dynamische Lichtstreuung (DLS) Die auf 20°C temperierte Lichtstreuungszelle wurde von ei-

nem Laser (Spectra Physics 165, 514 nm, 300 mW) durchstrahlt. Die gestreute Intensität wurde

in VV-Geometrie (90o) detektiert und in einen ALV 5000 Autocorrelator eingespeist. Zweifach-

exponentielles Fitting führte zu der bestmöglichen Anpassung an die Autokorrelationsfunktionen.

2.2.12. Komparative Strukturmodellierung

Zusammen mit Dr. J. Grötzinger (RWTH-Aachen/Universität Kiel) wurde unter Verwendung der

Röntgenstrukturen von chicken egg white Cystatin (1 CEW) [104] und Malonyl-CoA: Acyl Carrier

Protein Transacylase (1MLA) [108] mit Hilfe des Computerprogramm-Pakets WHATIF (Sgi, IRIX)

[109] ein Modell der Domänen von Fetuin erstellt. Darüber hinaus wurden selbständig unter Ver-

wendung der folgenden Programme Modelle aller zur Cystatin-Superfamilie gehörenden Domänen

erarbeitet (Stefin ausgenommen):

MODELLER4 (X86, LINUX) wurde sequenzvergleichenden Modellierung der Domänen, basierend

auf räumlichen Beschränkungen, genutzt [110, 111].

PROCHECK 3.5 (x86, LINUX) [103] ist ein Programm zur Evaluierung von Proteinstrukturen anhand

von Torsionswinkeln und Bindungslängen (vgl. Kapitel 1.4).


PROSA II 3.0 (x86, LINUX) [112] ist ein weiteres Programm zur Analyse von Proteinstrukturen. Es

erweitert die Beurteilungsmöglichkeiten der Qualität von Proteinfaltungen anhand des

z-scores (ZStruktur). Hierfür werden Polyproteine bestehend aus einzelnen Proteinstruktu-

relementen konstruiert, die über Linker miteinander verbunden sind. In Prosa II ist ein

Polyprotein bestehend aus 219 Strukturen mit einer Sequenzlänge von etwa 47000 As

implementiert. Die Sequenz der zu analysierenden Struktur wird entlang der gesamten

Polyprotein-Struktur verschoben und für jede Position, d.h. die Anzahl der Konformatio-

nen entspricht annähernd der Sequenzlänge des Polyproteins, die Energie der Konforma-

tion durch Aufsummieren der Cβ—Cβ Paar-Wechselwirkungen berechnet. Die mittlere

Energie E aller generierten Konformationen sowie die daraus resultierende Standardab-

weichung σ gehen in den z-score ein, der die Energie der zu analysierenden Struktur

EStruktur mit den Energien aller generierten Konformationen in Relation setzt:

ZStruktur = EStruktur E

σProteine mit nativer Faltung fallen in einen für die Sequenzlänge typischen z-score Be-

reich. Mit zunehmender Sequenzlänge wird dieser Wert negativer.

MOLMOL 2K.1 (x86, Win NT) [113] wurde zur Berechnung und Darstellung der Oberflächenpoten-

ziale verwendet.

VMD 1.6 (x86, LINUX) [114] ist ein Strukturbetrachter. Zusätzlich konnten mit dem Hilfsprogramm

MSMS [115] schnell molekulare Oberflächen erzeugt werden. Die Strukturen wurden

schließlich durch Betrachtung auf ihre Kompaktheit untersucht. Zur Bildausgabe der

Strukturmodelle wurde Raster 3D [116] verwendet.

3. Ergebnisse

3.1. Strukturmodelle

3.1.1. Bewertung der modellierten Strukturen

Von AHSG selbst sind keine Strukturdaten verfügbar. Daher wurden Modelle nach der Struktur von

chicken egg white cystatin [Röntgenstruktur, 1CEW: 104] erstellt. Zunächst mußte ein Sequenzver-

gleich zwischen der Sequenz der bekannten Ausgangsstruktur und der Sequenz des Zielproteins mit

unbekannter Struktur angefertigt werden. Dabei war darauf zu achten, daß innerhalb der Sekundär-

strukturelemente α-Helix und β-Faltblatt keine Sequenzlücken auftraten. Vielmehr mußten Sequenz-

lücken bzw. -überhänge in unstrukturiertere Bereiche verschoben werden. Bei der anschließenden Mo-

dellierung wurden die in Kapitel 1.4 erwähnten Vorgaben berücksichtigt: die geladenen Aminosäure-

Reste des β-Faltblattes waren nach außen gerichtet, hydrophobe Reste zeigten in den kompakten Kern.

Die Modellierung gestaltete sich in in mehreren Verfeinerungs-Zyklen. Jeder Verfeinerungs-Schritt

mit MODELLER4 ergab eine frei wählbare Anzahl von möglichen Modellen, die anschließend eva-

luiert werden mußten. Hierfür wurde auf die Programme PROCHECK und PROSA II zurückgegriffen

(vgl. Kap. 2.2.12). Die nachfolgend angeführten Modelle bieten zwar keine atomare Auflösung, da

jedoch die Anordnung der As innerhalb der Sekundärstrukturelemente stimmig ist, kann von einem

educated guess gesprochen werden.

Die Analyse der Konformation ergab vereinzelt ungünstige Torsionswinkel für Aminosäuren in den

Schleifen zwischen den Strängen des β-Faltblattes. Bei durchgehend geringer Identität der Sequenzen

Cystatin-ähnlicher Domänen zur 1CEW-Basisstruktur von maximal 27% gelang es zwar, verbote-

ne Torsionswinkel in der backbone-Struktur zu vermeiden, der Anteil der Aminosäuren in den stark

bevorzugten Bereichen (vgl. Abb. 1.2a) lag jedoch nur zwischen 75 und 88%. Sequenzbrüche auf-

grund unterschiedlicher Sequenzlängen wurden innerhalb der Sekundärstrukturen vermieden, wirkten

sich jedoch in unstrukturierten Bereichen durch ungünstige Torsionswinkel und Abweichung von der

idealen Bindungslänge deutlich aus. Durch unterschiedliche Sequenzlängen können daraus Verschie-

bungen von Strukturelementen resultieren, sogannte rigid body shifts, die jedoch nicht oder nur sehr

schwer zu modellieren sind und folglich auch in den erstellten Modellen unberücksichtigt blieben. Die

erwähnten Abweichungen beeinträchtigen zwar die Qualität einzelner Modelle in ihrer Gesamtheit er-

28 Ergebnisse

heblich, befinden sich aber alle außerhalb der Bindungsregion auf dem ausgedehnten β-Faltblatt, das

die Bindung an Apatitoberflächen vermittelt. Ein akzeptabler z-score sowie die korrekte Orientierung

der geladenen und der hydrophoben Aminosäuren auf dem β-Faltblatt verleihen den Modellen hin-

sichtlich der Adsorption an Apatitoberflächen daher eine ausreichend hohe Aussagekraft.

PROCHECK (φ, ψ) PROSA II

Domäne Seq

uenz

läng

e

%Id

entit

ätzu

1CE

W

bevo

rzug

t

erla

ubt

bedi

ngt

erla

ubt

z-sc

ore

1CEW 108 100 83 (90.2%) 8 (8.7%) 1 (1.1%) -7.18

mAHSG D1 105 16 81 (85.3%) 10 (10.5%) 4 (4.2%) -5.18mAHSG D2 99 21 68 (76.5%) 19 (21.3%) 2 (2.2%) -4.45

mFetB D1 111 21 78 (78.8%) 19 (19.2%) 2 (2.0%) -6.24mFetB D2 107 25 73 (77.7%) 17 (18.1%) 4 (4.2%) -4.24

hHRG D1 110 19 80 (79.2%) 18 (17.8%) 3 (3.0%) -5.35hHRG D2 103 22 68 (74.7%) 21 (23.1%) 2 (2.2%) -4.75

hKNG D1 107 26 87 (87.9%) 11 (11.1%) 1 (1.0%) -6.87hKNG D2 106 21 76 (79.1%) 18 (18.8%) 2 (2.1%) -3.63hKNG D3 104 27 81 (84.4%) 12 (12.5%) 3 (3.1%) -5.78

Tabelle 3.1.: Evaluierung der Cystatin-ähnlichen Domänen. Alle Domänen besitzen eine niedrigeSequenz-Identität zu chicken egg white cystatin (1CEW). Die Torsionswinkel φ und ψ aller Aminosäu-ren liegen zu maximal 88% in stark begünstigten Konformationsbereichen des Ramachandran-Plots.Glycin und Prolin werden aufgrund ihrer sterischen Besonderheiten generell nicht berücksichtigt.Keines der Modelle zeigt Konformationen, die in verbotene Torsionswinkel-Bereiche fallen.

mAHSG D1 fiel durch eine im Vergleich zu den anderen Domänen extrem geringe Sequenz-Identität

von nur 16% mit chicken egg white cystatin (1CEW) auf, das Alignment der Sequenzen im Bereich

der Sekundärstrukturen war jedoch unproblematisch. Das Alignment der zweiten Domäne von hKNG

hingegen erwies sich trotz geringfügig höherer Sequenz-Identität (21%) als wesentlich schwieriger,

was sich in einem niedrigen Betrag des z-scores wiederspiegelt. Generell ließ sich jeweils die er-

ste aminoterminale Domäne einfacher modellieren als die nachfolgenden Domänen. Dies zeigt sich

im prozentualen Anteil der Aminosäuren in bevorzugten Torsionsbereichen des Ramachandran-Plots

sowie in einem hohen Betrag des z-scores.

3.1 Strukturmodelle 29

3.1.2. Domänen-Modell von AHSG

Abbildung 3.1.: Modell der drei Domänen von Fetuin. Die ersten beiden Domänen (D1 und D2)gehören zur Cystatin Superfamilie. D3 besitzt eine strukturelle Homologie zu einer Insertionsdomänevon Malonyl-CoA: Acyl Carrier Protein Transacylase.

Abbildung 3.1 zeigt das Modell aller drei Domänen von murinem AHSG. Die ersten zwei Cystatin-

ähnlichen Domänen besitzen C-terminal ein viersträngiges antiparalleles β-Faltblatt, das sich um ei-

ne N-terminale α-Helix wölbt. Dem Modell dieser beiden Domänen liegt die Röntgenstruktur von

Chicken-Egg-White-Cystatin (1CEW) zugrunde [104].

Die erste Cystatin-ähnliche Domäne vermag die Präzipitation von Calciumphosphat/Apatit aus über-

sättigter Lösung zu inhibieren [42] und TGF-β zu binden [77, 78]. Die zweite Cystatin-ähnliche

Domäne trägt N- und O-glykosidisch verknüpfte Zuckerseitenketten. Die dritte Domäne weist eine

strukturelle Homologie zu einer Insertionsdomäne des E. coli Proteins Malonyl-CoA: Acyl Carrier

Protein Transacylase (1MLA) [108] auf. Das Strukturmotiv, das die Bindefähigkeit von Fetuin ge-

genüber Fettsäuren, Lipiden und Cholesterin vermittelt [85, 86, 87], ist daher warscheinlich innerhalb

der letzten Domäne lokalisiert.

Ausgehend von den modellierten Tertiärstrukturen der drei Fetuin/AHSG-Domänen, kann über die

Anordnung zueinander, d.h. die Quartärstruktur, nur spekuliert werden. Aufgrund der gewölbten Form

der Cystatin-ähnlichen Domänen ist es denkbar, daß diese entlang ihrer α-Helices aggregieren. Die

30 Ergebnisse

dritte Domäne würde dann verbrückend über den beiden Domänen positioniert sein und durch die

Disulfid-Brücke zum N-Terminus der ersten Domäne die Struktur stabilisieren.

Abbildung 3.2.: Proteinsequenz-Alignment mit Clustal W [117] der für das Modelling verwen-deten Sequenzabschnitte Cystatin-ähnlicher Domänen mit Angabe der Sekundärstruktur-Elemente(m = Maus, r = Ratte, h = Mensch). Die kürzere α-Helix wurde mittels Röntgenbeugung bestimmt,die NMR-Struktur [118] gibt hier jedoch einen Coiled-Bereich an. Für Reste, die auf dem β-Faltblattlokalisiert sind, gilt folgendes Farbschema: sauer-rot, basisch-blau.

Die aminoterminalen Domänen aller in Abbildung 3.2 aufgeführten Proteine der Cystatin-Superfamilie

besitzen zwei Disulfid-Brücken. Die jeweils nachfolgenden Domänen enthalten zusätzlich eine en-

ge Disulfid-verbrückte Schleife. Nur der durch die Röntgenstruktur abgedeckte Sequenzbereich des

Chicken-Egg-White-Cystatins (1CEW) konnte für die nachfolgenden Modelle in Betracht gezogen

werden. Daher sind die Modelle dieser Domänen amino- und carboxyterminal um durchschnittlich

ca. 15 Aminosäuren verkürzt.


Nahezu jede zweite Position auf dem β-Faltblatt der ersten Domäne von Fetuin (mAHSG D1) ist mit

einer geladenen Aminosäure, meist einer sauren, besetzt. Keine andere Cystatin-ähnliche Domäne

weist eine derart hohe Konzentration an sauren Aminosäure-Resten auf ihrem β-Faltblatt auf. Die

β-Faltblatt Konformation bedingt eine alternierende Orientierung der Reste, wodurch geladene bzw.

polare Reste überwiegend nach außen, hydrophobe Reste hingegen in den Kern zeigen (Abb. 3.3).

Für mAHSG D1 gilt daher, daß fast jede exponierte, d.h. dem Solvens ausgesetzte Position, mit einer

sauren Aminosäure (oder zumindest mit einer geladenen As) besetzt ist (vgl. Abb. 3.2). Der Abstand

dieser Reste zueinander beträgt 4–9 Å und liegt somit im Bereich der Gitterkonstanten der Apatit-

Struktur.

(a) AHSG Domäne 1 (b) Orientierung der As-Reste auf dem beta-Faltblatt

Abbildung 3.3.: (a) AHSG D1 besitzt eine im Vergleich zu anderen Cystatin-ähnlichen Domänen au-ßerordentlich hohe Konzentration an sauren As-Resten [119]. (b) Aufgrund der alternierenden Orien-tierung der Aminosäure-Reste auf dem β-Faltblatt der ersten Domäne von AHSG zeigen vorwiegendpolar-geladene Reste nach außen und hydrophobe Reste Richtung α-Helix in den Core. Das Farbsche-ma entspricht dem des Alignments (vgl. Abb. 3.2), hydrophobe Reste sind weiß gekennzeichnet.

32 Ergebnisse

3.1.3. Modelle der Cystatin-ähnlichen Domänen

Die mit den Programmen MODELLER4 und MOLMOL erstellten Cystatin-ähnlichen Domänen sind

als Aufsicht auf das β-Faltblatt in Abbildung 3.4 dargestellt. Ein Vergleich der Ladungsverteilungen

auf den β-Faltblättern der Domänen verdeutlicht die bereits im Sequenzalignment gefundenen Un-

terschiede. Das inhibitorische Potenzial dieser zusätzlich rekombinant exprimierten Domänen ist in

Kapitel 3.3.1 beschrieben.

Im folgenden werden die modellierten Strukturen im Hinblick auf Bindung an HAp-Oberflächen bzw.

Inhibition der Calciumphosphat-Präzipitation diskutiert:

AHSG

Domäne D1 zeigt auf ihrem β-Faltblatt einen einzigartigen negativ geladenen Bereich. Die sauren

Aminosäure-Reste binden entweder direkt an Calcium-Ionen oder sie besetzen vakante Phosphat-

Positionen an der Oberfläche. Eine genaue Zuordnung der Bindungspartner auf atomarer Ebene oder

die Vorhersage einer bevorzugten Adsorption an eine bestimmte Fläche der Apatitstruktur ist jedoch

nicht möglich.

Im Vergleich dazu sind in der Domäne D2 mehrere exponierte Positionen statt mit geladenen Ami-

nosäuren mit polaren oder hydrophoben Aminosäuren besetzt. Die vereinzelten Ladungen vermögen

offenbar nicht, die Präzipitation von Calciumphosphat/Apatit aus überättigter Lösung zu inhibieren.

FETUB

Bisher konnte keine Funktion dem von Olivier et. al. [88] durch Alignment überlappender ESTs ent-

deckten zweiten Fetuin Typus zugeordnet werden. Es handelt sich ebenfalls um ein Protein mit drei

Domänen, wobei die ersten zwei aminoterminalen Domänen Cystatin-ähnlich sind. Im Rahmen der

vorliegenden Arbeit stellte sich die Frage, ob ausgehend vom Modell eine Vorhersage bezüglich der

Inhibitionseffizienz getroffen werden kann und darüberhinaus, inwieweit FETUB als Inhibitor im Se-

rum relevant ist. Beide Domänen zeigen keinen zusammenhängenden Bereich mit negativer Ladung.

Vielmehr tragen basische Aminosäurereste zu einer unregelmäßigen Ladungsverteilung bei. Die Ver-

mutung lag daher nahe, daß Fetuine vom Typ B schwächer inhibieren würden als vom Typ A.

Histidine Rich Glycoprotein (HRG)

Es ist bekannt, daß humanes HRG molar etwa nur halb so effizient die Präzipitation von Calcium-

phosphat zu inhibieren vermag wie AHSG [44]. Zwei der drei Domänen sind Cystatin-ähnlich. Die

Modelle der Cystatin-ähnlichen Domänen von HRG zeigen ebenfalls eine unregelmäßige Ladungs-

verteilung. Die verminderte Effizienz ist daher nicht verwunderlich.


Abbildung 3.4.: Modelle der Domänen von Proteinen der Cystatin-Superfamilie (negative Ladung -rot, positive Ladung - blau)

34 Ergebnisse

Kininogen

Kininogen besteht aus fünf Domänen wovon drei Cystatin-ähnlich sind. Auf den β-Faltblättern der

drei Cystatin-ähnlichen Domänen ist ebenfalls ein unregelmäßiges Ladungsmuster sichtbar. Deshalb

konnte mit großer Sicherheit für alle drei Domänen ein im Vergleich zu AHSG vermindertes Inhibiti-

onspotenzial angenommen werden.

3.2. Expression, Rückfaltung und Isolierung rekombinanter Fetuine

Mit der Klonierung und Expression verschiedener Fetuine und deren Deletionsmutanten wurden zwei-

erlei Ziele verfolgt. Einerseits sollten die Teildomänen im beschriebenen Präzipitations-Assay getestet

werden, um das inhibitorische Motiv innerhalb der ersten Domäne weiter einzugrenzen, und anderer-

seits in hoher Reinheit und intakter Konformation, d.h. alle Disulfidbrücken geschlossen und keine

Aggregate-Bildung, für eine CD- und NMR-Strukturuntersuchung angereichert werden.

3.2.1. Expression in E. coli

Hierzu wurden Konstrukte verschiedener Längen in die Vektoren pGEX-2T, pMal-c2, pET-21a(+)

und pFLAG-MAC kloniert und in dem Bakterienstamm BL21 exprimiert. Aus Tabelle 3.2 ist er-

Vektor pGEX-2T pMAL-c2 pET-21a(+) pFLAG-MACPromotor tac tac T7 tac

N-term. Fusion GST MBP T7-Tag Flag-Tag

Insert mAHSG kompl. FETUB mAHSG

kom

plet

t

D1+

2

D1

Del

etio

nsm

utan

ten

Men

sch

Rat

te

Mau

s

1-11

9C

>S

1-23

4C

>S

1-11

9/2

34C

>S

kom

plet

t

Expression + + + + + + - + - +

Tabelle 3.2.: Schematische Darstellung der Expression von mAHSG und dessen Mutanten sowieFETUB in verschiedenen Expressionssystemen

sichtlich, daß die Konstrukte unterschiedlich gut exprimiert wurden. Die GST-fusionierten Fetuine

wurden durchweg am stärksten exprimiert. Allerdings fielen dabei etwa 90% zwar als unlösliche, je-

doch fast verunreinigungsfreie Inclusion Bodies (IBs) an. Generell wurde die Expression mit 300 µM

IPTG Endkonzentration induziert. Selbst eine Erniedrigung auf 83 µM führte bei den GST-fusionierten

3.2 Expression, Rückfaltung und Isolierung rekombinanter Fetuine 35

AHSG-Deletionsmutanten zu keiner nennenswerten Erhöhung des Anteils an löslichem cytoplasma-

tischem Protein. Bei MBP-Fusionen lag das Verhältnis von löslichem (cytoplasmatischem) AHSG

und in Form von unlöslischen Inclusion Bodies aggregiertem AHSG bei etwa 1:1. Es zeigte sich,

daß Konstrukte mit einer größeren N-terminalen Fusion (die Proteine MBP und GST) weitaus besser

exprimiert werden als mit kleinen Peptiden (T7-Tag und Flag-Tag). Anscheinend begünstigen große

aminoterminal an mAHSG fusionierte Proteine die Stabilität des Konstruktes.

3.2.2. Rückfaltung

Fetuin und seine Cystatin-ähnlichen Domänen

GST-mAHSG und dessen Deletionsmutanten fallen als Inclusion Bodies an und müssen daher erst

mit Harnstoff oder GdnHCl denaturierend solubilisiert und anschließend renaturiert werden. MBP-

mAHSG ist zwar überwiegend löslich im Cytoplasma lokalisiert, bleibt jedoch ohne Renaturierung,

d.h. Neubildung der Disulfidbrücken, im Präzipitations-Assay (vgl. Kap. 2.2.10 und 3.3.1) inaktiv.

Zuvor beschriebene Renaturierungen von Fetuin erwiesen sich als schlecht reproduzierbar und er-

gaben zu geringe Ausbeuten, da das Protein bei Verdünnung in den Rückfaltungspuffer präzipitierte

[42, 78]. Außerdem waren mit diesen Methoden nur marginale Mengen Monomer zu produzieren.

Voraussetzung für eine Strukturanalyse ist jedoch monomeres Fetuin. Folglich mußten die bekannten

Methoden durch Modifizierungen weiterentwickelt werden.

Erst gegen Ende der experimentellen Arbeiten stellte sich heraus, daß der Zusatz von NDSB 201 (3-(1-

Pyridino)-1-Propan Sulfonat, PPS) bei Rückfaltung von MBP-mAHSG bzw. mFETUB die Isolation

von Monomeren ermöglicht. Eine GST-Fusion hingegen führt jedoch zu Trimeren und höhermole-

kularen Aggregaten. Darauf gründet nun eine separate Strategie zur Isolierung der rekombinanten

Proteine zum Zweck der Strukturbestimmung, die allerdings gerade erst begonnen hat.

Bei NDSB 201 handelt es sich um ein Zwitterion, das bereits zuvor [120, 121], aufgrund geeigne-

ter physikochemischer Eigenschaften, bei Proteinrückfaltungen Anwendung fand: es ist gut löslich,

es wirkt nicht chaotrop, bildet keine Micellen und verändert nicht die Viskosität der Lösung. Es sta-

bilisiert exponierte hydrophobe (Kern-)Bereiche im Moment der Faltung und verhindert somit eine

Aggregation.

Das denaturiert vorliegende MBP-mAHSG wurde durch eine Glaskapillare in 1 M NDSB 201 haltigen

Rückfaltungspuffer auf eine Endkonzentration unter 50 µg/ml verdünnt und über Nacht bei Raumtem-

peratur stehengelassen. Anschließend wurde die Lösung durch Ultrafiltration etwa fünf-fach aufkon-

zentriert und gegen TRIS-Puffer dialysiert (mindestens 1:2000).

Mittels Gelfiltration wurde die Rückfaltungsqualität hinsichtlich des Monomer-Anteils überprüft (vgl.

Abb. 3.5. Laufpuffer: 50 mM KH2PO4 pH 6, 300 mM KCl (Chromatographie in TBS ist nahe-

zu identisch). Die Peaks wurden fraktioniert gesammelt und im ELISA auf mAHSG getestet. Zwi-

schen Fetuin und dem aminoterminal fusionierten MBP ist die Sequenz IEGR lokalisiert, wodurch die

36 Ergebnisse

(a) Faktor Xa Spaltung vor Rückfaltung (b) Faktor Xa Spaltung nach Rückfaltung

Abbildung 3.5.: Gelfiltration (Superdex 200 HR 10/30, OD280) im Rahmen der Protein-Faltungsprozedur zur Prüfung auf Aggregatbildung:(a) Chromatogramm 1 vor Rückfaltung, Peak A: liegt unmittelbar nach Elution von der Amylose-Säule ausschließlich als hochmolekulares Aggregat 600 kDa vor. Chromatogramm 2: Faktor XaSpaltung an der Spaltstelle zwischen den beiden Proteinen (MBP = 42.5 kDa, mAHSG = 38.5 kDa).Der Hauptpeak weist unverändert auf hochaggregiertes Protein hin. Zusätzlicher Fetuin-haltiger Peakbei ~150 kDa (B). Chromatogramm 3 nach Rückfaltung mit NDSB 201: mAHSGmyc (D) und MBP(E).(b) Chromatogramm 1 nach Rückfaltung des ungespaltenen MBP-mAHSG in NDSB 201, Chroma-togramm 2 nach Faktor Xa Spaltung des renaturierten Proteins: Aggregat (A), MBP-mAHSGmycMonomer (B), mAHSGmyc Monomer (C) und MBP Monomer (D).

MBP-Fusion mit Faktor Xa vom Fetuin abgespalten werden kann. Nach Faktor Xa-Spaltung wird das

Fetuin-Monomer (apparentes Molekulargewicht: ~56 kDa) deutlich vor dem MBP (apparentes Mole-

kulargewicht: ~40 kDa) eluiert (vgl. Abb. 3.5 (a) und (b)). Eine SDS-Gel Silberfärbung zeigte jedoch

keine Protein-Bande oberhalb von 43 kDa, sondern gab die korrekten Molekulargewichte entspre-

chend der Proteinsequenz wieder (mAHSGmyc 38.5 kDa, MBP 42.5 kDa). MBP-mAHSG, welches

unter Zusatz von NDSB 201 zurückgefaltet wurde, inhibiert die Calciumphosphat Präzipitation mit

einer IC501 von 0.6–1 µM, womit dieser Wert etwas über dem Referenzwert von kommerziellem

bAHSG von 0.47 µM liegt [42] (vgl. Kap. 3.3.1).

1Konzentration der halbmaximalen Inhibition

3.2 Expression, Rückfaltung und Isolierung rekombinanter Fetuine 37

Fusion der Fetuin Domäne 1 mit BMP-2

Bisher wurde das osteoinduktive Zytokin BMP-2 nur lokal in der Dentalrekonstruktion eingesetzt.

In anderen Versuchen zur Knochenrekonstruktion wurde die systemische Applikation gewählt. Dabei

gelangte nur ein geringer Teil des BMP-2 vom Injektionsort bis in den Knochen, um dort auf Osteo-

blasten differenzierungsfördernd wirken zu können. Fetuin hingegen erreicht über den Blutkreislauf

den Knochen und akkumuliert dort [74, 75]. In einem Bone Targeting Ansatz sollte die erste Domäne

von Fetuin, die das inhibtorische Strukturmotiv mit der hohen HAp-Bindungsaffinität (vgl. Kap. 4.2)

enthält [42] mit dem BMP-2 fusioniert werden.

Aktives BMP-2 liegt als Dimer mit einer intra- und einer intermolekularen Disulfidbrücke vor. Da nur

das aminoterminale Ende von BMP-2 frei zugänglich ist [Röntgenstruktur: 122], ergab sich folgende

Klonierungsstrategie:

• Cystein14 in mAHSG D1 wurde durch Serin substituiert (C>S). Normalerweise ist Cys14 an

einer Disulfid-Brücke zwischen Fetuin D1 und D3 beteiligt. Im verkürzten Fetuin D1 kann je-

doch diese Brücke nicht geschlossen werden. Somit würden die verbleibenden Cys14 durch

unerwünschte Brückenbildungen nur stören. Derartige Faltungsstörungen wurden in Konstruk-

ten mit freien Cys auch tatsächlich beobachtet. mAHSG D1 besitzt eine TGF-β Typ II Rezeptor

(TGFR) ähnliche Disulfid-verbrückte Schleife [77]. Deshalb wurden zwei Längen kloniert: 1–

116 umfasst die gesamte Domäne (mit TGFR), 1–95 ist um einen Strang des β-Faltblattes und

TGFR verkürzt.

• Carboxy-Terminus von mAHSG D1 und amino-Terminus hBMP-2 sind über einen Glycin-

Serin Linker (GS)x mit einander verknüpft.

• Der amino-Terminus von BMP-2 wurde um die Heparin-Bindungsstelle [123] verkürzt (11 As).

Das Konstrukt wurde gut exprimiert, wobei die GST-Fusionen hauptsächlich als IBs anfielen. Die

Rückfaltung stellte allerdings wiederum ein großes Problem dar. Nach der Rückfaltungsprozedur wa-

ren mittels Gelpermeationschromatographie stets nur hochmolekulare Aggregate >150 kDa detektier-

bar. Es war zu befürchten, daß BMP-2 als Mitglied der TGF-β Superfamilie an die TGFR-ähnliche

Schleife binden würde. Dies führt zur Ausbildung inter- und vielleicht auch intramolekularer Ag-

gregate. Aber auch das verkürzte mAHSG D1 1–95 ist nur als hochmolekulares Aggregat detektier-

bar. Möglicherweise sind auch hier, wie auch bei den einzelnen mAHSG D1 Fragmenten, durch die

Verkürzung hydrophobe Bereiche des Kerns nun dem Solvens ausgesetzt, was die zu beobachtende

Aggregation zur Folge hat. Da keine funktionellen mAHSG-D1—BMP-2 Dimere hergestellt werden

konnten, wurde dieser Ansatz wieder verworfen.

38 Ergebnisse

Schema der Konstrukte:

Die beiden Teile mAHSG D1 und BMP-2 können über die Schnittstellen Kpn2I oder BamHI in ihren(GS)-Linker-Hälften zusammengefügt werden.

MBP/GST Fusionsprotein — mAHSG D1 C>S — (GS)x — BMP-2

Western Blot:

Abbildung 3.6.: Expression der mAHSG-D1—BMP-2 Fusionen. (K) GST mAHSG Kontrolle, (1)GST mAHSG1-116C>S (GS)6 BMP-2 (Kpn 2I), (2) GST mAHSG1-116C>S (GS)7 BMP-2 (Bam-HI), (3) MBP mAHSG1-116C>S (GS)6 BMP-2, (4) MBP mAHSG1-95C>S (GS)6 BMP-2, (5)GST mAHSG1-95C>S (GS)6 BMP-2. 1–3: je zwei Klone in 2 YT- bzw. SOC-Medium. 4+5: inSOC-Medium. Die erste Western-Blot Detektion erfolgte mit polyklonalem anti-mAHSG Erstanti-körper (oben). Anschließend wurden die Antikörper durch Inkubation der Membran mit 0.7% β-Mercaptoethanol, 2% SDS, 80 mM TRIS pH 6.8, 30 min bei 50°C abgewaschen. Die zweite Western-Blot Detektion erfolgte mit monoklonalem anti-hBMP-2 Antikörper (unten).

3.3. Inhibition der Calciumphosphat-Präzipitation

3.3.1. Rekombinant exprimierte Proteine

Zur genaueren Charakterisierung des inhibitorischen Sequenz-/Strukturmotivs innerhalb mAHSG D1

wurden auf den Arbeiten von Schinke et. al. [42] aufbauend, weitere GST-fusionierte Deletionsmu-

tanten vom AHSG der Maus kloniert. Diese wurden in E. coli exprimiert, affinitätschromatographisch

isoliert, denaturiert, renaturiert und zuletzt im Präzipitationsassay nach Schema A (vgl. Kapitel 2.2.10)

getestet. Hierbei wurde die erhaltene Präzipitatmenge im Vergleich zu Protein-freien Kontrolle in ei-

nem Konzentrationsbereich von 0.1 bis 10 µM gemessen. Rekombinantes AHSG inhibiert bereits bei

3 µM die Präzipitation. FETUB und KNG sind schwächere Inhibitoren, die erst oberhalb von 5 µM

inhibieren (mFETUB, rFETUB, KNG D2).

3.3 Inhibition der Calciumphosphat-Präzipitation 39

Abbildung 3.7.: Inhibition der Cystatin-ähnlichen Domänen. Oben: Schema der mAHSG D1 mitSequenzlängenmarken, die die entsprechenden verwendeten Fragmentbereiche anzeigen. Unten: In-hibition in % der Protein-freien Kontrolle. Die Inhibitionswerte von zwei rekombinant exprimiertenProteinen wurden zum Vergleich eingefügt, beruhen aber nicht auf eigenen Messungen [124] undwurden daher grau markiert. Alle Proteine wurden 3 µM eingesetzt. Die Fusionsproteine GST undMBP zeigen keine Inhibition. BSA, ein wichtiges, relativ saures, Calcium-Bindeprotein im Serumerniedrigt die Präzipitatmenge nur geringfügig. Glycosyliertes bovines AHSG (bAHSG) besitzt dasstärkste inhibitorische Potenzial . Der Sequenzbereich 15–70, d.h. die aminoterminale α-Helix unddie ersten beiden Stränge des β-Faltblattes, von mAHSG ist hinsichtlich des inhibitorischen Potenzi-als ausreichend. Im Vergleich zu AHSG zeigen FETUB und KNG eine deutlich schwächere Inhibitionder Präzipitation.

40 Ergebnisse

Inhibition von mAHSG

GST-mAHSG und MBP-mAHSG inhibieren annähernd gleich gut (vgl. Abb. 3.7), sind jedoch etwas

schwächere Inhibitoren als das aus bovinem Serum isolierte AHSG. Mittels GST-fusionierter De-

letionsmutanten der mAHSG D1 sollte das inhibitorisch wirksame Strukturmotiv enger eingegrenzt

werden. Es zeigte sich, daß der Sequenzabschnitt 15 bis 70, d.h. die aminoterminale α-Helix und die

ersten zwei Stränge des β-Faltblattes, zur Aufrechterhaltung des inhibitorischen Effekts vollkommen

ausreichend sind. Wird die Sequenz um die α-Helix weiter verkürzt (mAHSG 42–81), resultiert dies

in einer Verminderten Inhibition, d.h. in einer Verschiebung der Inhibitionskurve zu höheren Protein-

Konzentrationen. Erstaunlicherweise zeigte jedoch die Deletionsmutante MBP-mAHSG 42-70 keine

Inhibition.

Zuvor konnte bereits gezeigt werden, daß die aminoterminale α-Helix alleine (MBP-mAHSG 1-52)

nicht inhibiert [124]. Die ersten beiden Stränge des sauren β-Faltblattes hingegen nur schwach (MBP-

mAHSG 42–81). Ohne die α-Helix sind die hydrophoben Reste auf der Rückseite des β-Faltblattes

dem Solvens ausgesetzt. Es ist daher davon auszugehen, daß bei dieser Deletionsmutante das β-

Faltblatt nicht oder nur teilweise ausgebildet ist. Zum Aufbau der Tertiärstruktur ist also die α-Helix

unbedingt notwendig, auch wenn sie selbst keinen inhibitorischen Effekt zeigt.

Weiterhin wurde der Frage nachgegangen, ob sich die mehrfache Serin-Phosphorylierung von Leber-

bzw. Serum-Fetuin [71, 72] auf das inhibitorische Potenzial auswirkt. Durch vier Serin Glutamat

Substitutionen werden bei der Mutante mAHSG 4S>E diese Phosphorylierungen simuliert. Die erste

Substitutionsstelle befindet sich unmittelbar vor der ersten α-Helix der zweiten Domäne, während die

restlichen drei Substitutionen innerhalb der dritten Domäne liegen. Wie aus Abbildung 3.7 zu ersehen

ist, haben offensichtlich diese Mutationen keinen Einfluß auf das inhibitorische Potenzial.

Protein ExpressionGST mAHSG ++MBP mAHSG + bis ++GST mFETUB +MBP mFETUB +

GST rFETUB +GST hFETUB -MBP hFETUB - -

MBP hKNG D1–3 +

Tabelle 3.3.: Vergleich der Expressionsraten:++ > 2mgProtein

100ml Bakteriensuspension

- - < 100µgProtein100ml Bakteriensuspension )


Inhibition von FETUB

Wie anhand der Strukturmodelle vorhergesagt, inhibiert FETUB aller drei untersuchten Spezies (Maus,

Ratte und Mensch) schlechter als murines AHSG, denn das β-Faltblatt der Cystatin-ähnlichen Domä-

nen der Fetuine vom Typ B enthält weniger saure Reste als das β-Faltblatt von AHSG D1. Dabei

fiel zunächst auf, daß die Expressionsrate von GST-fusioniertem humanem FETUB (GST-hFETUB)

deutlich unter der anderer Fetuine lag. Zudem neigte das Protein außerordentlich stark zur Aggrega-

tion mit nachfolgender Präzipitation während der Rückfaltungsprozedur. MBP-fusioniertes humanes

FETUB wurde so schwach exprimiert, daß mit vertretbarem Mehraufwand nicht genügend Protein für

den Präzipitations-Assay zu isolieren war. Möglicherweise liegt auch hier ein Faltungsproblem vor.

Inhibition der drei Cystatin-änlichen Domänen von Kininogen

Die drei Cystatin-ähnlichen Domänen von humanem Kininogen fielen als MBP-Fusionen bei der

Expression in E. coli fast ausschließlich cytoplasmatisch an. Die Domänen waren daher leicht nach

Lyse der Bakterien über eine Amylose-Säule aufzureinigen.

Aufgrund von Vergleichen der Sequenzen und der Domänen-Modelle war vorherzusagen, daß alle drei

untersuchten Domänen schlechter inhibieren würden als AHSG. Die Abstufung ihrer Inhibitionseffi-

zienzen untereinander kann jedoch anhand der Modelle nicht vollständig erklärt werden. Insbesondere

ist es bemerkenswert, daß nur die dritte Domäne bei Konzentrationen bis 10 µM keinen inhibitorischen

Effekt zeigt, was wiederum auf ein Faltungsproblem hindeutet.

Die Domänen D1 und D3 ließen sich gut modellieren . Das Modellieren der zweiten Domäne erwies

sich jedoch als schwierig, was sich in einem vergleichsweise schlechten z-score äußert (vgl. Kap.

3.1.1). Größere Abweichungen von der Cystatin-Struktur sind daher wahrscheinlich. Diese zeigt aller-

dings die beste Inhibition aller drei Domänen. Folglich existieren möglicherweise auch Bindemotive

außerhalb des β-Faltblattes.

3.3.2. Einfluß des genetischen Hintergrunds bei Wildtyp und Ahsg

Mäusen

Zur Bestätigung der physiologischen Relevanz von Fetuin als systemischer Inhibitor der Calcium-

phosphat-Präzipitation wurde der bereits für rekombinante Proteine beschriebene Inhibitions-Assay

auf verschiedene Seren angewandt.

42 Ergebnisse

Inhibition der Seren der Stämme DBA/2 und C57BL/6

Ahsg 2 Mäuse mit genetischem DBA/2 Hintergrund zeigen massive ektopische Calcifizierungen

in allen Organen [125], während ein C57BL/6 Hintergrund einen milderen Phänotyp hervorruft [43]3.

Bei Mäusen des Inzuchtstammes DBA/2 treten spontane dystrophe cardiale Calcifizierungen (DCC),

aber auch solche in Niere und Zunge, auf. DCC wird nicht durch ein einzelnes fehlerhaftes Gen her-

vorgerufen. Mittels quantitative trait locus (QTL) Analyse des Genoms der F2 Generation einer Kreu-

zung von C57BL/6 und C3H/HeJ bzw. DBA/2 Mäusen konnte ein Dyscalc-Locus auf Chromosom 7

identifiziert werden, der eine Prädisposition für Calcifizierungen anzeigt [126, 127, 128]. Das Fetuin

codierende Gen ist auf Chromosom 16 lokalisiert, d.h. daß die DCC-Prädisposition des DBA/2 Stam-

mes nicht auf einen Defekt dieses Gens zuückzuführen ist. Zusätzlich wurden drei weitere Dyscalc-

Loci mit weitaus geringerem LOD-score (logarithm of the likelihood odds ratio) identifiziert [129].

Zur Klärung der Frage, in welchem Ausmaß die verbleibenden inhibitorischen Proteine im Serum von

Knockout Mäusen zu diesem Stamm-abhängigen Phänotyp beitragen, wurde die Inhibitionsfähigkeit

der Seren bei verschiedenen Verdünnungsstufen untersucht.

0

20

40

60

80

100

120

0,1 1 10

% Serum

% P

räzi

pita

t

Abbildung 3.8.: Inhibition der Seren von Fetuin-WT (C57BL/6 , DBA/2 ) und Fetuin-KO(C57BL/6 ,DBA/2 ) Mäusen in % der protein-freien Kontrolle. Die Inhibitionskurven 4% Se-rum zeigen das Inhibitionspotenzial einzelner Se-ren, oberhalb dieser Serumkonzentration mußtengepoolte Seren verwendet werden (markierter Be-reich ). Jeder Messpunkt wurde in Triplikatenbestimmt.

Abbildung 3.8 zeigt die Inhibitionskurven der Seren vonC57BL/6 bzw. DBA/2 Wildtyp und Ahsg

Mäusen. Da die aus einer Maus gewonnene Menge Serum im Mittel bei etwa 300µl liegt, wobei star-

ke Schwankungen (100–500µl) auftreten können, waren vollständige Kurven einzelner Seren nur bis

zu einer Konzentration 4% ermittelbar. Die EC50 der Wildtyp-Seren beider Stämme liegt deut-

lich unter 1.5% Serum. Bei den Wildtypen konnten keine stammabhängigen Unterschiede festgestellt

werden, allerdings war die IC50 der DBA/2 Seren über einen breiteren Konzentrationsbereich gestreut.

Oberhalb von 4% Serum mußten aufgrund des geringen, und darüber hinaus schwankenden, gewinn-

baren Serumvolumens, insbesondere bei DBA/2 Fetuin-KO Mäusen von 100–250µl, mehrere Seren

2Deletion beider Allele des Ahsg/Fetuin Gens.3Kreuzung der KO-Mäuse auf den genetischen Hintergrund der beiden Stämme, sowie physiologische Untersuchungen an

den daraus hervorgehenden Tieren sind Teil der Dissertation von C. Schäfer


gepoolt werden. Die IC50 der KO-Seren lag bei etwa 7%, wobei die C57BL/6-KO Seren etwas besser

inhibierten.

Es ist schwer zu beurteilen, inwieweit dieser geringe stammabhängige Unterschied des inhibitori-

schen Potenzials der KO-Seren den jeweiligen Calcifizierungs-Phänotyp unmittelbar bedingt. Mäuse

vom Stamm DBA/2 neigen bekanntermaßen von Natur aus zu den beschriebenen ektopischen Calcifi-

zierungen. Es muß bedacht werden, daß bei den DBA/2-Tieren eventuell ein präzipitationsfördernder

Gewebsfaktor hinzu kommt, der in den Seren fehlt. Van den Broek stellte fest, daß dieser Stamm

einen niedrigeren Plasma-Magnesiumspiegel aufweist [130]. Da Magnesium die Nukleation und das

Wachstum von Apatitkristallen verlangsamt [36, 131, 132, 133], könnte hier ein Zusammenhang be-

stehen.

Rekonstitution der Knockout-Seren

Dieses Kontroll-Experiment soll verdeutlichen, daß das inhibitorische Potenzial im Serum von Ahsg

Mäusen durch die Fetuin-Defizienz stark vermindert ist aber durch Serum-äquivalente nachträgliche

Beimengung von Fetuin rekonstituiert werden kann.

Abbildung 3.9.: Rekonstitution der murinenAhsg

Seren. KO-Seren (-/-) inhibieren deut-

lich schlechter als WT-Seren (+/+). Angabe derPräzipitatmenge in % der proteinfreien Kontrolle.Der inhibitorische Effekt auf die CalciumphosphatPräzipitation kann für KO-Seren durch Zugabe einerdem WT-Serum äquivalenten Menge mAHSG re-konstituiert werden. Die Fetuin-Konzentrationen imSerum vor und nach Rekonstitution wurden mittelsWestern Blot ermittelt

Hierzu wurde in einem ersten Schritt Fetuin aus 15 ml Maus-Serum durch fraktionierte Ammonium-

sulfat-Fällung angereichert. Die Präzipitate wurden in 1.5 ml PBS gelöst und im ELISA auf ihren

Fetuin-Gehalt geprüft. Fetuin präzipitierte in einem Konzentrationsbereich von ~41–52% Ammoni-

umsulfat. Die zusammengeführten Fetuin-Fraktionen wurden anschließend über eine Superdex 75

26/60 Säule in 50 mM in TRIS pH 8 gelfiltriert. Darauf folgte ein weiterer Aufreinigungsschritt mit

der Anionenaustauscher-Säule Resource Q. Die Fraktionen von jedem chromatographischen Aufrei-

nigungsschritt wurden mittels ELISA auf Fetuin getestet. Zuletzt wurden die zusammengeführten

Fetuin-haltigen Fraktionen mit einem Centriprep (15 ml, 30 kDa) bzw. Centricon (2 ml, 30 kDa) auf-

konzentriert. Die Reinheit wurde anhand einer SDS-PAGE Silberfärbung auf etwa 85-90% geschätzt.

44 Ergebnisse

Mit der Rekonstistution der Seren durch nachträgliche Beimengung von Fetuin ist bewiesen, daß das

verminderte Inhibitionspotenzial im Serum von Ahsg

Tieren unmittelbar auf das Fetuin zurückzu-

führen ist. Die gezielte Deletion dieses Gens ruft keine weiteren Effekte hervor, die das systemische

Inhibitionspotenzial beeinflussen.

3.3.3. Humane Seren

Inhibition der Seren hämodialysierter Patienten

Patienten, die aufgrund einer Niereninsuffizienz hämodialysiert werden, entwickeln in der Regel einen

sekundären Hyperparathyreoidismus. Dieser ist Folge mehrer Effekte:

Aufgrund der Nirenfehlfunktion kann nicht genügend Phosphat ausgeschieden werden. Dies führt zu

einer verminderten Umsetzung des des 25-OH Vitamin D3 zum aktiven 1,25-(OH)2 Vitamin D3. Ein

erniedrigter 1,25-(OH)2Vitamin D3 Spiegel hat eine geringe Calcium-Aufnahme im Darm zu Fol-

ge. Dem wirkt der Organismus durch eine Erhöhung der Konzentration des in der Nebenschilddrüse

gebildeten Parathormons (PTH) entgegen. PTH bewirkt eine verstärkte Osteoclasten-Aktivität und so-

mit die Freisetzung von Calcium- und Phosphat-Ionen aus dem Knochen. Dialyse-Patienten besitzen

daher allgemein einen normalen Calcium- aber einen erhöhten Phosphat-Spiegel.

Dies bedingt eine stärkere Übersättigung des Serums hinsichtlich der Calcium- und der Phosphat-

Ionen, was zu unkontrollierten Mineralablagerungen in den Gefäßen führen kann. Bei einer unkon-

trollierten Calciumphosphat-Präzipitation werden wiederum fortlaufend Calcium-Ionen entzogen.

010

203040

50

607080

90100

-0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

log % Serum

% P

räzi

pita

t

0

102030

4050

607080

90100

-0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

log % Serum

% P

räzi

pita

t

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

-0,4 0,1 0,6 1,1

log % Serum

% P

räzi

pita

t

Abbildung 3.10.: Inhibitorisches Potenzial ein-zelner Seren von Dialyse-Patienten ( ) im Ver-gleich mit zwei Kontrollseren gesunder Men-schen ( ). Eine verschieden stark ausgeprägteVerminderung des Inhibitionspotenzials in Serenvon Dialysepatienten äußert sich in einer Ver-schiebung der Kurven zu höheren Konzentratio-nen. Dieser Präzipitationstest wurde nach Sche-ma B (5 mM CaCl2, 3 mM Na2HPO4,vgl. Kapitel2.2.10) durchgeführt. Jeder Meßpunkt wurde alsTriplikat bestimmt.

Unglücklicherweise liegt gleichzeitig durch den Fremdmaterialkontakt des Blutes mit Schläuchen

und Membranen der Dialyse-Apparatur eine permanente Entzündungssituation vor. Dies bewirkt eine

Downregulation von Fetuin/AHSG als einem negativen Akutphase-Protein. Einer verstärkten Über-

sättigung steht daher ein vermindertes inhibitorisches Potenzial im Plasma gegenüber.


Diese Beobachtung war Anlaß, in einem einleitenden Experiment Seren von Dialysepatienten auf ihr

verbleibendes inhibitorisches Potenzial zu untersuchen. Abbildung 3.10 zeigt die Inhibitionskurven

der verdünnten Seren gesunder Menschen im Vergleich mit Patienten-Seren, deren Inhibitionspoten-

zial, bis auf eine Serumprobe, deutlich vermindert ist. Dies war Ausgangspunkt einer größer ange-

legten klinischen Studie an Dialyse-Patienten, in der CRP als Entzündungsmarker mit der Fetuin-

Konzentration und dem Auftreten vaskulärer Calcifizierungen korreliert wurde [134].

Inhibition der Seren hämodialysierter Patienten mit ausgeprägter Calciphylaxie

Ein geringer Anteil der Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz und sekundärem Hyperparathy-

reoidismus entwickelt eine Calciphylaxie, d.h. massive Calcifizierungen der Haut, der Media von

Blutgefäßen, der Lunge, der Niere und des Herzens.

Von acht Calciphylaxie-Seren konnte das inhibitorische Potenzial bestimmt werden. Fünf dieser Seren

wiesen einen erniedrigten Gesamtproteinspiegel von 34–61 mg/ml (Referenz: 66–80 mg/ml [21]) auf,

was bis auf eine Ausnahme (39 mg/ml) auf einen erniedrigten Albuminspiegel von 16–29 mg/ml (Re-

ferenz: 35–52 mg/ml [21]) zurückzuführen ist. Die Konzentration von Fetuin lag zwischen 0.19 und

0.43 mg/ml (Referenz: 0.4–0.6 mg/ml [135]). Darüber hinaus wiesen die Seren ein erhöhtes Calcium-

phosphat Produkt von 4,37 0.69 mmol2/l2 auf (Kontrollgruppe: 2,81 1,04 mmol2/l2).

0

20

40

60

80

100

120

0,1 1 10

% Serum

% P

räzi

pita

t

Abbildung 3.11.: Vergleich des Inhibitions-potenzials humaner Seren einer gesundenKontrollgruppe mit Seren von Calciphylaxie-Patienten . Die Fetuin-Konzentration derPatienten-Seren beträgt maximal ungefähr dieHälfte der Kontroll-Seren. Daraus resultierterwartungsgemäß eine Verschiebung der Inhibi-tionskurven zu höheren Konzentrationen. DieserPräzipitationstest wurde nach Schema A (4.8 mMCaCl2, 1.6 mM Na2HPO4, vgl. Kapitel 2.2.10)durchgeführt.

Alle Patienten-Seren zeigten im Vergleich zu den Kontroll-Seren eine deutliche Verschiebung der

EC50 zu höheren Konzentrationen: EC50(Kontrolle)~2% und EC50(Calciphylaxie) > 3.5%. Zwei Se-

ren bewirkten im untersuchten Verdünnungsbereich keine Inhibition (EC50(Calciphylaxie) < 5% bzw.

6%, vgl. Abbildung 3.11). Auffallend war bei beiden Seren der mit 29% bzw. 35% ungewöhnlich

hohe Anteil der Immunglobulin-haltigen γ-Fraktion. Es ist anzumerken, daß alle anderen Patienten-

Seren hinsichtlich des γ-Anteils innerhalb des Normbereichs von 10–19% [21], oder mit 21%4 leicht

4Das Serum eines Patienten.

46 Ergebnisse

erhöht, liegen. Weiterhin fiel auf, daß mit wiederum zwei Seren, die einen besonders niedrigen Fe-

tuinspiegel aufwiesen, keine vollständige Inhibition zu erzielen war und sich stattdessen bei höheren

Serumkonzentration ein flach abfallendes Plateau bildete.

3.4. Das Prinzip der transienten Inhibition: Bildung löslicher

ACP-Nanosphären

3.4.1. Raster EM

Abbildung 3.12.: Die Kontrolle auf der linken Seite (ohne Zugabe von Fetuin) zeigt ein sehr kompak-tes Präzipitat. Die Zugabe von 200 nM Fetuin führt zu einem stark porösen Präzipitat, in dem einzelnerundliche Aggregate mit einem Durchmeser von 2–15 µm sichtbar sind (rechts). 20 kV.

Aufgrund der hohen Bindungsaffinität an die mineralische Phase des Knochens reichert sich AHSG

darin gegenüber anderen Serumproteinen bis zu etwa hundertfach an [75]. Blumenthal fand, daß die

Umwandlung von ACP zu HAp durch die Adsorption von Serumproteinen verlangsamt wird [136].

Darüber hinaus wurde bereits gezeigt, daß mAHSG D1 die Präzipitation von ACP transient inhibiert

[42].

Es stellte sich daher die Frage, wie AHSG die Morphologie des Präzipitates einer Inhibition beeinflus-

sen würde. Um den Inhibitionsmechanismus elektronenmikroskopisch genauer zu untersuchen, wur-

de in einem Vorversuch eine übersättigte (etwa 20–30 min stabil) Calciumphosphatlösung hergestellt

[137] und das Präzipitat einer Präzipitation ohne bzw. in Gegenwart von bovinem Fetuin untersucht.

Das abzentrifugierte und getrocknete Präzipitat erwies sich im SEM (vgl. Abbildung 3.12) sehr kom-

pakt und besaß nur eine geringe Kristallinität, wohingegen bereits 200 nM bovines AHSG zu einem

stark aufgelockerten Präzipitat führen, in dem einzelne rundliche Aggregate mit einem Durchmesser

3.4 Das Prinzip der transienten Inhibition: Bildung löslicher ACP-Nanosphären 47

von 2–15 µm sichtbar sind5.

3.4.2. Transmissions EM

Um einen genaueren Einblick in den Inhibitionsmechanismus zu erhalten, wurden Proben, wie in

Kapitel 2.2.11 beschrieben, präpariert und mittels TEM untersucht. Unter den hierfür gewählten Be-

dingungen (vgl. Kap. 2.2.10, Schema B) bildete sich selbst nach mehreren Stunden kein Präzipitat.

Wie in Abbildung 3.14 A und F zu sehen ist, enthielt jedoch der Überstand sphärische Aggregate aus

ACP (analysiert durch Elektronenbeugung), die im folgenden als Nanosphären bezeichnet werden

[138, 139]. Ihr Durchmesser bewegt sich in diesem frühen Stadium der Aggregatbildung zwischen 30

und 150 nm.

Abbildung 3.13.: Elastisch gefiltertesBild (A) einer Ansammlung von Na-nosphären, Elementverteilungen vonPhosphor (B), Kohlenstoff (C, auf ei-nem Bor-Film) und Calcium (D) einerRegion. Elemente zeigen in den Nano-sphären eine gleichmäßige Verteilung

Größe und Form sind von der Reihenfolge der Zugabe von Calcium bzw. Phosphat zu Beginn des

Experiments unabhängig. Die Elementverteilungsanalyse (vgl. Abb. 3.13) zeigte für die Elemente Ca,

P, O, N und C (auf Bor-Film) eine absolut gleichmäßige Verteilung innerhalb der Nanosphären. Die

Elemente C, N und O sind Bestandteil des Fetuins als auch des Puffers. Wieviel Fetuin sich auf den

Nanosphären befindet und wieviel im Innern, ist momentan noch unklar.

Durch den fokussierten Elektronenstrahl (vor allem) bei hohen Vergrößerungen kollabieren vermut-

lich die Nanosphären und nehmen eine Torus6-Form an. Dies wurde bereits für ACP-Präzipitate

beschrieben [27, 140]. Deshalb zeigten einige Nanosphären (vgl. Abbildung 3.14 F) einen von

den relativ dichten Außenbereichen zum Zentrum hin abnehmenden Dichtegradienten, wodurch der

Kern im TEM wesentlich Elektronen-durchsichtiger erscheint (vgl. Abbildung 3.15). In Kontroll-

5Kooperation mit Prof. Duschner, Experimentelle Zahnheilkunde, Universität Mainz6“Doughnut“-ähnlich

48 Ergebnisse

Experimenten wurde Fetuin durch BSA in gleicher Konzentration substituiert bzw. kein Protein zuge-

geben. Ganz vereinzelt waren im BSA-Überstand schmierige oder Tropfen-artige Rückstände zu er-

kennen, die vermutlich auf unvollständige Dialyse zurückzuführen oder Trocknungs-bedingt sind, sich

jedoch deutlich von den beschriebenen Nanosphären unterscheiden. Im Überstand der Protein-freien

Kontrolle war im TEM nur der unbelegte Kohlenstoff-Film sichtbar. Das Präzipitat der BSA-Probe

war genauso wie das der Protein-freien Kontrolle unstrukturiert amorph.

Bei einer Inkubationstemperatur von 37°C wer-

Abbildung 3.15.: Modell der im fokussierten

Elektronenstrahl kollabierenden Nanosphären.

den bereits nach 4 Stunden kristalline Nadeln

auf der Oberfläche der Sphären sichtbar (vgl.

Abbildung 3.14 G). Die einsetzende Kristalli-

sation schlägt sich auch im Beugungsbild nie-

der. Der diffuse Beugungsring nach zweistündi-

ger Inkubation bei 37°C weist nur auf Nahord-

nung hin (vgl. Abbildung 3.14 F), wohingegen

nach sechs Stunden unter gleichen Bedingungen

zwei scharfe Beugungsringe sichtbar sind (vgl. Abbildung 3.14 H), die die fortschreitende Kristallisa-

tion wiederspiegeln. Da es sich um einen diffusionskontrollierten Prozess handelt, ist eine vergleich-

bare Veränderung bei 22°C erst nach 23 Stunden zu beobachten (Abbildung 3.14 C).

Allgemein ist festzustellen, daß sich dieses epitaktische Nadel-Wachstum weiter verstärkt, wobei sich

in einigen Fällen der amorphe Kern zunehmend aufzulösen scheint. Zusätzlich zu den Ionen aus der

Lösung würde die amorphe Phase als Ionenreservoir für das nachfolgende Nadelwachstum dienen.

Zu diesem Zeitpunkt, d.h. nach etwa 6 Stunden Inkubation, ist allerdings noch kein sedimentierbares

Präzipitat sichtbar (Diese Beobachtungen werden in Kap. 4.2 diskutiert)!

Erst zu einem späteren Zeitpunkt nach maximal 30-stündiger Inkubationsdauer bildete sich ein kristal-

lines Präzipitat. Abbildung 3.14 J zeigt ein solches großvolumiges Präzipitat mit einem Durchmesser

von ca. 450 nm. Die Oberfläche dieses Aggregates ist nun vollständig mit hochkristallinen Apatit-

Nadeln bedeckt. Abbildung 3.14 I zeigt in derselben Probe den Überstand, der Aggregate kristalliner

Nadeln enthält.


Abbildung 3.14.: Zeitabhängigkeit der Inhibition. Fetuin vermag die Präzipitation von Calcium-phosphat aus übersättigter Lösung transient durch Bildung amorpher Nanosphären zu inhibieren(A und F). Bei fortschreitender Inkubationsdauer setzt das Wachstum nadeliger Kristallite auf derSphären-Oberfläche (C und G) ein. Der Übergang von einem diffusen Beugungsring (F) zu zweischarfen Ringen (H) spiegelt die fortschreitende Kristallisation wieder. Erst nach 30h bei 37°C ent-stand ein kristallines Präzipitat (Abbildung J). Der Maßstabsbalken, soweit nicht anders angegeben,entspricht 100 nm.

50 Ergebnisse

3.4.3. Dynamische Lichtstreuung

Die dynamische Lichtstreuung stellt eine wichtige Methode zur zeitabhängigen Bestimmung von Grö-

ße und Dichte makromolekularer Teilchen dar. Sie ist daher eine gute methodische Ergänzung zu den

elektronenmikroskopischen Untersuchungen.

Für 10 µM Fetuin in 50 mM TRIS pH 7.4 wurden zwei unterschiedliche hydrodynamische Radien (rh)

detektiert. Für das 48 kDa Fetuin-Monomer konnte ein rh = 4.2 nm/rg = 3.2 (rg ist proportional zu rh:

r2g

3r2h

5 ) ermittelt werden (vgl. Tab. 3.4). Zum Vergleich beträgt der mit Small-angle x-ray scattering

(SAXS) für das 67 kDa Serum-Protein Albumin ermittelte Gyrationsradius rg = 3.4 nm [141]. Auch

aufgrund einer Größenabschätzung anhand des Drei-Domänen-Modells von AHSG ist dieser Wert

realistisch.

Der zweite Wert von rh = 55.4 nm deutet auf aggregiertes Fetuin hin. Die integralen Intensitäten der

beiden Prozesse waren mit 53.6 % bzw. 46.4 % annähernd gleich. Dabei ist jedoch zu beachten, daß

die Streuintensität mit der zweiten Potenz des Gyrationsradius ansteigt, woraus geschlossen werden

kann, daß der Aggregat-Anteil etwa 0.5 % beträgt.

Nach Zugabe von CaCl2 wuchs der kleinere Radius um etwa 7 %. Die darauf folgende Phosphat-

Zugabe bewirkte einen drastischen Anstieg der Streuintensität. Langsame, stark streuende Teilchen,

deren Radius etwa 80 % der ursprünglichen Fetuin-Aggregate betrug, traten auf. Es ist anzuneh-

men, daß es sich hierbei um die oben beschriebenen Nanosphären handelt. Die Streuung des Fetuin-

Monomers war nun nur noch schwer detektierbar. Folglich war zu diesem Zeitpunkt lediglich noch

ein kleiner Teil des Fetuins ungebunden in Lösung. Über einen Zeitraum von 2 Stunden nahm die

Streuintensität der Nanosphären kontinuierlich stark zu, jedoch verbunden mit einer Verringerung

ihrer Größe. Diese Beobachtung beruht vermutlich auf der schnellen zahlenmäßigen Zunahme der

amorphen Nanosphären zu Beginn und der nachfolgend einsetzenden Kristallisation, die mit der Ver-

drängung von Wasser aus dem Kern (Verdichtung) verbunden ist (vgl. Abb. 3.16).


Nach 20 Stunden konnte wiederum ein Anstieg des Radius und eine deutliche Zunahme der Streuin-

tensität verzeichnet werden7.

Abbildung 3.16.: Dynamische Licht-streuung Fetuin-haltiger übersättigterCalciumphosphat Lösung (vgl Kap.2.2.10 Schema B). Die zeitliche Ent-wicklung der Intensität des gestreutenLichts spiegelt die Kinetik der Nuklea-tion und des Wachstums der Nanosphä-ren wider.

Lösung Zeit partielle Int. [kHz] rh [nm]

10 µM BF, 50 mM Tris pH7.40

51.0 (46.4%) 55.4 (Aggregat)58.9 (53.6%) 4.2 (Monomer)

+ 5 mM CaCl2 097.2 61.0

pH7.4 58.8 4.5

+5 mM CaCl2+3 mM NaHPO4pH 7.4

25 min482 45.285 5.4

35 min571 43.178 5.1

50 min761 45.094 5.3

120 min993 42.177 4.3

20 h2098 5365 9.7

Tabelle 3.4.: Dynamische Lichtstreuung Fetuin-haltiger Lösungen. Alle Lösungen wurden filtriert(0.22 µM), 10 min bei 8000 g zentrifugiert und vor Versuchsbeginn 10 min auf 20°C temperiert.

Das inhibitorische Prinzip der Bildung von Nanosphären, das zunächst elektronenmikroskopisch un-

tersucht wurde, konnte somit unabhängig durch DLS bestätigt werden. Die zeitabhängige starke Zu-

nahme der Streuintensität spiegelt zweifellos die Kinetik der transienten Inhibition wieder. Allerdings

liegen die mittels Lichtstreuung ermittelten Radien ca. 30–50% unter den aus TEM-Bildern ermittel-

ten Werten.

7Obwohl danach eine weitere Erhöhung von rh zu verzeichnen war, begann die Streuintensität als Folge der einsetzendenSedimentation zu fallen.

4. Diskussion

4.1. Fetuin als systemischer Inhibitor ektopischer Calciumphosphat

Calcifizierungen

Die Knochenmineralisierung beruht vereinfacht auf einem Gleichgewicht von Osteoblasten-kontrollierter

aktiver (d.h. zellgesteuerter) Mineralablagerung in kollagener Matrix und der passiven Inhibition der

Präzipitation im (unmittelbar knochenumgebenden) Weichgewebe durch inhibitorische Proteine.

Fetuin wurde in vitro [42] und in vivo [43] als Inhibitor der Calciumphosphat Präzipitation identifi-

ziert. Durch Rückkreuzung der Fetuin-defizienten Mäuse auf den genetischen Hintergrund des Stam-

mes DBA/21 und durch die Untersuchung dieser Seren, sowie der Seren von Calciphylaxie-Patienten,

konnte die große physiologische Relevanz von Fetuin als Inhibitor unerwünschter Calcifizierung ein-

drucksvoll bestätigt werden [125, 134]:

Dialyse-Patienten sind durch den extrakorporalen Kontakt des Blutes mit den Schläuchen und Mem-

branen der Dialyse-Apparatur einer permanenten Entzündungs-Situation ausgesetzt. Deren Ausmaß

kann durch Bestimmung der Konzentration des Akut-Phase Proteins C-reaktives Protein (CRP) im

Blut beurteilt werden. Ältere Untersuchungen belegten eine Korrelation zwischen der Konzentration

des CRPs und dem Risiko cardiovaskulärer Krankheiten, die bei Dialyse-Patienten die häufigste To-

desursache darstellen [142, 143, 144, 145]. Andere Studien fanden eine inverse Korrelation zwischen

dem Albumin-Spiegel und der Mortalität. Hypoalbuminämie hingegen resultiert ebenfalls aus der

Akutphase-Antwort, kombiniert mit einem schlechten Ernährungszustand des Patienten [146]. Dar-

über hinaus wurden Herzklappen-Calcifizierungen als unmittelbare Folge von Entzündungen, auch

hier verbunden mit schlechter Ernährung, diskutiert [147]. Es blieb aber bisher unklar, ob CRP an

vaskulären Schädigungen direkt beteiligt ist oder ob diese durch andere Prozesse im Rahmen der

Entzündung hervor gerufen werden, also CRP lediglich einen Marker darstellt.

Fetuin ist ein negatives Akut-Phase Protein, das bei Dialyse-Patienten folglich entzündungsbedingt

herabreguliert ist. Gleichzeitig bedingt die Hyperphosphatämie ein generell erhöhtes Calciumphosphat-

Produkt. Offensichtlich besteht eine direkte Korrelation zwischen der Fetuin/AHSG-Serum Konzen-

tration und dem Ausmaß ektopischer Calcifizierungen [125, 134]. Es handelt sich dabei um sphärische

1Teil der Dissertation von C. Schäfer.

4.2 Transiente Inhibition der Präzipitation durch Bildung löslicher Nanosphären in vitro.Mögliche Bedeutung für die Biomineralisation. 53

ACP-Präzipitate im Weichgewebe, die sich somit klar von der BMP induzierten Knochenbildung in

der Muskulatur von FOP-Patienten [66] unterscheiden (vgl. Kap. 1.1.2.3).

Aufgrund der Übersättigung der extrazellulären Flüssigkeiten hinsichtlich der Calcium- und Phosphat-

Konzentration muß ohnehin davon ausgegangen werden, daß potentiell jedes Organ calcifizieren kann,

ohne daß es verschiedener Initiatoren, wie Kollagen oder BSP bedarf. Vielmehr ist der Organismus

zwingend auf Inhibitoren angewiesen, um dies zu verhindern.

4.2. Transiente Inhibition der Präzipitation durch Bildung löslicher

Nanosphären in vitro. Mögliche Bedeutung für die

Biomineralisation.

Folgende einfache Abschätzung macht deutlich, daß die Inhibition der Calciumphosphat/Apatit Prä-

zipitation durch AHSG D1 nicht auf reiner Bindung von Calcium-Ionen beruhen kann, denn sie ist

nicht über eine Verminderung des Ionenproduktes durch eine Konzentrationsabsenkung freier Calci-

um Ionen zu erklären:

2 µM AHSG inhibiert die Präzipitation nach Schema A (vgl. Kap. 2.2.10) vollkommen (ebenso

5 µM nach Schema B). Eine Gleichgewichtsdialyse von Fetuin gegen Calcium bei einer Ionenstär-

ke von 0.16 und pH 7.4 ergab eine Calcium-Bindungstelle pro Molekül [148]. Nach neueren Un-

tersuchungen von Suzuki et.al. [149] vermag Fetuin über eine Bindungsstelle mit höherer Affinität

(KD1 = 0.95 10 4) und fünf schwächere Bindestellen (KD2 = 1.05 10

3) Calcium-Ionen zu binden.

Selbst unter Annahme einer maximalen Bindung von 6 Ca-Ionen pro AHSG Molekül, d.h. eine Ver-

ringerung der freien Ca-Ionen um (2 6=) 12 µmol/l, würde sich das Ionenprodukt nur geringfügig än-

dern: I = [Ca2 ]5[PO3 4 ]3[OH] = [4.8 10

3 - 12 10 6]5[1.16 10

8]3[10 6 6] 10

42M9 KLP(HAp)

= 3.7 10 58M9

Deshalb muß die Inhibition der Präzipitation über die Bindung von weitaus mehr Calcium- und

Phosphat- Ionen erfolgen, offenbar durch Adsorption von Fetuin/AHSG an die Oberfläche des ACP-

Nucleus. Die Stadien dieser transienten Inhibition der ACP/HAp Präzipitation in Lösung (d.h. vor

Einsetzen der Präzipitation!) sind zuvor nicht untersucht worden. Die Kombination mehrerer Metho-

den (Inhibitions-Assay, SEM, TEM und DLS) ermöglichte es, ein schlüssiges und anschauliches Mo-

dell der Inhibition der Calciumphosphat Präzipitation durch Bildung von Nanosphären zu erstellen,

das über bisherige Untersuchungen hinausgeht. Die Versuchsbedingungen wurden wie folgt gewählt:

10 µM bovines Fetuin entspricht der Konzentration im Serum. Die Calcium- und Phosphat-Konzen-

trationen überschritten mit 5 mM bzw. 3 mM die physiologischen Konzentrationen um etwa das Dop-

pelte. Durch Pufferung mit 50 mM Tris/HCl pH7.4 wird eine Absenkung des pHs im Verlauf der

Ionen-Aggregation und Kristallisation vermieden. Die Seren hypercalcämischer Mäuse erwiesen sich

aufgrund ihrer hohen Proteinkonzentration und Komplexität als ungeeignet für hochauflösende TEM-

Analyse. Trotz mehrfacher, unterschiedlicher Ansätze war bisher die Isolierung bzw. der Nachweis

54 Diskussion

von Nanosphären im Blut nicht möglich. Allerdings konnten neuerdings Price et. al. aus dem Blut

junger Etidronat-behandelter Ratten hochmolekulare Aggregate isolieren, die eventuell mit den Na-

nosphären identisch sind [150].

Wichtige Aspekte der Nanosphären sind nachfolgend zusammengefasst:

• Fetuin bindet mit hoher Affinität an HAp/OCP-Microkristallite, bzw. es induziert sogar teil-

weise deren Bildung. Diese nukleierende Wirkung von Fetuin in geringen Konzentrationen um

0.1 µM im Inhibitions-Assay äußert sich in einer leicht erhöhten Präzipitatmenge gegenüber der

Protein-freien Kontrolle (vgl. Kap. 4.3.1).

• Das offenbar an der Oberfläche der Nanosphären adsorbierte Fetuin beeinträchtigt die Diffusi-

on der Calcium- und der Phosphat-Ionen und somit das weitere Wachstum der Sphären. Auf

der Oberfläche der Nanosphären werden bereits nach 4h bei 37°C kristalline Nadeln sichtbar.

Zeitabhängig nehmen Anzahl und Länge der Nadeln zu. Währenddessen löst sich scheinbar der

ursprüngliche amorphe Kern zunehmend auf2 und würde somit als Ionenreservoir für die un-

mittelbar benachbarte Kristallisation dienen. Die Kristallisation in Lösung schreitet weiter fort

bis nach spätestens 30h bei 37°C eine bestimmte Größe und Dichte der Aggregate überschritten

ist und nun ein sedimentierbares Präzipitat nachweisbar ist.

Umgekehrt schützt das umhüllende AHSG bei Dialyse gegen bidest. Wasser nach der Inkuba-

tion im Rahmen der Aufbereitung für die TEM die Nanosphären, da die Diffusionsrate der Ionen

von der Oberfläche in die Lösung ebenfalls herabgesetzt ist. Über die Verteilung des AHSGs in

bzw. auf den Nanosphären kann momentan noch keine Aussage getroffen werden.

Ein ähnlicher Vorgang wurde bei der bereits erwähnten Transformation von präzipitiertem ACP

in HAp beobachtet. Hierbei stellt die Solubilisierung von ACP einen geschwindigkeitsbestim-

menden Schritt dar. Durch Zugabe von Serum(-proteinen) wird dieser Schritt deutlich ver-

langsamt. Darüber hinaus war zu beobachten, daß mit Proteinen ummanteltes ACP wesentlich

schlechter zu lösen ist. Dies führte zu der Annahme, daß die Proteine durch Adsorption an der

Oberfläche des ACP-Präzipitats einen abschirmenden Effekt zeigen [136]. Fetuin zeigt offen-

sichtlich einen analogen Effekt auf der Oberfläche der löslichen und zu Beginn der Inkubation

amorphen Nanosphären.

• AHSG inhibiert die Präzipitation durch Bildung löslicher amorpher Calciumphosphat-Sphären

transient, d.h. die Präzipitation tritt zeitlich verzögert ein.

Die elektronenmikroskopische Untersuchung der Inhibition in vitro und der starke Calcifizier-

ungs-Phänotyp von Ahsg

DBA/2 Mäusen legen die Vermutung nahe, daß Fetuin als Inhibitor

der extrazellulären ACP/HAp Präzipitation in vivo die wahrscheinlich ständig auftretende Bil-

dung von Calciumphosphat Nuclei zwar nicht verhindert, jedoch ihr Wachstum durch Adsorp-

tion an deren Oberfläche drastisch verlangsamt. Diese Verzögerung würde ein Zeitfenster öff-

nen, das den Transport dieser noch löslichen Sphären im Blutkreislauf zum Knochen gestattet,

2Mit zunehmender Inkubationsdauer nimmt die Anzahl der Aggregate mit einem erkennbaren sphärischen Kern ab.

4.3 Struktur-Funktionsbeziehung 55

wo diese metabolisiert oder abgelagert werden können. Auch das Reticulo-Endotheliale System

(RET), welches aus einer Vielzahl von Zellen besteht (retikuläre Zellen, Endothel-Zellen, Fibro-

blasten und Monozyten), könnte bei Entfernung (clearance) der Nanosphären aus dem Blut eine

wichtige Rolle spielen. Die phagozytotischen Zellen des RET, vor allem Macrophagen, bilden

das Mononukleäre Phagozytotische System (MPS). Eine wichtige Funktion der Kupfer-Zellen

(Macrophagen) im Endothel der Leber besteht darin, durch Endozytose potentiell schädigende

Stoffe aus dem Blut zu entfernen. Es ist durchaus denkbar, daß auf diese Weise auch ACP-

Fetuin Aggregate in der Größenordnung von etwa 100 nm Durchmesser aus dem Blutstrom

entfernt werden können.

Bisherige elektronenmikroskopische Untersuchungen beschränkten sich auf das unter verschie-

denen Bedingungen gebildete Präzipitat. In diesen ACP/HAp-Präzipitaten konnten bereits zu-

vor sphärische Aggregate beobachtet werden. Dabei überschneidet sich der untere Größenbe-

reich der in der Literatur beschriebenen sphärischen Präzipitate mit dem der in Abbildung 3.14

gezeigten Vorläufer-Sphären: bei geringer Übersättigung wurden im Präzipitat unter anderem

auch amorphe sphärische Aggregate mit einem Durchmesser von 200–1200 Å [27] bzw. 80–

1700 Å [151] gefunden. Suvurova und Buffat erhielten durch sehr schnelles Mischen von

Calcium- und Phosphat-Lösungen ein Präzipitat, das Sphären mit 100–500 Å Durchmesser

enthielt [152]. Die jetzt in Gegenwart von Fetuin nachgewiesenen löslichen Nanosphären sind

zunächst amorph. Sie ähneln den von Suvurova und Buffat detailliert untersuchten Sphären

im Präzipitat. Obwohl diese Sphären zunächst ebenfalls ein amorphes Beugungsbild zeigten,

konnten diese Autoren durch genauere Untersuchungen mit Mikrodiffraktion beweisen, daß die

Sphären kristalline Domänen enthalten.

Knochen enthält calcifizierte Sphären unterschiedlichen (zellulären) Ursprungs mit Durchmes-

sern zwischen 10 nm und 10 µm. Knorpel im Bereich der Epiphysen-Wachstumsfuge enthält

sogenannte Matrix-Vesikel (10–110 nm). Durch daran assoziierte alkalische Phosphatase und

Calcium-Kanal bildende Annexine könnte darin die de novo Mineralbildung begünstigt sein

[153, 154, 155]. Weiterhin wurden calcifizierte Microsphären mit Durchmessern > 100 nm in

der kollagenen Knochenmatrix beschrieben. Sie bestehen aus mehreren Untereinheiten und ent-

halten insbesondere die Phosphoproteine BSP und OPN [156]. Calcifizierte Sphären, deren Ur-

sprung nicht in den Knochenzellen liegt, konnten bisher nicht nachgewiesen werden.

4.3. Struktur-Funktionsbeziehung

4.3.1. Rekombinant exprimierte Domänen

Fetuin/AHSG ist der einzige bekannte physiologisch relevante Inhibitor der Calciumphosphat-Präzi-

pitation aus der Cystatin-Superfamilie im Plasma. Denaturiertes Fetuin bzw. Fetuin, dessen saure

Reste mit Iodacetamid blockiert wurden, zeigt einen stark verminderten inhibitorischen Effekt [42],

d.h. zur Inhibition ist eine intakte 3D-Struktur nötig.

56 Diskussion

Durch Vergleich der modellierten Struktur Cystatin-ähnlicher Domänen mit ihrem inhibitorischen Po-

tenzial konnte das inhibitorische Strukturmotiv genauer innerhalb der ersten Domäne lokalisiert wer-

den. Keine weitere der rekombinant exprimierten und im Präzipitations-Assay getesteten Domänen

der Cystatin-Superfamilie zeigte ein der AHSG-Domäne D1 vergleichbares inhibitorisches Potenzi-

al. Ein Vergleich der Protein-Sequenzen und der modellierten Domänen ergab, daß der ausgedehnte

negative Ladungsbereich auf dem β-Faltblatt die AHSG-Domäne D1 im Vergleich zu allen ande-

ren Cystatin-Domänen auszeichnet. Bei den modellierten Cystatin-ähnlichen Domänen von FETUB,

HRG und KNG war die vergleichsweise geringere Ladungsdichte unregelmäßig verteilt. Auch Ober-

flächenbereiche außerhalb des β-Faltblattes wiesen keine vergleichbare Ladungsdichte auf. Das ge-

ringere Inhibitionspotenzial dieser Domänen äußerte sich in einer deutlichen Verschiebung ihrer Inhi-

bitionskurven zu höheren Konzentrationen.

Abbildung 4.1.: AHSG D1 über der (001) Flä-che von HAp (3x3 Elementarzellen). Die positiveLadung der Calcium-Ionen ist blau markiert, dienegativ geladenen Sauerstoffatome der Phosphatesind rot markiert.

AHSG wirkt auf die Präzipitation im Konzentrationsbereich unterhalb des inhibitorischen Effekts nu-

kleierend. Dieser konzentrationsabhängige Effekt ist Folge der hohen Bindungsaffinität von AHSG

an HAp. Bei niedrigen Konzentrationen um 0.1 µmol/l induziert AHSG aufgrund einer gewissen

Grenzflächen-Komplementarität die Keimbildung. Oberhalb einer bestimmten Belegungsdichte des

Keims mit AHSG ist dessen Wachstum jedoch durch die erniedrigte Diffusionsrate der Calcium- und

Phosphat-Ionen stark verlangsamt. Eine Beschreibung der Adsorption auf atomarer Ebene ist momen-

tan noch nicht möglich. Es existieren allerdings zwei Modelle. Die Adsorption an HAp-Flächen über

die exponierten sauren As-Reste des β-Faltblattes kann entweder durch Besetzung der unbelegten

Phosphat-Positionen an der Mineral-Oberfläche im Sinne von Epitaxie (bzw. lattice matching) oder

über eine allgemeinere elektrostatische Komplementarität erfolgen (vgl. Abb. 4.1).

Eine weitere funktionelle Eingrenzung gelang mit Hilfe von (Deletions-) Mutanten. In den vorlie-

gendenen Experimenten zeigte sich, daß die aminoterminale α-Helix und die ersten zwei Stränge

des β-Faltblatt der ersten Domäne von AHSG ausreichend sind, eine unverändert starke Adsorption


an Calciumphosphat/HAp zu vermitteln, sodaß das inhibitorische Potenzial komplett erhalten bleibt

(GST-mAHSG 15–70). Die Deletionsmutante, die nur die aminoterminale α-Helix enthält (MBP-

mAHSG 1–52), ist im Assay inaktiv [42]. Die Deletionsmutante indessen, die sich nur über die bei-

den ersten Stränge des β-Faltblattes erstreckt (GST-mAHSG 42–81), weist ein deutlich vermindertes

inhibitorisches Potenzial auf. Auch die Substitution von vier außerhalb der ersten Domäne lokali-

sierten Serinen durch Glutamat, wodurch Phosphorylierungen imitiert werden sollten, veränderte das

inhibitorische Potenzial von AHSG nicht.

Dynamische Simulationen an einem Modell von humanem Cystatin des Speichels, das ebenfalls von

der 1CEW-Struktur abgeleitet wurde, hatten Bell et. al. zu der Vermutung veranlaßt, daß sich die

Apatit-Binderegion möglicherweise am N-Terminus vor der ersten α-Helix bzw. in einem Bereich

nach der zweiten α-Helix zwischen dem dritten Strang des β-Faltblattes befindet [157]. Dieses Modell

muß nun im Hinblick auf die Sonderstellung von AHSG D1 innerhalb der Cystatin-Superfamilie über-

dacht werden. Das mAHSG D1 Fragment 1–52 enthält zwar Sequenzabschnitt (1)3 (vgl. Abb. 4.2),

zeigt aber keinen inhibitorischen Effekt [42]. mAHSG D1 Fragment 15–70 enthält ebenfalls nur Se-

quenzabschnitt (1), inhibiert aber genauso gut wie das gesamte mAHSG (vgl. Abb. 3.3.1). Allgemein

ist zu beachten, daß bei Teildomänen leicht eine nicht-native Faltung vorliegen kann, da möglicher-

weise hydrophobe Aminosäuren des Kerns nun exponiert an der Oberfläche liegen. Da der Sequenzab-

schnitt (1) im N-Terminus der mAHSG D1 vermutlich annähernd in der Ebene des β-Faltblattes liegt,

ist es durchaus denkbar, daß dieser ebenfalls β-Faltblatt Konformation einnimmt. Zusammenfassend

kann gesagt werden, daß Abschnitt (1) an der Apatit-Bindung beteiligt sein kann, aber sicherlich nicht

ausreichend ist. Abschnitt (2) spielt im Hinblick auf das inhibitorische Potenzial von AHSG sicherlich

keine Rolle. Dies gilt ebenfalls für FETUB, das im Sequenzbereich (2) keine sauren As besitzt.

(1) (2)

salivary Cystatin S ...DADLNDE...EQPE...chicken egg white Cystatin ...PVDENDE...DEPE...

murine AHSG D1 ...DDPEAEQ...QLTE...murine FETUB D1 ...PLGNDSE...RMFY...

Abbildung 4.2.: Sequenzvergleich der putativen Apatit-Binderegion von Speichel-Cystatin S nachBell et. al. [157] mit Cystatin aus Hühnereiweiß sowie der ersten Domäne von mAHSG-Domäne D1bzw. mFETUB-Domäne D1. Die Sequenzmotive in Region (1) und (2) der ersten drei oben aufge-führten Domänen sind hinsichtlich der Anzahl saurer (hervorgehoben) und polarer As-Reste und ihrerPosition ähnlich. FETUB ist in diesen Sequenzbereichen etwas unpolarer.

Die Rückfaltung der Cystatin-ähnlichen Domänen erwies sich als unerwartet schwierig. Auch konnte

die IC50 aus Serum isolierter muriner und boviner Fetuine nicht mit rekombinant exprimiertem Fetuin

3Zuordnung der Sequenzabschnitte (1) und (2) für mAHSG Domäne D1:(1) entspricht den Aminosäuren 15–21(2) entspricht den Aminosäuren 86–89

58 Diskussion

reproduziert werden. Grund hierfür ist sicherlich das starke Aggregationsverhalten. Als Faktoren, die

diese Aggregation induzieren bzw. verhindern, sind hier anzuführen:

1. Wie bereits in Kapitel 1.3 der Einleitung beschrieben, neigt Cystatin C im partiell gefalteten

Übergangszustand zur Dimersierung mit nachfolgender Aggregation zu Amyloid-Fibrillen. Die

Dimerisierung erfolgt über ein sogenanntes Domain Swapping, bei dem ein Austausch von

zwei Strängen des β-Faltblattes zwischen den beiden Partnern nachgewiesen werden konnte

[95, 96, 97, 98]. Transthyretin, ein Protein mit ebenfalls hohem β-Faltblatt Anteil und entfernt

verwandter Struktur, bildet ebenso Dimere als Startpunkt einer fortlaufenden Aggregation zu

Amyloid-Fibrillen [158].

2. Die Deglycosylierung von Fetuin führt zur Bildung von Aggregaten. Weiterhin zeigte sich, daß

die Aggregationstendenz umso stärker ist, je kleiner der Fusionsanteil ist (MBP < GST < T7-

Tag). Die Abspaltung des MBP- bzw. GST- Fusionsanteils verstärkt wiederum die Aggregation.

3. Eine Aufkonzentrierung von MBP-mAHSG bzw. mFETUB auf c 10 mg/ml, ebenso die La-

gerung bei 4°C über mehrere Tage, führt zu einer starken Zunahme des hochmolekularen

Aggregat-Anteils.

4.3.2. Vergleich Apatit-bindender Motive

Das lösliche Plasmaprotein Fetuin/AHSG und das unlösliche Zellwand-gebundene Matrix GLA Pro-

tein (MGP) gelten beide als wichtige extrazelluläre Inhibitoren der Calciumphosphat-Präzipitation in

Säugetieren. Das HAp-bindende Strukturmotiv von Fetuin wurde im vorherigen Kapitel diskutiert.

Ähnlich wie es für AHSG der Fall ist, sind für MGP keine Strukturdaten verfügbar, aber es kön-

nen auch hier über Homologien strukturelle Vorhersagen getroffen werden, aus denen ein möglicher

Inhibitionsmechanismus abgeleitet werden kann.

MGP ist zum löslichen Osteocalcin/BGP homolog, das bereits CD-spektroskopisch untersucht wurde.

Beide Proteine besitzen mehrere γ-carboxylierte Glu-Reste. In Calcium-freier Lösung ist Osteocalcin

unstrukturiert (random coil), zeigt aber in Gegenwart physiologischer Calcium Konzentrationen zu

38% eine α-helicale Struktur. MGP besitzt also sicherlich kein mit sauren As-Resten belegtes β-

Faltblatt.

Welches Prinzip könnte der Inhibition der Präzipitation durch MGP zugrunde liegen? Hauschka et. al.

erkannten, daß beim BGP aufgrund des Sequenz-Abstandes der GLA-Reste von etwa einer Ganghöhe

auf einer α-Helix die Reste auf einer Seite zu liegen kämen und somit eventuell Calcium-Ionen oder

Apatit binden könnten. Interessanterweise entspricht die Ganghöhe einer α-Helix mit 5.4 Å dem

Abstand der Ca(I)-Ionen in der (001) Ebene von Apatit (vgl. Kap. 1.1.1.4) [159]. Gleiches gilt offenbar

auch für MGP (Abb. 4.3a). Sekundärstruktur-Vorhersagen mit PSIPRED [160] und PHD [161] ergaben


für diese Bereiche in MGP mit hoher Wahrscheinlichkeit jeweils eine α-helicale Struktur. Hier sind

jedoch statt einer Dreier-Anordnung zwei GLA-Reste Paare zu finden.

Von Prothrombin ist bekannt, daß es tatsächlich nach dem beschriebenen Prinzip Calcium-Ionen zu

komplexieren vermag. Es enthält eine GLA-reiche Domäne mit ebenfalls zu einer Seite einer α-Helix

ausgerichteten GLA-Resten. Abbildung 4.3b zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus der Röntgen-

struktur [2PF2, 162].

(a) Alignment: hMGP-hBGP (b) Ca-GLA-Komplexierung

Abbildung 4.3.: (a) Alignment der Proteinsequenzen von hMGP und hBGP. Beide Proteine besitzenSignalpeptide unterschiedlicher Länge (grau unterlegt), die während der Prozessierung zum reifenProtein abgespalten werden. hMGP besitzt drei phosphorylierte Serine an den Positionen 1–3. Dar-über hinaus sind vier Glutamate von hMGP γ-carboxyliert. Sie bilden zwei Paare (4/5 und 7/9) imAbstand von jeweils vier Aminosäuren. Ein vergleichbares Paar befindet sich auch in hBGP (7/9),sowie eine weiterer GLA-Rest (11) in einem verkürzten Abstand von 3 Aminosäuren. Die beidenGLA-Paare liegen wahrscheinlich jeweils auf α-Helices, die im Bereich der Proline (6/8) unterbro-chen sind. Beide Proteine besitzen eine Disulfid-verbrückte (10/12) Schleife gleicher Länge, aberohne Homologie (b) Ein Calcium-Ion wird von zwei GLA-Resten komplexiert, die zu einer Seite derα-Helix ausgerichtet sind.

Aber welchen Einfluß hat nun die γ-Carboxylierung auf die Präzipitations-Inhibition? Durch den Vit-

amin K Antagonisten und γ-Carboxylase Inhibitor Warfarin wird die postranslationale Carboxylierung

der Glu-Reste unterbunden. In vivo führt die Gabe dieses Inhibitors zur Calcifizierung der Arterien

[163]4 und der Herzmuskulatur. Die Fähigkeit Calcium-Ionen zu binden und die Bildung von Apatit

zu inhibieren erfolgt also über strukturell benachbarte carboxylierte Glutamat-Reste.

Statherin, ein Präzipitations-Inhibitor des Speichels, bindet an HAp vermutlich über ein ähnliches

Strukturmotiv. Hier liegen zwei phosphorylierte Serin-Reste im Abstand einer Ganghöhe überein-

ander. Festkörper-NMR Untersuchungen zeigten, daß bei Adsorption an HAp diese Phosphoserine

nahezu immobilisiert werden. Long et. al. vermuteten daher, daß die Bindung über diese beiden Reste

an die Ca(I)-Ionen der (001) Ebene erfolgt [164].

4Vergleichbar dem MGP-Knockout in der Media der Arterien [46]

60 Diskussion

4.4. Ausblick

• Die herausragende Bedeutung von Fetuin als effektiver Inhibitor der spontanen Calciumphosphat-

Präzipitation im Serum konnte durch Bestimmung des inhibitorischen Potenzials verschiedener

Fetuin-defizienter Seren zweifelsfrei belegt werden. Fetuin-KO Mäuse vom Stamm DBA/2 aber

auch Calciphylaxie-Patienten zeigen massive ektopische Calcifizierung. Daher bieten sich diese

Mäuse zum Test verschiedener Therapie-Modelle an. Zunächst gilt es die Bedeutung des er-

niedrigten Magnesium-Spiegels in DBA/2 Tieren als möglicher Auslöser von Calcifizierung

genauer zu untersuchen. Vielleicht ist ein Rescue des beschriebenen Phänotyps bereits durch

Gabe von Magnesium-haltigen Verbindungen möglich. Darüber hinaus sind weitere Therapie-

Ansätze denkbar. Einerseits könnte ein Fetuin-Mangel durch Fetuin-Injektionen ausgeglichen

werden. Das dazu benötigte Fetuin könnte entweder aus Serum isoliert oder rekombinant expri-

miert werden. Andererseits wäre es denkbar, ein synthetisches Fetuin-Analogon zu entwickeln.

Ziel wäre demnach, eine planare Struktur mit darauf funktionalisierten Carboxyl-Endgruppen

zu schaffen.

• Eine große Bedeutung muß der weiteren Strukturaufklärung mittels Röntgenbeugung an Kri-

stallen oder NMR-Spektroskopie an gelöstem Fetuin beigemessen werden. Exakte Strukturda-

ten würden einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Bindung auf atomarer Ebene darstel-

len. Aufgrund der starken Aggregationstendenz konnten diese Arbeiten bisher nicht in Angriff

genommen werden.

• Weitere Erkenntnisse über den Inhibitionsmechanismus Cystatin-ähnlicher Domänen könnten

sogenannte Gain and Loss Of Funktion Effekte ermöglichen. Hierbei wird versucht, durch ge-

zielte Mutationen einzelner Aminosäuren das inhibitorische Potenzial positiv oder negativ zu

beeinflussen.

Wesentliche Grundlagen hierzu wurden in der vorliegenden Arbeit gelegt.

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A. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Wolf-Alexander Heiß

Geburtsdatum 17. September 1970

Geburtsort Göttingen (Niedersachsen)

Eltern Dr. med. Hermann Wolfgang Heiß

Monica Heiß

Staatsangehörigkeit deutsch

Schulbildung

1977–80 Besuch der Alemannen-Grundschule in Schallstadt-Mengen.

1980–5/90 Besuch des Martin-Schongauer-Gymnasiums in Breisach am Rhein (Baden-Württemberg).

Studium

10/1990 Chemiestudium an der Universität Konstanz (Baden-Württemberg).

7/1996 Anfertigung der Diplomarbeit am Institut für Festkörperchemie bei Prof. Dr. Felsche:

Syntaktische Kristallisation von Apatit in Kollagen- und Gelatine-Gelen

2/1997 Studium mit dem Diplom in Chemie abgeschlossen.

7/1997 Beginn der Promotion bei Prof. Dr. Müller-Esterl / Priv.-Doz. Jahnen-Dechent am Institut

für Physiologische Chemie und Pathobiochemie der Universität Mainz (Rheinland-Pfalz).

75

4/1999 Umzug der Arbeitsgruppe aufgrund der Berufung von Priv. Doz. Jahnen-Dechent auf den

Lehrstuhl Zell- und Molekularbiologie an Grenzflächen am IZKF BIOMAT im Universi-

tätsklinikum Aachen (Nordrhein-Westfalen).

B. Danksagung

Im Verlauf der Promotion habe ich von vielen Seiten Unterstützung erfahren, wofür ich mich nun ganz

herzlich bedanken möchte.

Mein besonderer Dank gilt Prof. Willi Jahnen-Dechent. Er hat die Verantwortung und

Mühe nicht gescheut, mich als Chemiker in seine molekularbiologisch-biochemisch ori-

entierte Arbeitsgruppe aufzunehmen und wissenschaflich-kritisch wie menschlich zu be-

gleiten.

Für die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe in Mainz möchte ich Prof. Müller-

Esterl (jetzt Universität Frankfurt) danken.

Herrn Prof. Höcker danke ich für die Übernahme des Koreferats.

Der außerordentliche Einsatz von Dr. DuChesne bereitete den Weg zu einer überaus er-

folgreichen Kooperation auf dem Gebiet der TEM. Dr. Gapinski half mit DLS-Messungen.

(Beide MPI für Polymerforschung Mainz)

In Kooperation mit Priv. Doz. Grötzinger wurde ein Modell der drei Domänen von AHSG

erstellt (jetzt Universität Kiel). Er und Dr. Kernebeck gaben darüber hinaus viele wertvol-

le Ratschläge zur Proteinaufreinigung, der Renaturierung von Proteinen und der Struk-

turmodellierung.

Meine langjährige Laborkollegin C. Schäfer begleitete diese Arbeit auf vielfältige Weise.

Einerseits stellte sie die verschiedenen Maus-Seren bereit und andererseits war sie bei

den vielen größeren und kleineren Problemen des Laboralltags eine verlässliche Hilfe.

Mit cDNA-Konstrukten wurde ich von Dr. Denecke (MBP/GST-FETUB), Dr. Renné

(MBP-hKNG Domäne D1–3) und Dr. Yamamoto (GST-mAHSG/4SE) unterstützt.

Dr. Schinke (jetzt Universität Hamburg) gab sich zu Beginn meiner praktischen Laborar-

beit große Mühe, mir fundiert die grundlegenden molekularbiologischen und proteinche-

mischen Methoden zu vermitteln.

Initiale SEM Untersuchungen der Calciumphosphat-Präzipitate in Gegenwart von AHSG

wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. Duschner (Universiät Mainz) durchgeführt.

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Den Mitgliedern der damaligen Pathobiochemie der Universiät Mainz und der Zentralen

Laborfläche des IZKF BIOMAT im Universitätsklinikum Aachen möchte ich für die gute

Zusammenarbeit danken.

Zusammen mit Dr. Mailänder bewältigte ich nicht nur den Mainzer Laboralltag, sondern

ich erinnere mich auch gern an die gemeinsamen Unternehmungen in der Freizeit.

Meinem Aachener BIOMAT-Labor danke ich für die angenehme Arbeitsatmosphäre:

B. Tschöke, L. Leclaire, C. Schäfer, N. Tsuschida und Dr. Wöltje

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Zur molelularen Topologie der Bindung von Fetuin an HApsylvester.bth.rwth-aachen.de/dissertationen/2002/117/02_117.pdf · Knochen besteht aus etwa 45% Mineral, 40% organischer Matrix